KR20220067412A - 요로 이행상피세포암 환견에서 분리한 braf 돌연변이를 포함한 종양세포주와 전이암세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델 - Google Patents
요로 이행상피세포암 환견에서 분리한 braf 돌연변이를 포함한 종양세포주와 전이암세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220067412A KR20220067412A KR1020200154077A KR20200154077A KR20220067412A KR 20220067412 A KR20220067412 A KR 20220067412A KR 1020200154077 A KR1020200154077 A KR 1020200154077A KR 20200154077 A KR20200154077 A KR 20200154077A KR 20220067412 A KR20220067412 A KR 20220067412A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell line
- animal model
- metastatic cancer
- isolated
- tumor
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 59
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 37
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 title claims description 30
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 title claims description 30
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 title claims description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 title abstract description 21
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 title description 3
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 title description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 210000004419 bladder transitional cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 11
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 101150048834 braF gene Proteins 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 abstract 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 229940125648 antineoplastic drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 2
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 238000011728 BALB/c nude (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000010772 Dog disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011563 immunodeficient animal model Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000022766 lymph node neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000002673 radiosurgery Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000000682 transitional epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000023747 urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 요로 이행상피세포암 반려견의 조직으로부터 분리한 종양세포주와 전이된 림프절에서 분리한 전이세포주 및 이를 이용한 이종 이식 동물 모델 및 이의 제조 방법에 대한 것으로서, 상기 동물 모델을 이용하여 반려견의 요로 이행상피세포암의 치료 및 상기 질환에 대한 치료제의 개발을 위한 연구에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 요로 이행상피세포암으로 진단받은 반려견(환견)의 수술조직으로부터 분리한 종양세포주와 전이된 림프절에서 분리한 전이암 세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델에 대한 것이다.
이행상피세포암(Transitional cell carcinoma, TCC)은 개의 비뇨기에서 가장 흔하게 발생하는 암종으로, 악성도와 침윤성이 높고 수술이 불가능한 경우가 많아 불량한 예후를 보이는 특징을 가진다. TCC는 반려견의 방광 내부 또는 방광에서 외부로 소변을 배출하는 요도에 주로 발생되며, 전립샘, 신장 또는 요관에서도 발생될 수 있다.
이행상피세포암은 요로의 안쪽 면의 이행상피세포에서 발병하며, 요로 안쪽 면의 선을 따라 성장한다. 이외에도, 방광 및 요도의 내강 내측으로 국부적으로 침입하여 전이되는 특징을 가진다. 명확한 원인이 알려져 있는 것은 아니나, 유전적인 요인과 환경적인 요인이 작용하는 것으로 추측되며, 제초제 또는 반려견의 간접 흡연에 의해 발명된다는 연구 결과도 보고되어 있다.
반려견을 입양하는 인구가 늘어나고, 반려견의 질병에 대한 관심이 높아지고 있는 추세에 따라, 발병률이 높은 요로 이행상피세포암과 같은 중증 질병의 연구가 필요하며, 악성도가 높아 전이 위험이 높은 만큼 원발종양과 전이의 특성을 연구할 수 있는 세포주 또는 소동물 모델의 개발이 필요한 실정이다. 현재 자연발생 반려견 유래 요로 이행상피세포암의 원발종양세포주와 동일환견의 전이조직에서 유래한 전이암세포주의 매칭된 pair는 연구용으로 제공되고 있지 않다.
따라서 본 발명자들은 자연발생한 요로 이행상피세포암으로 진단받은 반려견의 원발성 암조직 및 전이조직으로부터 세포주를 분리하여 분석한 결과, BRAF 유전자로부터 코딩되는 아미노산의 595번 아미노산 잔기가 발린(V)에서 글루탐산(E)으로 변이된 돌연변이를 포함하고 있는 것을 발견하고, 이와 같은 특징을 가지는 원발성 종양 및 전이 종양세포주를 이용한 이종 이식 동물모델에 대한 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 환견의 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 원발종양세포주 및 전이암세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 환견의 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 원발종양세포주 및/또는 전이암세포주가 피하에 이식된 이종 이식 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 환견의 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 원발종양세포주 및/또는 전이암세포주를 면역 결핍 동물에 이식하는 단계를 포함하는, 요로 이행상피세포암의 원발암 및 전이암 이종 이식 동물 모델의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제작된 요로 이행상피세포암의 원발암 및 전이암 이종 이식 동물 모델에 치료 후보물질을 처리하고, 종양억제 및 전이억제 치료 효과를 확인하는 단계를 포함하는 약물 후보 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 환견의 요로 이행상피세포암 조직으로부터 분리된 원발종양세포주 및 동일 환견의 전이된 조직에서 분리한 전이암세포주를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 환견의 요로 이행상피세포암 종양세포주 및/또는 동일환자의 전이된 조직으로부터 분리된 전이암세포주가 피하에 이식된 이종 이식 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 환견의 요로 이행상피세포암 조직으로부터 분리된 원발종양세포주 및/또는 전이암세포주를 면역 결핍 동물에 이식하는 단계를 포함하는, 요로 이행상피세포암 이종 이식 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제작된 요로 이행상피세포암의 원발암 및 전이암 이종 이식 동물 모델에 치료 후보물질을 처리하고, 종양억제 및 전이억제 치료 효과를 확인하는 단계를 포함하는 요로 이행상피세포암 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명은, 반려견의 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 종양세포주에 대한 것이다. 본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 종양세포주는 요로이행상피세포암 환견에서 분리한 것이며, 환견의 요로이행상피세포암의 원발종양 조직 및 전이된 종양조직으로부터 종양세포주를 분리하여 분석한 결과, BRAF 유전자로부터 코딩되는 아미노산의 595번 아미노산 잔기가 발린(V)에서 글루탐산(E)으로 변이된 돌연변이를 포함하고 있는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 상기 세포주는 BRAF (V595E) 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하며, 상기 세포주는 요로이행상피세포암의 원발종양 세포주 및/또는 동일 환견의 전이조직으로부터 분리된 전이암세포주를 포함할 수 있다.
상기 세포주는 요로이행상피세포암의 원발종양세포주 (KU-CTCC-001, 한국세포주은행 KCLRF-BP-00501) 및 전이암세포주(KU-CTCC-001LM3, 한국세포주은행 KCLRF-BP-00502)일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서 본 발명은 상기 환견의 요로이행상피세포암 세포주가 이식된 이종 이식 동물 모델에 대한 것이다.
본 발명에서의 용어 "이종이식"이란, 종이 다른 동물의 간, 심장, 신장 등 기관, 장기, 조직, 세포 등을 이식하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 이종이식은 환견으로부터 분리된 암세포를 면역결핍 동물에 이식하는 방법으로 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
특히 본 발명의 이종 이식 동물 모델은, 요로이행상피세포암의 원발종양 세포주 및 전이암 세포주가 각각 별개의 동물에 이식된 것일 수 있다. 즉, 상기 전이암세포주는 상기 원발종양으로부터 전이된 전이암 조직으로부터 분리된 것이며, 동일 개체로부터 유래한 원발종양 이종이식모델과 전이암 이종이식모델을 별도로 제작할 수 있음을 의미한다. 상기 원발종양세포주와 전이암 세포주는 각각의 면역결핍동물모델에 주입될 수 있으며, 이로부터 동일 개체의 원발 종양과 전이암의 이종 이식 동물 모델을 쌍으로 구축할 수 있어 전이된 암세포에 중요한 악성도의 특성을 비교할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "이종 이식 동물 모델"이란, 대상체(환견)의 종양조직으로부터 분리된 세포, 특히 이러한 세포를 일차 배양하여 면역체계손상마우스(immune compromised mouse)와 같은 면역결핍 동물에 이종 이식하여 제작된 맞춤형 동물모델로서, 본 발명에서는 특히 반려견의 요로 이행상피세포암과 형태학적 환경이 동일 또는 유사하고, 유전학적 환경이 동일 또는 유사하며 환견의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 반영한 조건을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 이종이식 동물모델에, 항암제 후보물질, 방사선 치료(방사선 수술) 증감제(sensitizer), 면역치료 후보물질 등을 처리하면, 실제로 암세포 또는 암 조직을 제공한 환견에게 처리한 것과 동일한 효과를 확인할 수 있으므로, 상기 이종 이식 동물 모델을 이용하면 항암제 등이 세포수준이 아닌 생체 내 (in vivo )에서 실제로 치료 효과를 나타낼 수 있는지 확인할 수 있다는 장점을 가진다.
상기 동물 모델은 인간 및 개 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 조류 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 마우스이다. 상기 동물은 면역체계손상마우스(immune compromised mouse)와 같은 면역 결핍된 동물임을 특징으로 할 수 있다. "면역 결핍된 동물"이란 요로 상피이행세포암이 발병될 수 있도록 면역시스템을 구성하는 일부 구성요소를 유전자 수준에서 인위적으로 손상시켜서 정상적인 면역시스템이 구현되지 않도록 조작하여 제조된 동물을 의미한다. 상기 동물로는 신경계가 형성된 동물을 사용할 수 있는데, 바람직하게는, 면역 결핍되도록 조작된 마우스, 랫트, 햄스터, 기니어피그 등의 면역 결핍 설치류가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 누드 마우스, NOD(nonobese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/shi-SCID/IL2Rnull) 마우스 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 이종 이식 동물 모델의 제조 방법에 대한 것이다.
일 양태로서, 상기 제조 방법은 본 발명의 요로이행상피세포암 환견으로부터 유래된 종양세포주 또는 전이암 세포주(KU-CTCC-001 또는 KU-CTCC-001LM3)를 면역 결핍 동물에 주입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 T 세포가 결손된 면역결핍 마우스의 피하에 주입하여, 종양을 유발하였다. 주입되는 세포의 수는 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 2.0 내지 5.0 x 106 개의 종양 세포를 주입하여 이종 이식 동물 모델을 제작하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 이종 이식 동물 모델을 이용하여 요로이행상피세포암 치료제를 스크리닝 하는 방법에 대한 것으로서, 이는 이종 이식 동물 모델에 항암 치료제 후보 물질을 처리하고, 치료 효과를 확인하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 상기 치료 물질 처리 후, 이종 이식 동물 모델의 예후를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 이종 이식 동물 모델에 요로 이행상피세포암 치료용 후보 물질의 투여 후 종양 크기 감소 및 항암 효과가 확인되는 경우, 상기 암 치료제로 결정하는 방법을 의미한다. 상기 종양크기 감소 및 항암 효과의 확인 방법은 분자생물학적 어쎄이(assay), 디지털 이미징, 세포학적 및 조직학적 검사 등 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 특별히 그 방법에 제한되는 것은 아니다.
상기 치료 물질은 천연물, 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체, 천연추출물 또는 복합물 등 그 종류에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 요로이행상피세포암 반려견의 수술 조직으로부터 분리한 종양세포주 및 전이된 림프절에서 분리한 전이세포주 및 이를 이용한 이종 이식 동물 모델은 특히 반려견의 요로 이행상피세포암의 치료 및 상기 질환에 대한 치료제의 개발을 위한 연구에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 반려견의 요로 이행상피세포암의 원발 종양세포(좌) 및 전이림프절(우)로부터 수립된 종양세포주이다.
도 2는 본 발명의 반려견의 정상 조직 및 요로 이행상피세포암의 원발 종양세포 및 전이림프절로부터 분리한 세포주의 STR 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 종양세포주에서 나타나는 BRAF 유전자의 코돈의 돌연변이를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 세포주를 주입하여 제작한 이종 이식 마우스 동물 모델이다.
도 5는 본 발명의 세포주를 주입하여 제작한 이종 이식 마우스 모델의 종양 조직을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 6은 본 발명의 세포주를 주입하여 제작한 이종 이식 마우스의 종양 조직 크기 및 체중을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 반려견의 정상 조직 및 요로 이행상피세포암의 원발 종양세포 및 전이림프절로부터 분리한 세포주의 STR 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 종양세포주에서 나타나는 BRAF 유전자의 코돈의 돌연변이를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 세포주를 주입하여 제작한 이종 이식 마우스 동물 모델이다.
도 5는 본 발명의 세포주를 주입하여 제작한 이종 이식 마우스 모델의 종양 조직을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 6은 본 발명의 세포주를 주입하여 제작한 이종 이식 마우스의 종양 조직 크기 및 체중을 확인한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 요로 이행상피세포암 세포주의 분리 및 배양
반려견에서 자연적으로 발생한 요로 이행상피세포암의 원발 종양 조직 및 전이된 주변 림프절 조직으로부터 세포를 분리, 배양하여 세포주(KU-CTCC-001 와 KU-CTCC-001LM3)를 수립하고 이를 한국세포주연구재단 (KCLRF)에 기탁하였다. (기탁번호 KCLRF-BP-00501, KCLRF-BP-00502) (도 1)
세포는 penicillin/streptomycin, 10 mM HEPES, L-glutamine 그리고 10% fetal bovine serum (FBS)를 넣은 Dulbecco's modified Eagle medium/F12 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 가 공급되는 배양기에서 배양하였다.
조직을 세포로 분리하기위해 작은 크기로 충분히 자른 조직을 Collagenase II (1.5 mg/ml), Hyaluronidase (20 ug/ml) 그리고 L-Y-27632 (10 uM)가 포함된 배지에 넣고, 37
인큐베이터에서 40분 반응시킨다. 반응이 끝나면 세포배양액을 1:1 비율로 섞고, 여과필터로 걸러 균일한 세포를 분리하여 세포배양액에 배양하였다.
또한, 상기 원발 종양조직으로부터 수립한 세포주와 전이림프절 조직으로부터 유래한 세포주를 정상 조직과 비교하여, 단연쇄 반복 분석(Short tendem repeat)을 시행한 결과, 분석된 STR 프로파일이 동일하며, 유전적인 특성이 서로 유지되고 있는 것을 확인하였다. (도 2)
상기 세포주에 포함되는 BRAF 유전자를 시퀀싱하여 확인한 결과, 상기 유전자로부터 암호화되는 아미노산 서열의 595번 아미노산 잔기가 발린(Valin, V)에서 글루탐산(Clutamate, E)로 변화된 것을 확인하였다.(도 3)
실시예 2. 종양 세포주를 이용한 이종 이식 동물모델 제작
상기 실시예 1.로부터 수립된 세포주를 T 세포 결손 면역 결핍 마우스의 피하에 접종하여, 이종 이식 동물 모델을 제작하였다. 마우스는 (BALB/c Nude (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrljOri, 6주령, 암컷)을 사용하였다. 종양세포 접종은 마우스를 이소프란액으로 마취 후, 핀셋으로 피하를 얇게 들어올려 phosphate buffered saline (PBS)에 고르게 섞인 종양 세포 5 x 106 개를 멸균된 주사기로 천천히 주입하였다. 마우스는 일주일에 두 번씩 체중과 종양크기를 관찰하였으며, 접종 후 9주 동안 종양 형성을 관찰하였다. 약 4주 후부터 종양크기를 측정하였고, 9주에 마취후 안락사하여 부검하였다 (도 4). 형성된 원발종양 조직 및 전이 림프절 종양 조직을 적출 후 포르말린으로 고정, 파라핀 포매하여 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 이후 조직 절편은 Hematoxylin & Eosin 염색하여 주입한 세포와 동일한 특성을 확인하였다. (도 5)
또한, 상기 이종 이식 모델의 종양 크기는 체중에 따라 차이는 있으나, 800 내지 1000mm3으로 확인되었다.(도 6)
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (11)
- 환견의 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 종양세포주 또는 동일환견의 전이된 림프절에서 분리된 전이암 세포주를 포함하는 개의 요로이행상피세포암 세포주.
- 제 1항에 있어서,
상기 세포주는 BRAF 유전자로부터 암호화되는 아미노산의 595번 잔기가 발린에서 글루탐산으로 변이된 돌연변이를 암호화하는 서열을 포함하는 개의 요로이행상피세포암 세포주. - 제1항에 있어서,
상기 종양세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00501, 상기 전이암 세포주는 기탁번호 수탁번호 KCLRF-BP-00502인 개의 요로이행상피세포암 세포주. - 환견의 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 종양세포주 또는 동일환견의 전이된 림프절에서 분리된 전이암 세포주가 이식된 이종 이식 동물 모델.
- 제 4항에 있어서,
상기 동물 모델은 요로이행상피세포암 조직으로부터 분리된 종양세포주 또는 동일환견의 전이된 림프절에서 분리된 전이암 세포주가 각각 별개의 동물 모델에 이식된 것임을 특징으로 하는 이종 이식 동물 모델. - 제 4항에 있어서,
상기 동물 모델은 면역 결핍 마우스를 이용한 것을 특징으로 하는, 이종 이식 동물 모델. - ⅰ) 반려견의 요로 이행상피세포암 조직으로부터 종양세포주 또는 동일환견의 전이된 림프절에서 전이암 세포주를 분리하는 단계; 및
ⅱ) 상기 분리된 종양세포주 또는 전이암 세포주를 면역 결핍 동물에 이식하는 단계를 포함하는, 요로 이행상피세포암 이종 이식 동물 모델의 제조 방법. - 제 7항에 있어서,
상기 종양세포주 또는 전이암 세포주는 면역 결핍 마우스의 피하에 주사되는 것을 특징으로 하는 이종 이식 동물 모델의 제조 방법 - 제 7항에 있어서,
상기 종양세포주 또는 전이암 세포주는 2~5 x 106 세포수의 양으로 주입되는 것을 특징으로 하는 이종 이식 동물 모델의 제조 방법. - 제 7항에 있어서,
상기 이종 이식 동물 모델은 요로이행상피세포암의 종양세포주 또는 전이암 세포주가 분리된 반려견의 유전적 특성 및 형태적 특성이 동일한 것을 특징으로 하는 이종 이식 동물 모델의 제조 방법. - 제 4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 요로이행상피세포암 이종 이식 동물 모델에 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
상기 동물 모델에 대하여 종양의 치료 효과를 확인하는 단계를 포함하는 요로이행상피세포암 치료제의 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200154077A KR102465079B1 (ko) | 2020-11-17 | 2020-11-17 | 요로 이행상피세포암 환견에서 분리한 braf 돌연변이를 포함한 종양세포주와 전이암세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200154077A KR102465079B1 (ko) | 2020-11-17 | 2020-11-17 | 요로 이행상피세포암 환견에서 분리한 braf 돌연변이를 포함한 종양세포주와 전이암세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220067412A true KR20220067412A (ko) | 2022-05-24 |
| KR102465079B1 KR102465079B1 (ko) | 2022-11-09 |
Family
ID=81807294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200154077A KR102465079B1 (ko) | 2020-11-17 | 2020-11-17 | 요로 이행상피세포암 환견에서 분리한 braf 돌연변이를 포함한 종양세포주와 전이암세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102465079B1 (ko) |
-
2020
- 2020-11-17 KR KR1020200154077A patent/KR102465079B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SCIENTIFIC REPORTS, vol.10:7826, pp.1~13(2020)* * |
| UROLOGIC ONCOLOGY: SEMINARS AND ORIGINAL INVESTIGATIONS , vol.27, pp.284~292(2009)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102465079B1 (ko) | 2022-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Akter et al. | Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities | |
| KR20140133399A (ko) | 환자유래 일차배양 암세포의 배양방법 및 일차배양 암세포를 이용하여 제작된 암 환자와 동일한 이종 이식 동물모델의 구축 방법 | |
| KR20160033180A (ko) | 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법 | |
| WO2011078301A1 (ja) | Nog樹立癌細胞株が移植された非ヒト動物モデルを用いた抗癌剤ターゲット探索及びスクリーニング法 | |
| US20120110682A1 (en) | Animal Model for Toxicology and Dose Prediction | |
| CN101809156A (zh) | 体内扩增人类肝细胞的方法 | |
| JP2718596B2 (ja) | 非ヒトキメラ動物 | |
| JP2005523012A (ja) | 癌モデル | |
| CN111635912A (zh) | 一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用 | |
| Xia et al. | Human tissue-specific microenvironment: an essential requirement for mouse models of breast cancer | |
| KR102465079B1 (ko) | 요로 이행상피세포암 환견에서 분리한 braf 돌연변이를 포함한 종양세포주와 전이암세포주 및 이를 이용한 이종이식 동물모델 | |
| JP2022506569A (ja) | ヒトまたは動物循環腫瘍細胞を増幅するための動物モデル | |
| CN114027256B (zh) | 高肝硬度背景sd大鼠原位肝癌模型的构建方法及其应用 | |
| JP6161828B2 (ja) | がんの非ヒトモデル動物及びその作製方法、がん幹細胞及びその製造方法 | |
| KR101743340B1 (ko) | 위암 환자 종양 유래 이종이식 모델 및 이의 용도. | |
| KR102048963B1 (ko) | 신규한 교모세포종 이종 이식 모델의 제조 방법 | |
| EP3777528A1 (en) | Non-human vertebrate transplanted with human hepatocytes and method for producing same | |
| CN113416703A (zh) | 一种人源外周t细胞淋巴瘤的pdx模型细胞和应用 | |
| AU2006239726B2 (en) | Animal models for cell therapy and cell based gene therapy | |
| Tanaka et al. | A severe combined immunodeficiency disease mouse model of human adenocarcinoma with lepidic-predominant growth | |
| Ran et al. | Revealing mitf functions and visualizing allografted tumor metastasis in colorless and immunodeficient Xenopus tropicalis | |
| CA2582236A1 (en) | Tumor models employing green fluorescent protein | |
| JP4321936B2 (ja) | 不死化血管周皮細胞株 | |
| WO2018164174A1 (ja) | 細胞及びその使用 | |
| US11414691B2 (en) | Organoid with metastatic property and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |