KR20220088208A - 레몬 품종 선별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레몬 품종 선별용 조성물; 이를 포함하는 키트; 이를 이용한 레몬 품종 선별 방법; 및 레몬 품종 선별을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

Description

레몬 품종 선별용 마커 및 이의 용도{Novel marker for selecting a lemon variety and the use thereof}

본 발명은 레몬 품종 선별용 조성물; 이를 포함하는 키트; 이를 이용한 레몬 품종 선별 방법; 및 레몬 품종 선별을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

감귤은 경제적이면서 영양학적 가치가 높기 때문에 전세계적으로 중요한 작물 중 하나에 속하나, 막대한 로열티를 지불해야 하는 문제가 발생하여, 신품종 감귤 육성에 대한 관심도가 높아지고 있는 추세이다.

그러나, 감귤 바이러스의 감염 및 피해 사례가 증가됨에 따라 무병화묘 생산에 대한 중요성이 높아지고 있다. 일반적으로 감귤 무병화묘 생산시 주로 탱자 품종과 레몬 품종을 이용하고 있다. 목표 품종의 경정접목 이후 대목으로 사용한 레몬 품종의 접목 유무를 조기에 구분하고, 레몬 품종의 국내 재배 면적이 증가됨에 따라 레몬을 종류별로 구분하기 위해서 레몬 품종만을 선별할 수 있는 기술이 필요하게 되었다.

한편, 분자생물학의 발전에 따라, 외관이 유사한 품종들을 유전학적인 방법으로 구별하는 다양한 방법이 제시되고 있다. 예로, RAPD, RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences), EST-SSR, 게놈 SSR 분자 표지 마커 등이 사용되고 있으며, SSR 마커를 사용하여 귤의 품종을 동정하는 방법이 개발된 바 있다(한국 등록특허공보 제10-0842432호). 그러나, 상술한 방법들은 분석과정 등이 복잡하여 많은 시간이 소요되며, 재현성이 낮다는 단점을 갖고 있었다. 또한, 레몬 품종만을 특이적으로 구별하는 마커는 현재까지 개발되지 않았는바, 레몬 품종을 구별하고, 더욱 정밀한 유전자 지도의 필요성 및 정확도가 높은 분자마커의 개발 필요성이 존재하였다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 다양한 감귤류 품종 중에서도 특히 레몬 품종만을 선별하기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 레몬 품종을 특이적으로 선별할 수 있는 인델(InDel) 마커를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 레몬 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 레몬 품종 선별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 레몬 품종을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 레몬 품종 선별을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 레몬 품종 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "레몬 품종 선별용 조성물"은 여러 감귤류(Citrus sp.) 중에서 레몬의 품종을 구별, 선별, 판별 또는 식별하는 조성물을 의미한다. 상기 레몬 품종은 알렌레몬, 후로스트유레카, 유레카, 리스본, 제라몬, 닥터스트롱레몬, 프로스트리스본레몬, 제노아레몬, 인터도나토레몬, 라피티오타키레몬, 리모네로피노레몬, 리모네로메시나레몬, 우트알렌유레카레몬, 빌라프랑카레몬, 옌벤리스본레몬, 프라이어리스본레몬, 및 메이어레몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적상 레몬 품종 특이적 분자마커 개발을 위하여, 공개된 감귤류 엽록체 유전체 정보를 수집하고, 수집한 감귤류 엽록체 유전체의 비교 분석을 수행하여 인델(InDel) 마커를 발굴하였다. 본 발명의 인델 마커는 감귤류(Citrus sp.) 중에서 레몬의 품종만을 특이적으로 구별하는데 특징이 있다.

본 발명의 용어, “InDel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기서열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 본 발명에서는 인델마커, 분자마커 또는 마커의 용어로 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 InDel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작하는 것이며, 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 인델 마커를 통해 46개의 감귤류 시료 중에서 레몬 품종만 특이적으로 구별할 수 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 8).

본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기세트(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다. 또한, 프라이머는 변형될 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

구체적으로, 상기 프라이머는 다양한 감귤류 품종 중에서도 레몬 품종만을 검출할 수 있고, 본 발명의 목적상 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

특정 서열번호로 표현되는 염기서열 또는 아미노산 서열의 유전자와 동일 또는 상응하는 활성을 갖는 이상, 특정 서열번호로 표현되는 염기서열과 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 서열도 본 발명의 범주에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 특정 서열번호의 염기서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있으며, 상응하는 효능 또는 활성을 나타내는 것으로, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 다양한 감귤류 품종 중에서도 레몬 품종만을 선별하기 위하여 이의 특이적인 인델 마커를 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였고(표 1), 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 및/ 또는 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트가 다양한 감귤류 품종 중에서도 비레몬류 품종을 제외하고, 레몬 품종만을 선별할 수 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 8).

이는, 상기 프라이머 세트 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 다양한 감귤류 품종 중에서도 비레몬류 품종을 제외하고, 레몬 품종 특이적 분자마커를 높은 특이도로 검출할 수 있으므로, 레몬 품종의 선별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 레몬 품종 선별용 조성물을 포함하는 레몬 품종 선별용 키트를 제공한다,

상기 “레몬 품종 선별용 조성물”은 전술한 바와 같다.

상기 마커의 유무를 측정하기 위한 프라이머, 프로브뿐만 아니라 분석방법에 적합한 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명에서 "프로브"는 공지의 방법으로 특정 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화 될 수 있는 것이라면 본 발명의 범주에 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 30℃내지 65℃, 38℃ 내지 60℃, 38℃ 내지 58℃, 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 키트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 본 발명의 인델 마커의 존재여부를 검출할 수 있는 프라이머 쌍이면 제한 없이 포함할 수 있다.

상기 키트는 PCR　키트, RT-PCR　키트(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 레몬의 품종을 선별할 수 있다면 그 작동 원리나 형태에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트는 레몬 품종 선별을 위해 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분　조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다른 구성 성분의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 키트는 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함 할 수 있으며, 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응완충액을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 인델 마커의 전사부위를 탐지하기 위한 RT-PCR의 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 요소의 구체적인 예로, 인델 마커에 특이적인 각각의 프라이머 쌍, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), DNA 중합효소, 역전사효소, DNase 억제제, RNase 억제제, 반응완충액, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 “DNA 칩”은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는 일반적으로 편평한 고체 지지판, 일반적으로 현미경용 슬라이드 보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산 및 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간의 다중 혼성화 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 레몬 품종 선별 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 대상 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 레몬 품종 선별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (b) 얻어진 증폭 산물로부터 레몬 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 레몬 품종을 선별하는 방법을 제공한다.

상기 “레몬 품종 선별용 조성물”은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 “레몬 품종 선별 방법”은 여러 감귤류 품종 중에서 특정한 감귤의 품종, 즉, 레몬 품종만을 구별, 선별, 판별 또는 식별하는 방법을 의미한다. 상기 레몬 품종 선별 방법은 특정한 레몬의 품종을 구별, 선별, 판별 또는 식별할 수 있다면 구체적인 방법에 제한되지 않는다.

상기 대상 시료는 감귤류(Citrus sp.) 유래인 것일 수 있으며, 감귤류에 속하는 종류라면 제한되지 않는다. 상기 게놈 DNA는 감귤의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것일 수 있으나, 대상 작물의 게놈 DNA를 분리할 수 있다면 그 종류에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 레몬 품종은 알렌레몬, 후로스트유레카, 유레카, 리스본, 제라몬, 닥터스트롱레몬, 프로스트리스본레몬, 제노아레몬, 인터도나토레몬, 라피티오타키레몬, 리모네로피노레몬, 리모네로메시나레몬, 우트알렌유레카레몬, 빌라프랑카레몬, 옌벤리스본레몬, 프라이어리스본레몬, 및 메이어레몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출은 레몬 품종에서 특이적으로 검출되는 인델마커에 의한 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트에 의해 증폭되어 검출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 증폭은 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있으며, 구체적인 예로 PCR, 리가제 연쇄반응(LCR), 전사증폭, 자가유지 서열 복제 또는 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 방법 등이 사용될 수 있다.

하나의 구체예로, 상기 단계(b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 방법은 (c) 증폭 산물이 검출되는 경우에 상기 품종을 레몬 품종으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 (c)의 증폭 산물을 검출은 전기영동, 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.　

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 결과, 46개의 감귤류 시료에서 레몬 품종에 해당하는 G그룹에서 동일한 유전자형을 가짐을 확인하였다(도 2).

이는, 상기 프라이머 세트 또는 이들의 조합을 이용하면 레몬 특이적 인델 마커를 높은 특이도로 검출할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 다양한 감귤류 품종에서 비레몬 품종을 제외하고 레몬 품종만의 선별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

레몬 품종 특이적 인델 마커 검출용 프라이머를 포함하는 본 발명의 레몬 품종 선별용 조성물은 단시간 내 저비용으로 간편하게 레몬 품종을 선별할 수 있으므로, 보급된 품종의 특성 모니터링에 편리하게 사용될 수 있다. 또한, 감귤 품종의 무병묘 생산시 대목의 구분을 용이하게 하여 작업효율을 증진시키고, 레몬 대목별 생육 차이를 구별할 수 있다.

도 1은 감귤류 엽록체 비교 분석을 통해 발굴한 InDel locus를 나타낸 것이다.
도 2는 6세트의 감귤 엽록체 InDel 마커를 사용하여 레몬 품종을 포함한 46개 감귤류 시료들간의 유전적 거리를 토대로 작성된 UPGMA dendrogram이다.
도 3 내지 도 8은 7개 감귤류 그룹에서 각 그룹별로 1개의 시료를 취하여 각 유전좌위별 genotype을 비교 정리하여 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 감귤 엽록체 유전체 비교 분석으로부터 후보 InDel locus 발굴

레몬 품종 특이적 분자마커 개발을 위하여, 공개된 감귤류 엽록체 유전체 정보를 수집하였다(표 1).

감귤류 엽록체 유전체 정보

No.	종명	GenBank accession No.
1	Citrus limon	NC_034690
2	C. maxima	NC_034290
3	C. reticulata	NC_034671
4	C. sinensis	NC_008334

상기 수집한 감귤류 엽록체 유전체의 비교 분석을 수행하여 6개의 후보 InDel locus를 발굴하였다(도 1).

실시예 2: 발굴된 InDel locus 증폭을 위한 프라이머 제작

상기 실시예 1에서 감귤류 엽록체 비교 분석을 통해 발굴한 InDel locus의 증폭을 위한 프라이머 세트를 제작하였다. 구체적인 프라이머 세트는 하기 표 2와 같다.

InDel locus의 증폭을 위한 프라이머

Locus name	프라이머 이름	프라이머 서열(5' to 3')	서열번호	Amplicon Size (bp)
Limon#13	Limon#13-F1	AGGGTCGGTCTTGAAACA	1	325
	Limon#13-R1	AAGGCCAAAAAGCCCCTT	2
Limon#15	Limon#15-F1	CTAACAATTACGAGAATCTAG	3	351
	Limon#15-R1	CGAATTAGAATAGAGCAAATTT	4
Limon#16	Limon#16-F2	AGTGATATGGCTCGCCATA	5	400
	Limon#16-R1	ATGCCTGAAAGTTGGATAGG	6
Limon#21	Limon#21-F1	TATCGAGGGGCTTTTCTTC	7	252
	Limon#21-R1	ATCAAAATCGGGCGAATCC	8
Limon#22B	Limon#22B-F1	TAGTGTCCTTGCCCATGA	9	255
	Limon#22B-R1	AACTCGAGTTTTTGGTGC	10
Limon#23	Limon#23-F2	TGTAGACCCTCGCAATAGTT	11	325
	Limon#23-R2	ATGGGTCCTACTGCGAAA	12

실시예 3: 유전형 결정 및 Dendrogram 작성

실시예 2에서 선별한 InDel 마커를 이용하여 레몬 품종을 판별할 수 있는지 알아보기 위하여, 46개의 시료(레몬 품종-17개, 감귤류-29개)에서 DNA(genomic DNA) 분리하고 상기에서 제조한 InDel 마커 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 본 발명에서 사용된 시료의 목록은 하기 표 3과 같으며, 46개 감귤류 시료에서 6개 엽록체 InDel 유전자위의 size 데이터는 표 4와 같다.

본 발명에 사용된 감귤류 시료 목록

No.	citrus group	시료명
1	Lemon	알렌레몬	LM-AN
2		후로스트유레카	LM-FN
3		유레카	LM-UR
4		리스본	LM-RM
5		제라몬	LM-JRM
6		닥터스트롱레몬	LM-DS
7		프로스트리스본레몬	LM-FL
8		제노아레몬	LM-JN
9		인터도나토레몬	LM-ID
10		라피티오타키레몬	LM-LT
11		리모네로피노49레몬	LM-LP
12		리모네로메시나레몬	LM-LM
13		우트알렌유레카레몬	LM-AAE
14		빌라프랑카레몬	LM-VF
15		옌벤리스본레몬	LM-YB
16		프라이어리스본레몬	LM-PL
17		메이어(806)레몬	LM-MY
18	Grape fruit	그레이프프룻	GF
19		레드블러쉬	RB
20		레이루비	RR
21	Mandarin	병감	BG
22		동정귤	DJK
23		진귤	JG
24	Pomelo	마두문단	MM
25		만백유	MB
26		병귤	BK
27	Sour orange	금감자	KG
28		입화오렌지	LHO
29		황금하귤	HH
30	Sweet orange	상귀넬리	SG
31		델피노	DP
32		브림타로코	BTR
33	Citron	대본취등	DB
34		소유자	SYJ
35		스타치	SDC
36	Tangor	비풍	BP
37		청견	CK
38		하레히메	HM
39	Tangelo	사토노카오리	STNK
40		세미놀	SN
41		폴글로	FG
42	Mandarin-tangelo	오발로	OV
43		프린스	PR
44		모로	MR
45	기타	인창귤	IC
46		흥진46호	HJ46

46개 감귤류 시료에서 6개 엽록체 InDel 유전좌위의 size data

No.	Citrus group	시료명		Limon#13	Limon#15	Limon#16	Limon#21	Limon#22B	Limon#23
1	Lemon	알렌레몬	LM-AN	279	369	418	270	272	343
2		후로스트유레카	LM-FN	279	369	418	270	272	343
3		유레카	LM-UR	279	369	418	270	272	343
4		리스본	LM-RM	279	369	418	270	272	343
5		제라몬	LM-JRM	279	369	418	270	272	343
6		닥터스트롱레몬	LM-DS	279	369	418	270	272	343
7		프로스트리스본레몬	LM-FL	279	369	418	270	272	343
8		제노아레몬	LM-JN	279	369	418	270	272	343
9		인터도나토레몬	LM-ID	279	369	418	270	272	343
10		라피티오타키레몬	LM-LT	279	369	418	270	272	343
11		리모네로피노49레몬	LM-LP	279	369	418	270	272	343
12		리모네로메시나레몬	LM-LM	279	369	418	270	272	343
13		우트알렌유레카레몬	LM-AAE	279	369	418	270	272	343
14		빌라프랑카레몬	LM-VF	279	369	418	270	272	343
15		옌벤리스본레몬	LM-YB	279	369	418	270	272	343
16		프라이어리스본레몬	LM-PL	279	369	418	270	272	343
17		메이어(806)레몬	LM-MY	279	369	418	270	272	343
18	Grape fruit	그레이프프룻	GF	279	371	418	270	272	347
19		레드블러쉬	RB	279	371	418	270	272	347
20		레이루비	RR	279	371	418	270	272	347
21	Mandarin	병감	BG	273	380	419	262	277	364
22		동정귤	DJK	278	371	417	270	272	345
23		진귤	JG	273	380	419	262	277	364
24	Pomelo	마두문단	MM	279	371	418	270	272	347
25		만백유	MB	279	371	418	270	272	347
26		병귤	BK	278	370	417	270	272	345
27	Sour orange	금감자	KG	279	371	418	270	272	347
28		입화오렌지	LHO	279	371	418	270	272	347
29		황금하귤	HH	279	371	418	270	272	347
30	Orange	상귀넬리	SG	279	371	418	270	272	347
31		델피노	DP	278	371	417	270	272	345
32		브림타로코	BTR	278	370	417	270	272	345
33	Citron	대본취등	DB	278	370	417	270	272	345
34		소유자	SYJ	278	370	419	262	277	360
35		스타치	SDC	280	373	419	270	272	345
36	Tangor	비풍	BP	273	380	419	262	277	364
37		청견	CK	273	380	419	262	277	364
38		하레히메	HM	273	380	419	262	277	364
39	Tangelo	사토노카오리	STNK	273	380	419	262	277	364
40		세미놀	SN	279	371	418	270	272	347
41		폴글로	FG	273	380	419	262	277	364
42	Mandarin-tangelo	오발로	OV	273	380	419	262	277	364
43		프린스	PR	273	380	419	262	277	364
44		모로	MR	278	370	417	270	272	345
45	기타	인창귤	IC	278	370	417	270	272	345
46		흥진46호	HJ46	273	380	419	262	277	364

InDel 마커를 이용한 유전형 결정은 M13-tailed PCR 방법(Schuelke, 2000, Nat. Biotechnol. 18, 233-234)을 사용하여 수행하였으며, 상세한 PCR reaction 조건과 PCR cycling 조건은 표 5와 같다. PCR 증폭은 ABI 2720 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.

PCR reaction 조건		PCR cycling 조건
Components	Volume (uL)	Temperature (℃)	Time (min)	Cycle No.
Genomic DNA (5 ng/uL)	1	94	5	1
M13-tailed Forward primer (10 pmol)	0.06	94	0.5	15
Reverse primer (10 pmol)	0.3	58	0.5
6-FAM labelled M13 primer (10 pmol)	0.3	72	0.5
2x Taq polymerase mix	15	94	0.5	20
Distilled water	13.34	53	0.5
Reaction volume	30	72	0.5
		72	30	1

M13-tailed PCR을 위한 프라이머 정보는 하기 표 6과 같으며, PCR 산물의 형광 표지를 위하여 6-FAM 형광으로 표지된 M13 프라이머를 사용하였다.

M13-tailed PCR을 위한 프라이머 정보

Locus name	프라이머 이름	프라이머 서열(5' to 3')	서열번호	Amplicon Size (bp)
Limon#13	Limon#13-F1	TGTAAAACGACGGCCAGTAGGGTCGGTCTTGAAACA	13	325
	Limon#13-R1	AAGGCCAAAAAGCCCCTT	14
Limon#15	Limon#15-F1	TGTAAAACGACGGCCAGTCTAACAATTACGAGAATCTAG	15	351
	Limon#15-R1	CGAATTAGAATAGAGCAAATTT	16
Limon#16	Limon#16-F2	TGTAAAACGACGGCCAGTAGTGATATGGCTCGCCATA	17	400
	Limon#16-R1	ATGCCTGAAAGTTGGATAGG	18
Limon#21	Limon#21-F1	TGTAAAACGACGGCCAGTTATCGAGGGGCTTTTCTTC	19	252
	Limon#21-R1	ATCAAAATCGGGCGAATCC	20
Limon#22B	Limon#22B-F1	TGTAAAACGACGGCCAGTTAGTGTCCTTGCCCATGA	21	255
	Limon#22B-R1	AACTCGAGTTTTTGGTGC	22
Limon#23	Limon#23-F2	TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAGACCCTCGCAATAGTT	23	325
	Limon#23-R2	ATGGGTCCTACTGCGAAA	24

M13-tailed PCR 증폭 후, 0.2 ㎕의 PCR 증폭산물을 9.8 ㎕의 Hi-Di formamide (Applied Biosystems), 0.2 ㎕의 GeneScan^TM 500 LIZ^® 사이즈 스탠다드(Applied Biosystems)와 혼합하였다. 혼합물은 95도에서 5분간 변성시킨 후 얼음에 방치하였다. 증폭된 DNA 절편은 50 cm 모세관이 장착된 ABI 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems) 상에서 모세관 전기영동을 통해 DNA 절편들을 분리하였다. 대립유전자들의 크기는 GeneMapper 소프트웨어(ver. 4.0; Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다.

또한, PowerMarker 소프트웨어(v. 3.25) (Liu and Muse, 2005)를 사용하여 공유하는 유전형 빈도를 계산하고, MEGA 소프트웨어(v. 7.0)를 사용하여 UPGMA dendrogram을 작성하였다(도 2).

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 분석에 사용된 46개의 시료는 본 발명의 6개 세트의 마커에 의해 7개의 그룹(A~G그룹)으로 나누어짐을 알 수 있었으며, 각 그룹은 6개 유전좌위에 대해 서로 동일한 유전형을 가짐을 알 수 있었다.

또한, 상기 7개 그룹(A~G그룹)에 대해 각 그룹별로 1개의 시료를 취하여 각 유전좌위별 genotype을 비교 정리하였다(도 3 내지 도 8). 일 예로, G그룹에 속하는 유레카 레몬의 경우에는 Limon#13(서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 279 bp의 PCR 밴드를, Limon#15(서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 369 bp의 PCR 밴드를, Limon#16(서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 418 bp의 PCR 밴드를, Limon#21(서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 270 bp의 PCR 밴드를, Limon#22B(서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 272 bp의 PCR 밴드를, Limon#23(서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 343 bp의 PCR 밴드를 나타냄을 확인할 수 있다.

그러나, A그룹에 속하는 하레히메의 경우에는 Limon#13(서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 273 bp의 PCR 밴드를, Limon#15(서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 380 bp의 PCR 밴드를, Limon#16(서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 419 bp의 PCR밴드를, Limon#21(서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 262 bp의 PCR밴드를, Limon#22B(서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 277 bp의 PCR 밴드를, Limon#23(서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트)를 사용하는 경우 364 bp의 PCR 밴드를 나타냄을 확인할 수 있다.

상기 결과를 통해, 다양한 감귤류 품종을 포함한 시료에서 본 발명의 6개의 프라이머 세트를 이용하면 비레몬 품종을 제외하고, 레몬 품종만 선별할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel marker for selecting a lemon variety and the use thereof <130> KPA201371-KR <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#13-F1 <400> 1 agggtcggtc ttgaaaca 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#13-R1 <400> 2 aaggccaaaa agcccctt 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#15-F1 <400> 3 ctaacaatta cgagaatcta g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#15-R1 <400> 4 cgaattagaa tagagcaaat tt 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#16-F2 <400> 5 agtgatatgg ctcgccata 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#16-R1 <400> 6 atgcctgaaa gttggatagg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#21-F1 <400> 7 tatcgagggg cttttcttc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#21-R1 <400> 8 atcaaaatcg ggcgaatcc 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#22B-F1 <400> 9 tagtgtcctt gcccatga 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#22B-R1 <400> 10 aactcgagtt tttggtgc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#23-F2 <400> 11 tgtagaccct cgcaatagtt 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#23-R2 <400> 12 atgggtccta ctgcgaaa 18 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#13-F1 <400> 13 tgtaaaacga cggccagtag ggtcggtctt gaaaca 36 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#13-R1 <400> 14 aaggccaaaa agcccctt 18 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#15-F1 <400> 15 tgtaaaacga cggccagtct aacaattacg agaatctag 39 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#15-R1 <400> 16 cgaattagaa tagagcaaat tt 22 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#16-F2 <400> 17 tgtaaaacga cggccagtag tgatatggct cgccata 37 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#16-R1 <400> 18 atgcctgaaa gttggatagg 20 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#21-F1 <400> 19 tgtaaaacga cggccagtta tcgaggggct tttcttc 37 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#21-R1 <400> 20 atcaaaatcg ggcgaatcc 19 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#22B-F1 <400> 21 tgtaaaacga cggccagtta gtgtccttgc ccatga 36 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#22B-R1 <400> 22 aactcgagtt tttggtgc 18 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#23-F2 <400> 23 tgtaaaacga cggccagttg tagaccctcg caatagtt 38 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Limon#23-R2 <400> 24 atgggtccta ctgcgaaa 18

Claims (8)

1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 레몬 품종 선별용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 레몬 품종은 알렌레몬, 후로스트유레카, 유레카, 리스본, 제라몬, 닥터스트롱레몬, 프로스트리스본레몬, 제노아레몬, 인터도나토레몬, 라피티오타키레몬, 리모네로피노레몬, 리모네로메시나레몬, 우트알렌유레카레몬, 빌라프랑카레몬, 옌벤리스본레몬, 프라이어리스본레몬, 및 메이어레몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 레몬 품종 선별용 조성물.
   
3. 제1항의 레몬 품종 선별용 조성물을 포함하는, 레몬 품종 선별용 키트.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 키트.
   
5. (a) 대상 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 레몬 품종 선별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
   (b) 얻어진 증폭 산물로부터 레몬 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 레몬 품종을 선별하는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 대상시료인 감귤 품종의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인, 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 단계 (b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 레몬 품종은 알렌레몬, 후로스트유레카, 유레카, 리스본, 제라몬, 닥터스트롱레몬, 프로스트리스본레몬, 제노아레몬, 인터도나토레몬, 라피티오타키레몬, 리모네로피노레몬, 리모네로메시나레몬, 우트알렌유레카레몬, 빌라프랑카레몬, 옌벤리스본레몬, 프라이어리스본레몬, 및 메이어레몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.

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