KR102048963B1 - 신규한 교모세포종 이종 이식 모델의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 교모세포종 이종 이식 모델의 구축 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어 빠른 치료 옵션 선택을 가능하게 하는 환자 유래 배양세포를 이용한 신규한 교모세포종 이종 이식 모델의 제조 방법에 대한 것이다.
본 발명은 이종이식 모델 구축에 있어 높은 성공률 (종양 발생율 80%)을 가지고 있고, 본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 본래 종양의 특징을 보유하며, 1-2개월 내로 종양이 빠르게 형성되어, 생존기간이 짧은 교모세포종 환자에 있어 빠른 치료 옵션 선택이 가능하도록 한다. 아울러, 교모세포종 모델 제작에 상대적으로 적은 수의 교모세포종 세포가 필요한바 동시에 여러 치료 옵션의 동시 평가를 가능하게 하여 유용하다.
본 발명은 이종이식 모델 구축에 있어 높은 성공률 (종양 발생율 80%)을 가지고 있고, 본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 본래 종양의 특징을 보유하며, 1-2개월 내로 종양이 빠르게 형성되어, 생존기간이 짧은 교모세포종 환자에 있어 빠른 치료 옵션 선택이 가능하도록 한다. 아울러, 교모세포종 모델 제작에 상대적으로 적은 수의 교모세포종 세포가 필요한바 동시에 여러 치료 옵션의 동시 평가를 가능하게 하여 유용하다.
Description
본 발명은 신규한 교모세포종 이종 이식 모델의 구축 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어 빠른 치료 옵션 선택을 가능하게 하는 환자 유래 배양세포를 이용한 신규한 교모세포종 이종 이식 모델의 제조 방법에 대한 것이다.
교모세포종은 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포에서 시작하는 종양으로 전체 뇌종양의 12~15%를 차지한다고 알려져 있다. 신경교세포는 중추 신경계의 조직을 지지하는 역할을 하며 혈관과 신경세포 사이에 위치하여 신경 세포의 물질대사에 관여하고, 상해나 염증이 있을 때에는 증식하여 세포의 회복을 돕는 일을 하는데 이 신경교세포에서 시작하는 종양이 교모세포종이다. 그러나, 교모세포종은 뇌에서 가장 흔한 암인 동시에 악성인 암이며, 교모세포종의 평균 생존 기간은 15개월 미만이다.
이러한 교모세포종의 종양 특성을 연구하고 다양한 치료 옵션들의 잠재적인 치료 효능을 조사하기 위하여 최근에 교모세포종 환자 유래 이종이식(PDX,patient derived xenograft) 모델들이 개발되고 있다. 일 예로, 교모세포종 환자 수술 중에 얻은 종양조직을 그대로 채취하여 이 조직을 immune compromised mouse에 바로 주입하여 종양 모델을 제작하는 방법이 시도되었으나, 종양 모델의 성공 비율이 20 내지 30%로 매우 낮고, 종양 모델이 만들어지기까지 수개월 심지어는 수년까지 시간이 소요되는 문제로, 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어서 환자에게 빠른 치료 옵션의 선택이 가능하지 못한 한계점이 존재한다.
이에 본 발명자들은, 짧은 기간내에 환자에게 신속한 치료 옵션 선택이 가능하도록 할 수 있는 교모세포종 환자 유래 이종이식 모델 제작방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 교모세포종 환자 유래 일차 배양을 통해 신규한 교모세포종 이종 이식 동물 모델을 제작하고, 이것이 1-2개월 내에 약 80%의 높은 성공률로 이종 이식 동물 모델이 확립됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 새로운 교모세포종의 환자 유래 세포의 일차 배양 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 환자 유래 일차 배양세포를 이용한 교모세포종 이종 이식 모델의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 교모세포종 환자 유래 세포의 배양 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 새로운 교모세포종의 환자 유래 암세포의 일차 배양 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 교모세포종 환자 조직을 잘게 자르고 원심분리한 후 조직을 회수하는 단계;
(b) 회수된 조직을 트립신-EDTA, PIPES 및 DNase가 함유된 용액에 넣어 인큐베이션하고, 원심분리하는 단계;
(c) 원심분리 후 회수된 조직을 분쇄시키고, 여과하여 단일 세포로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 분리된 단일 세포를 페니실린 및 스트렙토마이신을 혼합한 FBS 함유 DMEM 배지에 2주 동안 3 내지 4회 계대 배양한 후 계대 세포를 수득하는 단계;
를 포함하는, 교모세포종 환자 유래 암세포의 일차 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 상기 일차 배양된 암세포를 L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640과 HEPES에 재현탁하는 단계; 및 (ii) 재현탁된 일차 배양 세포를 면역결핍 마우스에 주입하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 일차 배양 세포를 이용한 교모세포종 이종 이식 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 이종이식 모델 구축에 있어 높은 성공률 (종양 발생율 80%)을 가지고 있고, 본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 본래 종양의 특징을 보유하며, 1-2개월 내로 종양이 빠르게 형성되어, 생존기간이 짧은 교모세포종 환자에 있어 빠른 치료 옵션 선택이 가능하도록 한다. 아울러, 교모세포종 모델 제작에 상대적으로 적은 수의 교모세포종 세포가 필요한바 동시에 여러 치료 옵션의 동시 평가를 가능하게 하여 유용하다.
도 1은 왼쪽 사진은 교모세포종 일차배양세포를 이식한 마우스로써 종양이 형성된 군(SNPDCX-004)과 이식하지 않은 마우스(대조군)를 비교한 사진이고, 오른쪽 사진은 교모세포종 일차배양세포를 이식한 마우스로 종양이 좌우 양쪽 다 형성된 실험군(SNPDCX-007)의 사진이다.
도 2는 제작된 교모세포종 이종 이식모델에서, 각 실험군별 종양 체적이 극적으로 상승됨을 나타낸 결과 그래프이다.
도 3은 환자의 종양 조직 세포와 이식된 종양조직 세포를 병리학적 비교한 결과이다.
도 2는 제작된 교모세포종 이종 이식모델에서, 각 실험군별 종양 체적이 극적으로 상승됨을 나타낸 결과 그래프이다.
도 3은 환자의 종양 조직 세포와 이식된 종양조직 세포를 병리학적 비교한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서의 용어 "질환 동물모델"이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자 특성, 면역화학적 특성, 종양 및 면역 단백질 발현 특성, 예후 인자들을 알아내고, 발현 유전자 및 발현 단백질들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제효능 및 독성검사를 통해 실용화 가능성 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다. 이러한 질환 동물 모델의 예시로는, 뇌종양, 특히 교모세포종동물 모델이 본 발명에서 얻고자 하는 질환 동물 모델에 해당한다.
본 발명에서의 용어 "환자 유래 세포 이종이식 동물모델(Patient Derived Cell Xenograft)"이란, 환자 유래 암조직으로부터 분리된 세포, 특히 이러한 세포를 일차 배양하여 면역체계손상마우스(immune compromised mouse)와 같은 면역결핍 동물에 이종이식하여 제작된 암 환자 맞춤형 동물모델로서, 암 환자에서 암과 형태학적 환경이 동일 또는 유사하고, 유전학적 환경이 동일 또는 유사하며 암 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 반영한 조건을 제공할 수 있다. 따라서, 환자 유래 이종이식 동물모델에, 항암제 후보물질, 방사선 치료(방사선 수술) 증감제(sensitizer), 면역치료 후보물질 등을 처리하면, 실제로 암세포 또는 암 조직 제공 암 환자에게 처리한 것과 동일한 효과를 확인할 수 있으므로, 상기 환자 유래 이종이식 동물모델을 이용하면 항암제 등이 실제로 환자에게 적절한 효과를 나타낼 수 있는지 확인할 수 있다는 장점을 가진다.
본 발명에서의 용어 "동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 마우스이다.
본 발명에서의 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적일 수 있음), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(palliating) "하는 것은 치료를 하지 않는 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 진행의 시간적 추이가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 명세서를 통하여, 문맥에서 달리 표현하지 않으면, "포함하다" 및 "함유하다"란 문구는 제시된 단계 또는 단계들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 단계들의 군이 배제되지 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 신규한 교모세포종 환자 유래 세포의 배양 방법으로, 교모세포종 환자 유래 세포의 일차 배양 방법에 관한 것이다.
구체적으로, (a) 교모세포종 환자 조직을 잘게 자르고 원심분리한 후 조직을 회수하는 단계; (b) 회수된 조직을 트립신-EDTA, PIPES 및 DNase가 함유된 용액에 넣어 인큐베이션하고, 원심분리하는 단계; (c) 원심분리 후 회수된 조직을 분쇄시키고, 여과하여 단일 세포로 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 단일 세포를 페니실린 및 스트렙토마이신을 혼합한 FBS 함유 배양 배지에서 2주동안 3 내지 4회 계대 배양한 후 계대 세포를 수득하는 단계;
를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 인큐베이션은 1시간 내지 2시간동안 37℃에서 수행될 수 있고, 상기 (c)단계에서 원심분리 후 회수된 조직은, FBS 및 DNA 분해효소를 포함하는 배양 배지에서 10 내지 20분동안 인큐베이션 하고 다시 원심분리한 후 회수된 조직으로, 이러한 회수된 조직이 분쇄될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 배지는 DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM, 줄기세포 배양 배지를 포함한다.
아울러, 다른 관점에서 본 발명은 (i) 상기 일차 배양된 세포를 L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640과 HEPES에 재현탁하는 단계; 및 (ii) 재현탁된 일차 배양 세포를 면역결핍 마우스에 주입하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 일차 배양 세포를 이용한 교모세포종 이종 이식 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 재현탁에 있어서도, DMEM, MEM, IMDM 배지를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 이때, 동물은 면역체계손상마우스(immune compromised mouse)와 같은 면역 결핍된 동물임을 특징으로 할 수 있으며, "면역 결핍된 동물"이란 교모세포종이 발병될 수 있도록 면역시스템을 구성하는 일부 구성요소를 유전자 수준에서 인위적으로 손상시켜서 정상적인 면역시스템이 구현되지 않도록 조작하여 제조된 동물을 의미한다. 상기 동물로는 신경계가 형성된 동물을 사용할 수 있는데, 바람직하게는, 면역체계손상마우스, 면역결핍되도록 조작된 마우스가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 적정 세포양을 동물 모델에 주입하는 것 또한 동물 모델 구축 성공률에 있어서 매우 중요하다. 너무 적은 양, 또는 너무 과량의 세포를 주입할 경우 종양 형성이 단기간에 되지 않거나, 동물 모델 구축 성공률이 낮아진다. 그리하여, 본 발명에서는 특히 동물 모델 당 1.75 내지 2.5×106개의 암세포를 주입하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이러한 주입 세포 수는 마우스를 기준으로 산정한 것으로, 다른 종의 동물 모델의 경우 그 주입 세포수는 변할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (ii) 단계 주입은, 면역 결핍 마우스의 피하층에 주입하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (ii) 단계에서 주입 부피는 동물 모델당 80 내지 120 ㎕일 수 있다.
종래 시도되고 있는 교모세포종 환자 유래 이종이식 모델은 조직을 직접 면역결핍된 동물 모델에 주입함으로써 제작되는 것인데, 그 성공률이 매우 낮고, 동물 모델이 만들어지기까지 수개월, 수년이 걸려, 생존기간이 짧은 교모세포종의 치료 옵션 선택에는 큰 도움이 되지 못하고 있다.
이에 반하여, 본 발명의 방법에 따라 제작시에는, 1-2월내로 종양이 형성됨으로써 그 제작기간이 매우 짧으며, 종양 성공률도 80%로 매우 높아, 실제로 교모세포종 환자들에게 종래 치료법에 대하여 내성 종양이 있는 경우 2 차 치료 옵션을 선별하기 위해서는 효율적이고 신속한 스크리닝 시스템으로서의 활용이 가능하다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 교모세포종 환자 유래 세포 이종 이식 동물모델에 교모세포종에 대한 후보 치료방법을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 후보 치료방법이 수행된 동물모델의 치료 효과를 확인하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별을 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 것이다.
동일한 교모세포종이 발병된 환자라고 할지라도 그 특성이 개별적으로 모두 다르므로 개개의 환자에 따라 치료 효과가 다르고 예후가 다를 수 있다. 따라서, 모든 환자에 대하여 동일한 치료방법을 선택하였을 때, 그 효과가 다를 수 있으므로, 다양한 교모세포종의 치료방법 중에서 개개의 환자에 특이적이고 보다 효과적인 치료방법을 선택하거나 새로운 치료방법을 스크리닝할 필요가 있다. 본 발명의 교모세포종 PDX는 이식된 교모세포종 세포가 유래한 환자의 특성을 그대로 반영하므로, 이를 이용하여 그 환자에 적합한 치료방법의 선택을 가져올 수 있다.
상기 후보 치료방법은 목적하는 환자에서 발병된 교모세포종을 치료하기 위한 맞춤형 치료법의 선별에 사용될 수 있는 다양한 치료방법을 의미하는데, 통상적으로 알려진 가능한 모든 교모세포종의 치료방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
상기 화학적 요법은 통상적으로 알려진 항암활성을 가지는 치료제 후보물질을 환자에게 투여하여 교모세포종을 치료하는 방법을 의미한다. 또한, 상기 방사선 요법은 방사선을 환자에게 처리하여 교모세포종을 치료하는 방법이며, 외과적 요법은 외과수술로서 교모세포종이 발병된 부위를 적출하여 교모세포종을 치료하는 방법이다. 상기 면역세포치료법은 환자의 혈액에서 추출한 말초혈액단핵세포에서 교모세포종에 공격성을 나타내는 면역세포를 분리하고, 이를 환자에서 분리된 교모세포종 세포와 융합시킨 다음, 환자에게 항암백신의 형태로 다시 투여함으로써, 환자에서 발병한 교모세포종을 치료하는 방법이다.
아울러, 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별을 위해서는 바람직하게는, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하여 예후를 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료 효과 확인은 예컨대 상기 동물모델의 종양 조직의 크기가 감소하거나 전이가 억제되었는지를 확인하는 것으로, 그 제한은 없다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 교모세포종 환자 유래 세포 이종 이식 동물모델 또는 이로부터 유래된 교모세포종 세포에 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질 처리 후, 상기 동물모델 또는 상기 교모세포종 세포를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 동물모델의 종양 조직의 크기가 감소하거나 전이가 억제되는 경우이거나 상기 교모세포종 세포의 증식이 억제제거나 사멸하는 경우 후보물질을 교모세포종 치료제로 결정하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 동물모델의 피하에 형성된 종양 조직의 크기 감소를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 교모세포종 치료제 결정을 위해서는 바람직하게는, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하여 예후를 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 동물로서 마우스를 이용하여 실험을 수행하였으나, 이에 제한되지 않고 임의의 포유류라면 종류와 무관하게 적용 가능하다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 제조
1-1: 교모세포종 세포의 분리 및 일차 배양
서울 대학교 병원 임상 시험위원회의 승인을 받아 교모세포종 환자의 조직을 얻은 후, 환자 조직을 Ca/Mg을 포함하는 HBSS 용액에 모아서 조직을 면도날 및 가위를 사용하여 각 모서리 약 1mm3 조각으로 수집하였다. 작게 자른 조직은 Ca/Mg을 포함하는 HBSS 용액이 담긴 튜브에 모두 옮겼고 1000RPM의 4분동안 원심분리하여 회수하였다.
회수된 조직은 1:1 부피비율로 혼합된 PIPES와 HBSS 혼합 용액에 옮겨 1000RPM의 4분동안 원심분리하였다. 다음으로, 0.05% 트립신-EDTA에 2배의 PBS 용액을 넣어 37℃에서 10분동안 프리엑티베이션 (preactivation)을 처리하였다. 이 트립신-PBS 용액에 DNA 가수분해효소(DNase I)를 첨가하고 1:1 부피비로 PIPES 용액을 넣었다. 그 다음에 조직을 상기 준비된 트립신-EDTA 및 PIPES 용액(120 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM glucose, 20 mM PIPES), DNA 분해효소가 혼합된 용액에 넣어 1시간 30분동안 37℃에서 인큐베이션하고, 1000RPM의 4분동안 원심분리하였다.
원심분리후 회수된 조직은 FBS와 DNA 분해효소(DNase I)를 포함하는 DMEM 배지에 담아 37℃에서 15분동안 인큐베이션을 하였고, 다시 1000RPM의 4분동안 원심분리하였다. 그 다음에 회수된 조직은 세 개의 유리파이펫을 사용하여 분쇄시키고 40 ㎛ 나일론 메쉬 세포 스트레이너로 여과하였다.
단일 세포(Single cells) 단위로 교모세포종 일차배양세포(Primary culture cells)를 분리하여 10% FBS(Fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에 50U/ml의 페니실린과 50mg/ml 스트렙토마이신을 혼합한 배지에 담아서 배양을 시작하였다. T-75 플라스크에 80% 이상으로 자라게 되면 계대배양하고 초기 페세지의 세포스톡으로 질소탱크에 보관하였다. 총 2주동안 3-4회 계대 배양한 후 계대세포를 수득하였다.
1-2: 교모세포종 일차 배양 세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델의 제조
교모세포종 이종이식모델은 DNA Link의 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스를 사용하여 제작하였다.
사용한 세포양은 2마리에 3.5 ~ 5 x 106 cells였다. 자세한 마우스 제조과정은 아래와 같이 수행하였다:
1) 캐비닛에 마취기를 배치하고, oxygen/isoflurane 혼합물을 설정한다.
2) 혈청없는 RPMI1640에 페니실린/스트렙토 마이신 용액을 1:100으로 희석한 후 추가하여 배지를 준비한다.
3) 마취기에 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스를 올려놓고 마취한 후 절개를 준비하기 위해 70% 에탄올이 스며든 사각 거즈를 사용하여, 종양을 이식할 양쪽 옆구리 범위를 소독한다.
4) L-glutamine을 포함하는 RPMI 1640과 25mM HEPES(CORNING) 100㎕에 재현탁액(resuspension)하여 1마리에 1.75 ~ 2.5 x106의 세포를 준비한다.
5) 큰 곧은 집게(straight forcep)로 표피를 잡은 후 26G 1ml 주사기를 이용해 마우스의 옆구리 안쪽까지 밀어 넣어 피하(subcutaneous)에 주입(injection) 한다.
6) 알콜로 이식표피 부분을 소독하고 PDCX 마우스를 마취기에서 떼어낸 후 온열패드로 옮겨 마취가 깰 때까지 관찰한다.
상기 과정을 통해, 전체 10개의 교모세포종 이종 이식 모델(SNPDCX-001 내지 SNPDCX-010)을 제작하였는데, 이 중에서 SNPDCX-002, SNPDCX-003을 제외한 8마리의 마우스 모델에서 종양이 생성되어, 종양 생성율은 80%로 매우 높았다.
도 1은 왼쪽 사진은 교모세포종 일차배양세포를 이식한 마우스로써 종양이 형성된 군(SNPDCX-004)과 이식하지 않은 마우스(대조군)를 비교한 사진이고, 오른쪽 사진은 교모세포종 일차배양세포를 이식한 마우스로 종양이 좌우 양쪽 다 형성된 실험군(SNPDCX-007)의 사진이다.
도 2는 제작된 교모세포종 이종 이식모델에서, 각 실험군별 종양 체적이 극적으로 상승됨을 나타낸 결과 그래프이다.
1-3. 병리학적 유사성 확인
환자의 종양 조직과 이식된 종양조직을 형태학적으로 비교하였다. 상기 종양조직을 H&E 염색하여, 병리학적 유사성을 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 환자 조직(왼쪽)에서는 종양성 신경교 세포의 시트(sheet)가 확인되며, 종양 세포들이 과염색된 타원형 핵과 호산구성 세포질을 가지는 다각형 형태의 종양 세포들이며, 미세혈관 증식과 빈번한 유사분열이 확인되었다.
이종이식모델로부터 얻어진 종양 조직(오른쪽)의 경우, 조금 작긴 하지만, 유사한 다각형 형태의 종양 세포들 시트(sheet)가 확인되었으며, 세포성은 환자 종양세포에 비해 높은 것으로 확인되었다. 유사분열이 빈번하지만 미세혈관성 증식은 확인되지 않았다.
이종이식모델 조직세포는 환자 조직세포들과 전반적인 조직학적 유사성이 있지만 환자 조직세포들보다 좀 더 세포질이 많고, 일반적으로 크기가 작다. 유사분열은 유사하지만, 이종이식 모델 조직에서는 미세혈관성 증식은 존재하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이는 본 발명에 따른 교모세포종 이종이식모델의 종양의 특성이 본래의 환자의 종양의 특징을 그대로 유지하고 있다는 것을 보여주는 것으로, 본 발명에 따른 교모세포종 이종이식모델이 환자의 치료옵션 선택을 위한 표준적인 동물 모델로써 사용될 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음
Claims (8)
- (i) 교모세포종 환자 조직을 잘게 자르고 원심분리한 후 조직을 회수하는 단계;
회수된 조직을 트립신-EDTA, PIPES 및 DNase가 함유된 용액에 넣어 인큐베이션하고, 원심분리하는 단계;
원심분리 후 회수된 조직을 분쇄시키고, 여과하여 단일 세포로 분리하는 단계; 및
상기 분리된 단일 세포를 페니실린 및 스트렙토마이신을 혼합한 FBS 함유 배양 배지에서 2주동안 3 내지 4회 계대 배양한 후 계대 세포를 수득하는 단계에 의해 일차 배양된 세포를 L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640과 HEPES에 재현탁하는 단계; 및
(ii) 재현탁된 일차 배양 세포 1.75 내지 2.5×106개를 면역결핍 마우스의 피하층에 주입하는 단계;
를 포함하는, 환자 유래 일차 배양 세포를 이용한 교모세포종 이종 이식 동물 모델의 제조 방법으로서,
주입 후 1 내지 2개월 내로 종양이 형성되는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 인큐베이션은 1시간 내지 2시간동안 37℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원심분리 후 회수된 조직을 FBS 및 DNA 분해효소를 포함하는 DMEM 배지에서 10 내지 20분동안 인큐베이션 하고 다시 원심분리한 후 회수된 조직을 분쇄시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원심분리 후 회수된 조직을 세 개의 유리파이펫을 사용하여 분쇄시키고, 세포 스트레이너로 여과하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 주입 부피는 80 내지 120 ㎕인 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (2)
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Applications Claiming Priority (1)
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