KR20220084560A - 청각 추출물 및 아라키돈산을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 청각 추출물 및 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)을 유효성분으로 포함하는 면역 조절용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 청각추출물 및 ARA는 대식세포주에서, 면역관련 유전자 및 다중 불포화 지방산에 대한 수용체인 GPR120의 발현을 증가시키고, MAPK 경로 및 NF-κB경로와 관련된 NF-κB p-65, ERK1/2 및 p-38 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하여, 본 발명의 청각 추출물 및 ARA가 효과적으로 면역을 조절하는 것을 확인하였다.

Description

청각 추출물 및 아라키돈산을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물{Food composition for enhancing immunity containing Codium fragile extract and arachidonic acid as active ingredients}
본 발명은, 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.
면역은 체내에 존재하는 자기방어체계로서 인체가 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정이다. 이러한 면역과 관련된 세포 중에서, 특히 대식세포가 많은 역할을 하고 있으며, 대식세포의 활성화는 통한 산화 질소 합성효소(nitric oxide synthase, iNOS)의 조절과 관련이 있으며, 이는 산화, 항바이러스, 및 항원을 방어하기 위한 사이토카인의 분비에서 중요한 역할을 하고 있다.
외부 자극에 의한 손상이나 병원 미생물의 침입으로부터 자신을 방어하기도 하지만 염증반응 등과 같이 자기 자신의 조직에 손상을 줄 수도 있다. 면역기능의 변화를 조절하여 정상으로 회복시키거나 변화의 폭을 줄여 주는 작용으로 면역기능 억제나 면역기능 증강으로 구분된다. 과민면역 반응 완화는 외부 물질에 대해 불리하게 반응하여 초래되는 알레르기 반응 자기항원 또는 변형된 자기항원에 대한 반응 등 바람직하지 않게 증가된 면역 반응을 억제시키는 것을 의미한다.
이러한 면역 반응이 발생하는 문제점을 극복하기 위하여, 다양한 면역 증강제 및 치료제가 사용되고 있으나, 부작용 문제들이 있고, 주로 시판되는 것은 예방보다는 치료용으로 복용되는 것으로, 부작용이 없어 장기 복용이 가능하고, 예방용으로도 적합한 면역증진용 조성물이 요구되는 실정이다.
청각(Codium fragile)은 동아시아, 오세아니아 및 북유럽 해안에서 서식하는 Codiaceae과에 속하는 녹색의 해초로서, 청각으로부터 추출된 추출물은 항응고제, 항바이러스제, 항염증제 및 면역 조절 활성과 같은 생물학적 기능이 알려져 있다.
아라키돈산은 뇌와 근육 및 간에 풍부하며 체내 세포막의 인지질, 특히 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)에 존재하는 불포화 지방산이다. 특히 골격근(skeletal muscle)은 아라키돈산을 많이 보유하는 부위이며, 인지질 지방산 함량의 대략 10-20% 를 차지한다. 아라키돈산은 포스포라이페이즈 C(phospholipase C, PLC)나 단백질 카이네이즈 C(Protein kinase C, PKC) 같은 효소를 조절하는 이차 전달자(second messenger)로서 세포 신호 전달에 중요한 역할을 한다. 또한 아라키돈산은 급성 염증의 매개 물질이며 혈관확장제로도 작용할 수 있다.
본 발명의 목적은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 조절용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학 조성물 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 청각을 80% 에탄올로 추출하고 증류수를 첨가하여 조 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 청각 조 추출물에 아세톤을 첨가하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 청각 추출물에 유리 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 면역 증진용 식품 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학 조성물 제공한다.
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물 제공한다.
본 발명은 1) 청각을 80% 에탄올로 추출하고 증류수를 첨가하여 조 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 청각 조 추출물에 아세톤을 첨가하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 청각 추출물에 유리 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 면역 증진용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 청각 추출물(Codium fragile) 및 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA)은 대식세포주에서, 면역관련 유전자 및 다중 불포화 지방산에 대한 수용체인 GPR120의 발현을 증가시키고, MAPK 경로 및 NF-κB경로와 관련된 NF-κB p-65, ERK1/2 및 p-38 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하여, 본 발명의 청각 추출물 및 ARA가 효과적으로 면역을 조절하는 것을 확인하여, 본 발명의 조성물은 면역 조절용 약학 조성물로서 관련 분야에서 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 청각추출물 및 아라키돈산의 처리에 따른 세포 생장률 및 산화질소 생성을 확인한 것이다(A: 세포 생장률 확인, B: 산화 질소 생성 확인).
도 2는 본 발명의 청각 추출물 및 아라키돈산의 처리에 따른 면역 관련 인자의 발현량을 정량적 Real-Time PCR로 확인한 것이다(A: iNOS 발현량 확인, B: COX-2 발현량 확인, C: IL-1β 발현량 확인, D: IL-6 발현량 확인, E: TNF-α 발현량 확인, F: INF-γ 발현량 확인, G: GPR120 발현량 확인, H: TLR-4 발현량 확인).
도 3은 본 발명의 청각 추출물 및 아라키돈산의 처리에 따른 면역 관련 경로의 인산화 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다(A: 웨스턴 블랏 결과, B: 인산화 수준 그래프).
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 면역 증진 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 청각 추출물은 증류수, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤 및 헥산을 이용하여 추출되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 에탄올 및 아세톤 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 청각 추출물 및 아라키돈산은 0.1 내지 5 μg/ml 및 0.3 내지 0.7 μM의 농도로 처리되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 청각 추출물 0.4 mg/ml 및 아라키돈산 0.5 μM일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 청각 추출물 및 아라키돈산은, iNOS, COX-2, IL-β1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GPR120 및 TLR-4으로 이루어진 군에서 1이상 선택된 인자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 청각 추출물 및 아라키돈산은, ERK1/2, p-38 및 p-65으로 이루어진 군에서 1이상 선택된 인자의 인산화를 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 청각 추출물 및 아라키돈산은, 산화 질소의 생성을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학 조성물 제공한다.
또한, 본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 테트라펩타이드 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 1) 청각을 80% 에탄올루 추출하고 증류수를 첨가하여 조 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 청각 조 추출물에 아세톤을 첨가하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 청각 추출물에 유리 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 면역 조절용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 인간을 제외한 개체에, 청각 추출물 및 아라키돈산을 투여하는 단계; 및
상기의 개체에서, 면연 기능 관련 인자의 조절을 확인하는 것을 특징으로 하는 면역 조절 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 사용 시약 및 통계학적 분석
본 발명에서 사용한 아라키돈산은 Nu-Check Prep, Inc(미국)에서 구입하였다. Griess시약은 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하여 사용하였으며, EZ-Cytox Cell Viability Assat Kit은 Daeil Labservice(한국)에서 구입하였다. Tri reagentⓡ은 Molecular Research Center, Inc.에서 구입하였으며, High capacity cDNA revers transcription kit은 Applied Biosystems에서 구입하였다. SYBRⓡ Primix Ex TaqTM II 는 타카라 바이오(Takara Bio, 일본)에서 구입하여 사용하였으며, RIPA 버퍼는 Tech & Innovation(중국)에서 구입하였다. PierceTM BCA Protein assay kit 과 Pierceⓡ ECL Plus Western Blotting Substrate는 ThermoScientific에서 구입하였다. p-NF-κB p65, p-p38, p-ERK1/2 및 p-JNK 특이적 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였으며, α-Tubulin은 Abcam에서 구입하였다.
본 발명에서 시행한 실시예들은, 모두 3회 반복 수행하였으며, 통계 소프트웨어인 Statistix 8.1을 이용하여 분석하였고, 모든 값은 일원 분산 분석 후, Duncan의 다중 범위 평가를 이용하여 분석하였다. 각 군간의 차이는 t-test를 이용하여, p값이 0.05이하인 값을 신뢰하였다(p<0.05).
<실시예 2> 비정제(crude) 음이온성 고분자의 분리 및 조성 확인
청각(Codium fragile)로부터 음이온성 고분자를 분리하기 위하여, 이전의 연구에서 이용한 추출법을 사용하였다. 구체적으로, 청각을 80% 에탄올을 사용하여 추출하였으며, 추출 후 퓸후드(fume hood)에서 건조하여, 청각 조 추출물을 추출하였다. 건조된 청각 바이오메스는 증류수에 침지하여, 65 ℃로 2시간 동안 스터링(stirring) 하여 추가로 추출하였다. 그 후 상등액을 분리하여, 60 ℃에서 감압 농축하여, 200 ml 의 청각 바이오메스 추출물을 얻었다. 200 ml의 청각 바이오메스 추출물에 99% 에탄올을 첨가하여, 최종 에탄올 농도가 70%가 되도록 조절하여, 4 ℃에서 18시간동안 침지하였다. 침지된 용액은 필터를 이용하여 여과한 후, 99% 에탄올로 세척하고, 아세톤을 첨가하여, 퓸후드에서 건조시켰다. 건조된 침전물은 증류수를 이용하여 재용해 하고, 침전물과 공유 결합되어 있는 단백질을 확인하고, 유리 단백질을 제거하기 위하여, Sevag 방법을 이용하여, 최종적으로 청각 추출물(Codium)을 얻었다.
또한, 청각 추출물의 조성비를 확인해 본 결과, 청각 추출물은 54.6%의 탄수화물, 15.7%의 단백질, 13.0% 황산염 및 1.4%의 우론산으로 구성되어 있었으며, 청각 추출물의 탄수화물 중 주요 당은 갈락토스(59.5%)인 것을 확인하였다.
<실시예 3> 대식세포 분아증식 및 산화질소 생성 확인
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640 배지로 96 well plate에서 5% CO2, 37℃의 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 RAW264.7 세포에 각각 다른 농도의 청각 추출물(0, 0.5, 1, 2 및 4 μg/ml)을 0.5 μM 농도의 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)과 함께 처리하여, 추가로 24시간 배양하였으며, 대조군으로 1 μg/ml의 LPS를 첨가하여 배양하였다. 산화질소(nitric oxide)생성 측정은 세포배양 배지를 Griess reagent로 사용하여, 세포 내 아질산염 축적을 기준으로 산화질소 생성을 확인 하였다. 대식세포 분아증식은 EZ-Cytox Cell Viability assay kit을 사용하여 측정하였으며, 분아 증식비는 하기에 표시된 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
Figure pat00001
그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 청각 추출물(0 내지 4 μg/ml) 및 ARA의 처리는 RAW264.7 세포주에서 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 또한, 청각 추출물(Codium) 또는 ARA의 단독 처리보다, 청각 추출물 및 ARA 0.5 μM을 동시에 처리하였을 때 NO 생성이 유의적으로 높은 것을 확인하였다(도 1B).
<실시예 4> RNA 추출 및 cDNA 합성
총 RNA는 Tri reagentⓡ을 세포에 처리하여 추출되었으며, 추출된 RNA는 75% 에탄올로 세척하고, 100% 이소프로판올을 이용하여 침전시켰다. RNA 농도는 나노포토미터(nanophotometer, Implen, 독일)을 이용하여 분석하였다. 첫 번째 가닥의 cDNA는 High capacity cDNA reverse transcription kit을 이용하여, 제조사의 가이드에 따라 합성하였다.
<실시예 5> 정량적 Real-Time PCR(RT PCR)
RAW264.7세포주의 면역관련 유전자 발현의 정량은 SYBRⓡ premix Ex taqTM II를 이용하여 측정하였다. 정량적 RT PCR을 위한 반응 혼합물(reaction mixture)은 0.4 μM 농도로, 각 유전자에 대한 특이적 프라이머쌍 및 0.1 ng의 합성된 cDNA 주형을 혼합하였다. 반응 혼합물은 QuantStudio 3 Flex real time PCR system(Applied Biosystems, Foster city, 미국)을 이용하여 정량적 RT PCR을 수행하였으며, β-엑틴을 대조군으로 사용하였다. 정량적 RT PCR을 위해 사용한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.
Gene Accession No. Oligonucleotide Sequence (5’-3’)
iNOS BC062378.1 F: TTCCAGAATCCCTGGACAAG
R: TGGTCAAACTCTTGGGGTTC
IL-1β NM_008361.4 F: GGGCCTCAAAGGAAAGAATC
R: TACCAGTTGGGGAACTCTGC
IL-6 NM_031168.2 F: AGTTGCCTTCTTGGGACTGA
R:CAGAATTGCCATTGCACAAC
TNFF-α D84199.2 F: ATGAGCACAGAAAGCATGATC
R: TACAGGCTTGTCACTCGAATT
INF-γ NM_008337.3 F: CTCAAGTGGCATAGATGT
R: GAGATAATCTGGCTCTGCAGGATT
COX-2 NM_011198.4 F: AGAAGGAAATGGCTGCAGAA
R: GCTCGGCTTCCAGTATTGAG
TLR-4 NM_021297.3 F: CGCTCTGGCATCATCTTCAT
R: GTTGCCGTTTCTTGTTCTTCC
GPR120 AY288424.1 F: GATGACAATGAGCGGCAGCG
R: GATTTCTCCTATGCGGTTGGG
β-actin NM_007393.5 F: CCACAGCTGAGAGGGAAATC
R: AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 청각 추출물(4 μg/ml)을 처리하였을 때, RAW264.7 세포에서 면역관련 유전자의 발현이 증가한 것을 확인 하였다. 또한, 청각 추출물(Codium) 및 0.5 μM의 ARA를 함께 처리하였을 때, 청각 추출물(Codium)을 단독으로 처리하였을 때 보다 면역관련 유전자의 발현이 유의적으로 높게 발현되는 것을 확인하였다. 그 중에서도, 다중 불포화 지방산에 대한 수용체인 GPR120은 청각 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 높은 수준으로 발현이 증가한 것을 확인하였다.
<실시예 6> 웨스턴 블랏
RAW264.7 세포는 RIPA 버퍼를 이용하여 수확했으며, PrerceTM BCA protein Assat Kit과 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)를 이용하여 단백질 농도를 분석하였다. 전기영동된 단백질은 폴리비닐리딘 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 옮겼으며, Narayanan의 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 특이 항원으로는 p-NF-κB p65, p-p38, p-ERK1/2 및 p-JNK을 사용하였으며, 대조군으로 α-Tubulin을 사용하였다. 단백질과 특이적으로 결합한 항원의 신호는 Pierceⓡ ECL Plus Western Blotting Substrate로 인식하였으며, ChemiDoc XRS+ imaging system(Bio-Rad)을 이용하여 단백질을 정량하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 청각 추출물(Codium)은 ERK1/2 및 p-38과 같은 MAPK 경로와 관련된 유전자를 인산화 시키는 것을 확인하였다. 또한, 청각 추출물(Codium) 및 ARA를 동시에 처리했을 때 NF-κB 경로에서의 p-65, ERK1/2 및 p-38의 인산화가 청각 추출물(Codium)을 단독으로 처리하였을 때 보다 더욱 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 청각추출물(Codium) 및 ARA는 RAW264.7 대식세포주에서, 면역관련 유전자 및 다중 불포화 지방산에 대한 수용체인 GPR120의 발현을 증가시키고, MAPK 경로 및 NF-κB경로와 관련된 NF-κB p-65, ERK1/2 및 p-38 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하여, 본 발명의 청각 추출물(Codium) 및 ARA가 효과적으로 면역을 조절하는 것을 확인하여, 본 발명의 조성물이 면역 조절용 약학 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 청각 추출물은 증류수, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤 및 헥산을 이용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 청각 추출물 및 아라키돈산은 0.1 내지 5 μg/ml 및 0.5 μM의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 청각 추출물 및 아라키돈산은, iNOS, COX-2, IL-β1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GPR120 및 TLR-4으로 이루어진 군에서 1이상 선택된 인자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 청각 추출물 및 아라키돈산은, ERK1/2, p-38 및 p-65으로 이루어진 군에서 1이상 선택된 인자의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 청각 추출물 및 아라키돈산은, 산화 질소의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물.
  8. 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학 조성물.
  9. 청각(Codium fragile) 추출물 및 아라키돈산(Arachidonic acid)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물.
  10. 1) 청각을 80% 에탄올 추출하고 증류수를 첨가하여 조 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 청각 조 추출물에 아세톤을 첨가하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 청각 추출물에 유리 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법.
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