KR20220065439A

KR20220065439A - 트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20220065439A
Application number: KR1020200151957A
Authority: KR
Inventors: 갈상완; 강동우
Original assignee: 주식회사 제노자임
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-05-20

Abstract

본 발명은 트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 티로시나아제 억제 활성, 열 안정성, 및 항균활성이 우수한 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

트리코데르마 아트로비리데 배양 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening comprising Trichoderma atroviride culture extract}

멜라닌은 여러 동물의 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 흑색 내지 갈색 색소를 총칭한다. 멜라닌은 주로 글로불린과 강한 결합을 이루는 멜라닌 프로테인으로 존재하며, 피부의 체온을 유지하며 자외선으로부터 피부를 보호한다. 그러나 과다한 멜라닌의 생성은 피부 색소를 침착시켜 피부색을 어둡게 만들게 되고, 멜라닌의 양에 의해서 피부색이 결정된다.

멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 중요한 요인으로 피부뿐만 아니라 털, 눈, 귀, 심지어 뇌에도 존재한다. 피부의 멜라닌은 멜라닌 세포(melanocyte)에 의해 생성되며 인종에 따라 멜라닌 발현 유전자가 다르고 이에 따라 멜라닌 세포의 양이 조절되어 피부색이 결정된다. 몇몇 동물이나 사람들은 멜라닌 세포가 적거나 존재하지 않아 백색증(Albino)에 걸린다.

멜라닌은 작은 분자들의 집합체이기에 여러 가지 종류가 있다. 인체에는 페오멜라닌과 유멜라닌이 존재하지만 유멜라닌이 주를 이루고 유멜라닌의 부족이 백색증의 가장 주요한 원인이다. 유멜라닌은 올리고머의 결합체로 갈색 유멜라닌과 흑색 유멜라닌 2가지 종류로 나뉜다. 페오멜라닌은 노란색이나 붉은색을 띄며 자외선에 노출되면 발암물질로 돌변하게 된다.

멜라닌은 멜라닌 세포(melanocyte) 내의 멜라노솜(melanosome)이라 불리는 특수한 구조에서 생성된다. 멜라닌 세포는 멜라노솜이 포함된 돌기를 뻗어서 케라틴 세포 등 주변 다른 세포에 멜라닌을 전달하기도 하며 멜라노솜 중 티로신(tyrosine) 같은 페놀 종류와 그 산화효소를 가지고 있는 경우에는 형성된 멜라닌을 자기 내부에 축적시키기도 한다. 생성된 멜라노솜은 표피세포 내부로 전달되고 이것이 피부나 털의 암색화를 일으킨다.

이러한 멜라닌이 생성되기 위해서는 자외선뿐만 아니라 티로신(Tyrosine) 산화효소인 티로시나아제(tyrosinase), TRP1, TRP2, 그리고 멜라닌생성 촉진 인자인 MSH, 멜라닌 생성 조절 인자인 MITF 등 외인성 및 내인성 인자들에 의해 조절된다 (Videira I.F.S., Moura D.F.L., Magina S.B. L.M.V., Videira I.F.S., Moura D.F.L., Magina S. Mechanisms regulating melanogenesis. Ann. Bras. Dermatol. 2013;88:76-83. doi: 10.1590/S0365-05962013000100009.).

상기와 같이, 멜라닌의 합성 과정은 비 필수 아미노산인 티로신으로부터 시작되며 티로신에 산화효소인 티로시나아제가 반응하게 되면 DOPA가 형성되게 되고 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine)에 티로시나아제가 다시 반응하면서 DOPA 퀴논을 형성한다. 이후 일련의 중합과정을 거쳐 TRP2에 의해 DHICA를 형성하고 TRP1과 작용하여 최종적으로 멜라닌이 합성된다.

따라서, 미백 메커니즘은 크게 3단계로 나뉘며, 첫번째로 티로시나아제(tyrosinase) 효소를 억제하는 멜라닌 합성 전 단계, 두번째로 티로시나아제(tyrosinase) 효소에 자극받은 티로신의 산화를 억제하는 합성단계, 세번째로 멜라닌 세포에서 생성된 후 표피세포로 이동하는 과정을 억제하는 합성 후 단계로 이루어진다.

첫번째 단계에 관여하는 대표적인 물질로 알부틴, 닥나무 추출물, 유용성 감초 추출물, 알파-비사볼올 등이 알려져 있으며, 두번째 단계에 관여하는 대표적인 물질로 에칠 아스코빌 에텔, 아스코빌 글루코사이드, 아스코빌테트라이소필미테이트 등의 비타민C 유도체가 작용하며, 세번째 단계에 관여하는 물질로 나이아신아마이드가 효과를 나타내며 현재 각광받고 있는 물질이다.

이외에도 세포내에서 멜라닌 합성 관련 인자인 티로시나아제(tyrosinase), TRP1, TRP2, MITF 유전자의 전사 및 발현을 억제함으로써 멜라닌 합성을 억제하는 기능을 하는 물질들도 연구되어지고 있다

이러한 작용기작에 의해 미백활성을 나타내는 물질들이 발견되고 사용되어지고 있으나 실제 인체 피부에서 미백효과를 보기에는 여러 애로사항이 존재한다.

먼저, 티로시나아제 활성부위의 구리이온을 킬레이트화 시켜 티로신의 합성과정을 저해하는 코직산(kojic acid) 같은 경우 화장품 원료로서 사용되지만 인체 독성 관련하여 문제가 제기되어 왔으며 현재는 일정 국가에 한해서만 사용이 용인되고 있다. 한국 식약처에서는 고시원료로 등재되지 않아 원료로서 사용이 권장되지 않으며 CIR(Cosmetic Ingredient Review) 에서는 최대 1%까지 허용하고 있다.

또한, 하이드로퀴논(Hydroquinone) 같은 경우 강한 미백 능력을 가지는 물질이다. 하지만, 앞서 설명한 물질들의 미백 메커니즘과 다르게 멜라닌 생성 세포를 살해함으로써 미백 기능을 나타낸다. 이러한 세포 살해 기능에 의해 강한 미백효과를 나타내지만 강한 미백효과에 의해 사용시 백반증을 일으킬 수 있을 위험성이 있다. 따라서 화장품이 아닌 약품으로서 사용되며 일정 농도 이상 사용시에는 의사처방에 의해 사용된다.

상기와 같이, 실제 사용되는 많은 미백 물질들의 경우 피부 독성 및 인체알레르기 반응 등의 부작용이 보고됨에 따라 저농도의 사용이 권장되고 있으며, 실제 화장품 등에 미량만 함유되어진다. 따라서 실제 미백효과는 떨어질 수밖에 없으며 이에 따라 독성이 없는 천연물질로부터의 화장품 원료개발의 필요성이 대두되고 있다

본 발명의 배경기술로 대한민국 등록특허 제10-1492196호에 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 인체 및 세포 독성의 문제를 최소화할 수 있는 고 미백 활성의 천연물질을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 멜라닌 합성을 억제하여 피부 미백 활성이 우수한 동시에 열 안정성 및 항균력도 우수한 천연물질 유래의 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인체 및 세포 독성의 문제를 최소화할 수 있는 고 미백 활성의 천연물질을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 효율적으로 제조할 수 있는 미백용 화장료 조성물 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

일 측면에 따르면, 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 포함하는, 미백 화장료 조성물이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주일 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본원의 미백 화장료 조성물을 포함하는 화장품으로, 상기 화장품은 미백용 비누 또는 클렌저인, 화장품이 제공된다.

또 다른 측면에 따르면, i) 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 1 내지 5일 동안 배양하는 단계; ii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계; 및 iii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 첨가하는 단계;를 포함하는, 미백 화장료 조성물의 제조 방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 단계 i)에서 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주이고, 단계 iii)에서 상기 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 균주 배양물의 상등액을 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 첨가할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 인체 및 세포 독성의 문제를 최소화할 수 있고 미백 활성이 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 멜라닌 합성을 억제하여 피부 미백 활성이 우수한 동시에 열 안정성이 우수한 천연물질 유래의 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 피부 미백 활성뿐만 아니라 항균활성도 우수한 복합 기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 인체 및 세포 독성의 문제를 최소화할 수 있는 고 미백 활성의 천연물질을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 효율적으로 제조할 수 있는 미백 화장료 조성물 제조 방법을 제공할 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 동정 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 배양기간별 티로시나아제 억제 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 3일간 배양한 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 농도별 티로시나아제 억제 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 열처리 후 티로시나아제 억제 실험 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 세포내 멜라닌 생성 억제 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 상등액에 대한 티로시나아제의 유전자 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 2-피콜린산의 HPLC 분석 결과 및 표준 곡선을 나타낸다.
도 9는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 상등액의 농도에 따른 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 추출물의 항균 활성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "포함"은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원의 일 측면에 따르면, 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 포함하는, 미백 화장료 조성물이 제공된다.

트리코데르마 속(Trichoderma spp)은 다양한 종류의 곰팡이균에 의해 야기되는 식물병에 가장 잘 이용되는 미생물 방제제 중 하나이며, 세포 외 가수분해효소의 생산은 트리코데르마(Trichoderma)가 곰팡이 병원체에 미치는 생물학적 방제 기작 중 하나이다. 세포 외 키틴분해효소를 생산함으로써, 병원성 진균의 성장을 방해하는 생물학적 기작이 있으며, 이는 곰팡이 세포벽의 키틴 중합체를 분해시킨다고 알려져 있다.

본 발명자는 상기 트리코데르마 속(Trichoderma spp)에 속하는 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물이 피부 미백 효과가 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주일 수 있다.

본 발명자들은 토양으로부터 분리한 티로시나아제 억제 활성 균주로 선별된 sw-1 균주를 동정하였다. 도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride )의 ITS와 99% 일치되는 결과로 나타나 트리코데르마 아트로비리데( Trichoderma atroviride )로 동정되었으며, 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)으로 명명하였다.

상기 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 10월 29일자로 기탁되어, 2020년 11월 09일에 기탁번호 KCTC 18858P를 부여받았다.

본원의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)인 기탁번호 KCTC 18858P의 균주는 티로시나아제 억제 활성으로 멜라닌 합성을 억제하는 효과가 우수한 동시에 열 안정성도 우수하여 미백 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.

본원의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)인 기탁번호 KCTC 18858P의 균주는 피부 미백 활성뿐만 아니라 항균활성도 우수하여 복합 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.

이에 한정되는 것은 아니나, 본원의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)인 기탁번호 KCTC 18858P의 균주의 미백 활성은 티로시나아제 억제 활성에 의한 세포내 멜라닌 생성 억제에 의한 것일 수 있다.

이에 한정되는 것은 아니나, 본원의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)인 기탁번호 KCTC 18858P의 균주의 미백 활성은 2-피콜린산(2-picolinic acid)에 의한 티로시나아제 억제 활성에 의한 것일 수 있다.

본원에 있어서, 미백은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소한 피부의 명도를 증가시키거나, 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가한 피부 등을 포괄하여 의미한다.

본원에 있어서, 배양 추출물은 트리코데르마 아트로비리데 균주를 배양하여 얻어진 배양배지, 상기 배양배지에서 균체를 제거한 무세포 배양배지, 및 이의 농축물을 모두 포함하는 것이나, 균체를 제거한 무세포 액상 배양배지 내지 상등액이 적합할 수 있다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물을 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 포함할 수 있다.

상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물을 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 포함하는 것이 티로시나아제 억제 활성면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물이 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 미만으로 포함되는 경우, 티로시아나제 억제 활성이 미비할 수 있다.

상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1 내지 5일 동안 배양한 배양 추출물이 티로시아나제 억제 활성면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1일 미만으로 배양한 배양 추출물의 경우 티로시아나제 억제 활성이 미비하고, 5일 초과로 배양한 배양 추출물의 경우 함량이 증가하여도 티로시아나제 억제 활성은 오히려 감소할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 배양기간은 2 내지 5일이 더 적합할 수 있고, 2 내지 4일이 더 적합할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 조성물을 화장품으로 사용하는 경우, 본 발명의 추출물을 분말화하여, 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤), 색조제품 화장료(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 콘디셔너, 헤어 젤) 등에 화장료의 건조중량에 대하여 1.0 ~ 30.0 중량% 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 수분크림, 발효크림, 앰플, 샴푸, 린스, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

이에 한정되는 것은 아니나, 본원의 미백 화장료 조성물을 포함하는 화장품은 미백용 비누 또는 클렌저일 수 있다. 상기 구성에 의하면, 미백 및 항균 효과를 동시에 도모할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 중 어느 하나 이상을 선택하여 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 글리세롤, 글리세린, 지방족 에스테르, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄세스퀴오레이드, 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 카르복시폴리머, 시토스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 콜레스테롤, 스테아레스-4, 디세틸포스페이트, 마카다미아 오일, 카르복시비닐폴리머, 산탄검 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 중에서 선택된 어느 하나 이상을 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 소디움히아루로네이트, 페녹시에탄올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 스테아린산, 세틸알코올, 글리세릴모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트, 솔비탄세스퀴올레이트, 글리세릴모노스테아레이트 /글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트, 왁스, 파리핀, 스쿠알란, 카프릴릭 /카프릭트리글리세라이드, 카르복시비닐폴리머, 트리에탄올아민, 아가 또는 트라칸트 중에서 선택된 어느 하나 이상을 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 중에서 선택된 어느 하나 이상을 선택하여 이용할 수 있다.

다른 측면에 따르면, i) 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 1 내지 5일 동안 배양하는 단계; ii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계; 및 iii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 첨가하는 단계;를 포함하는, 미백 화장료 조성물의 제조 방법이 제공된다.

보다 구체적으로 살펴보면, 단계 i)은 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 배양하는 단계이다.

상기 단계 i)에서 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주가 적합할 수 있다.

본원의 균주의 배양 배지는 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지 등 공지의 다양한 배지를 이용할 수 있으나, 식용배지를 이용하는 것이 적합할 수 있다. 식용배지를 이용하면 트리코데르마 아트로비리데 (Trichoderma atroviride) 배양 상등액 자체를 독성이 없이 산업적으로 적용시킬 수 있다. 상기 식용배지는 콜라겐 및 감자전분 등이 포함된 곡물배지가 적합할 수 있다.

본원의 균주의 배양은 균주의 배양 효율이란 측면에서, 상대습도를 기준으로 40% 내지 50%의 상대습도 조건 또는 30℃ 내지 40℃의 온도 조건에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1 내지 5일 동안 배양한 배양 추출물이 티로시아나제 억제 활성면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물은 1일 미만으로 배양한 배양 추출물의 경우 티로시아나제 억제 활성이 미비하고, 5일 초과로 배양한 배양 추출물의 경우 함량이 증가하여도 티로시아나제 억제 활성은 오히려 감소할 수 있다.

다음, 단계 ii)는 배양된 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계이다. 상기 배양물의 상등액을 얻는 단계는 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 일단 거즈를 이용하여 균사체를 분리한 후, 2차 여과하여 상등액을 얻을 수 있다.

다음, 단계 iii)은 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분에 첨가하는 단계이다. 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분은 상술한 바와 같다.

단계 iii)에서 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액은 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 첨가하는 것이 티로시나아제 억제 활성면에서 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양 추출물이 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 미만으로 포함되는 경우, 티로시아나제 억제 활성이 미비할 수 있다.

[실시예]

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 미백 화장료 조성물에 대한 더욱 상세하게 설명한다.

실시예. 티로시나아제 저해 활성 우수 균주 스크리닝

봉화군 백두대간 국립공원에서 채취한 나무껍질 및 버섯 등으로부터 28개의 시료를 채취하였으며 각 시료별 자생 곰팡이를 순수 분리하였다.

순수 분리된 곰팡이를 액체 배양하여 티로시나아제(tyrosinase) 억제 시험을 통해 1차 스크리닝을 진행하였다.

1차 스크리닝된 균주 4종에 대하여 ITS (internal transcribed spacer) region 시퀀싱을 통하여 동정을 하였으며 GF-001, GF-008, GF-018, GF-020 순서대로 트리코데르마 베르티눔(Trichoderma velutinum), 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코데르마 에리나세움(Trichoderma erinaceum), Fungal sp(미확인)로 확인되었다. 다음 1차 screening 된 균주들에 대하여 항산화 실험을 통해 최종 균주를 선택하였다.

최종 선택된 균주는 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride)의 its와 99% 일치되는 결과로 나타나 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride)로 동정 되었으며, 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1)으로 명명하였다(도 1a 내지 도 1c).

실험예 1. 인 비트로( In vitro ) 티로시나아제 활성 억제 실험

세포실험에 사용된 세포주 B16F0 mouse melanoma cell은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양 시 필요한 소태아 혈청(FBS) 및 배지(DMEM)는 Lonza사와 Gibco사에서 구입하여 사용하였다. 인 비트로 티로시나아제 저해 확인 실험을 위한 L-tyrosine 및 mushroom tyrosinase는 sigma사에서 구입하여 사용하였다.

RT-PCR을 위해 사용된 프라이머는 Macrogen사에서 oligo nucleotide 합성을 통해 제작하였다(표 1).

Oligonucleotide names	Nucleotide sequence(5’- 3’)
Tyr-F	GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT(서열번호 1)
Tyr-R	TGG TGC TTC ATG GGG AAA ATC(서열번호 2)
B-Actin-F	TAC AGC TTC ACC ACC ACA GC(서열번호 3)
B-Actin-R	AAG GAA GGC TGG AAA AGA GC(서열번호 4)

B16F0 mouse melanoma cell은 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, switzerland) medium을 함유한 DMEM (21063-029, fee phenol red, GIBCO, Grand Island, NY) 배지를 사용하여 배양하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 항생물질(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA (PBS-EDTA)로 세척한 후 0.25% Trypsin EDTA를 1 ml 처리하여 dish 바닥에 부착되어있는 세포를 떼어내 계대 배양하였다. 배지는 48 시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

1-1. 배양기간별 티로시아나제 활성 억제 실험

트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 배양기간별 티로시나아제 활성 억제율을 측정하기 위해 1일부터 6일 차까지 하루 단위로 배양액을 채취하였으며, 96 well plate에 트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 1일 차부터 6일 차까지 채취한 배양 상등액을 10ul 첨가하여, mushroom tyrosinase(2000unit, sigma Chemical Co., USA) 5ul 및 100mM sodium phosphate buffer(pH 6.8) 20ul 혼합 후 10mM L-tyrosine 20ul를 넣고 배양 배지로 200ul가 되게 조절하여 제조하였다. 그 후 37℃에서 60분간 반응시킨 후 ELISA Leader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 다음 수학식 1을 이용하여 티로시나아제 활성 억제율을 구하였다.

[수학식 1]

티로시나아제 활성억제율(IC rate %)

* a : 공시료액의 반응 후의 흡광도

* b : 시료액의 반응 후의 흡광도

* a', b' : 티로시나아제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

상기와 같이, in vitro 상에서 배양 기간에 따른 티로시나아제 억제 활성을 확인하기 위해 1일차부터 6일차까지 1일 간격으로 배양액을 빼낸 후 L-tyrosine과 mushroom tyrosinase의 반응액에 각 기간별 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 0.1%를 첨가하여 나타난 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 1일차부터 활성을 나타내기 시작하여 3일차에서 68%까지 저해되었으며 이후 점차 활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 각 기간 별 저해율은 1일차부터 6일차까지 11.8%, 60.9%, 68%, 58%, 46%, 1% 순으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 이후 실험은 트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 3일 차 배양액을 이용하였다.

1-2. 농도별 티로시아나제 활성 억제 실험

트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 농도별 티로시나아제 활성 억제율을 측정하기 위하여, 96well plate에 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양액 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10% 농도별로 첨가한 후 mushroom tyrosinase(2000unit, sigma Chemical Co., USA) 5ul와 100mM sodium phosphate buffer(pH6.8) 20ul 혼합 후 10mM L-tyrosine 20ul를 넣고 배양 배지로 200ul가 되게 조절하여 제조하였다. 그 후 37℃에서 60분간 반응시킨 후 Microplate Spectrophtometer(LTEK Co, Korea)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였으며 수학식 1을 이용하여 티로시나아제 활성 억제율을 구하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 3일 차 배양액 0.2%부터 활성을 나타내며 5% 이상부터 티로시나아제 활성 억제율이 우수한 것으로 나타났다.

실험예 2. 열안정성 평가 실험

트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 배양 상등액의 티로시나아제 저해 성분이 열 안정성이 있는지 조사하기 위해, 배양 상등액을 100℃, 80℃, 60℃에서 1시간 반응시킨 후 티로시나아제 저해 활성 측정을 전술한 방법으로 실시하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1의 배양 상등액의 티로시나아제 저해 성분은 열 안정성이 우수한 것으로 나타났다.

실험예 4. 세포 독성

트리코데르마 아트로비리데의 세포 독성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 세포 독성 실험을 진행하였다.

세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA) 시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×10⁴cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이후 시료를 농도별로 처리하여 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 72시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 MTS 시약 1 ml에 배지(DMEM (21063-029, free phenol red, GIBCO, Grand Island, NY) 9 ml을 넣어 희석한 후 시료처리 완료된 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.

도 5는 상기와 같은 세포 독성 실험 방법에 따라 본 발명에서 사용된 세포주 B16F0 mouse melanoma cell에 대하여 MTS 방법에 의하여 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군인 PDB(potato dextrose broth)와 동일하게 1%부터 10%까지 모든 농도에서 생존율에서 차이를 보이지 않았으며, 따라서 트리코데르마 아트로비리데는 독성이 존재하지 않는 것으로 확인되었다.

실험예 5. 세포 내 멜라닌 생성 억제

독성이 없는 농도의 트리코데르마 아트로비리데 상등액을 세포에 처리 후 단백질 당 멜라닌 함량을 측정하여 세포 내 트리코데르마 아트로비리데에 의한 멜라닌 생성 저해 활성을 확인하였다.

보다 구체적으로, 6-well plate에 well당 1×10⁵cells/well로 플레이팅하고 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 100 nM α-MSH, 검액을 함유한 새로운 배지로 교환하고, 72 시간 동안 배양하였다. 배지는 phenol red가 포함되지 않은 것을 사용하여 흡광도 측정에 영향을 미치지 않도록 하였다. 배지는 제거하고, 부착된 세포는 1N 수산화나트륨용액 120 ㎕ 넣고 60℃ 항온조에서 1 시간 용해하고 원심분리 하였다(2,000 rpm, 4℃, 10 분). 멜라닌 함량은 멜라닌 표준품으로 표준 검량선을 작성하여 멜라닌 함량을 구하였다. 멜라닌 함량은 배양 세포의 단백질 함량에 대한 멜라닌 함량으로 환산하고, 시료를 녹인 용매를 처리한 대조군의 결과와 비교하였다.

이때, 단백질은 pierce BCA protein Assay kit (thermo fisher Scientific, Cramlington, UK)를 이용하여 계산하였고, 멜라닌 함량은 멜라닌(M0418-100MG, sigma)을 1N NaOH로 희석하여 검량 곡선을 작성 후 대입하여 산출하였고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

도 6a에 나타난 바와 같이, PDB 배지를 농도별로 처리하였을 때, 10% 농도에서만 세포 내 멜라닌 함량이 유의적으로 감소하였다.

도 6b에 나타난 바와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 농도별로 처리하였을 때, 세포 내 멜라닌 함량은 유의적으로 감소하였고, 10% 트리코데르마 아트로비리데 상등액의 멜라닌 함량은 39.21 mg/g protein 이었으며 멜라닌 저해 활성은 39.63%로 나타났다. 따라서, 트리코데르마 아트로비리데 상등액은 동일 농도 PDB 배지 보다 멜라닌 저해활성이 훨씬 높았다.

실험예 6. 세포외 멜라닌 생성 억제

독성이 없는 농도의 트리코데르마 아트로비리데 상등액을 세포에 처리 후 단백질 당 멜라닌 함량을 측정하여 세포 외 트리코데르마 아트로비리데에 의한 멜라닌 생성 저해 활성을 확인하였다.

보다 구체적으로, 6-well plate에 well당 1×10⁵(1×10⁵cells/1.2ml/well)으로 플레이팅하고 세포배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 100 nM α-MSH, 검액 및 새로운 배지를 넣고 72 시간 배양하였다. 배지는 phenol red가 포함되지 않은 것을 사용하여 흡광도 측정에 영향을 미치지 않도록 하였다. 72 시간 후 세포의 배양배지는 96well에 100 ㎕ 취하여 (3반복) 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량은 세포내 멜라닌 함량과 동일한 방법으로 계산하였다.

그 결과, A -MSH(100nM)만 처리한 군의 멜라닌 함량이 42.75mg/g of protein으로 나타났다. PDB 배지를 농도별로 처리하였을 때 5% 및 10% 농도에서만 세포 외 멜라닌 함량이 유의적으로 감소하였다. 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 농도별로 처리하였을 때, 세포 외 멜라닌 함량이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 10% 트리코데르마 아트로비리데 상등액의 멜라닌 함량은 33.19mg/g of protein이며, 멜라닌 저해 활성은 22.36%로 확인되었다. 트리코데르마 아트로비리데 상등액은 동일농도 PDB 배지 보다 높은 멜라닌 저해활성을 확인하였다.

실험예 7. 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 상등액에 대한 티로시나아제의 유전자 발현 확인

트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 처리한 B16F0 마우스 세포의 멜라닌 저해를 전사수준에서 유전자 발현 억제로 인한 작용인지를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 하였다.

10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 DMEM (21063-029, fee phenol red, GIBCO, Grand Island, NY) 배지를 사용하여 6 well plate에 well당 1×10⁵으로 플레이팅 한 후 세포배양조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액 및 100nM a-MSH 처리한 후 새로운 배지로 교환하여 72시간 배양하였다. 그 후 세포 부분만을 수확하여 RNA prep kit(GENEALL Ribospin)에 의해 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 RTase 등등이 포함된 one step premix(Bioneer, Accupower RoketScript RT-PCR premix)를 이용하여 cDNA 합성 후 티로시나아제 유전자 프라이머 및 B-actin 프라이머를 이용하여(표 1) 두 유전자를 PCR 의해 증폭시켜 전사 수준에서의 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실험예 8. LC-MS 분석

경성대학교에 의뢰하여 q-tof lc/ms 분석을 진행하였다. 시료 전처리는 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액 채취 후 13,000 rpm으로 원심분리 하였으며 50% acetonitrile로 1/10 희석하여 분석을 진행하였다. 물질 확인을 위해 polarity(positive, negative) 및 fragmentor 값을 조정하여 반복 분석을 진행하였으며 분석 결과의 질량(m/z) 값을 확인한 후 1종의 library(natural products) 검색을 통해 후보물질을 추출하였다.

HPLC 분석은 Agilent사의 Agilent 1260을 사용하였으며 0.1% formic acid를 포함한 정제수(A)와 0.1% formic acid를 포함한 acetonitrile(B)를 이동상으로 하여 0.5ml/min의 flow rate로 2ul 주입하였으며 ZORBAX XDB-C18(4.6 X 50mm, 1.8um) column을 이용하여 분석하였다.

QTOF/MS는 Agilent사의 Agilent 6530을 사용하여 10ml/min Drying gas, 50 nebulizer gas, 4000V의 capillary voltage, fragmenter 100, 150, 200, collision energy 10, mass range는 100~1,000 m/z 범위로 분석을 진행하였다.

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이, q-tof lc/ms 분석 결과 Tripeptide를 포함한 6종의 물질을 확인할 수 있었다. 분석된 물질 중 미백기능을 가진 물질을 확인한 결과 금속 킬레이트제로 알려진 2-피콜린산(2-picolinic acid)에서 티로시나아제 억제 활성을 확인하였다.

실험예 9. HPLC 분석

LC-MS 분석 결과로 특정된 물질 중 킬레이트제로 사용되는 2-피콜린산(2-picolinic acid)에 대하여 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액과 HPLC를 이용하여 비교 분석하였다.

분석을 위한 시료는 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 20% MeCN으로 1/2, 1/4, 1/8 희석하여 사용하였으며 2-피콜린산(2-picolinic acid)은 20% MeCN을 용매로 사용하여 12.5ppm, 25ppm, 50ppm, 100ppm 농도로 제조하여 분석하였다.

동일 피크 유무를 확인하기 위하여 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액 원액과 25ppm, 50ppm, 100ppm 농도의 2-피콜린산(2-picolinic acid) 각각을 절반씩 혼합한 후 분석을 진행하였다.

Agilent사의 HPLC 기기를 사용하였으며 4.6 × 250mm, 5um Eclipse Plus C18 column으로 분리하였다. 0.1% Acetic acid를 포함한 정제수(A) 80%와 acetonitrile(B) 20%를 이동상으로 하여 0.7ml/min의 유속으로 시료 20ul씩을 주입하여 20분 동안 분석하였으며 UV-vis detector로 250nm에서 검출하였다.

그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다. 도 8은 2-피콜린산의 HPLC 분석 결과 및 표준 곡선을 나타낸다. 도 9는 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 배양 상등액의 농도에 따른 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

실험예 10. 피부 자극 시험

(재) 대구테크노파크 한방산업지원센터에 의뢰하여 트리코데르마 아트로비리데 상등액의 인체피부 일차자극시험을 진행하였다. 국제접촉피부염연구회(ICDRG)의 판정기준과 화장품협회(PCPC)의 안전성 가이드라인을 응용하여 평가를 진행하였다. 평가 부위에 이상이 없는 성인 30명을 대상으로 하였다. 모든 대상자에 대해 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액을 24시간 첩포하고 첩포 제거 후 0.5시간, 24시간, 48시간 후에 나타나는 피부증상을 관찰하였다. 피부 자극 정도는 CTFA(The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association) 안전성 평가 가이드라인을 반영한 기준에 따라 판정하였다.

상기와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 상등액의 인체피부 일차자극시험을 진행한 결과 20대 5명, 30대 11명, 40대 4명, 50대 9명, 60대 1명의 모든 연령대에서 첩포전과 0.5시간, 24시간, 48시간 첩포 시 홍반, 발진, 각질, 부종 등에서 변화를 일으키지 않아 무자극(No irritancy)로 판정되었다.

실험예 11. 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액의 항균 활성

트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액의 항균 활성은 Escherichia coli , Bacillus cereus , Streptococcus iniae , Salmonella galinarum 그리고 Salmonella typhymurium을 이용하여 microtiter plate 방법으로 MIC (minimal inhibitiory concentration) 분석을 통해 확인하였다 항균 분석을 위해 overnight(O/N)으로 전 배양된 균주는 10^6 CFU/mL 로 조정하여 실험에 사용하였다.

MIC 분석에 사용된 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액은 2.5%, 5%, 12.5%, 25%, 50%로 조절하였고, 반응액을 96 well microtiter plate 첨가하여 37℃에서 16시간 배양한 후 microtiter reader (Multiscan GO, Thermo Scientific Co. Ltd., Rochester, NY, USA)로 600nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액의 병원성 균주 5종의(Escherichia coli , Bacillus cereus , Streptococcus iniae , Salmonella galinarum, Salmonella typhymurium)에 대하여 항균활성을 평가하기 위하여, microtiter plate 방법으로 minimal inhibitiory concentration(MIC) 분석을 통해 실시한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 트리코데르마 아트로비리데 배양 상등액은 E. coli를 포함한 모든 균주에서 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC18858P

수탁일자 : 20201029

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시의 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> GENOZYME.CO.Ltd. <120> Cosmetic composition for skin whitening comprising Trichoderma atroviride culture extract <130> NPF34164 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 1 ggccagcttt caggcagagg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 2 tggtgcttca tggggaaaat c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 3 tacagcttca ccaccacagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 4 aaggaaggct ggaaaagagc 20

Claims

트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주 배양 추출물을 포함하는, 미백 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주인, 미백 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 미백 화장료 조성물을 포함하는 화장품으로,
상기 화장품은 미백용 비누 또는 클렌저인, 화장품.
i) 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 균주를 1 내지 5일 동안 배양하는 단계;
ii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 얻는 단계; 및
iii) 배양된 트리코데르마 아트로비리데 균주 배양물의 상등액을 첨가하는 단계;를 포함하는, 미백 화장료 조성물의 제조 방법.
제4항에 있어서,
단계 i)에서 상기 트리코데르마 아트로비리데 균주는 기탁번호 KCTC 18858P의 트리코데르마 아트로비리데 sw-1(Trichoderma atroviride sw-1) 균주이고,
단계 iii)에서 상기 트리코데르마 아트로비리데 sw-1 균주 배양물의 상등액을 미백 화장료 조성물 중 5 부피% 이상으로 첨가하는, 미백 화장료 조성물의 제조 방법.