KR20220070547A - TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

TL1 A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물 및, 예를 들어 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 및 장애의 치료를 위한 이들의 사용 방법이 기술된다. 또한 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, IL-2) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법이 기술된다. 일부 구현예에서, (a) 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 25(TNFRSF25)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 (b) 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산이 본원에 제공된다.

Description

TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE REGULATION OF T REGULATORY CELLS USING TL1A-IG FUSION PROTEIN}
연방에서 지원하는 연구 또는 개발에 관한 진술
본원에 기술된 연구는 부분적으로 국립보건원으로부터의 허가(NIH 5P01CA 109094)에 의해 지원되었다. 따라서, 정부는 본 발명에서 일부 권리를 갖는다.
관련 출원
본원은 2013년 1월 9일자 출원된 미국 가출원번호 제61/750,672호; 2013년 1월 17일자 출원된 미국 가출원번호 제61/753,634호; 2013년 7월 2일자 출원된 미국 가출원번호 제61/842,127호; 그리고 2013년 7월 8일자 출원된 미국 가출원번호 제61/843,558호에 대한 우선권의 이익을 주장하고; 각각의 전체 내용은 전체로서 본원에 참조로 도입된다.
이 개시 내용은 분자 생물학 및 면역학 분야에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 25(TNFRSF25)의 천연 리간드 TNFSF15(TL1A로도 알려져 있음)에 의한 생체내 자극은 마우스에서 Treg의 선택적 증식 및 알러지성 폐 염증, 동종의 심장 이식 및 HSV-1 중재의 안구 염증에서 면역병리의 억제를 용이하게 한다. 그러나, 인간에서 Treg 요법의 이해에 대한 진보는 느리고, 따라서 생체외 세포 배양 방법론으로 한층 제한되어있다. 더욱이, 이러한 요법은 또한 안전해야 하고, 염증성 장 질환(IBD)과 같은 위험한 부작용을 피해야 한다. 어떤 TNFRSF25 효능제에 의한 지속적인 자극은, 예를 들어 마우스 천식 모델에서 증가된 염증, 염증성 장 질환 및 관절염을 포함하는 위험한 생체내 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 인간에서의 Treg 요법을 위한 안전하고 ㅎ효과적인 개선된 치료법이 요구된다.
위에 논의된 바와 같이, 동종의 고형 기관 이식에 대한 용인이 확립된 자가면역 질환 및 장애를 치료하고, 특히 인간 환자에서 다른 항원-특이적 면역 반응을 조절하기 위한 안전하고 효과적인 치료법이 해당 분야에 요구된다. 본 개시는 이들 및 다른 관련된 장점을 제공한다.
일부 구현예에서, (a) 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 25 (TNFRSF25)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 인간 TL1A 폴리펩타이드의 세포외 영역 또는 이의 단편을 포함하는데, 여기에서 이 단편은 TNFRSF25에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 융합 단백질 호모다량체를 형성할 수 있는 단량체 융합 단백질을 코딩한다. 일부 구현예에서, 이 호모다량체는 3량체의 2량체이다. 일부 구현예에서, 이 핵산은, 필요로 하는 인간에 투여될 때 인간에서 나이브(naive) CD4 T 세포의 빈도를 감소시키는 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 폴리펩타이드(예를 들어, IgG1)의 하나 이상의 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 폴리펩타이드의 둘 이상의 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 폴리펩타이드의 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 서열번호 14의 폴리펩타이드 사열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12의 서열로 구성된다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 서열번호 12 및 서열번호 14를 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 서열번호 16을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 서열번호 16으로 구성되는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 이 융합 단백질에 작동 가능하게 연결된 분비 및/또는 신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 융합 단백질 호모다량체(예를 들어, 3량체의 2량체)로서 숙주 세포로부터 분비된다.
또한, 위에 기술된 핵산(예를 들어, (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산)을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 이 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 이 벡터는 플라스미드 벡터이다. 일부 구현예에서, 위에 기술된 벡터(예를 들어, (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산을 포함하는 벡터)를 포함하는 재조합 또는 단리된 숙주 세포가 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 위에 기술된 임의의 핵산(예를 들어, (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산)으로 형질감염된 재조합 또는 단리된 숙주 세포가 또한 본원에 제공되는데, 여기에서 숙주 세포는 이 융합 단백질을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 숙주 세포는 진핵 세포이다.
또한, (a) 위에 기술된 핵산(예를 들어, (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산)을 세포의 집단으로 도입하되, 여기에서 이 핵산은 이 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 생산하는 데 유효한 조절 서열에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 (b) 배양 배지에서 이 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생산하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이 방법은 (c) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 이 핵산은 이 융합 단백질에 작동 가능하게 연결된 분비 또는 신호 펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 융합 단백질 호모다량체(예를 들어, 3량체의 2량체)로서 숙주 세포로부터 분비된다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질 호모다량체는 배양 배지로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 배양 배지, 숙주 세포, 또는 숙주 세포 주변세포질(periplasm)로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질 호모다량체는 제1 융합 단백질의 시스테인 잔기와 하나 이상의 추가적 융합 단백질의 적어도 하나의 시스테인 잔기 사이에 하나 이상의 공유 이황화 결합을 포함한다.
또한, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물이 본원에 제공되는데, 이 융합 단백질은 (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 인간 TL1A 폴리펩타이드의 세포외 영역 또는 이의 단편을 포함하는데, 여기에서 이 단편은 TNFRSF25에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 조성물은, 필요로 하는 인간에 투여될 때 인간에서 나이브(naive) CD4 T 세포의 빈도를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 호모다량체이다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 3량체의 2량체이다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 IgG 폴리펩타이드의 하나 이상의 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 IgG 폴리펩타이드의 둘 이상의 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 IgG 폴리펩타이드의 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 서열번호 14와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 서열번호 14와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 서열번호 14와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 IgG 폴리펩타이드는 서열번호 14와 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 서열번호 16과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 서열번호 16과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 서열번호 16과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 서열번호 16과 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 조성물은 Ig 폴리펩타이드와 결합하지 않았을 때의 제1 폴리펩타이드와 비교하여 증진된 생체내 효능을 특징으로 한다.
또한, 필요로 하는 인간 환자에서의 항원-특이적 면역 반응을 조절하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 위에 기술된 조성물(예를 들어, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 이 융합 단백질은 (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다)을 이 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서 이 조성물은 치료적으로 유효한 양의 융합 단백질을 포함하는 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 필요로 하는 환자는 고형 기관 또는 줄기세포 이식을 위한 준비로 유도 치료 중이거나 이를 받으려 하는 환자, 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자로 유지 요법 중이거나 이를 받으려 하는 환자, 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자인 환자, 알러지 환자; 백신을 맞고 있거나 맞으려 하는 환자, 면역 체크포인트 저해제(예를 들어, CTLA-4 또는 PD-1 저해제)로 치료 중이거나 치료받으려 하는 환자로 구성되는 군으로부터 선택되는 환자이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 1일 당 체중 킬로그램 당 0.1 - 10 밀리그램(mg/kg/일)의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 0.5 - 5 mg/kg/일의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 1 - 2 mg/kg/일의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 이 조성물은 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 적어도 20% 감소시킨다. 일부 구현예에서, 이 방법은 환자에게 이 조성물을 다중 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 위의 조성물은 유효량의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 대상에게 단독으로 투여될 경우 Treg 세포의 준최적(suboptimal) 팽창을 유도할 양이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 내지 300,000 단위의 범위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 단위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위이다. 일부 구현예에서, 임의의 위의 조성물은 유효량의 mTOR 저해제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 라파마이신(시롤리무스), CI-779, 에베롤리무스 ABT-578, 타크롤리무스, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라시브, TAFA-93, 데포롤리무스(AP-23573), 템시롤리무스, 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올(PP242), AP-23841, 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신(CCI779), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신(ABT578), 비올리무스-7, 비올리무스-9, 및 AP23464로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한, 필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료, 또는 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 위에 기술된 조성물(예를 들어, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 이 융합 단백질은 (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다)을 이 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서 이 조성물은 치료적으로 유효한 양의 융합 단백질을 포함하는 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 0.1 - 10 mg/kg/일의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 0.5 - 5 mg/kg/일의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 1 - 2 mg/kg/일의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 이 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애, 이식 거부, 이식편대숙주병, 염증, 천식, 알러지 및 만성 감염으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이 질환 또는 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 환자에게 이 조성물을 다중 투여하는 것을 포함한다. 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이 조성물은 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 적어도 20% 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 환자에게 유효량의 IL-2를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 환자에게 단독으로 투여될 경우 Treg 세포의 준최적(suboptimal) 팽창을 유도하거나 팽창을 유도하지 못할 양이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 내지 300,000 단위의 범위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 단위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위이다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 환자에게 유효량의 mTOR 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 라파마이신(시롤리무스), CI-779, 에베롤리무스 ABT-578, 타크롤리무스, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라시브, TAFA-93, 데포롤리무스(AP-23573), 템시롤리무스, 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올(PP242), AP-23841, 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신(CCI779), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신(ABT578), 비올리무스-7, 비올리무스-9, 및 AP23464로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한, TNFRSF25 효능제의 투여를 포함하는, 치료와 관련된 부정적인 사건의 빈도 및/또는 심한 정도를 감소시키는 방법이 본원에 제공되는데, 여기에서 부정적인 사건의 빈도 및/또는 심한 정도를 감소시키는 방법은 생리적으로 허용 가능한 담체 중의 위에 기술된 임의의 조성물(예를 들어, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 이 융합 단백질은 (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및/또는 효능적 항-TNFRSF25 항체, 및/또는 작은 분자 TNFRSF25 효능제, 및/또는 인터류킨 또는 이의 유사체(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15), 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)를 포함한다)을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 부정적인 사건은 염증성 장 질환의 하나 이상의 증상의 발생이다. 일부 구현예에서, 이 부정적인 사건은 염증성 장 질환의 발생이다. 일부 구현예에서, 이 부정적인 사건은 체중 감소, 발진, 설사, 근육통, 혈소판 수의 감소, 간 효소 농도의 증가, 및 사망으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이 조성물은 투여 후 환자에서 Treg 세포의 증식을 유의성 있게 증가시키는 양으로 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 이 조성물은 투여 후 환자에서 Treg 세포의 증식을 적어도 2 배 증가시키는 양으로 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 이 방법은 환자에게 이 조성물을 다중 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 염증성 장 질환 및 류마티스성 관절염으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이 조성물은 약제학적 제제로 제형화된다. 일부 구현예에서, 위의 부정적인 사건의 빈도 및/또는 심한 정도를 감소시키는 방법은 환자에게 유효량의 IL-2를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 환자에게 단독으로 투여될 경우 Treg 세포의 준최적(suboptimal) 팽창을 유도하거나 팽창을 유도하지 못할 양이다. 부정적인 사건의 빈도 및/또는 심한 정도를 감소시키는 위의 방법의 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 내지 300,000 단위 사이의 범위에 있는 용량이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 단위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위이다. 일부 구현예에서, 위의 부정적인 사건의 빈도 및/또는 심한 정도를 감소시키는 방법은 환자에게 유효량의 mTOR 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 라파마이신(시롤리무스), CI-779, 에베롤리무스 ABT-578, 타크롤리무스, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라시브, TAFA-93, 데포롤리무스(AP-23573), 템시롤리무스, 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올(PP242), AP-23841, 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신(CCI779), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신(ABT578), 비올리무스-7, 비올리무스-9, 및 AP23464로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한, (a) 위에 기술된 임의의 조성물(예를 들어, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 이 융합 단백질은 (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및/또는 효능적 항-TNFRSF25 항체, 및/또는 작은 분자 TNFRSF25 효능제, 및/또는 인터류킨 또는 이의 유사체(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15), 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)를 포함한다); 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이 악제학적 조성물은 유효량의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 환자에게 단독으로 투여될 경우 Treg 세포의 준최적(suboptimal) 팽창을 유도하거나 팽창을 유도하지 못할 양이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 내지 300,000 단위 사이의 범위에 있는 용량이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 단위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위이다.
또한, 필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 조절하고/하거나 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하고/하거나 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되는데, 이 방법은 환자에게 TNFRSF25 효능제 및 유효량의 인터류킨 2 및/또는 mTOR 저해제를 포함하는 조합 요법제를 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법의 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 TNFRSF25 효능제는 작은 분자, 효능적 항-TNFRSF25 항체, 또는 TL1A 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, TL1A 융합 단백질은 0.1 - 10 mg/kg/일, 0.5 - 5 mg/kg/일, 또는 1 - 2 mg/kg/일의 범위의 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 환자에게 단독으로 투여될 경우 Treg 세포의 준최적(suboptimal) 팽창을 유도하거나 팽창을 유도하지 못할 양이다. 이 방법의 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 내지 300,000 단위 사이의 범위에 있는 용량이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 단위이다. 일부 구현예에서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위이다. 일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제 및 유효량의 IL-2는 동일한 날에 함께 또는 별개로 투여된다. 일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제 및 유효량의 IL-2는 다른 날에 투여된다. 이 방법의 일부 구현예에서, 조합 요법제는 TNFRSF25 효능제 및 유효량의 mTOR 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 1일 당 체중 kg 당 75 내지 300 마이크로그램 범위의 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제 및 mTOR 저해제는 동일한 날에 함께 또는 별개로 투여된다. 일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제 및 mTOR 저해제는 다른 날에 투여된다. 조합 요법제를 포함하는 위의 방법의 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애, 이식 거부, 이식편대숙주병, 염증, 천식, 알러지 및 만성 감염으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 라파마이신(시롤리무스), CI-779, 에베롤리무스 ABT-578, 타크롤리무스, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라시브, TAFA-93, 데포롤리무스(AP-23573), 템시롤리무스, 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올(PP242), AP-23841, 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신(CCI779), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신(ABT578), 비올리무스-7, 비올리무스-9, 및 AP23464로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 개시의 하나 이상의 구현예의 세부 사항은 첨부되는 도면 및 아래의 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 장점은 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 해당 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 저촉되는 경우, 본 문서가 정의를 포함하여 제어할 것이다.
본원에 언급되는 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 각각 그 전체가 참조로 도입된다. 본원에 개시되는 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산을 제공한다. 이 융합 단백질은 (a) 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 25(TNFRSF25)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 본원에 개시되는데, 여기에서 이 융합 단백질은 인간 또는 히말라야 원숭이(rhesus macaque) TL1A 폴리펩타이드의 기능적으로 활성인 단편을 포함한다. 기능적으로 활성인 단편은, 예를 들어 TL1A(예를 들어, 인간 또는 히말라야 원숭이 TL1A)의 세포외 영역 또는 TL1A 수용체, TNFRSF25에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 임의의 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, TL1A의 기능적으로 활성인 단편은 인간 TL1A 세포외 영역으로부터 아미노산 68-252를 포함한다. 이 융합 단백질은 또한, Ig 불변 영역의 하나 이상의 영역, 예를 들어 힌지 영역, CH2 영역, 및/또는 CH3 영역과 같은, 하나 이상의 Ig 분자를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 융합 단백질이 생체내 동족 T 조절 세포(Treg)의 증식을 안전하고 선택적으로 자극한다는 것이 현재 발견되었다. 인간에서 TL1A 다형과 염증성 장 질환(IBD)을 관련시키는 역학적 데이터(예를 들어, 국제특허공보 WO 2006/127900 참조), 그리고 TL1A의 유전자변형 과발현이 IBD 민감성 성향을 갖게 하는 것을 보여주는 뮤린 연구에 근거하면, 이 융합 단백질이 생체내 안전하고 유효하게 투여될 수 있는지 여부가 불명확하였다. 더욱이, 치료적으로 유효한 양의 TL1A 융합 단백질이 안전하게 투여될 수 있는지 여부는 전적으로 예측할 수 없었는데, 이는 부분적으로 어떤 TNFRSF25 효능제는 생체내 유해한 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 예를 들어, 선행기술의 마우스 모델에서는, 예를 들어 Meylan et al. Immunity. 2008 Jul 18;29(1):79-89; Meylan et al. Mucosal Immunol. 2011 Mar;4(2):172-85; Migone et al. Immunity. 2002 Mar;16(3):479-92; Fang et al. J Exp Med. 2008 May 12;205(5):1037-48; 및 Bull et al. J Exp Med. 2008 Oct 27;205(11):2457-64에 기술된 바와 같이, 염증성 장 질환, 천식 및 관절염의 마우스 모델에서 TL1A의 유전자이식 발현을 연구하였다. 이들 보고서에서는 TL1A의 존재, 및 TNFRSF25를 통한 신호전달이 조사하는 질환 세팅에서 관찰되는 면역병리학의 심한 정도를 증가시키고 작동체 T 세포의 자극을 증진시키는 결과를 야기한다는 것을 보여준다. 더욱이, 백신 접종의 맥락에서 TNFRSF25를 통한 신호전달이, Treg 세포의 동시 팽창에도 불구하고 작동체 T 세포의 증가된 증식을 유도하는 것으로 나타났다(Schreiber et al. J Immunol. 2012 Oct 1;189(7):3311-8 참조). 이들 연구는 TNFRSF25 자극의 특이성이 동족 항원의 유용성에 의해 통제되고, 영장류에서 이들 약제의 특이성과 관련된 심각한 안전성 우려를 야기한 것을 보여주었다. 이러한 우려의 이유는 선행기술 연구가 무균 세팅에 수용된 실험실 마우스에서 수행되었고 따라서 다양한 집합체의 환경 항원에 대한 노출 이력을 갖지 않는다는 인식으로부터 발생하였다. 인간 및 비-인간 영장류에서는 환경 세팅이 매우 어렵기 때문에(즉, 무균이 아님), 인간 또는 비-인간 영장류 세포의 TNFRSF25 효능제(예를 들어, TL1A-유래의 효능제)에 대한 노출은 Treg 세포에 대한 증진 효과에도 불구하고, 작동체 T 세포의 자극 및 증진된 면역병리를 유도할 것이라는 심각한 우려가 있었다. 특히, 마우스에서의 실험실 데이터에 근거하여, "외래" 항원(내인성 세균) 및 환경 또는 식품 항원의 높은 유행으로 인해 폐 및 장관 시스템에서의 증가된 염증이 예측되었다.
그러나, 예상치 못하게도, 인간화된 마우스 및 영장류에서의 연구에서 본원에 기술된 TL1A 융합 단백질 처리가 Treg 세포 증식을 유도하는 데 효과적일 뿐 아니라, 체중 감소를 유도하거나, 백혈구 계수에서 변화를 야기하거나, 임의의 다른 위험하거나 원치 않는 부작용을 유도하지 않는다는 것이 현재 밝혀졌으며, 이는 놀랍게도, TL1A 융합 단백질이 영장류를 포함하여 생체내 안전하게 투여될 수 있다는 것을 나타낸다(TL1A 융합 단백질이 인간에게 안전하게 투여될 것으로 예상됨을 나타낸다). 따라서, 융합 단백질 자체에 추가하여, TNFRSF25 효능제의 투여를 포함하는 치료와 관련하여 부정적인 사건을 감소시키기 위한 방법이 또한 본원에 기술되며, 여기에서 이 방법은 본원에 기술된 TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법은, 아래 논의되는 바와 같이, TNFRSF25 효능제 치료와 관련된 부정적인 사건을 감소시키는 한편, 동시에 항원-특이적 면역 반응을 조절하고 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 데 유효하다.
더욱이, 임의의 특정 이론 또는 작용 기전에 구애되지 않고, 본 실시예는 또한 TL1A 융합 단백질의 효과가, 전신적 및 점막에서 둘 다 항원-특이적인 것을 보여주는데, 이는 이 융합 단백질이 전신적 및 점막 항원-특이적 면역 반응을 조절하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 항원-특이적 반응(예를 들어, 필요로 하는 인간 환자에서)을 조절하기 위해 이 융합 단백질을 사용하는 방법이 또한 본원에 기술된다. 항원-특이적 면역 반응에 관련된 질환 또는 장애(예를 들어, 자가면역 질환 또는 장애(예를 들어, 염증성 장 질환(IBD) 및 류마티스성 관절염), 이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 염증, 천식, 알러지, 및 만성 감염)의 치료, 및/또는 이 질환 또는 장애(예를 들어, 필요로 하는 인간 환자에서)의 하나 이상의 증상의 치료 방법이 또한 기술된다. 이 융합 단백질 및 이들의 사용 방법은 아래 구체적으로 기술된다.
또한, 대상에게 (1) TNFRSF25 효능제, (본원에 개시되는 TL1A 융합 단백질 또는 효능성 항-TNFRSF25 항체 4C12), 및 (2) 낮은 용량 또는 매우 낮은 용량의 인터류킨(IL)-2를 투여하는 단계를 포함하는 조합 요법이 FoxP3+ T 조절 세포의 팽창에 대하여 놀랍고도 예상치 못한 상승 효과를 갖는다는 것이 현재 발견되었다. 이론에 구애되거나 특정 작용 기전에 제한되지 않고, Treg 세포의 팽창은 원치 않는 항원-특이적 면역 반응, 예를 들어 자가면역 질환 또는 장애(예를 들어, IBD 및 류마티스성 관절염), 이식 거부, GVHD, 염증, 천식, 알러지, 및 만성 감염과 관련된 질환 및 장애에서 유익한 작용을 갖는 것으로 생각된다. 따라서, 위에 기술된 조합 요법을 사용하여, 위의 질환 및 장애 등을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
또한, 대상에게 mTOR 저해제 라파마이신을 효능적 항-TNFRSF25 항체 4C12와 조합하여 투여하는 것이 작동체 T 세포의 특이적 감소를 야기하지만, 효능적 항-TNFRSF25 항체에 의해 유도된 Treg 세포의 팽창에는 영향이 없다는 것이 현재 발견되었다. 이전에는 라파마이신이 작동체 T 세포 및 Treg 세포 둘 다에 대하여 전반적인 저해 효과를 갖는 것으로 생각되었기 때문에, 이러한 발견은 놀라운 것이다. 적어도 부분적으로는 이러한 발견에 근거하여, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T 작동체 세포의 팽창 및 원치 않는 활성화를 저해하기 위해, 필요로 하는 대상에게 TNFRSF25 효능제를 투여하는 단계 및 mTOR 저해제의 투여를 포함하는 조합 요법이 또한 본원에 제공된다.
정의:
본원에 사용되는 "단리된(isolated)"이라는 용어는 참조 물질이 정상적으로 발견되는 환경으로부터 제거되는 것을 의미한다. 따라서, 단리된 생물학적 물질은 세포 성분, 즉 이 물질이 발견되거나 생산되는 세포의 성분이 없을 수 있다. 단리된 핵산 분자는, 이에 제한되지 않는 예를 들어 PCR 산물, 단리된 mRNA, cDNA, 또는 제한 효소에 의해 얻어진 단편을 포함한다. 단리된 핵산 분자는 또한, 예를 들어 벡터로 삽입되는 서열, 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체 등을 포함한다. 단리된 핵산 분자는 바람직하게는 그것이 발견될 수 있는 게놈으로부터 절제되고, 더욱 바람직하게는 게놈 내에서 발견될 때 핵산 분자의 상향 또는 하향 위치의 비-조절 서열, 비-코딩 서열, 또는 다른 유전자에 더이상 결합되지 않는다. 단리된 핵산은 그 천연적 환경에(즉, 세포의 핵에) 있을 때 핵산의 3' 및 5' 말단과 다른 3' 및 5' 말단을 갖는다. 단리된 단백질은 세포 내에서 연결되는 다른 단백질 또는 핵산, 또는 둘 다와 연결되거나, 또는 멤브레인-연결된 단백질인 경우 세포 멤브레인과 연결될 수 있다. 단리된 융합 단백질은 생체외에서 이 융합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 세포의 세포 성분과 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 TL1A 융합 단백질을 "코딩하는 핵산(nucleic acid encoding)" 또는 "코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide encoding)"라는 용어는 TL1A 융합 단백질에 대한 코딩 서열만을 포함하는 핵산뿐 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함한다.
"백분율(%) 서열 동일성" 등의 용어는 일반적으로 공통의 진화 기원을 공유하거나 하지 않는 다른 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질의 아미노산 서열 사이에서 동일성 또는 유사성의 정도를 말한다. 서열 동일성은 BLAST, FASTA, DNA Strider, GCG(Genetics Computer Group, GCG 패키지를 위한 프로그램 매뉴얼, Version 7, Madison, Wis.) 등과 같은 임의의 공개적으로 사용 가능한 많은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 두 아미노산 서열 또는 두 핵산 분자 사이의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열이 최적 비교 목적을 위해 배열된다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성 백분율 = 동일한 위치의 수/전체 위치의 수(예를 들어, 중첩되는 위치)x100). 일 구현예에서, 두 개의 서열은 동일한 길이이거나, 또는 거의 동일한 길이이다다. 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율은, 갭을 허용하거나 허용하지 않으면서, 아래 기술되는 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 동일성 백분율의 계산에서는, 전형적으로 정확히 똑같은 것이 계수된다. 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 두 개의 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 비-제한적 예는 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:5873-5877에서와 같이 변형된 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:2264의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본원에 개시된 서열과 상동의 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해, NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본원에 개시된 단백질 서열과 상동의 아미노산 서열을 얻기 위해, XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적의 갭트 얼라인먼트를 얻기 위해, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. 대안으로서, PSI-Blast가 분자 사이의 원연 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하기 위해 사용될 수 있다. Altschul et al. (1997) supra 참조. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다. 월드와이드웹에서 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조. 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비-제한적 예는 Myers and Miller, CABIOS1988; 4: 11-17의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 얼라인먼트 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(version 2.0)으로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위한 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 두 개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol. 1970, 48:444-453)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있는데, 이는 GCG 소프트웨어 패키지(Accelrys, Burlington, Mass.; 월드와이드웹 상의 accelrys.com에서 이용 가능함)의 GAP 프로그램으로 도입되어, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 그리고 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 2 개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 갭 중량 40, 50, 60, 70, 또는 80, 그리고 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 특히 바람직한 매개변수 세트(그리고 분자가 어떤 서열 동일성을 갖는지 결정하기 위해 어느 매개변수가 적용되어야 할지에 대하여 확실하지 않은 경우 사용될 수 있는 것은 12의 갭 개방 페널티, 4의 갭 확장 페널티, 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하는 것이다.
아미노산 서열 수준에서 "실질적으로 동일한(substantially identical)"이라는 용어는, 두 개의 아미노산 서열의 서열 동일성이 적어도 약 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는, "종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 25(TNFRSF25)에 특이적으로 결합할 수 있는" TL1A 폴리펩타이드는, 천연 리간드 TL1A에 의해 중재되는 적어도 하나의 기능이 중재되도록 TNFRSF25와 상호작용하는 것이다. 이 기능은, 예를 들어 조절 T 세포 증식의 유도 및/또는 증진일 수 있다. 더욱이, TL1A 폴리펩타이드 및 본원에 기술되는 융합 단백질은 만약 1) 이들이 결합 활성의 역치를 나타내고/내거나 2) 이들이 공지의 관련된 수용체와 유의성 있게 교차-반응하지 않는다면 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다. TNFRSF25에 대한 결합의 특이성은 도 6에 나타낸 바와 같이 카스파제-분비 분석을 사용하여 일상적으로 확인된다. 이들 연구에서의 대조군은 TNFRSF25로 형질감염되지 않은 세포를 포함하는데, 이는TL1A-Ig를 포함하는 TNFRSF25 효능제로 처리 후 사망에 대한 감수성을 나타내지 않는다. 효능제의 효력 및 EC50 역시 이 분석에서 개략적으로 계산되고, 도 6에 나타낸 바와 같이 ng-㎍ 범위에서 기계적으로 나타내어진다.
"항원-특이적 면역 반응"이라는 구절의 의미는 해당 분야에 알려져 있다. 예로서, 항원 "X"에 특이적인 면역 반응은 항원 "X"에 존재하는 하나 이상의 에피토프를 인식하는 B 및/또는 T 세포를 활성화시킬 것이다.
본원에서 사용되는 구절 "항원-특이적 면역 반응을 조절하는 것"은 항원에 대한 면역 반응이, 임의의 적절한 척도(예를 들어, 항원-특이적 항체, T 세포, B 세포, 항원-특이적 T 세포 증식 등의 빈도)에 의해 측정되어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 25%, 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 증가 또는 감소하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "TNFRSF25 효능제"는 TNFRSF25 수용체에 결합하고 세포를 천연 TNFRSF25 리간드, 예를 들어 TL1A에 노출시킴으로써 관찰될 반응과 유사하게 TNFRSF25 수용체가 발현되는 세포내의 반응을 촉발하는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는, 다른 약제(예를 들어, TNFRSF25 효능제, 예를 들어, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체, 또는 작은 분자 TNFRSF25 효능제)와의 조합 요법에서 인터류킨(예를 들어, IL-2 또는 이의 유사체)에 의해 유도되는 Treg 세포의 팽창의 맥락에서 "준최적(suboptimal)"은 동일한 인터류킨 또는 이의 유사체 단독(즉, 조합 요법에서가 아닌)의 존재 중에 유도되는 Treg 세포 팽창의 정도 또는 양과 비교하여 100% 미만을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 인간 및 인간화된 항체를 포함하는 모든 종을 포함하고, 항원 표적, 예를 들어 TNFRSF25는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 항체, 예를 들어 항-TNFRSF25는 마우스 항-인간 TNFR25, 염소 항-인간 TNFR25; 염소 항-마우스 TNFR25; 래트 항-인간 TNFR25; 마우스 항-래트 TNFR25 등일 수 있다. 다른 종 또는 어떤 경우 동일 종(예를 들어, 자가면역 또는 염증 반응에서)으로부터의 항원 표적, 예를 들어 TNFRSF25에 대하여 어떤 종에서 발생되는 항체의 조합은 무제한이고 모든 종이 본 개시에 구현된다. 항체라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 완전 조립 항체, 단클론 항체(인간, 인간화된, 또는 키메릭 항체를 포함하여), 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab', F(ab)2, Fv, 단일 사슬 항체, 다이어바디(diabodies))을 포함하며, 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 전술한 것들의 상보적으로 결정되는 영역(CDRs)을 포함한다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 인간 면역글로불린은 다른 클래스에 배정될 수 있다. 5 개의 주요 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇은 서브클래스 또는 동형(isotypes), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 분류될 수 있다. 면역글로불린의 다른 클래스와 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤로 불리운다. 면역글로불린의 다른 클래스의 서브유닛 구조 및 3-차원 구조는 잘 알려져 있다. 다른 동형은 다른 작동체 기능을 갖는데; 예를 들어 IgG1 및 IgG3 동형은 ADCC 활성을 갖는다. 본 발명은, 비록 IgG가 바람직하지만, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하여, 임의 클래스 또는 서브클래스의 항체가 제조될 수 있을 것으로 예상한다.
"면역원성 폴리펩타이드" 또는 "항원"은 대상에서 항체-중재의 면역 반응(즉, "B 세포" 반응 또는 체액성 면역), 세포-중재의 면역 반응(즉. "T 세포" 반응), 또는 이들의 조합을 이끌어내는 세포 또는 유기체로부터 유도되는 폴리펩타이드이다. 세포-중재의 반응은 동원 헬퍼 T 세포, 세포독성 T-림프구(CTLs), 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 폴리펩타이드는 항체-중재의 반응, CD4+ Th1-중재의 반응(Th1: 타입 1 헬퍼 T 세포), 및 CD8+ T 세포 반응의 하나 이상을 이끌어낸다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 아미노산의 중합체를말하고 특정 길이의 아미노산의 중합체를 말하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어 펩타이드, 올리고펩타이드, 및 단백질이라는 용어는 폴리펩타이드의 정의 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 상태, 질환, 장애 또는 병태를 "치료하는 것(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 다음을 포함한다: (1) 이 상태, 질환, 장애 또는 병태에 취약하거나 이로써 고통을 받을 수 있지만 아직 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 임상적 또는 준임상적 증상을 경험하거나 나타내지 않는 포유류에서 발생하는 상태, 질환, 장애 또는 병태의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 방지 또는 지연시키는 것; 또는 (2) 이 상태, 질환, 장애 또는 병태를 저해, 즉 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 발생, 또는 이의 재발(유지 치료의 경우) 또는 적어도 하나의 이의 임상적 또는 준-임상적 증상을 저지, 감소 또는 지연시키는 것; 또는 (3) 이 상태, 질환, 장애 또는 병태를 경감, 즉 이 상태, 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 임상적 또는 준-임상적 증상의 적어도 하나의 퇴행을 야기하는 것. 치료될 대상에서의 혜택(예를 들어, 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 경감)은 통계적으로 유의성이 있거나, 또는 환자 또는 의사에게 적어도 인식 가능하다. 경감(예를 들어, 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상의)은 전형적으로 (치료 전과 비교하여) 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 이보다 큰 것이다.
본원에서 사용되는, 대상에서 상태, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 항원-특이적 면역 반응과 관련된 상태, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 자가면역 질환 또는 장애, 이식 거부, 이식편대숙주병, 염증, 천식, 알러지, 및 만성 감염)을 "예방하는 것"은, 예를 들어 환자 또는 환자의 의사에 의해 검출 가능하거나 일어나기 전에 대상에서, 예를 들어 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생을 저지하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 이 상태, 질환, 장애 또는 병태는 전혀 발생하지 않는데, 즉 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 어떠한 증상도 검출 가능하지 않다. 그러나, 이는 또한 이 상태, 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생을 느리게 하거나 지연시키는 것을 야기할 수도 있다. 대안으로서, 또는 추가로, 하나 이상의 후속으로 발생하는 증상의 심한 정도를 감소시키는 결과를 가져올 수도 있다.
본원에서 사용되는 "조합 요법(combination therapy)"는 예를 들어, 항원-특이적 면역 반응을 조정하고/하거나 질환 또는 장애를 치료(예를 들어, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료)하기 위해, 본원에 기술된 TNFRSF25 효능제(예를 들어, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체, 작은 분자 등) 및 하나 이상의 다른 요법(예를 들어, 약물 또는 치료적 처치)에 의한 대상(예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상, 예를 들어, 인간 환자)의 치료를 의미한다. 이러한 조합 요법은, 먼저 환자가 하나의 요법으로 치료되고 다음에 다른 것으로 치료되는 등의 연속적 요법일 수 있고, 또는 모든 치료제가 동시에 투여될 수 있다. 어느 한 경우에, 이들 치료제는 "공동투여되는(coadministered)"것으로 언급된다. "공동투여되는" 것은 반드시 이 약물 및/또는 요법이 조합된 형태로 투여되는 것을 의미하는 것은 아니다(즉, 이들은 동일 또는 다른 부위에 동일 또는 다른 회수로 별개 또는 함께 투여될 수 있다).
"약제학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 화합물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는, 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같이 석유, 동물,식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수용액 식염수 및 수성의 덱스트로스 및 글리세롤 용액이, 특히 주사 가능한 용액을 위해 담체로서 바람직하게 사용된다. 적절한 약제학적 담체는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 유도체"라는 용어는, 수용자에게 투여시 본원에 개시된 화합물, 또는 이의 활성 대사물 또는 잔기를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는, 본원에 개시된 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 전구약물, 예를 들어 에스테르를 의미한다. 이러한 유도체는 부당한 실험 없이 해당 분야의 당업자에게 인식 가능하다. 그럼에도 불구하고, 이러한 유도체를 교시하는 정도까지 본원에 참조로 도입되는 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Edition, Vol 1: Principles and Practice의 교시를 참조한다. 바람직한 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 염, 용매화물, 에스테르, 카바메이트 및 포스페이트 에스테르이다. 특히 바람직한 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 염, 용매화물 및 에스테르이다. 가장 바람직한 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 염 및 에스테르이다.
"핵산 혼성화(nucleic acid hybridization)"라는 용어는 핵산의 상보적 가닥의 접합을 말한다. 접합의 기전은 수소 결합을 포함하는데, 이는 핵산 가닥의 상보적 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 염기(핵염기) 사이에서의 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌과 티민은 수소 결합의 형성을 통해 접합하는 상보적 핵염기이다. 혼성화는 다양한 환경 하에서 일어날 수 있다. 핵산 분자는 정의된 스트린전시 조건 하에서 하나의 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥이 다른 핵산 분자의 상보적 염기와 수소 결합을 형성할 수 있을 때 서로 "혼성화 가능"하다. 혼성화의 스트린전시는, 예를 들어 (i) 혼성화 및/또는 세척이 수행되는 온도, 및 (ii) 이온 강도 및 (iii) 포름아마이드와 같은 혼성화의 변성제 및 세척 용액의 농도, 그리고 다른 변수에 의하여 결정된다. 혼성화는 두 개의 가닥이 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 것을 필요로 한다. 그러나, 혼성화의 스트린전시에 따라, 어느 정도의 미스매치는 허용될 수 있다. "낮은 스트린전시" 조건 하에서는 더 큰 비율의 미스매치가 허용 가능하다(즉, 역-병렬 혼성체의 형성을 방지하지 않을 것이다). Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3rd ed., New York and London: Garland Publ., 1994, Ch. 7 참조.
전형적으로, 높은 스트린전시에서 두 가닥의 혼성화는, 서열이 그 길이의 연장된 부분에 걸쳐 높은 정도의 상보성을 나타낼 것을 요구한다. 높은 스트린전시 조건의 예로는 다음을 포함한다: 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA 중 필터-결합된 DNA에 혼성화, 다음에 68℃에서 0.1x SSC/0.1% SDS(여기에서 1x SSC는 0.15 M NaCl, 0.15 M 구연산나트륨)로 세척 또는 6xSSC/0.5% 피로인산나트륨 중 올리고뉴클레오타이드(올리고) 저해제 세척을 약 37℃에서(14 뉴클레오타이드-길이 올리고), 약 48℃에서(약 17 뉴클레오타이드-길이 올리고), 약 55℃에서(20 뉴클레오타이드-길이 올리고), 및 약 60℃에서(23 뉴클레오타이드-길이 올리고).
중급 또는 중간 정도의 스트린전시(예를 들어, 65℃에서 2xSSC의 수용액; 또는 예를 들어 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA 중 필터-결합된 DNA에 혼성화 다음에 42℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS 중 세척과 같은) 및 낮은 스트린전시(예를 들어 55℃에서 2xSSC의 수용액과 같은)의 조건은, 두 서열 사이에서 혼성화가 일어나기 위해 더 낮은 전체 상보성을 상응하여 요구한다. 임의의 주어진 스트린전시 혼성화 반응을 위한 특정 온도 및 염 조건은 표적 DNA 또는 RNA 분자의 농도 및 프로브의 길이 및 염기 조성에 의존하고, 보통 일상적인 예비 실험에서 실험적으로 결정된다(Southern, J. Mol. Biol. 1975;98:503; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 2, ch. 9.50, CSH Laboratory Press, 1989; Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3 참조). 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는, 예를 들어 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chapt 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, N.Y. ("Tijssen")에서 발견된다.
본원에서 사용되는 "표준 혼성화 조건"이라는 용어는 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 두 개의 뉴클레오타이드 분자의 혼성화를 허용하는 혼성화 조건을 말한다. 특정 구현예에 따라, 더 높은 스트린전시의 혼성화 조건은 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열들만의 혼성화를 허용하도록 사용될 수 있다.
단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드의 정의는 해당 분야에 잘 알려져 있다. 본원에서 사용되는 "단백질"이라는 용어는 "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"라는 용어와 같은 의미를 갖고, 선형으로 배열되고 인접 아미노산 잔기의 카복실 및 아미노기 사이의 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 사슬을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 폴리펩타이드라는 용어는 단백질의 전체 길이 아미노산 서열 또는 이의 단편을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 "핵산", "올리고뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 단일- 또는 이중-가닥의 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 말한다. 이 용어는 또한 합성 골격을 갖는 핵산-유사 구조를 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 DNA 골격 유사체는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카바메이트, 모르폴리노 카바메이트, 및 펩타이드 핵산(PNAs)을 포함한다; Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) 참조. PNAs는 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위와 같은 비-이온성 골격을 포함한다. 포스포로티오에이트 연결은 WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197에 기술되어 있다. 이 용어에 의해 포함되는 다른 합성 골격에는 메틸-포스포네이트 연결 또는 교차되는 메틸포스포네이트 및 포스포디에스테르 연결(Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698), 및 벤질포스포네이트 연결(Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156)이 포함된다. 핵산이라는 용어는 cDNA, cRNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 증폭 산물과 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드 서열과 "작동 가능하게 연결된"은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 하나 이상의 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터)이 숙주 세포 내에서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 발현을 허용하도록 물리적으로 연결된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 측정 방법 및 값의 종류에서 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미한다. 예를 들어, 이는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 더욱 바람직하게는 10% 이내, 그리고 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미할 수 있다. 또는, 특히 생물학적 시스템에서 "약"이라는 용어는 바람직하게는 주어진 값의 지수 2 아내에서 약 1 로그(즉, 한 자릿수) 이내를 의미한다.
TNFRSF25 효능제
본 개시는 TNFRSF25(DR3로도 알려져 있음)의 효능제를 단독 또는 조합 요범의 일부로서 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시는 본원에서 기술되는 TL1A 융합 단백질과 같은 신규의 TNFRSF25 효능제를 제공한다. 그러나, 해당 분야에 알려진 다른 TNFRSF25 효능제의 사용을 포함하는 신규의 방법도 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본원에 개시되는 조합 요법(mTOR 저해제, 예를 들어, 라파마이신 및/또는 IL-2와 TNFRSF25 효능제의 공동-투여를 포함하는)에서 사용될 수 있는 TNFRSF25 효능제의 비-제한적 예는, 예를 들어 작은 분자, 항체, 및 융합 단백질을 포함한다. 이러한 TNFRSF25 효능제의 비-제한적 예는, 예를 들어 모두 Podack et al. 에 의한 U.S. 특허허여 전 공개번호 제2011/0243951호, 제2012/0029472호, 및 제2012/0135011호에 기술된다. 항-TNFRSF25 항체의 제조 방법은 Podack et al. 에 의한 US 2012/0029472에 기술된다. 본 방법, 예를 들어 본원에 개시되는 조합 요법은 해당 분야에 알려진 임의의 적절한 TNFRSF25 효능제의 사용을 예상한다. 일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제는 Treg 세포의 팽창을 증진시키는 것이다.
일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제는 작은 분자이다. 해당 분야에서 "작은 분자"로 언급되는 화학작용제는 전형적으로 10,000 Da 미만, 바람직하게는 5,000 Da 미만, 더욱 바람직하게는 1,000 Da 미만, 그리고 가장 바람직하게는 500 Da 미만의 분자량을 갖는 유기, 비-펩타이드 분자이다. 이 계열의 조절제는 화학적으로 합성된 분자, 예를 들어 결합 화학 라이브러리로부터의 화합물을 포함한다. 합성 화합물은 해당 분야에 알려진 방법에 따라 TNFRSF25-조절 활성에 대한 화합물 라이브러리를 스크리닝함으로써 합리적으로 확인 또는 디자인될 수 있다. 이 계열의 다른 적절한 조절제는 천연 산물, 특히 식물 또는 진균과 같은 유기체로부터의 2차 대사산물로, TNFRSF25-조절 활성에 대한 화합물 라이브러리를 스크리닝함으로써 또한 확인될 수 있다. 작은 분자를 생성 및 수득하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Schreiber, Science 2000;151:1964-1969; Radmann et al., Science 2000;151:1947-1948 참조).
일부 구현예에서, 본 개시는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및 TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 TL1A 융합 단백질을 생산하는 방법이 본원에 기술된다. 이 방법은, 예를 들어 세포의 집단으로 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 예를 들어 본원에 기술된 핵산(예를 들어, 서열번호 15)을 도입하고, 여기에서 이 핵산은 이 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 폴리펩타이드를 생산하는데 유효한 조절 서열에 작동 가능하게 연결되고; 그리고 배양 배지에서 이 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 방법은 이 융합 단백질 폴리펩타이드를 세포 또는 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 핵산은 또한 이 융합 단백질에 작동 가능하게 연결된 분비 또는 신호 펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 숙주 세포로부터 융합 단백질 호모다량체(예를 들어, 3량체의 2량체)로서 분비된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 호모다량체는 배양 배지, 숙주 세포 또는 숙주 세포 주변 세포질로부터 회수된다. 또한, 이 융합 단백질 호모다량체는 제1 융합 단백질의 시스테인 잔기와 하나 이상의 추가 융합 단백질의 적어도 하나의 시스테인 잔기 사이에 하나 이상의 공유 이황화 결합을 포함할 수 있다.
TL1A는 TNF 수퍼패밀리에 속하는 타입 II 막관통 단백질이고, TNF 수퍼패밀리 멤버 15(TNFSF15)로 지칭된다. TL1A는 TNFRSF25의 천연 리간드이다.U.S. Pat. No. 6,713,061, 및 Borysenko, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar. 18; 328(3):794-9, Sheikh, et al., Curr. Cancer Drug Targets. 2004 February; 4(1):97-104, 및 U.S. 공개번호 2007/0128184 참조. 인간 TL1A 핵산 및 아미노산 ㅅ서열은 공지이고 기술되어 있다. 예를 들어, GenBank® Accession No. CCDS6809.1 (핵산 서열)(서열번호 1); 및 GenBank® Accession No. EAW87431(아미노산 서열) (서열번호 2) 참조. 인간 TL1A의 다른 핵산 및 아미노산 서열은 GenBank® Accession Nos. NM_001204344.1/ NP_001191273.1, NM_005118.3/ NP_005109.2, NM_001039664.1/ NP_001034753.1, NM_148970.1/ NP_683871.1, NM_148967.1/ NP_683868.1, NM_148966.1/ NP_683867.1, NM_148965.1/ NP_683866.1, and NM_003790.2/ NP_003781.1을 포함하여 기술되어 있지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 (참조 서열을 포함하여) 참조로 도입된다.
히말라야 원숭이(Rhesus macaque) TL1A 핵산 및 아미노산 서열은 Macaca mulatta 염색체 15, Mmul_051212, 전체 게놈 샷건 서열(GenBank® Accession No. NC_007872.1)로부터 유추할 수 있다. mRNA 서열은 GenBank® Accession No. NM_001194132.1(서열번호 3)를 갖는다. 예시적인 히말라야 원숭이 아미노산 서열은 GenBank® Accession No. NP_001181061를 갖고, 이는 (참조 서열을 포함하여) 참조로 도입된다.(서열번호 4).
TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 융합 단백질을 코딩하는 비-천연으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 포함된다. 예를 들어, (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) Ig 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 또는 단리된 핵산이 본원에 제공된다. 본원에 기술되는 융합 단백질은 또한, 예를 들어 2량체, 3량체, 3량체의 2량체 등으로의 다량체화를 촉진하는 다른 제2 폴리펩타이드에 연결된 TL1A 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 제2 폴리펩타이드는 계면활성 단백질일 수 있다.
일반적으로, 이 융합 단백질은 TNFRSF25의 효능제이다. 일부 구현예에서, 이 융합 단백질은 TL1A 폴리펩타이드를 포함한다("TL1A 융합 단백질"). 전형적으로, 본원에 포함되는 TL1A 융합 단백질은 천연 리간드 TL1A에 의해 유도되는 반응과 유사한 신호전달 반응을 유도한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 포함되는 TL1A 융합 단백질은 생체외 및/또는 생체내에서 Treg 세포의 증식을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 포함되는 TL1A 융합 단백질은 T 작동체 세포 공동자극 효과를 갖는다. 생체외 및 생체내에서 T 세포 증식을 측정하기 위한 적절한 분석은 해당 분야에 알려져 있고 실시예 1 (재료 및 방법)에 기술된다. TL1A 융합 단백질의 활성은 Khan et al. J Immunol. 2013 Feb 15;190(4):1540-50에 구체적으로 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, TL1A 융합 단백질은 다음을 포함한다: TNFRSF25에 결합할 수 있는 제1 폴리펩타이드; 및 적어도 하나의 제2 폴리펩타이드. 일부 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 TL1A의 세포외 영역(예를 들어, 인간 TL1A 세포외 영역) 또는 TNFRSF25에 결합할 수 있는 이의 단편(즉, "기능적으로 활성인 단편")으로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 폴리펩타이드는 인간 TL1A 또는 이의 기능적으로 활성인 단편의 변종 또는 오솔로그(ortholog)이다. 일부 구현예에서, 인간 TL1A 폴리펩타이드는 TL1A 세포외 영역으로부터의 아미노산 잔기 68-252로 구성되거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 Ig 분자일 수 있다. 예를 들어, 이 면역글로불린은 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM 또는 IgD)의 불변 영역일 수 있다. 이 Ig 중쇄는 다음 3 개의 기능적 영역으로 분할될 수 있다: Fd (VH 및 CH1 영역을 포함하여), 힌지, 및 Fc. Fd는 경쇄와 조합하여 항체의 "Fab" 부분을 형성한다. 이 힌지 영역은 IgG, IgA 및 IgD 클래스에서 발견되고, 탄력적 스페이서로서 작용하여, Fab 부분이 공간에서 자유롭게 움직이도록 허용한다. 힌지 영역은 구조적으로 다양하고, 면역글로불린 클래스 및 서브클래스 사이에 서열 및 길이 둘 다에서 가변적이다. 3 개의 인간 IgG 서브클래스 IgG1, IgG2, 및 IgG4는 12-15 아미노산의 힌지 영역을 갖는 한편, IgG3는 21 프롤린 잔기 및 11 시스테인 잔기를 포함하여 대략 62 아미노산을 갖는다. 힌지 영역의 구조는 Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992) 및 U.S. 특허출원공보 No. 2013/0142793에 구체적으로 기술되어 있다.
인간에 사용하도록 의도되는 면역글로불린 융합 단백질에서는, 잠재적 항-인간 면역 반응을 최소화하기 위해 불변 영역이 인간 서열 기원의 것일 수 있다. 이 불변 영역은 또한 적절한 작동체 기능을 제공하기 위해 인간 서열 기원의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 융합 단백질의 다량체화를 용이하게 할 수 있다. 항체 불변 영역을 코딩하는 서열의 조작은 Morrison 및 Oi의 PCT 공보 WO 89/007142에 기술되어 있다. 예를 들어, CH1 영역은 삭제될 수 있고 결합 영역의 카복실 말단은 힌지 영역을 통해 CH2의 아미노 말단에 연결된다.
일부 구현예에서, Ig 분자는 면역글로불린의 CH2 영역 및/또는 CH3 영역 및/또는 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 분자(예를 들어, 인간 IgG)의 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 분자이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 분자(예를 들어, 인간 IgG)의 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 분자이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 분자(예를 들어, 인간 IgG)의 힌지 영역 및 다음의 하나 이상을 포함하는 Ig 분자이다: CH2 영역 및 CH3 영역. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 IgG 분자(예를 들어, 인간 IgG)의 CH2 영역 및 다음의 적어도 하나를 포함하는 Ig 분자이다: 힌지 영역 및 CH3 영역. 일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 힌지 영역은 0, 1, 2, 3, 또는 이보다 많은 시스테인 잔기를 포함하는 IgG1 힌지 영역이다.
본원에 포함되는 융합 단백질은 또한 위에 기술된 Ig 분자 대신 또는 이에 더하여 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 TNFRSF25에 결합하는 폴리펩타이드 및 계면활성 단백질, 또는 융합 단백질의 다량체화를 용이하게 하는 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본원에서 폴리뉴클레오타이드로도 언급되는, 본원에 개시되는 핵산은 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있고, 이 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함한다. 이 DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥이면 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티-센스) 가닥일 수 있다. 센스 및 안티-센스 가닥은 서로 "상보적"이다. 본원에 개시되는 방법 및 조성물에 따라 사용하기 위한 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 다음을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다: 단지 TL1A 융합 단백질의 코딩 서열; TL1A 융합 단백질의 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열; TL1A 융합 단백질의 코딩 서열(및 선택적으로 추가의 코딩 서열) 및 비-코딩 서열, 예를 들어 인트론 또는 TL1A 융합 폴리펩타이드의 코딩 서열의 비-코딩 서열 5' 및/또는 3', 이는, 예를 들어, 조절되거나 조절 가능한 프로모터, 인핸서, 다른 전사 조절 서열, 리프레서 결합 서열, 번역 조절 서열 또는 임의의 다른 조절 핵산 서열일 수 있는 하나 이상의 조절 핵산 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 위에 정의된 바와 같이, TL1A 융합 단백질을 "코딩하는 핵산" 또는 "코딩하는 뉴클레오타이드"라는 용어는 TL1A 융합 단백질에 대한 코딩 서열만을 포함하는 핵산 뿐 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함한다.
이 융합 단백질을 코딩하는 예시적인 융합 단백질 및 핵산 분자는 아래에 기술된다. 아래 기술되는 서열은 비제한적임이 이해될 것이다. 아래에서 보다 구체적으로 논의되는 바와 같이, 다른 TL1A 융합 단백질(예를 들어, TL1A의 단편, 변이체, 및 오솔로그를 포함하는 것들)뿐 아니라 다양한 제2 폴리펩타이드 및/또는 다른 기능적 영역 또한 본 개시에 포함된다. 예를 들어, TL1A 및 계면활성 단백질을 포함하는 융합 단백질도 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 인간 TL1A 폴리펩타이드는 TL1A 세포외 영역으로부터 아미노산 잔기 68-252로 구성되거나 이를 포함한다.
비-제한적 예로서, 일부 구현예에서, 히말라야 원숭이 TL1A 융합 단백질의 TL1A 부분의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
aaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgacacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggacccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctccttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 5); 및
kgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvtqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgpmfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 6).
추가로, 일부 구현예에서, 히말라야 원숭이 Ig의 핵산 서열(IgG1 힌지-CH2-CH3 서열)은 다음과 같다:
ataaaaacatgtggtggtggcagcaaacctcccacgtgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtagacgtgagccaggaagaccccgatgtcaagttcaactggtacgtaaacggcgcggaggtgcatcatgcccagacgaagccacgggagacgcagtacaacagcacatatcgtgtggtcagcgtcctcaccgtcacgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacacgtgcaaggtctccaacaaagccctcccggtccccatccagaaaaccatctccaaagacaaag ggcagccccgagagcctcaggtgtacaccctgcccccgtcccgggaggagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgtcgtggagtgggagaacagcgggcagccggagaacacctacaagaccaccccgcccgtgctggactccgacggctcctacttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag (서열번호 7), 여기에서 잔기 1-52(굵은 글씨)는 힌지 영역, 잔기 53-382는 CH2 영역, 그리고 잔기 383-675(굵은 이탤릭체 글씨)는 CH3 영역이고; 그리고 히말라야 원숭이 Ig의 아미노산 서열(IgG1 힌지-CH2-CH3 서열)은 다음과 같다:
iktcgggskpptcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpdvkfnwyvngaevhhaqtkpretqynstyrvvsvltvthqdwlngkeytckvsnkalpvpiqktiskdk gqprepqvytlppsreeltknqvsltclvkgfypsdivvewensgqpentykttppvldsdgsyflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq (서열번호 8), 여기에서 잔기 1-17(굵은 글씨)는 힌지 영역, 잔기 18-127은 CH2 영역, 그리고 잔기 128-225(굵은 이탤릭체 글씨)는 CH3 영역이다.
일부 구현예에서, 히말라야 원숭이 TL1A-Ig 융합 단백질의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac ctcgag ataaaaacatgtggtggtggcagcaaacctcccacgtgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtagacgtgagccaggaagaccccgatgtcaagttcaactggtacgtaaacggcgcggaggtgcatcatgcccagacgaagccacgggagacgcagtacaacagcacatatcgtgtggtcagcgtcctcaccgtcacgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacacgtgcaaggtctccaacaaagccctcccggtccccatccagaaaaccatctccaaagacaaagggcagccccgagagcctcaggtgtacaccctgcccccgtcccgggaggagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgtcgtggagtgggagaacagcgggcagccggagaacacctacaagaccaccccgcccgtgctggactccgacggctcctacttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag gaattc aaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgacacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggacccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctccttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 9); 및
metdtlllwvlllwvpgstgd le iktcgggskpptcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpdvkfnwyvngaevhhaqtkpretqynstyrvvsvltvthqdwlngkeytckvsnkalpvpiqktiskdkgqprepqvytlppsreeltknqvsltclvkgfypsdivvewensgqpentykttppvldsdgsyflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq ef kgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvtqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgpmfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 10).
위의 융합 단백질 서열(DNA 및 아미노산, 서열번호 9 및 10)에서, 이탤릭체 및 밑줄친 잔기는 마우스 카파 리더 서열(서열번호 9의 잔기 1-63 및 서열번호 10의 잔기 1-21)에 상응하고; 굵은 이탤릭체 글씨는 제한 효소 클로닝 부위(서열번호 9의 잔기 64-69 및 745-750 및 서열번호 10의 잔기 22-23 및 249-250)에 상응하고; 일반 글씨는 히말라야 원숭이 IgG1 힌지-CH2-CH3 서열(서열번호 9의 잔기 70-744 및 서열번호 10의 잔기 24-248)에 상응하고; 그리고 밑줄친 글씨는 히말라야 원숭이 TL1A 세포외 영역 서열(서열번호 9의 잔기 751-1290 및 서열번호 10의 잔기 251-429)에 상응한다.
일부 구현예에서, 인간 TL1A 폴리펩타이드는 인간 TL1A의 세포외 영역으로부터의 아미노산 잔기 68-252로 구성되거나 이를 포함한다.
또한, 비-제한적 예로서 일부 구현예에서, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질의 TL1A 부분의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
cgggcccagggagaggcctgtgtgcagttccaggctctaaaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgagacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggagccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctctttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 11)(인간 TL1A의 세포외 영역을 코딩); 그리고
raqgeacvqfqalkgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvrqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgamfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 12)(인간 TL1A의 세포외 영역).
일부 구현예에서, 인간 Ig 분자의 핵산 및 아미노산 서열(IgG1 힌지-CH2-CH3 서열)은 다음과 같다:
tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (서열번호 13); 그리고
cdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (서열번호 14)(인간 IgG의 힌지, CH2 및 CH3 영역).
일부 구현예에서, 인간 TL1A 융합 단백질의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa gaattc cgggcccagggagaggcctgtgtgcagttccaggctctaaaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgagacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggagccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctctttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 15); 그리고
cdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk ef raqgeacvqfqalkgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvrqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgamfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 16).
위의 예시적 융합 단백질 서열(인간 핵산 및 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 15 및 16)에서, 굵고 이탤릭체로 나타낸 잔기는 제한 효소 클로닝 부위(서열번호 15의 잔기 685-690 및 서열번호 16의 잔기 229-230)에 상응하고, 제한 효소 클로닝 부위 앞에 나타나는 잔기(일반 글씨)는 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 서열(서열번호 15의 잔기 1-684 및 서열번호 16의 잔기 1-228)에 상응하고, 그리고 제한 효소 클로닝 부위 다음의 잔기(밑줄친 글씨)는 인간 TL1A 세포외 영역 서열(서열번호 15의 잔기 691-1269 및 서열번호 16의 잔기 231-422)에 상응한다.
뮤린 TL1A 융합 단백질 또한 구축되었고 본원에 포함된다. 예시적인 뮤린 융합 단백질의 구축 방법, 그리고 기능적 특성화는 Khan, S.Q., et al. (2013) "Cloning, expression, and functional characterization of TL1A-Ig." J Immunol 190:1540-1550에 구체적으로 기술되어 있다.
위에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열에 더하여, 위에 언급된 임의의 서열과 일정 백분율의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또한 포함된다. 예를 들어, 본원에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 위에 언급된 임의의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 인간 또는 히말라야 원숭이 TL1A를 코딩하는, 그리고/또는 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드)와, 예를 들어, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 변종 및 오솔로지 종을 포함할 수 있고, 바람직하게는 위에 기술된 바와 같이 중간 또는 높은 스트린전시의 조건 하에서 혼성화된다. 예를 들어, TL1A 폴리뉴클레오타이드의 변종은 변경되거나 변화된 유전자 또는 DNA 서열, 예를 들어 돌연변이체이다. "돌연변이체" 및 "돌연변이"는 유전 물질(예를 들어, DNA)에서 임의의 검출 가능한 변화 또는 이러한 변화의 임의 과정, 기전 또는 결과를 말한다. 이는 유전자의 구조(예를 들어, DNA 서열)가 변화되는 유전자 돌연변이, 임의의 돌연변이 과정으로부터 일어나는 임의의 유전자 또는 DNA, 그리고 변경된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현되는 임의의 발현 산물(예를 들어, 단백질, 예를 들어 TL1A)를 포함한다.
폴리펩타이드의 변경은 해당 분야의 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 융합 단백질을 코딩하는 DNA의 변경 및 변경된 DNA의 발현에 의존할 수 있다. 위에 논의된 TL1A 융합 단백질의 하나를 코딩하는 DNA는 아래 기술되는 것을 포함하는 표준 방법론을 사용하여 돌연변이화될 수 있다. 예를 들어, 다르게는 다량체 형성을 용이하게 하거나 특정 분자 구조를 촉진할 수 있어, 집합체 형성의 원인이 되는 시스테인 잔기가, 예를 들어 폴리펩타이드로부터 삭제되거나 교체될 수 있다. 역으로, 예를 들어 2량체 또는 3량체 및/또는 3량체의 2량체를 생산하기 위해 집합이 요망되면, 추가의 시스테인 잔기가, 예를 들어 Ig 분자의 힌지 영역으로 도입될 수 있다. 필요하다면, 집합체 형성에 기여하는 시스테인 잔기의 확인은, 시스테인 잔기를 삭제 및/또는 교체하고 생성된 단백질이 생리적으로 허용 가능한 완충액 및 염을 포함하는 용액에서 집합하는지 여부를 확인함으로써 실험적으로 결정될 수 있다. 더욱이, 아미노산의 보존적 치환은 잘 알려져 있고, 일반적으로 생성된 TL1A 융합 단백질 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 않고 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 치환은 일반적으로 극성 잔기, 하전된 잔기, 소수성 잔기, 작은 잔기 등의 군 내에서 상호교환에 의해 일어난다. 필요하다면, 이러한 치환은 단지 생성된 변경 단백질에서 적절한 세포 표면 수용체(예를 들어, TNFRSF25)에 결합하고/하거나 원하는 효과(예를 들어, Treg 세포 증식)를 촉발하는 능력을 생체외 생물학적 분석으로 시험함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
오솔로그(orthologs)는 종 분화에 의해 공통 조상의 유전자로부터 일견 진화된 다른 종의 유전자이다. 정상적으로, 오솔로그는 진화의 과정을 통해 동일한 기능을 유지한다. 오솔로그의 확인은 새로 서열이 밝혀지는 게놈에서 유전자 기능의 신뢰성 있는 예측을 제공할 수 있다. 오솔로그를 확인하기 위해 사용될 수 있는 서열 비교 알고리즘으로는 BLAST, FASTA, DNA Strider, 및 GCG 파일업 프로그램이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 오솔로그는 종종 높은 서열 유사성을 갖는다. TNFRSF25, 바람직하게는 인간 TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 TL1A의 모든 오솔로그가 본원에 사용되도록 고려된다.
일부 구현예에서, TL1A 융합 단백질에 사용하기 위한, TL1A 폴리펩타이드의 절단된 성분(즉, 단편), 힌지 영역 폴리펩타이드, 링커 등이 제공된다. 또한, 이러한 절단된 성분을 갖는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다. 절단된 분자는 이 분자의 전체 길이 형태 보다 덜 포함하는 임의의 분자일 수 있다. 본 개시에서 제공되는 절단된 분자는 절단된 생물학적 고분자를 포함할 수 있고, 본 개시의 일부 구현예에서 이러한 절단된 분자는 절단된 핵산 분자 또는 절단된 폴리펩타이드일 수 있다. 절단된 핵산 분자는 공지이거나 기술된 핵산 분자의 전체 길이 뉴클레오타이드 서열 보다 덜 포함하는데, 여기에서 이러한 공지이거나 기술된 핵산 분자는 천연적으로 존재하는, 합성 또는 재조합 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 예를 들어 유전자 서열에 상응하는 절단된 핵산 분자는 전체 길이 유전자 보다 덜 포함하는데, 유전자는 코딩 및 비-코딩 서열, 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 서열, 측면 서열(flanking sequence) 등, 그리고 이 유전자의 일부로서 인식되는 다른 기능적 및 비-기능적 서열을 포함한다. 다른 예에서, mRNA 서열에 상응하는 절단된 핵산 분자는, 다양한 번역 및 비-번역 부위뿐 아니라 다른 기능적 및 비-기능적 서열을 포함할 수 있는 전체 길이 mRNA 사본 보다 덜 포함한다.
절단된 분자는 특정 단백질 또는 폴리펩타이드 성분의 전체 길이 아미노산 서열 보다 덜 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에서 사용되는 "삭제(deletion)"는 해당 분야의 당업자에 의해 이해되는 공통의 의미를 갖고, 예를 들어 본원에 제공되는 절단된 분자의 경우와 같이, 상응하는 전체 길이 분자와 비교하여 말단 또는 비-말단 부위로부터 서열의 하나 이상의 부분이 결핍된 분자를 말할 수 있다. 핵산 분자 또는 폴리펩타이드와 같은 선형의 생물학적 고분자인 절단된 분자는 분자의 말단으로부터의 삭제 또는 분자의 비-말단 부위로부터의 삭제 중 하나 이상을 가질 수 있는데, 여기에서 이러한 삭제는 1-550, 1-500, 1-450, 1-400, 1-350, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-25, 1-20, 15, 1-10, 또는 1-5 인접 뉴클레오타이드 잔기의 삭제일 수 있다. 절단된 폴리펩타이드 분자는 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 또는 1-5 연속 아미노산 잔기의 삭제를 가질 수 있다. 절단 분자(즉,단편)는, 예를 들어 TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 TL1A의 세포외 영역의 일부를 포함할 수 있다.
본원에 개시되는 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 예시적인 절단된 TL1A 폴리펩타이드는, 예를 들어 서열번호 16의 예를 들어 421 또는 이보다 적은 연속 아미노산, 서열번호 16의 예를 들어 400-420, 350-400, 300-350, 250-300, 200-250, 150-200, 100-150, 50-100, 25-75, 50-75, 25-75, 15- 25, 또는 10-20 연속 아미노산을 포함하는 단편을 포함한다. TL1A 폴리펩타이드(또는 핵산)의 임의의 단편은, 이 단편이 기능적으로 활성, 즉 TNFRSF25에 특이적으로 결합하는(또는, 핵산 단편에서는 기능적으로 활성인 폴리펩타이드를 코딩하는) 능력을 유지한다면, 본원에 기술되는 바와 같이 사용하도록 고려된다.
본 개시는 추가로, TL1A 융합 단백질의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 코딩하는, 본원에 언급되는 핵산의 변종과 관련된다. TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 변종은 이 핵산의 천연적으로 존재하는 대립형질 변종 또는 비-천연적으로 존재하는 변종일 수 있다. 해당 분야에 알려진 바와 같이, 대립형질 변종은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삭제 또는 부가의 적어도 하나를 가질 수 있는 핵산 서열의 대체 형태로, 이중 어느 것도 코딩된 TL1A 융합 단백질의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는다.
TL1A 융합 단백질의 유도체 및 변종은 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다. 천연 아미노산 서열의 변화는 임의의 다양한 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이는 천연 서열의 단편에 연결 가능한 제한 부위가 측면에 있는 돌연변이체 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 특정 장소에 도입될 수 있다. 연결 후, 생성된 재구축 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환 또는 삭제를 갖는 유사체를 코딩한다.
또는, 예정된 코돈이 치환, 삭제 또는 삽입에 의해 변경될 수 있는 변경된 유전자를 제공하기 위해 올리고뉴클레오타이드-유도된 부위-특이적 돌연변이 생성 과정이 이용될 수 있다. 이러한 변경을 만드는 예시적 방법은 Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); 및 U.S. Pat. Nos. 4,518,584 및 4,737,462에 의해 개시되어 있다.
하나의 예로서, DNA의 변경은 중첩 연장에 의한 PCR 접합(SOE)과 같이 DNA에서 변경을 도입하고 증폭시키기 위한 프라이머를 사용하는 DNA 증폭 방법의 사용과 조합하여 단백질을 코딩하는 DNA의 부위-유도된 돌연변이 생성에 의해 수행될 수 있다. 부위-유도된 돌연변이 생성은 전형적으로, 잘 알려져 있고 상업적으로 입수 가능한 M13 파아지 벡터와 같이 단일- 및 이중-가닥 형태를 갖는 파아지 벡터를 사용하여 이루어진다. 단일-가닥의 파아지 복제의 기점을 포함하는 다른 적절한 벡터가 사용될 수 있다(예를 들어, Veira et al., Meth. Enzymol. 15:3, 1987 참조). 일반적으로, 부위-유도된 돌연변이 생성은 흥미 있는 단백질(예를 들어, 주어진 TL1A 융합 단백질의 전체 또는 한 성분 부위)을 코딩하는 단일-가닥의 벡터를 준비함으로써 수행된다. 단일-가닥의 벡터에서 DNA와 상동 부위 이내에 원하는 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 벡터에 어닐링하고, E. coli DNA 폴리머라제 I(Klenow fragment)과 같은 DNA 폴리머라제의 부가가 속행되는데, 이는 프라이머로서 이중 가닥 부위를 사용하여 하나의 가닥이 변경된 서열을 코딩하고 다른 하나는 원래의 서열을 코딩하는 이형이중가닥(heteroduplex)를 생산한다. 이 이형이중가닥은 적절한 박테리아 세포로 도입되고 원하는 돌연변이를 포함하는 클론이 선택된다. 생성된 변형 DNA 분자는 적절한 숙주 세포에서 재조합으로 발현되어 변형된 단백질을 생산할 수 있다.
아미노산 잔기 또는 서열의 다양한 부가 또는 치환, 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 삭제를 코딩하는 균등의 DNA 구조가 또한 본원에 포함된다. 예를 들어, 그리고 위에 논의된 바와 같이, 원치 않거나 생물학적 활성에 필수적이 아닌 Cys 잔기를 코딩하는 서열은 이 Cys 잔기가 삭제되거나 다른 아미노산으로 교체되도록 변경될 수 있어, 복원시 부정확한 분자내 이황화 결합의 형성을 방지한다. 또는, 다량체화를 용이하게 하도록 추가의 Cys 잔기가 도입될 수 있다.
TL1A에 대한 결합 영역 및 TL1A와 그 수용체 TNFRSF25와의 결합 상호작용은 해당 분야의 당업자가 즉각적인 발현 구조체의 코딩 산물에서 삽입을 위한 적절한 폴리펩타이드 영역을 용이하게 선택할 수 있고, 어느 핵산 및/또는 아미노산 잔기가 변경(예를 들어, 치환, 삭제, 부가 등)에 용이한지 이해하도록 특성화된다. 예를 들어, Zhan et al. Biochemistry. 2009 Aug 18;48(32):7636-45 참조. 또한, 위에 기술된 임의의 폴리펩타이드가 특이적으로 TNFRSF25에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 분석은 해당 분야에 알려져 있고, 위에 논의된 바와 같이 실시예 1에 기술된다.
본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 핵산 및 올리고뉴클레오타이드는 해당 분야의 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다(예를 들어, WO 93/01286, U.S. 출원번호 07/723,454; U.S. Pat. No. 5,218,088; U.S. Pat. No. 5,175,269; U.S. Pat. No. 5,109,124 참조). 본 개시에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열의 확인은 해당 분야에 잘 알려진 방법을 포함한다. 예를 들어, 유용한 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 특성, 길이 및 다른 특징은 잘 알려져 있다. 어떤 구현예에서, 합성 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 설폰, 설페이트, 케틸, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트, 포스페이트 에스테르와 같은 연결, 그리고 안티센스 적용에 유용한 것으로 입증된 다른 연결을 포함하는 것에 의해 내인성 숙주 세포 핵산 분해 효소에 의한 변성에 저항하도록 디자인될 수 있다(예를 들어, Agrawal and Goodchild; Tetrehedron Lett. 28:3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrehedron Lett. 26:2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12:4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14:97-100 (1989); Stein In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989); Jager et al., Biochemistry 27:7237-7246 (1988) 참조).
숙주 유기체는, 생체외 및 생체내 발현을 포함하여, 본 개시의 재조합 구조체에 의해 코딩되는 TL1A 융합 단백질의 재조합 생산이 일어날 수 있는, 박테리아(예를 들어, E. coli), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포 및 포유류와 같은 유기체를 포함한다. 따라서, 숙주 유기체는 본원에 제공되는 조성물의 생산에서 구축, 증식, 발현 또는 다른 단계를 위한 유기체를 포함할 수 있고; 숙주는 또한 위에 기술된 바와 같이 면역 반응이 일어나는 대상을 포함한다. 현재 바람직한 숙주 유기체는 E. coli 박테리아 종, 근친교배한 뮤린 종 및 뮤린 세포주, 비-인간 영장류 대상 및 세포주, 그리고 인간 세포, 대상 및 세포주이다.
원하는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구조체는 적절한 숙주에서 발현을 위한 플라스미드로 도입된다. 숙주는 박테리아 숙주일 수 있다. 리간드 또는 핵산 결합 영역을 코딩하는 서열은 바람직하게는 특정 숙주에서 발현을 위해 코돈-최적화된다. 따라서, 예를 들어, 인간 TL1A 융합 단백질이 박테리아에서 발현될 경우, 코돈은 박테리아 사용에 최적화될 것이다. 작은 코딩 부위를 위해, 유전자는 단일 올리고뉴클레오타이드로서 합성될 수 있다. 더 큰 단백질을 위해서는, 복합 올리고뉴클레오타이드의 접합, 돌연변이화, 또는 해당 분야의 당업자에게 알려진 다른 기술이 사용될 수 있다. 프로모터 및 작동유전자와 같은 조절 부위인 플라스미드에서의 뉴클레오타이드의 서열은 전사를 위해 상호 작동적으로 연결된다. TL1A 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드의 서열은 또한 분비 신호를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있고, 이에 의해 생성된 펩타이드가 전구체 단백질이다. 생성되어 처리된 단백질은 주변세포질 공간 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
DNA 플라스미드는 또한 전자 종결부위 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "전사 종결 부위"는 전사 종결 신호를 보내는 서열이다. 전체 전사 종결부위는 단백질-코딩 유전자로부터 얻을 수 있는데, 이는 삽입된 TL1A 융합 단백질 코딩 유전자 또는 프로모터의 원천과 같거나 다를 수 있다. 전사 종결부위는 본원에서 발현 시스템의 선택적 성분이다.
본원에 사용되는 플라스미드는 흥미 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA와 작동성 연결된 플라스미드를 포함하고, 원하는 플라스미드의 용도에 따라(예를 들어, TL1A 융합 단백질 코딩 서열을 포함하는 백신의 투여) 위에 기술된 적절한 숙주(예를 들어, 박테리아, 뮤린 또는 인간)에서 단백질의 발현을 위해 디자인된다. 본원에서 단백질 및 폴리펩타이드의 발현을 위해 적절한 프로모터는 광범위하게 이용 가능하고 해당 분야에 잘 알려져 있다. 조절 부위에 연결되는 유도 가능한 프로모터 또는 구조 프로모터가 바람직하다. 이러한 프로모터에는, E. coli로부터의 T7 파아지 프로모터 및 다른 T7-유사 파아지 프로모터, 예를 들어 T3, T5 및 SP6 프로모터, trp, 1 pp, 및 lac 프로모터, 예를 들어 lacUV5; 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템의 P10 또는 폴리헤드린 유전자 프로모터(예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051, 및 5,169,784 참조) 및 다른 진핵세포 발현 시스템으로부터의 유도 가능한 프로모터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이는 또한 인간 페리틴 프로모터를 포함할 수 있다. 이 단백질의 발현을 위해 이러한 프로모터는 lac 오페론과 같은 제어 부위에 작동서 ddusruf로 플라스미드에 삽입된다.
바람직한 프로모터 부위는 E. coli에서 유도 가능하고 기능성인 것들이다. 적절한 유도 가능한 프로모터 및 프로모터 부위의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG; Nakamura et al., Cell 18:1109-1117, 1979 참조)에 반응성인 E. coli lac 작동유전자; 중-금속(예를 들어, 아연) 유도에 반응성인 메탈로티오네인 프로모터 메탈-조절-엘리먼트(예를 들어, Evans et al.의 U.S. Pat. No. 4,870,009 참조); IPTG에 반응성인 파아지 T7lac 프로모터(예를 들어, U.S. Pat. No. 4,952,496; 및 Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990 참조) 및 TAC 프로모터.
플라스미드는 숙주에서 기능성인 선택 가능한 마커 유전자 또는 유전자들을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자에는 형질전환된 박테리아 세포가 대다수의 비형질전환된 세포로부터 확인되고 선택적으로 성장하도록 허용하는 표현형을 박테리아에 부여하는 임의의 유전자가 포함된다. 박테리아 숙주에서 적절한 선택 가능한 마커 유전자는, 예를 들어 암피실린 저항 유전자(Ampr), 테트라사이클린 저항 유전자(Tcr) 및 카나마이신 저항 유전자(Kanr)를 포함한다.
플라스미드는 또한 작동 가능하게 연결된 단백질의 분비를 위한 신호를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 사용하기 적절한 분비 신호는 광범위하게 이용 가능하고 해당 분야에 잘 알려져 있다. E. coli에서 기능성인 원핵세포 및 진핵세포 분비 신호가 이용될 수 있다. 현재 바람직한 분비 신호는 다음 E. coli 유전자: ompA, ompT, ompF, ompC, 베타-락타마제, 및 알칼리 포스파타제 등에 의해 코딩되는 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985). 또한, 박테리아 pelB 유전자 분비신호(Lei et al., J. Bacteriol. 169:4379, 1987), phoA 분비 신호, 및 곤충 세포에서 기능성인 cek2가 이용될 수 있다. 해당 분야의 당업자에게 알려진 다른 원핵세포 및 진핵세포 분비 신호도 이용될 수 있다(예를 들어, von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985 참조). 본원에 기술된 방법을 사용하여, 해당 분야의 당업자는 효모, 곤충 또는 포유류 세포에서 기능성인 분비 신호를 이들 세포로부터 단백질을 분비하도록 대체할 수 있다.
일부 구현예에서, E. coli 세포의 형질전환을 위해 바람직한 플라스미드는 pET 발현 벡터(예를 들어, pET-11a, pET-12a-c, pET-15b; U.S. Pat. No. 4,952,496 참조; Novagen, Madison, Wis.로부터 이용 가능)를 포함한다. 다른 바람직한 플라스미드는 pKK 플라스미드, 특히 pKK 223-3를 포함하는데, 이는 tac 프로모터 포함한다(Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6929, 1984; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; U.S. Pat. Nos. 5,122,463, 5,173,403, 5,187,153, 5,204,254, 5,212,058, 5,212,286, 5,215,907, 5,220,013, 5,223,483, 및 5,229,279). 플라스미드 pKK는 암피실린 저항 유전자를 카나마이신 저항 유전자로 대체함으로써 변형되었다(Pharmacia로부터 이용 가능함; pUC4K로부터 수득, 예를 들어, Vieira et al. (Gene 19:259-268, 1982; 및 U.S. Pat. No. 4,719,179 참조). 바큘로바이러스 벡터, 예를 들어 pBlueBac(또한 pJVETL 및 이의 유도체로도 호칭됨), 특히 pBlueBac III(예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,278,050, 5,244,805, 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051, 및 5,169,784 참조; Invitrogen, San Diego로부터 이용 가능)도 곤충 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 다른 플라스미드에는 pIN-IIIompA 플라스미드(U.S. Pat. No. 4,575,013 참조; 또한 Duffaud et al., Meth. Enz. 153:492-507, 1987 참조), 예를 들어 pIN-IIIompA2가 포함된다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 박테리아 세포, 바람직하게는 E. coli에서 복제된다. 바람직한 DNA 분자는 또한 박테리아에서 대대로 DNA 분자의 유지를 확보하도록 박테리아 복제의 기점을 포함한다. 이 방식에서, 다량의 DNA 분자가 박테리아에서 복제에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 박테리아 복제의 기점은 fl-ori 및 col E1 복제의 기점을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 숙주는 lacUV 프로모터와 같은 유도 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 DNA의 염색체 복사를 포함한다(U.S. Pat. No. 4,952,496 참조). 이러한 숙주는 리소겐 E. coli 균주 HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) 및 BL21(DE3)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 균주 BL21(DE3)가 바람직하다. pLys 균주는 T7 RNA 폴리머라제의 천연적 저해제인 T7 리소자임을 저농도로 제공한다.
제공된 DNA 분자는 또한 억제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 억제 단백질은 억제 단백질이 결합한 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 프로모터의 전사를 억제할 수 있다. 프로모터는 세포의 생리적 조건을 변경시킴으로써 탈-억제될 수 있다. 예를 들어, 이 변경은 성장 배지에 작동 유전자 또는 조절 단백질 또는 다른 DNA의 부위와 상호작용하는 능력을 저해하는 분자를 첨가하거나 성장 배지의 온도를 변화시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 억제 단백질은 IPTG 유도에 반응성인 E. coli lacI 억제제, 온도 감응성 λcI857 억제제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 재조합 구조체는 또한 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함할 것이다. 특히, 이러한 요소는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 구조체가 숙주 세포 또는 유기체에서 발현하도록 의도될 때 바람직하다. 본 개시의 어떤 구현예에서, 세포 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 유형에 바람직하거나 세포 유형에 특이적인 발현은 유전자를 프로모터의 조절 하에 놓음으로써 달성될 수 있다. 프로모터의 선택은 형질전환될 세포 유형 및 원하는 제어의 종류 또는 정도에 의존할 것이다. 프로모터는 구성되거나 활성화될 수 있고, 또한 세포 유형 특이적, 조직 특이적, 개별 세포 특이적, 사건 특이적, 시간 특이적 또는 유도 가능할 수 있다. 세포-유형 특이적 프로모터 및 사건 유형 특이적 프로모터가 바람직하다. 구조적 또는 비특이적 프로모터의 예에는 SV40 초기 프로모터(U.S. Pat. No. 5,118,627), SV40 말기 프로모터(U.S. Pat. No. 5,118,627), CMV 초기 유전자 프로모터(U.S. Pat. No. 5,168,062), 및 아데노바이러스 프로모터가 포함된다. 바이러스 프로모터에 추가하여, 세포 프로모터도 사용될 수 있다. 특히, 소위 하우스키핑 유전자를 위한 세포 프로모터가 유용하다. 바이러스 프로모터가 바람직한데, 일반적으로 이들이 세포 프로모터보다 더 강한 프로모터이기 때문이다. 프로모터 부위는, 특정 숙주에서 사용하기 위해 적절한 프로모터가 해당 분야의 당업자에게 용이하게 선택될 수 있도록, 고등 진핵세포를 포함하는 많은 진핵세포의 유전자에서 확인되어 있다.
유도 가능한 프로모터 역시 사용될 수 있다. 이들 프로모터는 덱사메타손에 의해 유도 가능한 MMTV LTR(PCT WO 91/13160); 중금속에 의해 유도 가능한 메탈로티오네인 프로모터; 및 cAMP에 의해 유도 가능한, cAMP 반응 요소를 갖는 프로모터를 포함한다. 유도 가능한 프로모터를 사용함으로써, TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 발현 구조체에 의해 세포로 전달될 수 있고 유도체의 첨가시까지 휴지 상태로 유지될 것이다. 이는 유전자 산물의 생산 시기에 추가적 제어를 허용한다.
사건-유형 특이적 프로모터는 종양 형성 또는 바이러스 감염과 같은 사건의 발생시에만 활성 또는 상향-조절된다. HIV LTR은 사건-특이적 프로모터의 잘 알려진 예이다. 이 프로모터는 바이러스 감염시 발생하는 tat 유전자 산물이 존재하지 않는 한 비활성이다. 일부 사건-유형 프로모터는 또한 조직-특이적이다.
추가적으로, 특정 세포 유전자와 대등하게 조절되는 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 대등하게 발현되는 유전자의 프로모터는 특정 TL1A 융합 단백질-코딩 유전자의 발현이 하나 이상의 추가적 내인성 또는 외인성으로 도입된 유전자의 발현과 협력하여 원할 때 사용될 수 있다. 이 유형의 프로모터는 면역 시스템의 특정 조직에서 면역 반응의 유도와 관련된 유전자 발현의 패턴을 알고 있을 때 특히 유용한데, 이에 따라 이 조직 내에서 특정 면역성 세포가 면역 반응에 참여하도록 활성화되거나 모집될 수 있다.
프로모터에 추가하여, 억제 서열, 음성 조절자, 또는 조직-특이적 사일런서는, 예를 들어 치료 전략의 일부로서 일시적으로 면역약화된 숙주와 같은 어떤 상황에서 TL1A 융합 단백질 코딩 유전자를 감소시키도록 삽입될 수 있다. 다중 억제 요소는 프로모터 부위로 삽입될 수 있다. 전사의 억제는 프로모터로부터의 거리 또는 억제 요소의 배향에 의존한다. 억제 서열의 한 유형은 절연 서열(insulator sequence)이다. 이러한 서열은 전사를 저해하고(Dunaway et al., Mol Cell Biol 17: 182-9, 1997; Gdula et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:9378-83, 1996, Chan et al., J Virol 70: 5312-28, 1996; Scott and Geyer, EMBO J. 14:6258-67, 1995; Kalos and Fournier, Mol Cell Biol 15:198-207, 1995; Chung et al., Cell 74: 505-14, 1993) 배경 전사를 침묵시킬 것이다.
억제 요소는 또한 타입 II(연골) 콜라겐, 콜린 아세틸트랜스퍼라제, 알부민 (Hu et al., J. Cell Growth Differ. 3(9):577-588, 1992), 포스포글리세레이트 키나제(PGK-2)(Misuno et al., Gene 119(2):293-297, 1992) 유전자의 프로모터 부위에서, 그리고 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토스-2,6-비스포스파타제 유전자 (Lemaigre et al., Mol. Cell. Biol. 11(2):1099-1106.)에서 확인되어 있다. 또한, 음성 조절 요소 Tse-1은 많은 간 특이적 유전자에서 확인되어 있고, 간세포에서 cAMP 반응 요소--(CRE) 중재의 유전자 활성화의 유도를 차단하는 것을 보여주었다 (Boshart et al., Cell 61(5):905-916, 1990).
일부 구현예에서는, 원하는 산물의 발현을 증가시키는 요소가 구조체로 도입된다. 이러한 요소는 내부 리보솜 결합 부위(IRES; Wang and Siddiqui, Curr. Top. Microhiol. Immunol 203:99, 1995; Ehrenfeld and Semler, Curr. Top. Microhiol. Immunol. 203:65, 1995; Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996; Sugimoto et al., Biotechnology 12:694, 1994)를 포함한다. IRES는 번역 효율을 증가시킨다. 다른 서열 또한 발현을 증진시킬 수 있으며, 예를 들어 일부 유전자에서는, 특히 5' 말단에서 전사 및/또는 번역을 저해한다. 이들 서열은 보통 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 회문(palindromes)이다. 전달되는 핵산에서 이러한 임의의 서열은 일반적으로 삭제된다. 전사 또는 번역된 산물의 발현 수준은 어떤 서열이 발현을 유발하는지 확인 또는 알아내기 위해 분석된다. 전사 수준은 노던 블롯 혼성화, RNase 프로브 보호 등을 포함하는 임의의 공지 방법으로 분석될 수 있다. 단백질 수준은 ELISA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학 또는 다른 잘 알려진 기술을 포함하는 임의의 공지 방법에 의해 분석될 수 있다.
다른 요소들이 본 개시의 TL1A 융합 단백질 코딩 구조체로 도입될 수 있다. 예를 들어, 이 구조체는 폴리아데닐화 서열, 접합 공여 및 수용 부위, 및 인핸서를 포함하는 전자 종결 서열을 포함할 수 있다. 포유류 세포 또는 다른 진핵세포에서 구조체의 유지 및 발현에 유용한 다른 요소들도 도입될 수 있다(예를 들어, 복제의 기점). 구조체는 박테리아 세포에서 편리하게 생산될 수 있기 때문에, 박테리아에서 증식을 증진시키거나 필요한 요소가 도입될 수 있다. 이러한 요소는 복제의 기점, 선택 가능한 마커 등을 포함한다.
본원에 제공되는 바와 같이, 본원에 개시된 구조체를 사용하여 세포로 전달되는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 발현의 추가적 수준의 제어가 둘 이상의 다르게 조절되는 핵산 구조체의 동시 전달에 의해 제공될 수 있다. 이러한 다중 핵산 구조체 접근의 사용은, 예를 들어 다른 발현된 코딩 성분의 존재 및/또는 세포 유형에 의존하는 시공간적 조정과 같은, 면역 반응의 조직화된 조절을 허용할 수 있다. 해당 분야의 당업자는 프로모터, 인핸서 및 다른 잘 알려진 유전자 조절 요소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 적절한 조절 서열의 선택에 의해 다중 수준의 조절된 유전자 발현이 유사한 방식으로 달성될 수 있음을 인정할 것이다.
본 개시는 또한 벡터, 및 본 개시의 핵산을 포함하는 공지의 벡터로부터 제조된 구조체, 그리고 특히 TL1A 융합 단백질 및 위에 제공되는 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산을 포함하는 "재조합 발현 구조체"; 벡터 및/또는 구조체로 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의해 본원에 개시되는 이러한 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 단편, 오솔로그 또는 변이체를 포함하는 발현 구조체를 투여하는 방법에 관련된다. TL1A 융합 단백질은, 구조체의 성질(예를 들어, 위에 기술된 프로모터의 유형), 및 원하는 숙주 세포의 성질(예를 들어, 유사분열후 말단에서 분화되거나 활동적으로 분할하는지 여부; 예를 들어, 발현 구조체가 에피솜으로서 숙주 세포에 존재하거나 숙주 세포 게놈으로 통합되는지 여부)에 따라, 적절한 프로모터의 제어 하에 사실상 임의의 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 원핵세포 및 진핵세포 숙주에서의 사용을 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)에 의해 기술되고; 위에 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서는, 재조합 발현이 본원에 기술된 재조합 발현 구조체로 형질감염 또는 형질전환된 포유류 세포에서 수행된다.
전형적으로, 이 구조체는 플라스미드 벡터로부터 유래된다. 바람직한 구조체는 변경된 pNASS 벡터(Clontech, Palo Alto, Calif.)로, 이는 암피실린 저항 유전자, 폴리아데닐화 신호 및 T7 프로모터 부위를 코딩하는 핵산 서열을 갖는다. 다른 적절한 포유류 발현 벡터는 잘 알려져 있다(예를 들어, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., supra; see also, e.g., catalogues from Invitrogen, San Diego, Calif.; Novagen, Madison, Wis.; Pharmacia, Piscataway, N.J.; 등 참조). 현재 바람직한 구조체는 TL1A 융합 단백질의 증진된 생산 수준을 촉진하기 위해, 적절한 조절 제어 하에 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 코딩 서열을 포함하여 제조될 수 있으며, 이 수준은 유전자 증폭에 이어지는 적절한 선택 약제(예를 들어, 메토트렉세이트)의 도입으로부터 야기된다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 위에 기술한 바와 같이, 복제의 기점 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선택 가능한 마커, 및 고-발현된 유전자로부터 유래되는 프로모터를 포함하여, 하향 구조적 서열의 전사를 지시할 것이다. 이종의 구조적 서열은 적절한 시기에 번역 개시 및 종결 서열과 조립된다. 따라서, 예를 들어 본원에 제공되는 TL1A 융합 단백질 코딩 핵산은 숙주 세포에서 TL1A 융합 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 구조체로서 다양한 발현 벡터 구조체의 임의의 하나로 포함될 수 있다. 어떤 바람직한 구현예에서, 이 구조체는 생체내 투여되는 제형에 포함될 수 있다. 이러한 벡터 및 구조체는 아래 기술되는 바와 같이, 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드; 파아지 DNA; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파아지 DNA, 바이러스 DNA, 예를 들어 백시니아, 아데노바이러스, 가금 폭스 바이러스(fowl pox virus), 및 가성광견병, 또는 복제 결핍 레트로바이러스의 조합으로부터 유래되는 벡터를 포함한다. 그러나, 재조합 발현 구조체의 제조를 위해 임의의 다른 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직한 구현예여서, 이러한 벡터는 숙주에서 복제 가능하고 생존 가능할 것이다.
적절한 DNA 서열(들)은 다양한 과정에 의해 벡터로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 해당 분야에 알려진 과정에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)로 삽입된다. 클로닝, DNA 단리, 증폭 및 정제를 위한, DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제 등을 포함하는 효소 반응을 위한 표준 기술, 그리고 다양한 단리 기술은 알려져 있고 해당 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이용된다. 많은 표준 기술이, 예를 들어 Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, Mass.); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.); Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK); Hames and Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK); 등에 기술되어 있다.
발현 벡터에서 DNA 서열은 적어도 하나의 적절한 발현 제어 서열(예를 들어, 구조 프로모터 또는 조절된 프로모터)에 작동 가능하게 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 이러한 발현 제어 서열의 대표적인 예에는 위에 기술된 바와 같이 진핵 세포 또는 바이러스의 프로모터가 포함된다. 프로모터 부위는 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 적절한 마커를 갖는 다른 벡터를 사용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 진핵세포 프로모터에는 CMV 전 초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 말기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTRs, 및 마우스 메탈로티오네인-I이 포함된다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 해당 분야의 당업자 수준 이내이고, TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터 또는 조절된 프로모터를 포함하는 어떤 특히 바람직한 재조합 발현 구조체의 제조가 본원에 기술된다.
고등 진핵세포에 의한 본 개시의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입하는 것에 의해 증가될 수 있다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 DNA의 cis-작용 요소로, 보통 약 10 내지 300 bp이다. 예로는 복제 기점 100 내지 270 말기 측의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 말기 측의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
본원에 제공되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터(Miller et al., 1989 BioTechniques 7:980; Coffin and Varmus, 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.)와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들어 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma virus), 조류 백혈병 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스(Myeloproliferative Sarcoma Virus), 및 유방암 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
레트로바이러스는 DNA 중간체를 통해 복제 및 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 RNA 바이러스이다. 이 DNA 중간체, 또는 프로바이러스는 숙주 세포 DNA로 안정하게 통합될 수 있다. 본 개시의 어떤 구현예에 따르면, 발현 구조체는 외래 단백질을 코딩하는 외래 유전자가 정상적인 레트로바이러스 RNA의 위치로 도입되는 레트로바이러스를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 RNA가 감염과 동시에 숙주 세포로 들어갈 때, 외래 유전자 또한 그 세포로 도입되고, 다음에 레트로바이러스 게놈의 일부였던 것처럼 숙주 세포 DNA로 통합될 수 있다. 숙주 세포 내에서 이 외래 유전자의 발현은 외래 단백질의 발현을 야기한다.
유전자 치료를 위해 개발된 대부분의 레트로바이러스 벡터 시스템은 뮤린 레트로바이러스를 기반으로 한다. 이러한 레트로바이러스는 두 가지 형태, 비리온으로 불리우는 유리 바이러스 입자, 또는 숙주 세포 DNA로 통합되는 프로바이러스로서 존재한다. 바이러스의 비리온 형태는 레트로바이러스의 구조 및 효소 단백질(효소 역전사제를 포함하여), 바이러스 게놈의 두 RNA 복제본, 그리고 바이러스 외피 당단백질을 포함하는 근원 세포 원형질 멤브레인의 일부를 포함한다. 레트로바이러스 게놈은 4 개의 주요 영역: 전사의 개시 및 종결에 필요한 cis-작용 요소를 포함하고 코딩 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 위치하는 긴 말단 반복순서(Long Terminal Repeat; LTR), 및 3 개의 코딩 유전자 gag, pol, 및 env로 조직된다. 이들 3 개의 유전자 gag, pol, 및 env는 각각 내부 바이러스 구조, 효소 단백질(인테그라제와 같은), 및 외피 당단백질(gp70 및 p15e로 지칭됨)을 코딩하는데, 이는 바이러스의 감염성 및 숙주 범위 특이성뿐만 아니라 미결정된 기능의 "R" 펩타이드를 부여한다.
별개의 패키징 세포주 및 벡터 생산 세포주는, 본 개시에 의해 제공되는 발현 구조체에서의 사용을 포함하여, 레트로바이러스의 사용에 관한 안전성 우려 때문에 개발되었다. 간단히, 이 방법론에서는 2 개 성분, 레트로바이러스 벡터 및 피키징 세포주(PCL)의 사용을 이용한다. 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복순서 (LTRs), 전달되는 외래 DNA 및 패키징 서열(y)을 포함한다. 이 레트로바이러스 벡터는 구조 및 외피 단백질이 벡터 게놈 내에 포함되지 않기 때문에 스스로 번식하지 못할 것이다. PCL은 gag, pol, 및 env 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 패키징 신호 "y"는 포함하지 않는다. 따라서, PCL은 스스로 빈 비리온 입자만을 형성할 수 있다. 이러한 일반적인 방법 내에서, 레트로바이러스 벡터는 PCL로 도입되고, 이에 의해 벡터 생산 세포주(VCL)를 생성한다. 이 VCL은 단지 레트로바이러스 벡터의 (외래) 게놈만을 포함하는 비리온 입자를 제조하고, 따라서 이전에 치료적 용도로 안전한 레트로바이러스 벡터로 생각되었다.
"레트로바이러스 벡터 구조체"는 TL1A 융합 단백질 코딩 핵산 서열과 같이 흥미 있는 서열(들) 또는 유전자(들)의 발현을 지시할 수 있는 조립체를 말한다. 간단히, 레트로바이러스 벡터 구조체는 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성의 기점 및 3' LTR을 포함하여야 한다. 예를 들어, 단백질(예를 들어 세포독성 단백질, 질환-관련 항원, 면역 보조 분자, 또는 교체 유전자)을 코딩하거나, 분자 자체로서 유용한(예를 들어, 리보자임 또는 안티센스 서열) 서열을 포함하여, 광범위한 이종 서열이 이 벡터 구조체 내로 포함될 수 있다.
본 개시의 레트로바이러스 벡터 구조체는, 예를 들어 B, C, 및 D 타입 레트로바이러스뿐만 아니라 스푸마바이러스 및 렌티바이러스(예를 들어, RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985 참조)를 포함하는 광범위한 레트로바이러스로부터 용이하게 구축될 수 있다. 이러한 레트로바이러스는 American Type Culture Collection("ATCC"; Rockville, Md.)와 같은 기탁 기관 또는 수집품으로부터 용이하게 얻거나, 통상적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 공지의 원천으로부터 단리할 수 있다. 임의의 위 레트로바이러스는, 본원에 제공되는 개시 및 표준 재조합 기술(예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, PNAS 82:488, 1985)을 고려할 때, 레트로바이러스 벡터 구조체, 패키징 세포, 또는 본 개시의 생산 세포를 조립하거나 구축하기 위해 용이하게 이용될 수 있다.
바이러스 벡터에 사용하기 위한 적절한 프로모터는 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 Miller, et al., Biotechniques 7:980-990 (1989)에 기술된 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 또는 임의의 다른 프로모터(예를 들어, 히스톤, pol III, 및 (β-액틴 프로모터)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 진핵세포의 세포 프로모터와 같은 세포 프로모터)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파보바이러스 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적절한 프로모터의 선택은 본원에 포함되는 교시로부터 해당 분야의 당업자에게 명백할 것이고, 조절된 프로모터 또는 위에 기술된 프로모터 가운데 있을 수 있다.
위에 기술된 바와 같이, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 패키징 세포주를 생산자 세포주로 변환시키기 위해 이용된다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예는 PE501, PA317, .Psi-2, Psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, Psi-CRE, Psi-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990)에 기술된 DAN 세포주를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이 벡터는 해당 분야에 알려진 임의의 수단을 통해 패키징 세포를 변환시킬 수 있다. 이러한 수단은 전기천공, 리포좀의 사용, 및 CaPO4 침전을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 대안에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포좀 내로 인캡슐화되거나, 지질과 결합하여, 숙주로 투여될 수 있다.
생산자 세포주는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 다음에 생체외 또는 생체내에서 진핵세포를 변환시키기 위해 이용될 수 있다. 변환된 진핵세포는 TL1A 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 변환될 수 있는 진핵세포는 배아 줄기세포뿐만 아니라 조혈모세포, 간세포, 섬유아세포, 골수성 단구 세포를 포함하는 순환하는 말초 혈액 단핵 및 다형핵(PMN) 세포, 림프구, 근아세포, 조직 대식제포, 수지상 세포, 쿠퍼 세포(Kupffer cells), 림프절 및 비장의 림프양 및 세망내피계 세포, 케라틴세포, 내피세포, 및 기관지 상피 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 TL1A 융합 발현 구조체를 제조하기 위해 바이러스 벡터가 사용되는 또 다른 예로서, TL1A 융합 단백질 또는 융합 단백질의 발현을 지시하는 재조합 바이러스 구조체에 의해 변환된 숙주 세포는 발현된 TL1A 융합 단백질 또는 바이러스 출아 중에 바이러스 입자에 의해 도입된 숙주 세포 멤브레인의 일부로부터 유래된 융합 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 위에 기술된 재조합 TL1A 융합 발현 구조체를 포함하는 숙주 세포와 관련된다. 숙주 세포는 본원에 개시된 벡터 및/또는 발현 구조체로 유전자 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)되고, 이는 예를 들어, 클로닝 벡터, 셔틀 벡터 또는 발현 구조체일 수 있다. 이 벡터 또는 구조체는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화하거나, 형질전환체를 선택하거나, TL1A 융합 단백질을 코딩하는 유전자와 같은 특정 유전자 또는 TL1A 융합 단백질을 증폭시키기에 적절하게 변경된 통상의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은, 발현을 위해 선택되는 특정 숙주 세포를 위한 배양 조건은 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵세포이거나, 효모 세포와 같은 하등 진핵세포일 수 있고, 또는 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵세포일 수 있다. 본 개시에 따른 적절한 숙주 세포의 대표적인 예로는 E. coli, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; Drosophila S2 및 Spodoptera 519와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 293 세포와 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포, 또는 생체외 증식에 이미 적응되거나 처음부터 그렇게 설정된 임의의 적절한 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 해당 분야의 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
다양한 포유류 세포 배양 시스템 또한 재조합 단백질을 발현하기 위해 이용될 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는, Gluzman, Cell 23:175 (1981)에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주, 및 적합한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 포함된다. 포유류 발현 벡터는, 예를 들어 본원에서 TL1A 융합 발현 구조체의 제조와 관련하여 기술한 바와 같이, 복제 기점, 적절한 프로모터 및 인핸서, 그리고 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 접합 공여 및 수용 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측면 비전사 서열(5' flanking nontranscribed sequences)을 포함할 것이다. SV40 접합으로부터 유래된 DNA 서열, 그리고 폴리아데닐화 부위는 필요한 비전사 유전자 요소를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포로의 구조체의 도입은, 예를 들어 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란 중재의 형질감염, 또는 전기천공을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 해당 분야의 당업자에게 익숙한 다양한 방법으로 이루어질 수 있다(Davis et al., 1986 Basic Methods in Molecular Biology).
mTOR 저해제
일부 구현예에서, 필요로 하는 인간 환자에서, 예를 들어 항원-특이적 면역 반응을 조절, 및/또는 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료, 및/또는 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 조합 요법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이 방법은 필요로 하는 환자에게 TNFRSF25 효능제(예를 들어, IL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체, TNFRSF25 효능제의 작은 분자 효능제 등) 및 유효량의 mTOR 저해제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 위의 방법은 이 환자에게 TNFRSF25 효능제 및 mTOR 저해제를 포함하는 조합 요법제를 투여하는 단계를 포함한다.
통상 mTOR로 알려진 라파마이신의 포유류 표적은 세포 성장, 세포 증식, 세포 이동성, 세포 생존, 단백질 합성, 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. mTOR는 다중 유사분열촉진 신호전달 경로에서 핵심 중재자이고, 정상 조직에서 혈관형성 및 증식 및 종양형성 과정을 조절하는 데 중심 역할을 한다. mTOR는 2 개의 복합체 mTORC1 및 mTORC2 내에 존재한다. mTORC1은 라파마이신 유사체(템시롤리무스 또는 에베롤리무스와 같은)에 감응성이고 mTORC2는 대체로 라파마이신-비감응성이다.
본원에서 사용되는 용어 "mTOR 저해제"는 적어도 하나의 기질(예를 들어, p70S6 키나제 1, 4E-BP1, AKT/PKB 및 eEF2)에 대한 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성과 같은 mTOR의 적어도 하나의 활성을 저해하는 화합물 또는 리간드를 말한다. 해당 분야의 당업자는 라파마이신 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 화합물, 또는 다른 화합물,항체, 또는 작은 분자 등이 mTOR 저해제인지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. mTOR 저해제를 확인하는 방법은 해당 분야에 알려져 있다. mTOR 저해제의 예로는 라파마이신(시롤리무스), 라파마이신 유도체, CI-779, 에베롤리무스 (Certican™), ABT-578, 타크롤리무스(FK 506), ABT-578, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라시브, TAFA-93, 데포롤리무스(AP-23573), 템시롤리무스(Torisel™), 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올(PP242) 및 AP-23841이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적 mTOR 저해제"는 mTOR 활성을 저해하지만 PI3K 활성은 저해하지 않는 화합물 또는 리간드를 말한다. 적절한 선택적 mTOR 저해제에는 RAD001이 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제의 투여 및 선택적 mTOR 저해제의 투여를 포함하는 조합 요법이 본원에 제공된다.
라파마이신은 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산되는 공지의 마크로라이드 항생제이다. 적절한 라파마이신의 유도체는, 예를 들어 WO 94/09010, WO 95/16691, WO 96/41807, U.S. Pat. No. 5,362,718 및 WO 99/15530에 개시되어 있다. 이들은 이 참고문헌에 기술된 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 대표적인 라파마이신 유도체는, 예를 들어 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신(CCI779로도 호칭됨) 또는 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신(ABT578로도 호칭됨)이다. 라파마이신 유도체는 또한 소위 말하는 라팔로그 (rapalogs), 예를 들어 WO 98/02441 및 WO 01/14387에 개시된 바와 같이, 예를 들어 AP23573, AP23464, AP23675 또는 AP23841를 포함할 수 있다. 추가로, 라파마이신 유도체의 비-제한적 예로는 TAFA-93(라파마이신 전구약물), 비올리무스-7 또는 비올리무스-9, 및 AP23464의 명칭으로 개시된 것들이 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물 및/또는 조합 요법에 사용되는 mTOR 저해제는 에베롤리무스(RAD001) 또는 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올(PP242)이다(예를 들어, Apsel et al., Nature Chemical to Biology 4, 691-699 (2008) 참조).
인터류킨
본원에 개시되는 인터류킨을 포함하는 임의의 조성물 및 방법에서 인터류킨은, 예를 들어 TNFRSF25의 효능제와의 조합 요법으로 투여될 때, Treg 세포의 팽창에 대하여 원하는 상승 효과를 달성하는 임의의 인터류킨일 수 있다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 IL-2이다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 IL-7이다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 IL-15이다.
IL-2의 유사체, 예를 들어, 효능제 및 부분 효능제 IL-2 유사체(예를 들어, IL-2 돌연변이체)도 본원에 포함된다. 이러한 유사체는 해당 분야에 알려져 있다. 효능제 IL-2 유사체의 비-제한적 예로는, 예를 들어, BAY 50-4798(Margolin et al. Clin Cancer Res June 1, 2007 13; 3312 참조; 다른 예로는 Imler and Zurawski. J Biol Chem. 1992 Jul 5;267(19):13185-90 참조)가 포함된다. 또한, 화합물이 IL-2 유사체인지(즉, 고 친화성 IL-2 수용체에 결합하고 T 세포 증식을 개시하는 능력을 유지) 여부를 결정하기 위한 생체외 스크리닝 분석은 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Zurawski and Zurawski. EMBO J. 1992 November; 11(11): 3905-3910; "The Interleukin 2 Receptor" Annual Review of Cell Biology; Vol. 5: 397-425 (Volume publication date November 1989; and "The Biology of Interleukin-2"; Annual Review of Immunology; Vol. 26: 453-479 (Volume publication date April 2008) 참조.
조성물 및 약제학적 조성물
일부 구현예에서, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물이 본원에 제공되는데, 여기에서 이 융합 단백질은 (a) TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 인간 TL1A 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하고, 여기에서 이 단편은 TNFRSF25에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 필요로 하는 인간에게 투여시, 이 조성물은 인간에서 나이브 CD4 T 세포의 빈도를 감소시킨다.
일부 구현예에서, TNFRSF25 효능제와, 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및 mTOR 저해제 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 및 유효량의 IL-2를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 효능적 TNFRSF25 항체 및 유효량의 IL-2를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 작은 분자 TNFRSF25 효능제 및 유효량의 IL-2를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 및 유효량의 mTOR 저해제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 효능적 TNFRSF25 항체 및 유효량의 mTOR 저해제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 작은 분자 TNFRSF25 효능제 및 유효량의 mTOR 저해제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 및 유효량의 라파마이신을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 효능적 TNFRSF25 항체 및 유효량의 라파마이신을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술되는 작은 분자 TNFRSF25 효능제 및 유효량의 라파마이신을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
치료를 위해 본원에 개시된 조성물(TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물)을 그대로 사용하는 것이 가능한 한편, 일부 구현예에서는 이 조성물을 약제학적 조성물로, 예를 들어 투여의 의도된 경로 및 표준 약제학적 실무와 관련하여 선택된 적절한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 제형화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본원에 개시되는 적어도 하나의 활성 조성물(예를 들어, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체, 작은 분자 TNFRSF25 효능제 등)을 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 및/또는 담체와 공동으로 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형이 본원에 제공된다. 이 부형제, 희석제 및/또는 담체는 이 제형의 다른 성분과 양립 가능하다는 의미에서 "허용 가능"하여야 하고 이의 수용자에게 유해하지 않아야 한다.
이 조성물은 인간 또는 수의과 약제로 사용에 임의의 편리한 방식으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 인간에게 생체내 투여를 위해, 본원에 개시되는 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 사용되는 공지의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이 TNFRSF25 효능제(예를 들어, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체, 작은 분자 TNFRSF25 효능제 등)는 유일한 활성 물질로서, 또는 다른 공지의 활성 물질(예를 들어, 아래 기술되는 바와 같이, 조합 요법에 유용한 하나 이상의 치료제)과 함께, 약제학적으로 적절한 희석제(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 보존제(예를 들어, 티메로살, 벤질알콜, 파라벤), 유화제, 가용화제, 보조제 및/또는 담체와 혼합하여 조합될 수 있다. 적절한 담체 및 이의 제형화는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co.에 기술되어 있다.
본원에 기술되는 TNFRSF25 효능제(예를 들어, TL1A 융합 단백질, 항체)뿐만 아니라 인터류킨(IL-2, 또는 이의 유사체 등) 및 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신 등)는 함께 또는 별개로 지속적 방출 조성물로서 제형화될 수 있다. "지속적 방출 조성물(sustained release composition)"은 TL1A 융합 단백질을 일정 시간에 걸처 방출하는 임의의 적절한 비히클을 포함할 수 있다. 지속적 방출 조성물의 비-제한적 예는 미소구(예를 들어, 폴리(DL-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 미소구), 무수 폴리-비닐알콜(PVA), 밀리실린더, 알기네이트 겔, 생분해성 하이드로겔, 착화제 및 나노입자를 포함한다. [예를 들어, Ashton, et al. (2007) Biomaterials, 28, 36, 5518; Drury, J. L. et al. (2003) Biomaterials; 24:4337-4351; U.S. Pat. No. 7,226,617 to Ding et al.; Simmons, C. A. et al. (2004) Bone; 35:562-569; Zhu, G. et al. (2000) Nat Biotech; 18:52-57, Biodegradable Hydrogels for Drug Delivery, K. Park et al, 1993, Technomic Publishing, Trans Am Ophthalmol Soc, K. Derwent et al, 2008;106:206-13 참조]
투여 및 투여량
본원에 기술되는 조성물은 해당 분야에 알려진 임의의 적절한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, TNFRSF25 효능제, 인터류킨, 및 mTOR 저해제는 함께 또는 별개로, 비경구적 투여(예를 들어, 정맥내, 복막내, 경막외, 척추강내, 근육내, 관내, 기관내, 피부내 또는 피하)를 위해 제형화될 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체 또는 작은 분자 TNFRSF25 효능제는 면역화 경로, 예를 들어 정맥내, 근육내, 복막내 등을 통해 환자에게 투여된다.
본원에 기술되는 방법에 사용되는 임의의 조성물 또는 제형을 위해, 치료적으로 유효한 용량은 처음에 동물 모델로부터 추정될 수 있다. 동물 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선은 다음에 인간에서 초기의 임상 연구를 위해 시험 용량을 결정하는 데 사용된다. 각각의 조성물의 안전성 결정에서, 용량 및 투여 빈도는 임상 연구에서의 사용을 위해 예상된 것과 부합하거나 초과되어야 한다. 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서의 사용을 위한 용량 범위를 만드는 데 사용될 수 있다. 인간에서의 사용을 위해 치료적으로 유효한 용량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 ED50을 포함하는 순환하는 농도의 범위 이내이다. 투여량은 채용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 이내에서 변화될 수 있다.
본원에 기술되는 조성물은 원하는 효과를 달성하기 위해 조성물의 유효량을 전형적으로 포함한다. 본원에서 사용되는 "치료적으로 유효한 양" 및 "유효량"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 용량 또는 양에 적용되는데, 필요로 하는 동물에 투여시 원하는 활성을 야기하는 데 충분한 조성물, 화합물 또는 약제학적 제형의 양을 말한다. 본 개시의 맥락 내에서, "치료적으로 유효한 양"이라는 용어는 본원에 명시된 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 제거하기에 충분한 조성물, 화합물 또는 약제학적 제형의 양을 말한다. 활성 성분의 조합이 투여될 때, 조합의 유효량은 개별 투여시 유효할 각각의 성분의 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 치료적 제형의 투여량은 질환 또는 병태의 특성, 환자의 병력, 투여의 빈도, 투여의 방법, 숙주로부터 약제의 청소율 등에 따라 변화할 것이다. 초기 용량은 더 클 수 있고, 더 작은 유지 용량이 이어질 수 있다. 이 용량은 유효 용량 농도를 유지하기 위해, 예를 들어 매주, 격주로, 매일, 주 2회 등으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "유효량의 인터류킨"(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체)은 TNFRSF25 효능제(예를 들어, 본원에 기술되는 바와 같이, 효능적 항-TNFRSF25 항체, TL1A 융합 단백질, 또는 작은 분자 TNFRSF25 효능제)와 조합 요법의 일부로서 대상에 투여시, Treg 세포의 팽창에 대한 상승 효과를 달성하기 위해 충분한 양이다. 전형적으로, 본원에 기술되는 방법(예를 들어, 조합 요법)에 사용되는 유효량의 IL-2 또는 다른 적절한 인터류킨 또는 이의 유사체는, 인간 환자에게 단독으로(즉, 조합 요법에서가 아니라) 투여될 경우 Treg 세포의 준최적 (suboptimal) 팽창을 유도하거나 팽창을 유도하지 못할 양(용량)이다. 전형적으로, 인간 환자에서 Treg 세포의 준최적(suboptimal) 팽창을 유도하거나 팽창을 유도하지 못할 IL-2의 용량은 1일 당 제곱미터 당 1백만 단위 미만의 용량이다(예를 들어, Koreth, J.; N Engl J Med. 2011 Dec 1;365(22):2055-66; and Matsuoka, K. Sci Transl Med. 2013 Apr 3;5(179):179ra43 참조). 일부 구현예에서, IL-2는 인간 환자에게 "낮은 용량"의 IL-2 또는 "매우 낮은 용량"의 IL-2로 고려되는 양으로 투여된다. 본원에서 사용되는 "낮은 용량의 IL-2"는 1일 당 제곱미터 당 대략 300,000 단위의 용량이다. 본원에서 사용되는 "매우 낮은 용량의 IL-2"는 1일 당 제곱미터 당 대략 30,000 단위의 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량의 IL-2는 1일 당 제곱미터 당 30,000 내지 300,000 단위 범위의 양이다.
본원에서 사용되는 "유효량의 mTOR 저해제"(예를 들어, 라파마이신)는 TNFRSF25 효능제(예를 들어, 본원에 기술되는 바와 같이, 효능적 항-TNFRSF25 항체, TL1A 융합 단백질, 또는 작은 분자 TNFRSF25 효능제)와 조합 요법의 일부로서 대상에 투여시, 작동체 T 세포의 팽창 및/또는 빈도를 감소시키기 위해 충분한 양이다. 전형적으로, mTOR 저해제의 유효량은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%만큼 대상에서 작동체 T 세포의 팽창을 저해 및/또는 빈도를 감소시키는 양이다. 다른 구현예에서, 작동체 T 세포 팽창의 저해 및/또는 작동체 T 세포의 빈도를 감소시키는 양은 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 이보다 높다. 치료적으로 유효한 용량은 (i) 판독으로서, 예를 들어 T 조절 세포 증식을 사용하는 생체외 세포 배양 분석에서 조성물 또는 화합물의 유효량의 특징화 (ii) 동물 연구에서 판독으로서 모델 질환(예를 들어, IBD, 천식 등)에서 개선 및/또는 동물 생존 및/또는 T 조절 세포 증식을 사용하여 특징화, 이어서 (iii) 인간 실험에서 판독으로서 증상(예를 들어, 질환 또는 장애, 예를 들어 자가면역 질환, 천식, 이식편대숙주병, 만성 감염, 염증 등)의 개선 및/또는 증진된 생존율을 사용하여 특징화와 같은 접근의 조합에 의해 단계적으로 결정할 수 있다.
어떤 조건 하에서 적절한 용량 및 투여 회수는 위에 기술된 지표를 기반으로 하는 시험에 의해 결정될 수 있지만, 표준 임상적 기술에 따라 의사의 판단 및 각각의 환자의 환경(연령, 일반적 병태, 증상의 심한 정도, 성별 등)에 따라 궁극적으로 결정되고 개량될 수 있다.
본원에 기술되는 조성물에서 TL1A 융합 단백질의 전형적인 투여량은 1일 당 체중 킬로그램 당 약 0.001-100 밀리그램(mg/kg/일), 약 0.001-50 mg/kg/일, 약 0.0025-40 mg/kg/일, 약 0.005-30　mg/kg/일, 약 0.01-25 mg/kg/일, 약 0.025-20 mg/kg/일, 약 0.05-15 mg/kg/일, 약 0.05-10 mg/kg/일, 0.05-5 mg/kg/일, 또는 약 1-2 mg/kg/일의 범위이다.
효능적 항-TNFRSF25 항체의 1일 당 전형적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 10 mg/kg 사이, 약 0.1 mg/kg 내지 8 mg/kg 사이, 약 0.2 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 사이, 또는 약 0.4 mg/kg 내지 약 4 mg/kg 사이이다. 일부 구현예에서, 효능적 항-TNFRSF25 항체의 전형적인 투여량은 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 4 mg/kg 등이다.
본원에 개시된 조합 요법, 예를 들어 TNFRSF25 효능제(예를 들어, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체 등)와의 조합 요법에 사용하기 위한 IL-2 또는 다른 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15)의 전형적인 투여량은, 1일 당 제곱미터 당 약 10,000 내지 1,000,000 단위 사이, 1일 당 제곱미터 당 약 15,000 내지 900,000 단위 사이, 1일 당 제곱미터 당 약 20,000 내지 800,000 단위 사이, 1일 당 제곱미터 당 약 25,000 내지 700,000 단위 사이, 1일 당 제곱미터 당 약 30,000 내지 500,000 단위 사이, 1일 당 제곱미터 당 약 30,000 내지 400,000 단위 사이, 또는 1일 당 제곱미터 당 약 30,000 내지 300,000 단위 사이의 투여량이다.
1일 당 라파마이신의 전형적인 투여량은 약 25 ㎍/kg 내지 약 500 ㎍/kg 사이, 약 50 ㎍/kg 내지 약 400　㎍/kg 사이, 또는 약 75 ㎍/kg 내지 약 300 ㎍/kg 사이이다.
본원에 기술되는 TNFRSF25 효능제(예를 들어, TL1A 융합 단백질, 효능적 항-TNFRSF25 항체, 작은 분자 TNFRSF25 효능제 등), 및/또는 하나 이상의 TNFRSF25 효능제를 포함하고/하거나 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15)을 포함하는 하나 이상의 조성물은 대상에서 Treg 세포의 증식을 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 이보다 많이 증가시키기에 충분한 하나 이상의 투여량으로 대상에 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, IL-2 및 TNFRSF25 효능제는 Treg 세포의 팽창에 있어서 함께 상승 효과를 야기하는 양으로 투여된다. Treg 세포 증식을 측정하는 방법은 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 생체내 Treg 증식을 모니터링하기 위해, 말초 혈액 세포를 처리된 대상으로부터 수집하고, CD4, CD25, IL7R 및 FoxP3을 포함하는 세포 표지를 염색(예를 들어, 면역염색)하고, 유동세포분석법으로 분석할 수 있다. 순환하는 FoxP3 Treg 세포의 개수를 정량화하고 출발 개수(예를 들어, 처리 전)와 비교할 수 있다.
또한, 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%만큼 대상에서 작동체 T 세포 팽창을 저해하고/하거나 작동체 T 세포의 빈도를 감소시키기에 충분한 하나 이상의 투여량으로 대상에 투여된다. 일부 구현예에서, 작동체 T 세포의 저해 및/또는 작동체 T 세포 빈도의 감소의 양은 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 이보다 크다.
작동체 T 세포의 빈도 및/또는 팽창(예를 들어, 증식)을 측정하는 방법은 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 생체내에서 CD4 및/또는 CD8 T 세포 증식을 모니터링하기 위해, 말초 혈액 세포를 처리된 대상으로부터 수집하고, CD4, CD25, FoxP3, Ki67, 및 다른 적절한 증식의 세포 표지를 포함하는 페포 표지를 염색(예를 들어, 면역염색)하고, 유동세포분석법으로 분석할 수 있다. 순환하는 T 작동체 세포의 개수 및 빈도는 정량화 및 출발 개수(예를 들어, 처리 전)와 비교할 수 있다.
TL1A 융합 단백질 및 다른 TNFRSF25 효능제의 용도
필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 조절하는 방법이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 이 방법은 환자에게 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 전형적으로, TL1A 융합 단백질을 포함하는 이 조성물은 치료적으로 유효한 양의 TL1A 융합 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원-특이적 면역 반응은 저해된다.
일부 구현예에서, 임의의 적절한 척도(예를 들어, 항원-특이적 항체, T 세포, B 세포, 항원-특이적 T 세포 증식 등의 빈도)에 의해 측정되는 항원에 대한 면역 반응이 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%만큼 증가 또는 감소되면, 항원-특이적 면역 반응이 조절되는 것으로 결정된다. 다른 구현예에서, 임의의 적절한 척도(예를 들어, 항원-특이적 항체, T 세포, B 세포, 항원-특이적 T 세포 증식 등의 빈도)에 의해 측정되는 항원에 대한 면역 반응이 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 이보다 많이 증가 또는 감소되면, 항원-특이적 면역 반응이 조절되는 것으로 결정된다. 또한, 필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료, 또는 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법이 본원에 기술된다. 이 방법은 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 전형적으로, TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물은 치료적으로 유효한 양의 TL1A 융합 단백질을 포함한다.
또한, 대상(예를 들어, 환자)에 TNFRSF25 효능제의 투여와 관련되고/되거나 이에 의해 야기되는 하나 이상의 부정적인 사건의 심한 정도 및/또는 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 부정적인 사건의 심한 정도 및/또는 빈도를 감소시키는 방법은 생리적으로 허용 가능한 담체 중 본원에서 기술되는 TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물을 필요로 하는 인간 환자에게 투여하는 단게를 포함한다. 일부 구현예에서, 감소 또는 저해되는 부정적인 사건은 염증성 장 질환의 하나 이상의 증상, 염증성 장 질환의 발생, 체중 감소, 발진, 설사, 근육통, 혈소판 수 감소, 간 효소 농도의 증가 및 사망이다.
또한, 필요로 하는 대상(환자)에게 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, 유효량의 인터류킨, 예를 들어, IL-2)을 포함하는 조합 요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 조절하고/하거나 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하고/하거나 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 필요로 하는 대상(환자)에게 TNFRSF25 효능제 및 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)를 포함하는 조합 요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 조절하고/하거나 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하고/하거나 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 필요로 하는 대상(환자)에게 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨 (예를 들어, 유효량의 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체)) 및 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)을 포함하는 조합 요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 인간 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 조절하고/하거나 항원-특이적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 치료하고/하거나 이 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 개시되는 방법에서 사용하기 위한 TNFRSF25 효능제, 인터류킨, 및 mTOR 저해제의 예시적인 유효량은 위에 기술된다.
임의의 위에 기술된 방법에서, 치료를 필요로 하는 환자는, 예를 들어 고형 기관 또는 줄기세포 이식을 위한 준비로 유도 치료 중이거나 이를 받으려 하는 환자, 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자로 유지 요법 중이거나 이를 받으려 하는 환자, 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자인 환자, 알러지 환자; 백신을 맞고 있거나 맞으려 하는 환자, 면역 체크포인트 저해제(예를 들어, CTLA-4 또는 PD-1 저해제)로 치료 중이거나 치료받으려 하는 환자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
임의의 위 방법에서, 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애(예를 들어, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염), 이식 거부, 이식편대숙주병, 염증, 천식, 알러지, 및 만성 감염일 수 있다.
일부 구현예에서, 위의 방법은 환자에서 항원-특이적 면역 반응을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%만큼 감소된다. 다른 구현예어서, 이 항원-특이적 면역 반응은 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 이보다 많이 감소된다.
일부 구현예에서, 위에 기술된 방법은 본원에 기술되는 조성물(예를 들어, TL1A 융합 단백질을 포함하는)의 투여 또는 조합 요법(예를 들어, TNFRSF25 효능제 및 IL-2 및/또는 mTOR 저해제의 투여) 이후 환자에서 Treg 세포의 유의성 있게 증가된 증식을 야기한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 본원에 기술되는 방법은 이 방법의 투여 후 환자에서 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 또는 적어도 10-배 또는 이보다 많이 Treg 세포의 증가된 증식을 야기한다.
임의의 위 구현예에서, 이 방법은 환자에게 투여되는 하나 이상의 조성물의 단일 또는 다중 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상(예를 들어, 환자)에게 TL1A 융합 단백질을 포함하는 조성물이 투여될 때, 이 방법은 단일 투여 또는 이보다 많은 투여를 포함할 수 있다. 예시적인 투여 양생법은 위에 기술된다. TNFRSF25 효능제가 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)와 조합 요법제로 투여될 때, TNFRSF25 효능제는 인터류킨 및/또는 mTOR 저해제와 같거나 다른 날에 투여될 수 있다. 각각의 활성 약제는 별개의 조성물로 투여되거나, 둘 이상의 활성 약제가 조합으로 투여될 수 있다.
위에 기술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 기술되는 방법은 자가면역 질환, 동종면역 반응, 또는 T 세포 반응을 포함하는 임의의 다른 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 데 유용하다(예를 들어, 필요로 하는 환자에서). 일반적으로, 이들은 개인의 면역 시스템(예를 들어, 활성화된 T 세포)이 그 개인 자신의 조직 및 세포, 또는 이식된 조직, 세포, 또는 분자(이식편 또는 이식 조직에서)를 공격하는 질환이다. 본원에 기술되는 방법에 따라 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 비-제한적 예는, 예를 들어, 자가면역 질환 또는 장애(예를 들어, IBD 및 류마티스성 관절염), 이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 염증, 천식, 알러지, 및 만성 감염을 포함한다.
이식 거부 및 GVHD 관련된 장애에서, 치료를 필요로 하는 환자는 고형 기관 또는 줄기세포 이식을 위한 준비로 유도 치료 중이거나 이를 받으려 하는 환자, 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자로 유지 요법 중이거나 이를 받으려 하는 환자, 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자인 환자(그리고 이 치료제, 예를 들어 TL1A 융합 단백질 또는 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 유지 면역억제 요법의 조기 중단을 용이하게 하기 위해 투여됨), 알러지 환자(그리고 이 치료제, 예를 들어 TL1A 융합 단백질 또는 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 특정 알러지 반응의 증상을 감소시키기 위해 투여됨); 백신을 맞고 있거나 맞으려 하는 환자(그리고 이 치료제, 예를 들어 TL1A 융합 단백질 또는 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 백신에 의해 자극되는 항원-특이적 T 세포 반응을 증진시기기 위해, 또는 T 세포 메모리 면역 반응을 증진시키기 위해 투여됨), 또는 면역 체크포인트 저해제(예를 들어, CTLA-4 또는 PD-1 저해제)로 치료 중이거나 치료받으려 하는 환자(그리고 이 치료제, 예를 들어 TL1A 융합 단백질 또는 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 T 세포 면역 반응을 증진시키기 위해 투여됨)일 수 있다.
본 개시의 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 질환은, 예를 들어 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 갑상선염(Hashimoto 갑상선염 및 Ord 갑상선염과 같은), 그레이브스병(Grave's disease), 전신성 루푸스 홍반성 낭창, 피부경화증, 건선, 관절염, 류마티스성 관절염, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병(Behcet's disease), 크론병(Crohn's disease), 피부근염, 사구체신염, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), IBD, 루푸스 신염, 중증 근무력증, 심근증, 수포창/유천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발성동맥염, 다발성근염, 원발성 담즙성 간경화, 류마티스성 열, 유육종증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 포함한다.
본 개시의 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 동종면역 반응은 GVHD 및 이식 거부를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 개시되는 융합 단백질은 고형 기관 또는 줄기세포 이식을 위한 준비에서 "유도 치료"로서, 또는 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자에 "유지 요법"으로서 투여될 수 있고, 또한 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자에게 유지 면역억제 요법의 조기 중단을 용이하게 하기 위해 투여될 수 있다.
본원에 기술되는 방법, 예를 들어 TL1A 융합 단백질의 투여를 포함하거나 TNFRSF25 효능제 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 또한 특정 알러지 반응의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 알러지 환자에게 투여될 수 있다. 알러지 반응의 예로는, 예를 들어 알러지성 천식, 견과(예를 들어, 땅콩) 알러지, 소아 지방변증(밀 글루텐) 알러지, 약물 알러지(예를 들어, 페니실린, 설폰아마이드)에서의 내성유도 프로토콜이 포함된다. 많은 물질이 알러지원으로서 작용할 수 있으며; 그러나, 화분 및 곰팡이, 집먼지 진드기 탈락물, 애완동물 알러지원, 다양한 식품, 곤충 침, 및 바퀴벌레 항원과 같은 일부 물질은 매우 흔한 알러지원이다.
본원에 기술되는 조성물 및 조합 요법은 또한 백신에 의해 자극되는 항원-특이적 T 세포 반응을 증진시기기 위해 백신과 함께 환자에게 투여될 수 있다. 위에 기술한 바와 같이, 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질은 T 작동체 세포 공동-자극에 대한 효과를 가짐으로써 항원-특이적 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 및 TNFRSF25 효능제의 투여 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 또한 환자에게, T 세포 메모리 면역 반응을 증진시키기 위해 백신과 함께, 또는 T 세포 면역 반응을 증진시키기 위해 면역 체크포인트 저해제(예를 들어, CTLA-4 또는 PD-1 저해제)와 함께 투여될 수 있다. 위에 기술한 바와 같이, 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 및 TNFRSF25 효능제의 투여 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 또는 이의 유사체) 및/또는 mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신)의 투여를 포함하는 조합 요법은 T 작동체 세포 공동자극에 대한 효과를 가짐으로써 항원-특이적 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
또한, TL1A 융합 단백질 및/또는 다른 TNFRSF25 효능제 및 항-염증 및/또는 면역억제 항체 또는 다른 항-염증 또는 면역억제 약제의 투여를 포함하는 조합 요법이 본원에서 고려된다. 예로써, 일부 구현예에서는, 본원에서 기술되는 TL1A 융합 단백질 또는 다른 TNFRSF25 효능제가, 고형 기관 또는 줄기세포 이식을 위한 준비로 유도 치료 중인 대상에게, 또는 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자에서 유지 요법으로서 투여될 수 있고, 또한 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수용자에게 유지 면역억제 요법의 조기 중단을 용이하게 하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, TL1A 융합 단백질을 라파마이신, 타크롤리무스, 다른 mTOR 저해제, MEK 저해제, CTLA4-Ig 분자, CD80 또는 CD86 차단 항체 또는 분자, CD40 또는 CD40L 차단 항체 또는 분자, PTEN 차단 분자, OX40 또는 OX40L 차단 항체 또는 분자, 프레드니손, 메틸프레드니손, 플루티카손 또는 이의 조합과 같은 약제와의 조합 요법제로 공동투여하는 것이 유리할 수 있다. 대안으로서, 또는 추가하여, TL1A 융합 단백질 또는 다른 TNFRSF25 효능제는 인터류킨(예를 들어, 아래 실시예에서 기술되는 바와 같이, 낮은 용량 또는 매우 낮은 용량의 IL-2)과 함께 투여될 수 있다.
다른 예로서, 일부 구현예에서는, 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 또는 다른 TNFRSF25 효능제가 특정 알러지 반응(예를 들어, 천식, 소아 지방변증, 약물 알러지)의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 대상 환자에게 투여될 수 있다. 본원에서 기술되는 TL1A 융합 단백질 또는 다른 TNFRSF25 효능제는 라파마이신, 타크롤리무스, 다른 mTOR 저해제, CTLA4-Ig 분자, CD80 또는 CD86 차단 항체 또는 분자, CD40 또는 CD40L 차단 항체 또는 분자, PTEN 차단 분자, OX40 또는 OX40L 차단 항체 또는 분자, 프레드니손, 메틸프레드니손, 플루티카손 또는 칼시뉴린 저해제와의 조합 요법제로 공동투여하는 것이 유리할 수 있다. 대안으로서, 또는 추가하여, TL1A 융합 단백질 또는 다른 TNFRSF25 효능제는 인터류킨(예를 들어, 아래 실시예에서 기술되는 바와 같이, 낮은 용량 또는 매우 낮은 용량의 IL-2)과 함께 투여될 수 있다.
또한, 위에 논의된 바와 같이, 본원에 개시되는 TL1A 융합 단백질은 생체내에서 동족 T 조절 세포(Treg)의 증식을 안전하고 선택적으로 자극한다는 것이 현재 발견되었다. 특히, TNFRSF25 조절 약제로 면역 반응을 조절하는 이전에 기술된 어떤 시도와는 대조적으로, 인간화된 마우스 및 영장류의 연구에서 본원에 기술되는 TL1A 융합 단백질 처리가 체중 감소를 유도하거나, 백혈구 계수에서 변화를 야기하거나, 임의의 다른 위험하거나 원치 않는 부작용을 유도하지 않는다는 것이 현재 밝혀졌으며, 이는 TL1A 융합 단백질이 영장류를 포함하여 생체내 안전하게 투여될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 연구는 또한 TL1A 융합 단백질이 인간 환자에게 안전하게 투여될 것으로 예상됨을 보여준다. 따라서, 이들 발견과 함께, 인간 환자에서 TNFRSF25 효능제의 투여를 포함하는 치료와 관련하여 부정적인 사건을 감소시키는 방법이 또한 본원에서 고려된다. 이 방법은 생리적으로 허용 가능한 담체 중의 본원에 기술된 TL1A 융합 단백질-포함 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 부정적인 사건은 염증성 장 질환의 하나 이상의 증상의 발생일 수 있다. 부정적인 사건은 또한 체중 감소, 발진, 설사, 근육통, 혈소판 수의 감소, 간 효소 농도의 증가, 및/또는 사망일 수 있다.
본 개시와 관련하여, 통상의 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 면역학, 세포 생물학 및 해당 분야의 기술 이내에서 다른 관련된 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 다른 것들 중에서도 Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4th ed. Wiley-Liss 참조. 위에 수록된 현재의 프로토콜은 매년 수회 업데이트된다.
도 1은 뮤린 양자 전달 모델의 모식적 개요이다.
도 2는 장간막 림프절(mLN)(위의 그래프) 및 비장 세포(아래 그래프)에서, 전체 CD4+로부터 FoxP3+ Ki67+ 세포의 백분율(%)로 표현한 OT-II pTreg 세포와 FoxP3-RFP 양성 nTreg 세포의 비율을 정량화한 막대 그래프를 도시한다. 데이터는 그룹 당 ≥3 마리 마우스를 가지고 평균±S.E.M.으로서 나타내고; *는 p<0.05의 통게적 유의성을 나타낸다.
도 3은 연속적으로 음용수 중 1% 오브알부민(ova)을 받은 마우스의 그룹(좌측 패널) 또는 표시된 일수 동안(0-20일) ova를 '제거'하기 위해 정상적인 물로 대체된 1% ova를 포함하는 음용수를 받은 마우스의 그룹(우측 패널)에서 총 CD4+ 세포 중 FoxP3+Ki67+ mLN pTreg(위 패널) 및 mLN tTreg 세포에서의 비율을 정량화한 선 그래프를 도시한다. 각각의 그래프에서 하나의 마우스 그룹은 동형 대조군 IgG를 받은 마우스에 상응하고 다른 그룹은 4C12 항체를 받은 마우스에 상응한다. 데이터는 2 개의 독립된 실험으로부터 0 및 10일 시점에서 그룹 당 ≥3 마리 마우스 20일 시점에서 그룹 당 ≥4 마리 마우스를 가지고 평균±S.E.M.으로서 나타내고; *는 p<0.05의 통게적 유의성을 나타낸다.
도 4는 연속적으로 음용수 중 1% ova를 받은 마우스의 그룹(좌측 패널) 또는 표시된 일수 동안(0-20일) ova를 '제거'하기 위해 정상적인 물로 대체된 1% ova를 포함하는 음용수를 받은 마우스의 그룹(우측 패널)에서 총 CD4+ 세포 중 비장 FoxP3+Ki67+ pTreg(위 패널) 및 비장 tTreg 세포에서의 비율을 정량화한 선 그래프를 도시한다. 각각의 그래프에서 하나의 마우스 그룹은 동형 대조군 IgG를 받은 마우스에 상응하고 다른 그룹은 4C12 항체를 받은 마우스에 상응한다. 데이터는 2 개의 독립된 실험으로부터 0 및 10일 시점에서 그룹 당 ≥3 마리 마우스 20일 시점에서 그룹 당 ≥4 마리 마우스를 가지고 평균±S.E.M.으로서 나타내고; *는 p<0.05의 통게적 유의성을 나타낸다.
도 5는 비-환원 및 환원된 조건 하에서 정제된 hTL1A의 웨스턴 블롯을 도시한다. 분자량은 사진의 좌측에 나타낸다.
도 6은 표시된 용량(ng/mL)의 뮤린(ms) 또는 인간(h) TL1A-Ig 융합 단백질로 처리된 인간(h)TNFRSF25 형질감염된 p815 세포의 기능적 활성을 정량화(로다민 110 카운트에 근거하여)한 선 그래프를 도시한다.
도 7-9는 인간(h)TL1A-Ig 융합 단백질(100 ㎍. 복막내(i.p.)) 또는 IgG 대조군 처리 5일 후 NSG-hu 마우스의 비장(도 7), mLN(도 8) 및 소장(도 9)에서 % 이식(인간 CD45+ 세포/총 간 림프양 세포의 %)(좌측 위 그래프), CD4+ 세포의 빈도(%)(우측 위 그래프), 빈도(%) CD8+ 세포(좌측 아래 그래프), 및 인간 Treg 세포의 빈도(총 CD25+CD127-CD4+ 세포 중 FoxP3+의 %)(우측 아래 그래프)를 정량화한 막대 그래프를 도시한다. 각각의 그룹에서, 밝은 회색 막대는 Ki67- 세포의 백분율을 정량화하고, 어두운 회색 막대는 Ki67+ 세포의 백분율을 정량화한다. 데이터는 3 개의 독립된 실험으로부터 그룹 당 총 8 마리 마우스를 가지고 평균±S.E.M.으로서 나타낸다.
도 10은 0일에 표시된 용량(mg/kg)으로 히말라야 원숭이(rm) 또는 인간(h)TL1A-Ig 융합 단백질을 투여한 히말라야 원숭이의 시간(실험일) 경과에 따른 체중(kg)을 정량화한 선 그래프를 도시한다.
도 11은 0일에 표시된 용량으로 개별 히말라야 원숭이 rhTL1A-Ig 또는 hTL1A-Ig 융합 단백질을 투여한 후 표시된 연구 일에 말초 혈액 CBC 분석에 의해 측정한 절대수의 백혈구(103/μL)(위 패널) 및 총 다형핵(PMN) 세포(103/μL)(아래 패널)를 정량화한 선 그래프를 도시한다.
도 12는 융합 단백질로 처리된 히말라야 원숭이의 시간 경과에 따른 혈청 중 인간 TL1A-Ig 융합 단백질의 평균 농도(㎍/mL)를 정량화한 선 그래프를 도시한다.
도 13은 표시된 농도의 히말라야 원숭이(rm)TL1A-Ig 융합 단백질 또는 인간(h)TL1A-Ig 융합 단백질 처리 후, 0일, 2일 및 4일에 개별 히말라야 원숭이에서 IFN-γ(ng/mL)(위 패널) 및 TGFβ(ng/mL)(아래 패널)의 혈청 농도를 정량화한 막대 그래프를 도시한다. 데이터는 0.5 mg/kg rmTL1A-Ig을 받은 2 마리 동물, 1.5 mg/kg rmTL1A-Ig를 받은 4 마리 동물 및 1.5 mg/kg hTL1A-Ig를 받은 2 마리 동물을 가지고 평균±S.E.M.으로서 나타낸다.
도 14 및 15는 0일에 표시된 용량으로 rhTL1A-Ig 또는 hTL1A-Ig 융합 단백질 처리 후 표시된 날에 히말라야 원숭이에서 FoxP3 Treg 세포의 빈도(%)(총 CD4+ 세포 중)(도 14) 및 CD28+CD95- 나이브 CD4 T 세포의 빈도(%)(총 CD4+CCR7+ 중)(도 15)를 정량화한 선 그래프를 도시한다.
도 16은 Y-축에서의 총 CD4+ 세포(세포들은 CD3+ 세포에서 전-게이티드됨) 중 FoxP3+CD4+ Treg 세포의 빈도(%) 대 X-축에서의 표시된 처리 양생법((낮은 용량 IL-2(300,000 단위); TL1A-Ig 융합 단백질 + 매우 낮은 용량 IL-2(30,000 단위); TL1A-Ig 융합 단백질 + 낮은 용량 IL-2(300,000 단위); 대조군(IgG); 또는 TL1A-Ig 융합 단백질)으로 처리 후 일수를 정량화한 선 그래프이다. 데이터는 평균±S.E.M.을 그룹 당 3 마우스를 사용하여 나타낸다. 시험 후 Turkey와 함께 일원변량분석을 사용한 5일 분석은 TL1A-Ig 대 대조군(p < 0.05), TL1A-Ig + 매우 낮은 용량 IL-2 대 대조군(p < 0.01) 및 TL1A-Ig + 낮은 용량 IL-2 대 대조군(p < 0.001)에서 유의성 있는 차이를 보여주었다.
도 17은 Y-축에서의 총 CD4+ 세포(세포들은 CD3+ 세포에서 전-게이티드됨) 중 FoxP3+CD4+ Treg 세포의 빈도(%) 대 X-축에서의 표시된 처리 양생법((낮은 용량 IL-2(300,000 단위); 4C12 항체 + 낮은 용량 IL-2(300,000 단위); 4C12 항체; 또는 대조군(IgG))으로 처리 후 일수를 정량화한 선 그래프이다. 데이터는 평균±S.E.M.을 그룹 당 5 마우스를 사용하여 나타낸다. 시험 후 Turkey와 함께 일원변량분석을 사용한 5일 분석은 4C12 대 대조군(p < 0.05) 및 4C12 + 낮은 용량 IL-2 대 대조군(p < 0.001)에서 유의성 있는 차이를 보여주었다.
도 18, 19 및 20은 그래프에 표시된 바와 같이(Ova/alum + TL1A-Ig 융합 단백질 + 라파마이신; TL1A-Ig 융합 단백질 + 라파마이신; ova/alum + 라파마이신; ova/alum + TL1A-Ig 융합 단백질; 또는 ova/alum) 처리된 그룹으로부터의 마우스 말초 혈액에서 총 CD8+ T 세포 중 양자 전달된 OT-I(CD8+ 오브알부민(ova)-특이적) T 세포(도 18), 또는 총 CD4+ T 세포 중 양자 전달된 OT-II(CD4+ ova-특이적) T 세포(도 19), 또는 총 CD4+ T 세포 중 CD4+FoxP3+ Treg 세포(도 20)의 빈도(백분율)를 정량화한 그래프를 도시한다. 데이터는 총 2 개의 독립된 실험으로부터 그룹 당 6 마리의 마우스를 사용하여 평균±S.E.M.으로서 나타낸다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
다음은 아래 제시되는 실시예에 사용되는 재료 및 방법이다.
마우스 및 양자 전달 모델
B6 배경에서 Foxp3+RFP+(FIR 마우스) 및 Foxp3+GFP+리포터 마우스(Dr. Richard Flavell 및 Dr. Alexander Rudensky에 의해 관대하게 제공됨[Wan, Y. Y., and R. A. Flavell. 2005. Identifying Foxp3-expressing suppressor T cells with a bicistronic reporter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 5126-5131 참조]), CD4-/- 마우스, NOD.SCID/γc-/-(NSG), OT-II 및 OT-II/FIR 마우스는 동물 시설에서 사육되었다. 마우스는 6-12 주령에 사용되고 무균 조건에서 유지되었다. Treg 양자 전달 모델은 이전에 보고된 것과 같이 설정되었다(Schreiber et al. Oncoimmunology. 2012 Aug 1;1(5):642-648 참조).
히말라야 원숭이 및 인간 TL1A-Ig의 클로닝
전체 RNA는 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 히말라야 원숭이 말초 혈액 단핵세포의 조제물로부터 단리하였다. 히말라야 원숭이 cDNA 라이브러리를 다음에 5' RACE (Invitrogen)를 사용하여 5' 캡트 및 3' 폴리-A 테일드 RNA의 PCR 증식에 의해 생성하였다. 히말라야 원숭이 TL1A의 세포외 영역(아미노산 73-252)은 다음 프라이머를 사용하여 증폭하였고: 정방향 5'-AAAGGACAGGAGTTTGCACC-3' (서열번호 17), 역방향 5'-CTATAGTAAGAAGGCTCCAAA-3' (서열번호 18), 그리고 히말라야 원숭이 IgG1의 힌지-CH2-CH3 영역에 융합하여, 다음 프라이머를 사용하여 증폭하고: 정방향 5'-ATAAAAACATGTGGTGGTGG-3' (서열번호 19), 및 역방향 5'-CTGCGTGTAGTGGTTGTGCA-3' (서열번호 20), 포유류 발현 벡터 pVITRO2-hygro-mcs (Invivogen)의 제2 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다.
인간 TL1A-Ig를 위해, 인간 cDNA 라이브러리를 5' RACE(Invitrogen)를 사용하여 5' 캡트 및 3' 폴리-A 테일드 RNA의 PCR 증식에 의해 생성하였다. 인간 TL1A의 세포외 영역(아미노산 60-251)을 증폭하고 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 영역에 융합하여, pVITRO2-hygro(InvivoGen, San Diego, Calif.)로 클로닝하였다.
히말라야 원숭이 융합 단백질의 TL1A 부분의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
핵산 서열:
aaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgacacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggacccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctccttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 5); 및
아미노산 서열:
kgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvtqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgpmfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 6).
히말라야 원숭이 IgG1 힌지-CH2-CH3 서열의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
핵산 서열:
ataaaaacatgtggtggtggcagcaaacctcccacgtgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtagacgtgagccaggaagaccccgatgtcaagttcaactggtacgtaaacggcgcggaggtgcatcatgcccagacgaagccacgggagacgcagtacaacagcacatatcgtgtggtcagcgtcctcaccgtcacgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacacgtgcaaggtctccaacaaagccctcccggtccccatccagaaaaccatctccaaagacaaagggcagccccgagagcctcaggtgtacaccctgcccccgtcccgggaggagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgtcgtggagtgggagaacagcgggcagccggagaacacctacaagaccaccccgcccgtgctggactccgacggctcctacttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag (서열번호 7); 및
아미노산 서열:
iktcgggskpptcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpdvkfnwyvngaevhhaqtkpretqynstyrvvsvltvthqdwlngkeytckvsnkalpvpiqktiskdkgqprepqvytlppsreeltknqvsltclvkgfypsdivvewensgqpentykttppvldsdgsyflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq (서열번호 8).
완전한 히말라야 원숭이 TL1A-Ig 융합 단백질의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
DNA 서열:
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac ctcgag ataaaaacatgtggtggtggcagcaaacctcccacgtgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtagacgtgagccaggaagaccccgatgtcaagttcaactggtacgtaaacggcgcggaggtgcatcatgcccagacgaagccacgggagacgcagtacaacagcacatatcgtgtggtcagcgtcctcaccgtcacgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacacgtgcaaggtctccaacaaagccctcccggtccccatccagaaaaccatctccaaagacaaagggcagccccgagagcctcaggtgtacaccctgcccccgtcccgggaggagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgtcgtggagtgggagaacagcgggcagccggagaacacctacaagaccaccccgcccgtgctggactccgacggctcctacttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag gaattc aaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgacacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggacccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctccttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 9); 및
아미노산 서열:
metdtlllwvlllwvpgstgd le iktcgggskpptcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpdvkfnwyvngaevhhaqtkpretqynstyrvvsvltvthqdwlngkeytckvsnkalpvpiqktiskdkgqprepqvytlppsreeltknqvsltclvkgfypsdivvewensgqpentykttppvldsdgsyflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq ef kgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvtqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgpmfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 10).
위의 완전한 융합 단백질 서열(DNA 및 아미노산) 각각에서, 이탤릭체 및 밑줄친 잔기는 마우스 카파 리더 서열에 상응하고; 굵은 이탤릭체 글씨는 제한 효소 클로닝 부위에 상응하고; 일반 글씨는 히말라야 원숭이 IgG1 힌지-CH2-CH3 서열에 상응하고; 그리고 밑줄친 글씨는 히말라야 원숭이 TL1A 세포외 영역 서열에 상응한다.
인간 TL1A-Ig 융합 단백질의 TL1A 부분의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
핵산 서열:
cgggcccagggagaggcctgtgtgcagttccaggctctaaaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgagacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggagccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctctttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 11); 및
아미노산 서열:
raqgeacvqfqalkgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvrqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgamfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 12).
인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 서열의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
핵산 서열:
tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (서열번호 13); 및
아미노산 서열:
cdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (서열번호 14).
완전한 hTL1A-Ig 융합 단백질의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
핵산 서열
tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa gaattc cgggcccagggagaggcctgtgtgcagttccaggctctaaaaggacaggagtttgcaccttcacatcagcaagtttatgcacctcttagagcagacggagataagccaagggcacacctgacagttgtgagacaaactcccacacagcactttaaaaatcagttcccagctctgcactgggaacatgaactaggcctggccttcaccaagaaccgaatgaactataccaacaaattcctgctgatcccagagtcgggagactacttcatttactcccaggtcacattccgtgggatgacctctgagtgcagtgaaatcagacaagcaggccgaccaaacaagccagactccatcactgtggtcatcaccaaggtaacagacagctaccctgagccaacccagctcctcatggggaccaagtctgtgtgcgaagtaggtagcaactggttccagcccatctacctcggagccatgttctccttgcaagaaggggacaagctaatggtgaacgtcagtgacatctctttggtggattacacaaaagaagataaaaccttctttggagccttcttactatag (서열번호 15); 및
아미노산 서열
cdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk ef raqgeacvqfqalkgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvrqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgamfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll (서열번호 16).
위의 완전한 융합 단백질 서열(인간 핵산 및 아미노산 서열) 각각에서, 굵고 이탤릭체로 나타낸 잔기는 제한 효소 클로닝 부위에 상응하고, 제한 효소 클로닝 부위 앞에 나타나는 잔기(일반 글씨)는 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 서열에 상응하고, 그리고 제한 효소 클로닝 부위 다음의 잔기(밑줄친 글씨)는 인간 TL1A 세포외 영역 서열에 상응한다.
뮤린 TL1A 융합 단백질 또한 구축되었다. 뮤린 융합 단백질의 구축 방법, 그리고 기능적 특성화는 Khan, S.Q., et al. (2013) "Cloning, expression, and functional characterization of TL1A-Ig." J Immunol 190:1540-1550에 구체적으로 기술되어 있고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 도입된다.
세포 배양
NIH-CHO 세포의 형질감염은 표준 전기천공 및 지질-기반의 형질감염 방법을 사용하여 수행하였다. 형질감염된 세포를 적절한 항생제(히그로마이신)로 선택하고, 제한 희석 단일-세포 클로닝 기술로 추가 선택하여 고-역가 생산 클론을 확인하였다. 선택된 클론을 다음에 혈청을 끊고 무혈청 조건에서 성장하도록 조정하였다. 무혈청 배지에서 성장하는 안정적인 클론을 다음에 융합 단백질 제조를 위해 중공-섬유 카트리지 시스템에 적재하였다. NIH-CHO-hTL1A-Ig 세포를 OPTI-CHO 배지에 유지하고 hTL1A-Ig를 포함하는 세포 배양 상등액을 수집하였다. hTL1A-Ig의 정제는 표준 배지를 사용하여 단백질 A 또는 단백질 G와 결합시킴으로써 수행하고, 기본 용출 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출하여 융합 단백질의 적절한 기능성을 유지하도록 하였다. 산성 완충액 용출은 기능적 활성을 파괴하므로, 기본 완충액으로 용출하는 것은 필수적이다. 용출 후, 단백질 분획을 모으고 IgG 테일의 검출을 위해 표준 단백질 분석(Bradford) 및 특이적 ELISA 분석 둘 다를 사용하였다. 정제된 단백질을 다음에 PBS로 투석하고 -80℃에서 저장하였다.
시약, 항체 및 유동세포분석법
유동세포분석법, ELISA 및 생체내 연구에 사용하기 위한 시판 항체는 BD Pharmingen, eBioscience 또는 BioLegend로부터 구입하였다. 아메리칸 햄스터 IgG 동형 대조군은 eBioscience로부터 구입하였다. 마우스 TNFRSF25(4C12, 효능적)에 대한 항체를 생산하는 아메리칸 햄스터 하이브리도마를 Fang, et al. 2008. Essential role of TNF receptor superfamily 25 (TNFRSF25) in the development of allergic lung inflammation. J Exp Med 205:1037-1048에 기술된 바와 같이 생성하였다. 간단하게는, 4C12, hTL1A-Ig 및 rmTL1A-Ig를 중공 섬유 생물반응기 (Fibercell Systems, Frederick, MD)에서 생산하고 단백질 G(4C12) 또는 단백질 A (TL1A-Ig) 컬럼(GE Healthcare, UK)에서 무혈청 상등액으로부터 정제하였다. 유동세포분석을 위해, 단일 세포 현탁액을 비장 및 림프절로부터 제조하였다. 106 세포를 항-마우스 CD16/CD32로 전-차단하고 다른 항체 조합으로 염색하였다. 세포내 염색은 표준 공정에 따라 수행하였다. 유동세포분석 포착은 Becton Dickinson Fortessa 기기에서 수행하고 FACSDIVA 또는 FlowJo 소프트웨어를 분석에 사용하였다.
웨스턴 블롯
4-12% SDS-PAGE 겔을 웰 당 10-40 ng 적재하고, 표준 완충액 및 전압을 사용하여 겔 작동, 표준 방법을 사용하여 PVDF 멤브레인으로 전사 및 a-hIgG-HRP를 사용한 1-단계 염색에 이어서 피코 또는 펨토 알칼리 포스파타제 기반의 검출 시약 (Pierce)을 사용하여 검출하는 것을 포함하는 표준 방법을 사용하였다.
카스파제 검출 분석
인간 TNFRSF25(hTNFRSF25)를 클로닝하고 p815 세포(ATCC로부터 입수)를 형질감염시키는 데 사용하였다. 표준 전기천공 또는 지질 기반의 형질감염 방법을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 p815 세포를 증가하는 농도의 정제된 hTL1A-Ig(1　pg/mL - 1 ㎍/mL)와 공동-배양하고 제조자 프로토콜(Roche, Caspase 3 Activity Assay, Product 12012952001)에 따라 카스파제 검출 분석을 수행하였다.
T 세포 증식 분석
이들 분석은 Khan et al. J Immunol. 2013 Feb 15;190(4):1540-50에 기술된 바와 같이 수행하였다.
인간화된 마우스의 생성
인간 태아 간을 선택적 중절(수태령 12-20 주, Advanced Bioscience Resources)로부터 서비스 기준 비용으로 입수하였다. CD34+ 세포를 제조자의 지침에 따라 면역자기성 비드를 사용하고 이어서 단일 세포 현탁액의 밀도 구배 원심분리로 강화하였다(CD34+ 선택 키트; Miltenyi Biotec, Auburn, CA). 단리된 CD34+ 세포의 순도를 유동세포분석법으로 평가하였으며 >85%였다. 세포를 부분 표본하여 이후의 HLA형 분류를 위해 동결하고 준-치사량으로 조사된 신생 NSG 마우스로 이식하였다. HLA형 CD34+ 세포 조혈모세포(HSC)를 IMDM 중 10% 인간 혈청, 10 ng/mL 각 인터류킨(IL)-3, IL-6 및 줄기세포 인자(SCF)를 포함하는 배지에 3-5일 동안 방치하였다. 이식 날에, 세포를 배양 접시로부터 수확하고 HBSS에서 세척하여 CFU 및 LTC-IC 분석을 수행하여 증식 및 분화 포텐셜을 평가하였다. 이들 분석은 제조자에 의해 발표된 방법 및 표준 시약(StemCell Inc.)을 사용하여 수행하였다. CFU 포텐셜은 SCF, GM-CSF, IL-3 및 EPO로 보충된 메틸셀룰로스 배지에서 14일 배양 후 골수 전구 세포와 동일하였다. 이들 분석은 단리된 HSC의 총 형태적 특징 및 콜로니 수가 예상된 범위 내에 있는지 여부를 용이하게 밝혀준다. 시기를 정한 교배로부터 발생된 1일령의 NSG 마우스를 24 시간 후-조사(준-치사량, 1 Gy, 전신 조사) 동안 포스터-댐에 수용하였으며, 이 시기에 1x106 - 2x106 예비-배양된 HSC를 20 μL의 용량으로 해밀턴 시린지 및 30 게이지 ½ 인치 바늘을 사용하여 간내(i.h.) 이식하였다. 새끼들을 즉시 포스터-댐으로 돌려보내고 28일에 이유시까지 수유를 허용하였다. 인간/마우스 키메라현상을 15 주령에 말초 혈액에서 유동세포분석법으로 뮤린 및 인간 CD45+ 세포의 상대적 백분율을 측정함으로써 평가하였다. 먼저 인간 CD45+ 세포를 검출하고, 모든 혈액 수집물에서 인간 CD3, CD4, CD8, CD11c 및 CD19를 포함하도록 분석을 확장하였다. 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 분획이 60%(NSG-hu)를 초과할 때 성공적으로 이식된 마우스를 선택하였다.
히말라야 원숭이에서 TL1A-Ig의 안전성 및 활성
비-인간 영장류(NHP)(인도-기원의 히말라야 원숭이)에서 TL1A-Ig의 안전성 및 효능을 측정하였다. 일상적인 스크리닝 및 60-일 격리 후, 히말라야 원숭이(rm) TL1A-Ig 또는 인간(h)TL1A-Ig를 NHP에게 0일에 정맥내(IV) 볼루스 주입(15 분)으로 투여하였다. 동물 체중 및 케이지-측 관찰을 매일 수행하고 완전 혈구 측정, 일상적 화학검사, CD4 TruCounts, 혈청 단리 및 유동세포분석을 위해 말초 혈액을 수집하였다. 유동세포분석을 위해, 말초 혈액 세포를 Countess 자동 세포 계수기에서 계수하고 1.5x106 세포의 부분 표본을 샘플 튜브, FMO(Fluorescent Minus One), 대조 및 보정 튜브에 분배하였다. 시험 샘플을 D-PBS 및 0.5% FBS에서 1 μL/mL 라이브 데드 아쿠아 블루 판별기(Life Technologies)로 염색하였다. 시험 샘플 및 적절한 대조군을 표시된 항체 칵테일(BD, Becton Dickinson, eBioscience or Life Technologies로부터 구입)로 30 분 동안 표면 염색하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 Fix/perm 용액(eBioscience)으로 30 분 동안 4℃에서 투과성으로 하였다. 세포를 세척하고 항-FoxP3 항체로 30 분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 세척하고 BD™ LSRII 유동세포분석기(Beckton Dickinson (BD))에서 포착을 위해 300 μL FACs 세척 완충액에 재현탁하였다. 세포를 수득하고 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR) 분석을 수행하였다. CD4/CD8 트루카운트를 위해, CD45, CD3, CD4 및 CD8 항체를 TruCount 튜브(BD, Cat.No. 340334)에 분산시키고; 50 μL 샘플을 추가하여 15 분 동안 실온 암소에서 염색되도록 하였다. 계속해서, 샘플을 450 μL FACS 용해액으로 용해하고 15 분 동안 배양하였다. 샘플 튜브를 세포분석기 (Calibur, BD)에서 분석하였다. 이벤트를 사이드 스캐터(SSC) 도트 플롯으로 림프구에서 게이팅하고 CD45-양성 집단을 선택한 다음, 보고하였다: CD3+CD4+ T 세포, 및 CD3+CD8+T 세포. 혈청 사이토카인의 다중 분석을 위해, 지시된 일자의 혈청을 수집하고 표준 곡선을 위해 샘플 및 대조군을 필터 플레이트에 놓고 ¼ 희석하여 2 시간 동안 실온에서 항-사이토카인 비드와 함께 배양하였다. 각각의 웰에 비오틴화된 검출 항체를 혼합하기 전에 내용물을 제거하고 완충액으로 2회 세척하였다. 검출 항체와 1 시간 동안 배양한 후, 플레이트를 2 회 세척하고 스트렙타비딘-PE와 30 분 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하고 150 μL 시스 액으로 웰을 재현탁하고; 다음에 플레이트를 Luminex® SD 분석기(Life Technologies, Inc.)에서 판독 및 분석하였다. PE 신호(중앙 형광 강도, MFI)는 샘플에 존재하는 각각의 사이토카인의 양과 비례하고; 농도는 표준 곡선으로부터 계산하였다.
통계적 분석
모든 그래프작업 및 통계적 분석은 ABI Prism® 프로그램(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 쌍을 이룬 분석은 Student's t-test를 사용하여 수행하였다. 2 개 조건 보다 많은 조건의 분석은 one-way ANOVA with Tukey's post-hoc test를 사용하여 수행하였다. 유의성은 도면을 통해 *　(p<0.05); ** (p<0.01); 및 *** (p<0.001)로 표시하였다.
실시예 2: 동족 항원-의존성 Treg 증식
이 실시예는 TNFRSF25에 의해 자극된 Treg 증식이 동족 항원에 의존하는 것을 보여준다.
Schreiber, T.H., et al. 2012. Oncoimmunology 1:642-648에 기술된 바와 같이, CD4-/- 마우스를 CD4+FoxP3GFP+(tTreg)의 혼합 집단으로 양자 전달된 마우스 모델을 이용하였는데, 이는 자기 항원에 특이적이고 오브알부민(ova)-특이적 CD4+Vα2+Vβ5+FoxP3RFP-(OTIIconv, OT-II 마우스를 FIR 마우스와 이종교배하여 생성)이다. 이 모델은 도 1에 도식적 개요로 나타낸다. 이 연구에서, tTreg는 내인성(생식세포 계열 코딩된) 자기 항원을 인식하는 모든 흉선-유래의 Treg 세포를 포함하는 것으로 추정된다. pTreg은 FoxP3을 발현하지 않고 흉선을 나온 말초 T 세포로부터 발생한 모든 Treg를 포함하는 것으로 추정되고, 따라서 외래(비-생식세포 계열 코딩된) 항원을 인식하는 것으로 추정된다. 따라서, pTreg는 규칙적으로 위장관, 피부 및 폐를 포함하는 내인성 환경적 또는 미생물 항원을 만나는 조직에서 면역 반응의 조절에 중요한 것으로 추정된다. OT-IIconv는 외래 항원 오브알부민("ova")에 특이적인 MHC 클래스 II 제한된 T 세포 수용체를 발현하는 유전자 이식된 마우스로부터 유래된 세포이다. 이들 세포는 CD4의 발현 및 FoxP3의 비-발현을 기반으로 OT-II 유전자 이식된 마우스로부터 단리되었다.
음용수 중 0.5% 오브알부민을 5-일 경구 투여한 후, 마우스를 IgG 동형 대조군 항체 또는 TNFRSF25 효능적 항체, 클론 4C12로 처리하였다. 5일 후, 비장세포 및 장간막 림프절(mLN) 세포를 수확하여 OT-II pTreg 세포 및 FoxP3-RFP 양성 nTreg 세포를 분석하였다. 이 모델은, 각각 FoxP3GFP 및 FoxP3RFP 발현을 기반으로 우세하게 자기-항원 특이적 tTreg이 OVA-특이적 pTregOTII로부터 구분될 수 있는 다루기 쉬운 모델을 제공하였다.
다른 실험에서는, 음용수 중 0.5% 오브알부민을 5-일 경구 투여한 후, 위와 같이 tTreg 및 OTIIconv의 혼합된 집단이 양자 전달된 CD4-/- 마우스를 IgG 동형 대조군 항체 또는 TNFRSF25 효능적 항체, 클론 4C12로 처리하였다. 도 2에서는, mLN 및 비장에서 증식(Ki67+) 중인 OT-II-iTreg 세포 및 nTreg 세포의 집단을 보여준다. 6.6 ± 1.6%의 비장 OTIIconv이 FoxP3RFP를 발현하도록 유도되고 pTregOTII로 되었다. 별개의 실험에서, mLN(도 3) 및 비장(도 4)에서 OT-II iTreg 세포 또는 nTreg 세포 증식의 항원-의존성을 결정하기 위해, 표시된 날짜 수 동안 음용수 중 1% ova를 지속하거나(좌측 패널) 정상적인 물로 교체하여 오브알부민(ova)을 '제거'하였다(우측 패널). 표시된 처리 기간((0, 10 또는 20일) 후, 그룹들을 IgG 동형 대조군 항체 또는 4C12 항체로 처리하고 각 조직에서 5일 후 OT-II iTreg 세포 및 nTreg 세포를 위와 같이 분석하여 FoxP3+Ki67+ 세포의 백분율을 결정하였다. 오브알부민의 경구 투여로 pTregOTII의 유도 후, 각각의 케이지를 오브알부민-함유 음용수로 유지하거나, 정상적인 물로 바꾸어 동족 항원 유용성과 TNFRSF25 자극에 대한 감도 사이의 관계를 결정하였다.
항원 제거(0일) 전 TNFRSF25 효능적 항체의 투여는 모든 마우스에서 pTregOTII 및 tTreg 둘 다의 증식을 유도하였다(도 3). 모든 그룹에서, tTreg에 대한 동족 '자기' 항원의 지속적인 유용성 때문에 tTreg의 증식은 내부 대조군으로서 작용하였다. 오브알부민 항원 제거 10일 후("ova 제거 일수"), pTregOTII은 4C12의 투여 후 계속 증식하였는데, 이는 오브알부민이 음용수로부터 제거 후 적어도 10일 동안 지속되는 것을 나타낸다. 그러나, 오브알부민 항원 제거 20일 후에는, 장간막 림프절(도 3)과 비장(도 4) 둘 다에서 tTreg의 계속적인 증가에도 불구하고, 4C12의 투여 후 pTregOTII의 증식이 관찰되지 않았다. ova를 함유하는 음용수가 같은 20일 기간 동안 제공된 경우, pTregOTII는 두 조직(mLN 및 비장)에서 4C12에 반응하여 계속 증식하였다. 이들 데이터는 동족 항원의 제거가 4C12 자극된 증식에 대한 pTregOTII의 반응성을 저해하여, 항원-특이적 반응임을 보여주었다.
실시예 3: 인간 TL1A-Ig는 인간화된 마우스에서 인간 tTreg의 증식을 자극
이 실시예는 인간 TL1A-Ig 융합 단백질이 인간 Tregs의 강한 증식을 전신적으로, 그리고 인간화된 마우스의 점막에서 유도하는 것을 보여준다.
위에 기술된 바와 같이, 인간 TL1A의 세포외 영역 및 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 영역을 포함하는 융합 단백질을 클로닝하고 세포-배양 상등액으로부터 정제하였다. 단량체 및 다량체 hTL1A-Ig 복합체를 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 5). 인간 TL1A-Ig(hTL1A-Ig)의 생체외 활성을 카스파제 검출 분석을 사용하여 나타내었는데, 여기에서는 p815 세포로 형질감염된 인간 TNFRSF25(hTNFRSF25)가 증가하는 농도의 정제된 hTL1A-Ig와 공동-배양되었다(도　6).
인간 Treg에 대한 hTL1A-Ig의 생체내 활성을 결정하기 위해, 위에 기술된 바와 같이 NOD, SCID, 통상의 γ-사슬 결핍(NSG) 수용자 마우스로 인간 태아 간 CD34+ 세포를 전달하였다. 실험 마우스(NSG-hu)에 인간 CD45+ 세포 이식은 모든 마우스에서 15주령에 비장세포에서 ≥60% 키메라현상 및 림프절에서 ≥90% 키메라현상을 보여주었다. 비장에서 인간 CD45+ 림프구의 대부분은 T 세포(~50%)였고, 다음에 B 세포(~35%), NK 세포(~2-3%) 및 수지상 세포(~1%)였다.
hTL1A-Ig의 투여는 주사 후 5일에 분석한 수용자 마우스의 비장, 림프절, 또는 소장 어디에서도 hCD45+, hCD4+ 또는 hCD8+ 세포의 전체적인 균형을 유의성 있게 변경시키지 않았다(도 7-9). 그러나, 전체 CD4+CD25hiCD127- 세포 중 FoxP3+ 세포의 백분율로서의 인간 Treg 세포의 분석은, 비장, 림프절 및 소장에서 투여 후 5일에 능동적 증식(Ki67+)에서 Treg의 비율 및 Treg의 전체 빈도 둘 다에서 유의성 있는 증가를 나타내었다(도 7-9). 비장에서, 평균 Treg 값(±SEM)은 대조군에서 0.72 ± 0.11%이고 hTL1A-Ig에서는 1.71± 0.24%이다(도 7). 림프절에서, 대조군의 평균 Treg 값은 0.91 ± 0.12인 한편 hTL1A-Ig에서는 1.94 ± 0.21이었다(도　8). 소장에서, 평균 Treg 값(±SEM)은 대조군에서 1.56 ± 0.31%이고 hTL1A-Ig 처리군은 4.54 ± 0.69%이다(도 9). 표현형으로, Treg 세포는 주로 중심 기억(CCR7+CD45-RA-; ~ 70-80%) 표현형을 갖는 한편, 비-Treg 세포는 주로 나이브 (CCR7+CD45-RA+; ~ 70-80%) 표현형을 보여준다. 통상의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 발현되는 활성화 표지(CD25, CD69)의 분석은 hTL1A-Ig 처리된 NSG-hu의 림프절에서는 아니지만 비장에서는 CD4+(p=0.0363) 및 CD8+(p=0.0064) 통상의 세포 둘 다에서 CD69의 증가된 발현을 나타내었다. 이들 데이터는 hTL1A-Ig이 인간 Tregs의 강한 증식을 전신적으로, 그리고 인간화된 마우스의 점막에서 유도하는 것을 나타내었다.
Khan, S.Q. et al. (supra)에 구체적으로 기술된 바와 같이, 유사한 결과가 뮤린 융합 단백질을 사용하여 얻어졌다.
실시예 4: 히말라야 원숭이에서 TL1A-Ig의 안전성 및 활성
이 실시예는 TL1A-Ig가 인간화된 마우스 및 영장류에서 동족 Treg 세포의 증식을 생체내에서 안전하고 선택적으로 자극할 수 있다는 것을 보여준다.
설치류 동물 모델의 내재적 제한은 무균 조건 하에서 교배되고 사육되는 실험 동물의 고도로 제어되고 한정된 외래 항원 도전 이력과 관련된다. TNFRSF25 효능제의 항원-의존성 활성을 고려하면, 이러한 제한은 이들 약제의 NHP로의 번역 연구에서 중요한 결과를 갖는데, 여기에서 외래 항원 노출의 이력은 보다 극적으로 다양하다. 이러한 의문을 다루기 위해, 히말라야 원숭이 TL1A-Ig(rmTL1A-Ig)가 NHP에서 생산되고 시험되었다. 미처리 인도-기원 히말라야 원숭이(비인간 영장류(NHP))는 Advanced Bioscience Laboratories(ABL, Rockville, MD)에서 입수, 수용 및 숙련된 요원에 의해 처리되었다. 히말라야 원숭이 TL1A-Ig(rmTL1A-Ig) 및 인간(h)TL1A-Ig를 위에 기술된 바와 같이 제조 및 정제하고 전체 용적 10 mL PBS으로 희석하여 블라인드 처리된 튜브에 표시된 농도로 ABL 요원에게 배송하였다. 60-일 격리를 마친 후, 기준 완전 혈구 측정(CBC) 및 혈청 화학분석을 예정된 rmTL1A-Ig 및 hTL1A-Ig의 정맥내 주사 14일 전에 얻었다. 2 마리 동물은 0.5 mg/kg rmTL1A-Ig을 받고, 4 마리 동물은 1.5 mg/kg rmTL1A-Ig을 받고, 그리고 2 마리 동물은 1.5 mg/kg hTL1A-Ig를 본 연구 0일에 단일 IV 주사로 받았다. 연구 21일에 희생시킨 동물로부터 조직의 조직병리와 함께, TL1A-Ig 반감기, Treg 팽창, Tconv 서브셋 및 활성화 분석 및 사이토카인 프로파일을 21일 실험 과정에 걸쳐 순차적 혈액 드로에 의해 모니터링하였다.
어느 NHP에서도 주사 직후 12 시간이나 이 연구 나머지 동안에 급성 독성이 관찰되지 않았다. 매일의 케이지-측 관찰에서는 이 연구의 과정에 걸쳐 모든 NHP의 정상적인 행동이 주목되었으며, 천명, 경면, 설사, 구토, 아나필락시스, 피부 발진 또는 자극, 말초 부종, 관절 삼출 또는 점막 분비의 증거는 없었다. 이 연구의 과정에 걸쳐 어느 NHP에서도 설사 또는 체중 감소가 관찰되지 않았다(도 10). 혈청 화학분석은 전해질 농도: 나트륨, 칼륨, 인산염, 염화물, 칼슘, 포도당, 크레아티닌, 혈액 요소 질소, 총 혈청 단백질, 알부민, 총 콜레스테롤 또는 글로불린에서 변화를 나타내지 않았다. 완전 혈구 측정은 처치 후 첫날에 총 백혈구(도 11A) 및 호중구(도 11B)에서 증가를 나타냈지만, 총 헤모글로빈, 헤마토크리트, 총 적혈구, MCV, MCH, 혈소판, 림프구, 단핵구, 호산구 또는 호염기구에서는 이 연구의 과정에 걸쳐 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 간 효소 패널은 알칼리 포스파타제, 총 빌리루빈 또는 ALT에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 그러나, 모든 동물에서, AST 및 크레아티닌 포스포키나제의 대략 10-배의 증가가 처치 후 첫날에 관찰되었는데, 이러한 증가는 처치 프로토콜 전 마취제의 근육내 주사 후 NHP에서 일상적으로 관찰된다. AST 및 CPK의 농도는 모든 동물에서 연구 4일까지는 기준선으로 돌아왔다.
순차적으로 수집한 혈청 샘플의 분석은 NHP에서 hTL1A-Ig는 일-단계 지수함수형 붕괴 모델을 사용하여 계산된 12.5 시간의 반감기를 나타내었다(도 12). 기준선(0일), 2일 및 피크 Treg 팽창 시기(4일)에서 혈청 사이토카인의 다중 분석(Luminex®)은, 처리 후 4일까지 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 또는 TNF-α의 농도에서 어떠한 검출 가능한 변화도 나타내지 않았고 IFN-γ 및 TGF-β의 농도가 감소되는 경향을 나타냈다(도 13). 유동세포분석법에 의한 말초 혈액 Treg 세포의 분석은 인간화된 마우스와 비교하여 히말라야 원숭이에서 거의 일치하는 상대적 크기 및 동력학의 생체내 Treg 팽창을 나타내었다(도 14). 상대적 배수-팽창은 Treg 구획의 대략 3-배 팽창으로 처리 후 4일에 피크였다. 유사한 반응은 1.5 mg/kg의 rmTL1A-Ig 및 hTL1A-Ig 둘 다를 사용하여 관찰되었으며, 0.5 mg/kg rmTL1A-Ig 용량에서는 Treg 팽창의 감소 경향을 나타내었으나 유의성은 없었다.
CD4+ 및 CD8+ Tconv 세포 활성화를 모니터링하기 위해, 나이브 (CCR7+CD28+CD95-), 중심 기억(CCR7+CD28+CD95+), 작동체 기억(CCR7-CD28-CD95+) 및 일시적 작동체 기억(CCR7-CD28+CD95+) T 세포 서브유닛을 말초 혈액에서 실험 과정에 걸쳐 모니터링하였다. 분석은 CD8 나이브, 중심 기억, 작동체 기억 또는 일시적 작동체 기억 T 세포 구획에서는 유의성 있는 변동을 나타내지 않았다. CD4 구획 내에서, 연구 11일까지 말초 혈액 나이브 CD4 세포의 빈도에서 유의성 있는 감소가 있었는데, 이는 다음에 15일까지 신속하게 기준선까지 튀어올랐다(도 15). 비록 유의성은 없지만, 연구 11일까지 CD4 중심 기억의 빈도가 증가하는 경향이 있었는데, 이는 절대 세포수로 조정할 때 변화를 나타내지 않았으며; 이러한 상대적 차이는 아마도 중심 기억 세포에 대한 증식 효과 보다는 나이브 세포에서의 상대적 감소와 관련된 것임을 나타낸다.
비록 TL1A-Ig 투여 직후 염증성 사이토카인의 농도 증가 또는 CD4+ 또는 CD8+ 작동체 T 세포 활성화의 증거는 없었지만, 준-임상적 면역병리의 징후가 개별 조직에서 존재할 수 있을 가능성이 남아있다. 개별 조직 내에서 면역병리의 징후를 조사하기 위해, rmTL1A-Ig(1.5 mg/kg)를 받은 2 마리 동물 및 hTL1A-Ig(1.5 mg/kg)을 받은 2 마리 동물을 연구 21일에 부검 및 말단-기관 조직병리를 위해 선택하였다. 중뇌, 뇌간, 간 및 췌장의 헤마톡실린 및 에오신 염색된 절편 분석에서는 어떤 분석된 동물에서도 염증 또는 병리의 증거를 나타내지 않았다. 한 동물에서는, 폐 절편에 최소의 다초점 혈관주변 림프구 집합의 증거를 나타내었으며, 나머지 3 마리 동물은 본질적으로 정상적인 폐 조직으로 해석되었다. 2 마리 동물에서, 털이 있는 피부의 절편에 경도 내지 중등도 면적의 초점이 있는 심각한 피부 부종을 나타내었으며, 나머지 2 마리 동물은 본질적으로 정상적인 피부 조직으로서 해석되었다. 4 마리 동물 중 3 마리에서, 공장 절편에 경도의 확산된 점막하 부종의 증거가 나타났다. 4 마리 동물 중 4 마리에서, 말단 회장의 절편이 경도의 확산성 점막 및 점막하 부종의 증거를 나타냈다. 4 마리 동물 중 4 마리에서, S형 결장의 절편에서 경도의 다초점 림포형질세포성 침윤의 증거가 나타났다. 장간막 림프절 절편은 3 또는 4 마리 동물에서 본질적으로 정상적인 조직으로 해석되고, 한 동물은 경도의 확산성 림프구증가의 증거를 보였다.
함께, 이들 결과는 수용체 효능적 항체 및 리간드 융합 단백질에 의한 TNFRSF25의 자극이 인간 및 NHP Treg 세포의 생체내 조절을 위한 독특하고 특이적인 방법을 제공한다. Treg 자극의 동력학 및 특이성은 마우스, 히말라야 원숭이 및 인간-특이적 TL1A-Ig 처리 후 마우스, NSG-hu 및 NHP에서 현저하게 유사한데; 이는 동족 항원/TCR 맞물림, IL-2 수용체 및 Akt 활성화를 포함하는 내재된 기전이 마우스에서 보여준 바와 같이 인간에서도 보존되는 것을 나타낼 수 있다(Khan et al. (supra)). 말초 혈액에서 Treg 팽창의 피크 직후 나이브 CD4 T 세포의 감소가 NHP에서 관찰된 것은 CD4 나이브 세포의 생체내 억제의 증거를 나타낼 수 있다.
논의
실시예 2-4의 데이터는 TL1A-Ig이 마우스, NSG-hu 및 NHP에서 동족 Treg 세포의 증식을 생체내에서 안전하고 선택적으로 자극할 수 있는 분자라는 것을 나타낸다. 특히 관심 있는 것은, TL1A의 유전자 이식 발현이 IBD 감수성의 성향을 갖게 하는 것을 보여주는 뮤린 연구 및 인간에서 TL1A 다형을 IBD에 연결하는 역학적 데이터 둘 다에 기인하는 염증성 장 질환(IBD)에 대한 감수성 가능성이다. 장에서 내인성 '외래' 항원에 대한 내성이 특히 Treg의 면역억제 활성에 의존하기 때문에, NHP에서 TNFRSF25의 조절이 유사한 면역병리를 유도할 것임이 예상된다. 이 연구에서는 행동 변화, 설사 또는 체중 감소에 의해 나타나는 이러한 독성이 이들 연구 과정에 걸쳐 관찰되지 않았으며, 말초 혈액에서 염증성 사이토카인 생산 또는 확산성 작동체 세포 활성화의 어떠한 증거도 없었다. 말단-기관 조직병리는, 조직 면역병리의 명시적인 징후 없이, 말단 회장 및 S형 결장 내에서 림프양 세포의 경도의 축적만을 보여주었다.
실시예 5: TNFRSF25 효능제와 IL-2의 조합 요법
이 실시예는 TL1A-Ig 융합 단백질 또는 효능적 항-TNFRSF25 항체 4C12와 같은 TNFRSF25 효능제와, 낮거나 매우 낮은 용량의 IL-2의 조합이 생체내 Treg 세포의 팽창에 대한 상승 효과를 갖는다는 놀랍고도 예상치 못한 발견을 보여준다.
실험의 제1 세트에서, 야생형 마우스를 낮은 용량의 IL-2(300,000 단위/㎡), 대조군(IgG), TL1A-Ig(0.5 mg/kg)로 처리하거나, 또는 TL1A-Ig 및 단일 주사의 매우 낮은 용량 IL-2(30,000 단위/㎡)의 조합 치료, 또는 TL1A-Ig 및 단일 주사의 낮은 용량 IL-2(300,000 단위/㎡)의 조합 치료로 처리하였다. 총 CD4+ 세포 중 CD4+FoxP3+ 세포의 빈도를 표시된 날에 말초 혈액에서 모니터링하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, TL1A-Ig와 어느 한 용량의 IL-2(매우 낮은 용량 IL-2(30,000 단위) 또는 낮은 용량(300,000 단위))의 처리는 TL1A-Ig 또는 IL-2 단독 처리와 비교하여 Treg 세포 팽창에 대한 상승 효과를 가졌다. 예를 들어, 처리 후 5일에, FoxP3+ Treg 세포의 백분율은 TL1A-Ig로 처리된 마우스에서의 40% 및 낮은 용량 IL-2 단독으로 처리된 마우스에서의 20% 미만과 비교하여, TL1A-Ig와 낮은 용량 IL-2로 처리된 마우스에서 60%, TL1A-Ig와 매우 낮은 용량 IL-2로 처리된 마우스에서 50%였다. 이 상승 효과는 처리 후 6일에 Treg 세포의 빈도가, TL1A-Ig 또는 낮은 용량 IL-2 처리 후의 각각 25% 미만과 20% 미만과 비교하여, TL1A-Ig와 낮은, 또는 매우 낮은 용량 IL-2의 조합 치료 후 각각 55% 및 약 40%였을 때, 한층 더 현저하였다.
실험의 제2 세트에서, 야생형 마우스를 낮은 용량 IL-2(300,000 단위/㎡), 대조군(IgG), 4C12 항체(0.4 mg/kg)로 처리하거나, 또는 4C12 항체와 단일 주사의 낮은 용량 IL-2(300,000 단위/㎡)의 조합 치료로 처리하였다. 총 CD4+ 세포 중 CD4+FoxP3+ 세포의 빈도를 표시된 날에 말초 혈액에서 모니터링하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 4C12 항체와 낮은 용량 IL-2의 조합에 의한 치료는 Treg 세포의 팽창에 대한 극적인 상승 효과를 가졌다. 4C12/IL-2 조합으로 치료 후 6일에 Treg 세포의 빈도는, 각각 4C12 항체 또는 낮은 용량 IL-2만을 받은 마우스에서의 모든 CD4+ CD3+ 말초 혈액 세포의 약 30% 및 모든 CD4+ CD3+ 말초 혈액 세포의 20% 미만과 비교하여, 모든 CD4+ CD3+ 말초 혈액 세포의 약 70%였다.
위에 기술한 조합 요법으로 달성된 이 결과는 많은 이유에서 놀랍고도 예상치 못한 것이었다. 예를 들어: 1) TNFRSF25 효능제/IL-2 조합은 이전에는 Treg 세포를 팽창시키는 것을 보여주지 않은 용량의 IL-2(300,000 단위)에서 Treg 팽창을 달성하였다; 2) 이 조합 치료는 "낮은 용량" IL-2(30,000 단위)로 고려되었던 것보다 10-배 더 낮은 용량에서 Treg 팽창을 달성하였다; 그리고 3) Treg 팽창의 크기가 전례 없는 것이었다. 이는 CD4 구획에서 50% Treg 세포를 얻는 것(즉, 모든 CD4+ 세포의 50%가 Treg 세포)을 최초로 기술한 것으로 믿어지며, 4C12/낮은 용량 IL-2의 경우, 이 비율은 70%에 도달하였다. 더욱이, Treg 세포의 이렇게 높은 수치는 IL-2와의 조합 요법에서 TL1A-Ig 및 TNFRSF25 효능적 항체 둘 다를 사용하여 얻어졌으며, 이는 수용체 자체의 특성이고 특정 시약의 것이 아님을 나타낸다.
실시예 6: TL1A-Ig 및 라파마이신의 조합 요법
이 실시예는 TL1A-Ig 융합 단백질과 라파마이신의 조합이 동시적 작동체 T 세포 활성화를 제거하면서 생체내 Treg 세포 팽창을 보존하였다는 놀랍고도 예상치 못한 발견을 보여준다.
야생형 마우스를 -2일에 오브알부민 특이적 CD8(OT-I) 또는 CD4(OT-II) T 세포로 양자 전달하였다. 다음에 마우스를 대조군 IgG, TL1A-Ig(0.5 mg/kg) 및/또는 6-일 과정의 낮은 용량 라파마이신(75 ㎍/kg)와 함께, 수산화알루미늄("alum")-보조된 오브알부민으로 면역화시켰다. 총 CD8+ 세포 중 OT-I 세포, 총 CD4+ 세포 중 OT-II 세포의 빈도, 그리고 총 CD4+ 세포 중 CD4+FoxP3+ 세포(Treg cells)의 빈도를 18일에 걸쳐 유동세포분석으로 모니터링하였다.
도 18 및 19에 나타낸 바와 같이, 라파마이신이 포함된 치료 후 CD8+(OT-I) 및 CD4+(OT-II) 세포의 빈도는 현저하게 감소하였다. 그러나, 가장 현저한 것은 OVA/alum, TL1A-Ig, 및 라파마이신으로 처리 후 Treg 세포의 빈도가 영향을 받지 않았다는 것으로(도 20), 이는 라파마이신의 효과는 특이적으로 활성화된 T 작동체 세포에 대한 것이지 Treg 세포가 아님을 나타낸다.
이러한 발견은 놀라운 것이고 TNFRSF25 효능제(TL1A-Ig 융합 단백질, 그리고 다른 효능제, 예를 들어 4C12 항체와 같은)의 투여를 포함하는 요법이 라파마이신의 공동-투여로부터 혜택을 받아 CD4 및 CD8 T 작동체 세포의 원치 않는 활성화 및 팽창을 방지하는 것을 나타낸다.
예측 실시예 1: 인간 대상에게 인간 TL1A-Ig 융합 단백질의 투여
hTL1A-Ig 융합 단백질은 정맥내 투여를 위한 완충된 식염수에서 제형화된다. 위의 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조 및 단리된, 0.1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일 범위에서 증가되는 용량의 hTL1A-Ig 융합 단백질이 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수 일 전에 유도 약제로서 인간 환자에게 투여된다. 다음에 치료의 효능이 수 주의 기간에 걸쳐 순차적 혈액 드로에 의해 측정되는데, 여기에서는 Treg 세포, T 작동체(Teff) 세포 및 염증성 사이토카인의 빈도가 처리된 대상의 말초 혈액에서 측정된다. 이 치료의 장-기간 혜택 또한, 타크롤리무스 또는 다른 mTOR 저해제, 사이클로스포린 저해제 및 프레드니손 및 메틸프레드니손을 포함하는 스테로이드 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 면역억제 유지 요법의 조기 중단을 위한 능력을 기반으로, 처리되는 대상에서 측정된다.
초기 안정성 연구 또한 건강한 대상에서 수행될 수 있는데, 여기에서는 0.1-10 mg/kg/일 hTL1A-Ig가 완충된 식염수에서 정맥내로 투여된다. 다음에 hTL1A-Ig의 기능은 수 주의 기간에 걸쳐 순차적 혈액 드로에 의해 처리된 대상에서 측정되는데, 여기에서는 Treg 세포, Teff 세포 및 염증성 사이토카인의 빈도가 처리된 대상의 말초 혈액에서 측정된다.
예측 실시예 2: 인간 TL1A-Ig 융합 단백질 및 인터류킨-2의 조합 요법
hTL1A-Ig 융합 단백질은, 위의 실시예 1에서 제조 및 단리되어, 위의 예측 실시예 1에서 유효한 것으로 발견된 용량으로(예를 들어 0.1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일의 범위로) 정맥내 투여를 위해 완충된 식염수에서 제형화된다. hTL1A 융합 단백질은 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수 일 전에 유도 약제로서 인간 환자에게 투여된다. hTL1A-Ig 융합 단백질의 투여 1 또는 2일 전, 투여 당일, 또는 투여 1 또는 2일 후, 환자는 또한 제곱미터 당 낮은 용량(300,000 단위) 또는 매우 낮은 용량(30,000 단위) 또는 30,000 내지 300,000 단위 사이의 IL-2도 정맥내로 투여된다.
다음에, 이 치료의 효능이 수 주의 기간에 걸쳐 순차적 혈액 드로에 의해 측정되는데, 여기에서는 Treg 세포, T 작동체(Teff) 세포 및 염증성 사이토카인의 빈도가 처리된 대상의 말초 혈액에서 측정된다. 이 치료의 장-기간 혜택 또한, 타크롤리무스 또는 다른 mTOR 저해제, 사이클로스포린 저해제 및 프레드니손 및 메틸프레드니손을 포함하는 스테로이드 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 면역억제 유지 요법의 조기 중단을 위한 능력을 기반으로, 처리되는 대상에서 측정된다.
예측 실시예 3: TNFRSF25 효능제 및 라파마이신의 조합 요법
예를 들어, 위의 실시예 1 및 3에 기술된 인간 TL1A-Ig 융합 단백질, 또는 항-TNFRSF25 항체는 위의 실시예 1에서 제조 및 단리되어, 유효 용량으로(예를 들어, TL1A-Ig 융합 단백질의 경우 위의 예측 실시예 1에서 유효한 것으로 발견된 용량(예를 들어 0.1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일의 범위로) 정맥내 투여를 위해 완충된 식염수에서 제형화된다. 인간 TL1A 융합 단백질 또는 항-TNFRSF25 항체는 고형 기관 또는 줄기세포 이식 수 일 전에 유도 약제로서 인간 환자에게 투여된다. TNFRSF25 효능제의 투여 1 또는 2일 전, 투여 당일, 또는 투여 1 또는 2일 후, 환자는 또한 체중 kg 당 75 내지 300 마이크로그램 사이의 용량으로 라파마이신이 투여된다.
다음에, 이 치료의 효능이 수 주의 기간에 걸쳐 순차적 혈액 드로에 의해 측정되는데, 여기에서는 Treg 세포, T 작동체(Teff) 세포 및 염증성 사이토카인의 빈도가 처리된 대상의 말초 혈액에서 측정된다. 이 치료의 장-기간 혜택 또한, 타크롤리무스 또는 다른 mTOR 저해제, 사이클로스포린 저해제 및 프레드니손 및 메틸프레드니손을 포함하는 스테로이드 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 면역억제 유지 요법의 조기 중단을 위한 능력을 기반으로, 처리되는 대상에서 측정된다.
본 발명의 많은 구현예가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 정수 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 모든 값은 근사치이고, 설명을 위해 제공됨이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예도 첨부되는 청구범위의 범위 내에 있다.
<110> Podack, Eckhard R. Schreiber, Taylor H. Khan, Samia Q. <120> Compositions and Methods for the Regulation of T Regulatory Cells Using TL1A-Ig Fusion Protein <130> 37405-0005WO1 <150> 61/750,672 <151> 2013-01-09 <150> 61/753,634 <151> 2013-01-17 <150> 61/842,127 <151> 2013-07-02 <150> 61/843,558 <151> 2013-07-08 <160> 16 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggccgagg atctgggact gagctttggg gaaacagcca gtgtggaaat gctgccagag 60 cacggcagct gcaggcccaa ggccaggagc agcagcgcac gctgggctct cacctgctgc 120 ctggtgttgc tccccttcct tgcaggactc accacatacc tgcttgtcag ccagctccgg 180 gcccagggag aggcctgtgt gcagttccag gctctaaaag gacaggagtt tgcaccttca 240 catcagcaag tttatgcacc tcttagagca gacggagata agccaagggc acacctgaca 300 gttgtgagac aaactcccac acagcacttt aaaaatcagt tcccagctct gcactgggaa 360 catgaactag gcctggcctt caccaagaac cgaatgaact ataccaacaa attcctgctg 420 atcccagagt cgggagacta cttcatttac tcccaggtca cattccgtgg gatgacctct 480 gagtgcagtg aaatcagaca agcaggccga ccaaacaagc cagactccat cactgtggtc 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acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaagaattc cgggcccagg gagaggcctg tgtgcagttc 720 caggctctaa aaggacagga gtttgcacct tcacatcagc aagtttatgc acctcttaga 780 gcagacggag ataagccaag ggcacacctg acagttgtga gacaaactcc cacacagcac 840 tttaaaaatc agttcccagc tctgcactgg gaacatgaac taggcctggc cttcaccaag 900 aaccgaatga actataccaa caaattcctg ctgatcccag agtcgggaga ctacttcatt 960 tactcccagg tcacattccg tgggatgacc tctgagtgca gtgaaatcag acaagcaggc 1020 cgaccaaaca agccagactc catcactgtg gtcatcacca aggtaacaga cagctaccct 1080 gagccaaccc agctcctcat ggggaccaag tctgtgtgcg aagtaggtag caactggttc 1140 cagcccatct acctcggagc catgttctcc ttgcaagaag gggacaagct aatggtgaac 1200 gtcagtgaca tctctttggt ggattacaca aaagaagata aaaccttctt tggagccttc 1260 ttactatag 1269 <210> 16 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 16 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Glu Phe Arg Ala Gln Gly Glu Ala Cys Val Gln Phe 225 230 235 240 Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr 245 250 255 Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val 260 265 270 Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu 275 280 285 His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn 290 295 300 Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile 325 330 335 Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile 340 345 350 Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly 355 360 365 Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr 370 375 380 Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn 385 390 395 400 Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe 405 410 415 Phe Gly Ala Phe Leu Leu 420

Claims (9)

  1. (i) (a) C 말단에서 서열번호 12의 아미노산 60-251로 구성된, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 25 (TNFRSF25)에 특이적으로 결합하는 인간 TL1A 폴리펩타이드 또는 그의 단편의 세포외 영역인 제1 폴리펩타이드, 및
    (b) N 말단에서 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드로서, Ig 폴리펩타이드는 인간 IgG1 또는 IgG2 폴리펩타이드의 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제2 폴리펩타이드
    를 포함하는 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물; 및
    (ii) 유효량의 인터류킨(IL)-2
    의 조합을 포함하는,
    질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에서 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 약제로서,
    IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 또는 300,000 단위이며,
    질환 또는 장애는 이식 거부, 이식편대숙주병, 또는 T 조절 세포 반응을 포함하는 질환 또는 장애인 것을 특징으로 하는, 약제.
  2. 제 1항에 있어서, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질은 호모다량체이며, 상기 호모다량체는 3량체의 2량체인 것을 특징으로 하는, 약제.
  3. 제 1항에 있어서, Ig 폴리펩타이드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제.
  4. 제 1항에 있어서, 인간 TL1A-Ig 융합 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제.
  5. 제 1항에 있어서, 약제는 대상에서 총 CD4+ 세포 중 CD4+ FoxP3+ T 조절 (Treg) 세포의 빈도를 증가시켜, 대상에서 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, 약제.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 약제는 Ig 폴리펩타이드와 결합하지 않았을 때의 제1 폴리펩타이드와 비교하여 증진된 생체내 효능을 특징으로 하는, 약제.
  7. 제 1항에 있어서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위인 것을 특징으로 하는, 약제.
  8. (i) (a) C 말단에서 서열번호 12의 아미노산 60-251로 구성된, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 25 (TNFRSF25)에 특이적으로 결합하는 인간 TL1A 폴리펩타이드 또는 그의 단편의 세포외 영역인 제1 폴리펩타이드, 및
    (b) N 말단에서 인간 IgG1 또는 IgG2 유래의 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드
    를 포함하는 인간 TL1A-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물; 및
    (ii) 유효량의 인터류킨(IL)-2
    의 조합을 포함하는,
    총 CD4+ 세포 중 CD4+ FoxP3+ T 조절 (Treg) 세포의 빈도의 증가를 필요로 하는 대상에서 총 CD4+ 세포 중 CD4+ FoxP3+ T 조절 (Treg) 세포의 빈도를 증가시키는데 사용하기 위한 약제로서,
    IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 30,000 또는 300,000 단위인 것을 특징으로 하는, 약제.
  9. 제 8항에 있어서, IL-2의 유효량은 1일 당 제곱미터 당 300,000 단위인 것을 특징으로 하는, 약제.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2621083C (en) 2005-08-30 2017-04-11 University Of Miami Immunomodulating tumor necrosis factor receptor 25 (tnfr25) agonists, antagonists and immunotoxins
KR20120089259A (ko) 2009-08-03 2012-08-09 유니버시티 오브 마이애미 Ｔ 조절 세포의 생체 내 확장 방법
KR102565827B1 (ko) 2013-01-09 2023-08-11 유니버시티 오브 마이애미 TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9982057B2 (en) 2014-11-17 2018-05-29 Pelican Therapeutics, Inc. Human TNFRSF25 antibody
RU2714157C2 (ru) * 2015-02-06 2020-02-12 Хит Байолоджикс, Инк. Вектор, коэкспрессирующий молекулы для вакцинации и костимулирующие молекулы
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
WO2017214547A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 Pelican Therapeutics, Inc. Anti-tnfrsf25 antibodies
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US20200376036A1 (en) * 2018-02-20 2020-12-03 University Of Miami Methods of regulatory t cell expansion and activation
AU2020340372A1 (en) * 2019-08-30 2022-03-10 Pelican Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using TNFRSF25 antibodies
TW202124425A (zh) * 2019-09-13 2021-07-01 日商協和麒麟股份有限公司 DcR3改型體
WO2021062371A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Pelican Therapeutics, Inc. Tnfrsf25-mediated treatments of immune diseases and disorders
CN116348481A (zh) * 2020-08-19 2023-06-27 詹森生物科技公司 使用工程化配体的材料和方法
WO2023159135A2 (en) * 2022-02-16 2023-08-24 University Of Miami Il-2 and tl1a fusion proteins and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011017303A1 (en) * 2009-08-03 2011-02-10 University Of Miami Method for in vivo expansion of t regulatory cells
CN102453097A (zh) * 2010-10-27 2012-05-16 上海科新生物技术股份有限公司 抑制血管新生的融合蛋白vf及药物组合物和应用

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
NZ201418A (en) 1982-07-28 1986-08-08 Barmac Ass Ltd Mineral breaker with centrifugal breaking action
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4654307A (en) 1983-02-17 1987-03-31 The Research Foundation Of State University Of New York Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US5175269A (en) 1984-01-30 1992-12-29 Enzo Diagnostics, Inc. Compound and detectable molecules having an oligo- or polynucleotide with modifiable reactive group
US5118627A (en) 1984-02-27 1992-06-02 Amgen Papova virus construction
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5212286A (en) 1984-04-19 1993-05-18 Scios Nova Inc. Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds
US4761367A (en) 1984-11-07 1988-08-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences
US4719179A (en) 1984-11-30 1988-01-12 Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Six base oligonucleotide linkers and methods for their use
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5859208A (en) 1988-07-06 1999-01-12 Fiddes; John C. Human basic fibroblast growth factor analog
US5198343A (en) 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5510099A (en) 1987-05-01 1996-04-23 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
US5229279A (en) 1987-06-29 1993-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
US5223483A (en) 1987-10-22 1993-06-29 Merck & Co., Inc. Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5215907A (en) 1989-02-24 1993-06-01 Oklahoma Medical Research Foundation Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius
US5173403A (en) 1989-02-24 1992-12-22 Oklahoma Medical Research Foundation Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius and gene
US5242687A (en) 1989-03-15 1993-09-07 Tkb Associates Limited Partnership Method of reducing cellular immune response involving T-cells using CD8-bearing antigen presenting cells
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5244805A (en) 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5155037A (en) 1989-08-04 1992-10-13 The Texas A&M University System Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5218088A (en) 1989-11-02 1993-06-08 Purdue Research Foundation Process for preparing dithiophosphate oligonucleotide analogs via nucleoside thiophosphoramidite intermediates
EP0517768A1 (en) 1990-02-28 1992-12-16 Schering Corporation Mammalian expression vectors
US5212058A (en) 1990-05-09 1993-05-18 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases
US5122463A (en) 1990-05-17 1992-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for trans-destabilization of specific proteins in vivo and dna molecules useful therefor
DE4017595A1 (de) 1990-05-31 1991-12-05 Consortium Elektrochem Ind Maltopentaose produzierende amylasen
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
US5266317A (en) 1990-10-04 1993-11-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions
US5462990A (en) 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
JPH07501204A (ja) 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
US5243041A (en) 1991-08-22 1993-09-07 Fernandez Pol Jose A DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin
US5714323A (en) 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
US5444149A (en) 1992-05-11 1995-08-22 Duke University Methods and compositions useful in the recognition, binding and expression of ribonucleic acids involved in cell growth, neoplasia and immunoregulation
GB9221220D0 (en) 1992-10-09 1992-11-25 Sandoz Ag Organic componds
US5434065A (en) 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
AU7568094A (en) 1993-08-12 1995-03-14 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5700657A (en) 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
NZ277498A (en) 1993-12-17 1998-03-25 Novartis Ag Rapamycin derivatives
US5362718A (en) 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
IL109558A (en) 1994-05-04 2004-08-31 Yissum Res Dev Co DNA structures Derived from the SV40 virus that include DNA sequences External
JPH10502535A (ja) 1994-07-08 1998-03-10 シェーリング コーポレイション ｃ−ｆｏｓプロモーター活性化タンパク質をコードする核酸を同定する方法
US7597886B2 (en) 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US20030129189A1 (en) 1994-11-07 2003-07-10 Guo-Liang Yu Tumor necrosis factor-gamma
US5792647A (en) 1995-02-13 1998-08-11 The Johns Hopkins University Bacterial catabolism of chitin
US6254874B1 (en) 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
WO1996039154A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
PT833828E (pt) 1995-06-09 2003-02-28 Novartis Ag Derivados de rapamicina
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US7357927B2 (en) 1996-03-12 2008-04-15 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
US6713061B1 (en) 1996-03-12 2004-03-30 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
WO1997033904A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
EP0937082A2 (en) 1996-07-12 1999-08-25 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Materials and method for treating or preventing pathogenic fungal infection
TW557297B (en) 1997-09-26 2003-10-11 Abbott Lab Rapamycin analogs having immunomodulatory activity, and pharmaceutical compositions containing same
US20020111325A1 (en) 1997-11-03 2002-08-15 Human Genome Sciences, Inc. VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
EP1992633A1 (en) * 1997-11-03 2008-11-19 Human Genome Sciences, Inc. VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
BR9908267A (pt) 1998-02-27 2000-10-24 Univ Pennsylvania Plasmìdeo, composição farmacêutica, processos para induzir uma resposta imunológica em um indivìduo contra um imunógeno, para imunizar um indivìduo contra uma infecção por vìrus de herpes simples e para tratar um indivìduo que tem uma doença autoimune, vacina recombinante, e, patógeno atenuado vivo
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
EA004590B1 (ru) 1999-01-15 2004-06-24 Байоджен, Инк. Способ блокировки развития, или снижения тяжести, или проявлений заболевания "трасплантат против хозяина"
US20020004041A1 (en) 1999-02-19 2002-01-10 Albert Matthew L. Methods for abrogating a cellular immune response
IL145676A0 (en) 1999-04-12 2002-06-30 Genentech Inc Tumor necrosis factor homologs and nucleic acids encoding the same
JP2003522118A (ja) 1999-04-22 2003-07-22 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド デスドメイン含有受容体
AU783158B2 (en) 1999-08-24 2005-09-29 Ariad Pharmaceuticals, Inc. 28-epirapalogs
EP1231937A2 (en) 1999-11-19 2002-08-21 Thomas V. Tittle Tr3-specific binding agents and methods for their use
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
US6652854B2 (en) 2000-08-08 2003-11-25 Immunex Corporation Methods for treating autoimmune and chronic inflammatory conditions using antagonists of CD30 or CD30L
AU1092602A (en) 2000-10-24 2002-05-06 New Ind Res Organization Genomes participating in rheumatoid arthritis, method of the diagnosis thereof, method of evaluating the onset possibility thereof, diagnostic kit for detectingthem and therapeutic method and remedies for rheumatoid arthritis
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7189820B2 (en) 2001-05-24 2007-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against tumor necrosis factor delta (APRIL)
AU2002320079A1 (en) 2001-06-11 2002-12-23 Jeong-Im Sin Vaccines, immunotherapeutics and methods of using the same
AU2002315848B2 (en) 2001-06-22 2008-05-15 Asubio Pharma Co., Ltd. Remedies for eosinophilic diseases
AU2002359446B2 (en) 2001-11-09 2008-12-04 Georgetown University Novel isoforms of vascular endothelial cell growth inhibitor
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
AU2002333502A1 (en) 2002-02-10 2003-09-04 Apoxis Sa Fusion constructs containing active sections of tnf ligands
CN1446833A (zh) 2003-02-08 2003-10-08 复旦大学 一种温敏性可降解微凝胶及其制备方法
EP1667730B1 (en) 2003-08-20 2013-06-26 University of Miami Compositions and methods for treating inflammatory lung disease
CN1953767B (zh) 2004-01-08 2011-03-16 加利福尼亚大学董事会 调节t细胞抑制自身免疫
US7723454B2 (en) 2004-02-03 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Coating of organic fibers with siloxane-carborane polymers
US20090317388A1 (en) 2005-05-25 2009-12-24 Linda Burkly Tl1a in treatment of disease
CA2621083C (en) 2005-08-30 2017-04-11 University Of Miami Immunomodulating tumor necrosis factor receptor 25 (tnfr25) agonists, antagonists and immunotoxins
JP2009510102A (ja) * 2005-09-29 2009-03-12 ヴァイラル ロジック システムズ テクノロジー コーポレーション 免疫調節組成物およびその使用
JP5647098B2 (ja) 2008-03-21 2014-12-24 ザ ユニヴァーシティー オヴ シカゴ オピオイド拮抗薬とｍＴＯＲ阻害薬を用いた治療
SI2310509T1 (sl) 2008-07-21 2015-07-31 Apogenix Gmbh TNFSF enoverižne molekule
WO2010071880A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 University Of Miami Tnfr25 agonists to enhance immune responses to vaccines
EP2683395B1 (en) 2011-03-11 2018-08-01 Assistance Publique - Hôpitaux de Paris Use of low dose il-2 for treating type 1 diabetes
CA2836898A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Government Of The United States, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology and antibodies thereof
EP2718457A4 (en) * 2011-06-06 2014-12-24 Immungene Inc GENETICALLY MODIFIED FUSION MOLECULES LIGAND TNFSF-ANTIBODY ELEMENT
KR102565827B1 (ko) 2013-01-09 2023-08-11 유니버시티 오브 마이애미 TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011017303A1 (en) * 2009-08-03 2011-02-10 University Of Miami Method for in vivo expansion of t regulatory cells
CN102453097A (zh) * 2010-10-27 2012-05-16 上海科新生物技术股份有限公司 抑制血管新生的融合蛋白vf及药物组合物和应用

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