KR20220071556A - 함초 추출물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 함초 추출물 - Google Patents
함초 추출물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 함초 추출물 Download PDFInfo
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Abstract
제1 함초 추출물 및 제2 함초 추출물을 포함하는 함초 추출물의 제조 방법으로서, 함초 원재료를 제염하는 단계; 제염된 함초 원재료에 열수 추출공정을 수행하여 제1 함초 추출물 및 잔여 함초 원재료를 하는 단계; 잔여 함초 원재료에 미생물을 이용한 해당 공정을 수행하는 단계; 및 해당 공정이 수행된 잔여 함초 원재료에 가압 추출공정을 수행하여 제2 함초 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는 함초 추출물의 제조 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 새로운 함초 추출물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 함초 추출물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 높은 수율로 추출되면서도 높은 항비만 활성을 갖는 함초 추출물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 함초 추출물에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)는 2016년 기준으로 전세계 과체중 인구가 19억명이고 이 중 6억명 이상이 비만인 것으로 추산했다. 세계비만연맹(World Obesity Federation)은 2025년에 비만 인구가 10억명을 넘어서고, 이 중 중증 비만자가 1.77억 명에 이를 것으로 예상하였다. 비만은 비단 산업화된 나라에만 국한되는 것이 아니다. 영국 해외개발연구소(ODI)에서 발표한 자료에 따르면 1980년대 이후 대부분의 개발도상국의 과체중?비만인구는 3배 이상 증가했다고 밝혔다. 비만은 더 이상 선진국형 질병이 아닌 전세계적으로 치료되어야 하는 질병이 되었다. 우리나라의 경우에도 비만율이 해마다 빠르게 증가하고 있다. 특히 남성 인구에서 비만율이 빠르게 증가하고 있다. 2009년도에는 35.6%인 반면 2018년도에는 45.4%로 약 10% 증가한 양상이다.
한편, 비만을 개선하기 위해 전세계적으로 식사, 운동, 행동 요법이나 약물 치료 등의 비만의 치료와 예방에 대한 관심이 증가하고 있다. 국내에서도 부작용이 적은 천연물질 원료에 대한 개발이 이루어지고 있지만 아직까지 국내 항비만 관련 원료는 해외 수입에 대한 의존도가 높기 때문에 원료와 기술의 국산화가 필요하다. 또한 최근 심장질환, 암, 내혈관질환, 당뇨, 독감, 폐렴, 패혈증 등 각종 질병의 원인이 되는 비만의 해결을 위해 부작용이 적고 효과가 뛰어난 자연 유래 항비만 소재에 대한 수요가 증가하고 있으며, 이에 따라 우수한 천연 소재 개발이 필요하다.
이와 같은 천연 소재 개발로서 염생식물에 관한 연구가 최근에 활발히 진행되고 있다. 일본의 동경대학교 생체공학대 및 국립 천연물 과학 연구소의 공동 연구팀은 맹그로브 유용 유전자를 분리하여 약리학적 응용에 대해 연구하고 있으며, 중국에서는 해양생물자원분야에서 “해수에 견디는 채소 신품종 선정과 응용” 이라는 사업을 진행하며 습지에 자생하는 맹그로브로부터 많은 유용생체물질을 분리하여 논문으로 발표하였다. 이와 같이 해외에서는 염생식물의 유용성에 대해 관심이 집중되고 있는 반면 국내에서 의·약학적인 관점에서 연구는 부족한 실정이다.
함초(Salicornia herbacea)는 명아주과의 한해살이 초본 염생식물로 우리나라에서는 퉁퉁 마디로도 불린다. 칠면초와 해홍나물과 같이 우리나라의 서해안과 남해안 바닷가에서 군락을 이루어 자생하는 염생식물들 중의 하나이다. 함초는 일반적인 육상식물들과는 다르게 염분의 농도가 높은 갯벌에서 삼투압을 견디기 위해 식물체 내에 다량의 염화소듐을 축적하고 있어 매우 즙이 많다. 그리고 식이섬유가 미역이나 김 등의 다른 해조류에 비해 2배 이상 높고, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 등의 천연미네랄과 필수아미노산 및 필수지방산이 풍부하여 예로부터 숙변을 제거하고 변비를 없앤다고 알려져 있으며 또한 암, 축농증, 관절염, 고혈압, 요통, 치질, 당뇨병, 갑상선염, 천식, 기관지염, 간질환 그리고 비만증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
하지만 이러한 우수한 효과에도 불구하고, 국내에서의 유효성분의 추출은 연구 샘플들을 추출하는 기존의 방식을 따라 진행되었을 뿐 추출법에 관한 연구가 전무한 상태이다.
이러한, 문제점을 극복하기 새로운 함초 추출 공정의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 구현예들에서는 기존 대비 높은 수율로 추출되는 함초 추출물의제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 구현예들에서는 함초 추출물의 제조방법으로 제조된 함초 추출물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1 함초 추출물 및 제2 함초 추출물을 포함하는 함초 추출물의 제조 방법으로서, 함초 원재료를 제염하는 단계; 제염된 함초 원재료에 열수 추출공정을 수행하여 제1 함초 추출물 및 잔여 함초 원재료를 수득하는 단계; 잔여 함초 원재료에 미생물을 이용한 해당 공정을 수행하는 단계; 및 해당 공정이 수행된 잔여 함초 원재료에 가압 추출공정을 수행하여 제2 함초 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 함초 추출물의 제조 방법이 제공된다.
예시적인 구현예에서, 함초 원재료를 제염하는 단계는, 함초 원재료를 증류수와 함께 분체혼합기에 혼입하는 단계; 및 분체혼합기를 3 내지 10분 동안 가동시켜 염분을 제거하는 단계; 를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 함초 원재료를 제염하는 단계는, 환코팅기를 통해 제염된 함초 원재료상에 당의를 입힌 후 건조시켜 제염된 함초 원재료의 수분을 제거하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 열수 추출공정을 수행하는 단계는 78 내지 82℃의 온도에서 35 내지 50시간 동안 수행될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 해당 공정에서의 미생물은 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii) 및 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir)로 이루어진 그룹에서 선택된 1 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 해당 공정에서의 상기 헤당 공정에서의 미생물은 락토바실러스 파라카세이일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 가압 추출공정을 수행하는 단계에서의 용매는 물일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 가압 추출공정은 48-53 bar, 155-165
의 조건에서 70 내지 90분 동안 수행될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 가압 추출공정은 50 bar, 160
의 조건에서 80분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 항비만용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 동물사료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 건강기능식품이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 함초 추출물의 제조 방법에 따르면, 높은 수율로 추출되면서도 높은 항비만 활성을 갖는 함초 추출물을 제조할 수 있다.
아울러, 해당 함초 추출물의 제조 공정 중 해당 공정에서 대사산물로 항진균 활성 성능을 갖는 물질을 이용하기 때문에 함초 추출물의 품질유지기한이 증가되어 식품, 동물사료, 건강기능식품 등에 사용시 적용 제품의 보존일을 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 함초 추출물의 제조방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 함초 원재료에 대한 열수 추출 공정에서의 온도 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 함초 원재료에 대한 열수 추출 공정 수행 시간 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 해당 공정에서의 균주 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 잔여 함초 원재료에 대한 가압 추출 공정에서의 온도 및 압력 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 잔여 함초 원재료에 대한 가압 추출과정에서의 열수 추출 공정 수행 시간 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 기존 추출공정에 따라 제조된 함초 추출물(E로 표기) 및 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 함초 추출물(N으로 표기)의 흡광도 비교를 나타내는 그래프이다.
도 2는 함초 원재료에 대한 열수 추출 공정에서의 온도 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 함초 원재료에 대한 열수 추출 공정 수행 시간 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 해당 공정에서의 균주 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 잔여 함초 원재료에 대한 가압 추출 공정에서의 온도 및 압력 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 잔여 함초 원재료에 대한 가압 추출과정에서의 열수 추출 공정 수행 시간 설정 변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 기존 추출공정에 따라 제조된 함초 추출물(E로 표기) 및 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 함초 추출물(N으로 표기)의 흡광도 비교를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 구현예들을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명의 구현예들이 첨부된 도면을 참고로 설명되었으나 이는 예시를 위하여 설명되는 것이며, 이것에 의해 본 발명의 기술적 사상과 그 구성 및 적용이 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "잔여 함초 원재료" 란 제염된 함초 추출물에서의 추출되지 않고 여과 및 분리된 잔여물을 의미한다. 즉, 추출물 중 열수 추출 공정을 거쳐 형성된 추출액을 제외한 나머지 잔여물을 의미한다. 즉, 열수 추출 공정 결과로 제1 함초 추출물(추출액)과 잔여물 형성되는데, 해당 추출 결과물 중 추출액에서 여과 및 분리된 잔여물을 의미한다.
본 명세서에서, "제1 함초 추출물"이란 열수 추출 공정의 추출 결과물 중 잔여 함초 원재료가 여과 분리된 추출액을 의미한다. 즉, 열수 추출 공정을 통해 추출된 함초 추출물(혹은 추출액)을 의미한다.
본 명세서에서, "제2 함초 추출물"이란 가압 추출 공정의 추출 결과물을 의미한다. 즉, 가압 추출 공정을 통해 추출된 잔여 함초 원재료를 의미한다.
본 명세서에서, "함초 추출물"이란 본 발명의 제조 방법에 따라 추출된 함초 추출물을 의미한다. 상기 함초 추출물은 열수 추출을 통해 추출된 제1 함초 추출물과 해당 공정 및 가압 추출공정을 통해 추출된 제2 함초 추출물의 혼합물을 의미한다.
본 명세서에서, "항비만 활성"이란 오일 레드오 실험(Oil Red O Relative absorbance value)에서 오일 레드 오(Oil Red O) 용액으로 염색된 지방세포를 아이소프로판올 용액으로 용해한 후 흡광도를 측정하였을 때 육안으로 관측되는 면적%를 의미하며, %가 낮을수록 항비만 활성이 높음을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1 함초 추출물 및 제2 함초 추출물을 포함하는 함초 추출물의 제조 방법으로서, 함초 원재료를 제염하는 단계; 제염된 함초 원재료에 열수 추출공정을 수행하여 제1 함초 추출물 및 잔여 함초 원재료를 수득하는 단계; 잔여 함초 원재료에 미생물을 이용한 해당 공정을 수행하는 단계; 및 해당 공정이 수행된 잔여 함초 원재료에 가압 추출공정을 수행하여 제2 함초 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 함초 추출물의 제조 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 함초 추출물의 제조방법을 나타내는 흐름도이다. 이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 일 구현예에 따른 함초 추출물의 제조 방법을 설명한다.
먼저, 함초 원재료를 제염한다(S1).
구체적으로, 함초 원재료를 증류수와 함께 분체혼합기에 혼입한 후, 분체혼합기를 3 내지 10분 동안 가동시켜 염분을 제거한다.
일반적으로 염분을 제거하는 제염 과정은 물에 대상을 넣고 가열하는 방법, 과세척하는 방법, 장시간 동안 물에 침지시키는 방법 등이 있으나, 이와 같은 방법들은 염생식물 내에 유효 성분들의 손실을 가져오는 결과를 낳을 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 일 구현예에서는 분체의 혼합, 연합, 과립 과정을 목적으로 이용되는 분체혼합기를 이용하여 제염을 진행할 수 있다.
일 구현예에서, 분체 혼합기에 증류수 50 L 및 함초 원재료 40 내지 60 g을 혼입하여 제염을 진행할 수 있다. 상기 범위 미만으로 함초 원재료가 혼입되는 경우 함초 원재료의 유효성분의 손실이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 초과하여 함초 원재료가 혼입되는 경우 제염이 원활히 진행하게 진행되지 못하거나 공정 수율이 현저히 저하될 수 있다.
한편, 상기 제염 공정은 3 내지 7분 동안 진행될 수 있으며, 이에 따라 분체혼합기의 블레이드가 회전하면서 함초 내의 염분이 증류수에 용해되어 제염이 진행된다.
예시적인 구현예에서, 3분 미만으로 제염 공정이 진행되는 경우, 제염이 원활히 진행하게 진행되지 못하거나 공정 수율이 현저히 저하될 수 있으며, 7분을 초과하여 제염 공정이 진행되는 경우 함초 원재료의 유효성분이 과도하게 손실될 수 있다.
한편, 함초 원재료를 제염하는 단계는, 환코팅기를 통해 제염된 함초 원재료상에 당의를 입힌 후 건조시켜 제염된 함초 원재료의 수분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이에 따라, 함초에 과한 열을 주지 않고 추출 효율을 저하시키는 함초 내의 수분을 제거할 수 있다.
이어서, 제염된 함초 원재료를 열수 추출하여 제1 함초 추출물 및 잔여 함초 원재료를 수득한다(S3).
구체적으로, 제염된 함초 원재료에 78 내지 82℃의 온도에서 35 내지 50시간 동안 열수 추출 공정을 수행하여 제1 함초 추출물 및 잔여 함초 원재료를 수득한다. 상기 범위를 벗어나는 경우 함초 추출물의 유효성분의 수율이 현저히 저하되거나, 함초 추출물의 항비만 활성이 현저히 저하될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 열수 추출 단계는 80
의 온도에서 42시간 동안 수행될 수 있으며, 이 경우, 제1 함초 추출물의 유효성분의 수율이 30%이상이며, 항비만 활성이 82%미만일 수 있다.
한편 도시되지 않았으나, 상기 함초 추출물의 제조 방법은 상기 열수 추출 단계 이후 제1 함초 추출물과 잔여 함초 원재료를 여과하여 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이후, 잔여 함초 원재료에 미생물을 이용한 해당공정을 수행한다(S5). 이에 따라, 열수 추출 공정을 통해 추출되지 않은 잔여 함초 원재료에 존재하는 다당류들의 결합을 끊어 추출 수율을 높일 수 있다.
한편, 상기 미생물로는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii) 및 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir)로 이루어진 그룹에서 선택된 1 이상이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 헤당 공정에서의 미생물은 락토바실러스 파라카세이 일 수 있으며, 락토바실러스 파라카세이는 항진균 활성 성능을 갖기 때문에, 이를 이용하여 해당공정을 거쳐 추출된 함초 추출물의 품질유지기한이 증가될 수 있다. 이에 따라, 상기 함초 추출물이 적용되는 식품, 동물사료, 건강기능식품 등에 사용시 적용 제품의 보존일을 높일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구현예에서, 락토바실러스 파라카세이의 균주로서 락토바실러스 파라카세이 코리아 오션 바이오 클러스터 190619 (Lactobacillus paracasei Korea Ocean Bio Cluster 190619), 락토바실러스 파라카세이 코리아 오션 바이오 클러스터 190628 (Lactobacillus paracasei Korea Ocean Bio Cluster 190628) 및 락토바실러스 파라카세이 코리아 오션 바이오 클러스터 190703 (Lactobacillus paracasei Korea Ocean Bio Cluster 190703)로 이루어진 그룹에서 1 이상을 사용할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 해당 공정은 잔여 함초 원재료 100wt% 당 미생물 균주를 1 내지 5wt% 비율로 접종한 후 인큐베이터에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 범위 미만으로 균주가 접종된 경우 함초 추출물의 품질유지기한 증대 성능이 발현되기 어려우며, 상기 범위를 초과하여 균주가 접종된 경우 함초 추출물의 품질이 저하될 수도 있다.
이후, 해당공정이 수행된 잔여 함초 원재료에 가압 추출공정을 수행하여 제2 함초 추출물을 제조한다(S7).
구체적으로, 다당류의 헤당 공정을 거친 잔여 함초 원재료에 물을 이용하여 가압 추출공정을 수행하여 제2 함초 추출물을 제조한다.
일반적으로 식용으로 사용가능한 용매는 물, 천연에탄올 등이 있지만 본 발명에서는 물을 사용하여 가압 추출 공정을 진행한다. 물은 광범위한 수소 결합 구조로 구성되어있어 실온 즉 대기압 상태에서는 유전 상수가 높은 극성 용매이기 때문에, 실온상태에서는 비극성 또는 유기화합물에 적합한 추출 용매로 쓰이지 않는다. 하지만 물의 온도가 상승하면 유전율과 점도 및 표면장력이 감소하고 물의 확산은 증가한다는 특징이 있다. 이에 따라, 압력을 높여 온도를 물의 끓는점인 100
초과, 임계점 미만의 온도로 올리게 된다면 중간 및 낮은 극성의 물질들도 용해시킬 수 있는 유기 용매와 같은 특성을 지니게 된다. 이러한 특성을 이용해 헤당 공정을 거친 잔여 함초 원재료의 유효성분들을 가압 추출공정을 통해 추출하게 된다면 해당공정을 통해 저분자화된 물질들을 더욱 효과적으로 추출할 수 있게 된다. 즉, 가압 추출공정을 통해 해당 공정을 거친 잔여 함초 원재료에 존재하는 다당류들의 결합을 끊어 저분자화된 물질들을 더욱 효과적으로 추출할 수 있다.
한편, 예시적인 구현예에서 해당 공정을 거친 잔여 함초 원재료에 가압 추출공정을 수행하는 단계는 40-60 bar, 150-170
의 조건에서 60 내지 100분 동안 수행될 수 있으며, 구체적으로는 48-53 bar, 155-165
의 조건에서 70 내지 90분 동안 수행될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 함초 추출물 내에서의 유효성분의 수율이 현저히 저하되거나, 함초 추출물의 항비만활성이 저하될 수 있다.
일 구현예에서, 가압 추출공정을 수행하는 단계는 50 bar, 160
의 조건에서 80분 동안 수행될 수 있다. 상기 조건에서 함초 추출물이 가장 높은 추출 수율로 추출되면서도 높은 항비만 활성을 보일 수 있다.
한편, 도시되지는 않았으나, 상기 제2 함초 추출물 제조 후 전술한 제1 함초 추출물과 제2 함초 추출물을 혼합하여 함초 추출물을 제조할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 함초 추출물의 제조 방법에 따르면, 열수 추출 공정 수행 후 잔여 함초 원재료에 헤당 공정을 수행한 후, 물을 용매로 이용한 가압 추출 공정을 수행한다. 이와 같은 단계로 추출 공정이 진행되는 경우 해당 공정을 통해 잔여 함초 원재료에 존재하는 다당류들의 결합을 끊어 저분자화된 물질들을 더욱 효과적으로 추출할 수 있어 함초 추출물 내에 존재하는 유효 성분의 수율이 기존 공정 대비 높아질 수 있으며 항비만 활성 역시 기존 공정 대비 현저히 향상될 수 있다.
한편 본 발명의 다른 구현예에서는 전술한 함초 추출물의 제조 방법에 따라 제조된 함초 추출물이 제조된다. 상기 함초 추출물은 항비만 활성이 기존 공정에 의하여 제조된 함초 추출물 대비 우수하여 식용 제품의 대상에 제한되지 않고 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 함초 추출물은 함초 추출물을 유효성분으로 하는 식품에 제한되지 않고 적용될 수 있으며, 예컨대, 함초 추출물을 유효성분으로 하는 항비만용 조성물, 동물사료용 조성물, 건강기능식품 등에 사용될 수 있다.
한편, 상기 항비만용 조성물, 동물사료용 조성물, 건강기능식품 등에는 항비만활성을 보다 향상시킬 수 있는 물질이 함초 추출물 이외에 더 포함될 수 있으며, 예컨대, 상기 조성물 혹은 건강기능식품에는 망초추출물, 산사자추출물, 결명자추출물, 달맞이꽃어린잎추출물, 당귀추출물, 황기추출물, 뽕나무추출물 등이 더 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예들에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
한편, 본 실험에서 사용된 모든 실험은 3회 반복하여 진행하였으며, 결과 값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 그룹 간 평균은 명목형 변수의 단일집단 비율검정을 이용한 비 모수적 크루스칼왈리스(Kruskal-Wallis)검정법 및 맨위트니(Mann-Whitney) 분석을 사용하여 비교하였으며, p <0.01 과 p <0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
실시예
1.
공정의 최적화 조건 설정
(1)
제염된 함초 원재료의 열수 추출 공정(제1 추출 공정)
건조된 제염 함초를 이용하여 추출 온도, 시간에 따른 유효성분 차이를 확인하여 적절한 열수 추출 조건을 찾아보고자 실험을 진행하였다.
1) 추출 온도
추출 비율은 100 g당 1 L, 추출 시간은 24시간으로 설정한 후 실험을 진행하며, 시험 온도는 30
, 40℃?, 50℃?, 60℃?, 70℃?, 80℃?, 90℃?로 진행하며 100 g당 1 L, 추출 시간은 24시간으로 각 온도에서 추출을 진행하였다. 추출된 결과물들을 동결건조기를 이용해 분말화하여 추출 수율을 확인한 후 각 시료를 200 ug/mL의 농도로 제조하여 지방 세포 분화 유도를 마친 3T3-L1 세포에 각각 처리한다. 대조군은 샘플 처리 없이 배지만 첨가하였다. 샘플을 처리한 각각의 3T3-L1과 대조군은 48시간 동안 5% CO2, 37
환경의 인큐베이터에서 배양하였다. 샘플을 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거하고 피비에스(PBS)용액으로 세척한 후, 10% 포름알데히드 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 넣었던 포름알데히드용액을 버리고 새로운 10% 포름알데히드 용액을 가하고, 파라필름을 이용하여 밀봉한 뒤 1시간 동안 추가로 고정시켰다. 이후 포름알데히드 용액을 버리고 60% 아이소프로판올(isopropanol)용액을 통하여 세척하여 완전히 마르도록 기다리고 오일 레드 오(Oil Red O) 작동 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하고 증류수로 세척하였다. 염색된 지방세포는 100% 아이소프로판올 용액으로 용해하여 충분히 피펫팅하고 96 well 세포 배양 플레이트에 1 mL씩 분주 후 UV 마이크로플레이트 리더기를 통하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 표 1 및 도 2에 기재하였다.
| 30℃ | 40℃ | 50℃ | 60℃ | 70℃ | 80℃ | 90℃ | |
| 추출 수율 (g/100 g) |
10.7 | 12.7 | 15.9 | 21.4 | 22.6 | 23.5 | 24.4 |
| Oil Red O Relative absorbance value (%) | 99±1.40 | 97±1.19 | 94±1.65 | 89±1.51 | 93±1.28 | 95±1.42 | 95±1.29 |
표 1 및 도 2를 살펴보면, 추출 수율 및 항비만 활성을 모두 고려시 60
의 온도에서 열수 추출공정을 수행함이 가장 우수한 결과를 보임을 확인할 수 있었다.
2) 추출 시간
상기 도출된 결과를 바탕으로 가장 효율적인 열수 추출 시간을 알아보기 위하여 30 h, 40 h, 50 h, 60 h, 70 h, 80 h, 90 h, 100 h의 조건으로 가정을 두어 실험을 진행하였다. 기타 조건은 전술한 추출 온도 확인 실험과 동일하게 하였다.
추출된 결과물을 동결건조기를 이용해 분말화하여 추출 수율을 확인한 후 각 시료를 200 ug/mL의 농도로 제조하여 지방 세포 분화 유도를 마친 3T3-L1 세포에 각각 처리하였다. 대조군은 샘플 처리 없이 배지만 첨가하였다. 샘플을 처리한 각각의 3T3-L1과 대조군은 48시간 동안 5% CO2, 37℃환경의 인큐베이터에서 배양하였다. 샘플을 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거하고 피비에스(PBS)용액으로 세척한 후, 10% 포름알데히드 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 넣었던 포름알데히드 용액을 버리고 새로운 10% 포름알데히드 용액을 가하고, 파라필름을 이용하여 밀봉한 뒤 1시간 동안 추가로 고정시켰다. 이후 포름알데히드 용액을 버리고 60% 아이소프로판올 용액을 통하여 세척하여 완전히 마르도록 기다린 후, 오일 레드 오(Oil Red O) 작동 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하고 증류수로 세척하였다.
염색된 지방세포는 100% 아이소프로판올 용액으로 용해하여 충분히 피펫팅하고 96 well 세포 배양 플레이트에 1 mL씩 분주 후 UV 마이크로플레이트 리더기를 통하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 표 2 및 도 3에 기재하였다.
| 추출 시간 (h) | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
| 추출 수율 (g/100 g) |
14.5 | 20.4 | 21.2 | 24.9 | 27.5 | 31.7 | 32.7 | 33.1 |
| Oil Red O Relative absorbance value (%) | 82±0.92 | 79±1.06 | 78±0.96 | 75±1.21 | 73±1.19 | 68±0.90 | 74±1.12 | 75±1.19 |
표 2 및 도 3을 살펴보면, 추출 시간이 80시간동안 추출 공정을 진행한 경우, 30 g/100 g 이상의 높은 추출 수율을 보이면서도 항비만 효능이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. 추출 수율 및 항비만 활성을 모두 고려시 약 80시간 동안 열수 추출 공정을 수행함이 가장 우수한 결과를 보임을 확인할 수 있었다.
(1)
헤당 공정 균주 실험
열수 추출 공정으로는 추출되지 않는 함초 추출물에 존재하는 다당류들의 결합을 끊어 분해하고자 함초 박에 헤당 공정을 이용하여 전처리를 진행한 후 가압 추출 공정을 진행하였는데, 먼저 해당 공정시 어떠한 물질을 사용하는 것이 우수한 효과를 보이는지 확인하기 위해 다양한 종류의 유산균을 이용하여 전처리를 진행한 후 열수 추출 공정을 수행하여 추출 수율을 확인하였다.
구체적으로 유산균 중 락토바실러스 아시도필루스 2종, 락토바실러스 람노서스 1종, 락토바실러스 카제이 1종, 락토바실러스 파라카제이 3종, 락토바실러스 플란타륨 3종 즉 10종의 미생물을 이용하여 함초 박을 전처리 후 열수 추출 조건으로 추출을 진행하였고, 추출된 결과물들을 동결건조기를 이용해 분말화하여 추출 수율을 확인한 후 각 시료를 200 ug/mL의 농도로 제조하여 지방 세포 분화 유도를 마친 3T3-L1 세포에 각각 처리하였다. 이에 반해, 대조군은 샘플 처리 없이 배지만 첨가하였다.
샘플을 처리한 각각의 3T3-L1과 대조군은 48시간 동안 5% CO2, 37
환경의 인큐베이터에서 배양하였다. 샘플을 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거하고 피비에스(PBS)용액으로 세척한 후, 10% 포름알데히드 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 넣었던 포름알데히드 용액을 버리고 새로운 10% 포름알데히드 용액을 가하고, 파라필름을 이용하여 밀봉한 뒤 1시간 동안 추가로 고정시켰다. 이후 포름알데히드 용액을 버리고 60% 아이소프로판올 용액을 통하여 세척하여 완전히 마르도록 기다리고 오일 레드 오(Oil Red O) 작동 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하고 증류수로 세척하였다. 염색된 지방세포는 100% 아이소프로판올 용액으로 용해하여 충분히 피펫팅하고 96 well 세포 배양 플레이트에 1 mL씩 분주 후 UV 마이크로플레이트 리더기를 통하여 520 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 4에 기재하였다.
도 4를 살펴보면, 유산균 중 락토바실러스 파라카세이 균주를 이용함이 가장 우수한 효율을 보임을 알 수 있었으며, 그 중에서도 한국해양바이오 클러스터에서 분리한 락토바실러스 파라카세이 균주 3종(락토바실러스 파라카세이 코리아 오션 바이오 클러스터 190619 (Lactobacillus paracasei Korea Ocean Bio Cluster 190619), 락토바실러스 파라카세이 코리아 오션 바이오 클러스터 190628 (Lactobacillus paracasei Korea Ocean Bio Cluster 190628), 락토바실러스 파라카세이 코리아 오션 바이오 클러스터 190703 (Lactobacillus paracasei Korea Ocean Bio Cluster 190703)이 가장 우수한 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
아울러, 해당 균주들은 대사산물로 항진균 활성을 나타내는 물질을 만드는 균주이므로 상기 균주들을 이용하여 해당 공정을 진행함으로써 함초 추출물의 품질유지기한을 증가시켜 보존일을 높여줄 수 있을 것으로 예상된다.
(2)
가압 추출 공정(제2 추출 공정)
가압 추출 공정을 이용하여 함초 추출물을 제조하기 위한 최적의 압력, 온도 및 시간 조건을 찾고자 실험을 수행하였다.
우선 함초 박 상에 3wt%의 비율로 3개의 락토바실러스 파라카세이 균주를 이용하여 접종한 후 37
인큐베이터에서 4~5 일간 배양한 후(즉, 해당 과정 수행) 가압 추출 공정을 진행하였다.
이후, 해당 과정을 거친 함초 박 100 g당 1 L의 멸균된 물을 넣고 추출을 진행하였는데, 가압 추출 공정의 조건은 크게 압력, 온도, 추출시간으로 볼 수 있으므로, 이 3가지에 대해 실험을 진행하였다.
1) 추출압력 및 온도
가압 추출 공정에서의 추출압력에 따른 추출 온도를 설정하기 위하여 표 3과 같은 8가지 조건 하에 실험을 진행하였다.
| 압력(bar) | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 온도 (℃) | 110 | 120 | 130 | 140 | 150 | 160 | 170 | 180 |
가압 추출기를 이용하여 각 압력에 따른 온도별로 60분 동안 추출을 진행한 후에 추출된 결과물을 동결건조기를 이용해 분말화하여 추출 수율을 확인한 후 각 시료를 200 ug/mL의 농도로 제조하여 지방 세포 분화 유도를 마친 3T3-L1 세포에 각각 처리하였다. 이에 반해, 대조군은 샘플 처리 없이 배지만 첨가하였다.
샘플을 처리한 각각의 3T3-L1과 대조군은 48시간 동안 5% CO2, 37
환경의 인큐베이터에서 배양하였다. 샘플을 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거하고 피비에스(PBS)용액으로 세척한 후, 10% 포름알데히드 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 넣었던 포름알데히드 용액을 버리고 새로운 10% 포름알데히드 용액을 가하고, 파라필름을 이용하여 밀봉한 뒤 1시간 동안 추가로 고정시켰다. 이후 포름알데히드 용액을 버리고 60% 아이소프로판올 용액을 통하여 세척하여 완전히 마르도록 기다리고 오일 레드 오(Oil Red O) 작동 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하고 증류수로 세척하였다. 염색된 지방세포는 100% 아이소프로판올 용액으로 용해하여 충분히 피펫팅하고 96 well 세포 배양 플레이트에 1 mL씩 분주 후 UV 마이크로플레이트 리더기를 통하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 표 4 및 도 5에 기재하였다.
| 압력(bar) | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 온도 (℃) | 110 | 120 | 130 | 140 | 150 | 160 | 170 | 180 |
| 추출 수율 (g/100 g) |
10.7 | 11.5 | 14.7 | 16.9 | 18.5 | 23.4 | 22.9 | 22.7 |
| Oil Red O Relative absorbance value (%) | 85±1.44 | 84±1.30 | 82±0.93 | 80±1.24 | 79±0.91 | 75±1.17 | 81±1.04 | 83±1.03 |
표 4 및 도 5를 살펴보면, 50 bar, 160℃ 조건하에서 추출 수율이 가장 높으면서도, 항비만 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 추출 수율 및 항비만 활성을 모두 고려 시 50 bar 및 160℃ 조건하에서 가압 추출공정을 수행함이 가장 우수한 결과를 보임을 확인할 수 있었다.
2) 추출 시간
위 도출된 결과를 바탕으로 가장 효율적인 추출 시간을 알아보기 위하여 30 h, 40 h, 50 h, 60 h, 70 h, 80 h, 90 h, 100 h 조건으로 가정을 두어 실험을 진행하였다. 기타 조건은 추출온도 및 압력 설정 실험과 동일하게 설정하였다.
추출 후, 추출된 결과물을 동결건조기를 이용해 분말화하여 추출 수율을 확인한 후 각 시료를 200 ug/mL의 농도로 제조하여 지방 세포 분화 유도를 마친 3T3-L1 세포에 각각 처리하였다. 이에 반해, 대조군은 샘플 처리 없이 배지만 첨가하였다. 샘플을 처리한 각각의 3T3-L1과 대조군은 48시간 동안 5% CO2, 37
환경의 인큐베이터에서 배양하였고, 샘플을 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거하고 피비에스(PBS)용액으로 세척한 후, 10% 포름알데히드 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다.
이후, 반응 후 넣었던 포름알데히드 용액을 버리고 새로운 10% 포름알데히드 용액을 가하고, 파라필름을 이용하여 밀봉한 뒤 1시간 동안 추가로 고정시켰다. 그 다음 포름알데히드 용액을 버리고 60% 아이소프로판올 용액을 통하여 세척하여 완전히 마르도록 기다리고 오일 레드 오(Oil Red O) 작동 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하고 증류수로 세척하였다. 염색된 지방세포는 100% 아이소프로판올 용액으로 용해하여 충분히 피펫팅하고 96 well 세포 배양 플레이트에 1 mL씩 분주 후 UV 마이크로플레이트 리더기를 통하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 표 5 및 도 6에 나타내었다.
| 추출 시간 (h) | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
| 추출 수율 (g/100 g) | 14.5 | 20.4 | 21.2 | 24.9 | 27.5 | 31.7 | 32.7 | 33.1 |
| Oil Red O Relative absorbance value (%) | 82±0.92 | 79±1.06 | 78±0.96 | 75±1.21 | 73±1.19 | 68±0.90 | 74±1.12 | 75±1.19 |
표 5 및 도 6을 살펴보면, 80h시간 동안 추출공정을 수행한 경우, 30 g/100 g 이상의 추출효율을 보이며, Oil Red O Relative absorbance value 값이 가장 낮을 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 추출 수율 및 항비만 활성을 모두 고려시 80 h동안 가압 추출공정을 수행함이 가장 우수한 결과를 보임을 확인할 수 있었다.
1.
기존 추출공정의 비교
1차 열수 추출 공정만으로 추출한 함초 추출물의 항비만 활성(도 7의 그래프 상에 E로 표기)과 열수 추출 공정, 헤당 공정 및 가압 추출 공정을 이용하여 추출된 함초 추출물의 항비만 활성(도 7의 그래프 상 N으로 표기)을 비교하였다.
구체적으로, 각 추출 공정을 진행하여 추출된 추출물을 동결건조기를 이용해 분말화하여 추출 수율을 확인한 후 각 시료를 200 ug/mL의 농도로 제조하여 지방 세포 분화 유도를 마친 3T3-L1 세포에 각각 처리하였다. 대조군은 샘플 처리 없이 배지만 첨가하였고, 이후 샘플을 처리한 각각의 3T3-L1과 대조군은 48시간 동안 5% CO2, 37
환경의 인큐베이터에서 배양하였다.
샘플을 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거하고 피비에스(PBS)용액으로 세척한 후, 10% 포름알데히드 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 넣었던 포름알데히드 용액을 버리고 새로운 10% 포름알데히드 용액을 가하고, 파라필름을 이용하여 밀봉한 뒤 1시간 동안 추가로 고정시켰다. 이후 포름알데히드 용액을 버리고 60% 아이소프로판올 용액을 통하여 세척하여 완전히 마르도록 기다리고 오일 레드 오(Oil Red O) 작동 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하고 증류수로 세척하였다. 염색된 지방세포는 100% 아이소프로판올 용액으로 용해하여 충분히 피펫팅하고 96 well 세포 배양 플레이트에 1 mL씩 분주 후 UV 마이크로플레이트 리더기를 통하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 6 및 도 7에 나타내었다.
| 공정 | 기존 추출 공정 | 실시예에 따른 추출 공정 |
| 추출 수율 (g/100 g) |
32.3 | 64.1 |
| Oil Red O Relative absorbance value (%) | 81±1.17 | 62±0.98 |
표 6 및 도 7을 살펴보면, 1차 추출 공정만을 통해 추출된 함초 추출물(기존 추출공정, E)과 해당 과정 및 제2 추출공정을 추가하여 도출된 함초 추출물의 활성도(N으로 표시)를 비교할 수 있었다.
구체적으로 도 7을 보면, 기존 추출 공정은 활성 81±1.17%, 수율 32.3 g/100 g임을 보인 반면, 본 발명의 실시예에 따라 제조된 추출물의 경우 활성 62±0.98, 수율 64.1 g/100 g 로 기존의 통상적인 추출 공정에 비교하여 활성과 수율이 약 2배가량 높아진 것을 확인할 수 있었다.
앞에서 설명된 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.
Claims (13)
- 제1 함초 추출물 및 제2 함초 추출물을 포함하는 함초 추출물의 제조 방법으로서,
함초 원재료를 제염하는 단계;
제염된 함초 원재료에 열수 추출공정을 수행하여 제1 함초 추출물 및 잔여 함초 원재료를 하는 단계;
잔여 함초 원재료에 미생물을 이용한 해당 공정을 수행하는 단계; 및
해당 공정이 수행된 잔여 함초 원재료에 가압 추출공정을 수행하여 제2 함초 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는 함초 추출물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
함초 원재료를 제염하는 단계는,
함초 원재료를 증류수와 함께 분체혼합기에 혼입하는 단계; 및
분체혼합기를 3 내지 10분 동안 가동시켜 염분을 제거하는 단계; 를 포함하는 함초 추출물의 제조 방법. - 제2항에 있어서,
함초 원재료를 제염하는 단계는, 환코팅기를 통해 제염된 함초 원재료상에 당의를 입힌 후 건조시켜 제염된 함초 원재료의 수분을 제거하는 단계; 를 더 포함하는 함초 추출물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
열수 추출공정을 수행하는 단계는 78 내지 82℃의 온도에서 35 내지 50시간 동안 수행되는 함초 추출물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 해당 공정에서의 미생물은 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii) 및 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir)로 이루어진 그룹에서 선택된 1 이상을 포함하는 함초 추출물의 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 헤당 공정에서의 미생물은 락토바실러스 파라카세이인 함초 추출물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
가압 추출공정을 수행하는 단계에서의 용매는 물인 함초 추출물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
가압 추출공정에서는 단계는 48-53 bar, 155-165의 조건에서 70 내지 90분 동안 수행되는 함초 추출물의 제조 방법.
- 제8항에 있어서,
가압 추출공정을 수행하는 단계는 50 bar, 160의 조건에서 80분 동안 수행되는 함초 추출물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 항비만용 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 동물사료용 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 함초 추출물의 제조 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 건강기능식품.
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Legal Events
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |