KR20220043687A - 콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

식물의 제초제 저항성 증진 기술과 관련된 것으로, 보다 구체적으로, 콩의 5-에놀-피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase; EPSPS) 암호화 유전자에 돌연변이를 도입하여, 콩의 글라이포세이트 (glyphosate)에 대한 저항성을 증진 및/또는 부여하는 기술이 제공된다.

Description

콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하기 위한 조성물 및 방법{Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Glyphosate Tolerance of Soybean}
식물의 제초제 저항성 증진 기술과 관련된 것으로, 보다 구체적으로, 콩의 5-에놀-피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase; EPSPS) 암호화 유전자에 돌연변이를 도입하여, 콩의 글라이포세이트 (glyphosate)에 대한 저항성을 증진 및/또는 부여하는 기술이 제공된다.
제초제 저항성 작물의 개발은 쉽고 빠른 대규모 제초작업을 가능하게 하여 식량 생산성의 향상 및 농가 수입 증대에 기여하는 중요한 기술이다. 특히, 수작업이 불가능한 대규모 경작의 경우, 제초제 저항성 작물을 도입하여 경작함으로써 트렉터나 경비행기를 이용한 제초제의 대량 살포가 가능하여, 생산성이 크게 향상될 수 있다.
한편, 글라이포세이트 (glyphosate)는 방향족 아미노산을 생산하는 경로의 필수 효소인 5-에놀-피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase; EPSPS)를 억제하는 제초제이다. 글라이포세이트는 1996년 글라이포세이트 저항성 작물이 출시된 이래로 매출이 급격히 성장하여, 현재 전세계적으로 가장 널리 쓰이는 제초제 중 하나이며, 특히 미국의 옥수수 및 대두 작물의 90% 이상은 글라이포세이트 저항성 작물이다. 글라이포세이트의 탁월한 제초 효과로 그 사용량이 급격히 증가하면서 부작용으로 글라이포세이트 저항성 잡초가 등장하게 되었고, 이를 제거하기 위하여 기존보다 많은 양의 글라이포세이트 사용하게 됨으로써, 목표 작물의 생산성이 감소하는 문제가 생기고 있다.
이를 해결하기 위하여, 작물의 글라이포세이트에 대한 저항성을 보다 향상시키기 위한 기술의 개발이 요구된다.
본 명세서에서, 콩에 내재하는 5-에놀-피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase; EPSPS) 암호화 유전자에 돌연변이를 도입하여, 콩의 글라이포세이트 (glyphosate)에 대한 저항성을 증진 및/또는 부여하는 기술이 제공된다.
일 예는 콩의 EPSPS 단백질의 아미노산 서열에서 1개 이상 또는 2개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드는 콩의 EPSPS 단백질 (NCBI Accession No. XP_003517039.1; 서열번호 1)의 (1) 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기, 또는 (2) (i) 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기와 (ii) 27번째, 233번째, 251번째, 및 493번째 위치 중에서 선택된 하나 이상의 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 변이된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 변이는 원래와 다른 아미노산으로 치환 (아미노산 치환), 결실, 및/또는 해당 위치의 아미노산 부가 등일 수 있으며, 예컨대, 아미노산 치환일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 글라이포세이트 저항성이 부여 및/또는 증진된 콩의 제조용 또는 콩의 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 콩에 도입하여, 글라이포세이트 저항성이 증진 및/또는 부여된 콩을 제조하는 방법 또는 콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 방법은,
(1) 콩의 내재하는 EPSPS 암호화 유전자에 상기 폴리펩타이드에 포함된 아미노산 변이(치환)를 암호화하는 돌연변이를 도입하거나,
(2) 앞서 설명한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 콩에 도입시켜, (i) 상기 콩에 내재하는 EPSPS 암호화 유전자에 더하여, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하도록 형질전환시키거나, (ii) 상기 콩의 내재하는 EPSPS 암호화 유전자의 전부 또는 일부를 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부(상기 콩의 내재하는 EPSPS 암호화 유전자의 일부와 대응되는 부분)로 치환(대체)되도록 형질전환시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 콩(형질전환 콩)을 제공한다.
일 예에서, 상기 형질전환 콩은, 상기 폴리펩타이드를 암호화하도록 돌연변이가 도입된 내재하는 EPSPS 암호화 유전자를 포함하거나, 내재하는 EPSPS 암호화 유전자를 대체하여 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 내재하는 EPSPS 암호화 유전자에 더하여 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 형질전환 콩은 앞서 설명한 글라이포세이트 저항성이 증진 및/또는 부여된 콩을 제조하는 방법 또는 콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하는 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합을 포함하는 형질전환 콩 또는 상기 형질전환 콩이 제공된 재배지에 글라이포세이트의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 콩 재배 방법 또는 콩 재배시의 원하지 않는 생물 제거 방법을 제공한다. 상기 원하지 않는 생물의 제거 방법은 잡초 제거 방법일 수 있다.
본 명세서에서, DNA 복제의 정확도가 낮은 DNA 중합효소를 이용하여 콩 (Glycine max)의 EPSPS 서열에 무작위 돌연변이를 도입하고, 이를 플라스미드 형태의 라이브러리로 제작하고, 이와 같이 제작된 라이브러리를 EPSPS(5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase)가 결실된 대장균 균주에 형질전환하여서 포도당과 글라이포세이트(Glyphosate)가 첨가된 M9 최소배지에서 배양하고, 이와 같이 외부로부터 방향족 아미노산을 공급받지 못하면서 글라이포세이트가 존재하는 환경에서도 성장하는 대장균 클론들을 선별하여, 이들이 글라이포세이트 저항성 EPSPS 변이를 지니고 있음을 확인하였다. 상기 선별된 클론들을 글라이포세이트가 포함된 액체배지에 접종하고, 그 성장 정도를 야생형 EPSPS을 포함하는 대장균과 비교함으로써, 이들이 글라이포세이트에 대하여 저항성을 가짐을 다시 한 번 확인하고, 저항성이 특히 우수한 클론들을 선별하였다. 또한, 상기 선별된 클론에 포함된 변이 EPSPS 암호화 유전자를 콩에 도입 시 제초제 저항성이 획득됨을 확인하였다. 본 명세서에서는, 상기 선별된 클론의 EPSPS 서열을 분석하여, 콩의 글라이포세이트 저항성에 기여하는 EPSPS 변이체 및 이의 용도를 제안한다.
본 명세서에서, 식물(구체적으로, 콩)에 제초제(구체적으로, 글라이포세이트)에 대한 저항성을 부여 및/또는 증진하는 기술이 제공된다.
본 명세서에서, '콩의 글라이포세이트에 대한 저항성 부여 및/또는 증진' 또는 '콩의 글라이포세이트에 대한 저항성 증진'이란 글라이포세이트에 저항성이 없는 콩에 대하여 저항성을 부여하는 것, 또는 글라이포세이트에 저항성을 지닌 콩에 대하여 그 저항성을 보다 향상시키는 것, 또는 이 모두를 포괄하는 광범위한 의미로 해석될 수 있다.
본 명세서에서, '소정의 서열로 이루어진', '소정의 서열을 필수적으로 하여 이루어진' 또는 '소정의 서열을 포함하는' 이라 함은 기재된 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하는 경우를 모두 의미하기 위하여 사용되며, 원래의 기능을 유지하는 한, 기재된 서열 이외의 서열을 포함하거나 변이를 포함하는 것을 배제하는 의도로 해석되지 않는다.
본 명세서에서, '서열번호로 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드' 및 '서열번호로 정의된 핵산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드'는, (1) 해당 서열번호의 서열을 필수적으로 포함하거나, (2) 해당 서열번호의 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질 (또는 폴리펩타이드) 또는 유전자 (또는 폴리뉴클레오타이드)를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 상기 (2)의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 원래 (100% 동일한 서열을 포함하는) 폴리펩타이드의 기능 (예컨대, 본래의 효소 활성)을 유지하면서, 본 명세서에서 목적하는 식물 (콩)의 글라이포세이트 저항성 증진 및/또는 부여 기능을 보유하는 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 기능을 유지한다 함은, 예컨대, 식물 내 (식물체 내, 식물 세포 또는 식물 세포 배양체 내, 식물 조직 내 등) 및/또는 시험관내에서 측정된 바로서, 원래 (100% 동일한 서열을 포함하는) 폴리펩타이드의 효소 활성의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서에서, EPSPS (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase)는 식물 또는 미생물에 존재하는 효소로서, 포르포에놀피루베이트 (phosphoenolpyruvate; PEP)와 3-포스포시키메이트 (3-phosphoshikimate; S3P)의 포스페이트와 5-에놀피루빌시키메이트-3포스페이트 (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate; EPSP)로의 변환에 관여하는 촉매이다. 콩의 EPSPS는 Glycine max의 EPSPS일 수 있으며, 예컨대, NCBI Accession No. XP_003517039.1 (서열번호 1), XP_003521857.1 등으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 콩의 EPSPS는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 콩의 EPSPS 암호화 유전자는 콩 (예컨대, Glycine max)의 게놈에 내재하는 유전자로, 상기한 EPSPS를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 예컨대, SoyBase Accession No. Glyma.01G139600 (mRNA: Glyma.01g139600.1, NCBI mRNA Accession No.: XM_003516991.4), Glyma.03G027400 (mRNA Glyma.03g027400.1, NCBI mRNA Accession No.: XM_003521809.4) 등으로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 콩의 EPSPS 암호화 유전자는 서열번호 2(Glyma.01g139600)의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 아미노산 변이가 일어나는 아미노산 잔기 (위치 및 아미노산 종류)는 서열번호 1을 기준으로 기재되었으나, 이에 해당하는 다른 이소형(isoform)의 콩의 EPSPS의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기도 포함하는 것으로 이해될 수 있으며, 상기 '해당하는 다른 이소형의 콩의 EPSPS의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기'를 결정하는 것은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일 예는 콩의 EPSPS 단백질의 아미노산 서열에서 1개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 변이된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 아미노산 잔기의 변이는 원래와 다른 아미노산으로 치환 (아미노산 치환), 결실, 및/또는 해당 위치의 아미노산 부가 등일 수 있으며, 예컨대, 아미노산 치환일 수 있다. 상기 EPSPS 단백질 변이체에 포함된 아미노산 변이는 EPSPS 단백질과 글라이포세이트 간 상호작용 (결합) 부위의 아미노산 잔기 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 아미노산 변이를 갖는 EPSPS 단백질 변이체는 변이 전의 EPSPS의 효소 활성을 유지하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 폴리펩타이드는, 다르게 기재되지 않는 한, EPSPS 단백질 변이체 또는 변이 EPSPS 단백질과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 폴리펩타이드를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
일 예에서 제공되는 폴리펩타이드는, 콩 (Glycine max)의 EPSPS 단백질의 아미노산 서열에서, 하기의 아미노산 잔기가 각각 독립적으로 원래와 다른 아미노산으로 치환 및/또는 결실 및/또는 상기 위치에 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:
(1) 서열번호 1의 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기 (예컨대, 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌(T)으로 치환됨), 또는
(2) 서열번호 1의 (i) 182번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기 (예컨대, 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌(T)으로 치환됨) 및 (ii) 27번째, 233번째, 251번째, 및 493번째 위치 중에서 선택된 하나 이상 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 위치에 해당하는 아미노산 잔기.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는, 콩의 EPSPS 단백질의 아미노산 서열에서, 하기의 아미노산 잔기가 각각 독립적으로 원래와 다른 아미노산으로 치환 및/또는 결실 및/또는 상기 위치에 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 1의 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기 (예컨대, 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌(T)으로 치환됨);
서열번호 1의 187번째 (예컨대, 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌(T)으로 치환됨) 및 27번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기;
서열번호 1의 187번째 (예컨대, 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌(T)으로 치환됨) 및 233번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기; 또는
서열번호 1의 187번째 (예컨대, 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌(T)으로 치환됨) 및 251번째와 493번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기.
상기 아미노산 치환은 상기한 위치의 아미노산 잔기가, 각각 독립적으로, 히스티딘(H), 류신(L), 발린(V), 글라이신(G), 아스파라긴(N), 트립토판(W), 알라닌(A), 아르기닌(R), 타이로신(Y), 라이신(K), 시스테인(C), 이소류신(I), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 아스파르트산(D), 프롤린(P), 트레오닌(T), 글루타민(Q), 세린(S), 및 메티오닌(M) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환되는 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 콩의 EPSPS 단백질의 아미노산 서열이 다음에 해당하는 아미노산 치환으로 변이된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 1 기준으로,
P187T (187번째 아미노산 잔기인 프롤린(P)이 트레오닌(T)으로 치환; 이하 아미노산 치환 표현에 동일하게 적용됨; 178번째 아미노산 잔기에 해당하는 위치에 트레오닌을 포함하는 것을 의미할 수 있음 (이하 동일하게 해석됨)); 또는
P187T와, K27E, G233V, K251T, 및 A493V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 조합.
예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 콩의 EPSPS 단백질의 아미노산 서열이 다음에 해당하는 아미노산 치환으로 변이된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 1 기준으로,
187번째에 해당하는 위치에 트레오닌 포함 (P187T);
187번째에 해당하는 위치에 트레오닌 포함 및 27번째 해당하는 위치에 글루탐산 포함 (P187T 및 K27E의 조합; 'K27E+P187T'로 표시될 수 있음);
187번째에 해당하는 위치에 트레오닌 포함 및 233번째 해당하는 위치에 발린 포함 (P187T 및 G233V의 조합; 'P187T+G233V'로 표시될 수 있음); 또는
187번째에 해당하는 위치에 트레오닌 포함, 251번째 해당하는 위치에 트레오닌 포함, 및 493번째 해당하는 위치에 발린 포함 (P187T, K251T, 및 A493V의 조합; 'P187T+K251T+A493V'로 표시될 수 있음).
상기한 콩의 EPSPS 단백질에 아미노산 치환 변이가 도입된 폴리펩타이드(EPSPS 단백질 변이체)는 EPSPS 본래의 효소 활성은 유지하면서, 콩에서 야생형과 비교하여 증진된 글라이포세이트 저항성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 폴리펩타이드는, 본래의 효소 활성 및 목적하는 글라이포세이트 저항성을 보유하는 것을 조건으로, 앞서 설명한 바와 같은 서열번호 1에서의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열(100% 동일)을 포함하는 폴리펩타이드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추가적 변이는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환일 수 있다. 일 예에서, 상기 추가적 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 또는 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산이 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아실화 (acylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수식 (modification) 될 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 변이 및/또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리펩타이드에 포함된 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www. genscript. com/codon-opt. html", "http://sg. idtdna. com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
본 명세서에서, EPSPS 단백질 (야생형) 또는 여기에 앞서 설명한 아미노산 변이가 가해진 폴리펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻거나, 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 상기 숙주세포에서 발현된 폴리펩타이드의 분리 및 정제를 위하여, 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들 중 2가지 이상을 조합하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서, EPSPS 단백질 (야생형) 또는 여기에 앞서 설명한 아미노산 변이가 가해진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 합성되거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 명세서의 실시예에서는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 대장균의 글라이포세이트 처리시의 생존률이 야생형 EPSPS 단백질 (실시예 참조)과 비교하여 증가한 것을 확인하여, 상기 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진 효과를 확인하였다.
일 예는 상기 폴리펩타이드 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 글라이포세이트 저항성을 부여 및/또는 증진 용도를 제공한다.
보다 구체적으로,
(1) 앞서 설명한 폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
(3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
(4) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
상기 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물은 콩에 적용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는
(1) 앞서 설명한 폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
(3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
(4) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 글라이포세이트 저항성이 부여 및/또는 증진된 콩의 제조용 또는 콩의 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다. 상기 글라이포세이트 저항성이 부여 및/또는 증진된 콩의 제조용 또는 콩의 글라이포세이트 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물은 콩에 글라이포세이트에 대한 저항성을 부여하거나 및/또는 야생형 EPSPS 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 콩과 비교하여, 글라이포세이트에 대한 저항성 증진(또는 이와 같이 저항성이 부여되거나 및/또는 증진된 콩의 제조)이 가능하다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 콩에 도입(형질전환)하는 단계를 포함하는, 글라이포세이트 저항성이 증진 및/또는 부여된 콩을 제조하는 방법 또는 콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 방법은,
(1) 콩의 내재하는 EPSPS 암호화 유전자에 본 명세서에 설명된 아미노산 변이(치환)를 암호화하도록 돌연변이를 유도하거나,
(2) 앞서 설명한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 콩에 도입시켜, (i) 상기 콩에 내재하는 EPSPS 암호화 유전자에 더하여, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하도록 형질전환시키거나, (ii) 상기 콩의 내재하는 EPSPS 암호화 유전자의 전부 또는 일부를 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부(상기 콩의 내재하는 EPSPS 암호화 유전자의 일부와 대응되는 부분)로 치환(대체)되도록 형질전환시키는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 글라이포세이트 저항성이 증진 및/또는 부여된 콩을 제조하는 방법 또는 콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하는 방법은,
(1) 콩에 내재하는 EPSPS 암호화 유전자를 상기 아미노산 변이된 폴리펩타이드(EPSPS 단백질 변이체)를 암호화하도록 변이시키는 단계;
(2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 콩 (예컨대, 콩 세포 또는 콩 유전체(genome))에 도입하는 단계; 또는
(3) 상기 단계 (1) 및 (2) 모두
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (1)의 콩에 내재하는 EPSPS 암호화 유전자의 변이 단계는 통상적으로 사용 가능한 유전자 변이 수단, 예컨대, CRISPR-Cas 시스템 (Cas9 단백질, Cas3 단백질, 또는 이의 암호화 유전자 및 가이드 RNA 또는 이의 암호화 DNA의 혼합물, 복합체, 또는 상기 유전자 및/또는 DNA를 포함하는 재조합 벡터 등), CRISPR-Cpf1, Zinc Finger nuclease, TALEN 등에 의하여 수행될 수 있다.
상기 단계 (2)에서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터가 도입되는 콩은 상기 폴리펩타이드가 유래하는 콩과 동일한 종(species)의 동일 개체, 또는 동일한 종(species) 또는 동일한 속(genus; 종이 다른 경우도 포함)의 다른 개체의 것일 수 있다.
다른 예는 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 콩(형질전환 콩)을 제공한다. 상기 형질전환 콩은 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함함으로써, 이를 포함하지 않는 콩 (예컨대, 야생형 EPSPS 또는 이를 암호화 유전자를 포함하는 콩)과 비교하여, 글라이포세이트에 대한 저항성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 형질전환 콩은, 내재하는 EPSPS 유전자 및/또는 내재하는 EPSPS 단백질에 추가하여, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 추가로 포함되는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드는 상기 형질전환 콩과 동일한 종(species)의 동일 개체, 또는 동일한 종(species) 또는 동일한 속(genus; 종이 다른 경우도 포함)의 다른 개체에서 유래한 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 형질전환 콩은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 내재하는 EPSPS 암호화 유전자로서 포함하거나, 상기 폴리펩타이드를 내재하는 EPSPS 단백질로서 포함하는 것일 수 있다. 상기 '내재하는 유전자 또는 단백질'은 변이가 도입되는 세포 내에 원래 존재하는 유전자 또는 단백질을 의미하는 것으로, 외래의 유전자 또는 단백질 (예컨대, 다른 종 또는 다른 개체로부터 유래된 유전자 또는 단백질)이 아님을 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 형질전환 콩은 앞서 설명한 글라이포세이트 저항성이 증진 및/또는 부여된 콩을 제조하는 방법 또는 콩의 글라이포세이트 저항성을 증진 및/또는 부여하는 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바로서, '콩 또는 형질전환 콩'은 콩의 세포, 원형질체, 캘러스, 배아, 배축, 종자, 자엽, 식물체 전체(whole body), 또는 그의 자손으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 콩의 EPSPS 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 EPSPS 단백질에서 아미노산 변이가 일어나는 부위는, 변이가 되어도 EPSPS 원래의 효소 활성에 영향이 없거나 유의미한 영향을 미치지 않는 부위 또는 아미노산 잔기로서, 글라이포세이트와 상호작용 (결합)하는 부위 또는 아미노산 잔기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방법으로 제조되거나, 글라이포세이트 저항성이 부여 및/또는 증진된 콩 (형질전환 콩)은, EPSPS 단백질 및/또는 EPSPS 단백질을 암호화하는 유전자에 상기 돌연변이가 도입되지 않은 경우(예컨대, 야생형 콩)와 비교하여, 높은 글라이포세이트 저항성(예컨대, 글라이포세이트 처리시의 높은 생장률 및/또는 생존률 및/또는 종자 수득률 등)을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 콩에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 콩의 형질전환용 재조합 벡터(발현 벡터)가 이용될 수 있다.
식물체(콩) 형질전환의 경우에 벡터에 포함 가능한 적합한 프로모터로서, 식물체 내 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 모든 프로모터를 사용할 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유니트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB (blue copper binding protein) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end), 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터 (octopine synthase terminator), 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 및 파세올린 (phaseolin) 터미네이터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자로서 선택 표지를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지의 예로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 앰피실린, 클로람페니콜 등) 또는 제초제 (글라이포세이트 제외) 저항성 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti (tumor inducing) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB (left border)와 RB (right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터이다.
상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며 (Agrobacterium-mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법 (electroporation), 입자 총법 (particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및/또는 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본 명세서에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포 (현탁배양 세포 포함), 원형질체 (protoplast), 캘러스 (callus), 배축 (hypocotyl), 종자 (seed), 자엽 (cotyledon), 신초 (shoot) 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
또한, 본 명세서의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손 (T1 세대, T2 세대, T3 세대, T4 세대, T5 세대, 또는 그 이상)을 포함하며, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 암호화 유전자로 형질전환된 콩의 무성 또는 유성 자손으로서 글라이포세이트 저항성 형질이 유전된 식물들도 본 발명의 형질전환 식물의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서의 형질전환된 콩의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께, 초기 형질전환된 콩의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 콩, 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 괴경, 및/또는 괴근과 같은 식물의 일부도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 명세서의 기술이 적용되는 식물은 콩일 수 있으며, Glycine max, Glycine albicans, Glycine aphyonota, Glycine arenaria, Glycine argyrea, Glycine canescens, Glycine clandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine dolichocarpa, Glycine falcata, Glycine gracei, Glycine hirticaulis, Glycine hirticaulis subsp., Glycine lactovirens, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine microphylla, Glycine montis-douglas, Glycine peratosa, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Glycine priceana, Glycine pullenii, Glycine rubiginosa, Glycine soja, Glycine stenophita, Glycine syndetika, Glycine tabacina, Glycine tomentella, Glycine wrightii 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합을 포함하는 형질전환 콩 또는 상기 형질전환 콩이 제공된 재배지에 글라이포세이트의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 콩 재배 방법 또는 콩 재배시의 원하지 않는 생물 제거 방법을 제공한다. 상기 원하지 않는 생물의 제거 방법은 잡초 제거 방법일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 글라이포세이트 저항성 EPSPS 단백질의 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 식물, 예컨대 콩에 적용함으로써 우수한 글라이포세이트 저항성 형질 부여 및/또는 증진 효과를 얻을 수 있고, 글라이포세이트를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 생물을 제거하여, 작물의 생산성을 증대시킬 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 글라이포세이트 저항성 EPSPS 단백질의 변이체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 대장균의 글라이포세이트 저항성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 일 실시예에 따른 글라이포세이트 저항성 EPSPS 단백질의 변이체를 암호화하는 유전자로 형질전환된 콩의 글라이포세이트 저항성을 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 플라스미드 준비
E. coli를 숙주로 한 글라이포세이트 저항성 유전자 스크리닝 플랫폼 구축을 위하여, pSTV28-trc-GmEPSPS를 제작하였다. 해당 plasmid는 pSTV28 (Addgene; 2999bp)를 backbone vector로 하여, trc promoter, ribosome binding site (RBS), Glycine max 5-enylpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene (GmEPSPS), rrnB T1 transcription terminator 등을 포함하고 있으며, 선별마커로서 chloramphenicol 저항성 유전자를 포함한다.
E.coli의 codon usage에 근거해 codon optimization된 Glycine max EPSPS 유전자(SoyBase Accession no. Glyma.01g139600) 및 trc promoter, RBS, rrnB T1 transcription terminator 등을 포함하는 DNA fragment를 우선적으로 합성 후, pBLC vector에 클로닝하여 제작하였다(pBLC-PGE001, 제작업체: ㈜바이오니아, Codon optimization: https://zendto.bioneer.co.kr/codon/index.py).
그 후, EPSPSPgs 1F (5'-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTGACAATTAATCATCCGGC-3') 및 EPSPSPgs 1R (5'-ATGATTACGAATTCGAGCTCATTTGTCCTACTCAGGAGAG-3') 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 증폭하고, 이를 제한효소 처리 및 Gibson Assembly를 통해 pSTV28과의 재조합 Plasmid를 제작하였다.
Insert DNA 증폭을 위한 PCR 반응은 EPSPSPgs1F 및 EPSPSPgs1R 프라이머 (표 1)를 포함한 표 2의 반응액을 제조한 후, 표 3의 조건에 따라 수행하였다.
Insert DNA (trc-RBS-GmEPSPS-rrnB T1)의 DNA* 증폭 위한 PCR 프라이머
PCR primer Sequence (5'→3') 서열번호 Product size
EPSPSPgs 1F CCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTGACAATTAATCATCCGGC 3 1741 bp
EPSPSPgs 1R ATGATTACGAATTCGAGCTCATTTGTCCTACTCAGGAGAG 4
* trc promoter, ribosome binding site, Glycine max EPSPS, 및 rrnB T1 transcription terminator로 구성된 DNA 삽입 단편 (insert DNA).
Insert DNA (trc-RBS-GmEPSPS-rrnB T1)의 DNA* 증폭 위한 PCR 반응액 조성
Component Volume
Deionized water 33. 3 ㎕
5xPCR buffer (NEB) 10 ㎕
EPSPSPgs 1F primer (10 uM, 표 _) 2. 5 ㎕
EPSPSPgs 1R primer (10 uM, 표 _) 2. 5 ㎕
10 mM dNTPs (NEB) 1 ㎕
Template (pBLC-PGE001, 37. 6 ng/㎕) 0.2 ㎕
Q5 High Fidelity DNA Polymerase (NEB) 0.5 ㎕
Total 50 ㎕
* trc promoter, ribosome binding site, Glycine max EPSPS, 및 rrnB T1 transcription terminator로 구성된 DNA 삽입 단편.
pSTV28-trc-GmEPSPS의 DNA* 증폭 위한 PCR 반응 조건
Reaction Temperature Time Cycles
Pre-Denaturation 95℃ 2 m 1
Denaturation 95℃ 30 sec 25
Annealing 55℃ 30 sec
Extension 72℃ 2. 5 m
Final extension 72℃ 7 m 1
* trc promoter, ribosome binding site, Glycine max EPSPS, 및 rrnB T1 transcription terminator로 구성된 DNA 삽입 단편.
ExpinTM Gel SV Kit (GeneAll)를 이용하여 약 1. 7 kb의 DNA 삽입 단편 증폭 산물을 정제한 후, Gibson Assembly® Master Mix (NEB)를 사용하여 해당 증폭 산물을 PstI/SacI-digested pSTV28(Addgene; 2999bp)에 클로닝 하였다. 이를 Chemically competent E. coli DH5α (Enzynomics)에 화학적으로 도입한 후, chloramphenicol 0.25㎍/mL이 첨가된 LB 고체 배지에서 자란 colony를 10 mL의 LB 액체배지(chloramphenicol 0.25㎍/mL 포함)에 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 12-18 시간 배양하였다. ExprepTM Plasmid SV mini Kit (GeneAll)를 이용하여 plasmid DNA (pSTV28-trc-GmEPSPS라 명명)를 추출한 후, ㈜마크로젠을 통해 DNA 삽입 단편의 sequencing (sequencing primer: M13F-pUC (GTTTTCCCAGTCACGAC; 서열번호 5), M13R (GCGGATAACAATTTCACACAGG; 서열번호 6)을 수행하고, SnapGene 프로그램을 이용하여 의도한 서열과의 일치 여부를 확인하였다.
실시예 2. Glycine max EPSPS (GmEPSPS) random mutant library 제작
pSTV28-trc-GmEPSPS의 GmEPSPS에 무작위 돌연변이 (Random Mutation)을 도입하기 위하여 Agilent 사의 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (Catalog #200550)를 사용하였다. GmEPSPS에 변이를 도입하기 위하여 PtrcLibF (5'-GCA-TGC-CTG-CAG-TTG-ACA-ATT-AAT-CAT-CCG-GCT-CGT-ATA-ATG-TGT-GGT-TAA-TTA-AAA-GAA-GGA-GAA-TTC-TAG-ATG-3'; 서열번호 7) 및 rrnBLibR (5'-TTA-CGA-ATT-CGA-GCT-CAT-TTG-TCC-TAC-TCA-GGA-GAG-CGT-TCA-CCG-ACA-AAC―AAC-AGA-TAA-AAC-GAA-AGG-CCC-3'; 서열번호 8) 프라이머를 이용하여 표 4와 같이 Error-prone PCR 반응액을 제조 하였다.
pSTV28-trc-GmEPSPS의 Error-prone PCR 반응 조건
Component Volume
Deionized water Up to 50 μL
10× Mutazyme II reaction buffer (Agilent Tech) 5 μL
PtrcLibF primer (10 μM) 0.5 μL
rrnBLibR primer (10 μM) 0.5 μL
40 mM dNTPs (each 10 mM, Agilent Tech) 1 μL
Template (pSTV28-trc-GmEPSPS)* X μL for initial target 100 ng or 800 ng**
Mutazyme II DNA polymerase (Agilent Tech) 1 μL
Total 50 μL
* 서열 크기에 기초했을 때, 100 ng의 GmEPSPS 유전자 (initial target DNA)를 얻기 위해 283 ng의 pSTV28-trc-GmEPSPS (template DNA)가 필요하다.
** Template DNA의 양을 조절하여 Error-prone PCR의 돌연변이율을 조절한다.
이렇게 수득한 Error-prone PCR의 산물은 전기영동과 젤 추출 기법을 수행하여 정제하였다. 정제한 mutant GmEPSPS와 pSV28의 재조합을 PstI-HF (NEB사의 Cat# R3140) 및 SacI-HF (NEB사의 Cat# R3156) 제한 효소 처리와 Ligation (NEB사의 T4 DNA ligase, Cat# M0202)을 통하여 수행하였다. 이들 효소반응은 제조사에서 제공한 매뉴얼의 지시대로 수행하였다. 그 결과 GmEPSPS random mutant library를 획득하였다. 획득한 library 클론의 95% 이상에 GmEPSPS mutant가 포함되었음을 확인하였으며, 돌연변이는 최소 1개에서 9개까지 포함됨을 시퀀싱을 통해 확인하였다. 시퀀싱에 사용한 프라이머는 표 5의 3가지 프라이머를 이용하였다.
GmEPSPS mutant gene의 sequencing primer
Sequencing primer Sequence (5'→3') 서열번호
M13F GTAAAACGACGGCCAGT 9
ESPSPS_1252R CAAGTGTCATAGCCACATCT 10
ESPSPS_1012F AGTTATTTACTGGCTGGTGC 11
실시예 3. Glyphosate 저항성 Glycine max EPSPS ( GmEPSPS ) mutant 선별 및 검증
상기 실시예 2에서 제작한 GmEPSPS의 random mutant library에서 제초제 저항성을 지니는 클론만을 선별하는 과정을 EPSPS 유전자(aroA)가 knock out된 E. coli BW25113 균주 (Dharmacon, Cat# OEC4987-200826398) 에서 수행하였다. 위 균주에 GmEPSPS random mutant library를 형질전환하였고, 형질전환체를 30 mM Glyphosate를 포함하는 M9 최소배지에 도포하였다 (표 6). M9 최소배지는 E. coli의 생장에 필요한 최소 성분인 단일 탄소원, 무기물, 일부 비타민 만을 포함한 최소 영양 배지로서 방향족 아미노산이 공급되지 않기 때문에 이를 생산하기 위한 EPSPS 활성이 필수적이다. Glyphosate를 포함한 배지이기 때문에 Glyphosate 저항성이 있는 GmEPSPS를 지니는 클론만이 콜로니를 형성하게 된다. 콜로니를 형성한 클론은 표 5의 프라이머를 이용하여 시퀀싱을 통해 서열을 확인하고 이후 실험에서 Glyphosate 저항성을 측정하였다.
M9 고체배지(chloramphenicol 및 30 mM glyphosate 포함) 조성
Component 30 mM glyphosate
Volume
Autoclaved agar / deionized water 1. 5 g / 34. 7 mL
Glyphosate* 5X M9 minimal salts* 0.507 g 20 mL
Autoclaved deionized water* 44 mL
40% glucose stock (100X) 1 mL
0.5 M MgSO4 stock (1000X) 0.1 mL
1 MCaCl2 stock (10000X) 0.01 mL
0.1% thiamine-HCl stock (1000X)** 0.1 mL
0.25% chloramphenicol stock (1000X)** 0.1 mL
Total 100 mL
상기 서열 확인 결과, P187T, K27E+P187T, P187T+G233V, 및 P187T+K251T+A493V 변이가 도입된 GmEPSPS 변이체를 암호화하는 유전자 단편이 도입된 형질전환 E. coli BW25113 균주가 Glyphosate를 포함하는 배지에서 콜로니를 형성함을 확인하였다.
실시예 4. 대장균에서 글라이포세이트 저항성 측정
상기 실시예 3에서 획득한 형질전환체의 글라이포세이트 저항성을 평가하기 위하여, 각각의 단일 colony를 96-well plate의 M9 액체배지(chloramphenicol 0.25㎕ 포함)에 접종하고, 37℃, 200 rpm에서 16 시간 배양 후, 각 배양액의 OD600 (Optical Density at 600 nm)를 측정하였다. 새로운 96 well plate를 이용하여 M9 + 40 mM glyphosate 액체배지(chloramphenicol 25 μg/mL 포함)에 각 균주의 배양액을 Final OD600=0.01이 되도록 접종한다 (Final volume 200 μL). 이를 37℃에서 18시간 배양하였으며 3반복 실험을 수행하였다. 배양 18시간 시점에서 배양물의 OD600 값을 측정하여 형질전환체의 생장 정도를 확인하고 (n=3), 이를 기초로 형질전환체들의 글라이포세이트 저항성을 평가하였다.
M9 배지(chloramphenicol 및 40 mM glyphosate 포함) 조성
Component 40 mM glyphosate
Volume
Glyphosate* 5X M9 minimal salts* 0.676 g 20 mL
Autoclaved deionized water* 78.7 mL
40% glucose stock (100X) 1 mL
0.5 M MgSO4 stock (1000X) 0.1 mL
1 MCaCl2 stock (10000X) 0.01 mL
0.1% thiamine-HCl stock (1000X)** 0.1 mL
0.25% chloramphenicol stock (1000X)** 0.1 mL
Total 100 mL
상기 얻어진 결과를 표 8 및 도 1에 나타내었다:
GmEPSPS 변이체 0 hr 배양 OD600 18 hr 배양 OD600 ΔOD600
Average stdev Average stdev
야생형(WT) 0.029 0.006 0.053 0.015 0.024
P187S (비교군) 0.010 0.002 0.264 0.036 0.254
P187T 0.015 0.002 0.514 0.122 0.499
K27E+P187T 0.009 0.001 0.388 0.062 0.379
P187T+G233V 0.009 0.001 0.338 0.044 0.329
(표 8 에서, ΔOD600: 18hr 배양시의 OD600 값 - 0 hr 배양시의 OD600 값).
표 8 및 도 1에 나타난 바와 같이, 40 mM의 글라이포세이트 존재 하에서, 시험된 모든 GmEPSPS 변이체는, 야생형 대비 약 20배(P187T), 약 15배(K27E+P187T), 및 약 13배(P187T+G233V), 및 P187S 변이체 대비, 약 2배(P187T), 약 1.5배(K27E+P187T), 및 약 1.3배(P187T+G233V) 증가된 세포 생장을 보였으며, 이러한 결과는 상기 GmEPSPS 변이체의 야생형 대비 상승된 글라이포세이트 저항성을 입증한다.
실시예 5. 형질전환콩에서 글라이포세이트 저항성 검증
상기 실시예 4에서 Glyphosate 저항성이 확인된 변이를 지니는 콩 GmEPSPS (유전자: Glyma.01G139600)이 도입된 형질전환 콩을 준비하였다. 구체적으로, 콩 (Williams82)의 종자를 멸균된 MS 배지 (MURASHIGE & SKOOG; Cat. No. M0221; Duchefa)에 심어 6일 동안 배양한다. 배양된 콩의 cotyledonary node를 하배축 0.5cm 포함하여 자르고 생장점에 일정한 상처를 준 후, 상기 변이체들을 대표하P187T+G233V 변이가 도입된 GmEPSPS 변이체 암호화 유전자가 도입된 Agrobacterium과 3일동안 공동배양하였다.
보다 구체적으로, 상기 Agrobacterium 형질전환은 다음의 단계를 포함하는 동결융해기법(Freeze-thaw method)으로 수행하였다:
세포 배양액에서 원심분리로 세포를 농축시켜서 -80도에서 보관하여 얼림;
얼음 위에서 녹인 1의 세포에 DNA를 추가하고 톡톡 쳐서 섞어줌;
DNA를 넣은 세포를 액체질소에 10초 처리;
액체질소 처리 후 37도에 5분 처리;
28도에서 배양 후 적절한 항생제를 지닌 고체 배지에 도말; 및
이렇게 자라난 콜로니를 LB 등의 배지에 배양한 것을 공동배양.
공동 배양이 완료되면 식물 절편에서 Agrobacterium이 충분히 제거될 수 있도록 3~5회 세척한 후 줄기 유도 배지로 옮겨서 2주 동안 배양하는 것을 2회 반복하였다. 이후 줄기가 잘 발달한 식물 절편은 줄기 신장 배지로 옮기고 2주에 한번 계대 배양을 실시하여 줄기가 7 cm이상으로 발달하면 뿌리 유도 배지로 옮기고 5㎝ 정도의 뿌리가 3가닥 이상 발생하면 흙으로 옮겼다. 흙으로 옮긴 식물은 초기에는 외부 공기와 접촉을 차단하고 이후 서서히 외부 공기와 접촉을 늘려 주는 순화 과정을 진행하여 형질전환 콩을 생산하였다. 생산된 콩의 잎 조직 일부를 절취하여 gDNA를 추출하고 도입된 벡터의 염기 서열로 이루어진 P35 F (5'-AAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTC-3'; 서열번호 12)와 P35 R (5'-GCGAAGGATAGTGGGATTGTG-3'; 서열번호 13)의 프라이머를 이용한 PCR (polymerase chain reaction)을 실시하여 목적하는 유전자가 콩에 도입되었는지 여부를 확인하고, 유전자 도입이 확인된 개체에서 제초제 저항성 표현형을 검증하였다.
상기 준비된 형질전환 콩의 상단부의 잘 펼쳐진 어린잎에 15 mM 글라이포세이트를 10 ul의 양으로 1 point dropping 처리하였다.
대조군으로, 야생형 GmEPSPS 유전자가 도입된 형질전환 콩을 준비하여 동일한 시험을 수행하였다.
글라이포세이트 처리 19일 후 모습을 관찰하여 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 야생형 GmEPSPS 유전자가 도입된 형질전환 콩은 글라이포세이트가 적용된 지점 주위에 약해가 관찰되는 반면, GmEPSPS 유전자 변이체(P187T+G233V)가 도입된 형질전환 콩은 약해가 없거나 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 GmEPSPS 유전자 변이체가 도입된 형질전환 콩에 글라이포세이트 저항성이 부여 또는 강화되었음을 보여준다.
<110> LG CHEM, LTD. <120> Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Glyphosate Tolerance of Soybean <130> DPP20201948KR <160> 13 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSPS (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase) of Glycine max <400> 1 Met Ala Gln Val Ser Arg Val His Asn Leu Ala Gln Ser Thr Gln Ile 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Ser Asn Ser Asn Lys Leu Lys Ser Val Asn Ser Val 20 25 30 Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg Ile Pro Met 35 40 45 His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Val Gly Lys Gly Asn 50 55 60 Ser Gly Val Phe Lys Val Ser Ala Ser Val Ala Ala Ala Glu Lys Pro 65 70 75 80 Ser Thr Ser Pro Glu Ile Val Leu Glu Pro Ile Lys Asp Phe Ser Gly 85 90 95 Thr Ile Thr Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Tyr 115 120 125 Ser Glu Asp Ile His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 130 135 140 Arg Val Glu Asp Asp Lys Thr Thr Lys Gln Ala Ile Val Glu Gly Cys 145 150 155 160 Gly Gly Leu Phe Pro Thr Ser Lys Glu Ser Lys Asp Glu Ile Asn Leu 165 170 175 Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val 180 185 190 Val Ala Ala Gly Gly Asn Ala Ser Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg 195 200 205 Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Ala Gly Leu Lys Gln Leu 210 215 220 Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Val Arg 225 230 235 240 Val Asn Gly Lys Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly 245 250 255 Ser Val Ser Ser Gln Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu 260 265 270 Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Val Asp Lys Leu Ile Ser Val 275 280 285 Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Ser 290 295 300 Val Glu His Ser Gly Asn Trp Asp Arg Phe Leu Val His Gly Gly Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Phe Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser 325 330 335 Ala Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Ile Thr 340 345 350 Val Asn Gly Cys Gly Thr Ser Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala 355 360 365 Glu Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Ser Glu Asn Ser 370 375 380 Val Thr Val Ser Gly Pro Pro Arg Asp Phe Ser Gly Arg Lys Val Leu 385 390 395 400 Arg Gly Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr 405 410 415 Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asn Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp 420 425 430 Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys 435 440 445 Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr 450 455 460 Cys Val Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr 465 470 475 480 Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Gly 485 490 495 Asp Val Pro Val Thr Ile Lys Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe 500 505 510 Pro Asp Tyr Phe Glu Val Leu Glu Arg Leu Thr Lys His 515 520 525 <210> 2 <211> 1578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSPS coding gene (Glyma.01g139600) of Glycine max <400> 2 atggcccaag tgagcagagt gcacaatctt gctcaaagca ctcaaatttt tggccattct 60 tccaactcca acaaactcaa atcggtgaat tcggtttcat tgaggccacg cctttggggg 120 gcctcaaaat ctcgcatccc gatgcataaa aatggaagct ttatgggaaa ttttaatgtg 180 gggaagggaa attccggcgt gtttaaggtt tctgcatcgg tcgccgccgc agagaagccg 240 tcaacgtcgc cggagatcgt gttggaaccc atcaaagact tctcgggtac catcacattg 300 ccagggtcca agtctctgtc caatcgaatt ttgcttcttg ctgctctctc tgagggaaca 360 actgttgtag acaacttgtt gtatagtgag gatattcatt acatgcttgg tgcattaagg 420 acccttggac tgcgtgtgga agatgacaaa acaaccaaac aagcaattgt tgaaggctgt 480 gggggattgt ttcccactag taaggaatct aaagatgaaa tcaatttatt ccttggaaat 540 gctggtactg caatgcgtcc tttgacagca gctgtggttg ctgcaggtgg aaatgcaagc 600 tacgtacttg atggggtgcc ccgaatgaga gagaggccaa ttggggattt ggttgctggt 660 cttaagcaac ttggtgcaga tgttgattgc tttcttggca caaactgtcc acctgttcgt 720 gtaaatggga agggaggact tcctggcgga aaggtgaaac tgtctggatc agttagcagt 780 caatacttga ctgctttgct tatggcagct cctttagctc ttggtgatgt ggaaattgag 840 attgttgata aactgatttc tgttccatat gttgaaatga ctctgaagtt gatggagcgt 900 tttggagttt ctgtggaaca cagtggtaat tgggataggt tcttggtcca tggaggtcaa 960 aagtacaagt ctcctggcaa tgcttttgtt gaaggtgatg cttcaagtgc cagttattta 1020 ctagctggtg cagcaattac tggtgggact atcactgtta atggctgtgg cacaagcagt 1080 ttacagggag atgtaaaatt tgctgaagtt cttgaaaaga tgggagctaa ggttacatgg 1140 tcagagaaca gtgtcactgt ttctggacca ccacgagatt tttctggtcg aaaagtcttg 1200 cgaggcattg atgtcaatat gaacaagatg ccagatgttg ccatgacact tgctgttgtt 1260 gcactatttg ctaatggtcc cactgctata agagatgtgg caagttggag agttaaagag 1320 actgagagga tgatagcaat ctgcacagaa ctcagaaagc taggagcaac agttgaagaa 1380 ggtcctgatt actgtgtgat tactccacct gagaaattga atgtcacagc tatagacaca 1440 tatgatgacc acagaatggc catggcattc tctcttgctg cttgtgggga tgttccagta 1500 accatcaagg atcctggttg caccaggaag acatttcctg actactttga agtccttgag 1560 aggttaacaa agcactaa 1578 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSPSPgs 1F primer <400> 3 ccaagcttgc atgcctgcag ttgacaatta atcatccggc 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPSPSPgs 1R primer <400> 4 atgattacga attcgagctc atttgtccta ctcaggagag 40 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F-pUC primer <400> 5 gttttcccag tcacgac 17 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R primer <400> 6 gcggataaca atttcacaca gg 22 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PtrcLib_F primer <400> 7 gcatgcctgc agttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggtta attaaaagaa 60 ggagaattct agatg 75 <210> 8 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrnBLib_R primer <400> 8 ttacgaattc gagctcattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa 60 aacgaaaggc cc 72 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13_F primer <400> 9 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESPSPS_1252_R primer <400> 10 caagtgtcat agccacatct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESPSPS_1012_F primer <400> 11 agttatttac tggctggtgc 20 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35 F primer <400> 12 aagcaagtgg attgatgtga tatctc 26 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35 R primer <400> 13 gcgaaggata gtgggattgt g 21

Claims (16)

  1. 콩의 EPSPS (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase) 단백질이 다음의 아미노산 변이에 의하여 변이된 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 을 포함하는 폴리펩타이드:
    서열번호 1을 기준으로,
    (1) 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환, 또는
    (2) 다음의 (i)과 (ii)의 조합: (i) 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 및 (ii) 27번째 및 233번째 위치 중에서 선택된 하나 이상의 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 각각 독립적으로 원래와 다른 아미노산으로 치환, 결실 또는 부가.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 변이는 다음을 포함하는 것인, 폴리펩타이드:
    서열번호 1의 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환;
    서열번호 1의 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 및 27번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 원래와 다른 아미노산으로 치환; 또는
    서열번호 1의 187번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 및 233번째 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 원래와 다른 아미노산으로 치환.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 변이는 다음을 포함하는 것인, 폴리펩타이드:
    서열번호 1 기준으로,
    P187T; 또는
    P187T와, K27E 및 G233V로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조합.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 변이는 다음에 해당하는 것인, 폴리펩타이드:
    서열번호 1 기준으로,
    P187T;
    P187T 및 K27E의 조합; 또는
    P187T 및 G233V의 조합.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 콩의 글라이포세이트에 대한 저항성 증진 또는 부여용 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 콩에 도입하거나, 상기 폴리펩타이드를 암호화하도록 콩의 내재 EPSPS 암호화 유전자를 변이시키는 단계를 포함하는, 글라이포세이트 저항성이 증진 또는 부여된 콩의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 콩은 콩의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 식물체 전체, 또는 그의 자손인, 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 콩에 도입하거나, 상기 폴리펩타이드를 암호화하도록 콩의 내재 EPSPS 암호화 유전자를 변이시키는 단계를 포함하는, 콩의 글라이포세이트 저항성 증진 또는 부여 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 콩은 콩의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 식물체 전체, 또는 그의 자손인, 콩의 글라이포세이트 저항성 증진 또는 부여 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 글라이포세이트에 대한 저항성을 가지는 콩 형질전환체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 콩의 형질전환체는 콩의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 식물체 전체, 또는 이의 자손인, 콩 형질전환체.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환 콩 또는 상기 형질전환 콩이 제공된 재배지에 글라이포세이트의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 콩 재배 방법.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환 콩 또는 상기 형질전환 콩이 제공된 재배지에 글라이포세이트의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 콩 재배지에서 잡초를 방제하는 방법.
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