KR20220100041A - 단일 바이알 백신 제형 - Google Patents

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KR20220100041A
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크리스토퍼 비. 팍스
토마스 에스. 베드빅
브이. 루시엔 바네스
리안 엠. 크래머
스티븐 지. 리드
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Abstract

발명은 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 백신 및 약학 조성물을 포함하는 열안정성 동결건조된 제형, 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 동결건조된 제형은 일반적으로 항원 및/또는 보조제, 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함한다.

Description

단일 바이알 백신 제형{SINGLE VIAL VACCINE FORMULATIONS}
기술분야
본 발명은 일반적으로 약학 및 백신 제형 분야에 관한 것이다.
관련 특허 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2013년 12월 31일에 출원된 미국 임시 출원 일련 번호 61/922,761호의 우선권 유익을 주장하며, 상기 출원은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
차세대 합리적-디자인의 백신 보조제는 결핵, HIV 및 말라리아를 포함하여 도전적인 질환들에 대한 백신의 개발에서 중요한 돌파구를 나타낸다. 그러나 이들 새로운 보조제들은 또한 장기간 안정성을 보장하기 위한 콜드-체인 (cold-chain) 과정의 유지를 필요로 한다. 이것은 그런 백신의 세계적인 실시에 대한 상당한 재정적 및 기술적 장벽을 나타낸다. 추가로, 콜드-체인 유지는 동력 공급이 위태로워질 수 있는 자연재해 중에는 보장될 수 없다. 백신과 같은 단백질-함유 약제의 동결건조는 저장수명을 연장시키고 열적 스트레스에 대한 내성을 증가시키기 위하여 통상적으로 사용되는 방법이고 (Kasper et al., 2013, Eur J Pharm Biopharm. 2013 Oct;85(2):162-9; Wang et al, Int J Pharm, 203:1-60), 다수의 시판되는 백신들은 동결건조된 제품으로서 분배된다 (PATH, and Working in Tandem Ltd, 2012, Summary of stability data for licensed vaccines, Seattle, WA). 말라리아 또는 결핵과 같이 복잡한 세포 면역성-중재된 질환에 대한 개발하에 새로운 백신들은 면역 반응을 효율적으로 증강시키고 형상화하기 위하여 보조제 성분을 필요로 할 수 있다 (Reed et al., 2009, Trends Immunol, 30:23-32). 그러나, 백신 항원에의 보조제(들)의 첨가는 성분들 사이의 다중 상호작용에 대한 잠재성을 가지는 보다 복잡한 제형을 초래한다. 그러므로 보조제 첨가 백신에서 장기간 안정성을 유지하는 것은 백신 개발자에게는 상당한 도전을 제공할 수 있다. 이런 이유로 인해, 일부 보조제 첨가 백신은 별도의 보조제 바이알과의 측면-혼합 (bedside-mixing) 후에 투여된다 (US Food and Drug Administration, 2012, Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting). 더욱이, 기존에 시판되는 동결건조된 백신 중 어느 것도 동결건조된 제형에 보조제를 함유하지 않았다 (PATH, and Working in Tandem Ltd, 2012, Summary of stability data for licensed vaccines, Seattle, WA). 실제로, 알루미늄 염 또는 수-중-유 에멀션과 같은, 승인된 인간용 백신에 이미 사용되고 있는 보조제 제형은 특히 동결건조를 도전해볼 수 있다 (Clausi et al, 2008, J Pharm Sci, 97:2049-2061; Rossi et al., 2007, Role of Lipid Excipients in Modifying Oral and Parenteral Drug Delivery: Basic Principles and Biological Examples, pp 88-123, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken NJ). 비록 단백질, 살아있는-약화된 또는 비활성화된 바이러스 또는 박테리아-함유 백신들의 동결건조가 기본적인 관행이긴 하지만, 오늘날까지 보조제 첨가된 임상적 백신 후보의 성공적인 동결건조 및 열안정성 특성화에 대해 보고된 것은 없다 (PATH, and Working in Tandem Ltd, 2012, Summary of stability data for licensed vaccines, Seattle, WA). 스쿠알렌 에멀션에서 탄저병의 보호 항원의 동결건조가 보고된 바 있지만; 복원된 시스템의 열안정성 및 생물물리학적 특성화에 대한 설명은 포함되지 않았다 (Ivins et al., 1995, Vaccine, 13:1779-1784). 임상적으로 승인된 배긴 보조제들 (예컨대 명반, 수-중-유 에멀션 및/또는 모노포스포릴 지질 A (MPLA))의 복잡한 성질은 동결건조된 보조제 첨가 백신의 개발에 실질적인 장애물을 나타낸다.
콜드-체인 유지를 필요로 하지 않는 보조제 첨가 백신의 개발은 전세계적으로, 특히 자원이 적은 환경에서 새로운 백신의 실시의 비용 및 기술적 장애물을 상당히 감소시킬 것이다. 따라서 지속성 온도에서 열적으로 안정하고 백신 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 보유한 열안정성 보조제 첨가 백신에 대한 요구가 존재한다. 본원에 기술되는 바와 같이, 본 발명은 그런 요구를 충족시키고 다른 관련된 장점들을 제공한다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에 그것들의 전체가 모든 목적에 대해 참조로 포함된다.
한 측면으로, 본원에는 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물이 제공되며, 이때 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하며, 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류 (saccharide)의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스, 만노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다. 일부 구체예에서, 조성물은 추가로 항원 및/또는 보조제를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 유효량의 항원, 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물이 제공되는데, 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하며, 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다. 일부 구체예에서, 조성물은 추가로 보조제를 포함한다.
다른 측면으로, 본원에는 유효량의 보조제, 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물이 제공되는데, 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하며, 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다. 일부 구체예에서, 조성물은 추가로 항원을 포함한다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 수-중-유 에멀션 제형은 1% (w/v) 미만 또는 약 1% (w/v)의 글리세롤을 포함한다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 수-중-유 에멀션 제형은 0.5% (w/v) 미만 또는 약 0.5% (w/v)의 글리세롤을 포함한다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 수-중-유 에멀션 제형은 글리세롤을 포함하지 않는다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 수-중-유 에멀션 제형 중에 약 10% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 수-중-유 에멀션 제형 중에 약 5% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 수-중-유 에멀션 제형 중의 만니톨은 약 0.1% (w/v)의 농도로 존재하고 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 수-중-유 에멀션 제형 중에 약 5% (w/v)의 농도로 존재한다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 수-중-유 에멀션 제형 중의 만니톨은 약 2.5% (w/v)의 농도로 존재하고 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 약 2.5% (w/v)의 농도로 존재한다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 글리세롤을 포함하지 않는다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 3개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 6개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 12개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1일 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1주일 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1일 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1주일 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 50℃에서 적어도 1일 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 50℃에서 적어도 1주일 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 50℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 약 30℃ 내지 약 50℃에서 적어도 1일, 적어도 1주일 또는 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 엘레간트 케이크 (elegant cake)의 형태이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 본원에 기술된 어떠한 온도 및 기간 조건에서 저장될 때 육안 검사에 의해 갈변을 나타내지 않는 케이크의 형태이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물의 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 전에 측정된다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 케이크의 형태 및 열안정성은 수축, 균열 및/또는 갈변의 관찰에 의해 측정된다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 후에 측정된다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 열안정성은 크리밍 (creaming)을 위해 복원될 때 형성된 수-중-유 에멀션의 검사에 의해 측정된다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 복원 시에 형성된 수-중-유 에멀션 중의 항원 또는 보조제 농도는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형의 항원 또는 보조제 농도의 25% 이하 또는 약 25%의 분해를 나타낸다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 열안정성은 복원시 형성된 수-중-유 에멀션의 성분들의 분석에 의해 측정된다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 복원된 에멀션은 Z-평균 직경이 약 200 nm 미만인 입자 크기를 가진다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 항원은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 또는 병원체이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 보조제는 대사 가능한 오일이다. 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 합성 스쿠알렌, 포도씨유, 올리브유 또는 합성 아이소프레노이드이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 보조제는 TLR4 아고니스트이다. 일부 구체예에서, TLR4 아고니스트는 MPL, 3d-MPL 또는 합성 GLA이다. 일부 구체예에서, 합성 GLA 보조제는 다음의 구조를 가진다:
Figure pat00001
상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 일부 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
본원에 기술된 조성물의 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 미네랄 오일, 포도씨유, 합성 스쿠알렌 또는 합성 아이소프레노이드이다.
일부 구체예에서, 조성물은 추가로 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 난 (egg) PC, 레티신, 트윈 또는 그것들의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 추가로 계면활성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 플루로닉 F68이다. 일부 구체예에서, 조성물은 추가로 항산화제를 포함한다. 일부 구체예에서, 항산화제는 비타민 E이다.
또 다른 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 포함하는 단일 바이알이 제공되고, 이때 조성물은 바이알에 함유된다.
또 다른 측면으로, 본원에는 약 8℃ 내지 약 60℃에서 또는 약 25℃ 내지 약 60℃에서 조성물을 적어도 1개월 동안 저장하는 것을 포함하는, 본원에 기술된 열안정성 백신 조성물의 저장 방법이 제공되는데, 이때 백신 제형은 열안정성이다.
또 다른 측면으로, 본원에는 열 안정성 동결건조된 백신 조성물을 형성하기 위하여 수-중-유 에멀션을 동결건조하는 단계를 포함하는, 열 안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법이 제공되며, 이때 수-중-유 에멀션은 (1) 항원, (2) 대사 가능한 오일 및 (3) 케이크-형성 부형제를 포함하고, 케이크-형성 부형제는 (a) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (b) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이며, 백신 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성한다.
또 다른 측면으로, 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 형성하기 위하여 수-중-유 에멀션을 동결건조하는 단계를 포함하는, 열 안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법이 제공되며, 이때 수-중-유 에멀션은 (1) 보조제, (2) 대사 가능한 오일 및 (3) 케이크-형성 부형제를 포함하고, 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이며, 백신 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 1% (w/v) 미만 또는 약 1% (w/v)의 글리세롤을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 0.5% (w/v) 미만 또는 약 0.5% (w/v)의 글리세롤을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 글리세롤을 포함하지 않는다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션에 약 10% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션에 약 5% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이고, 이때 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 중의 만니톨은 약 0.1% (w/v)이고 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 중의 트레할로오스는 약 5% (w/v)이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 중의 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이고, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 중의 만니톨은 약 2.5% (w/v)이고 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 중의 트레할로오스는 약 2.5% (w/v)이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 글리세롤을 포함하지 않는다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 3개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 6개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 12개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 약 50℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 단게는 단일 바이알에서 수행된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 복원시의 수-중-유 에멀션은 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자 크기를 가진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 복원시의 수-중-유 에멀션은 약 100 nm 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자 크기를 가진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 복원시의 수-중-유 에멀션 중의 항원 및/또는 보조제의 농도는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 중의 항원 및/또는 보조제의 농도에 비교하여 약 25% 이하의 분해를 나타낸다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조된 조성물은 케이크의 형태이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 전에 측정된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조된 조성물은 케이크의 형태이고 열안정성은 수축 또는 갈변에 대해 케이크의 관찰에 의해 측정된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 후에 측정된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 열안정성은 크리밍에 대해 복원시의 수-중-유 에멀션의 관찰에 의해 측정된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 열안정성은 가시적으로 측정된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 열안정성은 복원시 수-중-유 에멀션의 성분들의 분석에 의해 측정된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 에멀션은 단일 바이알에서 동결건조된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 복원된 에멀션은 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자 크기를 가진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 항원 및 보조제를 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 항원은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 또는 병원체이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 보조제는 대사 가능한 오일이다. 본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일 보조제는 스쿠알렌, 합성 스쿠알렌, 포도씨유, 올리브유 또는 합성 아이소프레노이드이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 항원은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 또는 병원체이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 보조제는 TLR4 아고니스트이다. 일부 구체예에서, TLR4 아고니스트는 MPL, 3d-MPL 또는 합성 GLA이다. 일부 구체예에서, 합성 GLA 보조제는 다음의 구조를 가진다:
Figure pat00002
상기 식에서 R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 일부 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 미네랄 오일, 포도씨유, 합성 스쿠알렌 또는 합성 아이소프레노이드이다.
일부 구체예에서, 백신 조성물은 추가로 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 난 PC, 레티신, 트윈 또는 그것들의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 백신 조성물은 추가로 계면활성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 플루로닉 F68이다. 일부 구체예에서, 백신 조성물은 추가로 항산화제 (예컨대 비타민 E)를 포함한다.
다른 측면으로, 본원에는 (a) 본원에 기술된 열안정성 동결건조된 백신 조성물 중 어느 하나를 수-중-유 에멀션에 복원하는 단계; 및 (b) 에멀션을 대상에게 투여하고 그로써 대상에서 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 대상에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 비-특이적 면역 반응이다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응이다. 일부 구체예에서, 수-중-유 에멀션은 피내로 또는 경구로 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 GLA를 포함한다. 일부 구체예에서 포유류는 인간, 개 또는 소이다.
본원에 기술된 다양한 구체예들의 특성들 중 하나, 일부 또는 전부는 본 발명의 다른 구체예들을 형성하기 위해 조합될 수 있다. 발명의 이들 및 다른 측면들은 기술분야의 숙련자에게 명백해질 것이다.
도 1은 5% w/v 트레할로오스 중에서의 2% v/v SE의 동결건조는 에멀션 특성을 보유한 것을 도시한다. 도 1a) 동결건조 전 에멀션 (좌측), 동결건조된 케이크 (중간) 및 동결건조된 케이크의 복원 후 (우측)의 외관. 도 1b) 입자 크기 부피 분포는 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정되었다.
도 2는 동결건조가 37℃에서 에멀션의 물리적 및 pH 안정성 및 90℃에서 화학적 안정성을 상당히 개선시킨 것을 도시한다. 도 2a) 25℃ (상부 패널) 또는 37℃ (하부 패널)에서 시간경과에 따라 저장될 때 동결건조 전 액체 에멀션 (검은색 사각형) 및 복원된 동결건조된 에멀션 (검은색 원형) 중의 입자 크기. 도 2b) 25℃ (상부 패널) 또는 37℃ (하부 패널)에서 시간경과에 따라 저장될 때 액체 에멀션 (검은색 사각형) 및 복원된 동결건조된 에멀션 (검은색 원형)의 pH. 도 2c) 시간경과에 따라 90℃의 가속화된 분해 조건에서 저장될 때 에멀션의 성분들의 양. 액체 에멀션 중의 알 (egg)-유도된 포스파티딜 콜린 (액체 알-PC; 검은색 원형), 스쿠알렌 (액체 스쿠알렌; 검은색 삼각형) 및 α-토코페롤 (액체 α-토코페롤; 검은색 다이아몬드형)은 복원된 동결건조된 에멀션 중의 알-유도된 포스파티딜 콜린 (동결건조된 알-PC; 검은색 사각형), 스쿠알렌 (동결건조된 스쿠알렌; 검은색 역삼각형) 및 α-토코페롤 (동결건조된 α-토코페롤; 흰색 원형)에 비교하여 성분 농도의 급격한 변화를 나타낸다.
도 3은 1500시간에 걸쳐 주기적으로 복원된 25℃, 37℃, 50℃, 60℃ 및 90℃에서의 저장 중에 동결건조된 에멀션의 물리화학적 변화를 도시한다. 도 3a) 시간경과에 따라 25℃ (검은색 원형), 37℃ (검은색 사각형), 50℃ (검은색 삼각형), 60℃ (검은색 역삼각형) 또는 90℃ (흰색 원형)에서 저장될 때 복원된 동결건조된 에멀션 중의 입자 크기. 도 3b) 시간경과에 따라 25℃ (검은색 원형), 37℃ (검은색 사각형), 50℃ (검은색 삼각형), 60℃ (검은색 역삼각형) 또는 90℃ (흰색 원형)에서 저장된 복원된 동결건조된 에멀션의 pH. 도 3c) 시간경과에 따른 25℃ (검은색 원형), 37℃ (검은색 사각형), 50℃ (검은색 삼각형), 60℃ (검은색 역삼각형) 또는 90℃ (흰색 원형)에서 저장된 동결건조된 에멀션의 케이크 폭 비율. 도 3d) 동결건조된 에멀션이 스트레스를 받는 안정성 조건하에서 60℃에서 저장될 때 입자 크기와 역비례 상관되는, 수축되는 케이크 폭에 의해 측정되는 용융-백 (melt-back).
도 4는 부형제 선택이 복원 후의 에멀션 유지에 영향을 주는 것을 도시한다. 도 4a) 각 부형제의 제형 다중분산성 지수 (PdI). 도 4b) 각 부형제의 에멀션 입자 크기 (nM). 좌측으로부터 우측으로, SE (벌크 물질), 트레할로오스 (동결건조-전), 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스, 락툴로오스, 리보오스, 덱스트란 40,000, PEG 3350, 만니톨, 스타키오스, 다이피콜린산 (0.5%), 니코틴산 (0.5%) 및 프롤린.
도 5는 5% (w/v) 트레할로오스, 리보오스, 만니톨 또는 프롤린 중의 복원된 2% (v/v) 오일 SE의 제형 및 케이크 특성을 도시한다. 도 5a) 동결건조된 에멀션의 케이크 영상들. 도 5b) 트레할로오스 및 만니톨 복원된 동결건조된 제형 사이의 크리밍 비교. 화살표는 크리밍을 나타낸다. 도 5c) DLS에 의해 측정되는 입자 크기 부피 분포.
도 6은 부형제 선택 및 화학적 구조가 케이크 열안정성에 영향을 미치는 것을 도시한다. 도 6a) 대표적인 제형들에 대한 용융 전이의 용융점 장치 열분석도. 도 6b) 각 부형제 내의 케이크 개시 및 tm 온도.
도 7은 에멀션 크기 안정성은 케이크 형태 및 열적으로 유도된 용융-백에 대한 민감성에 좌우되는 것을 도시한다. 도 7a) 입자 크기 안정성은 사용된 벌크화제의 유형 및 벌크화제의 농도에 좌우된다. 5% 덱스트로오스 (검은색 사각형), 5% 수크로오스 (검은색 다이아몬드형), 5% 말토오스 (검은색 역삼각형), 5% 트레할로오스 (검은색 원) 및 15% 락토오스 (검은색 삼각형) 부형제 중의 SE. 도 7b) 입자 크기 성장 속도는 전이 온도, 벌크화제의 특성과 상관이 있다. 점선은 90℃의 스트레스를 받은 안정성 온도를 나타낸다.
도 8은 만니톨 및 부류 1 부형제를 가지는 제형은 에멀션 파괴 없이 케이크 열안정성을 크게 증가시킨 것을 도시한다. 0.2%, 5% (w/v) 만니톨을 포함하거나 만니톨이 없이 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스 또는 수크로오스를 함유하는 5% (w/v) 제형 중의 2% (v/v) 오일 SE 사이의 케이크 Tm의 비교.
도 9는 ID93+GLA-SE의 액체 (좌측), 동결건조된 (중심) 및 복원된 (우측) 바이알의 대표적인 이미지를 도시한다. 바이알들은 50에서 30일 동안 스트레스를 받지 않거나 (상부 열) 스트레스를 받았다 (하부 열).
도 10은 도면 표지로 표시된 것과 같이 ID93 및/또는 GLA-SE를 함유하는 액체 및 복원된 동결건조된 샘플의 입자 특성화를 도시한다. 도 10a) DLS 실험으로부터의 Z-평균 직경, 도 10b) DLS 실험으로부터의 다중분산성 지수 (PdI), 도 10c) 나노입자 트래킹 분석으로부터의 제타 가능성 측정 및 도 10d) 나노입자 트래킹 분석으로부터의 입자 농도 측정. 검은색 막대는 스트레스를 받지 않는 샘플 (즉 4℃에서 30일 동안 저장됨)을 나타내고 흰색 막대는 50℃에서 30일 동안 스트레스를 받은 샘플을 나타낸다.
도 11은 코바이알 (covial) ID93+GLA-SE 액체 (레인 1 및 3) 및 복원된 동결건조된 샘플 (레인 2 및 4)의 염색을 포함하는 환원 SDS-PAGE를 도시한다. 샘플들은 50℃에서 30일 동안 스트레스를 받지 않았거나 (레인 1 및 2) 또는 스트레스를 받았다 (레인 3 및 4). 스트레스를 받지 않은 GLA-SE 및 ID93이 비교용으로 도시된다 (각각 레인 5 및 6).
도 12는 ID93 및/또는 GLA-SE를 함유하는 액체 및 복원된 동결건조된 샘플을 도시한다. 도 12a) GLA, 도 12b) DMPC 및 도 12c) 스쿠알렌 농도는 역상 HPLC 분석의 표준 곡선으로부터 측정되었다. 도 12d) 성분 DMPC, 스쿠알렌 및 GLA를 보여주는 대표적인 크로마토그램. 검은색 막대는 스트레스를 받지 않은 샘플을 나타내고 흰색 막대는 50℃에서 30일 동안 스트레스를 받은 샘플을 나타낸다.
도 13은 ID93+GLA-SE의 동결건조가 열 스트레스로 인한 생물학적 활성의 손실을 방지한 것을 도시한다. 마우스들은 4℃에 또는 50℃에 1개월 동안 노출된 염수 또는 액체, 액체 코바이알 또는 동결건조된 코바이알 ID93+GLA-SE로 면역되었다. 도 13a) B 및 T 세포 혈액 카운트는 면역화되고 18시간 후에 측정되었다. 도 13b) ID93-특이적 혈청 항체 역가는 첫 번째 면역화 후 3주 후에 측정되었다. 도 13c) 비장의 ID93-특이적 CD4 T 세포들의 빈도는 ID93으로 시험관 내 재자극 후에 사이토킨 생성의 분석에 의해 최종 면역화 후 1개월 후에 평가되었다.
도 14는 ID93+GLA-SE 면역화된 마우스에서의 에어로졸화된 M. 결핵균 도전 및 계수 (enumeration)를 도시한다. 최종 면역화 후 1개월 후에 동물들은 소량의 에어로졸화된 M. 결핵균으로 도전되었다. 폐 (도 14a) 및 비장 (도 14b)에서의 박테리아 부담은 3주 후에 측정되었다. 데이터는 N=5 내지 7마리 마우스/그룹의 평균 + s.d.로서 표시되었다. 유사한 결과를 나타내는 두 실험 중 하나로부터의 데이터가 도시되었다. *, **, *** 및 ****는 각각 염수에 비해 P<0.05, 0.01, 0.001 및 0.0001을 나타낸다. n.s.는 염수에 비해 유의미하지 않음을 나타낸다. 4℃와 50℃ 사이의 통계학적 비교를 나타낸다.
도 15는 50℃에서 30일 동안의 스트레스 후 동결건조된 및 복원된 ID93+SLA-SE 공동-동결건조된 제형을 도시한다. 0일 및 30일 시점에 대한 중복 샘플이 도시된다.
도 16은 복원된 ID93+SLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 쿠마찌 염색된 환원 SDS-PAGE 겔 영상을 도시한다. 1 μg의 ID93+SLA-SE가 레인마다 로딩되었다.
도 17은 복원된 ID93+SLA-SE 공동-동결건조된 제형의 DLS 입자 크기를 도시한다. 도 17a) 세기에 의한 입자 크기 분포 (직경). 도 17b) Z-평균 직경. 도 17c) 다중분산성 지수 (PdI). 오차 막대는 평균에 대한 1 표준 편차를 나타낸다, n=4회 작동.
도 18은 복원된 ID93+SLA-SE 공동-동결건조된 제형의 DLS 제타 전위 (mV)를 도시한다. 오차 막대는 평균에 대한 1 표준 편차를 나타낸다, n=4회 작동.
도 19는 복원된 ID93+SLA-SE 공동-동결건조된 제형 중의 HPLC-유도된 SLA 농도 (μg/mL)를 도시한다. 오차 막대는 평균에 대한 1 표준 편차를 나타낸다, n=3회 작동.
도 20은 0 시간에서의 복원 후 및 4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장될 때 동결건조되고 1개월 후의 중복 동결건조된 ID93+GLA-SE 샘플의 케이크 형성 및 에멀션의 외관을 도시한다. 4℃에서 저장된 샘플은 2℃ 내지 8℃의 정상적인 콜드 체인 저장 조건하에서 유지된 대조 동결건조 에멀션을 나타낸다. 케이크는 백색을 나타내고 외관이 약간 수축되었지만 갈변의 증거가 없으며 복원된 에멀션은 복원되고 1시간 또는 24시간 후에도 크림이 되지 않는다.
도 21은 4℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월 동안 저장한 후 2개의 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형의 안정성 특성을 도시한다. 도 21a) 케이크는 어떠한 추가의 붕괴 또는 변색의 신호를 나타내지 않고, 복원된 샘플은 에멀션의 외관을 유지하였으며 복원되고 최대 24시간 후에도 크림을 형성하지 않는다. 도 21b) 표는 DLS 실험으로부터의 Z-평균 직경, DLS 실험으로부터의 다중분산성 지수, 복원된 에멀션들의 pH 및 GLA 농도를 보여준다. 오차 막대는 pH에 대한 2 바이알 및 DLS 크기 및 PDI 측정에 대해 2 바이알 x 3회 희석 x 3회 작동의 평균 근처의 1 SD를 나타낸다. 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL). 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3이다. 데이터는 어떠한 저장 온도의 복원 후의 복원된 에멀션의 입자 크기, 다중분산성 또는 pH에 인지할만한 증가가 없음을 증명한다. 도 21c)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 쿠마찌 염색된 환원 SDS-PAGE 겔 영상을 도시한다. 레인당 1 μg의 ID93+SLA-SE가 로딩되었다. 98kD 밴드의 존재는 ID93 폴리펩티드의 인지할만한 분해가 없음을 증명한다. 도 21d) 에멀션 성분 스쿠알렌 및 DMPC의 HPLC 추적. HPLC 분석은 추가 피크의 출현 또는 피크의 확장이 없는 것으로 증명되는 바 DMPC 에멀션 성분 또는 스쿠알렌이 어떠한 시험 온도에서도 인지할 정도로 분해되지 않은 것을 증명한다. 도 21e)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들 중의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL)를 도시한다. 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3회 작동이다. 3개월째에 복원된 에멀션 샘플들은 4℃ 및 25℃에서 거의 인지할 수 없을 정도의 GLA의 손실을 증명한다 (4℃ 샘플에서 51 μg/mL (102%)의 GLA 및 25℃ 샘플에서 46 μg/mL (92%)의 GLA). 37℃ 샘플은 3개월째에 42 μg/mL (84%)에서 GLA 농도가 약간 손실되는 경향을 보일 수 있다.
도 22는 4℃, 25℃ 및 37℃에서 6개월 동안 저장한 후 2개의 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형의 안정성 특성을 도시한다. 4℃에서 저장된 샘플은 2℃ 내지 8℃의 정상적인 콜드 체인 저장 조건하에서 유지된 대조 동결건조 에멀션을 나타낸다. 도 22a) 케이크는 어떠한 추가의 붕괴 또는 변색의 신호를 나타내지 않고, 복원된 샘플은 에멀션의 외관을 유지하였으며 복원되고 최대 24시간 후에도 크림을 형성하지 않는다. 도 22b) 표는 DLS 실험으로부터의 Z-평균 직경 및 DLS 실험으로부터의 다중분산성 지수, 복원된 에멀션들의 pH 및 GLA 농도를 보여준다. 오차 막대는 pH에 대한 2 바이알 및 DLS 크기 및 PDI 측정에 대해 2 바이알 x 3회 희석 x 3회 작동의 평균 근처의 1 SD를 나타낸다. 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL). 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3이다. 표는 복원되고 6개월에 걸쳐 저장된 샘플들에 대해 pH가 7.21 내지 7.49의 생리적 범위 내에서 유지되는 것을 증명한다. 도 22c)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 쿠마찌 염색된 환원 SDS-PAGE 겔 영상을 도시한다. 레인당 1 μg의 ID93+SLA-SE가 로딩되었다. 98kD 밴드의 존재는 6개월째에 추가 밴드의 출현 또는 98kD 밴드의 확장이 없는 것에 의해 증명되는 바 ID93 폴리펩티드의 인지할만한 분해가 없음을 증명한다. 도 22d) 에멀션 성분 스쿠알렌 및 DMPC의 HPLC 추적. HPLC 분석은 추가의 피크의 출현 또는 피크의 확장이 없는 것으로 증명되는 바 DMPC 에멀션 성분 또는 스쿠알렌이 어떠한 시험 온도에서도 인지할 정도로 분해되지 않은 것을 증명한다. 도 22e)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들 중의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL)를 도시한다. 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3 작동이다. 6개월째에 4℃ 및 25℃ 샘플은 인지할 수 있는 GLA의 손실이 없지만 (4℃ 샘플에서 47 μg/mL (94%)의 GLA 및 25℃ 샘플에서 42 μg/mL (84%)의 GLA), 37℃ 저장 샘플은 초기 GLA 농도, 25 μg/mL (84%)의 대략 50%의 손실을 보이는 것을 증명한다.
도 23은 4℃, 25℃ 및 37℃에서 9개월 동안 저장한 후 2개의 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형의 안정성 특성을 도시한다. 4℃에서 저장된 샘플은 2℃ 내지 8℃의 정상적인 콜드 체인 저장 조건하에서 유지된 대조 동결건조 에멀션을 나타낸다. 도 23a) 케이크는 어떠한 추가의 붕괴 또는 변색의 신호를 나타내지 않고, 복원된 샘플은 에멀션의 외관을 유지하였으며 복원되고 최대 24시간 후에도 크림을 형성하지 않는다. 도 23b) 표는 DLS 실험으로부터의 Z-평균 직경 및 DLS 실험으로부터의 다중분산성 지수, pH 및 GLA 농도를 보여준다. 오차 막대는 pH에 대한 2 바이알 및 DLS 크기 및 PDI 측정에 대해 2 바이알 x 3회 희석 x 3회 작동의 평균 근처의 1 SD를 나타낸다. 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL). 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3이다. 표는 복원되고 9개월에 걸쳐 저장된 샘플들에 대해 pH가 7.19 내지 7.53의 생리적 범위 내에서 유지되는 것을 증명한다. 도 23c)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 쿠마찌 염색된 환원 SDS-PAGE 겔 영상을 도시한다. 레인당 1 μg의 ID93+SLA-SE가 로딩되었다. 98kD 밴드의 존재는 9개월째에 추가 밴드의 출현 또는 98kD 밴드의 확장이 없는 것에 의해 증명되는 바 ID93 폴리펩티드의 인지할만한 분해가 없음을 증명한다. 도 23d) 에멀션 성분 스쿠알렌 및 DMPC의 HPLC 추적. HPLC 분석은 추가 피크의 출현 또는 피크의 확장이 없는 것으로 증명되는 바 DMPC 에멀션 성분 또는 스쿠알렌이 어떠한 시험 온도에서도 인지할 정도로 분해되지 않은 것을 증명한다. 도 23e)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들 중의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL)를 도시한다. 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3회 작동이다. 9개월째에 4℃ 및 25℃ 샘플은 인지할 수 있는 GLA의 손실이 없지만 (4℃ 샘플에서 40 μg/mL (80%)의 GLA 및 25℃ 샘플에서 40 μg/mL (80%)의 GLA), 37℃ 저장 샘플은 9개월의 저장 후에 초기 GLA 농도의 대략 69% (15 μg/mL)의 손실을 보이는 것을 증명한다.
도 24는 4℃, 25℃ 및 37℃에서 12개월 동안 저장한 후 2개의 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형의 안정성 특성을 도시한다. 4℃에서 저장된 샘플은 2℃ 내지 8℃의 정상적인 콜드 체인 저장 조건하에서 유지된 대조 동결건조 에멀션을 나타낸다. 도 24a) 케이크는 어떠한 추가의 붕괴 또는 변색의 신호를 나타내지 않고, 복원된 샘플은 에멀션의 외관을 유지하였으며 복원되고 최대 24시간 후에도 크림을 형성하지 않는다. 도 24b) 표는 DLS 실험으로부터의 Z-평균 직경 및 DLS 실험으로부터의 다중분산성 지수, pH 및 GLA 농도를 보여준다. 오차 막대는 pH에 대한 2 바이알 및 DLS 크기 및 PDI 측정에 대해 2 바이알 x 3회 희석 x 3회 작동의 평균 근처의 1 SD를 나타낸다. 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 HPLC-유도된 GLA 농도 (μg/mL). 오차 막대는 평균 근처의 1 표준 편차를 나타내고, n=3이다. 표는 복원되고 12개월에 걸쳐 저장된 샘플들에 대해 pH가 7.15 내지 7.48의 생리적 범위 내에서 유지되는 것을 증명한다. 도 24c)는 복원된 ID93+GLA-SE 공동-동결건조된 제형들의 쿠마찌 염색된 환원 SDS-PAGE 겔 영상을 도시한다. 레인당 1 μg의 ID93+SLA-SE가 로딩되었다. 98kD 밴드의 존재는 12개월째에 추가 밴드의 출현 또는 98kD 밴드의 확장이 없는 것에 의해 증명되는 바 ID93 폴리펩티드의 인지할만한 분해가 없음을 증명한다.
도 25는 동결건조 직후 (0일) 또는 50℃에서 30일 동안 저장된 후 GLA 농도 (ng/ml)의 범위에 걸쳐 케이크 형성 부형제로서의 글리세롤의 첨가 또는 제거, 에멸션 중의 오일의 백분율의 변동, 등장성 제제로서의 2% Tris의 포함이 동결건조된 에멀션에 미치는 영향을 도시한다. 도 25a는 증가하는 농도의 생체분해성 오일, 스쿠알렌 (2 내지 10% v/v)을 가지고 및 0.5% 글리세롤이 부족한 (글리세롤 없음으로 표지됨) 동결건조된 에멀션 제형들이 모두 50℃에서 30일이 지난 후에도 육안으로 보아 0.5% 글리세롤 v/v를 함유하는 제형 (글리세롤 포함으로 표지됨)에 비교할 때 케이크의 추가 수축이나 변색 없이 동결건조시에 엘레간트 케이크를 형성하였음을 보여준다. 글리세롤을 함유하는 케이크는 동결건조 직후 (시간 0일 및 50℃에서 저장하고 30일 후) 약간 수축 및 함입되었고 50℃에서 저장된 샘플은 50℃에서 저장되고 30일 후 추가로 (수축되고) 또는 케이크 구조의 붕괴를 나타냈다. 도 25b 및 도 25c)는 50℃에서 30일 동안 저장된 후의 제형들 중 어느 것에 대한 입자 크기 (Z-평균 nm) (도 25b) 및 다중분산성 (PDI) (도 25c) 중 어느 것에서도 인지할만한 차이가 없고, 모든 제형은 케이크의 복원 후에 약 또는 200 nm 아래의 입자 크기를 나타내는 것을 보여준다. 도 25d)는 0.5% v/v 글리세롤의 존재가 동결건조 제형의 GLA 보조제의 안정성에 영향을 미치는 것을 보여준다. 다양한 농도의 스쿠알렌 (2 내지 10 % v/v)을 함유하는 동결건조 제형은 다양한 농도의 GLA 보조제를 함유하였다. 0 시간에서의 농도가 동결건조 제형의 50℃에서 30일 동안 저장 후 얻어진 GLA의 농도에 비교되었다. 데이터는 어떠한 글리세롤도 함유하지 않은 동결건조 제형 (글리세롤 없음으로 표시됨)들은 모두 GLA의 초기 농도의 85%보다 큰 것을 증명한 한편 글리세롤을 함유한 동결건조 제형들은 50℃에서 1개월 동안 저장된 후의 GLA 농도의 80%보다 큰 손실을 증명하는 것을 보여준다.
도 26은 GLA-SE 에멀션을 열적보호하는 능력에 대해 평가된 4개의 동결건조 제형을 도시하는데, 동결건조 제형은 모두 글리세롤이 없는 것으로 평가되었다. 도 26 내지 31에 대해, 보조제, GLA의 농도는 GLA-SE 에멀션 중에서 100 ng/ml로 증가되어 동결건조된 케이크의 복원 후에 GLA 농도의 보다 반복적인 정량이 가능해진다. 제형들은 4℃, 25℃, 37℃ 및 50℃에서 표시된 시간 동안 저장된 샘플에 대한 동결건조 후 0 시간 (동결건조 직후), 1주 (1 wk), 2주 (2 wk), 1개월 (1 mo) 및 3개월 (3 mo)의 복원 시간 후 케이크 형성 및 외관, 및 크림형성에 대해 평가되었다. 도 26a) 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음), 도 26b) 5% 트레할로오스 w/v, 0.1% w/v 만니톨, 도 26c) 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨, 도 26d) 10% w/v 트레할로오스. 데이터는 글리세롤이 부족하거나 없는, 시험된 모든 동결건조 제형이 시험된 어떠한 시점에서든 (동결건조 후, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 1개월 또는 적어도 약 3개월) 또는 온도에서든 (적어도 약 4℃, 적어도 약 25℃, 적어도 약 37℃ 및 적어도 약 50℃) 동결건조된 케이크의 변색 또는 갈변 없이 엘레간트 케이크 형성에 양호한 것으로 증명되었음을 보여준다. 케이크는 모두 또한 붕괴 또는 수축 또는 변색이 거의 없거나 없는 것으로 나타났고 복원시 크림을 형성하지 않는 에멀션을 형성하였다.
도 27은 각각의 동결건조 제형에 대해 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음), 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨, 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨, 2.5% w/v/ 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨로서 각각의 막대 세트 아래에 표시된 것과 같은 동결건조 성분들 (케이크 형성 부형제)의 첨가 전의 동결건조-전 GLA-SE 에멀션 (Pre Lyo로서 막대 위에 표지됨), 동결건조 성분들의 첨가 직후의 GLA-SE 에멀션 (Lyo로서 막대 위에 표지됨) 및 복원에 이어 동결건조 후의 GLA-SE 에멀션 (0으로서 표지되거나, 미표지된 경우 각 동결건조 제형 세트에서 세 번째 막대)을 비교한 것을 도시한다. 동결건조 제형들의 초기 비교는 각 제형을 가지고 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자 크기, 다중분산성에 의해 측정되는 바 뚜렷한 응집체의 결핍, 생리적 pH 및 GLA의 뚜렷한 손실의 부재 (초기 함량의 90%보다 큰 값)를 포함하여 적절한 복원된 에멀션 특성들 (바람직한 특성들)을 가지는 동결건조 제형들 사이에 뚜렷한 차이가 없는 것을 증명하였다.
도 28은 4℃ (막대 1), 25℃ (막대 2), 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 1주 동안 (1 wk) 저장된, 각각의 막대 세트 아래에 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음), 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨, 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨, 2.5% w/v/ 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨로서 표시된 것과 같은 다양한 단일 바이알 GLA-SE 동결건조 제형 (케이크 형성 부형제를 함유한 에멀션)을 도시한다. 샘플은 복원되었고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석되었다. 도 28A) 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형은 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기를 나타냈고, 도 28B) 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형은 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 바람직한 결핍을 나타냈으며, 도 28C) 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형은 바람직한 생리적 pH를 나타냈다. 도 28D) 모두 동결건조된 케이크로서 저장되고 GLA-SE 에멀션으로서 복원될 때 원래의 GLA의 농도에 비교하여 인지할 수 있을 정도의 GLA의 손실을 보이지 않는다 (대략 105% 내지 95% 범위의 값).
도 29는 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 특별한 동결건조 제형에 대해 2주 동안 (2 wk) 저장된, 각각의 막대 세트 아래에 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음), 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨, 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨, 2.5% w/v/ 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨로서 표시된 것과 같은 다양한 단일 바이알 GLA-SE 동결건조 제형 (케이크 형성 부형제를 함유한 에멀션)을 도시한다. 샘플은 복원되었고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석되었다. 도 29A)는 37℃ 및 50℃의 온도에서 2주 동안 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 복원될 때 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기를 나타낸 GLA-SE 에멀션을 형성한 것을 증명하고, 도 29B)는 37℃ 및 50℃의 온도에서 2주 동안 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 복원될 때 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 바람직한 결핍을 나타낸 GLA-SE 에멀션을 형성한 것을 증명하며, 도 29C)는 37℃ 및 50℃의 온도에서 2주 동안 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 복원될 때 약 pH 7.0의 바람직한 생리적 pH를 나타낸 GLA-SE 에멀션을 형성하였음을 증명한다. 도 29D) GLA-SE에 대한 모든 동결건조 제형은 37℃ 및 50℃에서 2주 동안 동결건조된 케이크로서 저장되고 GLA-SE 에멀션을 형성하도록 복원될 때 GLA의 원래 농도의 인지할 수 있을 정도의 GLA의 손실을 나타내지 않는다 (대략 105% 내지 95% 범위의 값).
도 30은 4℃ (막대 1), 25℃ (막대 2), 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 1개월 동안 (1 mo) 저장된, 각각의 막대 세트 아래에 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음), 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨, 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨, 2.5% w/v/ 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨로서 표시된 것과 같은 다양한 단일 바이알 GLA-SE 동결건조 제형 (케이크 형성 부형제를 함유한 에멀션)을 도시한다. 샘플은 복원되었고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석되었다. 도 30A)는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기를 나타냈음을 증명하고, 도 30B)는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 바람직한 결핍을 나타냈음을 증명하며, 도 30C)는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 바람직한 생리적 pH를 나타냈음을 증명한다. 도 30D) GLA-SE에 대한 모든 동결건조 제형은 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 1개월 동안 동결건조된 케이크로서 저장되고 GLA-SE 에멀션을 형성하도록 복원될 때 GLA의 원래 농도의 인지할 수 있을 정도의 GLA의 손실을 나타내지 않는다 (대략 105% 내지 94% 범위의 값).
도 31은 4℃ (막대 1), 25℃ (막대 2), 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 1개월 동안 (1 mo) 특별한 동결건조 제형에 대해 저장된, 각각의 막대 세트 아래에 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음), 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨, 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨, 2.5% w/v/ 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨로서 표시된 것과 같은 다양한 단일 바이알 GLA-SE 동결건조 제형 (케이크 형성 부형제를 함유한 에멀션)을 도시한다. 샘플은 복원되었고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석되었다. 도 31A)는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기를 나타냈음을 증명하고, 도 31B)는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 바람직한 결핍을 나타냈음을 증명하며, 도 31C)는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 적어도 약 pH 7.0에서 바람직한 생리적 pH를 나타냈음을 증명한다.
한 측면으로, 발명은 (1) 대사 가능한 오일 및 (2) 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 제공한다. 열안정성 동결건조된 백신 조성물은 추가로 항원 및/또는 보조제를 임의로 포함한다. 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합이다. 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다. 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다. 일부 구체예에서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고 동결건조 전 또는 복원 시의 수-중-유 에멀션은 1% (w/v) 미만 또는 약 1% (w/v)의 글리세롤, 0.5% (w/v) 미만 또는 약 0.5% (w/v)의 글리세롤을 함유하거나, 또는 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성한다. 일부 구체예에서, 조성물은 단일 바이알에 저장된다.
기술분야의 숙련자가 인지하게 될 것과 같이, 용어 열안정성 동결건조된 백신 조성물, 동결건조된 백신 조성물, 동결건조된 열안정성 케이크 및 동결건조된 케이크는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 일반적으로 생체분해성 오일 또는 대사 가능한 오일, 및/또는 하나 또는 그 이상의 항원, 및/또는 및 하나 또는 그 이상의 보조제뿐 아니라 발명의 케이크를 제조하기 위해 사용된 케이크 형성 부형제를 포함하는 동결건조된 수-중-유 안정한 에멀션을 나타낸다. 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 복원시에, 다음의 발명의 바람직한 특성을 가지는 액체 수-중-유 에멀션이 형성된다: 200 nm 미만 또는 약 200 nm의 평균 입자 크기, 약 7.4의 생리적 pH 및 동결건조 전 초기 수-중-유 제형 중의 각 활성 성분의 농도의 25%보다 크거나 약 25%의 각 활성 성분 (예컨대 항원 또는 보조제)의 농도의 손실 또는 대상에서 면역 반응을 유도 또는 자극하기에 적합한 각 활성 성분 (예를 들면 항원, 보조제)의 어떠한 유의미한 분해 또는 변경의 부재.
본원에서 제공되는 동결건조된 백신 조성물은 열안정성이다. 예를 들어, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃에서 안정적이다. 그런 조성물은 추가로 적합한 부형제, 예컨대 기술분야에 잘 알려져 있고 본원에서 기술되는 완충제, 산, 염기, 당 (sugar), 희석제, 보존제 등을 포함하여 약학적으로 허용되는 부형제 (담체)를 포함한다. 또 다른 측면으로, 발명은 본원에 기술된 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 발명은 본원에 기술된 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 에멀션 안으로 복원하는 단계와 그 에멀션을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 에멀션은 수-중-유 에멀션이다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 비-특이적 면역 반응이다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응이다. 면역 반응을 자극하기 위해 본원에서 기술된 방법, 또는 본원에 기술된 복원된 열안정성 동결건조된 백신 조성물은 단독으로 또는 다른 종래의 치료 방법 (예컨대 화학요법제)과 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원의 "약" 값 또는 변수에 대한 언급은 그 값 또는 변수 자체에 대해 지시된 변화를 포함 (및 기술)한다. 예를 들면 "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
정의
본원에 기술된 발명의 측면들 및 구체예들은 측면 및 구체예들을 "포함하고", 그것들로 "구성되고" 및 그것들로 "본질적으로 구성되는"을 포함하는 것으로 인지된다.
"개체" 또는 "대상"은 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유류는 또한, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 가축, 경기용 동물, 애완동물 (예컨대 고양이, 개, 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 하나를 나타내는 형태는 맥락에서 명백하게 다른 것을 표시하지 않는 한 다수의 언급대상을 포함한다.
케이크-형성 부형제 및 케이크-형성 벌크화제는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 케이크-형성 부형제는 동결건조 후에 케이크를 유발하는 동결건조 전의 액체 안정성 수-중-유 에멀션 제형에 첨가되는 물질을 나타낸다. 동결건조된 케이크의 복원시에, 본 발명의 백신을 포함하는 약물학적으로 활성인 약물의 전달에 적합한 안정한 에멀션이 형성된다. 본원에서 사용되는 케이크-형성 부형제는 동결건조된 케이크의 복원시에 에멀션을 파괴하지 않는 그런 물질들이다.
본원에서 사용되는 것과 같은 부형제들은 제한 없이 동결건조를 포함한, 약물학적으로 활성인 약물의 제조 과정 또는, 저장 또는 수송을 위한 충전-완성 과정에 포함되고 완성된 제약 과정에 함유되는, 약물학적으로 활성인 약물 이외의 물질들을 나타낸다.
본원에서 사용되는 동결건조 부형제들은 형태에 기여하는 동결건조 과정 또는 적합한 케이크 구조의 제형에 포함되는 약물학적으로 활성인 약물 이외의 물질을 말할 수 있다. 동결건조 부형제는 벌크화제, 완충제 또는 가용화제를 포함할 수 있다.
일반적 기법
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는 분자 생물학, 재조합 DNA, 생화학 및 화학의 종래 기법들을 사용할 것이다. 그러한 기법들은 문헌에서 충분히 설명된다. 예컨대 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); and in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) 참조.
동결건조된 백신 조성물의 특성
본원에는 항원 및/또는 보조제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물이 제공된다. 본 발명은 수-중-유 에멀션 제형이 동결건조되고 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 저장되거나, 유지되거나 노출될 수 있으며, 복원될 때 다음의 특성들: (1) 크림 형성을 나타내지 않고, (2) 생리적 pH인 7.4 주변의 바람직한 pH를 유지하며, (3) 응집이 거의 없거나 없으면서, 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자를 유지하고, (4) 동결건조 전의 초기 수-중-유 에멀션 제형의 25%보다 크거나 약 25%의 활성 성분의 농도의 손실 또는 각 활성 성분 (예를 들면 항원, 보조제)의 어떠한 유의미한 분해 또는 변경을 나타내지 않으며, 및 (5) 대상에서 면역 반응을 유도하거나 자극하기에 적합한 특성 중 하나 또는 그 이상을 가질 수 있는 에멸션을 형성하는 것을 기술한다.
이들 동결건조된 제형은 (a) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; (b) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류; 또는 (c) 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류를 포함하여 케이크-형성 부형제를 포함한다. 이들 열안정성 제형은 기술을 뛰어넘어 개선된 것이고 많은 선진국에서 콜드 체인 저장의 유지의 실패로 인한 년간 백신 제형의 50% 이상의 손실을 상당히 감소시킬 수 있다. 콜드 체인 저장은 질병 통제 센터, CDC 및 http://www.vac-storagecdcpDF.pdf의 미연방 약품 기관 (UAFDA)에 의해 설명된다. 나아가, 개발도상국들의 많은 지역에서, 25℃보다 높은 주변 온도가 발생하고, 그로써 본원에 기술된 열안정성 백신 제형은 25℃의 주변 온도보다 높은 온도에서 저장되거나, 노출되거나 유지될 수 있다.
한 측면으로, 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 바람직한 열안정성 특성은 동결건조된 조성물이 장기간 안정성; 짧은 복원 시간; 저장 후 동결건조 직후의 케이크 외관과 동등한 케이크 외관의 유지; 복원 시, 용액 특성, 단백질의 구조 또는 형태를 포함한, 원래의 단위용량 형태의 특성의 유지; 및 입자 크기 및 입자들의 분포를 포함하여 원하는 특정 특성들을 가져야 한다는 것이다. (Frank Kofi Bedu-Addo in Understanding Lyophilization Development. Pharmaceutical Technology). 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 추가의 바람직한 특성들은 다음을 포함하는 바람직한 특성들 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 콜드 체인 저장 제품에 전형적인 8℃보다 위의 온도에서 장기 저장 안정성; 짧은 복원 시간; 약 8℃ 이상에서 저장, 노출 또는 유지 후에 동결건조 직후 케이크 외관과 실질적으로 유사한 케이크 외관의 유지; 백신의 활성 성분들 (활성 성분들은 항원 농도 및 또는 형태 및 보조제 농도를 포함하지만 그것들에 한정되지 않는다)의 원래의 단위용량 형태의 유지 (원래의 농도 또는 기능의 플러스 또는 마이너스 25%) 및 복원시 용액 특성, 포함되는 경우 단백질의 구조 또는 형태의 유지; 및 적어도 또는 약 200 nm의 평균 입자 크기보다 크지 않은 입자 크기 및 입자들의 분포.
한 구체예에서, 본원에서 사용되는 열안정성 케이크는 2℃ 내지 8℃의 전형적인 콜드 체인 저장 온도보다 위의 온도에서 저장되거나 저장을 통해 노출되거나 또는 수송될 때 백신 수-중-유 에멀션의 바람직한 특성들을 나타내는 적합한 케이크-형성 부형제의 존재하에 항원 및/또는 보조제를 포함하는 발명의 추가의 활성 성분들을 포함할 수 있는 발명의 수-중-유 안정한 에멀션 (SE)의 단일 바이알 동결건조로부터 제조될 수 있는 케이크를 나타낸다.
한 구체예에서, 본원에서 사용되는 열안정성 백신은 발명의 열안정성 케이크/열안정성 동결건조된 백신 조성물의 복원으로부터 제조되는 백신 조성물을 나타낸다. 또한, 본원에서 사용되는 열안정성 백신은 또한 열안정성 백신으로 복원될 열안정성 동결건조된/케이크 조성물을 나타낼 수 있다.
열안정성의 평가
본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물의 열안정성은 동결건조된 상태에서, 복원 전에 또는 복원 후에 평가될 수 있다. 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물의 열안정성은 육안 관찰 및/또는 본원에 제공된 하나 또는 그 이상의 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 이들 분석은 동결건조 및 복원 후에 에멀션, 항원 및/또는 보조제의 통합성에 대한 평가를 제공할 수 있다.
본원에 기술된 열안정성 분석 및 관찰은 동결건조시, 동결건조 후 1시간, 동결건조 후 6시간, 동결건조 후 12시간, 동결건조 후 24시간, 동결건조 후 36시간, 동결건조 후 48시간, 동결건조 후 1주, 동결건조 후 2주, 동결건조 후 1개월, 동결건조 후 2개월, 동결건조 후 3개월, 동결건조 후 4개월, 동결건조 후 6개월, 동결건조 후 12개월째에 또는 그것보다 나중에 수행될 수 있다. 분석 및 관찰을 수행하기 전에, 동결건조된 조성물은 8℃보다 높거나 약 8℃, 예를 들면 25℃보다 높거나 약 25℃, 37℃보다 높거나 약 37℃, 또는 50℃보다 높거나 약 50℃, 또는 약 60℃에서 유지되거나, 저장되거나 또는 노출될 수 있다.
본원에 기술된 열안정성 분석 및 관찰은 동결건조된 조성물의 복원시, 복원 직후, 복원 후 1시간, 복원 후 6시간, 복원 후 12시간, 복원 후 24시간, 복원 후 36시간, 복원 후 48시간 또는 복원 후 1주째에 수행될 수 있다. 복원 및 분석과 관찰을 수행하기 전에, 동결건조된 조성물은 8℃보다 높거나 약 8℃, 예를 들면 25℃보다 높거나 약 25℃, 37℃보다 높거나 약 37℃, 또는 50℃보다 높거나 약 50℃, 또는 약 60℃에서 유지되거나, 저장되거나 또는 노출될 수 있다.
기술분야의 숙련자는 본 발명이 선진국 또는 개발도상국에서 주변 온도에 보다 가깝게 도달하는 온도에서 저장되거나 수송될 수 있는 동결건조된 백신 조성물을 제공하기 위해 디자인되고, 따라서 일부 구체예에서 동결건조된 조성물은 8℃보다 높거나 약 8℃, 예를 들면 25℃보다 높거나 약 25℃, 37℃보다 높거나 약 37℃, 또는 50℃보다 높거나 약 50℃, 또는 약 60℃ 중 한 온도 이상의 온도 또는 온도들의 조합에서 유지되거나, 저장되거나 또는 노출되는 것을 인지하게 될 것이다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물의 열안정성은 복원 전에 육안 관찰에 의해 평가된다. 다른 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물의 열안정성은 하나 또는 그 이상의 분석, 예를 들면 생물물리학적 및 생화학적 분석을 사용하여 복원 후에 평가된다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물의 열안정성은 복원 후에 육안 관찰에 의해 평가된다. 다른 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물의 열안정성은 하나 또는 그 이상의 분석, 예를 들면 생물물리학적 및 생화학적 분석을 사용하여 복원 후에 평가된다.
한 구체예에서, 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조시 초래되는 동결건조된 케이크는 색 및 농도 (consistency)에 대해 관찰될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 언급되는 케이크는 동결건조 과정으로부터 유발되는 다공성이며 스폰지 구조-유사 물질이거나; 또는 케이크는 냉동 건조 과정 후 남아 있는 고체 내용물이다. 일부 구체예에서, 케이크의 외관은 스폰지형 케이크, 러블리 케이크 (lovely cake) 및 엘레간트 케이크로서 기술될 수 있다. 일부 구체예에서, 케이크는 균열, 붕괴 (또한 수축 또는 바이알의 측면으로부터 떨어짐, 케이크 상부의 가라앉음 (depression) 또는 약간의 자국, 또는 케이크 전체 부피의 감소로서 기술될 수도 있다)의 결핍 및/또는 케이크의 색의 변화 또는 변색 또는 갈변에 대해 육안으로 검사될 수 있다. 일부 구체예에서 케이크는 엘레간트 케이크, 화이크 케이크, 엘레간트 백색 케이크, 스폰지형 백색 케이크, 부피가 증가된 백색 케이크, 브라운 케이크, 갈변 케이크 또는 수축/수축된 케이크로서 분류될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 사용된 변색 또는 갈변은 동결건조시 및 약 8℃ 이상, 예를 들면 25℃, 37℃ 및 또는 60℃의 온도에서 케이크의 저장시 육안으로 보아 케이크에 황색-내지-갈색 색조를 초래하는 원래 케이크의 변색을 초래하는 마이야르 반응 또는 당의 환원을 진행할 수 있는 환원당 (예를 들면 락토오스 및 말토오스)을 함유하는 표현을 나타낸다. 일부 구체예에서, 만약 동결건조시 케이크가 형성되지 않으면, 결과적인 조성물은 투명한 필름, 두꺼운(think) 필름, 두꺼운 백색 필름 또는 고형화된 버블로서 특성화될 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 바람직한 케이크는 2℃ 내지 8℃의 전형적인 콜드 체인 저장 이상으로 기술된 온도 또는 약 8℃ 이상의 온도에서 케이크의 노출, 저장 또는 유지 후에 동결건조된 백신 제형의 바람직한 특성들을 나타내는 케이크를 나타낸다. ("Excipients used in lyophilization of small molecules" Ankit Bahetia, Lokesh Kumarb, Arvind K. Bansal, J. Excipients and Food Chem. 1 (1) 2010; 41-54.)
일부 구체예에서, 동결건조로부터 유발되는 케이크의 용융 온도 (Tm)가 측정된다.
일부 구체예에서, 에멀션 입자 크기는 동결건조된 조성물의 복원 후에 평가된다. 예를 들면, 에멀션 입자 크기를 평가하기 위하여 동적 광산란 (DLS)이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이것은 동결건조 전의, 예를 들면 동결건조 전의 액체 안정성 에멀션 상태의 에멀션 입자 크기에 비교된다. 일부 구체예에서, 에멀션 입자 크기는 동결건조 전의 입자 크기에 비교되지 않는다. 본원의 일부 구체예에서, 입자 크기는 액체 동결건조된 조성물의 Z-평균 직경 (Z-Aved)을 측정함으로써 측정된다. 특정 구체예에서, 열안정성 조성물은 8℃보다 높거나 약 8℃의 온도에서 유지되거나, 저장되거나 또는 노출된 동결건조된 조성물의 복원된 액체 에멀션이 약 200 nM 미만, 약 190 nM 미만, 약 180 nM 미만, 약 170 nM 미만, 약 160 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 140 nM 미만, 약 130 nM 미만, 약 120 nM 미만, 약 110 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 90 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만 또는 약 60 nM 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자 크기를 가질 때 표시된다. 특정 구체예에서, 복원된 에멀션은 약 100 nM 내지 약 200 nM의 Z-평균 직경 범위를 가지는 입자 크기를 가진다.
일부 구체예에서, 다중분산성 지수 (PdI)는 동결건조된 조성물의 복원 후에 평가된다. 예를 들어 PdI를 평가하기 위하여 동적 광산란 (DLS)이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이것은 동결건조 전의, 예를 들면 동결건조 전의 액체 안정성 에멀션 상태의 액체 에멀션의 PDI에 비교된다.
한 구체예에서, 제타 전위는 동결건조된 조성물의 복원 후에 평가된다. 예를 들어, 제타 전위를 평가하기 위해 동적 광산란 (DLS)이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이것은 동결건조 전의, 예를 들면 동결건조 전의 액체 안정성 에멀션 상태의 제타 전위에 비교된다.
일부 구체예에서, 에멀션의 pH는 동결건조된 조성물의 복원 후에 평가된다. 일부 구체예에서, 이것은 동결건조 전의, 예를 들면 동결건조 전의 액체 안정성 에멀션 상태의 pH에 비교된다.
일부 구체예에서, 에멀션의 크림형성은 동결건조된 조성물의 복원 후에 평가된다.
일부 구체예에서, 동결건조된 조성물의 항원, 보조제 및/또는 다른 성분들의 % 품질 저하 또는 % 파괴는 동결건조된 조성물의 복원시에 평가된다. 일부 구체예에서, 존재하는 경우 성분들의 화학적 분해를 평가하기 위하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)가 사용된다. 예시적인 한 구체예에서, 스쿠알렌, DMPC 및 GLA의 화학적 분해는 RP-HPLC에 의해 모니터링된다. 다른 구체예에서 겔-기초 쿠마찌 염색이 복원시, 존재한다면 동결건조된 조성물의 백신의 단백질 항원의 분해를 평가하기 위하여 사용된다. 본원에 제공된 열안정성 조성물은 약 8℃의 온도에서 유지된 열안정성 동결건조된 조성물의 복원 후에 항원 및/또는 보조제, 또는 다른 성분의 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하의 분해, 손실 또는 파괴를 나타내는 것이다.
열안정성 특성
한 측면으로, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 열안정성이다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 9℃ 이상에서, 약 10℃ 이상에서, 약 11℃ 이상에서, 약 12℃ 이상에서, 약 13℃ 이상에서, 약 14℃ 이상에서, 약 15℃ 이상에서, 약 16℃ 이상에서, 약 17℃ 이상에서, 약 18℃ 이상에서, 약 19℃ 이상에서, 약 20℃ 이상에서, 약 25℃ 이상에서, 약 30℃ 이상에서, 약 32℃ 이상에서, 약 35℃ 이상에서, 약 37℃ 이상에서, 약 40℃ 이상에서, 약 42℃ 이상에서, 약 45℃ 이상에서, 약 50℃ 이상에서 및 약 60℃ 이상에서 열안정성이다. 다른 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 내지 약 25℃에서, 약 25℃ 내지 약 37℃에서, 약 37℃ 내지 약 50℃에서, 약 25℃ 내지 약 50℃에서, 약 8℃ 내지 약 37℃에서, 약 8℃ 내지 약 50℃에서 또는 약 8℃ 내지 약 60℃에서 열안정성이다. 예시적인 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 25℃에서 또는 약 25℃에서 열안정성이다. 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 37℃에서 또는 약 37℃에서 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 50℃에서 또는 약 50℃에서 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 60℃에서 또는 약 60℃에서 열안정성이다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 적어도 1시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 1년, 적어도 1.5년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 및 적어도 5년 동안 열안정성이다. 예시적인 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 열안정성이다. 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 적어도 3개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 적어도 6개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 적어도 12개월 동안 열안정성이다. 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 8℃ 이상에서 무한정 열안정성이다.
일부 구체예에서 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 25℃ 이상에서 적어도 1시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 1년, 적어도 1.5년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 및 적어도 5년 동안 열안정성이다. 예시적인 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 25℃ 이상에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다. 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 25℃ 이상에서 적어도 3개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 25℃ 이상에서 적어도 6개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 25℃ 이상에서 적어도 12개월 동안 열안정성이다. 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 25℃ 이상에서 무한정 열안정성이다.
일부 구체예에서 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 37℃ 이상에서 적어도 1시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 1년, 적어도 1.5년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 및 적어도 5년 동안 열안정성이다. 예시적인 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 37℃ 이상에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다. 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 37℃ 이상에서 적어도 3개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 37℃ 이상에서 적어도 6개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 37℃ 이상에서 적어도 12개월 동안 열안정성이다. 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 37℃ 이상에서 무한정 열안정성이다.
일부 구체예에서 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 50℃ 이상에서 적어도 1시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 1년, 적어도 1.5년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 및 적어도 5년 동안 열안정성이다. 예시적인 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 50℃ 이상에서 적어도 1개월 동안 열안정성이다. 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 50℃ 이상에서 적어도 3개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 50℃ 이상에서 적어도 6개월 동안 열안정성이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 50℃ 이상에서 적어도 12개월 동안 열안정성이다. 한 구체예에서, 본원에 제공된 동결건조된 백신 조성물은 약 50℃ 이상에서 무한정 열안정성이다.
열안정성 백신 조성물에 사용하기 위한 부형제 및 제제
본원에는 항원 및/또는 보조제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 추가로 케이크-형성 부형제, 케이크-형성 벌크화제, 완충제, 가용화제, 등장성 제제, 계면활성제 및/또는 유화제와 같은 제제 및/또는 부형제를 포함한다.
부형제
발명의 부형제들은 단독으로 또는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 케이크-형성 부형제, 케이크-형성 벌크화제, 벌크화제, 완충제, 가용화제, 등장성 제제, 긴장성 증가제, 계면활성제, 유화제, 항미생물제 및/또는 붕괴 온도 조절제를 포함하는 다른 부형제와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 부형제는 제한 없이, 동결건조를 포함한, 약물학적으로 활성인 약물의 제조 과정, 또는 저장 또는 수송을 위한 충전-완성 과정에 포함되고 완성된 제약 과정에 함유되는, 약물학적으로 활성인 약물 이외의 물질이다.
일부 구체예에서, 부형제는 동결건조 후에 케이크를 유발하는, 동결건조 전에 액체 안정성 수-중-유 에멀션 제형에 첨가되는 물질이다.
백신 제형 및/또는 동결건조에 적합한 부형제는 기술분야에 알려져 있고 (예컨대 Bahetia et. al., 2010: J. Excipients and Food Chem.:1 (1)41-54, Grabenstein JD. ImmunoFacts: Vaccines and Immunologic Drugs - 2012 (37th revision). St Louis, MO: Wolters Kluwer Health, 2011 and, by Vaccine), 케이크-형성 부형제, 케이크-형성 벌크화제, 벌크화제, 완충제, 가용화제, 등장성 제제, 긴장성 증가제, 계면활성제, 유화제, 항미생물제 및/또는 붕괴 온도 조절제를 포함한다. 현재 승인된 백신 중의 부형제 목록은 질병 통제 센터를 통해 알 수 있고 (cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/B/excipient-table-2.pdf.의 월드와이드 웹, September 2013, "Vaccine Excipient & Media Summary. Excipients Included in U.S. Vaccines, by Vaccine"), 제한 없이 수크로오스, D-만노오스, D-프룩토오스, 덱스트로오스, 칼륨 포스페이트, 플라스돈 C, 무수 락토오스, 미정질 셀룰로오스, 폴라크릴린 칼륨, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 알코올, 아세톤, 캐스터유, FD&C 황색 #6 알루미늄 레이크 염료, 인간 혈청 알부민, 우태아 혈청, 나트륨 바이카보네이트, 인간-이극성 섬유아세포 세포 배양물 (WI-38), 둘베코 변형 이글스 배지, 알루미늄 하이드록사이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 포름알데하이드, 글루테르알데하이드, 아미노산, 비타민, 무기 염, 당, 글리세린, 아스파라긴, 시트르산, 칼륨 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 철 암모늄 시트레이트, 락토오스, 알루미늄 칼륨 설페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트, 칼륨 알루미늄 설페이트, 펩톤, 소 추출물, 티메로살 (미량), 변형된 뮐러 및 밀러 배지, 베타-프로피오락톤, 티메로솔 (다중-용량 바이알 단독), 일염기성 나트륨 포스페이트, 이염기성 나트륨 포스페이트, 일염기성 칼륨 포스페이트, 칼륨 클로라이드, 칼륨 글루타메이트, 칼슘 클로라이드, 나트륨 타우로데옥시콜레이트, 네오마이신 설페이트, 폴리믹신 B, 난 단백질, 락트알부민 가수분해물 및 네오마이신 설페이트를 포함한다.
케이크-형성 부형제/케이크-형성 벌크화제
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 동결건조 후에 케이크를 유발하는, 동결건조 전에 액제 안정성 수-중-유 에멀션 제형에 첨가된 물질이다. 동결건조된 케이크의 복원시, 본 발명의 백신을 포함하는 약물학적으로 활성인 약물의 전달에 적합한 수-중-유 에멀션이 형성된다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 케이크의 복원시 에멀션을 파괴하지 않는 그런 물질이다.
일부 구체예에서 본 발명에 대해, 또한 벌크화제로도 언급되는, 케이크-형성 부형제로서 유용한 제제는 당/단당류 또는 당 알코올과 조합된 당/당류를 포함한다. 본원에 개시된 일부 구체예에서, 당/당류 또는 당 알코올과 조합된 당/당류는 포함된 벌크화제 또는 케이크-형성 부형제로서 유용하다. 이것들은 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 스타키오스, 프룩토오스, 락툴로오스, 글루코오스 및 임의로 글리세롤, 소르비톨 및/또는 만니톨을 포함한다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 스타키오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합이다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 소르비톨 및 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 스타키오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합이다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 단당, 또는 글리세롤의 부재하에 당 알코올과 조합된 당류이다. 다른 구체예에서 케이크-형성 부형제는 당류, 또는 약 1% w/v 미만의 글리세롤, 약 0.5% 미만의 글리세롤 또는 약 0.1% 미만의 글리세롤의 존재하에 당 알코올과 조합된 당류이다.
일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 당류이고 당류는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 5% w/v 내지 약 10% w/v의 농도 범위로 또는 약 5% w/v 내지 약 7.5% w/v의 농도 범위로 존재한다. 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 5% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 약 0.01% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v, 약 1% w/v, 약 2% w/v, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v, 약 10% w/v, 약 11% w/v, 약 12% w/v, 약 13% w/v, 약 14% w/v, 약 15% w/v, 약 16% w/v, 약 17% w/v, 약 18% w/v, 약 19% w/v 또는 약 20% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 약 1% w/v 미만의 글리세롤, 약 0.5% w/v 미만의 글리세롤, 약 0.1% w/v 미만의 글리세롤의 존재하에 제공되거나, 또는 글리세롤 존재 없이 제공된다 (% 글리세롤은 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형 중의 글리세롤의 농도를 나타낸다).
예시적인 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 트레할로오스이고 트레할로오스는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 5% w/v 내지 약 10% w/v의 농도 범위로 또는 약 5% w/v 내지 약 7.5% w/v의 농도 범위로 존재한다. 일부 구체예에서, 트레할로오스는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 5% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 트레할로오스는 약 0.01% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v, 약 1% w/v, 약 2% w/v, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v, 약 10% w/v, 약 11% w/v, 약 12% w/v, 약 13% w/v, 약 14% w/v, 약 15% w/v, 약 16% w/v, 약 17% w/v, 약 18% w/v, 약 19% w/v 또는 약 20% w/v의 농도로 존재한다. 케이크-형성 부형제가 트레할로오스인 일부 구체예에서, 트레할로오스는 약 1% w/v 미만의 글리세롤, 약 0.5% 미만의 글리세롤, 약 0.1% 미만의 글리세롤의 존재하에 제공되거나, 또는 글리세롤 존재 없이 제공된다 (% 글리세롤은 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형 중의 글리세롤의 농도를 나타낸다).
예시적인 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 당 알코올과 조합된 당류이다. 그런 구체예에서, 당류는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v의 농도 범위로 존재하고, 당 알코올은 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v의 농도 범위로 존재한다. 일부 구체예에서, 당류는 당 알코올과 조합되어 존재하고, 당류는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 5% w/v 내지 약 7.5% w/v의 농도 범위로, 또는 약 5% w/v로 존재하고, 당 알코올은 약 0.01% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.1% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.05% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.1% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 약 1% w/v 내지 약 10% w/v, 약 1% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 2.5% w/v의 농도 범위로 또는 약 0.1% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 당류는 당 알코올과 조합되어 존재하는데, 이때 당류는 약 0.01% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v, 약 1% w/v, 약 2% w/v, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v, 약 10% w/v, 약 11% w/v, 약 12% w/v, 약 13% w/v, 약 14% w/v, 약 15% w/v, 약 16% w/v, 약 17% w/v, 약 18% w/v, 약 19% w/v 또는 약 20% w/v의 농도로 존재하고, 당 알코올은 약 0.01% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v, 약 1% w/v, 약 1.5%, 약 2% w/v, 약 2.5%, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v, 약 10% w/v, 약 11% w/v, 약 12% w/v, 약 13% w/v, 약 14% w/v, 약 15% w/v, 약 16% w/v, 약 17% w/v, 약 18% w/v, 약 19% w/v 또는 약 20% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서 당 알코올과 조합된 당류는 약 1% w/v 미만의 글리세롤, 약 0.5% 미만의 글리세롤, 약 0.1% 미만의 글리세롤의 존재하에 제공되거나, 또는 글리세롤 존재 없이 제공된다 (% 글리세롤은 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형 중의 글리세롤의 농도를 나타낸다).
예시적인 일부 구체예에서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 조합된 트레할로오스이다. 그런 구체예에서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v의 농도 범위로 존재하고, 만니톨은 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v의 농도 범위로 존재한다. 일부 구체예에서, 트레할로오스는 만니톨과 조합되어 존재하고, 트레할로오스는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 5% w/v 내지 약 7.5% w/v의 농도 범위로 또는 약 5% w/v의 농도로 존재하고 만니톨은 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.1% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.05% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.1% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 약 1% w/v 내지 약 10% w/v, 약 1% w/v 내지 약 7.5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 5% w/v, 약 1% w/v 내지 약 2.5% w/v의 농도 범위로 또는 약 0.1% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 트레할로오스는 만니톨과 조합되어 존재하고, 이때 트레할로오스는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v, 약 1% w/v, 약 2% w/v, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v, 약 10% w/v, 약 11% w/v, 약 12% w/v, 약 13% w/v, 약 14% w/v, 약 15% w/v, 약 16% w/v, 약 17% w/v, 약 18% w/v, 약 19% w/v 또는 약 20% w/v의 농도로 존재하고, 만니톨은 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.01% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v, 약 1% w/v, 약 1.5%, 약 2% w/v, 약 2.5%, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v, 약 10% w/v, 약 11% w/v, 약 12% w/v, 약 13% w/v, 약 14% w/v, 약 15% w/v, 약 16% w/v, 약 17% w/v, 약 18% w/v, 약 19% w/v 또는 약 20% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 만니톨과 조합된 당류는 약 1% w/v 미만의 글리세롤, 약 0.5% 미만의 글리세롤, 약 0.1% 미만의 글리세롤의 존재하에 제공되거나, 또는 글리세롤 존재 없이 제공된다 (% 글리세롤은 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형 중의 글리세롤의 농도를 나타낸다).
다른 구체예에서, 본 발명에 대해, 케이크-형성 부형제로서 유용한 제제는 어떠한 아미노산을 포함한다. 본 발명에서 벌크화제로서 유용한 아미노산의 예로는 순수한 분자로서 또는 제형된 상태로서의 단독 또는 조합된 아르기닌, 글리신, 프롤린, 글루탐산, 메티오닌, 시스테인, 프롤린 및 히스티딘을 포함한다.
다른 구체예에서 벌크화제는 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 포함한다.
완충제
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 완충제를 포함한다. 본 발명에서 부형제로서 유용한 완충제는 트리스 아세테이트, 트리스 염기, 트리스 HCl, 암모늄 포스페이트, 시트르산, 시트르산 나트륨, 시트르산 칼륨, 타르트산, 나트륨 포스페이트, 염화아연, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 완충제는 염산, 수산화나트륨 및 메글루민과 같은 pH 조절제를 포함한다.
가용화제
일부 구체예에서, 적합한 가용화제는 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 알파 사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스티린 (HP-β-CD)와 같은 복합체 형성 부형제를 포함한다. 폴리솔베이트 80 및 트윈을 포함하여 계면활성제 또한 가용화 부형제로서 포함될 수 있다. 기술분야에서 가용화제로서 알려져 있는 다른 공-용매도 사용될 수 있는데 예를 들면 삼차-부틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 다이클로로메탄, 에탄올 및 아세톤을 포함한다.
본 발명에서 부형제로서 사용하기 위한 긴장성 증가제는 글리세롤, 염화나트륨, 수크로오스, 만니톨 및 덱스트로오스를 포함한다. 붕괴 온도 조절제는 덱스트란, 하이드록시에틸 전분, 피콜 및 젤라틴을 포함한다. 항미생물제는 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 티메로솔을 포함한다.
등장성 제제
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 등장성 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 등장성 제제는 글리세롤이다. 한 특별한 구체예에서, 등장성 제제는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형에 또는 복원시 수-중-유 에멀션에 약 0.36% v/v의 농도로 존재한다.
계면활성제
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 계면활성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 플루로닉 F68이다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 약 100:1 (오일:계면활성제)의 비율로 존재한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 약 0.018% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 약 0.0001% w/v, 약 0.0005% w/v, 약 0.001% w/v, 약 0.005% w/v, 약 0.01% w/v, 약 0.011% w/v, 약 0.012% w/v, 약 0.013% w/v, 약 0.014% w/v, 약 0.015% w/v, 약 0.016% w/v, 약 0.017% w/v, 약 0.018% w/v, 약 0.019% w/v, 약 0.02% w/v, 약 0.03% w/v, 약 0.04% w/v, 약 0.05% w/v, 약 0.06% w/v, 약 0.07% w/v, 약 0.08% w/v, 약 0.09% w/v, 약 0.1% w/v, 약 0.2% w/v, 약 0.3% w/v, 약 0.4% w/v, 약 0.5% w/v, 약 0.6% w/v, 약 0.7% w/v, 약 0.8% w/v, 약 0.9% w/v 또는 약 1% w/v의 농도로 존재한다. 본원에 기술된 백분율 및 비율은 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형 또는 복원시 수-중-유 에멀션 중 어느 하나에서의 비율 및 백분율을 나타낸다.
유화제
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유화제를 포함한다. 일부 구체예에서, 유화제는 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC)이다. 일부 구체예에서, 유화제는 레시틴이다. 일부 구체예에서, 유화제는 약 1:5 (유화제:오일)의 비율로 존재한다. 일부 구체예에서, 유화제는 약 0.38% w/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 유화제는 약 0.002% w/v, 약 0.005% w/v, 약 0.010% w/v, 약 0.015% w/v, 약 0.020% w/v, 약 0.025% w/v, 약 0.030% w/v, 약 0.035% w/v, 약 0.040% w/v, 약 0.045% w/v, 약 0.050% w/v, 약 0.055% w/v, 약 0.060% w/v, 약 0.065% w/v, 약 0.070% w/v, 약 0.075% w/v, 약 0.080% w/v, 약 0.085% w/v, 약 0.090% w/v, 약 0.095% w/v, 약 0.10% w/v, 약 0.15% w/v, 약 0.20% w/v, 약 0.25% w/v, 약 0.30% w/v, 약 0.35% w/v, 약 0.40% w/v, 약 0.45% w/v, 약 0.50% w/v, 약 0.55% w/v, 약 0.60% w/v, 약 0.65% w/v, 약 0.70% w/v, 약 0.75% w/v, 약 0.80% w/v, 약 0.85% w/v, 약 0.90% w/v, 약 0.95% w/v, 약 1% w/v, 약 2% w/v, 약 3% w/v, 약 4% w/v, 약 5% w/v, 약 6% w/v, 약 7% w/v, 약 7.5% w/v, 약 8% w/v, 약 9% w/v 또는 약 10% w/v의 농도로 존재한다. 본원에 기술된 백분율 및 비율은 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형 또는 복원시 수-중-유 에멀션 중 어느 하나에서의 비율 및 백분율을 나타낸다.
열안정성 동결건조된 백신 조성물에서 사용하기 위한 보조제
본원에 기술된 발명의 일부 측면에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신)은 보조제를 포함한다. 일부 구체예에서 보조제는 단독으로, 예를 들면 치료제로서 사용하기 위해 제공된다. 다른 구체예에서, 보조제는 항원과 함께 제공된다. 면역 반응을 조절하는 조성물에서 사용하기 위한 보조제는 기술부야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물에 사용하기 위한 보조제는 면역자극성 보조제, 전달 보조제, 무기 보조제 또는 유기 보조제 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 조성물에 사용하기 위한 보조제의 비-제한적인 실례는, 그 중에서도, Barouch D.H., 2008, Nature, 455(7213):613-9; Morrow et al., 2008, AIDS, 22(3):333-8; 및 McGeary et al., 2003, Peptide Sci., 9(7):405-181에서 찾아볼 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신)에 사용된 보조제는 면역자극성 보조제이다. 면역자극성 보조제는 면역 시스템에 직접적으로 작용하는 보조제, 예를 들면 사이토킨, TLR 리간드 또는 미생물 독소와 같은 것일 수 있다. 본원의 일부 구체예에서, 보조제는 사이토킨 보조제이다. 하나 또는 그 이상의 사이토킨이 본원에 기술된 조성물에서 보조제 단독으로서 또는 하나 또는 그 이상의 추가 보조제와 조합되는 것으로서 적합할 수 있다. 적합한 사이토킨은 인터페론 (IFN), 인터류킨 (IL), 케모카인, 콜로니-자극 인자 또는 종양 괴사 인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 인터페론은 타입 I IFN, 타입 II IFN 또는 타입 III IFN이다. 일부 구체예에서, 인터페론은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ 또는 IFN-λ 및 이것들 중으로부터의 하위유형들 (예컨대 IFN-λ, IFN-λ2 및 IFN-λ3)이다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 인터류킨이다. 본원에 기술된 조성물에서 보조제로서 사용될 수 있는 인터류킨의 비-제한적인 실례는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36을 포함한다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 케모카인이다. 일부 구체예에서, 케모카인은 CC 케모카인, CXC 케모카인, C 케모카인 또는 CX3C 케모카인이다. 본원에 기술된 조성물에서 보조제로서 사용될 수 있는 CC 케모카인의 비-제한적 실례는 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 및 CCL28이다. 본원에 기술된 조성물에서 사용될 수 있는 CXC 케모카인의 비-제한적 실례는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16 및 CXCL17을 포함한다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 콜로니-자극 인자이다. 일부 구체예에서, 콜로니-자극 인자는 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 또는 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF)이다. 일부 구체예에서, 사이토킨은 종양 괴사 인자이다. 본원에 기술된 조성물에서 보조제로서 사용될 수 있는 종양 괴사 인자 패밀리 단백질의 비-제한적 실례는 TNF-α 및 4-1BBL이다.
일부 구체예에서, 자극성 보조제는 톨-유사 수용체 (TLR) 리간드 (예컨대 TLR 아고니스트)이다. 하나 또는 그 이상의 TLR 리간드가 본원에 기술된 조성물에서 보조제 단독으로서 또는 하나 또는 그 이상의 추가 보조제와 조합되는 것으로서 적합할 수 있다. TLR은 예컨대 대다수의 감염성 병원체에 또는 병원체 상에 존재할 수 있는 다양한 보존된 미생물 분자 구조에 대한 초기-단계 인식 능력을 숙주 세포에 부여하는 선천적 면역 시스템의 세포 표면 경막 수용체를 포함한다 (예컨대 Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect. 6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102).
선천적 면역 시스템을 통한 면역 반응의 개시를 강화시키기 위한 TLR-중재된 신호 변환의 유도는 세포 표면 TLR에 맞물려 있는 TLR 아고니스트 (즉 TLR 리간드)에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 리포다당류 (LPS)는 TLR2 또는 TLR4를 통한 TLR 아고니스트일 수 있고 (Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206); 폴리(이노신-시티딘) (폴릴:C)는 TLR3을 통한 TLR 아고니스트일 수 있으며 (Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119); CpG 서열 (메틸화되지 않은 시토신-구아노신 또는 "CpG" 다이뉴클레오티드 모티프를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드, 예컨대 CpG 7909, Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et al. Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al. Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol. 173:5148)은 TLR9를 통한 TLR 아고니스티일 수 있고 (Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol. 177:2373); 펩티도글리칸은 TLR2 및/또는 TLR6 아고니스트일 수 있으며 (Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174:1566); 3MOO3 (4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-다이메틸-6,7,8,9-테트라하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 하이드레이트, Mol. Wt. 318 Da from 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, 이것은 관련 화합물 3M001 및 3M002의 공급원이기도 함; Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259)은 TLR7 아고니스트 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) 및/또는 TLR8 아고니스트 (Johansen 2005)일 수 있고; 플라젤린은 TLR5 아고니스트일 수 있으며 (Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487); 프로필린은 TLR11 아고니스트일 수 있고 (Hedhli et al., 2009, Vaccine, 27(16):2274-87); 리포펩티드는 TLR1, TLR2 및/또는 TLR6 아고니스트일 수 있으며 (Gao et al., 2013, Vaccine, 31(26):2796-803); C형 간염 항원은 TLR7 및/또는 TLR9를 통해 TLR 아고니스트로서 작용할 수 있다 (Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724). 다른 TLR 아고니스트들도 알려져 있고 (예컨대 Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198) 본원에서 기술된 구체예들 중 특정 구체예에 따라 사용될 수 있다.
예를 들어, 및 배경기술 (예컨대 미국 특허 번호 6,544,518호)에 의하면, 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드 ("CpG")를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 전신적 및 점막 경로 둘 다에 의해 투여될 때 보조제로서 투여되는 것으로 알려져 있다 (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998. 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG는 DNA에 존재하는 시토신-구아노신 다이뉴클레오티드 모티프에 대한 약어이다. 면역자극에서 CG 모티프의 중심 역할은 Krieg에 의해 설명되었다 (Nature 374, p546, 1995). 상세한 분석은 CG 모티프가 특정 서열 맥락에 있어야 하고, 그런 서열은 박테리아 DNA에서는 흔하지만 척추동물의 DNA에서는 보기 힘든 것을 밝혔다. 면역자극 서열은 열려 있다: 퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘; 이때 다이뉴클레오티드 CG 모티프는 메틸화되지 않지만, 다른 메틸화되지 않은 CpG 서열들은 면여자극성인 것으로 알려져 있고 본 발명의 특정 구체예에 사용될 수 있다. CpG는 백신으로 제형될 때 유리 (free) 항원과 함께 (WO 96/02555; McCluskie and Davis, 상기 동일) 또는 항원에 공유적으로 포합되어 (PCT 공보 번호 WO 98/16247) 유리 용액으로 투여되거나, 또는 알루미늄 하이드록사이드와 같은 담체와 제형될 수 있다 (예컨대 Davis et al. 상기 동일, Brazolot-Millan et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
일부 구체예에서, 본 발명의 보조제로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 둘 또는 그 이상의 다이뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 사이는 포스포로다이티오에이트이거나, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이지만, 혼합된 뉴클레오티드간 연쇄를 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 포스포다이에스테르 및 다른 뉴클레오티드간 결합도 발명의 범주 내에 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로다이티오에이트의 제조 방법은 미국 특허 번호 제 5,666,153호, 5,278,302호 및 WO95/26204에 기술되어 있다.
바람직한 올리고뉴클레오티드의 실례는 다음의 공보에서 개시된 서열들을 가진다; 본원에 개시된 특정 구체예에 대하여 서열은 바람직하게 특정 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드간 연쇄를 함유한다: (1) CPG 7909: Cooper et al., "CPG 7909 보조제는 항레트로바이러스-치료된 HIV-감염 성인에서 B형 간염 바이러스 백신 혈청보호를 개선시킨다", AIDS, 2005 Sep 23;19(14):1473-9; (2) CpG 10101: Bayes et al., "임상 실험에의 관문", Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2005 Apr;27(3):193-219; 및 (3) Vollmer J., "TLR9에 대한 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 리간드의 약물 개발의 진전", Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 May; 5(5):673-682.
또 다른 CpG 올리고뉴클레오티드는 거기에 중요하지 않은 뉴클레오티드 서열 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가를 가진다는 점에서 상기-인용된 공보에 기술되어 있는 바람직한 서열의 변이체들을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 활용된 CpG 올리고뉴클레오티드는 기술분야에 공지되어 있는 (예컨대 EP 468520) 어떠한 방법에 의해 합성될 수 있다. 편리하게도, 그런 올리고뉴클레오티드는 자동 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 결합은 포스포로다이티오에이트, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포다이에스테르 또한 본 발명의 구체예들의 범주 내에 있다. 상이한 뉴클레오티드간 연쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 혼합 포스포로티오에이트 포스포로다이에스테르 또한 고려된다. 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 다른 뉴클레오티드간 결합 또한 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 보조제는 TLR4 아고니스트이다. 일부 구체예에서, 발명의 조성물에 사용된 TLR4 아고니스트는 글루코피라노실 지질 보조제 (GLA), 예컨대 미국 특허 공보 번호 US2007/021017, US2009/045033, US2010/037466 및 US 2010/0310602 (그것들의 내용은 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 것들을 포함한다.
예를 들어, 특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염을 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00003
.
상기 식에서,
L1, L2, L3, L4, L5 및 L6은 동일하거나 상이하며 독립적으로 -O-, -NH- 또는 -(CH2)-이고;
L7, L8, L9 및 L10은 동일하거나 상이하며 독립적으로 없거나 -C(=O)-이고;
Y1은 산 기능성 기이며;
Y2 및 Y3은 동일하거나 상이하며 독립적으로 -OH, -SH 또는 산 기능성 기이고;
Y4는 -OH 또는 -SH이며;
R1, R3, R5 및 R6은 동일하거나 상이하며 독립적으로 C8-13 알킬이고; 및
R2 및 R4는 동일하거나 상이하며 독립적으로 C6-11 알킬이다.
합성 GLA 구조의 일부 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C10 알킬이고; R2 및 R4는 C8 알킬이다. 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
예를 들어, 특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00004
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특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다.
다른 특정 구체예에서, GLA는 R1, R3, R5 및 R6이 C11 알킬이고; R2 및 R4가 C13 알킬인 상기 설명된 식을 가진다.
다른 특정 구체예에서, GLA는 R1, R3, R5 및 R6이 C10 알킬이고; R2 및 R4가 C8 알킬인 상기 설명된 식을 가진다.
또 다른 특정 구체예에서, GLA는 R1, R3, R5 및 R6이 C11 내지 C20 알킬이고; R2 및 R4가 C9 내지 C20 알킬인 상기 설명된 식을 가진다. 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00005
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상기 GLA 구조의 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00006
상기 GLA 구조의 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00007
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상기 GLA 구조의 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00008
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특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00009
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특정 구체예에서, TLR4 아고니스트는 다음 구조를 가지는 합성 GLA 보조제이다:
Figure pat00010
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또 다른 구체예에서, 본원 발명의 조성물에 사용된 보조제는 약화된 지질 A 유도체 (ALD)이다. ALD는 변경되거나 구성된 지질 A-유사 분자여서 그 분자는 지질 A보다 더 적거나 상이한 부작용을 나타낸다. 이들 부작용으로는 발열, 국소성 슈바르츠만 반응성 및 본 발명에 따라 유용한 닭배아 50% 치사량 분석 (CELD50) ALD에서 평가되는 독성을 포함하며 모노포스포릴 지질 A (MLA) 및 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MLA)를 포함한다. MLA 및 3D-MLA는 알려져 있고 본원에서 상세하게 기술할 필요는 없다. 예를 들면 미국 특허 번호 4,436,727호 (Ribi ImmunoChem Research, Inc.에 부여됨) 참조하는데, 그 특허는 모노포스포릴 지질 A와 그것의 제조를 개시한다. 미국 특허 번호 4,912,094 및 재심사 등록 B1 미국 특허 번호 4,912,094호 (또한 Ribi ImmunoChem Research, Inc.에 부여됨)는 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A 및 그것의 제조 방법을 구현한다.
일부 구체예에서, 이미다조퀴놀린과 같은 반응 조절제 및 기술분야에 공지되어 있는 다른 면역 반응 조절제들 또한 본 발명의 특정 개시된 구체예들에서 보조제로서 포함될 수 있다. 특정한 바람직한 이디마조퀴놀린 면역 반응 조절제들로는, 비-제한적 실례로서, 레지퀴모드 (R848), 이미퀴모드 및 가르디퀴모드를 포함하고 (Hemmi et al., 2002 Nat. lmmunol. 3:196; Gibson et al., 2002 Cell. Immunol. 218:74; Gorden et al., 2005 J. lmmunol. 174:1259); 이들 및 다른 이미다조퀴놀린 면역 반응 조절제 적절한 조건하에서, 또한 본원에 기술된 것과 같은 TLR 아고니스트 활성을 가질 수 있다. 다른 면역 반응 조절제는 핵산-기초 이중 스템 루프 면역 조절제 (dSLIM)이다. 개시된 본 구체예들의 특정 구체예에서 사용하기 위해 고려된 dSLIM의 구체적인 실례들은 다음 문헌들에서 찾아볼 수 있다: Schmidt et al., 2006 Allergy 61:56; Weihrauch et al. 2005 Clin Cancer Res. 11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knablein (Editor). John Wiley & Sons, December 6, 2005. (183 내지 ~200 페이지에서 논의된 dSLIM), 및 Mologen AG (Berlin, FRG: [8/18/06에 온라인상으로 검색됨, 월드와이드 웹 mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml 참조).
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물에 사용된 보조제는 박테리아 또는 식물로부터 유도된 다당류이다. 본원에 기술된 조성물에서 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 추가 보조제와 조합하여 사용될 수 있는 다당류-기초 보조제의 비-제한적 실례는 글루칸 (예컨대 베타 글루칸), 덱스트란 (예컨대 황화된 및 다이에틸아미노에틸-덱스트란), 글루코만난, 갈락토만난, 레반, 크실란, 프룩탄 (예컨대 이눌린), 키토산, 내독소 (예컨대 리포다당류), 바이오브란 MGN-3, 악티니디아 에리안타로부터의 다당류, 엘덱소머 및 그것들의 변이체들을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물에 사용된 보조제는 프로테오좀 또는 그것의 하위유닛이다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물에 사용된 보조제는 라이신 코어 주변에서 조립된 동일하거나 상이한 항원성 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물에 사용된 보조제는 독소 (예컨대 박테리아 독소)이다. 일부 구체예에서, 독소는 대장균, 비브리오 콜레라, 보르데텔라 퍼투시스 및 보르데텔라 파라퍼투시스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 박테리아로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신)에 사용된 보조제는 전달 보조제이다. 전달 보조제는 보조제로서 작용할 수 있고 및/또는 항원을 전달할 수 있다. 본원에 기술된 조성물에서 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 추가 보조제와 조합하여 사용될 수 있는 보조제의 비-제한적 실례는 미네랄 염 (예컨대 칼슘 포스페이트), 에멀션 (예컨대 물 중의 스쿠알렌), 리포좀 (예컨대 DPPC:콜레스테롤 리포좀), 바이로좀 (예컨대 면역강화용 복원된 인플루엔자 바이로좀) 및 마이크로스피어를 포함한다.
본원에 개시된 특정 구체예들에 따라 사용하기 위한 다른 보조제들은 블록 공중합체 또는 생체분해성 중합체를 포함하는데, 그것은 친숙하게 될 관련 기술의 중합체 화합물의 부류를 말한다. 본원에 기술된 조성물에 포함될 수 있는 블록 공중합체 또는 생체분해성 중합체의 실례는 플루로닉® L121 (BASF Corp., Mount Olive, NJ; 예컨대 Yeh et al., 1996 Pharm. Res. 13:1693; 미국 특허 번호 5,565,209 참조), CRL1005 (예컨대 Triozzi et al., 1997 Clin Canc. Res. 3:2355), 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(락트산) (PLA), 폴리-(D,L-락타이드-코-글리콜라이드) (PLG) 및 폴릴:C를 포함한다. (예컨대 Powell and Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New York 참조).
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신)에 사용된 보조제는 유기 보조제이다. 유기 보조제는 살아있는 유기체로부터 유도되거나 화학적으로 탄소를 함유하는 보조제일 수 있다. 일부 구체예에서, 보조제는 미생물 세포벽으로부터 유도된다 (예컨대 뮤라밀 다이펩티드 및 그것의 변이체). 일부 구체예에서, 보조제는 트레할로오스 6,6'-다이미콜레이트 또는 그것의 변이체이다. Schweneker et al., 2013, Immunobiology, 218(4):664-73 참조. 일부 구체예에서, 보조제는 스테아릴 타이로신이다.
QS21 및 유사한 효과를 부여하고 본원에서 QS21 모방물로서 언급되는 구조적으로 관련된 화합물 (예컨대 미국 특허 번호 5,057,540; EP 0 362 279 B1; WO 95/17210 참조), 토마틴과 같은 식물 알칼로이드, (그것에 한정되는 것은 아니지만) 사포닌, 폴리소르베이트 80, 스판 85 및 스테아릴 타이로신과 같은 계면활성제, 이미다조퀴놀린 면역 반응 조절제 및 이중 스템 루프 면역 조절제 (dSLIM, 예컨대 Weeratna et al., 2005 Vaccine 23:5263)를 포함하여 사포닌 및 사포닌 모방물이 현재 기술된 구체예들 중 특정 구체예에 따라 보조제로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물에 사용된 보조제는 사포닌 또는 사포닌 모방물이다. 사포닌을 포함하여 계면활성제들은 예컨대 미국 특허 제 6,544,518호; Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996 Phytomedicine 2:363-386), 미국 특허 번호 5,057,540, Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55, 및 EP 0 362 279 B1에서 교시된다. 면역 자극 복합체 (ISCOMS)로 명명되고, Quil A (사포닌)의 부분들을 포함하는 특별한 구조는 용혈성이고, 백신의 제조에 사용되어 왔다 (Morein, B., EP 0 109 942 B1). 이들 구조는 보조제 활성을 가지는 것으로 보고되었다 (EP 0 109 942 B1; WO 96/11711). 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (Quil A의 HPLC 정제된 부분)은 강력한 전신성 보조제로서 기술되었고, 그것의 제조 방법은 미국 특허 번호 5,057,540 및 EP 0 362 279 B1에 개시되어 있다. QS21은 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유도된 HPLC 정제된 비-독성 부분을 포함할 수 있다. QS21의 제조는 미국 특허 번호 제 5,057,540호에 개시되어 있다 (또한 미국 특허 번호 제 6,936,255호, 제 7,029,678호 및 제 6,932,972호 참조). 또한 이들 참고문헌에는 전신성 백신에 대한 강력한 보조제로서 작용하는 QS7 (Quil A의 비-용혈성 부분)의 사용이 기술되어 있다. QS21의 사용은 또한 Kensil 등에 의해 (1991. J. Immunology 146:431-437) 기술되어 있다. QS21과 폴리소르베이트 또는 사이클로덱스트린의 조합 또한 알려져 있다 (WO 99/10008). Quil A의 부분들을 포함하는 특별한 보조제 시스템, 예컨대 QS21 및 QS7은 WO 96/33739 및 WO 96/11711에 기술되어 있다. 전신성 백신화 연구에 사용되어 온 다른 사포닌들로는 집소필라 및 사포나리아와 같은 다른 식물 종으로부터 유도된 것들을 포함한다 (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).
일부 구체예에서, 보조제는 사포닌-유도된 ISCOMATRIX®을 포함하여, ISCOMS로 알려져 있는 "면역자극성 복합체"이고 (예컨대 미국 특허 번호 6,869,607, 6,846,489, 6,027,732, 4,981,684), 예를 들면 Iscotec (Stockholm, Sweden) 및 CSL Ltd. (Parkville, Victoria, Australia)로부터 상업적으로 구매할 수 있다.
에스신 (escin)은 본원에 개시된 구체예들의 보조제 조성물에 사용하기 위한 사포닌에 관련된 또 다른 계면활성제이다. 에스신은 머크 색인 (12판: 엔트리 3737)에 마로니에 나무의 종자에서 일어나는 사포닌, 아에스쿨러스 히포카스타눔 (Aesculus hippocastanum)의 혼합물로서 기술되어 있다. 그것의 분리는 크로마토그래피 및 정제에 의해 (Fiedler, Arzneimittel--Forsch. 4, 213 (1953)), 및 이온-교환 수지에 의해 (Erbring et al., 미국 특허 번호 3,238,190) 기술된다. 에스신 (또한 아에스신으로도 알려져 있음)의 부분들은 정제되었고 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다 (Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8):1454-1464)). 디기토닌은 또 다른 계면활성제로, 머크 색인 (12판, 엔트리 3204)에 디기탈리스 푸르푸레아의 종자로부터 유도되고 Gisvold 등에 의해 기술된 과정 (Gisvold et al., J. Am. Pharm.Assoc., 1934, 23, 664; and Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621)에 따라 정제되는 사포닌으로서 기술되어 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신)에 사용된 보조제는 무기 보조제이다. 무기 보조제는 예를 들면 미네랄 염, 에멀션 및 칼슘 포스페이트와 같이 일반적으로 탄소를 기초로 하지 않는 보조제들일 수 있다. 본원에서 고려되는 미네랄 염 보조제들로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 알루미늄-기초 화합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 칼슘 포스페이트 보조제는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 오르토포스페이트 (PO43-), 메타포스페이트 (PO3-) 또는 파이로포스페이트 (P2O74-)와 함께 칼슘 이온 (Ca2+)을 포함한다.
또한 상기에서 주지된 것과 같이, 본원에 기술된 조성물에 사용하기 위한 보조제의 한 가지 유형은, 일반적으로 "알룸(alum)"으로서 언급되는 알루미늄 보조제일 수 있다. 알룸 보조제는 다음을 기초로 한다: 알루미늄 옥시-하이드록사이드; 알루미늄 하이드록시포스페이트; 또는 다양한 적절한 염. 알룸 보조제를 사용하는 백신들은 파상풍 균주, HPV, A형 간염, 비활성화된 폴리오 바이러스 및 본원에 기술된 다른 항원들에 대한 백신들을 포함할 수 있다. 알룸 보조제는 그것이 양호한 안전성 기록을 가지고, 항체 반응을 증대시키며, 항원을 안정화시키고, 대규모 제조에 대해 상대적으로 간단하기 때문에 유리하다 (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2:370-383).
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 보조제를 포함한다. 일부 구체예에서, 보조제는 TLR4 아고니스트이다. 일부 구체예에서, 보조제는 약 0.5 μg/mL 내지 약 12 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 보조제는 약 0.5 μg/mL, 약 1 μg/mL, 약 2 μg/mL, 약 3 μg/mL, 약 4 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 6 μg/mL, 약 7 μg/mL, 약 8 μg/mL, 약 9 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 20 μg/mL, 약 30 μg/mL, 약 40 μg/mL, 약 50 μg/mL, 약 60 μg/mL, 약 70 μg/mL, 약 80 μg/mL, 약 90 μg/mL 또는 약 100 μg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 보조제는 본원에 기술된 MPL 또는 GLA이다. 일부 구체예에서, 보조제는 약 0.5 mg/mL, 약 1 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL 또는 약 12 mg/mL의 농도로 존재한다.
본원에 기술된 특정 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신 조성물)에 사용하기에 적합한 보조제는 상업적으로 활용될 수 있는 보조제, 예컨대 예를 들면 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 보조제 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 및 그것의 유도체 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); AddaVax (InvivoGen); MF59 (Norvartis); AS03 (GlaxoSmithKline); AS01B (GlaxoSmithKline); AS02A (GlaxoSmithKline)를 포함한다.
본원에 제공된 일부 구체예는 하나의 보조제 및 제 1 보조제와 상이한 적어도 하나의 추가 보조제를 함유하는 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신 조성물)을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 조성물은 GLA 및 GLA 이외의 제 2 보조제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 2, 3, 4 또는 5개의 보조제를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 2개의 보조제를 포함한다.
본원에 기술된 보조제는 인간 (예컨대 인간 환자), 비-인간 영장류, 포유류 또는 인식된 면역 시스템을 가지고 있는 다른 고등 진핵 유기체와 같은 대상에 투여될 때 면역 반응의 효능 및/또는 지속성을 변경시킬 수 있는 (즉 통계학적으로 유의미한 방식으로 증가시키거나 감소시킬 수 있는, 특정 구체예에서는 증강시키거나 증가시킬 수 있는) 보조제를 포함한다 (예컨대 Powell and Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New York 참조). 본원에 개시된 특정 구체예에서, GLA 및 바람직한 항원, 및 임의로 하나 또는 그 이상의 보조제는 바람직한 항원에 대해 지시된 면역 반응을 변경, 예컨대 유도 또는 증강시킬 수 있다.
열안정성 동결건조된 백신 조성물에 사용하기 위한 항원들
일부 구체예에서 열안정성 백신 조성물은 항원에 대한 숙주에서 면역반응성 또는 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위해 사용된다.
일부 구체예에서 항원은 자가면역 항원, 알레르기원 또는 암 항원과 같이 숙주에 이미 존재할 수 있고, 백신 조성물은 단지 투여될 때 대상에 이미 존재하는 항원에 대한 면역반응성을 유도하거나 증강시키는 안정한 에멀션 및 임의로 보조제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 것과 같이 숙주에 이미 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 이렇게 열안정성 동결건조된 에멀션 및 보조제를 포함하는 백신 조성물을 투여하는 것은 단일요법이다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 항원을 포함한다.
본원에 기술된 조성물 및 그런 조성물의 제조 및 사용 방법의 특정 구체예에 사용하기 위한 항원은 어떠한 표적 에피토프, 분자 (생체분자를 포함함), 분자 복합체 (생체분자들을 포함하는 분자 복합체를 포함함), 세포 이하의 어셈블리, 세포 또는 조직일 수 있고, 대상에서 그것들에 대한 면역반응성의 유도 또는 증강이 바람직하다. 자주, 항원이란 용어는 관심의 폴리펩티드 항원을 나타낼 것이다. 그러나, 본원에서 사용되는 항원은 또한 관심의 폴리펩티드 항원을 코드화하는 재조합 구성물 (예컨대 발현 구성물)을 나타낼 수 있다. 특정한 바람직한 구체예에서, 항원은 감염, 암, 자가면역 질병, 알레르기, 천식 또는 항원-특이적 면역 반응의 자극이 바람직하거나 유익할 수 있는 어떠한 다른 조건과 관련된 감염성 병원체 및/또는 에피토프, 생체분자, 세포 또는 조직이거나, 그것들로부터 유도될 수 있거나 또는 면역학적으로 교차-반응성인 것일 수 있다.
일부 구체예에서, 항원은 대상에서 원하는 수준으로 면역반응성을 유도하거나 증강시키기에 충분한 어떠한 농도로 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 2.5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 2.5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 2.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 2.5 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 약 2.5 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 2.5 μg/mL 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 1 μg/mL의 농도 범위로 존재할 수 있다. 제공된 농도는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션 제형 중의 또는 복원시 수-중-유 에멀션 중의 항원의 농도를 나타낸다.
특정 구체예에서 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신 조성물)은 인간 또는 다른 포유류 병원체에 맞서는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 포함하고, 그 항원 또는 항원성 조성물은 HIV-1로부터와 같은 바이러스 (예컨대 tat, nef, gp120 또는 gp160), 인간 허피스 바이러스, 예컨대 gD 또는 그것의 유도체 또는 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27과 같은 즉각 초기 단백질, 사이토메갈로바이러스 ((esp. 인간)(예컨대 gB 또는 그것의 유도체), 로타바이러스 (살아있는-약화된 바이러스를 포함함), 엡스타인 바르 바이러스 (예컨대 gp350 또는 그것의 유도체), 수두 대상포진 바이러스 (예컨대 gp1, II 및 IE63) 또는 B형 간염 바이러스 (예를 들면 B형 간염 표면 항원 또는 그것의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스로부터, 또는 다른 바이러스 병원체, 예컨대 파라믹소바이러스: 호흡기 합포체 바이러스 (예컨대 F 및 G 단백질 또는 그것들의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (예를 들면 HPV6, 11, 16, 18 등), 플라비바이러스 (예컨대 황색열 바이러스, 뎅기열 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스 (전체 바이러스 또는 비활성화된 바이러스, 분열 인플루엔자 바이러스, 난 또는 MDCK 세포에서 성장된, 또는 전체 플루 바이로좀 (Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920에 기술됨) 또는 그것의 정제되거나 재조합된 단백질, 예컨대 HA, NA 또는 M 단백질 또는 그것들의 조합)로부터 유도된 조성물을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신 조성물)은 인간 또는 다른 포유류 병원체에 맞서는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 포함하며, 그 항원 또는 항원성 조성물은 다음과 같은 하나 또는 그 이상의 박테리아 병원체로부터 유도된 조성물을 포함할 수 있다: 나이세리아 (Neisseria) 종, 이를테면 N, 고노레아 (N. gonorrhea) 및 N. 메닝기티디스 (N. meningitidis) (예를 들면 캡슐형 다당류 및 그것의 포합체, 트란스페린-결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 어드헤신); S. 피오게네스 (S. pyogenes) (예를 들면 M 단백질 또는 그것의 단편, C5A 프로테아제, 리포테이코산), S. 아갈락티아에 (S. agalactiae), S. 뮤탄스 (S. mutans): H. 듀크레이 (H. ducreyi); 모락셀라 (Moraxella) 종, 이를테면 브라나멜라 카타르할리스 (Branhamella catarrhalis)로도 알려져 있는 M. 카타르할리스 (M. catarrhalis) (예를 들면 고 및 저분자량 어드헤신 및 인베이신); 보르데텔라 (Bordetella) 종, 이를테면 B. 페르투시스 (B. pertussis) (예를 들면 페르탁틴, 백일해 독소 또는 그것의 유도체, 필라멘트형 헤마글루티닌, 아데닐레이트 사이클라제, 핌브리아), B. 파라페르투시스 (B. parapertussis) 및 B. 브론키셉티카 (B. bronchiseptica); 미코박테리움 종, 이를테면 M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) (예를 들면 ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), M. 보비스 (M. bovis), M. 레프라에 (M. leprae), M. 아비움 (M. avium), M. 파라투베르쿨로시스 (M. paratuberculosis), M. 스메그마티스 (M. smegmatis); 레지오넬라 (Legionella) 종, 이를테면 L. 뉴모필라 (L. pneumophila); 어셔리시아 (Escherichia) 종, 이를테면 내독소 대장균 (예를 들면 콜로니화 인자, 열-가변성 독소 또는 그것의 유도체, 열-안정성 독소 또는 그것의 유도체), 장출혈성 대장균, 장병원성 대장균 (예를 들면 시가 독소-유사 독소 또는 그것의 유도체); 비브리오 종, 이를테면 V. 콜레라 (예를 들면 콜레라 독소 또는 그것의 유도체); 시겔라 종, 이를테면 S. 소네이 (S. sonnei), S. 다이센테리아에 (S. dysenteriae), S. 플렉스네리이 (S. flexnerii); 예르시니아 (Yersinia) 종, 이를테면 Y. 엔테로콜리티카 (Y. enterocolitica) (예를 들면 Yop 단백질), Y. 페스티스 (Y. pestis), Y. 슈도투베르쿨로시스 (Y. pseudotuberculosis); 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 이를테면 C. 제주니 (C. jejuni) (예를 들면 독소, 어드헤신 및 인베이신) 및 C. 콜리 (C. coli); 살모넬라 종, 이를테면 S. 타이피 (S. typhi), S. 파라타이피 (S. paratyphi), S. 콜레라에수이스 (S. choleraesuis), S. 엔테리티디스 (S. enteritidis); 리스테리아 (Listeria) 종, 이를테면 L. 모노사이토게네스 (L. monocytogenes); 헬리코박터 종, 이를테면 H. 파이로리 (H. pylori) (예를 들면 우레아제, 카탈라제, 공포 (vacuolating) 독소); 슈도모나스 종, 이를테면 P. 아에루기노사 (P. aeruginosa); 스타필로쿠쿠스 종, 이를테면 S. 아우레우스 (S. aureus), S. 에피더미디스 (S. epidermidis); 엔테로코쿠스 종, 이를테면 E. 파에칼리스 (E. faecalis), E. 파에시움 (E. faecium); 클로스트리디움 종, 이를테면 C. 테타니 (C. tetani) (예를 들면 파상풍 독소 및 그것의 유도체), C. 보툴리눔 (C. botulinum) (예를 들면 보툴리눔 독소 및 그것의 유도체), C. 디피실 (C. difficile) (예를 들면 클로스트리디움 독소 A 또는 B 및 그것들의 유도체); 바실루스 종, 이를테면 B. 안트라시스 (B. anthracis) (예를 들면 보툴리눔 독소 및 그것의 유도체); 코리네박테리움 종, 이를테면 C. 디프테리아에 (C. diphtheriae) (예를 들면 디프테리아 독소 및 그것의 유도체); 보렐리아 (Borrelia) 종, 이를테면 B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi) (예를 들면 OspA, OspC, DDbpA, DbpB), B. 가리니이 (B. garinii) (예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 아프젤리이 (B. afzelii) (예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 안데르소니이 (B. andersonii) (예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 헤르미시이 (B. hermsii); 에를리시아 (Ehrlichia) 종, 이를테면 E. 에쿠이 (E. equi) 및 인간 과립구성 에를리히증의 병원체; 리케챠 종, 이를테면 R. 리케치이 (R. rickettsii); 클라미디아 종, 이를테면 C. 트라코마티스 (C. trachomatis) (예를 들면 MOMP, 헤파린-결합 단백질), C. 뉴모니아에 (C. pneumoniae) (예를 들면 MOMP, 헤파린-결합 단백질), C. 프시타치 (C. psittaci); 렙토스피라 (Leptospira) 종, 이를테면 L. 인테로간스 (L. interrogans); 트레포네마 (Treponema) 종, 이를테면 T. 팔리둠 (T. pallidum) (예를 들면 드문 외막 단백질), T. 덴티콜라 (T. denticola), T. 하이오다이센테리아에 (T. hyodysenteriae); 또는 다른 박테리아 병원체들.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신 조성물)은 인간 또는 다른 포유류 병원체에 맞서는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 포함하고, 그 항원 또는 항원성 조성물은 다음과 같은 하나 또는 그 이상의 기생충으로부터 유도된 조성물 (예컨대 John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia 참조): 플라스모디움 (Plasmodium) 종, 이를테면 P. 팔시파룸 (P. falciparum); 톡소플라스마 (Toxoplasma) 종, 이를테면 T. 곤디이 (T. gondii) (예를 들면 SAG2, SAG3, Tg34); 엔타모에바 (Entamoeba) 종, 이를테면 E. 히스톨리티카 (E. histolytica); 바베시아 (Babesia) 종, 이를테면 B. 마이크로티 (B. microti); 트리파노소마 (Trypanosoma) 종, 이를테면 T. 크루지 (T. cruzi); 기아르디아 (Giardia) 종, 이를테면 G. 람블리아 (G. lamblia); 레슈마니아 (Leshmania) 종, 이를테면 L. 메이저 (L. major); 뉴모시스티스 (Pneumocystis) 종, 이를테면 P. 카리니이 (P. carinii); 트리코모나스 종, 이를테면 T. 바기날리스 (T. vaginalis); 또는 예컨대 다음과 같이 포유류를 감염시킬 수 있는 기생충으로부터의 조성물을 포함할 수 있다: (i) 선충 감염 (이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 엔테로비우스 베르미큘라리스 (Enterobius vermicularis), 아스카리스 룸브리코이데스 (Ascaris lumbricoides), 트리큐리스 트리큐리아 (Trichuris trichuria), 네카토르 아메리카누스 (Necator americanus), 안실로스토마 두오데날레 (Ancylostoma duodenale), 부케레리아 반크로프티 (Wuchereria bancrofti), 브루기아 말라이 (Brugia malayi), 온코세르카 볼부루스 (Onchocerca volvulus), 드라칸쿨루스 메디넨시스 (Dracanculus medinensis), 트리키넬라 스피랄리스 (Trichinella spiralis) 및 스트론질로이데스 스테르코랄리스 (Strongyloides stercoralis)); (ii) 흡충 감염 (이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 스키스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni), 스키스토소마 헤마토비움 (Schistosoma haematobium), 스키스토소마 자포니쿰 (Schistosoma japonicum), 스키소토소마 메콩기 (Schistosoma mekongi), 오피스토르키스 시넨시스 (Opisthorchis sinensis), 파라고니무스 에스피 (Paragonimus sp), 파시올라 헤파티카 (Fasciola hepatica), 파시올라 마그나 (Fasciola magna), 파시올라 기간티카 (Fasciola gigantica)); 및 (iii) 촌총 감염 (이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 타에니아 사기나타 (Taenia saginata) 및 타에니아 솔리움 (Taenia solium). 그러므로 특정 구체예들은 스키소스토마 종, 스키스토소마 만소니이, 스키스토소마 헤마토비움 및/또는 스키스토소마 자포니쿰으로부터 유도되거나, 또는 C. 알비칸스를 포함한 칸디다 종; C. 네오포르만스를 포함한 크립토코쿠스 종과 같은 효모로부터 유도된 항원을 포함하는 백신 조성물을 고려할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 투베르쿨로시스 복합체의 미코박테리움 종의 적어도 2개의 이종성 폴리펩티드를 포함한다. 투베르쿨로시스 복합체의 미코박테리움 종은 전통적으로 결핵 질환을 유발하는 것으로 여겨지는 종들뿐 아니라, 면역 손상된 환자들, 예컨대 AIDS에 걸린 환자들에서 결핵 및 폐 질환을 유발하는 미코박테리움 환경적 및 기회적 종들, 예컨대 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mtb), 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 또는 미코박테리움 아프리카눔 (Mycobacterium africanum), BCG, 미코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 미코박테리움 인트라셀룰라레 (Mycobacterium intracellulare), 미코박테리움 셀라툼 (Mycobacterium celatum), 미코박테리움 게나벤스 (Mycobacterium genavense), 미코박테리움 헤모필룸 (Mycobacterium haemophilum), 미코박테리움 칸자시이 (Mycobacterium kansasii), 미코박테리움 시미아에 (Mycobacterium simiae), 미코박테리움 바카에 (Mycobacterium vaccae), 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum) 및 미코박테리움 스크로풀라세움 (Mycobacterium scrofulaceum)을 포함한다 (예컨대 Harrison's Principles of Internal Medicine, volume 1, pp. 1004-1014 및 1019-1020 참조). 미코박테리움 종으로부터의 항원들의 서열은 쉽게 입수가능하다. 예를 들어, 미코박테리움 투베르쿨로시스 서열은 Cole et al., Nature 393:537 (1998)에서 찾아볼 수 있고, Wellcome Trust, Sanger Institute and Institut Pasteur에 의해 유지되는 것과 같은 웹사이트에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기술된 조성물에 사용될 수 있는 M. 투베르쿨로시스에 대한 다른 특이적인 항원들은 예를 들면 Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1 (WO 99/51748)이다. M. 투베르쿨로시스에 대한 단백질은 또한 M. 투베르쿨로시스의 적어도 2, 바람직하게는 3개의 폴리펩티드가 더 큰 단백질에 융합되는 융합 단백질 및 그것의 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99151748)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 항원들은 US 2010/0129391 및 WO 2008/124647에 기술된 항원들, 항원들의 조합 및 융합 단백질을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 둘 또는 그 이상의 공유적으로 연결된 M. 투베르쿨로시스 항원들 또는 그것들의 면역원성 단편들의 조합을 포함하는 분리된 융합 단백질을 포함하며, 이때 항원들은 Rv0164, Rv0496, Rv2608, Rv3020, Rv3478, Rv3619, Rv3620, Rv1738, Rv1813, Rv3810, Rv2389, Rv2866, Rv3876, Rv0054, Rv0410, Rv0655, Rv0831, Rv1009, Rv1099, Rv1240, Rv1288, Rv1410, Rv1569, Rv1789, Rv1818, Rv1860, Rv1886, Rv1908, Rv2220, Rv2032, Rv2623, Rv2875, Rv3044, Rv3310, Rv3881, Rv0577, Rv1626, Rv0733, Rv2520, Rv1253, Rv1980, Rv3628, Rv1884, Rv3872, Rv3873, Rv1511 및 Rv3875로 구성되는 군으로부터 선택되고, 전술한 서열들 중 어느 것에 대해서든 적어도 90%의 동일성을 가진다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 항원 Rv2608, Rv3619, Rv3620 및 Rv1813 또는 항원들의 조합에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 ID93 융합 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 항원 Rv2608, Rv3619, Rv3620 및 Rv1813을 포함하는 ID93 융합 단백질을 포함하고, 이대 항원들의 서열은 M. 투베르쿨로시스로부터 유래된다. 다른 구체예에서, ID93 융합 단백질은 SEQ ID NO:1에 표시된 서열 또는 그것에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:2에 표시된 서열 또는 그것에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료용 백신은 미코박테리움 항원 Rv2608, Rv3620 및 Rv1813의 조합 또는 항원들의 조합에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 미코박테리움 항원 Rv2608, Rv3620 및 Rv1813은 M. 투베르쿨로시스 항원 Rv2608, Rv3620 및 Rv1813이다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:3 또는 4에 표시된 서열 또는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 Rv1813은 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 Rv3620은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 Rv2608은 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 Rv3619는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함한다. 당업자는 하나 또는 그 이상의 N-말단 아미노산 (예컨대 신호 서열)이 제거될 수 있을 것임을 인지할 수 있을 것이다. 이들 서열은 본원에 참조로 포함되는 US 8,486,414에 기술된다.
일부 구체예에서, 조성물은 US 특허 출원 공보 번호 2010/0129391 (전체 내용이 구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 것과 같이, 독성과 관련된 Mtb 단백질 (Rv2608, Rv3619, Rv3620) 또는 잠복기에 관련된 Mtb 단백질 (Rv1813) 패밀리에 속하는 4개의 항원을 포함하는 ID93 융합 단백질 또는 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 클라미디아 속에 대한 항원을 포함한다. 글라미디아 속에 대한 항원들은 예를 들면 고분자량 단백질 (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412) 및 추정되는 막 단백질 (Pmps)을 포함한다. 조성물의 다른 클라미디아속 항원들은 WO 99128475에 기술된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 S. 뉴모니아에를 포함하여 스트렙토코쿠스 종으로부터 유도된 항원들 (예를 들면 캡슐형 다당류 및 그것들의 포합체, PsaA, PspA, 스트렙토라이신, 콜린-결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴모라이신 (Pneumolysin) (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) 및 그것의 돌연변이인 독성제거된 유도체 (WO 90/06951; WO 99/03884)를 포함한다. 다른 박테리아 항원들은 H. 인플루엔자 타입 B (예를 들면 PRP 및 그것의 포합체), 타입화될 수 없는 H. 인플루엔자를 포함하여 헤모필루스 종으로부터 유도되는데, 예를 들면 OMP26, 고분자량 어드헤신, P5, P6, 단백질 D 및 리포단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 유도된 펩티드 (미국 특허 번호 5,843,464호) 또는 그것의 다중 복사물 변이체 또는 융합 단백질이 있다.
B형 간염 표면 항원의 유도체들은 기술분야에 잘 알려져 있고, 그 중에서도 유럽 특허 출원 EP-A414 374; EP-A-0304 578 및 EP 198474에 표시된 PreS1, Pars2 S 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 특히 CHO 세포에서 발현될 때 HIV 항원, gp120을 포함한다. 추가의 구체예에서, 조성물은 상기에서 정의된 gD2t를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 생식기 혹의 원인이 되는 것으로 여겨지는 인간 유두종 바이러스 (HPV) (HPV6 또는 HPV11 및 기타), 및 자궁경부암의 원인인 HPV 바이러스 (HPV16, HPV18 및 기타)로부터 유도된 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 L1 입자 또는 캡소머를 포함하는 생식기 혹 예방 또는 치료 백신, 및 HPV 6 및 HPV 11 단백질 E6, E7, L1 및 L2로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 형태의 융합 단백질은 WO 96/26277에 개시된 L2E7, 및 GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285)에 개시된 단백질D(1/3)-E7을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 HPV 16 또는 18 항원을 포함하는, HPV 자궁경부 감염 또는 암 예방 또는 치료 백신이다. 예를 들어, L1 또는 L2 항원 단량체, 또는 L1 또는 L2 항원은 바이러스 유사 입자 (VLP)로서 함께 제공되거나 또는 L1 단독 단백질이 VLP 또는 캡소머 구조로 단독으로 제공된다. 그런 항원, 바이러스 유사 입자 및 캡소머는 그 자체로 공지되어 있다. 예를 들면 WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 및 WO93/02184 참조.
추가의 초기 단백질은 단독으로 또는 E7, E2 또는 바람직하게는 예를 들면 F5와 같은 융합 단백질로서 포함될 수 있다; 일부 구체예는 L1E7 융합 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다 (WO 96/11272). 일부 구체예에서, HPV 16 항원은 HPV 16으로부터의 단백질 D-E6 또는 E7 융합 또는 그것의 조합물; 또는 E6 또는 E7과 L2와의 조합물 (WO 96/26277)을 형성하기 위하여 초기 단백질 E6 또는 E7을 단백질 D 담체와 융합된 상태로 포함한다. 다르게는 HPV 16 또는 18 초기 단백질 E6 및 E7은 단일 분자로, 바람직하게는 단백질 D-E6/E7 융합물로 제공될 수 있다. 그런 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신 조성물)은 임의로 HPV 전면에 E6 및 E7 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다를, 바람직하게는 단백질 D-E6 또는 단백질 D-E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 추가로 다른 HPV 스트레인, 바람직하게는 스트레인 HPV 31 또는 33으로부터의 항원들을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가로 말라리아를 유발하는 기생충으로부터 유도된 항원들을 포함할 수 있다. 예를 들어 플라스모디아 팔시파룸으로부터의 항원들은 RTS,S 및 TRAP를 포함한다. RTS는 B형 간염 바이러스의 표면 (S) 항원에 B형 간염 표면 항원의 preS2 부분의 4개의 아미노산을 통해 연결된 P. 팔시파룸의 서컴스포로조이트 (CS) 단백질의 실질적으로 모든 C-말단 부분을 포함하는 하이브리드 단백질이다. 그것의 전체 구조는 UK 특허 출원 번호 9124390.7호로부터의 우선권을 주장하는 WO 93/10152로서 공개된, 국제 특허 출원 번호 PCT/EP92/02591호에 개시된다. 효모에서 발현될 때 RTS는 리포단백질 입자로서 생성되고, HBV로부터의 S 항원과 공동-발현될 때 RTS,S로서 알려져 있는 혼합된 입자를 생성한다.
TRAP 항원은 WO 90/01496으로서 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/GB89/00895에 기술되어 있다. 본 발명의 구체예는 항원 제제가 RTS,S 및 TRAP 항원의 조합을 포함하는 말라리아 백신이다. 다단계 말라리아 백신의 성분들인 것으로 보이는 후보들인 다른 플라스모디아 항원들은 P. 팔시파룸 MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 그것들의 플라스모디움 종 에서의 유사체들이다.
본원에 개시된 특정 구체예는 M. 투베르쿨로시스 또는 M. 레프라에 또는 다른 미코박테리움과 같은 악티노박테리움; 살모넬라, 나이세리아, 보렐리아, 클라미디아 또는 보르데텔라 속의 구성원과 같은 박테리움; 허피스 심플렉스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 사이토메갈로바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 간염 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 호흡기 합포체 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 사이토메갈로바이러스; HIV-1 또는 HIV-2와 같은 HIV; 아스페르길루스, 블라스토마이세스, 코키다이오이드 및 뉴모시스티 또는 효모와 같은 진균, 이를테면 칸디다 종, 예컨대 C. 알비칸스, C. 글라브라타, C. 크루세이, C. 루시타니아에, C. 트로피칼리스 및 C. 파라프실로스; 원충, 예를 들면 P. 팔시파룸, P. 비박스, P. 말라리아에 및 P. 오베일을 포함한 플라스모디움 종과 같은 기생충; 또는 또 다른 기생충, 예컨대 아칸트아메바 (Acanthamoeba), 엔타메바 히스토라이티카 (Entamoeba histolytica), 안지오스트롱길루스 (Angiostrongylus), 쉬스토소마 만소니이 (Schistosoma mansonii), 쉬스토소마 헤마토비움 (Schistosoma haematobium), 쉬스토소마 자포니쿰 (Schistosoma japonicum), 크립토스포리디움 (Cryptosporidium), 안실로스토마 (Ancylostoma), 엔타메바 히스토라이티카 (Entamoeba histolytica), 엔타메바 콜리 (Entamoeba coli), 엔타메바 디스파르 (Entamoeba dispar), 엔타메바 하트만니 (Entamoeba hartmanni), 엔타메바 폴렉키 (Entamoeba polecki), 부케레리아 반크로프티 (Wuchereria bancrofti), 기아르디아 (Giardia) 및 레슈마니아 (Leishmania) 중 하나 또는 그 이상과 같은 박테리아, 바이러스 또는 진균과 같은 적어도 하나의 감염성 병원체로부터 유도된 항원을 고려한다.
예를 들면, 보렐리아 종으로부터 유도된 항원들을 함유하는 조성물의 구체예에서, 항원은 핵산, 병원체 유도된 항원 또는 항원 제제, 재조합적으로 제조된 단백질 또는 펩티드 및 키메라 융합 단백질을 포함할 수 있다. 한 가지 그런 항원은 OspA이다. OspA는 숙주 세포에서 그것의 생합성에 의해 지질화된 형태의 전체 성숙한 단백질이거나 (리포-OspA) 또는 다르게는 비-지질화된 유도체일 수 있다. 그런 비-지질화된 유도체는 인플루엔자 바이러스의 비-구조적 단백질 (NS1)의 처음 81개의 N-말단 아미노산을 가지는 비-지질화된 NS1-OspA 융합 단백질 및 완전 OspA 단백질을 포함하고, 다른, MDP-OspA는 3개의 추가의 N-말단 아미노산을 운반하는 OspA의 비-지질화된 형태이다.
본원에 기술된 감염성 병원체로 감염되었거나, 감염될 위험이 있는 것으로 예상되는 대상을 확인하기 위한 조성물 및 방법이 기술분야에 공지되어 있다.
예를 들어, 박테리움인 미코박테리움 투베르쿨로시스는 결핵 (TB)을 유발한다. 그 박테리아는 보통 폐를 공격하지만 또한 신장, 척수 및 뇌를 공격할 수도 있다. 만약 적절하게 치료되지 않는다면, TB 질환은 치명적일 수 있다. 그 질환은 감염된 사람이 재채기 또는 기침을 할 때 공기 중에서 한 사람으로부터 다른 사람으로 확산된다. 2003년도에, 미국에서 14,000 사례 이상의 TB가 보고되었다.
비록 결핵이 일반적으로는 연장된 항생물질 요법을 사용하여 제어될 수 있긴 하지만, 그런 처치는 질환의 확산을 예방하기에는 불충분하고 항생물질-내성 균주에 대한 잠재적 선택과 관련된 관심들이 존재한다. 감염된 개인은 증상이 없을 수도 있지만, 한동안은 전염성일 수 있다. 또한, 비록 처치 양생법을 따르는 것이 중요하긴 하지만, 환자의 행동방식을 모니터링하는 것은 어렵다. 일부 환자는 처치 과정을 완수하지 않는데, 그것은 비효율적인 처치 및 약물 내성의 발달을 유도할 수 있다 (예컨대 미국 특허 7,087,713호).
현재, 생박테리아를 사용한 백신 접종이 결핵에 맞서 보호성 면역을 유도하기에 가장 효과적인 방법이다. 이 목적에 대해 사용된 가장 흔한 미코박테리움은 미코박테리움 보비스의 무독성 균주인 바실루스 칼메트-게랭 (BCG)이다. 그러나, BCG의 안전성 및 효능은 논란의 근원이고 일부 국가, 예컨대 미국은 일반 대중을 예방접종하지 않는다. 진단은 통상 피부 시험을 통해 이루어지는데, 그것은 투베르쿨린 PPD (단백질-정제된 유도체)에 대한 피내 노출을 포함한다. 항원-특이적 T 세포 반응은 주사 후 48 내지 72시간 내에 주사 부위에서 측정가능한 경화를 초래하고, 그것은 미코박테리아 항원에 대한 노출을 가리킨다. 그러나 민감성 및 특이성이 이 시험에 대한 문제가 되었고, BCG로 예방 접종된 개인들은 감염된 개인들과 구별할 수 없었다 (예컨대 미국 특허 7,087,713).
마크로파지들은 M. 투벨르쿨로시스 면역의 원칙적인 이펙터로서 작용하는 것으로 밝혀진 한편으로, T 세포는 그런 면역의 우세한 인듀서이다. M. 투베르쿨로시스 감염에 대한 보호에서 T 세포의 본질적인 역할은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염과 관련된 CD4 T 세포의 고갈로 인한, AIDS 환자에서 M. 투베르쿨로시스의 빈번한 발생에 의해 예시된다. 미코박테리움-반응성 CD4 T 세포는 감마-인터페론 (IFN-감마)의 강력한 생성자인 것으로 밝혀졌고, 그것은 계속해서 마우스에서 마크로파지의 항-미코박테리아 효과를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 인간에서 IFN-감마의 역할이 덜 분명한 한편으로, 연구 결과 1,25-다이하이드록시-비타민 D3은 단독으로 또는 IFN-감마 또는 종양 괴사 인자-알파와 함께 M. 투베르쿨로시스 감염을 억제하기 위해 인간 마크로파지를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 나아가, IFN-감마는 인간 마크로파지를 자극하여 1,25-다이하이드록시-비타민 D3을 만드는 것으로 알려져 있다. 유사하게, IL-12는 M. 투베르쿨로시스 감염에 대한 내성을 자극하는데 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. M. 투베르쿨로시스 감염의 면역학의 개관에 대해서는 Chan and Kaufmann, in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press. Washington, D.C. (1994)를 참조한다.
결핵을 진단하거나 또는 결핵에 대한 보호성 면역을 유도하기 위한 기존의 화합물 및 방법은 하나 또는 그 이상의 미코박테리움 단백질의 적어도 하나의 면역원성 부분을 함유하는 폴리펩티드 및 그런 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 분자의 사용을 포함한다. 그런 폴리펩티드 또는 DNA 서열 및 적합한 검출 시약을 함유하는 진단용 키트는 환자 및 생물학적 샘플에서 미코박테리움 감염의 검출을 위해 사용될 수 있다. 그런 폴리펩티드에 대해 지시된 항체들 또한 제공된다. 또한, 그런 화합물들은 미코박테리움 감염에 대한 면역화를 위해 본원에 기술된 조성물로 제형될 수 있다 (미국 특허 번호 6,949,246 및 6,555,653).
말라리아는 1960년대에 전 세계의 많은 지역에서 제거되었지만, 그 질환은 여전히 계속되고 기존의 약물에 내성을 보이는 질환의 새로운 균주들이 출현하고 있다. 말라리아는 90개국 이상의 나라에서 중요한 대중 건강 문제이다. 말라리아의 10개 사례 중 9개가 사하라 사막 이남에서 발생한다. 전 세계 인구의 1/3 이상이 말라리아에 걸릴 위험이 있고, 3억 5천 만명 내지 5억명이 해마다 말라리아에 감염된다. 올해에는 4억 5천만명의 임산부가 말라리아와 접촉될 위험이 있다. 이미 감염된 개인 중에서 해마다 백만명 이상의 감염된 사람들이 예방할 수 있는 질환으로 사망한다. 아프리카에서 사망하는 사람들의 대부분은 어린이이다.
말라리아는 보통 사람이 감염된 암컷 아노펠레스 (Anopheles) 모기에 물렸을 때 전염된다. 전염시키기 위하여 모기는 이미 말라리아로 감염된 사람으로부터의 혈액을 흡혈함으로써 감염되어 있어야 한다. 말라리아는 기생충에 의해 유발되고 질환의 임상적 증상은 열 및 독감과 유사한 아픔, 예컨대 오한, 두통, 근육통 및 피로를 포함한다. 이들 증상은 구역질, 구토 및 설사를 동반한다. 말라리아는 또한 적혈구의 손실 때문에 빈혈 및 황달을 유발할 수 있다. 말라리아의 한 유형, 플라스모디움 팔시파룸으로의 감염은 적절하게 치료되지 않는다면 신부전, 발작, 정신적 혼란, 혼수상태 및 사망을 유발할 수 있다.
개인으로부터의 조직 또는 생물학적 유체를 분자 또는 폴리펩티드 조성물과, 시험관 내 면역학적 반응이 상기 조성물과 조직 또는 생물학적 유체에 존재할 수 있는 항체들 사이에서 일어나는 것과 형성된 항원-항체 복합체의 시험관 내 검출을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함하는, 개인의 말라리아에 대한 시험관 내 진단 방법은 알려져 있고, 이때 상기 분자 또는 폴리펩티드 조성물은 P. 팔시파룸의 감염섬 활성으로부터 유발되는 단백질들의 하나 또는 그 이상의 T 에피토프의 전부 또는 일부를 포함하는 하나 또는 그 이상의 펩티드 서열을 포함한다 (예컨대 미국 특허 제 7,087,231호 참조).
재조합 팔스모디움 팔시파룸 (3D7) AMA-1 엑토도메인의 발현 및 정제는 기술되어 있다. 이전의 방법들로는 천연 분자의 접힘 및 이황화 가교를 보유하는 고도로 정제된 단백질이 제조되었다. 재조합 AMA-1은 항체 제조에서뿐 아니라, 말라리아를 방지하기 위하여 단독으로 사용하기 위한 단백질로서 또는 백신의 일부로서, 진단 시약으로서 유용하다 (미국 특허 제 7,029,685호).
감염 후 취약한 포유류 숙주의 혈장으로 분비되는 단백질 또는 단백질의 단편들인 종-특이적 P. 비박스 말라리아 펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 이들 항원에 대한 단클론성 또는 다클론성 항체를 가지는 것으로 기술분야에 기술되어 왔다. 펩티드 항원, 단클론성 항체 및/또는 다클론성 항체는 말라리아를 진단하기 위해서뿐 아니라, 플라스모디움 비박스가 감염의 원인이 되는 종인지 아닌지를 측정하기 위해 사용된 분석에서 활용된다 (미국 특허 제 6,706,872호). 종-특이적 P. 비박스 말라리아 펩티드 항원은 또한 감염 후 취약한 포유류 숙주의 혈장으로 분비된 단백질 또는 단백질의 단편이고, 이들 항원에 대해 지시된 단클론성 또는 다클론성 항체를 가지는 것으로서 보고되었다. 펩티드 항원, 단클론성 항체 및/또는 다클론성 항체는 말라리아를 진단하기 위해서뿐 아니라, 플라스모디움 비박스가 감염의 원인이 되는 종인지 아닌지를 측정하기 위해 사용된 분석에서 활용된다 (에컨대 미국 특허 제 6,231,861호 참조).
재조합 플라스모디움 팔시파룸 (3D7) AMA-1 엑토도메인은 또한 천연 분자의 접힘 및 이황화 가교를 보유하는 고도로 정제된 단백질을 제조하는 방법에 의해 발현되었다. 재조합 AMA-1은 진단 시약으로서, 항체 제조에 사용하기 위해 및 백신으로서 유용하다 (미국 특허 제 7,060,276호). 유사하게, 천연 분자의 접힘 및 이황화 가교를 보유하는, 재조합 플라스모디움 팔시파룸 (3D7) MSP-142의 발현 및 정제가 공지되어 있다. 재조합 MSP-142는 진단 시약으로서, 항체 제조에 사용하기 위해 및 백신으로서 유용하다 (미국 특허 제 6,855,322호).
그러므로 말라리아 감염성 병원체로 감염되었거나 감염될 위험이 있는 것으로 의심되는 대상을 확인하기 위해 인간 말라리아 감염의 검출을 위한 진단 방법이 이들 및 관련된 개시내용에 따라 알려져 있다. 구체적으로, 예를 들면, 혈액 샘플이 3-아세틸 피리딘 아데닌 다이뉴클레오티드 (APAD), 기질 (예컨대 락테이트 염 또는 락트산) 및 완충제를 함유하는 시약과 조합된다. 시약은 말라리아 기생충에 의해 생성된 독특한 당분해 효소의 존재를 검출하기 위해 디자인된다. 이 효소는 기생충 락트산 탈수소효소 (PLDH)로서 알려져 있다. PLDH는 상기-기술된 시약을 사용하여 숙주 LDH와 쉽게 구별될 수 있다. 시약과 기생된 혈액 샘플과의 조합은 APAD의 환원을 초래한다. 그러나, APAD는 숙주 LDH에 의해서는 환원되지 않는다. 그런 다음 환원된 APAD는 스펙트럼, 형광측정, 전기영동 또는 비색 분석을 포함하여 다양한 기법에 의해 검출될 수 있다. 전술한 방식으로 환원된 APAD의 검출은 말라리아 감염의 양성 지표를 제공한다 (예컨대 미국 특허 제 5,124,141호). 말라리아를 진단하기 위한 또 다른 방법론에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원 GLURP로부터 유도된 특징적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 그 폴리펩티드에 대해 발생된 또는 그것과 반응하는 특이적 항체에 의해 시험 샘플에서 인식된다 (미국 특허 제 5,231,168호).
레슈마니아증은 인도 아대륙, 아프리카 및 라틴 아메리카에서 빈번하게 유행되는 광범위하게 퍼져 있는 기생충 질환이고 백신 개발에 대해 세계 보건 기구가 우선권을 가지고 있다. 상이한 질환들의 복합체인 레슈마니아 기생충은 내부 조직의 치명적인 감염뿐 아니라 심각한 피부 질환을 유발한다. 레슈마니아증의 가장 파괴적인 형태 중 하나는 코와 입을 망가뜨리는 감염이다. 레슈마니아증의 사례 수는 증가하고 있고, 현재 많은 지역에서 통제를 벗어나 있다. 레슈마니아증은 또한 일부 선진국에서도 발생하는데, 구체적으로 HIV 감염의 결과로서 서유럽에서 발생한다. 활용 가능한 약물은 독성이고, 고가이며, 장기간의 매일 주사를 필요로 한다.
레슈마니아는 면역 시스템의 마크로파지 또는 백혈구에 기생하는 원생동물류 기생충이다. 그 기생충은 작은 흡혈 곤충 (응애)에 물림으로써 전염되는데, 그것은 지구상의 전역에서 서식하기 때문에 제어가 어렵다.
내장 레슈마니아증은 3가지의 질환 징후가 있을 때 가장 위험하다. 매년 약 500,000건의 새로운 내장 형태 (칼라아자르 또는 "치명적 질환")가 발생하는 것으로 추정된다. 2억명 이상의 사람들이 현재 내장 레슈마니아증에 걸릴 위험이 있다. 내장 레슈마니아증 사례의 90% 이상이 인도, 방글라데시아, 수단, 브라질 및 네팔에서 발생한다. 사망자의 대부분은 어린이이다. 피부 형태로 발병된 사람들은 보통 영구적으로 뭉겨진 채로 살아간다.
레슈마니아 감염은 진단이 어렵고 전형적으로 조직 생검 시편의 조직학적 분석을 포함한다. 그러나 여러 혈청학적 및 면역학적 진단 분석이 개발되어 있다. (미국 특허 7,008,774호; Senaldi et al., (1996) J. Immunol. Methods 193:9 5; Zijlstra, et al., (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91:671 673; Badaro, et al., (1996) J. Inf. Dis. 173:758 761; Choudhary, S., et al., (1992) J. Comm. Dis. 24:32 36; Badaro, R., et al., (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg. 35:72 78; Choudhary, A., et al., (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84:363 366; and Reed, S. G., et al., (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43:632 639). 전편모충은 대사산물을 배양 배지로 방출하여 조건 배지를 생성한다. 이들 대사산물은 숙주에 대해 면역원성이다 (Schnur, L. F., et al., (1972) lsrl. J. Med. Sci. 8:932 942; Sergeiev, V. P., et al., (1969) Med. Parasitol. 38:208 212; El-On, J., et al., (1979) Exper. Parasitol. 47:254 269; and Bray, R. S., et al., (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605 609; 미국 특허 번호 제 6,846,648호, 미국 특허 제 5,912,166호; 미국 특허 제 5,719,263호; 미국 특허 제 5,411,865호 참조).
일부 구체예에서, 항원은 US 2009/0041798, US 2009/0291099, US 8,410,258, US 8,231,881 및 WO 2012/064659 (이것들은 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 레슈마니아 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 적어도 레슈마니아 스테롤 24-c-메틸트란스페라제 (SMT) 폴리펩티드 서열 및 레슈마니아 비-특이적 뉴클레오시드 하이드롤라제 (NH) 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 레슈마니아 NH 폴리펩티드 서열은 L. 도노바니, L. 인판툼 및 L. 메이저의 레슈마니아 NH 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열의 적어도 면역원성 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 레슈마니아 NH 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:1, 3 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열 또는 그것에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열의 적어도 면역원성 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 레슈마니아 SMT 폴리펩티드 서열은 L. 도노바니, L. 인판툼 및 L. 메이저의 레슈마니아 SMT 서열에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열의 적어도 면역원성 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 레슈마니아 SMT 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:7, 9 및 11로 구성된 군으로부터 선택된 서열 또는 그것에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열의 적어도 면역원성 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO:13에 표시된 아미노산 서열 또는 그것에 대해 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13의 서열은 본원에 참조로 포함되는 WO 2012/064659 및 US 20120114688에 제공된다.
전 세계적으로 약 4천만의 사람들이 AIDS를 유발하는 바이러스인 HIV로 감염된다. 대략 3백만의 사람들이 해마다 이 질환으로 사망하고, 그들 중 95%가 개발도상국의 사람들이다. 해마다, 5백만에 가까운 사람들이 HIV로 감염된다. 현재, 사하라사막 이남의 아프리카에서 질환이 가장 많이 발생하지만, 인도, 중국 및 러시아와 같은 다른 나라들에도 빠르게 확산되고 있다. 유행병은 소수 집단 중에서 가장 빠르게 늘어가고 있다. 미국에서는 1981년 이래로 950,000건 이상의 AIDS가 보고되었다. AIDS는 사람들이 가장 생산활동이 왕성한 시기에 사람들을 강타한다. 생물학적 및 사회적 이유 둘 다로, 여성들은 HIV/AIDS에 걸릴 위험이 증가하고 있다.
AIDS는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의해 유발되는데, 그 바이러스는 신체의 면역 시스템의 세포들을 사멸시키고 손상을 입히며 점진적으로 신체가 감염 및 특정 암에 대해 싸우는 능력을 파괴한다. HIV는 가장 흔하게는 감염된 파트너와의 무방비한 성관계를 가짐으로써 확산된다. 그 문제에 대한 가장 강력한 해결책은 바이러스가 확산되는 것을 방지하는 것이다. 안전하고, 효과적이며, 입수 가능한 HIV 백신을 만드는 것이 이 목표를 달성할 수 있는 한 가지 방법이다. 전 세계적으로, HIV 감염 위험이 높은 5명의 사람에서 1명 이하로 효과적인 예방이 가능하다.
바이러스 배양, 환자 시편으로부터의 한정적인 핵산 서열의 PCR 및 환자 혈청 중의 항-HIV 항체의 존재에 대한 항체 시험을 포함하는, HIV 감염을 진단하기 위한 방법은 알려져 있다 (예컨대 미국 특허 제 6,979,535호, 제 6,544,728호, 제 316,183호, 제 6,261,762호, 제 4,743,540호 참조).
본원에 개시된 특정한 다른 구체예에 따르면, 조성물 및 사용 방법은 암의 면역요법 치료에 유용할 수 있어서 암세포로부터 유도된 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어 조성물은 전립선, 유방, 직장, 폐, 췌장, 신장 및 흑색종 암에 대한 것과 같은 종양 거부 항원을 사용하여 유용할 수 있다. 예시적인 암 또는 암세포-유도된 세포들은 MAGE 1, 3 및 MAGE 4 또는 예컨대 WO99/40188에 개시된 것들과 같은 다른 MAGE 항원, PRAME, BAGE, Lage (또한 NY Eos 1로도 알려져 있음) SAGE 및 HAGE (WO 99/53061) 또는 GAGE (Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293)를 포함한다. 이들 암 항원의 비-제한적인 실례들은 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종과 같은 광범위한 종양 유형에서 나타난다. 예컨대 미국 특허 제 6,544,518호 참조.
다른 종양-특이적 항원들은 본원에 기술된 조성물에 사용하기에 적합하며, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 종양-특이적 또는 종양-결합된 강글리오시드, 예컨대 GM2 및 GM3 또는 그것들의 담체 단백질에의 포합체를 포함하고; 또는 항암 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 GLA 백신 조성물에 사용하기 위한 항원은 많은 암의 치료에 유용한, 짧은 10개 아미노산 길이의 펩티드인 전체 길이 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬 (GnRH, WO 95/20600)과 같은 자체 펩티드 호르몬일 수 있다. 다른 구체예에서, 전립선 항원, 예컨대 전립선 특이적 항원 (PSA), PAP, PSCA (예컨대 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), PSMA가 사용되거나, 또는 바람직한 구체예에서, 프로스타제로 알려진 항원이 사용된다 (예컨대 Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119; WO 98/12302; 미국 특허 제 5,955,306호; WO 98/20117; 미국 특허 제 5,840,871호 및 5,786,148호; WO 00/04149). 다른 전립선 특이적 항원들은 WO 98/137418 및WO/004149로부터 알려져 있다. 또 다른 것은 STEAP이다 (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).
본 발명의 맥락에서 유용한 다른 종양 관련 항원들은 다음을 포함한다: Plu -1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70, U.S. Pat. No. 5,654,140) 및 크립틴 (미국 특허 제 5,981,215호). 추가로, 암 치료법에서 백신에 특히 관련된 항원들은 또한 티로시나제 및 서바이빈 (survivin)을 포함한다.
암 항원을 포함하는 조성물에 속하는 본원에 개시된 구체예들은 종양 관련 항원 발현, 예컨대 HER--2/neu 발현 또는 다른 암-특이적 또는 암-관련 항원을 특징으로 하는 어떠한 암에 대해서든 유용할 수 있다.
암에 걸렸거나 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 추정되는 대상에서 암의 진단은 기술분야에서 허용된 광범위한 방법들 중 어느 것에 의해서든 이루어질 수 있고, 그것들은 임상적 표시, 암의 진전 정도, 암의 유형 및 다른 인자들을 포함한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 암 진단의 실례는 환자 샘플 (예컨대 혈액, 피부 생검, 다른 조직 생검, 수술적 시편 등)의 조직병리학적, 조직세포화학적, 면역조직세포화학적 및 면역조직병리학적 검사, 규정된 유전적 (예컨대 핵산) 마커에 대한 PCR 시험, 순환하는 암-관련 항원 또는 그런 항원을 포함하고 있는 세포들에 대한 또는 규정된 특이성을 가진 항체들에 대한 혈청학적 검사, 또는 기술분야의 숙련자들이 친숙할 다른 방법들을 포함한다. 예컨대 미국 특허 제 6,734,172호; 제 6,770,445호; 제 6,893,820호; 제 6,979,730호; 제 7,060,802호; 제 7,030,232호; 제 6,933,123호; 제 6,682,901호; 제 6,587,792호; 제 6,512,102호; 제 7,078,180호; 제 7,070,931호; JP5-328975; Waslylyk et al., 1993 Eur. J Bioch. 211(7):18 참조.
본 발명의 특정 구체예들에 따르는 조성물 및 방법들은 또한 숙주 또는 대상의 면역시스템이 "자체" 조직, 세포, 생체분자 (예컨대 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 당단백질, 리포단백질, 단백지질, 지질, 당지질, RNA 및 DNA와 같은 핵산, 올리고당류, 다당류, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 등, 및 대상 세포 및 조직의 다른 분자 성분들) 또는 에피토프 (예컨대 항체 가변 영역 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 또는 T 세포 수용체 CDR에 의해 인식된 것과 같은 특이한 면역학적으로 규정된 인식 구조)에 대해 지시된 면역 반응을 해롭게 중재하는 질환, 상태 또는 장애를 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료법에 사용될 수 있다.
그러므로 자가면역 질환은 정상적인 자기유래 조직에 대해 지시된 어느 한 경우인 세포 또는 항체 중 어느 하나를 포함하는 비정성적인 면역 반응을 특징으로 한다. 포유류에서 자가면역 질환은 일반적으로 두 가지의 상이한 범주: 세포-중재된 질병 (즉 T-세포) 또는 항체-중재된 장애 중 하나로 분류될 수 있다. 세포-중재된 자가면역 질환의 비-제한적인 실례는 다발성 경색, 류머티스성 관절염, 하시모토 갑상선염, 1형 진성 당뇨병 (청소년기 개시 당뇨병) 및 자가면역 우보레티니티스 (uvoretinitis)를 포함한다. 항체-중재된 자가면역 장애는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스 (또는 SLE), 그레이브즈병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 자가면역 천식, 저온글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 원발성 담즙관 경화 및 악성 빈혈을 포함한다. 전신성 홍반성 루푸스와 관련된 항원(들)은 작은 핵 리보핵산 단백질 (snRNP)이고; 그레이브즈병과 관련된 항원(들)은 갑상선 자극 호르몬 수용체, 타이로글로불린 및 갑상선 상피 세포들의 다른 성분들이며 (Akamizu et al., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997; 및 Texier et al., 1992); 천포창과 관련된 항원(들)은 카데린-유사 천포창 항원, 예컨대 데스모들레인 3 및 다른 어드헤신 분자들 (Memar et al., 1996: Stanley, 1995; Plott et al., 1994; and Hashimoto, 1993)이고; 혈전성 혈소판감소성 자반병과 관련된 항원(들)은 혈소판 항원들이다. (예컨대 미국 특허 제 6,929,796호; Gorski et al. (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch and Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY 참조).
자가면역성은 1형 당뇨병, 다발성 경색, 루푸스, 류머티스성 관절염, 경피증 및 갑상선 질환을 포함하여 80가지 이상의 상이한 질환에서 역할을 담당한다. 대부분의 자가면역 질환에 대한 병적상태를 평가하는 활동적인 정량법은 부족하다. 지난 1990년대에 수행된 가장 최근의 연구들은 자가면역 질환들이 미국에서 세 번째로 가장 흔한 주요 질병이며; 가장 흔한 자가면역 질환은 850만 이상의 미국인들에게 영향을 미치는 것을 나타낸다. 질환은 현재 미국 인구의 5 내지 8% 범위에서 만연되어 있는 것으로 평가된다. 대부분의 자가면역 질환은 불균형적으로 여성에게 영향을 미친다. 여성들은 남성들보다 2.7배 더 자가면역 질환에 걸리는 것으로 보인다. 여성들은 자가면역 질환에 더 취약하다; 남성들은 여성들보다 천연 킬러 세포 활성 수준이 더 높은 것으로 나타난다 (Jacobsen et al, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997).
자가면역 질환은 면역 시스템이 자기 조직을 자기 것이 아닌 것으로 오인하고 부적절한 공격을 시작할 때 발생한다. 신체는 예를 들면 소화관 (크론병) 및 뇌 (다발성 경색)을 포함하여 자가면역 질환과는 상이한 방법으로 영향을 받을 수 있다. 자가항체는 자체-세포 또는 자체-조직을 공격하여 그것들의 기능을 손상시키고 그 결과로서 자가면역 질환을 유발하며, 자가항체는 자가면역 질환이 실제적으로 발생하기 전에 (예컨대 임상적 징후 및 증상들이 나타나기 전에) 환자의 혈청에서 검출될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로 자가항체의 검출은 자가면역 질환의 존재 또는 그런 질환에 걸릴 위험의 조기 발견 또는 인식을 허용한다. 이들 발견을 기초로, 자가항원에 대한 다양한 자가항체가 발견되었고 자가항원에 대한 자가항체들은 임상 실험에서 측정되었고 (예컨대 미국 특허 제 6,919,210호, 제 6,596,501호, 제 7,012,134호, 제 6,919,078호), 한편 다른 자가면역 진단들은 관련된 대사물의 검출 (예컨대 미국 특허 제 4,659,659호) 또는 면역학적 반응성의 검출 (예컨대 미국 특허 제 4,614,722호 및 제 5,147,785호, 제 4,420,558호, 제 5,298,396호, 제 5,162,990호, 제 4,420,461호, 제 4,595,654호, 제 5,846,758호, 제 6,660,487호 참조).
특정 구체예에서, 발명의 조성물은 특히 신장 투석중인 대상, 화학요법중이거나 및/또는 방사선 요법 중인 대상, 이식 수용체 등을 포함하여, 고령자 및/또는 면역억제된 개인의 치료에 적용될 것이다. 그런 개인들은 일반적으로 백신에 대한 감소된 면역 반응을 나타내고, 따라서 발명의 조성물의 사용은 이들 대상에서 이루어진 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 예컨대 만성 폐색성 폐 질환 (COPD)과 같은 상태의 예방 및 치료를 위해 발명의 조성물에 사용된 항원 또는 항원들은 예컨대 박테리아 감염에 의해 유발되었거나 악화된 호흡기 질환과 관련된 항원들을 포함한다. COPD는 만성 기관지염 및/또는 기종이 있는 환자들에서 비가역적 또는 부분적으로 가역적인 기도 폐쇄의 존재에 의해 생리적으로 규정된다 (Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121). COPD의 악화는 자주 박테리아 (예컨대 폐렴구균) 감염에 의해 유발된다 (Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63).
열안정성 조성물에 사용하기 위한 오일
특정 구체예는 오일을 포함하는, 본원에 기술된 조성물을 고려하는데, 일부 그런 구체예에서 오일은 보조제 활성을 부여할 수 있고 다른 그런 구체예에서 오일은 추가로 또는 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 제공한다. 많은 적합한 오일이 공지되어 있고 본 개시를 기초로 한 조성물에 포함되기 위해 선택될 수 있다. 예시에 의한 그런 오일의 실례는 제한 없이, 스쿠알렌, 합성 스쿠알렌, 미네랄 오일, 포도씨유, 합성 아이소프레노이드, 올리브유, 콜레스테롤 및 만니드 모노올레에이트를 포함한다.
본원에서 고려된 오일은 에멀션 시스템에 사용될 수 있고 그런 에멀션 시스템은 에멀션 보조제로서 언급된다. 에멀션 보조제는 수-중-유, 유-중-수 또는 수-중-유-중-수 혼합물을 포함한다. 이론에 구속되지 않으면서, 그런 에멀션 보조제는 면역 시스템의 지속적인 자극을 제공하기 위하여 항원의 느린 방출을 가능하게 함으로써 기능할 수 있다. 특정 에멀션 보조제는 또한 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN), 글루코피라노실 지질 보조제 (GLA), 모노포스포릴 지질 A (MLA) 및 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MLA)와 같은 면역자극성 보조제를 포함하는 다른 보조제에 대한 전달 시스템으로서도 사용될 수 있다. 단일상 또는 다중상 (multiphase) 에멀션 시스템을 포함하여 보조제 조성물을 제형하기 위한 특정 에멀션 시스템이 기술되어 있다. 수-중-유 에멀션 보조제는 그 자체로 보조제 조성물로서 유용한 것으로 제안되었고 (EP 0 399 843B), 또한 수-중-유 에멀션과 다른 활성 제제의 조합도 백신용 보조제로서 기술되어 있다 (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). 다른 오일 에멀션 보조제, 예컨대 유-중-수 에멸션 (미국 특허 제 5,422,109호; EP 0 480 982 B2) 및 수-중-유 에멀션 (미국 특허 제 5,424,067호; EP 0 480 981 B)이 기술되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 오일 에멀션 보조제는 천연이거나 합성일 수 있고, 미네랄이거나 또는 유기적일 수 있다. 미네랄 및 유기 오일의 실례는 기술분야에 숙련된 사람에게 쉽게 드러날 것이다. 특별한 구체예에서, 발명의 조성물 (예컨대 열안정성 동결건조된 백신)은 보조제가 오일 상에 포함되어 있는 수-중-유 에멀션을 포함한다. 수-중-유 조성물이 인간에게 투여하기에 적합하게 되기 위해서는, 에멀션 시스템의 오일 상이 바람직하게 대사 가능한 오일을 포함한다. 대사 가능한 오일이란 용어의 의미는 기술분야에 잘 알려져 있다. 대사 가능한이란 "대사과정에 의해 변환될 수 있는"으로서 정의될 수 있다 (Dorland's illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25th edition (1974)). 오일은 어떠한 식물 오일, 식물성 오일, 어유 (fish oil), 동물유 또는 합성 오일일 수 있고, 그것들은 수용체에 독성을 나타내지 않으며 대사과정에 의해 변환될 수 있다. 견과류 (예컨대 땅콩 오일), 씨앗 및 곡물이 통상적인 식물성 오일의 공급원이다. 합성 오일 또한 사용될 수 있다.
예를 들어 스쿠알렌 (2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔)은 상어 간유에서 대량으로 발견되고, 소량으로는 올리브유, 맥아유, 미골유 (rice brain oil) 및 효모에서 소량으로 발견되며, 특히 본 발명에 사용하기에 바람직한 오일이다. 스쿠알렌은 콜레스테롤의 생합성에서 중간체인 사실에 의해 대사 가능한 오일이다 (Merck index, 10th Edition, entry no. 8619). 본 발명에 따라 유용한 대사 가능한 오일의 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 스쿠알렌, 대두유, 참기름 및 카프릴산/카프르산 트라이글리세리드 (MIGLYCOL 810 오일)를 포함한다. 한 구체예에서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌을 포함한다. 다른 구체예에서, 대사 가능한 오일은 하나 또는 그 이상의 효모-유도된 아이오프레노이드, 예컨대 효모-유도된 스쿠알렌 또는 효모로부터 유도된 관련된 아이소프레노이드 구조를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약 0.01%-5% v/v, 약 0.01%-4% v/v, 약 0.01%-3% v/v, 약 0.01%-2% v/v, 약 0.01%-1% v/v 또는 약 0.01%-0.5% v/v의 농도로 존재하는 대사 가능한 오일을 포함한다. 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일은 약 0.01% v/v, 약 0.05% v/v, 약 0.1% v/v, 약 0.5% v/v, 약 1% v/v, 약 1.5% v/v, 약 2% v/v, 약 2.5% v/v, 약 3% v/v, 약 3.5% v/v, 약 4% v/v, 약 4.5% v/v, 약 5% v/v, 약 6% v/v, 약 7% v/v, 약 8% v/v, 약 9% v/v, 약 10% v/v, 약 11% v/v, 약 12% v/v, 약 13% v/v, 약 14% v/v, 약 15% v/v, 약 16% v/v, 약 17% v/v, 약 18% v/v, 약 19% v/v 또는 약 20% v/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일은 약 2% v/v의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 대사 가능한 오일은 1% v/v 아래의 농도로 존재한다. 기술된 백분율은 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형 또는 복원시 수-중-유 에멀션 중 어느 하나의 백분율을 나타낸다.
안정한 수-중-유 에멀션 내에서 발견되는 오일 방울의 크기는 광자 상관 분광측정에 의해 측정되는 바, 바람직하게 1 마이크론 미만이고, 실질적으로 30 내지 600 nm의 범위에 있을 수 있으며, 바람직하게 실질적으로 직경이 대략 30 내지 500 nm, 가장 바람직하게 실질적으로 직경이 대략 150 내지 500 nm, 특히 직경이 약 150 nm일 수 있다. 이런 관점에서, 오일 방울의 수의 80%는 바람직한 범위 내에 있어야 하고, 보다 바람직하게는 오일 방울의 수의 90%보다 많은, 가장 바람직하게는 95%보다 많은 오일 방울이 규정된 크기 범위 내에 있어야 한다.
에멀션의 친수성-친유성 균형 (HLB)은 계면활성제의 친수성 또는 친유성 힘의 추정을 허용한다. 양친매성 분자의 HLB는 일반적으로 다음과 같이 계산된다:
HLB = (20 X 친수성 부분의 중량)/(양친매성 분자의 중량)
HLB는 0 (가장 친유성인 분자에 대해) 내지 20 (가장 친수성인 분자에 대해) 범위의 값을 가질 수 있다. 계면활성제의 화학적 조성에 따라서 (현저하게 예를 들면 에톡실 기 또는 알켄 옥사이드의 첨가), 이 추정은 바뀔 수 있고 HLB 값의 도메인은 증가할 수 있다 (예를 들어 LUTROL F68®은 29의 HLB를 가진다). 계면활성제의 혼합물을 사용하면, 혼합물의 HLB는 다음과 같이 중량비에 의해 균형이 맞추어진, 각각의 계면활성제의 HLB의 첨가이다:
HLB = (HLB 계면활성제 X x 중량 계면활성제 X) + (HLB 계면활성제 Y x 중량 계면활성제 Y)/(중량 계면활성제 X + 중량 계면활성제 Y)
본 발명에 따라 만들어진 에멀션의 한 구체예에서, 에멀션의 최종 HLB는 약 9 내지 약 12, 바람직하게는 약 9.5 내지 약 11.5이며 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 11.5이다. 일부 구체예에서, 에멀션의 HLB는 약 10.5 내지 약 11.0이다. 수-중-유 에멀션의 제조 방법은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 통상적으로, 방법은 용액과 같은 적합한 계면활성제와 오일 상을 혼합하고, 이어서 균등화기를 사용하여 균등화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 주사기 바늘을 통해 1회, 2회 또는 그 이상의 횟수로 혼합물을 통과시키는 것을 포함하는 방법은 적은 부피의 액체를 균등화하는 데에 적합할 것이다. 동일하게, 마이크로유동화제 (M110S 마이크로유체공학 기계, 최대 50회 통과, 6 바의 최대 유입 압력 (출력 압력은 약 850 바)에서 2분의 기간 동안 최대 50회 통과가 적응되어 보다 작거나 큰 부피의 에멀션이 생성될 수 있을 것이다. 이런 적응은 제제가 필요한 직경의 오일 방울들로 이루어질 때까지 결과적으로 생성된 에멀션의 측정을 포함하는 기본적인 실험에 의해 이루어질 수 있다.
약학적 열안정성 조성물의 사용
다른 측면으로, 본원에는 본원에서 기술된 복원된 열안정성 백신 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 그 방법은 투여 전에 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 수-중-유 에멀션으로 복원하는 단계를 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 숙주, 환자 또는 대상에서, 또는 세포 배양물에서 면역 반응을 증강시키거나 유도하는 데 유용하다. 환자는 감염성 질환, 암, 예컨대 유방암 또는 자가면역 질병에 걸렸거나 또는 정상 (즉 검출 가능한 질환 및/또는 감염이 없음)일 수 있다. "세포 배양물"은 면역 시스템의 면역경합 세포 또는 분리된 세포 (이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, T 세포, 마크로파지, 단핵세포, B 세포 및 수지상 세포)를 함유하는 어떠한 제제이다. 그런 세포들은 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람들에게 잘 알려져 있는 다양한 기법들 (예컨대 피콜-하이파크 밀도 원심분리) 중 어느 것에 의해서든 분리될 수 있다. 세포는 암에 걸린 환자로부터 분리될 수 있고 (그러나 반드시 그럴 필요는 없음) 처치 후 환자에게 재도입될 수 있다.
투여 경로
본 발명은 감염성 질환, 암 또는 자가면역 질환과 같은 상태들의 백신접종, 치료 및 방지를 위한 방법 및 조성물에 관련된다. 본 발명의 방법들은 비경구 및 비-비경구 투여를 포함한 투여 경로들을 포함한다. 비-비경구 경로의 투여는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 볼, 혀밑, 국소적, 경피, 눈, 귀, 코, 직장 및 질 경로를 포함한다. 주사 가능한 방법은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 비경구 경로 투여, 정맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 척수 내, 척추 강내, 뇌실 내, 동맥 내 및 다른 경로의 주사를 포함한다. 이들 발명은 예정된 시간 동안 항원 및/또는 보조제의 제어된, 느린 방출 또는 지속적 방출을 제공할 수 있는 조성물을 고려한다.
제형
제형들은 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있고, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 정제, 코팅정, 츄잉 정제, 발포정, 펠릿, 캡슐, 시럽, 좌제, 주사 가능한 제형, 및 생리적 유체에서 불용성이거나 항원 및/또는 보조제의 방출이 기계적, 화학적 또는 효소적 활성에 기인한 제형의 분해 후에 방출되는 배지 중의 활성 제제의 분산액과 같은 제형들을 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 특정 제형, 과정 단계 및 물질에이 다소 달라질 수 있기 때문에 그것들로 한정되지 않는다는 것이 인지되어야 한다.
키트 및 약학적 팩 (Pack)
또한 특정 구체예에서는 본원에 기술된 백신 조성물을 포함하고, 하나 또는 그 이상의 용기로 제공될 수 있는 키트가 고려된다. 한 구체예에서, 백신 조성물의 모든 성분은 단일 용기에 함께 존재하지만, 발명의 구체예들은 그렇게 한정되는 것으로 의도되지 않으며 또한 둘 또는 그 이상의 용기도 고려한다.
그런 키트 구체예들에 따르는 용기는 어떠한 적합한 용기, 그릇, 바이알, 앰플, 튜브, 컵, 박스, 병, 플라스크, 단지, 접시, 단일-웰 또는 다중-웰 장치의 웰, 저장고, 탱트 등 또는 본원에 개시된 조성물이 내용물을 제거하기 위해 배치되거나, 저장되거나 및/또는 수송되고, 접근될 수 있는 다른 장치일 수 있다. 전형적으로 그런 용기는 의도된 사용과 부합하고 그것으로부터 함유된 내용물의 회수가 쉽게 이루어질 수 있는 물질로 만들어질 수 있다. 그런 용기의 바람직한 실례는 고무 격막 또는 바늘 및 주사기를 사용한 내용물의 철회와 부합하는 다른 밀봉 수단을 가지는 것들을 포함하여, 유리 및/또는 플라스틱 밀봉된 또는 재밀봉이 가능한 튜브 또는 앰플을 포함한다. 그런 용기는 예를 들면 유리 또는 화학적으로 부합하는 플라스틱 또는 수지로 만들어질 수 있고, 용기로부터 물질의 효과적인 회수를 허용하고 및/또는 물질을 예컨대 자외선 광 또는 극한 온도와 같은 분해 조건으로부터 또는 미생물 오염을 포함하여 원하지 않는 오염물의 도입으로부터 보호하는 물질로 만들어지거나, 그런 물질로 코팅될 수 있다. 용기는 바람직하게 멸균되거나 멸균이 가능하며, 본원에 기술된 백신 조성물 및/또는 면역학적 보조제 조성물 및/또는 항원 및/또는 재조합 발현 구성물 등을 현탁시키거나 용해시키기 위해 사용될 수 있는 것과 같이, 어떠한 담체, 부형제, 용매, 비히클 등과 부합할 물질로 만들어진다.
발명은 다음의 실시예를 참조로 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 실시예는 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기술된 실시예 및 구체예들은 단지 예시를 목적으로 한 것임이 인지되어야 한다. 상기에서 기술된 다양한 구체예들은 추가의 구체예들을 제공하기 위해 조합될 수 있다. 그것들의 다양한 변형 또는 수정은 전술한 설명으로부터 당업자들에게 분명해질 것이고 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함될 것이며, 첨부된 청구범위의 범주에 속할 것이다.
실시예
실시예 1: 동결건조된 백신 에멀션 제형 및 단일 및 다중-부형제 시스템에서의 안정성
백신에 사용하기 위한 수-중-유 에멀션 (SE)의 동결건조가 바람직하였다. 동결건조시 열적으로 안정한 엘레간트 케이크를 형성하고 및/또는 복원시 에멀션 통합성을 보존하는 부형제의 능력을, 지구상의 모든 관련 온도에서 콜드 체인 유지에 대한 필요성이 감소되었거나 제거된 열적으로-안정한 백신 시스템을 개발하기 위해 조사하였다.
물질 및 방법
제형 및 동결건조
앞서 기술된 스쿠알렌-함유 안정한 에멀션 (SE) (EM001; Fox et al., 2012, Influenza and Other Respiratory Viruses, in press)을 총 충전 부피를 1.0 mL로 하고 최종 농도 2.0% 스쿠알렌 (v/v) (초기의 10% 제형으로부터 표적 최종 주사 농도로 희석함)에서 동결건조시켰다. 부형제 농도를 질량 백분율 (% w/v)로 기록하고 스쿠알렌 오일 상의 부피 백분율 (% v/v)로서 에멀션 농도를 기록하였다. 말토오스, D-(-)-리보오스, D-(-)-프룩토오스, 락토오스, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; mw 3,350 Da), 락툴로오스, 니코틴산, D(+)-라피노오스 5무수물, 2,6-피리딘다이카르복실산 및 L-프롤린을 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo)로부터 구매하였다. USP 등급의 D(+)-만니톨 및 D(+)-트레할로오스 2수화물, NF 등급의 수크로오스 및 락토오스 1수화물 및 덱스트란 (mw 40,000 Da)을 Spectrum Chemical (New Brunswick, NJ)로부터 구매하였다. 탈이온화한 물에 다양한 농도로 용해된 상기 부형제를 사용하여 샘플을 제형하였고 Barnstead/Thermolyne (Dubuque IA) E-Pure D4631 여과 시스템과 이어서 20 nm Whatman (Maidstone, Kent, UK) Anotop 플러스 필터를 통해 여과하였다. 복원시 극한 pH 변동 (5.0 아래 또는 7.0보다 위)을 초래하는 제형을 동결건조 전에 NaCl 및 NaOH를 사용하여 pH 5.5로 재-제형하였다. 동결건조를 VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85 벤치탑 냉동 건조기를 사용하여 수행하였다. 동결건조 방법은 4 내지 -40℃의 10-시간 냉동 단계 및 -15℃에서의 아닐링 단계를 포함하는 열처리 스케줄을 활용하였다. 일차 건조 단계 (100 mTorr)를 -40℃에서 25℃까지 18.3시간 동안 지속시켰다. 마지막으로, 50 mTorr에서의 이차 건조 단계를 25℃에서 9시간 동안 사용하였다. 모든 샘플을 대기 가스 중에서 500 mTorr에서 스톱퍼를 채우고, 알루미늄 캡을 사용하여 밀봉한 후 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
복원
복원 전에 케이크를 엘레간트 백색 케이크 (케이크가 백색이고, 대략 충전되었을 때와 동일한 부피이며, 균일한 격자를 가지는 것으로 보이는 것을 의미함)인지, 필름인지 또는 엘레간트 백색 케이크와 상이한 어떤 것인지를 육안으로 특성확인하였다. 모든 샘플을 20 nm 여과된 물 (상기에서 기술됨)을 사용하여 복원하고, 모든 성분들이 용해될 때까지, 또는 3분이 경화할 때까지, 어느 쪽이든 먼저 도달할 때까지 손으로 가볍게 돌려주었다. 복원 후에, 제형들은 우유같은 백색 에멀션 (동결건조-전 제형에 유사하게 나타남)으로서 기술할 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 우유같은 백색 에멀션과의 어떠한 차이점이라도 주의깊게 보았다. 그런 다음 각 제형의 부분 표본을 실온에서 1시간 동안 방치하였고, 크리밍으로 언급되는, 표면에 두꺼운 백색 상이 보이는 지를 육안으로 평가하였다. 각 제형의 pH를 또한 Mettler-Toledo (Columbus, OH) MP225 pH 계량기를 사용하여 검사하였다.
용융점 측정
각각의 동결건조된 제형의 용융점들을 스탠포드 연구 시스템 (Sunnyvale, CA) OptiMelt 자동화 용융점 시스템을 사용하여 3중으로 평가하였다. 각각의 용융 모세관을 케이크 안으로 일단 탐침으로 넣고 그 물질이 바닥에 닿을 때까지 꾹꾹 눌러주었다. 용융을 분당 1℃의 경사 속도로 27℃로부터 200℃까지 수행하였다 (전형적으로 1회 절단된 용융이 완료됨).
용융점에 대한 대체 계측은 영상 용융점 장치의 사용을 포함하였다. 다양한 부형제를 포함한 동결건조된 SE의 바이알을 상기에서 기술한 것과 같이 3중으로 용융시켰다. 용융 전이를 이미지 중의 샘플의 광세기를 감소시킨 투명한 액체로 용융되는 불투명한 케이크로서 관찰하였다. 개시점을 용융 전이가 시작될 때의 케이크 부피의 제 1 주지성 감소 (용융 직전의 케이크 변화의 시작)로서 평가하였고, 케이크의 중간 용융점 (Tm)은 케이크가 전체적으로 고체일 때와 전체적으로 용융된 케이크일 때 사이의 픽셀 세기의 절반을 잃어버렸을 때의 온도로서 측정하였다. 유사하게, 케이크가 25 및 75%의 세기를 잃어버렸을 때의 온도 (전이의 시작과 끝에 대해 표준화함)를 용융 범위의 계량으로서 계산하였다.
습기 측정
5% 트레할로오스-함유 동결건조된 케이크의 습기 함량을 Denver Instruments (Bohemia, NT) Karl Fischer 쿨롱 적정기 (Coulometric Titrator), (Model 270)를 사용하여 동결건조된 SE (2% 오일 SE가 첨가된 5% 트레할로오스)의 이중 바이알과 이어서 2개의 독립적인 동결건조 작동을 사용하여 특성화하였다. 적정 측정을 중간 교반 속도에서, 15초의 종점 지속 시간 및 0.05의 종점 기울기를 사용하여 수행하였다. 샘플을 Riedel-de-Haens Hydranal AG 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)을 사용하여 복원하였고, 중량을 측정한 용액을 적정기 안에 주입하였다. 기기를 사용하여 물 함량의 질량을 측정한 후에, 물 백분율을 % w/v로서 계산하였다.
입자 크기 및 제타 전위
에멀션 입자 크기, 다중분산성 (PdI) 및 제타 전위를 동적 광산란 (DLS)을 사용하여 Malvern (Worcestershire, UK) Nano-ZS 상에서 평가하였다. 측정은 일반적으로 앞서 기술한 것과 같이 수행하였다 (Fox et al., 2011, Pharmaceutical Development and Technology, 16(5):511-519). 간단히 설명하면, 모든 DLS 크기 측정을 20 nm 여과된 물 (상기 기술됨)로 10-2 희석으로 수행하였고 단일 부분표본에 대하여 3중으로 평가하였다. 제타-전위 측정을 위해서, 동일한 부분표본을 3중 측정 및 20 내지 40회 작동 기간 내 측정의 자동 소프트웨어 측정을 사용하여 평가하였다.
고성능 액체 크로마토그래피
스쿠알렌, DMPC 및 GLA의 화학적 분해를 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 모니터링하였다. Agilent 1200 (Santa Clara, CA) 및 ESA Biosciences Corona Charged Aerosol Detector (CAD; Chelmsford, MA)를 Waters Atlantics C18 μm 칼럼 (4.6mm x 250mm; Milford, MA)과 함께 사용하였다. Fox et al., 2008, Colloids and Sufaces B: Biointerfaces, 65:98-105 참조. 이동상 A는 75:15:10 (v/v/v)의 메탄올:클로로포름:물 및 1% 아세트산을 포함한 20 mM의 암모늄 아세테이트를 함유하였고, 이동상 B는 20 mM의 암모늄 아세테이트를 포함한 50:50 (v/v)의 메탄올:클로로포름 및 1% 아세트산을 함유하였다. 샘플을 복원된 샘플을 이동상 B로 1:20으로 희석함으로써 제조하였다. 9 μl를 45분에 걸쳐 이동상 A의 100%에서 10%까지의 선형 구배 및 30℃의 칼럼 온도와 함께 사용하여 주입하였다. 사용한 모든 용매는 HPLC 등급이었다.
복원 스크리닝
2%의 SE 및 5%의 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스, 락툴로오스, 리보오스, 덱스트란, PEG, 만니톨, 스타키오스, 소르비톨 및 프롤린 각각을 함유하는 제형을 3.1에서 기술하는 것과 같이 제조하였다. 다이피콜산 및 니코틴산을 포함한 제형 또한 제조하였지만, 용해도 제한으로 인해 0.5%로 제형하였다. 각각의 제형을 상기에서 기술한 대로 복원하였다. 샘플을 상기에서 기술한 것과 같이 케이크 외관, 크리밍, 입자 크기, 제타 전위, PdI 및 pH에 따라 특성화하였다.
케이크 안정성 스크리닝
5%의 화합물의 하위세트의 융점을 상기에서 기술한 것과 같이 평가하였다. 이들 화합물은 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 만노오스, 프룩토오스, 락툴로오스, 라피노오스, 리보오스, 스타키오스, 만니톨 및 프롤린을 포함하였다. 후속 연구로서, 5%의 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스 또는 수크로오스를 함유하는 제형들을 0.2 또는 5% 만니톨 및 2% SE를 사용하여 제조하였다. 이들 제형을 상기에서 기술한 것과 같이, 케이크 용융, 크리밍, pH, PdI 및 입자 크기에 따라 평가하였다.
가속화된 안정성 특성확인
5% 트레할로오스 중의 동결건조된 SE의 바이알을 25, 37, 50, 60 및 90℃에서 저장하였고, 1500 시간에 걸쳐 또는 완전한 실패가 관찰될 때까지 주기적으로 복원하였다. 샘플을 각 시점에서 DLS, pH, HPLC 및 케이크 외관에 의해 특성화하였다. 비교를 위해 비-동결건조 SE를 유사하게 특성화하였다. 높은 케이크 용융 온도를 가지는 것으로 확인된 제형들을 보다 안정한 시스템을 개발하기 위해 추가의 가속화된 안정성 특성확인을 위해 선택하였다. 제형들은 5% 덱스트로오스, 말토오스, 수크로오스 및 트레할로오스를 포함하였다. 15%의 락토오스를 함유하는 실헌 제형을 또한 포함시켰다. 이들 제형의 가속화된 안정성을 모든 이들 제형의 변화를 포착하기 위해 90℃에서 상기에서 기술한 것과 같이 특성화하였다.
결과
트레할로오스 중의 SE의 동결건조
동결건조된 제형에서 트레할로오스의 광범위한 사용으로 인해, 트레할로오스 함유 제형을 에멀션 동결건조의 실행가능성을 조사하기 위해 평가하였다. 동결건조 후에, 5% 트레할로오스 및 2% v/v 스쿠알렌 SE를 함유하는 케이크들은 습기 함량이 0.3% w/w이고 양호한 복원 용해도를 가지는 약간 수축된 백색 케이크를 유발하였다 (도 1a). 복원된 에멀션은 육안으로는 동결건조되지 않은 제형과 유사하게 보였다. 복원시 평균 입자 직경이 21 nm 증가한 것이 관찰되었고 (도 1b), 그와 함께 PdI가 0.02 증가하였다. 동결건조 및 복원은 pH를 변화시키지는 않았다. 이들 결과는 에멀션이 동결건조 및 복원 후에도 유지되었다는 초기 추정을 제공하였다.
트레할로오스 중의 SE의 가속화된 안정성
트레할로오스 중의 SE의 성공적인 동결건조 및 복원 후에, 동결건조된 및 비-동결건조 SE의 안정성을 평가하여 동결건조가 에멀션 안정성을 개선하였는지를 측정하였다. 복원된 동결건조된 SE 입자 크기 (도 2a) 및 pH (도 2b)를 기초로, 동결건조된 제형은 25℃ 및 37℃에서의 액체 제형보다 더 안정하였다. 이들 온도에서 액체 또는 복원된 동결건조된 SE에 대해 화학적 조성의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다. 동결건조는 도한 액체 제형의 조성 변화를 유도하기 위해 필요한 상승 온도에서 에멀션의 화학적 안정성을 증가시켰다 (도 2c). 구체적으로, α-토코페롤, 스쿠알렌 및 난-유도 포스파티딜콜린 (난-PC)은 모두 액체 제형에 비교하여 동결건조된 제형에서 보호되었다. 나아가, 오일-분리 현상의 지표가 될 오일상의 분리는 검출되지 않았다. 그러므로 오일이 이 시스템 내에서 재분배되거나 상이한 상으로 들어가는 것이 나타나지 않았기 때문에, 입자들은 복원 후에 에멀션으로서 유지되었다.
일차 실패 메커니즘의 측정
트레할로오스 외에도 동결건조된 SE의 안정성을 발전시키기 위하여, 일차 실패 메커니즘을 억제하는 미래 제형을 선택할 의도로, 이 메커니즘을 측정하기 위한 조사를 수행하였다. 동결건조된 SE를 25, 37, 50, 60 및 90℃의 온도범위에 1500시간까지 또는 제형들이 특성확인 한계를 지나쳐 실패할 때까지 저장하였다 (도 3). 동결건조된 에멀션은 50℃ 이상에서 훨씬 덜 안정하였다. 첫 번째로 관찰된 변화는 케이크 용융-백과 동시적으로 발생한 (도 3a 및 도 3c) 입자 크기 성장이었다. pH의 큰 변화는 단지 일단 입자가 크기가 커지지 않았을 때 발생하기 시작하였고 (도 3h), 따라서 일차 실패 메커니즘으로는 여겨지지 않았다. 그러므로, 에멀션 성분 농도 (도 2c) 및 pH (도 3b)가 먼저 변화하지 않았기 때문에, 메커니즘은 기원적으로는 공유성인 것이 아닌 것으로 추정되었다. 그러나, 케이크 용융-백은 직접적으로 시간 경과에 따른 입자 크기 성장과 상관이 있었다 (도 3d). 케이크 용융-백이 입자 크기 성장보다 빠르게 발생하는 것으로 나타났기 때문에, 용융-백에 대한 케이크 내성은 스트레스를 받는 조건하에서 에멀션 입자 크기 안정성을 유지하는 데 결정적으로 기여하였다.
SE 복원에 대한 부형제 스크리닝
추정되는 실패 메커니즘을 기초로, 에멀션 특성들을 유지하고 용융 백에 대해 내성인 화합물들을 확인하기 위하여 부형제 스크리닝을 수행하였다 (표 1, 도 4). 부형제들을 케이크 구조 및 복원 후의 에멀션 특성들의 유지에 따라 4개의 부류로 그룹화하였다. 이들 부류의 대표적인 데이터를 도 5에 나타낸다.
5% (w/v) 제형 중의 복원된 2% (v/v) 오일 SE 사이의 제형 특성의 비교
부형제 케이크 외관 크리밍
(1 시간) 		PdI DLS Z-평균 (d.nm) 평균
Z-전위 (mV) 		pH
동결건조되지 않은 SE
SE (10% v/v
벌크 물질)		 액체; 우유같은 백색 에멀션 네거티브 0.10 99.7 -8.6 5.5
트레할로오스
(동결건조-전)		 액체; 우유같은 백색 에멀션 네거티브 0.19 115.6 -9.6 6.0
부류 1: 케이크 형성함, 에멀션 유지
트레할로오스 백색 케이크 네거티브 0.21 136.8 -18.9 5.9
덱스트로오스 스폰지형 백색 케이크 네거티브 0.17 112.6 -18.7 6.1
락토오스 엘레간트 백색 케이크 네거티브 0.19 159.3 -19.0 5.9
말토오스 엘레간트 백색 케이크 네거티브 0.21 127.3 -21.5 6.2
수크로오스 스폰지형 백색 케이크 네거티브 0.22 115.5 -18 6.1
라피노오스 백색 케이크 with Increased Volume 네거티브 0.24 149 -24.2 5.8
만노오스 스폰지형 백색 케이크 네거티브 0.12 110.2 -15 6.1
프룩토오스 스폰지형 백색 케이크 네거티브 0.11 121.9 -16.8 5.5
락툴로오스 백색 케이크 네거티브 0.19 141.6 -22 5.7
부류 2: 케이크 형성하지 않음, 에멀션 유지
리보오스 케이크 없음,
백색/버블 필름		 네거티브 0.23 130.8 -11.4 5.2
부류 3: 우수한 케이크 형성, 에멀션 파괴
덱스트란 40,000 스폰지형 백색 케이크 포지티브 0.84 1000+ -27.8 5.5
PEG 3350 엘레간트 백색 케이크 포지티브 0.78 970.9 -24.6 3.3
만니톨 백색 케이크 포지티브 0.90 1000+ -19.4 2.9
스타키오스 엘레간트 백색 케이크 포지티브 0.60 253.6 -23.4 6.8
다이피콜린산 (0.5%) 엘레간트 백색 케이크 포지티브 0.93 1000+ -6.7 5.1
부류 4: 케이크 형성하지 않음, 에멀션 파괴
소르비톨 케이크 없음, 투명 필름 포지티브 0.83 1000+ -24.8 5.1
니코틴산
(0.5 %)		 케이크 없음,
두꺼운 백색 필름		 포지티브 0.61 265.4 -6.2 5.3
프롤린 케이크 없음,
고화된 버블		 포지티브 0.81 742 -5.5 4.3
부류 1 부형제들은 케이크 형태 범위를 가지는 백색 케이크를 형성하였고, 동결건조 후에 에멀션 특성들을 유의미하게 변화시키지 않았다 (표 1, 도 4a 내지 4b). 이 부류는 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스를 포함하였다. 복원된 에멀션 입자 크기는 200 nm 아래였고, 1시간 후에 크리밍이 관찰되지 않았으며, PdI는 0.25 미만이었다. 제타 전위는 -9mV로부터 -15 내지 -25 mV로 감소하였다. pH는 5.4로부터 6.2로 달라졌다. 대표적인 부류 1 제형인 5% 트레할로오스 중의 동결건조된 SE의 케이크 외관은 약간 수축되었음에도 불구하고 허용될 정도였다 (도 5a). 크리밍은 24시간 내에 관찰되지 않았고 (도 5b), 입자 크기 분포는 150 nm 아래로 균질하게 유지되었다 (도 5c).부류 2 부형제인 리보오스는 동결건조되었을 때 케이크를 형성하지 않았고, 대신 필름을 형성하였지만 (도 5a), 에멀션은 허용되는 입자 크기, PdI, 제타 전위 및 pH로 복원될 수 있었다 (표 1, 도 4a 및 4b).
부류 3의 부형제들은 양호한 케이크를 형성하였지만, 복원 후에 에멀션이 파괴되었다 (표 1, 도 4 및 도 5). 복원된 입자 크기는 200 nm보다 컸고, PdI 값은 0.59 내지 0.93으로 컸다. pH 및 결과적으로 제타 전위는 이 그룹 내에서 폭넓게 달라졌다. PEG 및 만니톨 함유 제형에 대해 관찰된 pH의 큰 변화는 동결건조 중에 일어났다. 동결건조 전 pH를 5.5로 조정하였다. 큰 입자 크기 및 높은 다중분산성으로부터 예상한 것과 같이, 부류 3 부형제들은 복원 후에 크리밍을 유발하였다 (표 1, 도 5b).
부류 4 부형제들은 케이크를 형성하지 않았고, 크리밍 대신 이들 제형은 완전하게 복원하지 못하였지만, 부류 3 화합물과 같은 방식으로 에멀션을 파괴하였다 (표 1, 도 4 및 도 5). 이들 부형제는 각각 높은 PdI 값 및 4.3과 5.1 사이의 pH 값을 가지는 큰 SE 입자를 유발하였다. 다이피콜린산 및 니코틴산은 물에 잘 녹지 않았는데, 이것은 이들 제형이 다른 제형의 질량 농도의 10%에서 제조되었음을 의미한다. 이것은 이들 부형제를 사용했을 때의 불량한 에멀션을 유지하게 하는 데 기여하는 요인일 수 있다.
케이크 열안정성에 대한 단일 부형제 구조적 스크리닝
대체 동결건조 부형제를 확인한 후에 케이크 열안정성을 케이크-형성 부형제의 선택에 대해 평가하였다. 이것을 더 높은 용융점 및 용융-백에 대해 더 큰 내성을 가지는 부형제를 확인하는 방법으로서 사용하였다 (표 2). 부류 1 부형제들은 즉각적인 온도로부터, 중간의 27℃ 또는 27℃ 아래의 출발 온도를 거쳐 78℃까지의 범위의 가장 낮은 개시점을 가졌다. 용융 중간점 범위는 36℃ 내지 94℃였다. 부류 3 부형제는 90℃보다 높은 개시점을 가졌고 모두 100℃보다 높은 용융 중간점을 가졌다. 만니톨은 가장 큰 케이크 안정성을 나타냈고, 160.1℃에서 중심을 잡은 좁은 용융점 범위를 나타냈다. 대표적인 케이크 용융 열분석도를 도 6a에 나타낸다. 케이크 개시 및 용융점을 기초로 한 부형제들의 비교를 도 6b에 나타낸다. 단량체 당은 중합체 당 부형제보다 훨씬 더 낮은 용융점을 가지는 것으로 나타났다.
5% (w/v) 제형 중의 SE 중의 2% (v/v) 오일 사이의 케이크 용융 특성의 비교
부형제
(5% w/v) 		t 개시 (°C) t m (°C) 용융 범위 (°C)
25 내지 75 % 세기 		부류 당 중합체
길이
덱스트로오스 27 아래 36.4 32.5 - 39.2 1 1
만노오스 27 아래 47 40.8 - 50.6 1 1
프룩토오스 27 아래 38.1 34.3 - 41.5 1 1
트레할로오스 75 91.8 86.0 - 94.7 1 2
락토오스 78 94.4 89.5 - 97.7 1 2
말토오스 58 82.5 73.7 - 87.0 1 2
수크로오스 39 67.4 59.2 - 73.4 1 2
락툴로오스 57 77.3 70.8 - 83.7 1 2
라피노오스 55 81.9 71.6 - 88.1 1 3
스타키오스 95 109.2 104.7 - 111.8 3 4
만니톨 158 160.1 158.6 - 161.1 3 NA
제형 안정성에 미치는 케이크 열안정성의 영향케이크 용융점과 열안정성 사이의 상관관계를 평가하기 위하여, 상이한 용융점을 가지는 다양한 당에서의 SE에 대한 입자 크기 성장률을 90℃에서 평가하였다. 덱스트로오스, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스의 5% 제형과 광범위하게 상이한 용융점을 가지는 15% 락토오스 제형 사이의 안정성의 차이를 조사하였다 (도 7). 15% 락토오스 제형을 5% 락토오스보다 높은 용융점을 가지는 것으로서 확인하였고, 그것의 용융점이 90℃의 스트레스 저장 온도보다 꽤 높았기 때문에 선택하였다. 덱스트로오스는 가장 낙은 용융점을 가지는 것으로 관찰되었고, 가장 빠른 입자 크기 성장을 나타냈다 (도 7a). 수크로오스, 말토오스 및 트레할로오스는 중간 용융점을 나타냈고, 중간 용융 속도를 나타냈다. 케이크 용융점이 제형들 사이에서 증가했기 때문에, 이 입자 크기 성장은 감소되었는데, 가장 높은 용융점 및 가장 낮은 입자 크기 성장률을 가진 것은 15% 락토오스였다. 추가로, 저장 온도보다 위 및 아래의 tm을 가지는 샘플들 사이에서 입자 성장률의 분기점이 관찰되었는데 (도 7b), 그것은 케이크 용융-백이 일차 열적 분해 실패 메커니즘이었다는 추가의 증거를 제공한다.
케이크 열안정성에 대한 부형제 조합 스크리닝
만니톨이 케이크 열안정성을 증가시켰던 (표 2) 관찰에 기인하여, 다양한 부류 1 부형제들을 만니톨과 조합하여 에멀션은 유지하지만 월등한 케이크 안정성을 가지는 제형들을 생성하는 시도를 하였다 (표 3, 도 8). 부류 부형제들은 만니톨의 존재하에서 에멀션 입자 크기 성장을 감소시켰다. 0.2% w/v 만니톨의 첨가는 입자 크기 또는 Tm을 증가시키지 않았다. 5% w/v 만니톨은 케이크 Tm을 크게 증가시켰을뿐 아니라 에멀션 입자 크기 및 PdI를 증가시켰고, 동시에 pH를 감소시켰다.
0.2% 또는 0.5% (w/v) 만니톨을 포함하는 5% (w/v) 제형 중의 2% (v/v) 오일 SE 사이의 케이크 특성들의 비교
부형제
(5% w/v)		 만니톨 농도
(% w/v)		 t개시
(℃		 tm (℃) 용융 범위 (℃)
25 내지 75% 세기		 pH PdI DLS Z-
평균(d.nm)
트레할로오스 0.2 64 83.8 78.5 - 87.1 6.0 0.19 138.6
트레할로오스 5 81 124.4 111.9 - 136.7 5.3 0.24 162.4
덱스트로오스 0.2 27 아래 43.1 37.4 - 47.3 5.9 0.18 114.4
덱스트로오스 5 84 115.9 106.3 - 121.7 5.0 0.17 123.8
락토오스 0.2 68 87.9 83.2 - 90.9 6.0 0.24 165.2
락토오스 5 141 148.6 146.3 - 150.1 5.2 0.24 175
말토오스 0.2 57 78.6 72.3 - 83.3 6.1 0.26 136.5
말토오스 5 83 121.6 107.4 - 136.4 5.3 0.25 154.4
수크로오스 0.2 42 64.7 56.8 - 71.0 6.1 0.20 110.9
수크로오스 5 78 124.7 113.1 - 129.0 5.3 0.21 125.9
실시예 2: 결핵에 대한 동결건조된 보조제첨가된 백신의 안정성
결핵 (TB)에 대해 유일하게 승인된 백신인 바실루스 칼메트-게랭 (BCG)은 인간에게서 1921년에 먼저 사용되었고 아동에서 전염된 TB의 발생을 감소시키는 데 효과적이었다. 그러나, BCG는 청소년과 성인에서 TB를 예방하는 것에는 비효과적인 것으로 증명되었다 (Checkley et al., 2011, Trends Pharmacol Sci, 32:601-606; Rowland et al., 2011, Expert Rev Vaccines, 10:645-658; Anderson et al., 2005, Nat Rev Microbiol, 3:656-662). 60%의 효능을 가지는 TB에 대한 가설적인 새로운 백신을 실행하는 영향에 대한 수학적 모델링은 2050년에는 발생률을 80% 떨어뜨릴 것으로 예측한다 (Abu-Raddad et al., 2009, PNAS, 106:13980-13985). 그러므로 BCG에 의해 프라임된 면역성을 부스팅하거나 BCG를 대체할 수 있는 새로운 TB 백신에 대한 급박한 요구가 존재한다. 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mtb)에 대한 보호 면역은 CD4 T 세포에 의한 TNF 및 IFN-γ 생성 둘 다를 필요로 한다 (Flynn et al., 2001, Annu Rev Immunol, 19:93-129; Cooper A.M., Annu Rev Immunol; 27:393-422). 4개의 단백질 Rv3619, Rv1813, Rv3260 및 RV2608로 구성되고, ID93으로 표시된 재조합 융합 단백질 항원을 개발하였다. 이들 성분 단백질은 TB-감염된 또는 BCG-접종된 공여자로부터의 인간 T 세포에 의해 인식되는 것으로서 확인되었고, 수-중-스쿠알렌 안정성 에멀션 (GLA-SE) 중에 제형된 합성 TLR4 아고니스트 글루코피라노실 지질 보조제와 같은 강력한 TH1 반응을 유도하는 보조제와 쌍을 이루었을 때 마우스 및 기니아 피그 모델에서 Mtb 도전에 대해 보호성을 나타냈다 (Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med, 2:53ra74; Bertholet et al., 2008, J Immunol, 181:7948-7947). ID93+GLA-SE는 현재 인간 지원자에서 단계 I 안전성 실험이 진행중이다.
ID93 및 GLA-SE는 둘 다 지속적인 콜드-체인 유지하에 저장될 때 1년 이상 안정하였다. 이들 조건하에서 단백질 농도, GLA 농도, 입자 크기 또는 물리적 외관의 변화는 관찰되지 않았다. 안정성 관찰은 4℃에서의 분해에 대한 시간의 추정 없이 진행되었다. 비록 ID93+GLA-SE의 안정성이 다른 백신과 동등하긴 하였지만, 지속적인 콜드 체인 유지를 위한 요구조건을 줄이기 위해서는 백신 열안정성의 증가가 바람직하였다. 상승된 온도에서의 백신 안정성을 개선시키기 위한 한 가지 접근법은 백신의 항원 성분을 동결건조시키고, 그것을 다음에 사용시점에서 보조제와 혼합하는 것이었다. 그러나 이것은 보조제에 대한 콜드-체인 유지를 필요로 하였고 백신접종의 기술적 부담을 증가시켰다. 이 문제를 극복하기 위하여 항원 ID93 및 GLA-SE 보조제 둘 다의 단일 바이알 ("코바이알됨"으로 명명함)을 개발하였다.
물질 및 방법
샘플 제조 및 동결건조
Ntb 유전자 Rv3619, Rv1813, Rv3620 및 Rv2608을 함유하는 ID93 탠덤 융합 단백질의 구성, 발현 및 정제는 앞서 기술되었다 (Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med, 2:53ra74). 간단히 설명하면, ID93 융합 단백질을 대장균에서 발현시키고, DEAE 및 Q 세파로오스 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 변성 조건하에서 정제한 후, 4 내지 20% 트리스 글리신 겔 (Invitrogen) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. GLA (또한 PHAD로도 알려짐)를 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL)로부터 구입하였다. 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC)을 함유하는 GLA-SE를 이전에 기술된 방법을 따라 제형하였다 (Orr et al., 2013 J Control Release 172:190-200; Anderson et al., 2010 Colloids Surf B: Biointerfaces 75:123-32). 간단히 설명하면, GLA-SE 에멀션을 완충된 수성 상 (암모늄 포스페이트 완충제 pH 5.1 중의 폴록사머 188 및 글리세롤)을 오일상 (70℃에서의 음파처리에 의해 스쿠알렌에 분산된 DMPC 및 GLA)과 혼합한 후 그 혼합물을 Microfluidics M110P (Newton, MA)를 사용하여 12번 통과시키는 동안 30,000 psi에서 미세유동화함으로써 제조하였다.
에멀션 중의 성분 농도는 10% v/v의 스쿠알렌, 1.9% w/v의 포스파티딜콜린, 0.1% w/v의 폴록사머 188, 2.3% w/v의 글리세롤 및 25 mM의 암모늄 포스페이트 완충제로 구성되었다. 사용을 위해 GLA-SE를 명시된 농도로 희석하였다.
GLA-SE 보조제 첨가된 백신의 분석을 위해, 액체 및 동결건조된 샘플을 3 mL 유리 바이알 중에서 1.5 mL 충전 부피로 제조하였다. ID93 (5 μg/mL) + GLA-SE (50 μg/mL, 2% 총 오일)을 함유하는 코바이알 샘플을 20 mM 트로메타민 (트리스) 중에서 pH 8.0에서 제조하였다 (Coler et al., 2011, PLoS One, 6, e16333). 별도로 바이알에 넣은 ID93 또는 GLA-SE를 코바이알 샘플의 농도의 두 배로 제조하고 (10 μg/mL ID93 또는 100 μg/mL GLA, 4 % 총 오일 GLA-SE) 주입 전에 1:1로 혼합하였다. SDS-PAGE를 위한 샘플을 100 μg/mL ID93으로 제조하여 분석을 용이하게 하였다. 동결건조된 샘플은 또한 안정화제로서의 5% (w/v) D-트레할로오스 탈수화물을 함유하였고, 그것을 VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85 벤치탑 냉동 건조기를 사용하여 동결건조시켰다. 동결건조 방법은 4에서 -40℃까지의 10-시간 냉동 단계 및 -15℃에서의 아닐링 단계를 포함하는 열 처리 스케줄을 활용하였다. 일차 건조 단계 (100 mTorr에서)를 -40℃부터 25℃까지 18시간 동안 계속하였다. 마지막으로, 50 mTorr에서 이차 건조 단계를 25℃에서 9시간 동안 사용하였다. 모든 샘플을 대기 가스에서 500 mTorr에서 중단시키고, 알루미늄 뚜껑을 사용하여 밀봉한 후, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 열 스트레스를 받은 샘플들을 50℃에서 30일 동안 인큐베이션하였고 스트레스를 받지 않은 샘플을 주입 전에 4℃에서 저장하였다.
SLA-SE 보조제 첨가된 백신의 분석을 위해, 3 mL의 유리 바이알에 1.5 mL의 충전 부피로 동결건조된 샘플을 제조하였다. 2% (v/v)의 오일 SE, 50 μg/mL의 SLA, 100 μg/mL의 ID93, 20 mM의 Tris pH 8.0 및 5% (w/v) 트레할로오스를 함유하는 코바이알 샘플을 제조하였다. 샘플들을 VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85 벤치탑 냉동 건조기를 사용하여 동결건조시켰다. 동결건조 방법은 4에서 -40℃까지의 10-시간 냉동 단계 및 -15℃에서의 아닐링 단계를 포함하는 열 처리 스케줄을 활용하였다. 일차 건조 단계 (100 mTorr에서)를 -40℃부터 25℃까지 18시간 동안 계속하였다. 마지막으로, 50 mTorr에서 이차 건조 단계를 25℃에서 9시간 동안 사용하였다. 모든 샘플을 대기 가스에서 500 mTorr에서 중단시키고, 알루미늄 뚜껑을 사용하여 밀봉한 후, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 열 스트레스를 받은 샘플들을 50℃에서 30일 동안 인큐베이션하였고 스트레스를 받지 않은 샘플을 4℃에서 저장하였다. 이중 바이알 (A 및 B로 표시함)을 특성화하였다. 샘플 복원을 1.5 mL 여과된 H2O를 사용하여 실시하였다.
환원 SDS-PAGE
환원 SDS-PAGE를 1.25% β-머캡토에탄올이 첨가되어 있는, Life Technologies (Grand Island, NY) NuPAGE LDS 샘플 완충액을 사용하여 수행하고, 90℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 180 V에서 Life Technologies Novex 4 내지 20% 아크릴아미드 트리스-글리신 프리캐스트 겔 카세트에서 레인당 1 μg의 ID93을 사용하여 65분 동안 흐르게 하였다. 겔을 Life Technologies SimplyBlue SafeStain을 사용하여 밤새 염색한 후 탈염색하고, 건조시킨 후 영상화하였다. 밴드 세기를 ImageJ 소프트웨어 (NIH) (Schneider et al., 2012, Nat Methods, 9:671-675)를 사용하여 비교하였다.
입자 분석
입자 크기, 다중분산성 및 제타 전위 측정을 앞서 기술된 것과 같이 (Fox et al., 2008, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65:98-105), 20 nm Whatman (Maidstone, Kent, UK) Anotop 플러스 필터를 통해 여과된 초고순도의 물에 100배희석한 후에 Malvern (Worcestershire, UK) Nano-ZS를 사용하여 실시하였다. 나노입자 트래킹 분석을 405 nm 레이저 및 Hamamatsu Orca Flash 2.8 CMOS 카메라 (Hamamatsu, JP)가 달린 NanoSight LM10 (Amesbury, UK)을 사용하여 수행하였다. 샘플을 3 단계로 20-nm 여과된 초고순도 물에 1:105로 희석하였다. 각 샘플을 희석하고 독립적으로 4회 분석하여 희석 에러를 만회하였다. 90초 비디오를 최적화된 셔터 및 게인 세팅을 사용하여 각 샘플에 대해 기록하였다. 카메라 히스토그램 게이팅을 감도를 최대화하기 위해 조정하였다. 데이터 분석을 NanoSight NTA 2.3 소프트웨어 (Wiltshire, UK)를 사용하여 표준 방식으로 수행하였다.
보조제의 화학적 세기
스쿠알렌, DMPC, GLA 및 SLA의 농도를 역상 HPLC (RP-HPLC)를 사용하여 앞서 기술된 것과 같이 모니터링하였다 (Fox et al., 2008, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65:98-105). Agilent 1200 (Santa Clara, CA) 및 ESA Biosciences 코로나 충전된 에어로졸 검출기 (CAD; Chelmsford, MA)를 Waters (Milford, MA) Atlantics C18 5 μm 칼럼 (4.6 mm x 250 mm)과 함께 사용하였다. 이동상 A는 75:15:10 (v/v/v)의 메탄올, 클로로포름 및 물을 20 mM 암모늄 아세테이트 및 1% 아세트산과 함께 함유하였다. 이동상 B는 50:50 (v/v)의 메탄올 및 클로로포름, 20 mM 암모늄 아세테이트 및 1% 아세트산을 함유하였다. 샘플들을 이동상 B에 희석함 (1:20)으로써 제조하였고, 9 μL를 30℃ 칼럼에 주입한 후 45분에 걸쳐 100% 내지 10% 이동상 A의 구배를 사용하여 용출하였다. 표준 곡선을 검출기 제조업체가 권장한 대로 이차 다항식에 맞추었고, 내삽에 의해 샘플 농도를 측정하였다.
동물 및 면역화
생후 6 내지 8주의 암컷 C57BL/6 마우스를 Charles River로부터 구매하고 특수한 병원체 유리 조건에서 유지시켰다. 감염 후 동물들을 동물 생체안정성 레벨 3 (Animal Biosafety Level 3) 방지책으로 유지시켰다. 마우스들을 3주 간격으로 100 mL의 표시된 백신 제제를 3회 근육 내 주입함으로써 면역화시켰다. BCG 면역화를 위해 5x104 CFU (Pasteur strain, Sanofi Pasteur)를 첫 번째 하위유닛 면역화시 피내로 한 번 주사하였다.
혈구 계수
말초혈을 면역화 후 18시간 후에 마우스들 (N=5/그룹)로부터 수집하였다. 전혈을 CD90.2 (클론 53-2.1) 및 CD19 (클론 6D5)에 대해 염색하였다. 구형의 AccuCount 레인보우 입자 (Spherotech, Lake Forest, IL)를 제조업체의 지시를 따라 첨가하였다. 세포를 세척하고 PBS에 재현탁하였다. 106 이벤트까지를 4-레이저 LSRFortessa 유세포분석기 (BD Biosciences) 상에 수집하였다. 데이터를 FlowJo를 사용하여 분석하였다. 혈액의 마이크로리터당 CD19+ B 세포 및 CD90.2+ T 세포의 절대수를 제조업체의 지시를 따라 계산하였다.
항체 반응
마우스 혈청 (N=5/그룹)을 면역화 후 21일째에 안와 뒤쪽 혈액을 마이크로테이너 혈청 수집 튜브 (VWR International, West Chester, PA) 안에 수집하고, 이어서 원심분리함으로써 제조하였다. 그런 다음 각각의 혈청 샘플을 항체 포획 ELISA에 의해 분석하였다. 간단하게 설명하면, ELISA 플레이트 (Nunc, Rochester, NY)를 0.1 M 중탄산염 완충액 중의 1 mg/ml 재조합 항원으로 코팅하고 1% BSA-PBS로 차단하였다. 그런 다음, 계속된 순서로 및 PBS/Tween20 중에서 세척한 후에, 혈청 샘플을 연속적으로 희석하고, 항-마우스 IgG, IgG1 또는 IgG2c-HRP (모두 Southern Biotech, Birmingham, AL) 및 ABTS-H2O2 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 405 nm에서 분석하였다 (ELX808, Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT).
세포 내 사이토킨 염색
최종 면역화 후 1개월 후에, 비장세포를 그룹당 5마리의 동물들로부터 분리하였다. 적혈구를 적혈구 용해 완충액 (eBioscience)을 사용하여 용해시키고 RPMI 1640 및 10% FBS에 재현탁하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 2x106 세포/웰로 플레이팅하고 1시간 동안 배지 또는 ID93 (10 mg/mL)로 37℃에서 자극하였다. 거기에 GolgiPlug (BD Biosciences)를 첨가하고 세포를 추가로 7시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 표면을 CD16/32에 대한 항체 (클론 2.4G2)의 존재하에 형광색소로 표지된, CD4에 대한 항체 (클론 ), CD8에 대한 항체 (클론 53-6.7) 및 CD44에 대한 항체 (클론 IM7)로 20분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포들을 세척하고 세포고정/세포침투 (Cytofix/Cytoperm) (BD Biosciences)로 20분 동안 실온에서 침투시켰다. 세포를 침투/세척 (Perm/Wash) (BD Biosciences)으로 2회 세척하고 IFN-γ에 대한 형광색소 표지된 항체 (클론 XMG-1.2), IL-2에 대한 형광색소 표지된 항체 (JES6-5H4), TNF에 대한 형광색소 표지된 항체 (MP6-XT22), CD154에 대한 형광색소 표지된 항체 (클론 MR1), IL-5에 대한 형광색소 표지된 항체 (클론 TRFK5) 및 IL-17A에 대한 형광색소 표지된 항체 (클론 TC11-18H10.1)로 세포 내에서 20분 동안 실온에서 염색하였다. 세포들을 세척하고 PBS에 재현탁하였다. 106 이벤트까지를 4-레이저 LSRFortessa 유세포분석기 (BD Biosciences) 상에 수집하였다. 데이터를 FlowJo를 사용하여 분석하였다. 세포를 단일세포 > 림프구 > CD4+ CD8- > CD44+ > 사이토킨 포지티브로서 모았다.
M. 투베르쿨로시스 에어로졸 도전 및 계수
마지막 면역화 후 4주 후에, 마우스들 (n=7/그룹)을 폐에 50 내지 100 박테리아를 전달하기 위해 눈금이 매겨진 GlasCol 에어로졸 발생기를 사용하여 M. 투베르쿨로시스 H37Rv (ATCC No. 35718; American Type Culture Collection)로 흡입시켜 감염시켰다. 전달된 박테리아의 양을 확인하기 위하여 감염당 추가의 3마리의 면역화되지 않은 동물을 하루 후에 안락사시키고 폐 안의 박테리아 무리를 계수하였다. 감염된 마우스로부터 폐를 수확하고, 조직을 0.1% PBS-Tween 80에 균등화한 후, 박테리아 성장을 위해 7H10 아가 플레이트 (Molecular Toxicology) 상에 5-배 연속 희석액을 플레이팅함으로써 도전 후 3주 후에 보호정도를 측정하였다. 37℃에서 5% CO2를 사용하여 14 내지 21일 동안 인큐베이션한 후에 박테리아 콜로니를 계수하였다.
통계학적 방법
박테리아 무리를 log10 변환에 의해 표준화하였다. 박테리아 무리의 차이의 통계학적 중요성, 사이토킨 생성, 혈구 계수 및 항체 역가를 프리즘 5를 사용하는 본페로니 다중 비교 시험으로 일원 변량 분석을 사용하여 측정하였다.
결과
GLA-SE 보조제 첨가된 백신 제형의 물리화학적 특성확인
이 코바이알 보조제 첨가된 백신에 대한 동결건조 방법을 개발하였다. 동결건조시, 백색의 부분적으로 수축된 케이크가 형성되었고, 물로 복원한 후 에멀션이 재형성되었으며 동결건조 전의 에멀션에 유사한 것으로 나타났다 (도 9, 상부 줄). 동결건조에 의한 열 스트레스에 대한 안정성을 증가시키는 가능성을 액체 또는 동결건조된 ID93 + GLA-SE를 50℃에서 30일 동안 인큐베이션함으로써 평가하였다. 열 스트레스 후에, 샘플 품질의 가시적인 변화는 스트레스를 받지 않은 샘플 (도 9, 상부 줄)에 비교할 때 관찰되지 않았다 (도 9, 하부 줄). 복원된 샘플은 에멀션의 외관을 유지하였고 동결건조된 케이크는 붕괴 또는 변색의 어떠한 추가 신호를 나타내지 않았다.
입자 특성들은 입자 크기가 생체 내에서의 백신의 수송 속도 및 메커니즘을 결정하기 때문에 효과적인 백신 개발에 중요하다. 200 nm 아래로 입자 크기를 유지하는 것이 생성물의 말단 멸균 여과를 허용하기 위해서 바람직하고; 또한 <200 nm의 입자 크기는 림프절에 신속하게 들어가는 것이 가능하다 (Bachmann et al., 2010, Nature Rev Immunol, 10:787-796). 코바이알링 또는 동결건조 및 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 동결건조가 생물물리적 특성들을 변경시키는 지를 평가하기 위하여, ID93, GLA-SE, 코바이알링된 ID93+GLA-SE 및 동결건조된 코바이알 ID93+GLA-SE의 입자 크기, 농도, 다중분산성 및 전체 제타 전위를 조사하였다. 혼합 후에 측정된 입자 특성들은 ID93에 비교하여 5배 더 큰 입자 농도 때문에 일차적으로 GLA-SE의 기여도를 반영하였다. ID93과 GLA-SE를 한 바이알에 넣는 것은 GLA-SE 단독에 비하여 입자 크기에 영향을 미치지 않았다 (두 경우 모두 80 nm). ID93+GLA-SE의 동결건조 및 후속적인 복원은 대략 10 nm의 미미한 증가를 초래하였지만 그것은 측정의 오차 범위 내에 있는 것이다. ID93은 Z-평균 직경이 대략 70 nm인 다분산성 응집체를 형성하였다. ID93 단독의 열 스트레스는 관찰된 평균 입자 크기를 감소시켰다; 그러나, 이것은 통계학적으로는 유의미하지 않았다 (p>0.05) (도 10a). GLA-SE 단독의 또는 ID93과 조합된 상태의 열 스트레스는 입자 크기나 시험된 플랫폼의 어느 것을 가로지르는 농도에 영향을 주지 않았다 (도 10a 및 도 10d). GLA-SE는 낮은 다중분산성 값에 의해 반영되는 것과 같이 고도로 균일한 용액이었다 (도 10b). 비록 ID93에 대해 관찰된 다중분산성의 정도가 훨씬 높다 할지라도, ID93과 GLA-SE의 혼합물은 전체적으로 GLA-SE의 낮은 다중분산성 특징을 보유하였고, 그것은 ID93과 GLA-SE 입자들의 상대적 비율을 반영한다. 중요한 것은, 동결건조되고 복원된 ID93+GLA-SE가 이 균일한 입자 크기를 유지하였다는 것이다. 열 스트레스에 대한 노출은 액체 또는 동결건조된 포맷의 ID93, GLA-SE 또는 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 다중분산성에 영향을 미치지 않았다. ID93 및 GLA-SE 둘 다 현재 형태에서 전체적인 네거티브 제타 전위를 가진다. 두 가지의 혼합은 -13 mV의 평균 제타 전위를 초래하였고, 그것은 동결건조에 의해 영향을 받지 않았다 (도 10c). 열 스트레스를 받을 대 모든 GLA-SE 함유 샘플에 대해 보다 네거티브한 제타 전위를 볼 수 있었지만; 이런 변화는 단지 동결건조된 ID93 + GLA-SE (p<0.025)에 대해서만 통계학적으로 유의미하였다. ID93+GLA-SE의 전체적인 동결건조 및 복원은 동결건조되지 않은 ID93+GLA-SE에 비교할 때 물리화학적 특성들을 변경시키지 않는다. GLA-SE가 아니라 ID93의 물리화학적 특성들은 연장된 시간 동안 상승된 온도에 대한 노출에 의해 상당히 영향을 받았다.
코바이알, 동결건조 및 열 스트레스가 ID93+GLA-SE의 화학적 통합성에 어떻게 영향을 미쳤는 지를 평가하기 위하여, SDS PAGE에 의한 ID93 농도 및 RP-HPLC에 의한 GLA, 스쿠알렌 및 DMPC (후자의 두 가지가 안정한 에멀션의 주요 성분이었음) 농도를 평가하였다. SDS-PAGE에 의해 5 μg/mL의 ID93을 검출할 수 없는 무능력으로 인해 100 μg/mL ID93을 함유하는 샘플을 평가하였다. 100 μg/mL 및 5 μg/mL ID93을 함유하는 코바이알 샘플은 액체, 동결건조 및 열-스트레스를 받는 조건하에서 입자 크기, 입자 농도, 제타 전위 및 GLA 분해 프로필의 관점에서 유사하게 행동하는 것으로 나타났다. GLA-SE는 SDS에 의해 에멀션 입자의 분포로 인한 것과 같이, 완화된 얼룩으로서 움직였고, 염색 후에 가시적이었다. 코바이알 ID93+GLA-SE의 동결건조 및 복원은 복원시 희석에 기인하여 예상된 것과 같이 ID93 농도의 5 내지 10% 감소를 초래하였고, 그것은 ID93의 실질적인 가수분해가 발생하지 않았음을 가리킨다 (도 11). 50℃에서 1개월 동안 열 스트레스에 노출될 때 ID93+GLA-SE에 존재하는 ID93의 극적인 감소가 있었다. ID93+GLA-SE의 동결건조는 이 분해에 대해 단백질을 내성으로 만들었고 이때 액체 및 동결건조된 샘플에 대해 열 스트레스 후 관찰된 ID93 밴드 세기는 스트레스를 받지 않은 샘플에 비해 각각 6% 및 90%였다 (도 11). 그러므로 ID93+GLA-SE의 동결건조는 열 스트레스-유도된 분해로부터 ID93 단백질을 보호하였다.
예상했던 것처럼, GLA-SE를 ID93과 1:1로 혼합한 후 GLA, DMPC 및 스쿠알렌의 원래 농도의 대략 절반이 측정되었는데, 동결건조 및 복원 후에 물질의 손실은 없었다 (도 12a). 액체 GLA-SR의 열 스트레스에 대한 노출은 GLA 농도의 50% 손실을 유발하였다 (p<0.001). 이것은 ID93과의 코바이알링에 의해 열 스트레스 후 검출할 수 있는 GLA가 없는 지점까지 악화되었다 (도 12a). 이렇게 증강된 민감성은 GLA-SE 단독에 비교하여 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 보다 염기성인 pH에 기인하는 것일 수 있다. GLA의 이런 손실은 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 동결건조에 의해 개선되었는데, 대략 50%의 GLA가 열 스트레스를 받은 동결건조된 ID93+GLA-SE의 복원 후에 회수되었다 (도 12d). GLA는 DMPC나 스쿠알렌 농도가 열 스트레스에 의해 영향을 받지 않았기 때문에 GLA-SE의 주요한 열 가변성 성분이었다 (도 12b 내지 12d). 이것들을 함께 고려하면, 이들 데이터는 ID93+GLA-SE의 두 가지 활성 성분이 동결건조에 의해 열 유도된 분해로부터 보호되었음을 나타냈다.
전체적으로, ID93+GLA-SE의 동결건조는 복원시 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 화학적 및 생물물리적 특성들을 보유한 백색 내지 백색을 벗어난 케이크를 초래하였다. ID93+GLA-SE의 열 스트레스에 대한 노출은 ID93 및 GLA 둘 다의 상당한 손실을 초래하였다. 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 동결건조는 열 스트레스로 인한 이런 손실을 크게 개선시켰는데, 그것은 이런 접근법이 이 백신 후보의 콜드-체인 유지에 대한 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있었음을 가리킨다.
GLA-SE 보조제 첨가된 백신 제형의 백신 면역원성 및 효능
열 스트레스가 ID93+GLA-SE의 생물학적 활성에 영향을 미친 방식 및 동결건조가 어떠한 유해 효과를 개선시켰는지의 여부를 측정하기 위하여, 마우스들을 염수 또는 액체 항원 및 보조제 (액체)의 별도의 바이알로서, 항원과 보조제의 혼합물로서 (액체 코바이알) 또는 공동-동결건조된 항원 및 보조제 (동결건조 코바이알)로서 저장하였던 ID93+GLA-SE로 면역화시켰다. 면역화 물질을 면역화 전에 4℃에서 (즉 스트레스를 받지 않음) 또는 50℃에서 (즉 열 스트레스를 받음) 1개월 동안 저장하였다. 면역화 후에 혈액으로부터의 순환하는 B 및 T 세포의 일시적인 손실이 있었는데, 이들 세포가 그것들이 항원을 만나게 되는 곳인 배수 (draining) 림프절로 귀환하기 때문이다 (Shiow et al., 2006, Nature, 440:540-544). 이런 일시적인 림프구 감소증은 항원 제공 세포와 동족 림프구 사이의 효과적인 상호작용에 필요한 과정에서 림프구가 일시적으로 림프절에 포획되기 때문에 림프절 셧다운이라 명명되었다. GLA-SE 보조제는 부분적으로 그것의 우수한 보조제 활성을 해명할 수 있는 이런 효과를 증대시켰다. 스트레스를 받지 않은 액체 ID93+GLA-SE를 사용한 면역화는 혈액으로부터의 B 및 T 세포의 극적인 손실을 유도하였다 (도 13a). 액체 ID93+GLA-SE를 50℃에서 1개월 동안 스트레스를 주면 이 효과가 감소되었는데, 그것은 열 스트레스에 의해 GLA의 활성이 손상되었음을 시사한다. 스트레스를 받지 않은 액체 코바이알 ID93+GLA-SE는 액체 백신만큼이나 효과적으로 림프절 셧다운을 유도하였지만, 이 액체 코바이알 물질은 림프절 셧다운의 정도가 검출 가능한 GLA의 손실을 반영하는 것처럼 현저히 감소되었기 때문에 열 스트레스에 의해 더 영향을 받았다 (도 13a). 동결건조된 코바이알 ID93+GLA-SE는 액체 물질에 대한 것과 유사한 정도로 일시적인 림프구 감소증을 유발하였지만, 액체 코바이알 물질과는 달리 이 효과는 동결건조된 코바이알 백신의 열 스트레스에 의해 손상되지 않았다. 이들 데이터는 GLA-SE 보조제의 생물학적 활성이 열 스트레스에 대해 민감하였고, 이것은 ID93 항원과의 코바이알링에 의해 악화되었음을 시사하였다. 중요한 것은, 동결건조는 코바이알 ID93+GLA-SE가 이 변수에 의해 판독되는 것과 같이 열 스트레스의 손상에 대해 내성이 되도록 하였다는 것이다.
열 스트레스 및 동결건조가 ID93+GLA-SE의 생물학적 활성에 미치는 영향을 보다 완전하게 조사하기 위하여, 면역화 후에 ID93-특이적 항체 역가를 평가하였다. ID93+GLA-SE로의 면역화는 IgG2c 생성을 향해 왜곡된 혼합된 IgG1, IgG2c 반으을 유도하였다. 이것은 ID93+GLA-SE에 의해 생성된 IFN-γ 지배된 CD4 T 세포 반응을 반영하였다. 열 스트레스에 대한 노출은 측정 가능한 항체 역가를 유도하는 액체 ID93+GLA-SE의 능력을 상당히 손상시켰다 (도 13b). 이것은 열 스트레스시 ID93 단백질의 분해에 기인하는 것으로 보였다 (도 11). 백신이 4℃에서 저장될 때 코바이알링 ID93+GLA-SE가 항체 반응의 크기를 변경시키지는 않았을지라도, 이것은 열 스트레스에 유발된 항체-유도 가능성의 손실을 방지하기에는 충분하지 않았다. 역으로, 동결건조된 코바이알 ID93+GLA-SE는 크기 및 스트레스를 받지 않은 액체 물질로 왜곡되는 IgG1/IgG2c에서 유사한 왕성한 항체 반응을 유도하였고, 이것은 열 스트레스에 의해 손상되지 않았다 (도 13b).
ID93+GLA-SE는 IFN-γ, TNF 및 IL-2를 만드는 ID93-특이적 CD4 T 세포 (즉 TH1 세포)를 유도함으로써 M. 투베르쿨로시스에 대해 보호하였다. 열 스트레스에 대한 노출은 액체 ID93+GLA-SE로의 세 번째 면역화 후에 거의 50%의 이들 사이토킨중 어느 것의 생성에 의해 측정되는 바 ID93-특이적 TH1 세포의 빈도를 감소시켰다 (도 13c). 스트레스를 받은 액체 ID93+GLA-SE에 대한 TH1 반응이 ID93 단백질의 분해에도 불구하고 유지되었다는 것은 열 노출 후에 면역원성 펩티드 및 잔류 GLA의 존재를 반영하는 것 같았다. 액체 ID93+GLA-SE의 코바이알링은 4에서 저장되었을 때 TH1의 크기를 약간 증가시켰지만, 열 스트레스에 대한 노출은 그런 반응을 유도하는 액체 단일 바이알의 ID93+GLA-SE의 능력을 완전히 제거하였다. 동결건조된 코바이알 ID93+GLA-SE는 액체 ID93+GLA-SE로 제조된 것과 유하한 수준으로 TH1 반응을 유도하였다. 비판적으로, 액체 또는 액체 코바이알링된 ID93+GLA-SE와 달리, 동결건조된 코바이알 ID93+GLA-SE는 열 스트레스 후에 ID93-특이적 TH1 세포를 유도하는 능력을 완전히 보유하였다 (도 13c). 천연 ID93+GLA-SE로 면역화를 유도한 ID93-특이적 CD4 T 세포는 배타적으로 TH1 세포이고, 재자극시 IL-5 (TH2) 또는 IL-17 (TH17)을 생성하지 못하였다는 것은 앞서 측정된 것이었다 (Orr et al, 2013, Eur J Immunol.). 코바이알링, 동결건조 및/또는 열 스트레스에 대한 노출은 검출 가능한 IL-5 또는 IL-17 생성에 의해 측정되는 바 ID93+GLA-SE에 의한 TH2 또는 TH17 세포 중 어느 하나의 유도를 증강시키지 못하였다. 자극 후 CD154의 생성은 사이토킨 생성에도 불구하고 CD4 T 세포 활성화의 일반적인 마커일 것으로 제안되었다 (Frentsch et al, 2005, Nat Med, 11:1118:1124). 모든 경우에 CD154 발현 수준은 IFN-γ 및 TNF 둘 다의 그것을 밀접하게 반영하였고, 나아가 TH1 프로그래밍으로부터의 편차가 없었음을 나타낸다. 전체적으로 혈액으로부터의 초기 손상 림프구 탈출 (egress) (도 13a)은 ID93+GLA-SE 백신 접종에 대한 항체 (도 13b) 및 CD4 T 세포 반응 (도 13c) 둘 다의 후속적인 손실과 강력하게 상관된다.
열 스트레스, 코바이알링 및 동결건조가 어떻게 ID93+GLA-SE의 보호 효능에 영향을 미쳤는지를 평가하기 위하여, 면역화된 마우스들을 저용량의 에어로졸화된 M. 투베르쿨로시스로 도전시켰다. 3주 후에 액체 ID93+GLA-SE로 면역화된 동물들은 염수로 면역화된 동물들에 비해 폐 및 비장에서의 감소된 박테리아 무리에 의해 측정되는 바 M. 투베르쿨로시스에 대해 상당히 보호되었다 (도 14a 및 도 14b). 열 스트레스를 받은 액체 ID93+GLA-SE는 별도로 이런 보호 효능을 손상시키지 못하였는데, 그것은 아마도 이 면역화에 의해 유도된 잔류 ID93-특이적 TH1 반응을 반영한다 (도 13c). ID93+GLA-SE의 코바이알링은 4℃에서 저장될 때 보호 효능을 손상시키지 못하였지만, 액체 코바이알링된 백신은 열 스트레스에 노출되었을 때 모든 보호 효능을 상실하였다. 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 동결건조는 보호 효능을 유지하였고 가장 중요하게는, ID93+GLA-SE의 동결건조는 열 스트레스로 인한 보호 효능의 손실을 제거하였다 (도 14a 및 도 14b).
항원 및 나노에멀션 보조제의 공동동결건존 및 복원은 백신의 물리화학적 특성들을 유의미하게 변경시키지 못하였다. 복원 시 항원 및 TLR4 아고니스트 GLA 둘 다, 뿐만 아니라 스쿠알렌 오일의 농도는 출발 물질의 그것과 실질저긍로 다르지 않았다. 열 스트레스에 대한 연장된 노출은 액체 코바이알링된 또는 공동동결건조된 백신 중 어느 것의 물리적 특성들에 거의 영향을 미치지 못하였지만; 열 노출은 보조제의 스쿠알렌 또는 인지질 성분이 아니라, 항원 및 TLR4 아고니스트 둘 다의 화학적 분해를 유도하였다. 공동동결건조는 부분적으로 TLR4 아고니스트의 이런 손실에 대해 보호하였다.
열 스트레스로 인한 GLA의 손실은 실험 동물에 투여되었을 때 백신의 손상된 면역 반응 및 보호 효능을 강력하게 예측하는 것이었다. 비록 이런 관계가 완전히 정비례하는 건 아니지만, 액체 샘플에서 GLA의 감소는 면역화 후 ID93-특이적 CD4 T 세포의 감소된 빈도를 초래하였다. 열 스트레스를 받은 액체 코바이알링된 ID93+GLA-SE의 GLA의 완전한 손실은 CD4 T 세포 유도의 손실과 매치되었다. 역으로, 액체 샘플에서 ID93 단백질의 분해는 CD4 T 세포 반응의 크기에 거의 영향을 미치지 못하였다. 이론에 구속되는 것을 바라지 않지만, 이것은 아마도 열 스트레스를 받은 샘플에서 T 세포 반응을 프라임하기 위해 필요한 면역우세 펩티드의 보유에 기여할 수 있다. 다른 한편으로, 열 유도된 ID93의 분해는 백신에 대한 항체 반응의 크기를 상당히 손상시켰다. ID93-특이적 항체중 많은 것이 형태학적으로 의존적일 수 있다. 나아가 잔류 항체 반응은 우선적으로 IgG1이었고, 그것은 GLA 구동된 IgG2c 왜곡의 손실을 나타낸다. ID93+GLA-SE의 공동동결건조는 열 스트레스로 유도된 ID93-특이적 항체 반응의 손실을 크게 방지하였고, 그것은 단백질 구조가 이 과정에 의해 보호되었음을 나타낸다. 이것은 열 스트레스에 대한 항원들의 보호가 보호 효능에 대해서는 T 세포에 의존하는 ID93+GLA-SE와 같은 백신보다는 보호 효능에 대해 항체 반응에 의존하는 백신에 대해 더 결정적인 변수라는 것을 시사할 것이다. 실제로 열 스트레스를 받은 별도로 바이알링된 액체 백신은 에어로졸화된 Mtb로의 실험적 도전에 대해 보호 효능의 정도를 보유하였다. 열적 스트레스에 직면하여 동결건조에 의한 GLA 농도의 보유 능력, TH1 유도의 보유와 보호 효능의 유지 사이에는 분명한 상관관계가 있다.
SLA-SE 보조제 첨가된 백신 제형의 물리화학적 특성확인
코바이알링된 SLA-SE 보조제 첨가된 ID93 백신에 대한 동결건조 방법을 개발하였다. 동결건조시, 백색의, 부분적으로 수축된 케이크가 형성되었고, 물로 복원된 후에 에멸선에 형성되었다 (도 15). 동결건조에 의한, 열 스트레스에 대한 안정성을 증가시키는 가능성을 동결건조된 ID93 + SLA-SE의 이중 샘플 (A 및 B)을 50℃에서 30일 동안 인큐베이션함으로써 평가하였다. 열 스트레스 후, 샘플 품질의 가시적인 변화는 스트레스를 받지 않은 샘플 (도 15; 0일, A 및 0일, B)에 비교할 때 관찰되지 않았다 (도 15; 30일, A 및 30일, B). 복원된 샘플은 에멀션의 외관을 유지하였고, 복원 후 24시간 후에 크리밍을 나타내지 않았으며, 동결건조된 케이크는 붕괴 또는 변색의 어떠한 추가 신호를 나타내지 않았다.
코바이알링, 동결건조 및 열 스트레스가 ID93+SLA-SE의 화학적 통합성에 어떻게 영향을 미쳤는지를 평가하기 위하여, 복원된 제형들 중의 ID93 농도를 SDS PAGE에 의해 평가하였다 (도 16). 1 μg/mL의 ID93을 함유하는 복원된 샘플을 레인당 로딩하였다. ID93을 모든 시험 샘플에서 98 kDa 밴드로서 관찰하였다. 스트레스를 받은 코바이알링된 ID93+SLA-SE의 동결건조 및 복원은 스트레스를 받은 코바이알링된 ID93+SLA-SE와 비교할 때 ID93의 실질적인 가수분해를 초래하지 않았다 (도 16). 그러므로, ID93+SLA-SE의 동결건조는 열 스트레스-유도된 분해로부터 ID93을 보호하였다.
복원된 동결건조된 코바이알링된 ID93+SLA-SE가 보조제 첨가된 백신의 생물물리적 특성들을 변경시켰는지를 평가하기 위하여, 동결건조된 코바이알링된 ID93+SLA-SE의 입자 크기, 농도, 다중분산성 및 전체 제타 전위를 스트레스를 받았거나 받지 않은 조건하에서 조사하였다. 복원된 동결건조된 코바이알링된 ID93+SLA-SE의 열 스트레스는 스트레스를 받지 않은 코바이알링된 ID93+SLA-SE에 비교하여 입자 크기 또는 다중분산성 응집체 (도 17a 내지 17c) 또는 제타 전위 (도 18)을 유의미하게 변경시키지 않았다. 복원된 동결건조된 코바이알링된 ID93+GLA-SE에 유사하게, 복원된 동결건조된 코바이알링된 ID93+SLA-SE의 열 스트레스는 SLA의 약 ~50% 회수를 초래하였다 (도 19).
실시예 3: 동결건조된 백신 에멀션 제형 및 장기간 안정성
코바이알링된 GLA-SE 보조제 첨가된 ID93 백신에 대한 동결건조 방법을 개발하였다. 장기간 안정성에 대해 평가한 제형은 2% v/v 스쿠알렌, 0.4 % w/v DMPC, 0.02 % w/v 폴록사머 188, 0.5 % w/v 글리세롤 및 5 mM 암모늄 포스페이트 플러스 20 mM 트로메타민 및 5 % w/v 트레할로오스의 존재하에 동결건조된 ID 93 폴리펩티드로 구성된 GLA-SE 제형에 대해 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 제형이었다. 동결건조시, 백색의 부분적으로 수축된 케이크가 형성되었고, 물로 복원한 후 가시적인 크리밍 신호 없이 에멀션이 재형성되었다 (도 20). 동결건조에 의한, 열 스트레스에 대한 안정성을 증가시키는 가능성을 동결건조된 ID93 + GLA-SE의 이중 샘플 (A 및 B)을 4℃, 25℃ 및 37℃에서 1년 동안 인큐베이션함으로써 평가하였다.
3개월 안정성 데이터
4℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월 동안의 저장은 0 시간에 비교하여 복원시 케이크의 외관에 변화가 없고 적합한 에멀션을 형성하는 능력이 있음을 증명한다 (도 21a 및 도 21b). 동결건조된 케이크는 붕괴 또는 변색의 어떠한 추가 신호도 보이지 않았고, 복원된 샘플은 복원 후 24시간이 되도록 크리밍이 없는 에멀션의 외관을 유지하였다.
동결건조된 보조제 첨가된 백신 ID93+GLA-SE의 생물물리적 특성들을 4℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월 동안 저장된 샘플에 대해 입자 크기 (Z-평균 nm) 및 다중분산성 (PDI)의 관점에서 조사하였다. 3개월째에 제형은 37℃까지의 어떠한 저장 온도에서도 입자 크기나 응집체에서 유의할만한 변경을 나타내지 않았다 (도 21b).
4℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월 동안 저장된 동결건조된 에멀션에서, 코바이알링, 동결건조 및 열 스트레스가 ID93 폴리펩티드의 화학적 통합성에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하기 위하여, 복원된 제형을 SDS PAGE에 의해 평가하였다 (도 21c). 1 μg/mL ID93을 함유하는 복원된 샘플을 레인마다 로딩하였다. ID93을 모든 시험 샘플에서 98 kDa 밴드로서 관찰하였다. ID93+GLA-SE의 동결건조 및 복원은 ID93 폴리펩티드의 실질적인 가수분해를 초래하지 않는다. 그러므로, ID93+GLA-SE의 동결건조는 열 스트레스-유도된 분해로부터 ID93 단백질을 보호한다.
SE 제형의 화학적 통합성을 HPLC에 의해 평가하고 DMPC 및 스쿠알렌에 대해 분석하였다. 도 21d의 결과는 수-중-유 에멀션의 어떠한 성분의 손실 또는 분해도 없음을 증명한다.
4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형 중의 보조제의 농도를 평가하였다 (도 21e). 데이터는 3개월째에 어떠한 저장 온도에서든 50μg/ml의 초기 농도로부터 GLA의 유의미한 손실이 없음을 증명한다.
6개월 안정성 데이터
4℃, 25℃ 또는 37℃에서 6개월 동안의 저장은 0 시간에 비교하여 복원시 케이크의 외관에 변화가 없고 적합한 에멀션을 형성하는 능력이 있음을 증명한다 (도 22a 및 도 22b). 동결건조된 케이크는 붕괴 또는 변색의 어떠한 추가 신호도 보이지 않았고, 복원된 샘플은 복원 후 24시간이 되도록 크리밍이 없는 에멀션의 외관을 유지하였다.
동결건조된 보조제 첨가된 백신 ID93+GLA-SE의 생물물리적 특성들을 4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 동결건조된 샘플에 대해 6개월째에 입자 크기 (Z-평균 nm) 및 다중분산성 (PDI)의 관점에서 조사하였다. 6개월째에 제형은 37℃까지의 어떠한 저장 온도에서도 입자 크기나 응집체에서 유의할만한 변경을 나타내지 않았다 (도 22b).
코바이알링, 동결건조 및 열 스트레스가 4℃, 25℃ 및 37℃에서 6개월 동안 저장된 후에 ID93+GLA-SE 동결건조된 제형 중의 화학적 통합성에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하기 위하여, 복원된 제형을 SDS PAGE에 의해 평가하였다 (도 22c). 1 μg/mL ID93을 함유하는 복원된 샘플을 레인마다 로딩하였다. ID93을 모든 시험 샘플에서 98 kDa 밴드로서 관찰하였다. ID93+GLA-SE의 동결건조 및 복원은 ID93 폴리펩티드의 실질적인 가수분해를 초래하지 않는다. 그러므로, ID93+GLA-SE의 동결건조는 열 스트레스-유도된 분해로부터 ID93 단백질을 보호한다.
SE 제형의 화학적 통합성을 HPLC에 의해 평가하고 DMPC 및 스쿠알렌에 대해 분석하였다. 도 22d의 결과는 수-중-유 에멀션의 어떠한 성분의 손실 또는 분해도 없음을 증명한다.
4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형 중의 보조제의 농도를 평가하였다 (도 22e). 데이터는 6개월째에, 4℃ 또는 25℃의 저장 온도에서 50 μg/ml의 초기 농도에 비교하여 GLA의 유의미한 손실이 없지만, 37℃ 저장 온도는 GLA의 대략 50%의 손실을 나타내는 것을 보여준다.
9개월 안정성 데이터
4℃, 25℃ 또는 37℃에서 9개월 동안의 저장은 0 시간에 비교하여 복원시 케이크의 외관에 변화가 없고 적합한 에멀션을 형성하는 능력이 있음을 증명한다 (도 23a 및 도 23b). 동결건조된 케이크는 붕괴 또는 변색의 어떠한 추가 신호도 보이지 않았고, 복원된 샘플은 복원 후 24시간이 되도록 크리밍이 없는 에멀션의 외관을 유지하였다.
동결건조된 보조제 첨가된 백신 ID93+GLA-SE의 생물물리적 특성들을 4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 샘플에 대해 9개월째에 입자 크기 (Z-평균 nm) 및 다중분산성 (PdI)의 관점에서 조사하였다. 9개월째에 제형은 37℃까지의 어떠한 저장 온도에서도 입자 크기나 응집체에서 유의할만한 변경을 나타내지 않았다 (도 23b).
코바이알링, 동결건조 및 열 스트레스가 4℃, 25℃ 및 37℃에서 9개월 동안 저장된 후에 ID93 폴리펩티드의 화학적 통합성에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하기 위하여, 복원된 제형을 SDS PAGE에 의해 평가하였다 (도 23c). 1 μg/mL ID93을 함유하는 복원된 샘플을 레인마다 로딩하였다. ID93을 모든 시험 샘플에서 98 kDa 밴드로서 관찰하였다. ID93+GLA-SE의 동결건조 및 복원은 ID93의 실질적인 가수분해를 초래하지 않는다. 그러므로, ID93+GLA-SE의 동결건조는 열 스트레스-유도된 분해로부터 ID93 단백질을 보호한다.
SE 제형의 화학적 통합성을 HPLC에 의해 평가하고 DMPC 및 스쿠알렌에 대해 분석하였다. 도 23d의 결과는 9개월의 저장 후에 수-중-유 에멀션의 어떠한 성분도 손실되거나 분해되지 않았음을 증명한다.
4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형 중의 보조제의 농도를 평가하였다 (도 23e). 데이터는 6개월째에 볼 수 있었던 것과 같이, 9개월째에 4℃ 또는 25℃의 저장 온도에서 50 μg/ml의 초기 농도에 비교하여 GLA의 유의미한 손실이 없지만, 37℃는 GLA의 대략 60%의 손실을 나타내는 것을 보여준다.
12개월 안정성 데이터
4℃, 25℃ 또는 37℃에서 12개월 동안의 저장은 0 시간에 비교하여 복원시 케이크의 외관에 변화가 없고 적합한 에멀션을 형성하는 능력이 있음을 증명한다 (도 24a 및 도 24b). 동결건조된 케이크는 붕괴 또는 변색의 어떠한 추가 신호도 보이지 않았고, 복원된 샘플은 복원 후 24시간이 되도록 크리밍이 없는 에멀션의 외관을 유지하였다.
동결건조된 보조제 첨가된 백신 ID93+GLA-SE의 생물물리적 특성들을 4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 동결건조된 샘플에 대해 12개월째에 입자 크기 (Z-평균 nm) 및 다중분산성 (PDI)의 관점에서 조사하였다. 12개월째에 제형은 37℃까지의 어떠한 저장 온도에서도 입자 크기나 응집체에서 유의할만한 변경을 나타내지 않았다 (도 24b).
코바이알링, 동결건조 및 열 스트레스가 4℃, 25℃ 및 37℃에서 12개월 동안 저장된 후에 ID93 폴리펩티드의 화학적 통합성에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하기 위하여, 복원된 제형을 SDS PAGE에 의해 평가하였다 (도 24c). 1 μg/mL ID93을 함유하는 복원된 샘플을 레인마다 로딩하였다. ID93을 모든 시험 샘플에서 98 kDa 밴드로서 관찰하였다. ID93+GLA-SE의 동결건조 및 복원은 ID93 폴리펩티드의 실질적인 가수분해를 초래하지 않는다. 그러므로, ID93+GLA-SE의 동결건조는 12개월째에 열 스트레스-유도된 분해로부터 ID93 단백질을 보호한다.
4℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 동결건조된 ID93+GLA-SE 제형 중의 보조제의 농도를 평가하였다 (도 23e). 데이터는 12개월째에, 4℃ 또는 25℃의 저장 온도에서 50 μg/ml의 초기 농도에 비교하여 GLA의 유의미한 손실이 없지만, 37℃는 GLA의 69%의 손실을 나타내는 것을 보여준다.
실시예 4: 동결건조된 백신 에멀션 제형 및 고온에서 열 안정성이 개선되고 보조제의 손실이 없는 단일 및 다중-부형제 시스템의 안정성
동결건조되고 제형된 수-중-유 안정한 에멀션을 실시예 1에서 기술한 물질을 사용하고 방법을 따라 제조하고 동결건조하였다. 동결건조된 수-중-유 안정한 에멀션 (SE) 제형의 특성들을 복원하고 실시예 1에서 기술한 대로 용융점, 습기 측정, 입자 크기 및 제타 전위, 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 화학적 분해, 복원 스크리닝, 케이크 안정성 스크리닝 및 가속화된 안정성 특성확인에 대해 특성화하였다.
예비 실험을 기초로, 등장성 제제로서의 글리세롤의 사용은 25℃보다 높은 온도에서 발명의 제형들의 열 불안정성에 기여할 수 있을 것으로 추정하였다. 발명의 제형에서 등장성 제제로서의 글리세롤의 제거가 3개월보다 긴 시간 동안 25℃보다 높은 온도에서 더 큰 열안정성을 제공할 수 있을 것인지를 측정하기 위하여 조사를 수행하였다. 글리세롤의 제거 외에, 이 실시예에서 생체분해성 오일, 스쿠알렌의 백분율을 실시예 1에 기술된 방법에 의해 발명의 개선된 50℃ 열안정성 2.5% 트레할로오스 및 2.5% 만니톨 동결건조 제형에서 동결건조될 때의 열안정성 및 케이크 특성확인에 대해 평가하였다.
실시예 1에서 기술된 것과 같은 샘플은 0.5% w/v 글리세롤을 함유하였거나 글리세롤이 없고 추가의 등장성 제제로서 2% v/v 트리스가 있거나 없이 제형된, 표시된 백분율의 스쿠알렌 (표시된 바 2% 내지 10% v/v 스쿠알렌), 0.4 % w/v DMPC, 0.02 % w/v 폴록사머 188, 0.5 % w/v 글리세롤 및 5 mM 암모늄 포스페이트를 나타낸다. 도 25a의 데이터는 증가하는 농도의 스쿠알렌 (2 내지 10% v/v)을 가지고 0.5% 글리세롤이 없는 (글리세롤 없음으로 표지됨) 에멀션 제형들이 모두, 동결건조 직후 (시간 0일) 및 50℃에서 30일 동안 저장한 후에 약간 수축되고 가라앉은 케이크를 형성하는 0.5% v/v 글리세롤을 함유하는 (글리세롤 포함으로 표지됨) 제형에 비교할 때 동결건조시 엘레간트 케이크를 형성하였고 50℃에서 30일 동안 저장한 후에도 케이크의 수축이나 변색이 없었음을 증명한다. 제형의 크리밍에 대한 케이크의 복원의 비교는 인지할만한 차이가 없는 것으로 나타났다.
도 25b 및 도 25c는 어떠한 제형에 대해서도 50℃에서 30일 동안 저장한 후 어떠한 제형에 대해 입자 크기 (Z-평균 nm) 및 다중분산성 (PDI) (각각)에 대해 어느 하나의 입자 크기에 인지할만한 차익 없음을 나타낸다. 도 25d는 0.5% v/v 글리세롤의 존재가 제형 중의 보조제, GLA에 대한 안정성에 영향을 미친다는 증거를 제공한다. 증가하는 생체분해성 오일 함량 (25 내지 10%)으로 제조된 에멀션 제형들 중 어느 것도 50℃에서 30일 동안 동결건조된 바이알을 저장한 후 복원된 샘플에 비교하여, 출발 농도에 비교하여 (막대 상에 0으로 시간이 0이라는 것이 표시됨) GLA 농도에 어떠한 손실도 보이지 않는다. 글리세롤의 존재하에 동결건조된 에멀션들은 30 내지 40%의 GLA 손실을 나타낸다.
이 데이터를 기초로, 발명의 백신 제형들은 50℃ 온도를 견디기 위해 동결건조될 수 있어서 더 엘레간트한 케이크를 제조할 수 있고 그로써 기술분야의 숙련자가 인식하게 되는 것처럼 더 큰 열안정성을 제공할 수 있는 것으로 보인다.
0실시예 5: 4개의 동결건조된 백신 에멀션 제형의 개발 및 특성확인 및 고온에서 열 안정성이 개선되고 보조제 손실이 없는 단일 및 다중-부형제 시스템의 안정성
4개의 동결건조 제형을 본원에 기술된 GLA-SE 에멀션을 열보호하는 능력에 대해 평가하였다. 모든 제형은 등장성 제제로서의 글리세롤이 없다. 개발되고 평가된 제형들은 5% 트레할로오스 단독 (글리세롤 없음)(도 26a), 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨 (도 26b), 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨 (도 26c) 및 10% w/v 트레할로오스 (도 26d)였고, 케이크 형성 및 복원 후의 외관 및 크리밍에 대해 표시된 것과 같이 4℃, 25℃, 37℃ 및 50℃에서 표시된 시간 동안 저장된 샘플에 대해 동결건조 후 시간 0에 (동결건조 직후), 1주 후 (1 wk), 2주 후 (2 wk), 1개월 후 (1 mo) 및 3개월 후 (3 mo)에 평가하였다. 데이터의 비교는 모든 샘플이 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨로 러블리 백색 케이크를 형성하였고 (도 26b), 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨이 모든 저장 온도에서 가장 엘레간트한 케이크를 형성하는 (도 26c) 것을 나타낸다. 5% w/v 트레할로오스, 0.1% w/v 만니톨 (도 26b), 2.5% w/v 트레할로오스, 2.5% w/v 만니톨 (도 26c)에 의해 형성된 엘레간트 케이크는 기술분야에 공지된 것과 같이 엘레간트한 구조를 나타낸다. 그로써 발명의 동결건조된 GLA-SE 에멀션으로부터 등장성 제제로서의 글리세롤의 제거는 4℃, 25℃, 37℃ 및 50℃로부터의 온도 범위에 걸쳐 1주 (1 wk), 2주 (2 wk), 1개월 (1 mo) 및 3개월 (3mo) 동안 저장될 때 그것의 구조적 통합성을 유지하는 보다 엘레간트한 케이크 구조를 유발한다 (도 26a 내지 26d).
동결건조된 제형들을 모두 표시된 것과 같이 4℃, 25℃, 37℃ 및 50℃에서 1주 (1 wk), 2주 (2 wk), 1개월 (1 mo) 및 3개월 (3mo) 동안 저장하였다. 샘플들을 저장소에서 꺼내어 복원하고, 도 27 내지 31에 나타낸 것과 같이 복원 후 입자 크기 (Z-평균 nm), 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA 함량에 대해 비교하였다.
도 27은 각 제형에 대해 동결건조 성분들의 첨가 전의 동결건조 전 에멀션 (막대 위에 Pre Lyo로 표지됨), 동결건조 전의 GLA-SE 제형 (막대 위에 Lyo로 표지됨) 및 동결건조 후 이어지는 복원 (O로 표지됨)을 비교한 것을 도시한다. 제형들의 초기 비교는 각각의 제형을 가지고 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경을 가지는 입자 크기, 다중분산성에 의해 측정되는 인지할 수 있을 정도의 응집체의 결핍, 생리적 pH 및 인지할 수 있을 정도의 GLA의 손실의 부재를 포함하여 적절한 복원된 에멀션 특성들을 가지는 동결건조 제형들 사이에 인지할 정도의 차이가 없는 것을 증명하였다.
도 28은 4℃ (막대 1), 25℃ (막대 2), 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 1주 동안 (1 wk) 저장된 다양한 단일 바이알 동결건조 제형을 도시한다. 샘플을 복원하였고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석하였다. 도 28A의 데이터는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기 (도 28A), 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 결핍 (도 28B) 및 생리적 pH (도 28C)를 증명하였다. 동결건조된 케이크에 대한 평균 입자 크기가 50℃에서 모든 제형에 대해 다른 샘플들에 비해 대략 40% 증가하는 한편, 입자 크기는 바람직하게 약 200 nm 미만의 범위 내에 머물러 있다는 것이 주목할 만하다. 중요하게도, 글리세롤이 없는, 시험한 제형들 모두 어떠한 시험 온도에서도 1주일의 저장 후에 GLA의 손실이 없는 것으로 나타났다.
도 29는 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 2주 동안 (2 wk) 저장된 다양한 단일 바이알 동결건조 제형을 도시한다. 샘플을 복원하였고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석하였다. 도 29A의 데이터는 37℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기 (도 29A), 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 결핍 (도 29B) 및 생리적 pH (도 29C)를 증명하였다. 동결건조된 케이크에 대한 평균 입자 크기가 50℃에서 모든 제형에 대해 다른 샘플들에 비해 대략 40% 증가하는 한편, 입자 크기는 2주째에 변하지 않는 것으로 나타났고 바람직하게 약 200 nm 미만의 범위 내에 머물러 있다는 것이 주목할 만하다. 중요하게도, 글리세롤이 없는, 시험한 제형들 모두 어떠한 시험 온도에서도 1주일의 저장 후에 GLA의 손실이 없는 것으로 나타났다.
도 30은 4℃ (막대 1), 25℃ (막대 2), 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 1개월 동안 (1 mo) 저장된 다양한 단일 바이알 동결건조 제형을 도시한다. 샘플을 복원하였고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석하였다. 도 30A의 데이터는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기 (도 30A), 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 결핍 (도 30B) 및 생리적 pH (도 30C)를 증명하였다. 2.5% 트레할로오스, 2.5% 만니톨 제형에 대한 평균 입자 크기가 120 nm로부터 175 nm로 성장하는 경향이 주지되지만, 평균 입자 크기는 여전히 200 nm 아래에 있고 제형은 GLA의 어떠한 손실도 나타내지 않는다.
도 31은 4℃ (막대 1), 25℃ (막대 2), 37℃ (막대 3) 및 50℃ (막대 4)에서 1개월 동안 (1 mo) 저장된 다양한 단일 바이알 동결건조 제형을 도시한다. 샘플을 복원하였고, 입자 크기 (Z-평균 직경, nm), 응집체의 함수로서의 다중분산성 (PDI), pH 및 GLA의 농도 (mg/ml)에 대해 분석하였다. 도 31A의 데이터는 4℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 저장될 때 4개의 모든 동결건조 제형이 약 200 nm 미만의 바람직한 크기의 입자 크기 (도 31A), 다중분산성에 의해 측정되는 바 인지할 수 있을 정도의 응집체의 결핍 (도 31B) 및 생리적 pH (도 31C)를 증명하였다. 이 실시예 5의 데이터는 50℃까지의 온도에서 1개월 이상 저장될 때 50℃에서 증강된 열안정성을 나타내는 보조제 (GLA)를 포함하는 수-중-유 에멀션 (SE)의 단일 바이알 동결건조에 대한 추가의 우세한 후보 제형을 제공한다.
본 발명은 항원, 단일 보조제, 다중 보조제 또는 그것들의 어떠한 조합에 적합하고, 콜드 체인 저장에 대한 필요성을 감소시키거나 제거하기 위한 특별한 활용성을 가짐으로써 그것들을 기술을 뛰어넘은 개선된 제형으로 만들어주는 수-중-유 에멀션의 단일 바이알 동결건조에 대한 많은 제형들을 제공한다.
서열
임의로 His 태그를 가지는 ID93 융합 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1)
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
ID93 융합 폴리펩티드 (SEQ ID NO:2)
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임의로 His 태그를 가지는 ID83 융합 폴리펩티드 (SEQ ID NO:3)
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ID83 융합 폴리펩티드 (SEQ ID NO:4)
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Rv1813 (SEQ ID NO:5)
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Rv3620 (SEQ ID NO:6)
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Rv2608 (SEQ ID NO:7)
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Rv3619 (SEQ ID NO:8)
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SEQUENCE LISTING <110> INFECTIOUS DISEASE RESEARCH INSTITUTE FOX, Christopher B. VEDVICK, Thomas S. BARNES, Lucien KRAMER, Ryan M. REED, Steven G. <120> SINGLE VIAL VACCINE FORMULATIONS <130> 712192003040 <140> PCT/US2014/072615 <141> 2014-12-29 <150> US 61/922,761 <151> 2013-12-31 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 911 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala 20 25 30 His Gly Ala Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His 35 40 45 Gln Ala Ile Ile Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Ala Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Phe Gln Val Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln 85 90 95 Ala Ala Gly Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser 100 105 110 Trp Ala Gly Thr His Leu Ala Asn Gly Ser Met Ser Glu Val Met Met 115 120 125 Ser Glu Ile Ala Gly Leu Pro Ile Pro Pro Ile Ile His Tyr Gly Ala 130 135 140 Ile Ala Tyr Ala Pro Ser Gly Ala Ser 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Gln Met Asn Gln Ala 260 265 270 Phe Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val 275 280 285 Arg Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile 290 295 300 Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Phe Ala Val Leu Pro Pro Glu Val Asn 305 310 315 320 Ser Ala Arg Ile Phe Ala Gly Ala Gly Leu Gly Pro Met Leu Ala Ala 325 330 335 Ala Ser Ala Trp Asp Gly Leu Ala Glu Glu Leu His Ala Ala Ala Gly 340 345 350 Ser Phe Ala Ser Val Thr Thr Gly Leu Ala Gly Asp Ala Trp His Gly 355 360 365 Pro Ala Ser Leu Ala Met Thr Arg Ala Ala Ser Pro Tyr Val Gly Trp 370 375 380 Leu Asn Thr Ala Ala Gly Gln Ala Ala Gln Ala Ala Gly Gln Ala Arg 385 390 395 400 Leu Ala Ala Ser Ala Phe Glu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Val Ser Pro 405 410 415 Ala Met Val Ala Ala Asn Arg Thr Arg Leu Ala Ser Leu Val Ala Ala 420 425 430 Asn Leu Leu Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu 435 440 445 Tyr Glu Gln Ile Trp Ala Gln Asp Val Ala Ala Met Phe Gly Tyr His 450 455 460 Ser Ala Ala Ser Ala Val Ala Thr Gln Leu Ala Pro 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Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His 195 200 205 Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln 210 215 220 Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Phe Ala 225 230 235 240 Val Leu Pro Pro Glu Val Asn Ser Ala Arg Ile Phe Ala Gly Ala Gly 245 250 255 Leu Gly Pro Met Leu Ala Ala Ala Ser Ala Trp Asp Gly Leu Ala Glu 260 265 270 Glu Leu His Ala Ala Ala Gly Ser Phe Ala Ser Val Thr Thr Gly Leu 275 280 285 Ala Gly Asp Ala Trp His Gly Pro Ala Ser Leu Ala Met Thr Arg Ala 290 295 300 Ala Ser Pro Tyr Val Gly Trp Leu Asn Thr Ala Ala Gly Gln Ala Ala 305 310 315 320 Gln Ala Ala Gly Gln Ala Arg Leu Ala Ala Ser Ala Phe Glu Ala Thr 325 330 335 Leu Ala Ala Thr Val Ser Pro Ala Met Val Ala Ala Asn Arg Thr Arg 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Val Ala Ala Asn Leu Leu Gly Gln Asn Ala Pro Ala 355 360 365 Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu Tyr Glu Gln Ile Trp Ala Gln Asp Val 370 375 380 Ala Ala Met Phe Gly Tyr His Ser Ala Ala Ser Ala Val Ala Thr Gln 385 390 395 400 Leu Ala Pro Ile Gln Glu Gly Leu Gln Gln Gln Leu Gln Asn Val Leu 405 410 415 Ala Gln Leu Ala Ser Gly Asn Leu Gly Ser Gly Asn Val Gly Val Gly 420 425 430 Asn Ile Gly Asn Asp Asn Ile Gly Asn Ala Asn Ile Gly Phe Gly Asn 435 440 445 Arg Gly Asp Ala Asn Ile Gly Ile Gly Asn Ile Gly Asp Arg Asn Leu 450 455 460 Gly Ile Gly Asn Thr Gly Asn Trp Asn Ile Gly Ile Gly Ile Thr Gly 465 470 475 480 Asn Gly Gln Ile Gly Phe Gly Lys Pro Ala Asn Pro Asp Val Leu Val 485 490 495 Val Gly Asn Gly Gly Pro Gly Val Thr Ala Leu Val Met Gly Gly Thr 500 505 510 Asp Ser Leu Leu Pro Leu Pro Asn Ile Pro Leu Leu Glu Tyr Ala Ala 515 520 525 Arg Phe Ile Thr Pro Val His Pro Gly Tyr Thr Ala Thr Phe Leu Glu 530 535 540 Thr Pro Ser Gln Phe Phe Pro Phe Thr Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr 545 550 555 560 Asp Val Ser Val Ala Gln Gly Val Thr Asn Leu His Thr Ala Ile Met 565 570 575 Ala Gln Leu Ala Ala Gly Asn Glu Val Val Val Phe Gly Thr Ser Gln 580 585 590 Ser Ala Thr Ile Ala Thr Phe Glu Met Arg Tyr Leu Gln Ser Leu Pro 595 600 605 Ala His Leu Arg Pro Gly Leu Asp Glu Leu Ser Phe Thr Leu Thr Gly 610 615 620 Asn Pro Asn Arg Pro Asp Gly Gly Ile Leu Thr Arg Phe Gly Phe Ser 625 630 635 640 Ile Pro Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ser Gly Ala Thr Pro Ala Asp Ala 645 650 655 Tyr Pro Thr Val Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Asp Gly Val Asn Asp Phe 660 665 670 Pro Lys Tyr Pro Leu Asn Val Phe Ala Thr Ala Asn Ala Ile Ala Gly 675 680 685 Ile Leu Phe Leu His Ser Gly Leu Ile Ala Leu Pro Pro Asp Leu Ala 690 695 700 Ser Gly Val Val Gln Pro Val Ser Ser Pro Asp Val Leu Thr Thr Tyr 705 710 715 720 Ile Leu Leu Pro Ser Gln Asp Leu Pro Leu Leu Val Pro Leu Arg Ala 725 730 735 Ile Pro Leu Leu Gly Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ile Gln Pro Asp Leu 740 745 750 Arg Val Leu Val Glu Leu Gly Tyr Asp Arg Thr Ala His Gln Asp Val 755 760 765 Pro Ser Pro Phe Gly Leu Phe Pro Asp Val Asp Trp Ala Glu Val Ala 770 775 780 Ala Asp Leu Gln Gln Gly Ala Val Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser 785 790 795 800 Gly Leu Gly Leu Pro Pro Pro Trp Gln Pro Ala Leu Pro Arg Leu Phe 805 810 815 Ser Thr <210> 4 <211> 795 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 His Leu Ala Asn Gly Ser Met Ser Glu Val Met Met Ser Glu Ile Ala 1 5 10 15 Gly Leu Pro Ile Pro Pro Ile Ile His Tyr Gly Ala Ile Ala Tyr Ala 20 25 30 Pro Ser Gly Ala Ser Gly Lys Ala Trp His Gln Arg Thr Pro Ala Arg 35 40 45 Ala Glu Gln Val Ala Leu Glu Lys Cys Gly Asp Lys Thr Cys Lys Val 50 55 60 Val Ser Arg Phe Thr Arg Cys Gly Ala Val Ala Tyr Asn Gly Ser Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Gly Gly Thr Gly Leu Thr Arg Arg Ala Ala Glu Asp Asp Ala 85 90 95 Val Asn Arg Leu Glu Gly Gly Arg Ile Val Asn Trp Ala Cys Asn Glu 100 105 110 Leu Met Thr Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met 115 120 125 Ala Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg 130 135 140 Arg Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly 145 150 155 160 Met Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala 165 170 175 Phe Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val 180 185 190 Arg Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile 195 200 205 Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Phe Ala Val Leu Pro Pro Glu Val Asn 210 215 220 Ser Ala Arg Ile Phe Ala Gly Ala Gly Leu Gly Pro Met Leu Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ser Ala Trp Asp Gly Leu Ala Glu Glu Leu His Ala Ala Ala Gly 245 250 255 Ser Phe Ala Ser Val Thr Thr Gly Leu Ala Gly Asp Ala Trp His Gly 260 265 270 Pro Ala Ser Leu Ala Met Thr Arg Ala Ala Ser Pro Tyr Val Gly Trp 275 280 285 Leu Asn Thr Ala Ala Gly Gln Ala Ala Gln Ala Ala Gly Gln Ala Arg 290 295 300 Leu Ala Ala Ser Ala Phe Glu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Val Ser Pro 305 310 315 320 Ala Met Val Ala Ala Asn Arg Thr Arg Leu Ala Ser Leu Val Ala Ala 325 330 335 Asn Leu Leu Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu 340 345 350 Tyr Glu Gln Ile Trp Ala Gln Asp Val Ala Ala Met Phe Gly Tyr His 355 360 365 Ser Ala Ala Ser Ala Val Ala Thr Gln Leu Ala Pro Ile Gln Glu Gly 370 375 380 Leu Gln Gln Gln Leu Gln Asn Val Leu Ala Gln Leu Ala Ser Gly Asn 385 390 395 400 Leu Gly Ser Gly Asn Val Gly Val Gly Asn Ile Gly Asn Asp Asn Ile 405 410 415 Gly Asn Ala Asn Ile Gly Phe Gly Asn Arg Gly Asp Ala Asn Ile Gly 420 425 430 Ile Gly Asn Ile Gly Asp Arg Asn Leu Gly Ile Gly Asn Thr Gly Asn 435 440 445 Trp Asn Ile Gly Ile Gly Ile Thr Gly Asn Gly Gln Ile Gly Phe Gly 450 455 460 Lys Pro Ala Asn Pro Asp Val Leu Val Val Gly Asn Gly Gly Pro Gly 465 470 475 480 Val Thr Ala Leu Val Met Gly Gly Thr Asp Ser Leu Leu Pro Leu Pro 485 490 495 Asn Ile Pro Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Arg Phe Ile Thr Pro Val His 500 505 510 Pro Gly Tyr Thr Ala Thr Phe Leu Glu Thr Pro Ser Gln Phe Phe Pro 515 520 525 Phe Thr Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Asp Val Ser Val Ala Gln Gly 530 535 540 Val Thr Asn Leu His Thr Ala Ile Met Ala Gln Leu Ala Ala Gly Asn 545 550 555 560 Glu Val Val Val Phe Gly Thr Ser Gln Ser Ala Thr Ile Ala Thr Phe 565 570 575 Glu Met Arg Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ala His Leu Arg Pro Gly Leu 580 585 590 Asp Glu Leu Ser Phe Thr Leu Thr Gly Asn Pro Asn Arg Pro Asp Gly 595 600 605 Gly Ile Leu Thr Arg Phe Gly Phe Ser Ile Pro Gln Leu Gly Phe Thr 610 615 620 Leu Ser Gly Ala Thr Pro Ala Asp Ala Tyr Pro Thr Val Asp Tyr Ala 625 630 635 640 Phe Gln Tyr Asp Gly Val Asn Asp Phe Pro Lys Tyr Pro Leu Asn Val 645 650 655 Phe Ala Thr Ala Asn Ala Ile Ala Gly Ile Leu Phe Leu His Ser Gly 660 665 670 Leu Ile Ala Leu Pro Pro Asp Leu Ala Ser Gly Val Val Gln Pro Val 675 680 685 Ser Ser Pro Asp Val Leu Thr Thr Tyr Ile Leu Leu Pro Ser Gln Asp 690 695 700 Leu Pro Leu Leu Val Pro Leu Arg Ala Ile Pro Leu Leu Gly Asn Pro 705 710 715 720 Leu Ala Asp Leu Ile Gln Pro Asp Leu Arg Val Leu Val Glu Leu Gly 725 730 735 Tyr Asp Arg Thr Ala His Gln Asp Val Pro Ser Pro Phe Gly Leu Phe 740 745 750 Pro Asp Val Asp Trp Ala Glu Val Ala Ala Asp Leu Gln Gln Gly Ala 755 760 765 Val Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Gly Leu Gly Leu Pro Pro Pro 770 775 780 Trp Gln Pro Ala Leu Pro Arg Leu Phe Ser Thr 785 790 795 <210> 5 <211> 143 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 5 Met Ile Thr Asn Leu Arg Arg Arg Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ala Ala Leu Gly Leu Gly Ile Leu Leu Val Pro Thr Val Asp Ala 20 25 30 His Leu Ala Asn Gly Ser Met Ser Glu Val Met Met Ser Glu Ile Ala 35 40 45 Gly Leu Pro Ile Pro Pro Ile Ile His Tyr Gly Ala Ile Ala Tyr Ala 50 55 60 Pro Ser Gly Ala Ser Gly Lys Ala Trp His Gln Arg Thr Pro Ala Arg 65 70 75 80 Ala Glu Gln Val Ala Leu Glu Lys Cys Gly Asp Lys Thr Cys Lys Val 85 90 95 Val Ser Arg Phe Thr Arg Cys Gly Ala Val Ala Tyr Asn Gly Ser Lys 100 105 110 Tyr Gln Gly Gly Thr Gly Leu Thr Arg Arg Ala Ala Glu Asp Asp Ala 115 120 125 Val Asn Arg Leu Glu Gly Gly Arg Ile Val Asn Trp Ala Cys Asn 130 135 140 <210> 6 <211> 98 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 6 Met Thr Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala 1 5 10 15 Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg 20 25 30 Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met 35 40 45 Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe 50 55 60 Arg Asn 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Gln Glu Gly Leu Gln Gln Gln Leu 165 170 175 Gln Asn Val Leu Ala Gln Leu Ala Ser Gly Asn Leu Gly Ser Gly Asn 180 185 190 Val Gly Val Gly Asn Ile Gly Asn Asp Asn Ile Gly Asn Ala Asn Ile 195 200 205 Gly Phe Gly Asn Arg Gly Asp Ala Asn Ile Gly Ile Gly Asn Ile Gly 210 215 220 Asp Arg Asn Leu Gly Ile Gly Asn Thr Gly Asn Trp Asn Ile Gly Ile 225 230 235 240 Gly Ile Thr Gly Asn Gly Gln Ile Gly Phe Gly Lys Pro Ala Asn Pro 245 250 255 Asp Val Leu Val Val Gly Asn Gly Gly Pro Gly Val Thr Ala Leu Val 260 265 270 Met Gly Gly Thr Asp Ser Leu Leu Pro Leu Pro Asn Ile Pro Leu Leu 275 280 285 Glu Tyr Ala Ala Arg Phe Ile Thr Pro Val His Pro Gly Tyr Thr Ala 290 295 300 Thr Phe Leu Glu Thr Pro Ser Gln Phe Phe Pro Phe Thr Gly Leu Asn 305 310 315 320 Ser Leu Thr Tyr Asp Val Ser Val Ala Gln Gly Val Thr Asn Leu His 325 330 335 Thr Ala Ile Met Ala Gln Leu Ala Ala Gly Asn Glu Val Val Val Phe 340 345 350 Gly Thr Ser Gln Ser Ala Thr Ile Ala Thr Phe Glu Met Arg Tyr Leu 355 360 365 Gln Ser Leu Pro Ala His Leu Arg Pro 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<212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 8 Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala Met 1 5 10 15 Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile Ile 20 25 30 Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser Ala 35 40 45 Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val Ile 50 55 60 Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly Asn 65 70 75 80 Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala 85 90

Claims (120)

  1. 유효량의 항원, 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물로서, 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하며, 이때 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류인, 열안정성 동결건조된 백신 조성물.
  2. 유효량의 보조제, 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 백신 조성물로서, 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하며, 이때 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류인, 열안정성 동결건조된 백신 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 수-중-유 에멀션 제형은 1% (w/v) 미만 또는 약 1% (w/v)의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 수-중-유 에멀션 제형은 0.5% (w/v) 미만 또는 약 0.5% (w/v)의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 수-중-유 에멀션 제형은 글리세롤을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 수-중-유 에멀션 제형에 약 10% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 수-중-유 에멀션 제형에 약 5% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 수-중-유 에멀션 제형 중의 만니톨은 약 0.1% (w/v)의 농도로 존재하고 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 수-중-유 에멀션 제형에 약 5% (w/v)의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 수-중-유 에멀션 제형 중의 만니톨은 약 2.5% (w/v)의 농도로 존재하고 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 약 2.5% (w/v)의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 수-중-유 에멀션 제형은 글리세롤을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 조성물은 적어도 3개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 조성물은 적어도 6개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 13항에 있어서, 조성물은 적어도 12개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 13항에 있어서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 13항에 있어서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 13항에 있어서, 조성물은 약 50℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 엘레간트 케이크의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제 13항 내지 제 19항의 어떠한 조건에서 저장될 때 육안 검사에 의해 갈변을 나타내지 않는 케이크의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 전에 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 조성물은 케이크의 형태이고 열안정성은 수축, 균열 및/또는 갈변에 대해 케이크를 관찰함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 후에 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 열안정성은 복원시에 형성된 수-중-유 에멀션의 크리밍에 대한 검사에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 복원시에 형성된 수-중-유 에멀션 중의 항원 또는 보조제 농도는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 제형 중의 항원 또는 보조제 농도의 25% 이하 또는 약 25%의 파괴를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 복원시 형성된 수-중-유 에멀션의 성분들의 분석에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 복원시에 형성된 수-중-유 에멀션은 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경의 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 2항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 또는 병원체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 2항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 대사 가능한 오일인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 합성 스쿠알렌, 포도씨유, 올리브유 또는 합성 아이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 2항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 TLR4 아고니스트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, TLR4 아고니스트는 MPL, 3d-MPL 또는 합성 GLA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 합성 GLA 보조제는 다음 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure pat00011

    상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다.
  37. 제 36항에 있어서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬인 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 합성 스쿠알렌, 포도씨유, 올리브유 또는 합성 아이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 난 PC, 레시틴, 트윈 또는 그것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 40항에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F68인 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 42항에 있어서, 항산화제는 비타민 E인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 단일 바이알로서, 조성물이 바이알에 함유되어 있는 단일 바이알.
  45. 제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항의 조성물을 약 25℃ 내지 약 60℃에서 적어도 1개월 동안 저장하는 것을 포함하는 백신 조성물의 저장 방법으로서, 백신 제형은 열안정성인, 백신 조성물의 저장 방법.
  46. 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법으로서, 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 형성하기 위하여 수-중-유 에멀션을 동결건조시키는 단계를 포함하며, 이때 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 (1) 항원, (2) 대사 가능한 오일 및 (3) 케이크-형성 부형제를 포함하고, 케이크-형성 부형제는 (a) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (b) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이며, 백신 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하는, 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법.
  47. 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법으로서, 열안정성 동결건조된 백신 조성물을 형성하기 위하여 수-중-유 에멀션을 동결건조시키는 단계를 포함하며, 이때 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 (1) 보조제, (2) 대사 가능한 오일 및 (3) 케이크-형성 부형제를 포함하고, 케이크-형성 부형제는 (a) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (b) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류이며, 백신 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하는, 열안정성 동결건조된 백신 조성물의 제조 방법.
  48. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 1% (w/v) 미만 또는 약 1% (w/v)의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 0.5% (w/v) 미만 또는 약 0.5% (w/v)의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 글리세롤을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션에 약 10% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 동결건조 전의 수-중-유 에멀션에 약 5% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 동결건조 전 수-중-유 에멀션 중의 만니톨은 약 0.1% (w/v)이고 동결건조 전 수-중-유 에멀션 중의 트레할로오스는 약 5% (w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 동결건조 전 수-중-유 에멀션 중의 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 동결건조 전 수-중-유 에멀션 중의 만니톨은 약 2.5% (w/v)이고 동결건조 전 수-중-유 에멀션 중의 트레할로오스는 약 2.5% (w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 53항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 전 수-중-유 에멀션은 글리세롤을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 1항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 조성물은 적어도 3개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 58항에 있어서, 조성물은 적어도 6개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 58항에 있어서, 조성물은 적어도 12개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 58항에 있어서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 58항에 있어서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 58항에 있어서, 방법은 약 50℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 동결건조 단계는 단일 바이알에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 46항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 복원시의 수-중-유 에멀션은 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경의 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 복원시의 수-중-유 에멀션은 약 100 nm 미만의 Z-평균 직경의 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 46항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 있어서, 복원시의 수-중-유 에멀션 중의 항원 및/또는 보조제의 농도는 동결건조 전 수-중-유 에멀션 중의 항원 및/또는 보조제 농도에 비교하여 25% 이하 또는 약 25%의 파괴를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 46항 내지 제 68항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 조성물은 케이크의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 46항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 전에 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 동결건조된 조성물은 케이크의 형태이고 열안정성은 수축 또는 갈변에 대해 케이크를 관찰함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 46항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 후에 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 열안정성은 복원시에 수-중-유 에멀션의 크리밍에 대한 검사에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 46항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 육안으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 46항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 복원시에 수-중-유 에멀션의 성분들의 분석에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 46항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 항원 및 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 46항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 또는 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 46항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 대사 가능한 오일인 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 합성 스쿠알렌, 포도씨유, 올리브유 또는 합성 아이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 46항 내지 제 79항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 TLR4 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 80항에 있어서, TLR4 아고니스트는 MPL, 3d-MPL 또는 합성 GLA인 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 합성 GLA 보조제는 다음 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure pat00012

    상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다.
  83. 제 82항에 있어서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 46항 내지 제 83항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 미네랄유, 포도씨유, 합성 스쿠알렌 또는 합성 아이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 46항 내지 제 84항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 전의 수-중-유 에멀션은 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 난 PC, 레시틴, 트윈 또는 그것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 46항 내지 제 85항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 86항에 있어서, 계면활성제는 플루로닉 F68인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 46항 내지 제 87항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 항산화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 88항에 있어서, 항산화제는 비타민 E인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. (a) 제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항의 조성물을 수-중-유 에멀션으로 복원하는 단계; 및 (b) 그 에멀션을 대상에게 투여함으로써 대상에서 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 대상에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  91. 제 90항에 있어서, 면역 반응은 비-특이적 면역 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제 90항에 있어서, 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제 90항에 있어서, 조성물은 GLA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제 90항에 있어서, 대상은 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제 94항에 있어서, 포유류는 인간, 개 또는 소인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제 90항 내지 제 95항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀션은 피내로 또는 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 대사 가능한 오일 및 케이크-형성 부형제를 포함하는 열안정성 동결건조된 조성물로서, 조성물은 케이크의 형태이고 복원시 수-중-유 에멀션을 형성하며, 케이크-형성 부형제는 (1) 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합; 또는 (2) 트레할로오스, 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류인, 조성물.
  98. 제 97항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 락토오스, 라피노오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류인 것을 특징으로 하는 조성물.
  99. 제 97항에 있어서, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 프룩토오스 및 락툴로오스로 구성되는 군으로부터 선택된 당류의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  100. 제 97항 내지 제 99항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 수-중-유 에멀션 제형은 1% (w/v) 미만 또는 약 1% (w/v)의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  101. 제 100항에 있어서, 수-중-유 에멀션 제형은 0.5% (w/v) 미만 또는 약 0.5% (w/v)의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  102. 제 100항에 있어서, 수-중-유 에멀션 제형은 글리세롤을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  103. 제 97항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 수-중-유 에멀션 제형에 약 10% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  104. 제 97항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 수-중-유 에멀션 제형에 약 5% (w/v)의 농도로 존재하는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  105. 제 97항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 수-중-유 에멀션 제형 중의 만니톨은 약 0.1% (w/v)이고 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 약 5% (w/v)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  106. 제 97항에 있어서, 조성물은 수-중-유 에멀션 제형의 동결건조에 의해 형성되고, 수-중-유 에멀션 제형 중의 케이크-형성 부형제는 만니톨과 트레할로오스의 조합이며, 수-중-유 에멀션 제형 중의 만니톨은 약 2.5% (w/v)이고 수-중-유 에멀션 제형 중의 트레할로오스는 약 2.5% (w/v)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  107. 제 103항 내지 제 106항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 글리세롤을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  108. 제 97항 내지 제 107항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 8℃ 내지 약 60℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  109. 제 108항에 있어서, 조성물은 적어도 3개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  110. 제 108항에 있어서, 조성물은 적어도 6개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  111. 제 108항에 있어서, 조성물은 적어도 12개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  112. 제 108항에 있어서, 조성물은 약 25℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  113. 제 108항에 있어서, 조성물은 약 37℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  114. 제 108항에 있어서, 조성물은 약 50℃에서 적어도 1개월 동안 열안정성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  115. 제 97항 내지 제 114항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 조성물은 케이크의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  116. 제 97항 내지 제 115항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원 전에 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  117. 제 97항 내지 제 116항 중 어느 한 항에 있어서, 열안정성은 동결건조된 조성물의 복원시에 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  118. 제 97항 내지 제 116항 중 어느 한 항에 있어서, 복원시의 수-중-유 에멀션은 약 200 nm 미만의 Z-평균 직경의 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  119. 제 97항 내지 제 118항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  120. 제 97항 내지 제 119항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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