KR20220043050A - 미생물을 포함하는 염증성 질환 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

미생물을 포함하는 염증성 질환 진단 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 패칼리박테리움속 미생물 및 이를 포함하는 장 질환 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

미생물을 포함하는 염증성 질환 진단 또는 치료용 조성물{Composition for diagnosis or treatment of inflammatory diseases including microorganism}
본 발명은 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 염증성 질환의 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증은 개체의 면역계가 침입 병원균 같은 유해성분에 대응하고자 할 때 발생한다. 면역조절 세포, 사이토카인 및 아폽토시스가 포함된 면역조절 기작은 병원균을 막기 위한 과도한 반응으로 발생하는 면역반응을 조절한다. 이러한 메카니즘이 결핍될 경우 염증성 장질환(inflammatory bowl disease, IBD)를 비롯한 다양한 염증 질환으로 나타난다. 상기 염증성 질환은, 예를 들면 염증성 장질환 (크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군, 만성 소화 장애(coeliac disease), 전염성 대장염(예를 들어, C. 디피실 (C. difficile)에 의해 기인함), 베체트병(Behcet’s disease), 그 밖의 위장관-관련된 질병, 및 이의 어떠한 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 염증성 위장관 질환을 포함한다.
염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)는 위장관의 만성적인 염증 상태로 붕괴된 점막 구조, 장내 미생물 조성 변화 및 전신 생화학적 비정상이 특징적이다. IBD는 염증의 임상 양상과 장 내 국소화에 따라 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC)과 크론병(Crohn`s disease, CD)으로 나뉘어진다. IBD의 정확한 병인은 알려져 있지 않으나, 장내 세균총의 변화나 병원성 미생물로 인한 환경적 요인에 의해 촉발된 과도한 면역반응이 주요 병인으로 알려져 있다.
IBD는 복합적이고 잘 알려져 있지 않은 병인에 의한 질병이기 때문에, IBD의 치료는 매우 제한적이며, 치료보다는 증상을 호전시켜 관해를 유도하고 관해 유지에 초점을 맞추고 있다. 병변의 범위, 중증도 및 임상양상, 합병증 등을 고려하여 최적의 치료방법을 선택하게 된다.
염증성 장질환의 치료제는 다양한 작용기전을 통해 효과를 나타내기 때문에 정교한 임상지침에 따라 단계적으로 사용되고 있으며 5-aminosalicylate와 corticosteroid는 경증 내지 중등증의 IBD에 1차 요법으로 자주 사용되며, TNF-α 억제제(예, infliximab, adalimumab and golimumab등 )과 같은 생물학적 제제는 1차 약제에 반응이 없거나 실패한 환자에게 2차 약제로 사용되도록 권장되고 있다. 그러나 질병 초기에 고농도의 TNF-α 억제제를 투여하는 환자가 기하급수적으로 증가하고 있다. 강력한 면역억제제의 장기 사용으로 인한 심각한 부작용 문제가 있어 대체 치료제에 대한 지속적인 임상적 필요성(clinical needs)을 나타내고 있다.
IBD와 장내 세균총 사이의 연관성은 세계적으로 많은 연구에서 확인되고 있는데, IBD환자에서 유익균(beneficial bacteria)의 결핍이 특징적인 미생물 군집 불균형(microbiota dysbiosis)가 나타나는 것으로 보고되고 있으며, 미생물 군집 불균형이 IBD의 면역병인(immunopathogenesis)으로 고려되고 있다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움 속 미생물을 이용한, 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환의 발병위험도 예측 또는 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환 진단하거나, 상기 미생물을 이용하여 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 반응성을 예측 또는 평가하는 조성물, 키트 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움 속 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 의약 또는 식품일 수 있다.
또한, 본 발명은 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 진단, 예를 들면 투여할 대상을 선택 또는 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 효능을 평가에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움 속 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환의 진단 방법, 조성물 또는 키트, 패칼리박테리움 속 미생물의 균체 등을 투여할 대상을 선택하는 방법, 조성물 또는 키트, 또는 대상에게 패칼리박테리움 속 미생물의 균체 등을 투여하여 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 효능을 평가하는 방법, 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 예는 본 발명에 따른 패칼리박테리움 속 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 함께, 항-염증제, 부신피질호르몬제(corticosteroid), 면역조절제(immunomodulator), 항생제(antibiotics), 종양 괴사인자 억제제(tumor necrosis factor-α agent inhibitor, TNF-α inhibitor), 야누스키나아제 억제제(예, 토파시티닙등), 항인테그린제제(예, 베돌리주맙등), 인터루킨억제제(예, 우스테키누맙 등) 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환 또는 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 항-염증제의 예는 5-아미노살리실산, 설파살라진 및 올살라진을 포함한다. 스테로이드류의 예는 코르티코스테로이드류, 글루코코르티코스테로이드류, 프레드니손, 프레드니솔론, 하이드로크로티손, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 및 아드레노코르티코트로픽 호르몬(Adrenocorticotropic hormone)(이하 "ACTH"라 약칭함.)을 포함한다. 면역조절제의 예는 디글리코리피드된, 디글리코리피드된 마이코박테리움 바캐)(deglycolipidated, deglycolipidated Mycobacterium vaccae)(이하 "PVAC"라 약칭함.), 항-종양괴사인자 수용체 상과 요소 5(Tumor Necrosis Factor receptor superfamily member 5)(이하 "항-CD40"이라 약칭함.) 리간드, 항-CD40, 나탈리주마브(natalizumab) (AntegrenTM), 항-맥관유착분자-1(Vascular Adhesion Molecule-1)(이하 "항-VCAM1"이라 약칭함.) 및 항-세포간유착분자-1(Intercellular Adhesion Molecule-1)(이하 "항-ICAM1"이라 약칭함.)을 포함한다. 사이토카인의 예는 인터류킨-10(Interleukin-10)(이하 "IL-10"이라 약칭함.)을 포함한다. TNF 길항체의 예는 인플리시마브(infliximab) (Remicade0), 에타너셉트(etanercept) (EnbrelOO), 아달리무마브(adalimumab) (Humira), 및 세르톨리주마브 패골(Certolizumab Pegol)(이하 "CDP870"이라 약칭함.)을 포함한다. 야누스키나아제 억제제의 예는 토파시티닙(Tofacitinib) (Xeljanz), 항인테그린제제의 예는 베돌리주맙(vedolizumab) (KyntelesR), 인터루킨억제제의 예는 우스테키누맙(ustekinumab) (Stelara pfs) 을 포함한다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움 속 미생물을 이용하여, 패칼리박테리움 속 미생물의 투여 대상을 선별하는 조성물, 키트 또는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명은 시험 대상의 시료에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스을 검출하여, 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 발병위험도 예측 또는 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환 진단하거나, 상기 미생물의 투여에 따른 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 반응성을 예측 또는 평가하는 것이며, 이에 따라 상기 대상이 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 개선 또는 치료를 받을 수 있을지 결정할 수 있다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움 속 미생물을 이용하여, 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)를 투여받은 대상에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 효능 또는 반응성을 평가하는 조성물, 키트 또는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 일 예는, 시험 대상의 생물학적 시료에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens) 미생물을 검출하는 제제를 포함하는, 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 발병위험도 예측 또는 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환 진단하거나, 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 반응성을 예측 또는 평가하기 위한 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는, 시험 대상의 생물학적 시료에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물을 검출하는 단계를 포함하는, 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 발병위험도 예측 또는 염증성 질환, 구체적으로 염증성 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환을 진단하거나, 위장관 질환, 예를 들면 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료 반응성을 예측 또는 평가하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 건강한 대조군에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 수준에 비해서 감소된 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 수준과 관련된 질환 또는 장애의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하며, 여기서 방법은 대상을 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 감소된 수준을 갖는 것으로서 결정하는 단계, 및 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 감소된 수준이 존재하는 것으로 결정되면 상기 패칼리박테리움 캔서인히벤스를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움 속 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항염증제에 관한 것이다. 상기 패칼리박테리움 속 미생물은 항염증 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있고, 프로바이오틱스 단독, 또는 프로바이오틱스와 프리바이오틱스를 함께 포함할 수 있다.
본 명세서에서 염증성 질환은 각종 염증을 포함할 수 있으며, 예를 들면 염증성 위장관 질환, 바람직하게는 염증성 장 질환 (크론병, 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군, 만성 소화 장애(coeliac disease), 전염성 대장염(예를 들어, C. 디피실 (C. difficile)에 의해 기인함), 베체트병(Behcet’s disease), 그 밖의 위장관-관련된 질병, 및 이의 어떠한 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 염증성 위장관 질환이다. 또는, 상기 염증성 질환은 염증성 자가면역 질환이고, 여기서 악화-균형잡힌 미생물총(dys-balanced microbiota) 및 저급 점막 염증(low grade mucosal inflammation)은, 당뇨병(타입 1 및 2), 천식 및 아토피 질환과 같은, 질환의 병인과 관련된 것일 수 있다.
본 발명에서 균주에 의해 발휘되는 면역 조절 또는 염증성 질환의 개선, 치료 또는 예방의 효과는 염증 억제 및 면역 조절에 관여하는 사이토카인의 증가 또는 감소, 구체적으로 IFN-γ, IL-8, IL-6 및 TNF-α등의 분비 감소 및 IL-10의 분비 증가 중 어느 하나 이상의 기전에 의해 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다.
IFN-γ의 역할은 대표적으로 NK 세포 활성화, 마크로파지 활성화, MHC 발현 증가 등이 있으며 IFN-γ에 대한 만성 노출은 자가면역 질환 및 염증성 질환과 같은 여러 비 감염성 병리에 관여하는 것으로 알려져 있다.
염증 발생시 Neutrophil은 장 상피세포 사이의 간격 (tight junction)을 통해 장의 내강까지 이동하기도 하여 염증을 더욱 악화시키는 역할을 할 수 있으며, 이때에 염증성 사이토카인에 해당하는 IL-8는 이러한 Neutrophil을 염증 부위로 끌어 모으는데 중요한 역할을 하는 인자로서 Neutrophil을 장점막 고유층 내로 침윤시켜 염증 매개 물질들을 분비시킴으로써 조직의 손상을 가져오는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
IL-6는 T림프구나 대식세포 등 다양한 세포에서 분비되어 면역 반응을 촉진하며 이 경우는 감염, 외상, 특히 화상이나 염증으로 이어지는 조식 손상을 가져올 수 있다. 또한 IL-6은 Th17 세포 분화를 유도함으로써 RORγt나 IL-17를 분비를 촉진함으로써 염증을 더욱 촉진시키는 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.
염증을 유발하는 주요 인자 중에 하나인 TNF-α는 주로 활성화된 대식세포에서 분비되며 보조 T세포, 자연살해세포, 그리고 손상된 뉴런등의 다양한 세포에서 분비된다. 그리고 가장 중요한 역할은 면역 세포의 조절로, IL-1과 IL-6의 생산을 유발할 수 있으며 류마티스 관절염이나 크론병, 궤양성대장염 등의 다양한 염증성 질환에서 염증 반응을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
또한 IL-10은 보조 T 세포, B 세포, 단핵세포 등 다양한 세포에서 생성되는 중요한 면역 조절 사이토카인으로 주요 기능은 염증 반응의 억제로서 IL-6, TNF-α를 포함한 전염증성 사이토카인 생성을 억제하는 등의 면역 억제 및 항염증 특성을 갖고 있다.
염증성 장 질환(IBD)은, 설사, 혈변, 복통 및 체중 손실에 의해 특징지어지는 위장관의 만성 염증성 질환이며, 원인 불명의 만성, 재발하는 염증이다. IBD는 두 가지 주요한 질환 상태, 궤양성 대장염(UC) 및 크론 질병(CD)을 포함하며, 더욱 자세하게는 만성 또는 급성 궤양성 대장염 및 크론 질환을 포함한다. UC는 주로 대장 또는 결장의 점막의 층에 영향을 미친다. 이에 반해서, CD는, 소장 및 대장의 부분(segments)을 포함할 수 있는 경벽의 육아종성 염증(transmural granulomatous inflammation)으로서 정의된 것이다.
본 발명에서 프로바이오틱 박테리아(probiotic bacteria)는 항-염증성(프로바이오틱) 조성물, 예를 들어, 기능성 식품, 뉴트라슈티컬(neutraceuticals) 또는 약제학적 조성물에 포함될 수 있으며, 위장관에서 프로바이오틱 생존을 촉진하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명에서, 상기 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속 미생물은, 예를 들면 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열과 98%이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 16S rDNA 서열을 포함하는 박테리아 균주(bacteria srain)일 수 있으며, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 16S rDNA 유전자를 포함하는 박테리아 균주, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 13783BP를 갖는 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1균주일 수 있다. 상기 미생물 또는 박테리아 균주(bacterial strain)은 하기 특성으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 가지는 것이다:
(1) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 16S rRNA 또는 이와 뉴클레오타이드 서열 동일성이 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 16S rRNA을 가짐;
(2) 지질 생산 패턴, 자세하게는 17:0 iso 3OH 지방산을 포함하지 않는 것이며, 더욱 자세하게는 15:1 w8c 지방산, 19:0 cyclo w10c/19w6 지방산, 20:1 w9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산을 포함하며, Faecalibacterium prausnitzii에는 없는 PL3를 포함;
(3) 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1균주의 유전체 서열과 대비하여, 평균 뉴클레오타이드 일치도(average nucleotide identity, ANI) 값이 95% 이하임.
(4)면역 조절능 및/또는 항염 활성, 예를 들면 IFN-γ, IL-6, IL-8 및 TNF-α로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 염증성 사이토카인의 수준을 감소시키는 것이거나, 및/또는 IL-10 및 TNF-β로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 항염증성 사이토카인의 수준을 증가시키는 것일 수 있어, 항염활성과 면역 조절 활성, 예컨대 면역 억제능을 가짐;
(5) 항암 활성, 구체적으로 암의 발생을 방지, 종양의 성장 속도를 지연 또는 저해하거나, 종양의 크기 또는 부피를 감소시키나, 또는 암의 전이를 억제 또는 지연시키는 활성이며, 일 예는 패칼리박테리움 캔서인히벤스 은 암세포주를 피하 이식한 마우스에 투여하였을 때, 상기 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비해 종양 부피가 10 내지 90%로 감소시키는 활성을 가지며,
더욱 자세하게는 종양의 성장 억제 활성 또는 암 세포의 세포사멸사(apoptosis)을 유발하는 항암 활성을 갖는 것;
암 세포주를 이식한 동물 모델에 투여하였을 때, 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비하여 상대적인 종양 부피의 감소율은 5% 이상; 또는
암 세포주를 이식한 동물 모델에 투여하였을 때, 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비하여 종양 무게에 따른 종양 성장 억제율이 5%이상을 가짐;
(6) 배양온도 20 내지 40 ℃이거나, 혐기 조건 하에서 배양되며, 구체적으로 20 내지 40 ℃온도, 25 내지 40 ℃온도, 30 내지 40 ℃온도, 35 내지 40 ℃ 또는 37℃온도에서 배양될 수 있음; 및
(7)높은 부티르산 함량, 자세하게는 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768 균주에 비해 2배 내지 50배을 가짐.
본 발명의 구체적인 Faecalibacterium cancerinhibens는 상기 특성 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 특성을 가질 수 있다. 예를 들면 상기 (1) 내지 (7)의 특성을 모두 가지는 균주(strain)을 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1은, 기존에 분리 및 보고되지 않은 신규한 종(species)임을 알 수 있다. 상기의 방법으로 동정된 Faecalibacterium 속 균주를 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1로 명명하고, 2019년 1월 3일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13783BP를 부여받았다.
더욱 자세하게는, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1 균주의 유전체 해독 및 근연종과의 비교 결과, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1 균주는 전체 유전체 수준에서 가장 가까운 근연종인 Faecalibacterium prausnitzii과 유전체 수준에서 85.99%의 평균 뉴클레오타이드 일치도(average nucleotide identity, ANI) 값을 보여, 기존에 분리 및 보고되지 않은 신규한 종(species)임을 알 수 있다.
더욱 자세하게는 본 발명에 따른 항암 활성은 대장암 및/또는 간암에 대한 항암 활성일 수 있으며, 예를 들면 간암 및/또는 대장암의 발생 또는 진행을 억제하는 활성일 수 있다. 구체적으로, 종양의 발생을 지연 또는 종양의 성장 속도를 저해하는 것일 수 있으며, 종양의 성장 속도 저해로 인한 암의 전이 예방 활성을 추가로 가질 수 있다.
본 발명에 따른 Faecalibacterium 속 미생물은, 건강한 성인 남성의 분변으로부터 분리하여 인간 암 세포주, 암 세포주를 피하 이식한 마우스 모델, 또는 암 세포주를 해당 조직에 이식한 마우스 모델에서 암 발생의 억제, 암종의 성장을 억제, 또는 암의 전이를 억제 또는 지연시키는 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 건강한 성인 남성의 분변으로부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물을 분리하여 대장암 또는 간암을 유도 또는 이식한 마우스에서 종양의 성장을 억제하는 효과를 확인하였다. 상기 종양 성장 억제 활성은 예를 들면 종양의 부피/크기 또는 종양의 무게를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens 은 암 세포주를 피하 이식한 동물 모델에 투여하였을 때, 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비하여, 종양 무게에 따른 종양 성장 억제율이 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상일 수 있으며, 상기 종양 무게에 따른 종양 성장 억제율은 하기 수학식 1에 의해 계산될 수 있다.
Figure pat00001
상기 수학식 1에서, IR은 종양 무게에 따른 종양의 성장 억제율 (Tumor growth inhibition rate, IR), T1은 각 실험군 그룹에서의 평균 종양 무게이고, C1은 음성 대조군에서의 평균 종양 무게이다
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens 은 암 세포주를 피하 이식한 동물 모델에 투여하였을 때, 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비하여, 종양 부피에 따른 상대적인 종양 부피의 감소율은 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상일 수 있으며, 상기 종양 부피에 따른 종양 성장 억제율은 하기 수학식 2에 의해 계산될 수 있다.
Figure pat00002
상기 수학식 2에서, T2는 각 실험군 그룹에서의 평균 종양 부피이고, C2는 음성 대조군에서의 평균 종양 부피이다.
본 발명의 일 예에 따라 암 세포주를 이식한 종양 동물 모델에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1을 투여하였을 때, 상기 미생물을 투여하지 않는 음성 대조군의 종양 부피 100%를 기준으로, 종양 부피가 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 77% 이하, 70% 이하, 67% 이하일 수 있으며, 종양 부피가 하한치 10% 이상, 15% 이상, 18%이상, 및 20%이상에서 선택된 수치와, 상한치 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 77% 이하, 70% 이하, 및 67% 이하에서 선택된 수치와 조합한 수치범위를 가지는 것일 수 있다.
상기 암이 대장암인 경우, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물은 상기 미생물을 투여하였을 때, 상기 미생물을 투여하지 않는 음성 대조군의 종양 부피 100%를 기준으로, 종양 부피가 10 내지 90%, 10 내지 85%, 10 내지 80%, 10 내지 77%, 10 내지 70%, 10 내지 67%, 20 내지 90%, 20 내지 80%, 20 내지 70%, 20 내지 67%, 30 내지 90%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 67%, 40 내지 90%, 40 내지 80%, 40 내지 70%, 40 내지 67%, 50 내지 90%, 50 내지 80%, 50 내지 70%, 50 내지 67% 또는 60 내지 67% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 인간 대장암 세포주를 이용한 마우스 피하 종양 모델에 미생물 투여를 시작한 당일(1일)의 평균 종양 크기는, 미생물을 투여하지 않은 음성 대조군 대비 약 60 내지 67%의 종양 부피를 가지는 것으로 확인되었는 바, 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 대장암 성장 억제 효과를 확인하였다.
상기 암이 간암인 경우, 본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물은 상기 미생물을 투여하였을 때, 상기 미생물을 투여하지 않은 대조군의 간암 종양 부피 100%를 기준으로, 종양 부피가 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 77% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 85%, 10 내지 80%. 10 내지 77%, 15 내지 90%, 15 내지 85%, 15 내지 80%, 15 내지 77%, 18 내지 90%, 18 내지 85%, 18 내지 80%, 또는 18 내지 77% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 간암의 종양 부피 감소는, 평균적으로 대조군에 비해 CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 간암 종양의 부피가 19.5% 내지 75.3%, 평균 32.9% 가량 낮은 수치를 보였다. 따라서 경구 투여된 CLCC1 미생물이 간암에 있어서 종양의 발생 및 진행을 억제하는 활성을 가짐을 알 수 있다.
본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens은 기존 패칼리박테리움 속 미생물인 패칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii)와는 상이한 지질 생산 패턴을 나타내는 특성이 있다.
본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens은 17:0 iso 3OH 지방산을 포함하지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물과 Faecalibacterium prausnitzii 종의 극성 지질 함량을 분석한 결과, CLCC1은 Faecalibacterium prausnitzii에는 없는 PL3를 추가로 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 3b). 본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens 은 15:1 w8c 지방산, 19:0 cyclo w10c/19w6 지방산, 20:1 w9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물과 Faecalibacterium prausnitzii 종의 지방산 구성을 가스 크로마토그래피 분석을 수행하여 비교한 결과, 두 미생물간 주요 지방산의 구성에 차이가 나는 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 15:1 w8c 지방산, 19:0 cyclo w10c/19w6 지방산, 20:1 w9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산은 CLCC1 미생물에서만 검출되었으며, 17:0 iso 3OH 지방산은 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768 에서만 검출되었다.
본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens 는 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acid; SCFA) 중 부티르산의 생산량이 높다. 구체적으로, 본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 부티르산 생산량은 Faecalibacterium prausnitzii 종에 비해 2배 이상, 3배 이상, 4배이상, 5배 이상, 6배 이상, 6.5배 이상, 또는 7배 이상일 수 있으며, 구체적으로 2 내지 50배, 2 내지 40배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 15배, 2 내지 10배, 5 내지 50배, 5 내지 40배, 5 내지 30배, 5 내지 20배, 5 내지 15배, 5 내지 10배, 6 내지 30배, 6 내지 20배, 6 내지 15배, 6 내지 10배, 7 내지 30배, 7 내지 20배, 7 내지 15배, 또는 7 내지 10배 일 수 있다. 구체적인 일예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 Faecalibacterium prausnitzii 종의 배양 상등액의 SCFA 분석 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium prausnitzii 종에 비해 7.8배 높은 부티르산 함량을 보였다 (도 3c 내지 3d).
본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens 균주는 한천 배지에 도말하여 배양하는 경우, 3mm 이내 또는 2mm 이내의 콜로니를 형성하고, 광학 현미경으로 관찰하였을 때 긴 막대 모양의 세포 모양을 가진다. 본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens 은 2.9Mbp의 유전체 크기를 가지며, 단백질 암호화 부위(CDS)의 수는 2695개이고, GC 비율은 56.1%, rRNA 유전자의 수는 21개, 전체 tRNA 유전자의 수는 69개로 나타났다. 본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1는, Faecalibacterium prausnitzii에 비해 7.8배 높은 함량의 부티르산(butanoic acid)이 검출되었다 (도 3c 내지 3d).
본 발명의 구체적 일 예에서, DSS 로 유도되는 대장염 모델은 조직학적으로 선와 (crypt) 형태의 변화 및 상실, 궤양, 염증 세포의 침윤 등이 사람의 궤양성 대장염 (UC; Ulcerative colitis)과 유사하며 대장염 모델에 많이 사용되고 있다. 본 발명에 따른 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1를 2x107 cells/head 및 2x108 cells/head 용량으로 1 회/일의 빈도로 24 일간 투여하여 용량에 따른 차이, 2x108 cells/head 용량으로 1 회/일의 빈도로 10 일간 투여하여 투여기간에 따른 차이, 사멸균 2x108 cells/head 용량으로 1 회/일의 빈도로 24 일간 투여하여 생균과 사균에 따른 대장염 개선 효과를 확인하였다.
그 결과, 3% DSS 로 대장염을 유발한 음성 대조군의 체중은 급격히 감소하고 혈변을 포함하는 무른 변 및 설사가 관찰되고, 대장의 길이는 감소하고, 조직병리학적으로 선와 구조가 붕괴되고 점막 생성에 관여하는 Goblet 세포가 사라지며 전층 염증이 발생하였으며, 염증 세포가 관찰되었다. 또한 음성 대조군에서 염증성 사이토카인인 IFN-γ, TNF-α 및 IL-6의 발현은 증가된다.
DSS 로 유발된 BALB/c mouse 대장염의 동물모델에 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1 생균의 반복 투여는 대장염으로 인한 체중 감소를 낮추고 대장의 길이가 감소하는 것을 개선시키고, 대장 점막의 조직 손상을 줄이고 염증성 사이토카인 IFN-γ, TNF-α, IL-6 의 발현을 억제함으로써 대장염 개선에 효과가 있다. 구체적으로, 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 IL-6 의 발현은 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 감소하였고, TNF-α 도 감소하는 경향을 보였다. 균수 및 투여 기간에 따른 큰 변화 없이 모든 측정항목에서 유사한 결과가 도출되었다. 사멸균 2x108 cells/head 24 회 투여군의 체중 감소 및 대장길이는 음성대조군과 유사하였다. 또한 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 IL-6 는 음성대조군에 비해 감소되었다.
본 발명에 따른 염증성 위장관, 예를 들면 IBD 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 패칼리박테리움 속 미생물은 균체 자체를 포함하거나, 또는 균체를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 패칼리박테리움 속 미생물 균체를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 패칼리박테리움 속 미생물은 상기 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명에 따른 조성물은 동결 건조된 균체를 포함할 수 있다. 미생물 균체의 동결 건조는 통상의 기술자가 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 살아있는 미생물의 배양물을 포함할 수 있다. 일 예에서, 본 발명에 따른 미생물은 상기 패칼리박테리움 속 미생물은 균체 자체를 포함하는 경우 생균, 사균 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따른 IBD 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 미생물을 포함한다. 치료 유효량의 미생물은 환자에게 유익한 효과를 발휘하기에 충분하다. 박테리아성 균주의 치료학적 유효량은 환자의 장내 수송 및/또는 부분적 또는 전체 콜로니화를 초래하기에 충분할 수 있다. 상기 박테리아 또는 추출물은, 예를 들어, 대상의 유형, 질병의 심각성 및 투여의 경로에 따라 달라지는, 치료학적 유효량으로 대상에서 투여되도록 제형화된다. 예를 들어, 성인 인간에 대한 박테리아의 적합한 일일 투여량은 약 1 x 103　내지 약 1 x 1015　콜로니 형성 단위(CFU)일 수 있고, 예를 들어, 약 1 x 103　내지 약 1 x 1015　CFU, 약 1 x 103　내지 약 1 x 1014　CFU, 약 1 x 103　내지 약 1 x 1013　CFU, 약 1 x 103　내지 약 1 x 1012　CFU, 약 1 x 103　내지 약 1 x 1011　CFU, 약 1 x 105　내지 약 1 x 1015　CFU, 약 1 x 105　내지 약 1 x 1014　CFU, 약 1 x 105　내지 약 1 x 1013　CFU, 약 1 x 105　내지 약 1 x 1012　CFU, 약 1 x 105　내지 약 1 x 1011　CFU, 약 1 x 107　내지 약 1 x 1015　CFU, 약 1 x 107　내지 약 1 x 1014　CFU, 약 1 x 107　내지 약 1 x 1013　CFU, 약 1 x 107　내지 약 1 x 1012　CFU, 약 1 x 107　내지 약 1 x 1011　CFUd 일 수 있으며, 상기 박테리아 균주 투여량의 단위는 상기 염증성 위장관, 예를 들면 IBD 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 총 중량을 기준으로, /g　콜로니 형성 단위(CFU), 즉, CFU/g일 수 있다.
상기 박테리아의 투여는 어떠한 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 특정한 페칼리박테리움 속 미생물은, 경구적으로 소화가능한 형태로 동물(인간을 포함함)에 투여될 수도 있다. 식품 조성물 또는 뉴트라슈티컬의 경우에, 상기 박테리아는 통상적인 식품 물품 또는 식품 보충물에 단순하게 포함될 수도 있다. 대표적인 약제학적 제형은, 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로키, 알약, 좌약, 현탁액 및 시럽을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은, 예를 들어, 직장의 좌약 또는 관장과 같은 동물(인간을 포함함)에 대한 직장 투여를 위한 형태로 있다. 적절한 제형은, 통상적인 유기 및 무기 첨가제를 사용하여 보통 적용된 방법에 의해 제조될 수도 있다. 의학 조성물에서 유효 성분의 양은 원하는 치료학적 효과를 달성하는 레벨로 있을 수도 있다.
본 발명의 조성물은 패칼리박테리움 속 미생물을 장내로 수송할 수 있도록 캡슐화될 수 있다. 캡슐화는 예를 들어 압력, 효소 활성 또는 pH의 변화에 의해 유발될 수 있는 물리적 붕괴와 같은 화학적 또는 물리적 자극에 의한 파열을 통해 표적 위치로 수송될 때까지 조성물이 분해되지 않도록 보호한다. 임의의 적절한 캡슐화 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기술은 다공성 매트릭스 내의 포착, 고체 담체 표면상의 부착 또는 흡착, 응집 또는 가교 결합제에 의한 자기 응집 및 미세다공성 막 또는 마이크로캡슐 후의 기계적 봉쇄를 포함한다.
본 발명에 따른 염증성 질환, 예를 들면 염증성 위장관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물은 패칼리박테리움 속 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하고, 및 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 치료적 사용을 위한 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 ㎎/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
본 발명의 조성물은 프로바이오틱스일 수 있으며, 프로바이오틱스는 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 배합될 수 있다. 상기 프리바이오틱 화합물은 일반적으로 올리고- 또는 폴리사카라이드 또는 설탕 알코올과 같은 비-소화성 탄수화물이며, 이는 상부 소화관에서 분해되거나 흡수되지 않는다. 공지의 프리바이오틱은 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고사카라이드와 같은 시판 중인 제품을 포함한다. 신바이오틱스(Synbiotics)는, 상승 작용의 형태로 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스를 결합한 영양상의 보충물(nutritional supplements)을 나타낸다.
본 발명의 일 예는 본 발명의 일 예는 항염증 활성을 갖는 패칼리박테리움 속 미생물의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물, 예를 들면 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 항암 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
통상적인 의미로서의 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품, 음료 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다. 본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 액상, 시럽 및/또는 겔 형태일 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 패칼리박테리움 속 미생물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 유효성분인 패칼리박테리움 속 미생물의 균체, 상기 미생물 배양물, 상기 미생물의 파쇄물 및 상기 미생물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량%, 0.001 중량% 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%, 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있다. 예를 들어, 식품 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품으로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 식품은 영양 보충제와 같이 본 발명의 치료 효과 이외에 영양적인 이득을 제공할 수 있다.
본원에서 용어,"위험도의 예측" 또는 “발병 가능성의 예측”이란 대상이 특정 질환이 발병할 가능성이 있는지를 판별하는 것을 말하고, 특정 질병의 발병 위험성이 높은 환자를 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상, 진단은 질병의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
상기 “대상”은 염증성 장질환의 발병위험도 예측 또는 암 진단, 패칼리박테리움 속 미생물의 치료 반응성을 예측 또는 평가, 상기 미생물의 투여 가능성이 있는 대상, 또는 상기 미생물의 투여를 받고 미생물 효능의 모니터링이 필요한 대상일 수 있으며, 예를 들면 염증성 장질환의 발병 위험이 의심되는 대상, 염증성 장질환의 진단을 받은 대상, 또는 항염증성 장질환 치료를 받는 대상일 수 있다. 상기 대상은 바람직하게는 사람이다.
본 명세서에서 대상의 생물학적 시료는, 염증성 장질환을 갖거나 또는 염증성 장질환을 갖는 것으로 의심되는 포유류로부터 분리된 시료와 같은 피검자로부터 분리된 세포 추출물, 어떠한 기관, 조직, 세포, 타액, 또는 대변 등이 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는, 비제한적으로, 위장관의 어느 부분(비한정적으로, 결장, 위, 대변, 항문, 직장, 십이지장을 포함하는)으로부터의 세포 또는 조직(예를 들면 생체 검사 또는 부검(autopsy)로부터의), 환자(인간 또는 동물), 실험 대상이나 실험적 동물로부터 얻은 위장의 세포 용해물(lysate), 또는 피검자의 배출물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 시료는 대변일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물의 검출은, 시료 내 미생물의 존부 확인, 미생물의 동정, 미생물의 수준 측정, 및 상대적 점유율 분석을 포함한다. 구체적으로, 시험 대상의 시료에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스미생물을 검출하거나 미생물을 수준을 측정하는 것은, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물에 특이적인 바이오마커로서, 핵산 서열, 아미노산 서열, 대사 산물, 또는 미생물 자체를 이용하여 수행하거나, 시료 내에 존재하는 미생물 군집의 전체 유전체, 또는 적어도 하나 이상의 특정 유전자의 염기서열 정보를 획득하여 미생물 수준을 평가하는 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, PacBio 시퀀싱 라이브러리 키트를 이용하여 시퀀싱 라이브러리 제작 후 PacBio RS II 플랫폼을 이용하여 전체 유전체 시퀀싱을 수행하고, 자사의 유전체 데이터 분석 플랫폼인 BIOiPLUG의 Whole Genome 분석 파이프라인을 이용하여 유전체 시퀀싱 정보를 분석할 수 있으며, 그 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 전체 유전체 크기는 약 2.9Mbp이고, 단백질 암호화 부위(CDS)의 수는 2695개이며, CDS 부위 또는 Intron 부위등 패칼리박테리움 캔서인히벤스에 특이적인 부위를 선택하여 바이오마커로 활용할 수 있다.
예를 들면, 상기 미생물의 검출은, 시험 대상의 장내 미생물 군집에 관한 속 (genus) 또는 종(species) 수준으로 구별되는 미생물들과 이들 미생물들에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 상대적인 점유비율(relative abundance)을 구하여, 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 수준을 측정하여 수행될 수 있다.
상기 미생물의 수준 측정은, 대상의 시료, 예를 들어 장 바이옵시스 또는 대변 시료로부터 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 비율을 측정하는 것일 수 있다. 상기 균주의 비율 측정 방법은, 통상의 기술자가 당 업계의 기술 상식에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR), 대용량염기서열분석법(massively parallel sequencing), 형광 인-시추 혼성화(FISH), 마이크로어레이 및 PCR-ELISA로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자적 방법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 상기 시험 대상의 시료 내 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물 수준을 측정하고, 참조 대상의 미생물 수준과 비교하여, 상기 시험 대상의 미생물 수준이 참조 대상의 미생물 수준에 비해 낮은 경우 상기 시험 대상이 장 질환의 발병 위험성을 갖는 것으로 결정하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 시험 대상의 시료 내 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물 수준을 측정하고, 참조 대상의 미생물 수준과 비교하여, 상기 시험 대상의 미생물 수준이 참조 대상의 미생물 수준에 비해 낮은 경우 상기 시험 대상이 장 질환의 발병 위험성을 갖는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인체 유래 시료를 이용한 메타게놈 분석을 통해 암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 암으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.
시험 대상의 시료에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스를 검출하거나 미생물을 수준을 측정하는 방법을, 이하에서 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예로서, 특정 유전자 예를 들면 16S rRNA 유전자 서열을 이용하여 상기 미생물의 검출 또는 수준을 측정하는 방법을 제공할 수 있다.
구체적으로 상기 미생물의 수준은 바람직하게는 상기 시료에서 특정 핵산 서열의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있으며, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 상기 하나 이상의 박테리아의 16S rRNA 유전자 서열, 더욱 바람직하게는 상기 16S rRNA 유전자 서열의 영역, 예를 들어 상기 16S rRNA 유전자 서열의 가변 영역 V1 및 / 또는 V6 중 하나 이상일 수 있다.
이에, 상기 미생물의 검출은, 시험 대상의 장내 미생물 군집에 관한 종(species) 수준으로 구별되는 균종과 이들 균종에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 점유비율을 얻어, 상대적인 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 수준을 측정하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 장내 미생물의 유전체 정보로부터 16S rRNA 유전 정보를 얻는 단계; 및 상기 장내 미생물의 16S rRNA 정보를 분석하여 시험 대상의 장내 미생물 군집에 포함된 균종의 점유비율을 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
시험 대상의 유전체 정보는 저장 매체에 저장된 유전 정보이거나, 시험 대상의 시료에서 분리된 미생물의 유전체 정보일 수 있다. 상기 16S rRNA 유전 정보를 얻는 단계는, 차세대 유전체 염기서열분석(NGS) 플랫폼을 이용하여, 상기 추출된 DNA의 16S rRNA 유전자 서열을 분석하는 단계일 수 있다.
상기 추출된 DNA의 16S rRNA 유전자 서열을 분석하는 단계는, 16S rRNA의 가변 영역(variable region)을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계, 바람직하게는 16S rRNA의 V3 내지 V4 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계, 더욱 바람직하게는 하기 서열을 갖는 universal primer를 이용하여 PCR을 수행하여 앰플리콘을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 장내 미생물의 16S rRNA 정보를 분석하여 시험 대상의 장내 미생물 군집에 관한 종(species) 수준으로 구별되는 균종과 이들 균종의 점유비율을 얻는 장내 미생물 군집 정보를 분석할 수 있다.
상기 미생물 군집을 분석하는 단계는, 16S rRNA 데이터베이스를 이용하여 미생물을 속 또는 종 수준으로 동정 및 분류하는 단계 및/또는 각 미생물 군집 규모(population)를 분석하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물의 동정 및 분류에 사용되는 데이터베이스는 필요에 따라 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, EzBioCloud, SILVA, RDP 및 Greengene으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 데이터베이스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물 군집 규모는 전체 장내 미생물 균총에서 특정 미생물 군집이 차지하는 비율(%)로 나타내어질 수 있다. 상기 미생물 군집이 차지하는 비율(%)은 전체 시퀀싱 리드 수 중 특정 미생물의 16S rRNA 리드 수 빈도(frequency)의 백분율로 나타내어 질 수 있다. 상기 특정 미생물은 본 발명이 제공하는 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens)이다.
미생물 군집분석을 하여 어떤 미생물이 존재하는지를 알고자 하는 경우, 종 동정을 위한 표지 유전자(marker gene)만을 선택적으로 증폭한 후 그 증폭산물의 염기서열을 분석하는 앰플리콘 시퀀싱(amplicon sequencing) 방법을 사용함으로써 분석에 필요한 비용과 시간을 줄일 수 있다. 세균 군집분석을 하기 위해서는 16S rRNA 유전자를 표지 유전자로 사용하는데, 이 유전자는 모든 세균에 존재하며 보존 영역과 변이 영역(v1-v9)을 적절히 포함하고 있어 계통 분석과 생태 연구에 적합하다.
본 발명의 추가 일예로서, 패칼리박테리움 캔서인히벤스에 특이적인 바이오마커를 이용하여 상기 미생물의 검출 또는 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물에 특이적인 바이오마커로서, 핵산 서열, 아미노산 서열, 및 대사 산물을 포함할 수 있다. 이에, 본 발명의 바이오마커를 검출할 수 있는 제제는, 시료 내 해당 미생물들에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 및 항체 등을 사용할 수 있다.
일 예로, 본 발명에서 상기 미생물들을 검출할 수 있는 제제는 해당 미생물을 검출할 수 있는 프로브, 또는 상기 프로브를 증폭하기 위한 프라이머 일 수 있다. 상기 프라이머는 해당 미생물들의 특정 프로브 유전자를 특이적으로 검출하고 다른 미생물의 유전체 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적 일 예는, 패칼리박테리움 캔서인히벤스를 다른 미생물 종 또는 아종과 구별하여 특이적으로 검출할 수 있고, 시료 내 소량 존재하는 패칼리박테리움 캔서인히벤스를 민감하게 검출할 수 있는 패칼리박테리움 캔서인히벤스 검출용 프로브, 프라이머 세트, 키트, 조성물, 및 검출 방법에 관한 것이다. 상기 패칼리박테리움 캔서인히벤스 검출용 프로브의 일 예는 Site-specific DNA-methyltransferase (dam)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 프로브는 검출표지와 연결될 수 있다. 상기 검출표지는 본 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법에 의해 검출될 수 있는 어떠한 화학적 모이어티라도 될 수 있다. 본 발명의 프라이머는 또한 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다. 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 분석하는 단계는 젤 전기영동, 모세관 전기영동, 염기서열 분석, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 염증성 질환, 예를 들면 염증성 위장관 질환의 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
도 1a는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1를 Reinforced clostridial media(RCM) 배지에 3일간 배양한 후 형성된 콜로니 형태를 나타낸 사진과, 액체 배양 시 대수기 상태(exponenetial growth phase)에서 세포 외형을 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 1b는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 액체 배양 시 대수기 상태(exponenetial growth phase)에서 세포를 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2a는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 16S rRNA 분석을 통해 얻은 계통분류학적 위치를 나타낸 그림이다.
도 2b은 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 유전체에 존재하는 92개의 핵심 유전자를 이용하여 계통분류학적 위치를 나타낸 그림이다.
도 2c는 평균 뉴클레오타이드 일치도 (ANI) 값에 기반한 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 유연관계도이다.
도 2d는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 및 근연종의 ANI값을 비교한 표이다.
도 3a는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 지방산 구성을 나타내는 가스 크로마토그래피 분석 결과 그래프이다
도 3b는 Faecalibacterium prausnitzii 균주의 지방산 구성을 나타내는 가스 크로마토그래피 분석 결과 그래프이다.
도 3c는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 극성 지질의 비교를 위해 수행한 2차원 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 3d는 Faecalibacterium prausnitzii 균주의 극성 지질의 비교를 위해 수행한 2차원 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 3e는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 짧은 사슬 지방산 분석을 수행한 GC-MS 분석 그래프이다.
도 3f는 Faecalibacterium prausnitzii의 짧은 사슬 지방산 분석을 수행한 GC-MS 분석 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 실시예 3-1에 따라 간암을 유도한 마우스에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 암 발생 억제 효과를 측정하기 위해 간암 유도 후 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4a는 각 개체를 검으로 나타낸 점그래프, 도 4b는 실험군과 대조군의 평균값을 비교한 그래프, 도 4c는 각 개체 별 종양의 부피 변화를 각각 나타낸 꺾은선 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 실시예 3-2에 따라 간 이식 모델에서의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 암 발생 억제 효과 시험 결과 및 각 결과의 점그래프와 꺾은선 그래프이다. 도 5a는 종양의 크기를 직접 비교한 결과, 도 5b는 종양의 크기 변화를 배수(fold)로 표현한 결과, 도 5c는 델타 값을 의미한다.
도 6a는 실시예 4-1에 따라 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 투여량에 따른 종양의 부피 변화를 나타내고, 도 6b는 종양의 무게 변화를 나타내고, 도 6c는 종양의 크기 변화를 육안 관찰한 결과이다.
도 6d는 실시예 4-1에 따라 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 투여 기간 종료 후 음성 대조군(G1) 및 각 실험군(G2 내지 G4)에서의 종양 조직을 분리하여 육안 관찰한 결과이다.
도 6e는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스의 종양 조직에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 투여에 따른 세포 괴사를 확인하기 위해 H&E 염색을 수행한 결과이다.
도 6f는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스의 종양 조직에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 투여에 따른 세포 자멸사(apoptosis)를 확인하기 위해 TUNEL 염색을 수행한 결과이다.
도 7는 마우스 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스의 종양 조직에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 투여에 따른 종양의 크기 변화를 관찰한 결과이다.
도 8은 실시예 5에 따라 Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델을 이용한 대장염 예방 및 치료 효과 실험에서 동물모델의 체중 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 5에 따라 Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델을 이용한 대장염 예방 및 치료 효과 실험에서 DAI(disease activity index)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 5에 따라 Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델을 이용한 대장염 예방 및 치료 효과 실험을 종료한 후에 적출한 대장의 길이를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 실시예 5에 따라 Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델을 이용한 대장염 예방 및 치료 효과 실험에서 사이토카인의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 12는 실시예 5에 따라 Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델을 이용한 대장염 예방 및 치료 효과 실험을 종료한 후에 적출한 대장 조직에 대한 병리학적 검사 결과를 보여주는 사진이다.
도 13은 실시예 7에 따라 ELISA로 분석한 HT-29 세포에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 사람 IL-8에 대한 효과를 나타낸다.
도 14는 실시예 7에 따라 ELISA로 분석한 RAW 264.7 세포에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 마우스 IL-6에 대한 효과를 나타낸다.
도 15는 실시예 7에 따라 ELISA로 분석한 RAW 264.7 세포에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 마우스 TNF-α에 대한 효과를 나타낸다.
도 16은 실시예 8에 따라 분석한 HPBMC에서의 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 사람 IL-10에 대한 효과를 나타낸다.
도 17은 실시예 8에 따라 분석한 HPBMC에서의 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 사람 IL-6에 대한 효과를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 일 예에 따라 정상 대조군, 궤양성 대장염(UC) 및 크론병 환자의 장내미생물 시료에서 패칼리박테리움 캔서인히벤스의 상대적인 풍부도를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 하기 예시적인 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 미생물의 분리 및 동정
1-1:미생물 분리
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 건강한 20대 성인 남성의 분변을 Reinforced clostridial media(RCM) 배지에 희석 도말한 후 37 ℃의 상온 혐기 배양 조건에서 배양하여 분리하였다.
구체적으로, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1은 RCM 한천 배지에서 3일간 배양하면 최대 2 내지 3mm의 콜로니를 형성하고, 광학 현미경으로 관찰하였을 때 긴 막대 모양의 세포 모양을 보이는 특성이 있다. 도 1a는 상기 콜로니 형태 및 광학 현미경을 이용한 세포의 형태 관찰 결과를 나타내고, 도 1b는 주사전자현미경을 이용하여 세포의 형태를 촬영한 사진을 나타내었다.
1-2: 16S rRNA 분석을 이용한 계통 분류학적 분석
실시예 1의 방법으로 분리된 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 RCM 액체 배지에서 37 ℃의 상온 혐기 배양 조건에서 1일간 배양 후, 원심분리하여 미생물을 수득하였다. FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)를 이용하여 수득된 미생물로부터 전체 유전체를 분리하였다.
PacBio 시퀀싱 라이브러리 키트를 이용하여 시퀀싱 라이브러리 제작 후 PacBio RS II 플랫폼을 이용하여 전체 유전체 시퀀싱을 수행하고, 자사의 유전체 데이터 분석 플랫폼인 BIOiPLUG의 Whole Genome 분석 파이프라인을 이용하여 유전체 시퀀싱 정보를 분석하였다.
하기 표 1에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 유전체 특성을 나타내었다. Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 전체 유전체 크기는 약 2.9Mbp이고, 단백질 암호화 부위(CDS)의 수는 2695개이며, GC 비율(GC ratio, %)은 56.1%로 나타났다. 전체 rRNA 유전자는 21개, 전체 tRNA 유전자는 69개로 나타났다.
상기 방법으로 서열 분석된 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 rRNA를 분석하여 계통 분류학적 분석을 수행하였다. Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
구체적으로, EzBioCloud 데이터베이스의 16S-based identification for prokaryote 파이프라인을 이용 16S rRNA의 유사성 분석을 수행하였고, MEGA 프로그램을 이용하여 계통분류학적 분석을 수행하였다. 도 2a에 16S rRNA 유전자 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 동정한 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 계통분류학적 위치를 표시하였다.
1-3: 핵심 유전자를 이용한 계통 분류학 분석
실시예 1-2의 방법으로 얻은 유전체 서열 데이터를 이용하여 유전자 서열간 분석을 통한 계통 분류학 분석을 수행하였다. 구체적으로, 박테리아의 taxonomic marker로 사용될 수 있는 92개의 유전자들(up-to-date bacterial core gene (UBCG))의 유사성을 이용해 계통분류학 분석을 수행하였다. 상기 92개의 유전자는 UBCG(up-to-date bacterial core gene) 파이프라인에서 제공하는 유전자들을 의미한다 (Na, S. I., Kim, Y. O., Yoon, S. H., Ha, S. M., Baek, I. & Chun, J. (2018)). 도 2b에 92개 핵심 유전자를 분석하여 얻은 근연종과의 계통분류학적 위치를 나타낸 그림을 표시하였다.
1-4: 평균 뉴클레오타이드 일치도(Average Nucleotide Identity, ANI)를 이용한 유연관계 분석
실시예 1-2의 방법으로 얻은 유전체 분석 데이터를 이용하여, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 근연종 간의 ANI 값을 비교하여 유연관계를 분석하였다.
구체적으로, ㈜천랩에서 제공하는 분석 플랫폼인 Genome-based identification for prokaryote (TrueBAC ID) 파이프라인을 이용하여 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 다른 근연종들 간의 전체 유전체 서열을 비교하여 유전체 유사도 값을 분석하였다.
도 2c에 ANI 값에 기반한 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 유연관계도를 나타내었다. 도 2d에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 ANI값 비교 표를 나타내었다. 각 행과 열은 1은 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1, 2는 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768(T), 3은 Fournierella massiliensis AT2(T), 4는 Intestinimonas butyriciproducens DSM 26588(T), 5는 Intestinimonas massiliensis GD2(T), 6은 Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799(T), 7은 Ruthenibacterium lactatiformans 585-1(T), 8은 Subdoligranulum variabile DSM 15176(T), 9는 Gemmiger formicilis ATCC 27749(T)를 의미한다. 각 종명 뒤 (T)는 type strain을 의미한다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 유전체 해독 및 근연종과의 비교 결과, CLCC1 균주는 전체 유전체 수준에서 가장 가까운 근연종인 Faecalibacterium prausnitzil과 유전체 수준에서 85.99%의 평균 뉴클레오타이드 일치도(average nucleotide identity, ANI) 값을 보여, 기존에 분리 및 보고되지 않은 신규한 종(species)임을 알 수 있다. 상기의 방법으로 동정된 Faecalibacterium 속 균주를 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1로 명명하였다.
실시예 2. 미생물의 이화학적 특성 분석
2-1: 지방산 함량 분석
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 분자생물학적 특성을 분석하기 위해, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii의 지방산(fatty acid) 구성을 비교하였다.
구체적으로, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 균주를 각각 RCM 배지에서 37 ℃ 온도 및 혐기 조건에서 배양 후, 약 40mg의 균체를 이용해 Miller의 방법(Miller, L. T. (1982) J. Clin. Microbiol. 18, 861-867)에 따라 지방산을 얻었다.
상기 추출된 지방산의 분석에는 Agilent technologies 6890 Gas chromatography가 이용되었으며 separation column은 A30m X 0.320mm X 0.25μm Crosslinked Methyl siloxane column (HP-1)을 사용하였다. 도 3a에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 균주(ATCC 27768)의 지방산 구성을 비교한 가스 크로마토그래피 분석 결과 그래프를 나타내었다. 도 3a의 그래프에서 각 피크(peak)가 의미하는 지방산의 이름과 그 수치(%, w/v)를 하기 표 1에 나타내었다.
지방산 종류 CLCC1 내 함량 (%) ATCC 27768 내 함량 (%)
16:00 32.42 42.28
18:1 7 28.15 14.88
17:0 2OH 12.51 8.09
16:1 ω7c/16:1 ω6c 5.22 6.04
16:1 ω9c 3.89 1.57
14:00 2.44 14.93
17:0 anteiso 2.42 0.99
16:1 ω5c 2.17 0.83
18:1 ω9c 1.88 0.86
18:00 1.59 2.17
16:1 2OH 1.41 0.51
20:1 ω7c 0.84 0.43
18:1 ω5c 0.81 0.32
15:0 2OH 0.75 0.5
18:0 10-methyl, TBSA 0.45 0.21
15:1 ω8c 0.44 -
15:1 iso H/13:0 3OH 0.35 1.44
16:0 3OH 0.32 0.11
15:0 anteiso 0.21 0.2
12:00 0.2 1.59
15:0 iso 3OH 0.17 0.49
17:00 0.17 0.2
19:0 cyclo ω10c/19ω6 0.16 -
20:00 0.14 0.1
13:1 at 12-13 0.13 0.35
10:00 0.13 0.2
20:1 ω9c 0.13 -
17:0 iso 0.12 0.17
14:0 3OH/16:1 iso I 0.12 -
15:0 3OH 0.11 -
16:0 iso 0.1 -
16:0 iso 3OH 0.05 -
17:0 iso 3OH - 0.54
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 15:1 ω8c 지방산, 19:0 cyclo ω10c/19ω6 지방산, 20:1 ω9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산은 CLCC1 균주에서만 검출되었으며, 17:0 iso 3OH 지방산은 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768 균주에서만 검출되었다.
상기 분자생물학적 특징 비교 분석 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium cancerinhibens에 포함되는 알려진 종인 Faecalibacterium prausnitzii와는 상이한 종임을 확인할 수 있었다. 두 미생물의 지방산(fatty acid) 구성을 비교해보았을 때 두 미생물간 주요 지방산의 구성에 차이가 나는 것을 알 수 있고, 해당 결과는 도 3a와 표 2에 나타내었다.
2-2: 극성 지질(Polar lipid) 분석
극성 지질(polar lipid) 구성을 비교하기 위해 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 50mg의 미생물 동결건조 시료로부터 Minikin의 방법(Minikin, D.E., et al. (1984). J Microbial Meth 2, 233-241.)을 이용해 극성 지질을 추출하였다. 그리고 클로로포름, 메탄올 및 물 65:25:3.8(v/v)의 비율인 용매(chloroform:methanol:water = 65:25:3.8(v/v)) 에서 1차 전개를 수행하였다. 이후, 클로로포름, 메탄올, 아세트산 및 물의 비율 40:7.5:6:1.8(v/v)인 용매(chloroform:methanol:acetic acid:water = 40:7.5:6:1.8(v/v)) 하에서 2차 전개를 수행하였다. 2차 전개 이후 5%(w/v) 에탄올릭 몰리브덴인산(ethanolic molybdatophosphoric acid)을 이용하여 염색하였다.
또한, 극성 지질(Polar lipid)의 조성을 비교하였을 때 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1과 Faecalibacterium prausnitzii는 1개의 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG), 2개의 알려지지 않은 인지질(unidentified phospholipids: PL1, PL2), 그리고 다수의 밝혀지지 않은 지질(unidentified lipid, L)을 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한 CLCC1은 Faecalibacterium prausnitzii에는 없는 unidentified phospholipids (PL3)를 추가로 가지고 있는 것을 알 수 있는 것을 확인하였고 해당 결과는 도 3b에 나타내었다. 상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1과 Faecalibacterium prausnitzii의 극성 지질 생산 패턴이 상이함을 알 수 있다.
2-3: 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acid; SCFA) 분석
Faecalibacterium prausnitzii과 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물의 짧은사슬 지방산 생산 패턴의 차이점을 살피기 위해 한국 의과학연구원에 분석 의뢰를 하여 짧은 사슬 지방산 분포 분석을 수행하였다.
구체적으로, Faecalibacterium prausnitzii과 본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 RCM 배지에서 16시간 배양 후, 원심분리 (4℃, 4,000 rpm, 10min)를 통해 세포를 침전시켜 상등액을 수집하였다. 상기 수집된 상등액은 0.22um 필터를 이용하여 필터링 후 냉장보관하였다. 상기 상등액으로부터 SCFA 분석을 위한 GC-MS용 시료는 Takeshi Furuhashi의 방법(Takeshi Furuhashi, et al., Analytical Biochemistry, Volume 543, 2018, Pages 51-54)을 이용하여 준비하였으며, GC-MS를 이용한 짧은사슬 지방산 분석에는 Agilent 사의 6890 시리즈 장비를 이용하였다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1과 Faecalibacterium 속의 알려진 다른 종인 Faecalibacterium prausnitzii의 배양 상등액에 존재하는 짧은 사슬 지방산(Short chain fatty acid, SCFA)을 비교 분석한 결과, 두 시료 모두에서 SCFA는 부티르산(butanoic acid)만 검출되었다. 또한 Faecalibacterium prausnitzii 시료에 비해 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 시료에서 7.8배 높은 함량의 부티르산(butanoic acid)이 검출되었다. 도 3c 내지 3d에 GC-MS 분석 결과 그래프를 표시하였다.
또한 각 시료 내 부티르산 비율로 보았을 때, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 배양 상등액에서는 91.64%가 부티르산으로 나타났고, Faecalibacterium prausnitzii의 배양 상등액에서는 76.40%가 부티르산이었다. 표 2에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 짧은 사슬 지방산 분석 결과를, 표 3에 Faecalibacterium prausnitzii의 짧은사슬 지방산 분석 결과를 나타내었다. 하기 표 2 내지 표 3에 표기된 기타 물질은 물질 라이브러리 데이터베이스 상에서 탐지가 되기는 하였지만 매칭률(quality)이 매우 낮아 정확히 물질을 특정할 수 없는 노이즈 시그날로 분류되었다. 하기 표 2 및 표 3에서 RT는 머무름 시간(retention time)을 의미한다.
피크 RT Library/ID 매칭률 (Quality) Area 비율(% of total, %)
1 2.6965 Oxirane 58 606,058 3.132
2 3.1915 Butanoic acid (CAS); n-Butyric acid 94 17,732,337 91.635
3 3.5174 Ethane, methoxy- (CAS); Methane 50 497,085 2.569
4 4.1933 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl- (CAS) 43 515,638 2.665
피크 RT Library/ID 매칭률
(Quality)		 Area 비율(% of Total, %)
1 2.6908 2-Decanone (CAS) 38 338,372 11.491
2 3.0167 Butanoic acid (CAS); n-Butyric acid 93 2,249,717 76.401
3 4.2057 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl- (CAS) 47 356,542 12.108
본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium prausnitzii에 비해 짧은 사슬 지방산 중 부티르산의 생산량이 높아, 우수한 항암 활성을 나타냄을 예측할 수 있다.
실시예 3. 간암에 대한 효능 평가
3-1: 피하 종양 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 암 발생 억제능을 확인하기 위해, 마우스 간암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험하였다. 6주령 수컷 C57BL/6 마우스 10개체에서 간암 세포주 (Hep55.1c)의 피하 종양 이식 실험을 통해 간암을 발생시키고, 55일 동안의 간암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 경구 투여가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보았다. 상기 간암 세포주 Hep55.1c는 마우스 유래 간세포암(hepatoma)이다.
구체적으로, 마우스 간암 세포주를 마우스 피하 조직에 이식하기 4일 전부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1을 경구로 투여하였다. 경구 투여 4일째에 마우스 간암 세포주(Hep55.1c)를 2.0 x 106 cells이 되게 하여 오른쪽 옆구리 피하 조직에 이식하였다.
상기 마우스 간암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에 대해, 55일간 1일 1회, 주5회 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 경구 투여하였다. 이후 이식 당일(0일)부터 55일이 되기까지 7일 간격으로 Magnetic Resonance (MR)촬영을 이용하여 간암 종양의 크기 (tumor volume)를 측정하였다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 RCM 배지에서 배양 후, 농축하여 PBS 버퍼와 글라이세롤을 이용해 최종 글라이세롤 농도 15%(v/v)가 되게 하여 냉동보관하였다. 그리고 마우스에 투여 직전 해동 후 마리당 200ul(2x108cells)이 되게 경구투여하였다. 대조군으로는 CLCC1 균주를 투여하지 않은 마우스 10개체를 사용하였다. 대조군은 균주가 포함되지 않은 PBS 및 글라이세롤 (15%, v/v) 용액을 200ul씩 경구투여 하였다.
하기 표 4 및 표 5에 피하 종양 모델에서 분리 균주의 간암 발생 억제 효능시험에서 대조군과 시험균의 종양 크기 결과를 나타낸다. 표 5에는 대조군에 관한 종양의 부피(volume) 변화 결과이고, 표 6은 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 투여한 실험군 종양의 크기(volume) 변화 결과이다. 표에서 S.D는 표준편차를 의미한다.
Figure pat00003
Figure pat00004
도 4는 마우스에 암을 유도한 후 시간의 변화에 따른 종양의 부피(tumor volume)를 측정하여 그래프로 나타내었으며, 상기 표 5 내지 표 6에 종양의 크기 변화를 수치로 나타내었다.
실험 결과, CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 간암 발생 및 진행이 억제됨이 확인되었다. 평균적으로 대조군에 비해 CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 종양의 부피가 19.5%에서 75.3%가량, 평균 32.9% 낮은 수치를 보여, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주가 투여된 실험군에서의 간암 발생이 지연되고, 종양의 성장 진행 속도가 저해됨이 확인되었다. 수술 후 첫 종양 크기 측정일인 4일에서, Faecalibacterium canceerinhibens CLCC1 균주를 투여한 실험군에서 종양의 크기가 대조군에 비해 확연히 작아, 암 발생 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다. 따라서 경구 투여된 CLCC1 균주가 간암의 발생 및 진행을 억제하는 활성을 가짐을 알 수 있다.
3-2: 간 이식 동물 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 살피기 위해, 8 주령 수컷 C57BL/6 마우스 4개체에서 간암 세포주의 간 이식 실험을 통해 간암을 발생시키고, 39일 동안의 간암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens 세균 CLCC1의 경구 투여가 간 암 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보았다.
구체적으로, 간암 세포주는 Hep55.1c을 사용하였으며, 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 상복부를 개복하여 간의 좌엽에 5.0 x 105 cells이 되도록 간암 세포주를 이식하였다. 간에 종양 세포주를 이식 후 4일간 회복 기간을 거친 후 MRI 촬영을 통해 종양의 크기를 확인하고, 종양이 잘 형성된 4마리를 선별하여 이후 실험에 사용하였다.
이식 수술 당일(0일)부터 39일간 CLCC1 균주를 실시예 4와 동일한 방법으로 준비하여 이식 수술을 완료한 마우스 4마리에 경구 투여하였으며, 대조군 4마리에는 CLCC1 균주를 투여하지 않았다. 대조군은 균주가 포함되지 않은 PBS 및 글라이세롤 (15%, v/v) 용액을 200ul씩 경구투여 하였다. 이후 주기적으로 종양의 크기와 상대적인 크기 및 성장의 상대 수치를 측정하였다.
종양의 크기는 7일 간격으로 자기공명 (Magnetic Resonance, MR) 촬영을 통해 측정되었으며, 종양 크기의 상대 수치는 이식 당일 종양 크기에 대한 상대적인 크기를 계산하여 도출하였다. 도 5a 내지 도 5c에 간 이식 모델에서의 CLCC1 균주의 암 발생 억제 효과 시험 결과와 그래프를 나타내었다.
도 5a는 종양의 크기를 직접 비교한 점그래프 및 꺾은선그래프, 도 5b는 종양의 크기 변화를 배수(fold)로 표현한 점 및 꺾은선 그래프, 도 5c는 종양의 크기 변화량(측정일 종양 크기와 이전 측정일 종양 크기의 차) 값을 나타낸 점 및 꺾은선 그래프이다.
그 결과 CLCC1를 경구 투여한 실험군에서 분리주를 투여하지 않은 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 간암 발생과 진행이 억제되는 것을 확인 하였다. 간 암 발생 억제에 대한 결과 및 종양의 크기 변화 데이터는 도 5a 내지 5c에 나타내었다.
표 6에 종양크기의 상대수치표 (Relative growth; Fold) 및 표 7에는 종양 성장의 상대수치표 (Relative growth; Delta)를 나타낸다.
Figure pat00005
Figure pat00006
표 6 및 표 7와 도 5a 내지 5b에서 확인할 수 있는 바와 같이, CLCC1 균주를 경구투여한 마우스의 종양 성장이 대조군에 비해 두드러지게 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서 패칼리박테리움 켄서인히벤스 CLCC1 균주가 종양의 성장 억제능이 뛰어남을 확인할 수 있다.
실시예 4. 대장암에 대한 효능 평가
4-1. 피하 종양 모델에서의 항암 효과 확인
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 암 발생 억제능을 확인하기 위해, 인간 대장암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험하였다. 상기 대장암 세포주는 HCT-116 세포를 이용하였고, 마우스는 누드마우스 (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlOri, SPF)를 이용하였다. 상기 HCT-116는 인간 유래 결직장암(colorectal carcinoma)에 해당하는 암세포주이다.
구체적으로, 1주일의 순화기간을 거친 마우스에 대장암 세포주 HCT-116 (2.5x107 cells/mL)을 일회용 주사기를 이용하여 마우스의 우측 등 피하에 0.2 mL/head씩 투여하여 이식하였다. 암 세포 이식 후 암 세포의 크기가 약 85~119mm3 까지 자랐을 때, CLCC1을 투여하지 않는 음성대조군과 CLCC1을 농도별로 투여하는 실험군 3 그룹에 해당될 마우스들을 군 당 10마리씩 분류하였다. 구체적으로, 실험군은 CLCC1의 농도에 따라 저, 중, 고의 세 그룹으로 나누었으며, 저농도는 2x106 cells/head, 중농도는 2x107 cells/head, 고농도는 2x108 cells/head의 농도로 F. cancerinhibens CLCC1 균주를 투여하였다. 균주의 투여는 36일간 매일 1회 주사기로 경구 투여하였다. 음성 대조군은 부형제(글리세롤이 15%(v/v) 포함된 PBS 용액)만을 투여하였다. 하기 표 8에 음성 대조군과 각 실험군의 정보를 나타내었다.
기호 CLCC1 투여량 투여액량 설명 개체수 (마리)
G1 0 0.2mL/head 음성 대조군 10
G2 2x106(cells/head) 0.2mL/head 저농도 실험군 10
G3 2x107(cells/head) 0.2mL/head 중농도 실험군 10
G4 2x108(cells/head) 0.2mL/head 고농도 실험군 10
(1) 종양의 크기 변화 및 성장 억제율
F. cancerinhibens CLCC1 균주의 항대장암 효과를 확인하기 위해, 종양의 크기 변화를 확인하였다. 구체적으로, 상기 균주 투여 시험 시작 이후 매일 1회씩 외관, 행동, 배설물 등의 일반 증상을 관찰하였고, 주 1회 몸무게를 측정하였으며, 주 2회 종양의 크기를 측정하고 부피를 계산하였다. 도 6c 및 6d에 종양의 크기를 육안 관찰한 결과를 나타내었다.
상기 종양의 부피(Tv)는 종양의 단축(perpendicular width, W)과 장축(maximum length, L)을 각각 측정하여 하기의 수학식 3의 방법으로 계산되었다.
Figure pat00007
36일에 걸쳐 종양의 부피 변화를 확인한 결과를 하기 표 9 및 도 6a에 나타내었다. 음성 대조군(G1)에 비해 CLCC1 균주를 투여한 실험군에서 모두 통계적으로 유의하게 종양의 크기가 감소한 것을 확인하였다. 하기 표 9에서, Mean은 평균 부피를, S.D.는 표준편차(standard deviataion)를 의미한다.
Figure pat00008
* p<0.05, Significant difference from the negative control group (G1) by Dunnett's t-test.
** p<0.01, Significant difference from the negative control group (G1) by Dunnett's t-test.
구체적으로, 미생물 투여를 시작한 당일(1일)의 평균 종양 크기는 4개 그룹에서 모두 105mm3로 같았으나, 36일 경과 후에는 음성 대조군에서 평균 종양 부피가 4330mm3로 나타난 반면, CLCC1 균주가 투여된 실험군에서는 모두 3000mm3 이하의 부피를 보여, 대조군 대비 약 60 내지 67%의 종양 부피를 가지는 것으로 확인되었는 바, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물의 대장암 성장 억제 효과를 확인하였다.
또한 종양의 무게 측정 결과를 바탕으로 각 실험군에서의 종양 성장 억제율(Tumor growth inhibition rate, IR)을 하기 수학식 1의 방법으로 계산하였다.
[수학식 1]
Figure pat00009
상기 수학식 1에서, T는 각 실험군 그룹에서의 평균 종양 무게이고, C는 음성 대조군에서의 평균 종양 무게이다.
하기 표 10 및 도 6b에 균주 투여 실험의 종료 후 각 그룹에서의 종양 무게 측정 결과를 나타내었으며, 하기 표 11에 실험 진행에 따른 각 그룹 마우스의 평균 체중 측정 결과를 나타내었다.
Figure pat00010
** p<0.01, Significant difference from the negative control group (G1) by Dunnett's t-test
Figure pat00011
음성 대조군 (G1)에서는 부검 후 적출된 종양 무게가 약 3.21g으로 나타났으나, 실험군에서는 저, 중, 고농도에서 각각 1.94, 2.17 및 1.95g으로 나타나 종양. 무게가 통계적으로 유의하게 감소한 반면 각 그룹에서의 전체 체중은 대조군과 실험군 사이에서 큰 차이를 나타내지 않았다.
저농도의 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.6%, 중농도의 실험군에서는 종양 성장 억제율이 32.4%, 고농도의 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.3%로 나타나, 모든 실험군에서 종양의 성장이 30% 이상 억제되었음을 확인하였다.
(2) 종양세포의 괴사(Necrosis) 및 세포자멸사(Apoptosis)
36일간의 CLCC1 균주 투여 종료 후 부검하여 종양 조직 내 종양세포의 괴사(necrosis)를 보기 위한 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin staining)과 세포자멸사(apotosis)를 보기 위한 TUNEL assay를 수행하였다.
도 6e에 종양 세포의 괴사 분석을 위한 H&E 염색 결과 사진을 나타내었다. 음성 대조군과 시험군간 종양 세포의 괴사 수준에는 큰 차이가 발견되지 않았다. 따라서 본원의 패칼리박테리움 캔서인히벤스 세포주는 종양의 괴사에 의한 염증 반응을 유발하지 않음을 알 수 있다.
도 6f에 종양 세포의 자멸사 분석을 위한 TUNEL 염색 분석 결과 사진을 나타내었다. 음성 대조군에 비해 패칼리박테리움 투여 실험군에서 종양 세포의 자멸사가 통계적으로 유의미하게 증가하였음이 확인되었다. 따라서 각 패칼리박테리움 투여군에서의 종양 부피 감소가 종양의 괴사에 의한 것이 아닌, 종양의 세포 자멸사에 의한 것으로서 염증반응을 유발하지 않음을 확인하였다.
하기 표 12에 종양세포의 괴사와 자멸사를 비교한 결과를 나타내었다. 하기 표에서 세포 사멸의 정도에 따라 ± 는 최소(minimal), + 는 약함(mild) ++는 보통(moderate), +++는 뚜렷함(marked), ++++는 심함(severe)을 나타낸다. 각 기호 아래에 해당 단계에 해당하는 사멸 세포의 개수를 나타내었다.
Figure pat00012
## p<0.01, Significant difference from the negative control group (G1) by Steel's t-test.
상기 표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군(Control, G1)에서는 약 10.33%의 세포 사멸 비율을 보였으며, 저농도의 실험군(G2)에서는 대조군과 유사한 세포사멸 비율을 보였으나, 중농도(G3) 및 고농도(G4) 실험군에서는 12.4% 이상의 세포사멸이 관찰되었다. 따라서 패칼리박테리움 캔서인히벤스 미생물의 투여로 인해 종양 세포의 자멸이 증가함이 확인되었다.
4-2: 대장암 피하 종양 모델을 이용한 효능 평가
CLCC1 균주의 투여 시 대장암에 대한 항암 효능을 확인하기 위해 대장암세포를 피하 이식한 마우스를 이용하였고 미국의 비임상 위탁시험 기관인 Champion's oncology에서 시험을 수행하였다. 대장암 세포는 마우스 유래 대장암 세포주인 MC38 세포를 이용하였고, 마우스 strain은 C57BL/6 를 이용하였다. 상기 MC38 세포는 마우스 유래 결직장암(colorectal carcinoma)에 해당하는 암세포주이다. 시험 그룹은 아래와 같고, 그룹 당 10마리의 마우스가 포함되어 있다.
구체적으로 6주령 수컷 C57BL/6 마우스에서 대장암 세포주인 MC38 세포주의 피하 종양 이식 실험을 통해 대장암을 발생시키고, 대장암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 경구 투여가 대장암 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보았다.
실시예 4-1의 대조군 및 실험군의 시험 제제 제조방법과 실적으로 동일한 방법으로, 실시예 1의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 RCM 배지에서 배양 후, 농축하여 PBS 버퍼와 글라이세롤을 이용해 최종 글라이세롤 농도 15%(v/v)가 되게 하여 냉동보관하였다. 그리고 마우스에 투여 직전 해동 후 마리당 200ul 함량으로 저농도 생균 (2x107 cells/dose)(시료 1은 실시예 8-1의 G3에 상응)과 고농도 생균 (2x108 cells/dose) 마리당 200ul(2x108cells) (시료 2 은 실시예 8-1의 G4에 상응)이 되게 경구투여하였다. 대조군으로는 CLCC1 균주를 투여하지 않은 마우스 10개체를 사용하였다.
시료 3은 상기 제조된 시료 2를 100℃ 온도의 오븐에서 2시간 동안 처리하여 고농도 사균 (2x108 cells/dose)으로 사용하였다.
구체적으로 대조군과 시료 1 내지 3의 시험제제를 암세포 접종하기 2주전부터 투여를 시작하여 총 40일간 1일 1회 투여하였다. 구체적으로, 대조군과 시료 1 내지 3의 시험제제를 40일간 1일 1회씩 경구 투여하였으며, 투여 시작일로부터 14일 경과 후에, 대장암 세포(5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS)를 왼쪽 옆구리의 피하 조직에 접종하고 1주일간의 생착기간을 거친 후, 종양의 크기를 관찰을 22일째부터 시작하여 40일째까지 18일간 수행하였다. 종양 관찰의 시작일인 22일을 0일로 간주하여 18일간 Magnetic Resonance (MR)촬영을 이용하여 대장암 종양의 크기 (tumor volume)를 측정하였다. 종양의 크기 변화는, 암 세포 생착 후 22일 동안 종양의 장축 (maximum length, L)과 단축 (perpendicular width, W)을 측정하고, 다음의 수학식 3에 대입하여 종양의 부피 (tumor volume, TV)를 계산하였다. 상기 18일간 측정된 종양 부피를 하기 표 13과 도 7에 나타냈다.
[수학식 3]
Figure pat00013
[수학식 2]
Figure pat00014
하기 표 13에서, Mean은 평균 종양 부피를, S.D.는 표준편차(standard deviataion)를 의미한다. 표 13는 대조군, 시료 1 내지 3에 따른 분리 균주를 대장암 세포주를 이식한 피하 종양 모델에서 종양 부피(volume, mm3) 변화 결과이다.
관찰일 대조군 시료1 시료2 시료3
Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D.
1 28.63 19.64 18.3 13.12 29.1 18.21 19 14.64
4 47.63 27.39 44.8 33.41 60.7 89.62 42.3 42.41
7 109.38 60.98 92.6 59.67 100.6 111.84 85.5 89.91
8 174.63 33.93 171.7 124.72 231.4 319.62 124.2 97.38
11 367.63 83.97 295.2 201.81 303.8 360.13 277.2 265.91
13 633.75 218.75 437.4 307.75 446.1 457.75 396.8 388.22
15 934.13 329.64 686.6 495.19 785.5 694.4 707.4 679.62
18 1441.86 444.79 1296 979.09 1070.56 852.65 1094.89 897
상기 결과, 대조군 대비 시료 1 내지 3의 균주를 투여한 그룹에서 얻어진 종양 부피변화를 도 7에 각각 나타냈다. 측정 마지막 날을 기준으로 하여, 대조군의 종양 부피를 100%로 설정하여 시료 1 내지 시료 3의 종양 부피를 퍼센트로 계산한 결과, 시료 1은 89.9% (10.1% 감소), 시료 2는 74.2% (25.8% 감소), 시료 3은 75.9% (24.1 감소)로서, 시험 결과 대조군에 비해 CLCC1을 투여한 대장암 모델 마우스에서 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제됨을 확인하였다. CLCC1의 사균체를 투여하였을 때도 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제됨을 확인하였다. 또한, CLCC1 균주의 생균을 사용하나 농도를 상이하게 설정한 시료 1과 시료 2의 종양 부피 감소를 살펴보면, 동일 실험 조건에서 농도 의존적 방식으로 항암 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 시험 제제를 투여한 날 이후 1~3일 간격으로 외관, 몸무게, 행동, 배설물 등의 일반 증상을 관찰하였다. 시험은 시험제제 투여 후부터 총 40일간 수행되었으며, 암 세포 생착 후 18일간 관찰하였다. 상기 측정된 실험 동물의 몸무게(Kg)을 하기 표 14에 나타냈다.
관찰일 대조군 시료1 시료2 시료3
1 20.60 20.79 20.60 21.17
4 20.03 20.62 21.31 21.64
7 20.24 20.47 21.42 21.55
8 20.26 20.41 21.22 21.52
11 20.05 20.44 21.06 21.22
13 20.42 20.44 21.17 21.28
15 20.54 20.77 21.13 21.38
18 20.50 20.93 21.27 21.09
실험 동물의 전체 몸무게는 암세포 생착 이후 대조군 그룹에 해당하는 마우스들의 몸무게가 시험군들보다 낮은 경향을 보이나, 전체적으로는 대조군과 시험군 간에 큰 차이가 없었다.
실시예 5: Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델에 대한 예방 효능평가
5-1: 모델 동물제조 및 시료 투여
암컷 BALB/c 마우스 (약 6 주령)을 공급 업체로부터 공급받아 순응 기간(약 7일)을 거쳐 실험을 진행하였다. 순응 기간 후에 시험 물질 투여 개시 3주차에 7일 동안, 정상 대조군은 정상적인 음수를 공급하고, 정상 대조군을 제외한 모든 군은 3% DSS를 음수병에 넣어 자유 급수하여 대장염을 유발하였다, 암컷 BALB/c 마우스(6주령)를 6일 간의 순화 기간을 거쳐 군당 6마리(7주령)로 본 실험을 진행하였다. 시험 동물은 총 6군으로 진행하였고, 군 구성은 다음과 같다.
Group Group 설명 투여용량
(cells/100 uL)		 투여액량
(mL/head)		 동물수
(개체번호)
G1 정상대조군 0 0.2 6(1101~1106)
G2 음성대조군 0 0.2 6(1201~1206)
G3 대조물질 투여군 200mg/Kg 10mL/Kg 6(1301~1306)
G4 시험물질 투여군1 1 x 107 0.2 6(1401~1406)
G5 시험물질 투여군2 1 x 108 0.2 6(1501~1506)
G7 시험물질 투여군3 1 x 108 0.2 6(1701~1706)
대조군은 정상 대조군(G1), 음성 대조군(G2) 및 양성 대조군(G3)으로 설정하였다. G1 및 G2는 시험 시작일부터 부형제인 15% glycerol를 투여하였고, G3는 Salicylazosulfapyridine(SASP)을 200mg/kg 투여하였다. 시험물질 투여군은 생균군(G4, G5)과 사균군(G7)으로 나누어 진행하였다. 생균군 G4와 G5, 및 사균군(G7)은 시험 시작일부터 종료일까지 1일 1회 24일 동안 CLCC1을 투여하여 CLCC1의 예방 효과를 확인하고자 하였다. 대장염은 시험 물질 투여 개시 3주차에 7일 동안 3% DSS를 음수병에 넣어 자유 급수하여 유발하였다.
본 실험에서 체중 감소 평가, 질병활성지수(Disease Activity Index, DAI), 대장 길이 측정하고, 대장 조직의 조직 병리학적 검사를 수행하였다.
5-2: 체중 감소 평가
체중은 투여개시일부터 시험종료일까지 2 회/주 간격으로 측정하였고, 각 투여 일의 투여 전에 측정하였다. 3% DSS 급수 전 측정된 체중을 기준으로 체중의 변화를 백분율로 계산하였으며, 그 결과를 도 8에 나타낸다.
DSS를 급수하였을 경우 6 일 후부터 모든 군(G2~G7)에서 급수전에 비해 체중이 감소되기 시작하여 시험 종료일까지 감소율이 증가되는 경향이 나타났다. 체중 감소는 염증성 장질환의 중요하고 잠재적으로 위험한 부작용이다. G2에 비해 G4, 및 G5군에서 체중 감소율이 통계적으로 유의하게 감소되었다. (*p<0.05 and **p<0.01, Independent t-test) G7은 G2와 차이를 보이지 않았다. 따라서 CLCC1 생균 투여는 대장염으로 인한 체중 감소를 개선시키는 것으로 확인되었다.
5-3: DAI (disease activity index)
DAI는 3% DSS 투여 일부터 체중(body weight), 변 상태(stool consistency) 및 분변내 혈액 유무(presence of fecal blood)에 따라 점수화 하여 합으로 나타냈다. 구체적으로, 질병활성지수는 체중 감량(예를 들어, 체중 증가 또는 베이스라인 대비 1% 이내 유지(점수 0); 1.5% 체중 감소(점수 1); 5~10% 체중 감소(점수 2); 10~15% 체중 감소(점수 3); >15% 체중 감소(점수 4)); 대변 일관성(예를 들어 정상(점수 0); 묽은 대변(점수 2); 설사(점수 4)); 및 출혈(예를 들어 출혈 없음(점수 0), 중등도 출혈(점수2), 심한 출혈(점수 4)))에 기초하여 점수를 매긴다.
상기 평과 결과를 도 9에 나타낸다. G3~G6 는 DSS 투여 후에 DAI 점수가 증가되었으나 시험 종료 시점에는 G2 대비 낮은 점수를 나타내었다. 시험 종료 시점에 G3, 및 G4 및 G6 의 평균 점수는 7.0 점, 및 6.7 점으로 G2 대비 통계학적으로 유의하게 낮았다. (*p<0.05 and **p<0.01, Independent t-test) G5 의 DAI 점수는 시험 종료 시점에 평균 7.3 점으로 G2 대비 낮았으나 통계학적으로 유의한 차이는 아니었다. G7 의 DAI 점수는 시험 종료 시점에 평균 11.3 점으로 G2 와 차이를 보이지 않았다.
따라서 CLCC1 생균 투여로 G2대비 DAI 점수가 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였고, 이는 체중, 변 상태 및 분변내 혈액 유무와 같은 증상이 개선되었음을 의미하였다.
5-4: 대장 길이 측정
시험 종료 후, 동물은 마취하고 개복하여 방혈한 다음 개체 별로 대장 조직을 적출하였다. 적출한 대장은 사진 촬영을 하고 길이를 측정하였다. 상기 측정된 결과를 도 10에 나타낸다.
DSS로 대장염을 유발하면 대장의 길이가 감소된다. G2의 대장 길이는 G1에 비해 통계학적으로 유의하게 감소되었다. (††p<0.01, Independent t-test) 생균 투여군 G4, 및 G5의 대장 길이는 G2에 비해 통계학적으로 유의하게 적게 감소되었다. (*p<0.05, Independent t-test) 이는 생균 투여군이 G2에 비해 대장 위축을 저해하여 대장의 길이가 감소하는 것을 방지 또는 개선하는 것을 의미하였다.
따라서 CLCC1 생균 투여는 결장 위축을 저해하여 대장의 길이가 감소하는 것을 개선하는 것으로 확인되었다.
5-5: Cytokines 분석
대장에서 RNA 를 추출하여 IL-6, TNF-α 및 IFN-γ 의 유전자 발현을 RT-qPCR 을 통해 분석하였다.
적출한 대장조직은 PBS에 수세 후 RNAlater (Lot No.: 00833281, Invitrogen, MA, U.S.A.)에 넣어 보관하였다. Total RNA extraction kit (Lot No.: 157031929, QIAGEN, Germany) 의 매뉴얼에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA는 핵산정량기 (IFNinite M200 pro, Tecan, Austria)를 이용하여 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. Real time PCR machine (CFX384, BIO-RAD, CA, U.S.A.)을 이용하여 TNF-α, IFN-γ및 IL-6 의 RT-qPCR을 다음의 조건으로 실시하였다.
RT-qPCR mixture 조성은 하기 표 16에 나타내고, RT-qPCR 조건은 하기 17에 나타낸다. RT-qPCR 결과는2 -ΔΔCt 방법을 이용하여 유전자 발현양을 비교하였다.
Figure pat00015
Figure pat00016
상기 측정된 결과를 도 11a 내지 도 11c에 나타낸다.
DSS로 대장염 유발 시 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-17, IL-1β, IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-12, IL-25, IL-33, IL-8, MCP-1, MIP-3α, CXCL1 및 IL-23 등)은 발현이 증가되고, 항 염증성 사이토카인(IL-4, IL-10, IL-13, IFN-α, TGF-β 등)은 발현이 감소된다. 이 중 본 실험에서는 염증성 사이토카인으로 IFN-γ, IL-6, 및 TNF-α 의 발현 수준을 측정하였다.
생균 투여군(G4~G5)에서 모두 음성 대조군(G2)에 비해 IFN-γ, 및 IL-6 수준이 통게적으로 유의하게 낮았다. TNF-α 수준은 CLCC1 고농도 생균 투여군(G5)에서 G2에 비해 통계적으로 유의하게 낮았다. (*p<0.05, Independent t-test) 따라서 CLCC1 생균 투여는 IFN-γ, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 수준을 낮추는 것으로 확인되었다.
5-6: 조직 병리학적 검사
적출된 조직을 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 적출하여 고정시킨 대장조직은 4 ~ 5 μm의 두께로 조직절편을 제작하여 박절하여 슬라이드에 부착시켰다. H&E staining 후 permount (Fisher Scientific, NJ, U.S.A.)로 봉입하여 현미경(CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하고 사진 촬영을 실시하였다.
상기 시험군 G2의 대장 점막은 crypt 구조가 상실되면서 점액을 분비하는 goblet 세포가 소실되었고 전층 염증 (transmural inflammation)이 발생되었다. 조직내 적혈구와 백혈구가 다량 관찰되었다. G3 ~ G5에서 cryp 구조가 유지되고 염증이 감소되는 것이 관찰되었다. G7 은 crypt 구조가 상실되고 조직내 적혈구와 백혈구가 관찰되었다. 상기 관찰된 결과를 도 12에 나타낸다. 따라서 CLCC1 생균 투여는 손상된 장 조직 병리를 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 6: Acute DSS-colitis을 갖는 동물모델에 대한 치료 효능평가
6-1: 모델 동물제조 및 시료 투여
암컷 BALB/c 마우스 (약 6 주령)을 공급 업체로부터 공급받아 순응 기간(약 7일)을 거쳐 실험을 진행하였다. 순응 기간 후에 시험 물질 투여 개시 3주차에 7일 동안, 정상 대조군은 정상적인 음수를 공급하고, 정상 대조군을 제외한 모든 군은 3% DSS를 음수병에 넣어 자유 급수하여 대장염을 유발하였다, 암컷 BALB/c 마우스(6주령)를 6일 간의 순화 기간을 거쳐 군당 6마리(7주령)로 본 실험을 진행하였다. 시험 동물은 총 4군으로 진행하였고, 군 구성은 다음과 같다.
Group Group 설명 투여용량
(cells/100 uL)		 투여액량
(mL/head)		 동물수
(개체번호)
G1 정상대조군 0 0.2 6(1101~1106)
G2 음성대조군 0 0.2 6(1201~1206)
G3 대조물질 투여군 200mg/Kg 10mL/Kg 6(1301~1306)
G6 시험물질 투여군4 1 x 108 0.2 6(1601~1606)
대조군은 정상 대조군(G1), 음성 대조군(G2) 및 양성 대조군(G3)으로, 치료군(시험물질 투여군4)은 생균군 G6으로 각각 설정하였다. G1 및 G2는 시험 시작일부터 부형제인 15% glycerol를 투여하였고, G3는 Salicylazosulfapyridine(SASP)을 200mg/kg 투여하였다. 시험물질 투여군 G6는 생균군으로 DSS로 대장염을 유발한 시점부터 10일 동안 1일 1회 투여하여 CLCC1의 치료 효과를 보고자 하였다. 대장염은 시험 물질 투여 개시 3주차에 7일 동안 3% DSS를 음수병에 넣어 자유 급수하여 유발하였다.
상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로, 체중 감소 평가, 질병활성지수(Disease Activity Index, DAI), 대장 길이 측정하고, 대장 조직의 조직 병리학적 검사를 수행하였다.
6-2: 체중 감소 평가
상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로, 체중은 투여개시일부터 시험종료일까지 2 회/주 간격으로 측정하였고, 각 투여 일의 투여 전에 측정하였다. 3% DSS 급수 전 측정된 체중을 기준으로 체중의 변화를 백분율로 계산하였으며, 그 결과를 도 8에 나타낸다.
DSS를 급수하였을 경우 6 일 후부터 모든 군(G2~G7)에서 급수전에 비해 체중이 감소되기 시작하여 시험 종료일까지 감소율이 증가되는 경향이 나타났다. 체중 감소는 염증성 장질환의 중요하고 잠재적으로 위험한 부작용이다. G2에 비해 G6군에서 체중 감소율이 통계적으로 유의하게 감소되었다. (*p<0.05 and **p<0.01, Independent t-test) 따라서 CLCC1 생균 투여는 대장염으로 인한 체중 감소를 개선시키는 것으로 확인되었다.
6-3: DAI (disease activity index)
상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로, DAI는 점수를 부여하였으며,상기 평과 결과를 도 9에 나타낸다. G6 는 DSS 투여 후에 DAI 점수가 증가되었으나 시험 종료 시점에는 G2 대비 낮은 점수를 나타내었다. 시험 종료 시점에 G6 의 평균 점수는 6.2 점으로 G2 대비 통계학적으로 유의하게 낮았다. (*p<0.05 and **p<0.01, Independent t-test)
따라서 CLCC1 생균 투여로 G2대비 DAI 점수가 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였고, 이는 체중, 변 상태 및 분변내 혈액 유무와 같은 증상이 개선되었음을 의미하였다.
6-4: 대장 길이 측정
상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로, 실험 동물의 대장 조직을 적출하고, 적출한 대장은 사진 촬영을 하고 길이를 측정하였다. 상기 측정된 결과를 도 10에 나타낸다. DSS로 대장염을 유발하면 대장의 길이가 감소된다.
G2의 대장 길이는 G1에 비해 통계학적으로 유의하게 감소되었다. (††p<0.01, Independent t-test) 생균 투여군 G6의 대장 길이는 G2에 비해 통계학적으로 유의하게 적게 감소되었다. (*p<0.05, Independent t-test) 이는 생균 투여군이 G2에 비해 대장 위축을 저해하여 대장의 길이가 감소하는 것을 방지 또는 개선하는 것을 의미하였다.
따라서 CLCC1 생균 투여는 결장 위축을 저해하여 대장의 길이가 감소하는 것을 개선하는 것으로 확인되었다.
6-5: Cytokines 분석
상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로, 대장에서 RNA 를 추출하여 IL-6, TNF-α 및 IFN-γ 의 유전자 발현을 RT-qPCR 을 통해 분석하였다. 상기 측정된 결과를 도 11a 내지 도 11c에 나타낸다.
DSS로 대장염 유발 시 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-17, IL-1β, IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-12, IL-25, IL-33, IL-8, MCP-1, MIP-3α, CXCL1 및 IL-23 등)은 발현이 증가되고, 항 염증성 사이토카인(IL-4, IL-10, IL-13, IFN-α, TGF-β 등)은 발현이 감소된다. 이 중 본 실험에서는 염증성 사이토카인으로 IFN-γ, IL-6, 및 TNF-α 의 발현 수준을 측정하였다.
생균 투여군(G6)에서 모두 음성 대조군(G2)에 비해 IFN-γ, 및 IL-6 수준이 통게적으로 유의하게 낮았다. TNF-α 수준은 CLCC1 고농도 생균 투여군(G6)에서 G2에 비해 통계적으로 유의하게 낮았다. (*p<0.05, Independent t-test) 따라서 CLCC1 생균 투여는 IFN-γ, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 수준을 낮추는 것으로 확인되었다.
6-6: 조직 병리학적 검사
상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로, 적출하여 고정시킨 대장조직의 절편을 현미경(CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하고 사진 촬영을 실시하였다.
상기 시험군 G2의 대장 점막은 crypt 구조가 상실되면서 점액을 분비하는 goblet 세포가 소실되었고 전층 염증 (transmural inflammation)이 발생되었다. 조직내 적혈구와 백혈구가 다량 관찰되었다. G6에서 cryp 구조가 유지되고 염증이 감소되는 것이 관찰되었다. 상기 관찰된 결과를 도 12에 나타낸다. 따라서 CLCC1 생균 투여는 손상된 장 조직 병리를 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 7: 염증성 사이토카인의 감소 평가 (HT-29 및 RAW 264.7)
7-1 HT-29 및 RAWN 264.7 세포주의 배양
HT-29 (한국세포주 은행, KCLB 30038)와 RAW 264.7 (한국세포주 은행, KCLB 40071)세포는 37˚C, 5%의 CO2 조건하에 10% FBS (Fetal bovine serum), penicillin (100 μg/mL), streptomycin(100 μg/mL)을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하며 2~3일에 한번씩 계대 배양을 진행하였다.
7-2: 균주의 배양 및 회수
본 실험에 사용된 F.prausnitzii A2-165는 DSMZ (DSMZ collection, Braunschweig, Germany) (DSM N°17677) 에서 입수하였다.
사용된 Faecalibacterium 속 미생물인 F.cancerinhibens CLCC1 및 F.prausnitzii A2-165는 절대혐기성 균주로 모든 배양 과정은 혐기 챔버에서 진행하였으며 mRCM의 media에서 배양하였고, 18~23시간 간격으로 총 2회의 계대 배양 (Subculture)를 통해 활성화시킨 뒤 실험에 사용하였다. 수득한 배양액을 3200 × g, 5min 조건에서 원심분리 한 뒤, 침전물을 제외한 상등액을 회수하여 실시예 7 및 실시예 8의 실험에 사용하였다.
7-3: HT-29 세포에서의 IL-8에 대한 효능 평가
HT-29 세포를 사용한 면역 조절 특성 평가 (Immuno-Modulatory Properties Using HT-29 Cells)를 수행하였다 (ELISA).
구체적으로, 사람 대장 상피 세포인 HT-29 를 이용하여 24-well plate에 5×10^4 Cells /well씩 culture 한 후, CLCC1 및 A2-165의 상등액과 co-culture 하기 하루 전에 RPMI1640에 10% FBS가 포함된 배지로 바꿔준다. Co-culture 당일에 RPMI1640 (+10% FBS) 배지에 CLCC1 및 A2-165 상등액 또는 mRCM의 media를 10% 되도록 넣어준다. 37˚C, 5% CO2 incubator에서 6시간 동안 TNF-α (5~10ng/ml; Peprotech, NJ)를 처리한 후 culture를 수행하였다. 모든 샘플은 3반복을 수행하였다. Co-culture 후에 배양 상등액을 수집하고, Interleukin-8 (IL-8)을 ELISA (Invitrogen, USA)를 통해 측정하였다. 결과는 pg/㎖으로 표현되며, mRCM의 media만 처리한 것을 negative control로 IL-8 기준 값으로 사용하여 normalization 하였다.
상기 ELISA로 분석한 HT-29 세포에서의 사람 IL-8의 분비량을 도 13에 나타낸다. 이 검사를 통하여 F.cancerinhibens CLCC1 및 F.prausnitzii A2-165 상등액 이 HT-29 cell 에서 mRCM의 media 만 처리한 대조군과 비교할 때, 통계적으로 유의미하게 IL-8 이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이는 F.cancerinhibens CLCC1이 TNF-α에 의해 증가한 염증 반응을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내며 또한 IL-8에 의해 유도될 수 있는 Neutrophil에 의한 장점막의 침윤 및 염증 매개 물질들의 분비를 억제함으로써 염증성 장질환의 치료제로 활용 가능한 것을 의미한다 (도 13).
7-4: RAW 264.7 세포에서의 IL-6 및 TNF-α에 대한 효능 평가
RAW 264.7 세포를 사용한 면역 조절 특성 평가 (Immuno-Modulatory Properties Using RAW 264.7)를 수행하였다. (ELISA)
구체적으로, 마우스 대식 세포 유래 세포주인 RAW 264.7를 이용하여 24-well plate에 5×10^4 Cells /well씩 culture한 후, F.cancerinhibens CLCC 및 A2-165의 상등액과 co-culture 하기 하루 전에 RPMI1640에 10% FBS가 포함된 배지로 바꿔준다. Co-culture 당일에 RPMI1640 (+10% FBS) 배지에 CLCC1 및 A2-165 상등액 또는 mRCM의 media를 10% 되도록 넣어준다. 37˚C, 5% CO2 incubator에서 6시간 동안 LPS (100ng/ml; Sigma, L4391)를 처리한 후 culture를 수행하였다. 모든 샘플은 3반복을 수행하였다. Co-culture 후에 배양 상등액을 수집하고, Interleukin-6 (IL-6) 및 TNF-α 를 ELISA (Invitrogen, USA)를 통해 측정하였다. 결과는 pg/㎖으로 표현되며, mRCM의 media 만 처리한 것을 negative control로 IL-6 및 TNF-α 기준 값으로 사용하여 normalization 하였다.
상기 ELISA로 분석한 RAW 264.7 세포에서의 마우스 IL-6 및 TNF-α의 분비량을 도 14 및 도 15에 나타낸다. 이 검사를 통하여 F.cancerinhibens CLCC1 및 F.prausnitzii A2-165 상등액이 RAW 264.7 cell 에서 mRCM의 media 만 처리한 대조군과 비교할 때, 통계적으로 유의미하게 IL-6 및 TNF-α 가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이는 CLCC1이 LPS에 의해 증가한 염증 반응이 감소할 수 있다는 것을 나타내며, IL-6에 의해 유도 될 수 있는 Th17 세포 분화에 따른 RORγT나 IL-17의 분비를 억제함으로써 염증 개선을 기대할 수 있으며 또한 TNF-α에서는 여러 면역 세포의 조절을 통하여 염증 관련 cytokine의 발현에 관여함으로써 염증성 장질환의 치료제로 활용 가능한 것을 의미하였다 (도 14 및 15)
실시예 8: 염증성 사이토카인의 억제 활성 평가 (HPBMC)
8-1: HPBMC Culture
HPBMC(Lonza, 4W-270)는 37˚C, 5%의 CO2 조건하에 10% FBS (Fetal bovine serum)을 첨가한 LGM-3™ (Lonza, CC-3211) 배지로 Culture하여 실험을 진행하였다.
8-2: HPBMC에서의 사람 IL-10에 대한 효능 평가
HPBMC 를 사용한 면역 조절 특성 평가 (Immuno-Modulatory Properties Using HPBMC)를 수행하였다.
구체적으로, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (Human Peripheral Blood Mononuclear Cells, HPBMC)을 12-well plate에 1×106 Cells /well씩 culture한 후, CLCC1과 A2-165의 상등액 및 PBS를 10% 되도록 넣어주었다. 37˚C, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 반응 이후 culture를 수행하였다. 모든 샘플은 3반복을 수행하였다. Co-culture 후에 배양 상등액을 수집하고, Interleukin-10 (IL-10)를 ELISA (Invitrogen, USA)를 통해 측정하였다. 결과는 pg/㎖으로 표현되며, PBS 만 처리한 것을 negative control로 IL-10 기준 값으로 사용하여 normalization 하였다.
상기 분석한 HPBMC에서의 사람 IL-10에 대한 효능 결과를 도 16에 나타낸다. 이 검사를 통하여 F.cancerinhibens CLCC1과 F.prausnitzii A2-165 상등액을 HPBMC 에서 PBS만 처리한 대조군과 비교하여, 통계적으로 CLCC1 상등액이 유의미하게 IL-10가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이는 F.cancerinhibens CLCC1이 인간 말초혈액 단핵 세포에서 항염증 관련 cytokine 중 IL-10 발현에 관여함으로써 항염증 작용을 할 수 있음을 의미하며 이는 염증성 장질환의 치료제로 활용 가능한 것을 의미한다 (도 16).
8-3: HPBMC에서의 IL-6에 대한 효능 평가
HPBMC 를 사용한 면역 조절 특성 평가 (Immuno-Modulatory Properties Using HPBMC)를 수행하였다.
구체적으로, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (Human Peripheral Blood Mononuclear Cells, HPBMC)을 24-well plate에 1×105 Cells /well씩 culture한 후, CLCC1 상등액 및 PBS를 10% 되도록 넣어준다. 37˚C, 5% CO2 incubator에서 6시간 동안 LPS(100ng/ml; Sigma, L4391)를 처리한 후 culture를 수행하였다. 모든 샘플은 3반복을 수행하였다. Co-culture 후에 배양 상등액을 수집하고, Interleukin-6 (IL-6)를 ELISA (Invitrogen, USA)를 통해 측정하였다. 결과는 pg/㎖으로 표현되며, PBS 만 처리한 것을 negative control로 IL-6 기준 값으로 사용하여 normalization 하였다.
상기 분석한 HPBMC에서의 사람 IL-6에 대한 효능 결과를 도 17에 나타낸다. 이 검사를 통하여 F.cancerinhibens CLCC1 상등액이 HPBMC 에서 PBS만 처리한 대조군과 비교하여, 통계적으로 유의미하게 IL-6가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이는 F.cancerinhibens CLCC1이 인간 말초혈액 단핵 세포에서 염증 관련 cytokine 중 IL-6 발현에 관여함으로써 염증 반응을 억제 할 수 있음을 의미하며 이는 염증성 장질환의 치료제로 활용 가능한 것을 의미하였다(도 17).
실시예 9: PCR 을 이용한 미생물 검출
9-1:시료 및 프라이머 준비
간략히 시료 준비에 대해 기재해 주세요. 상기 균주 게놈 DNA는 DNA prep kit (예. MO BIO's PowerSoil DNA Isolation Kit)를 이용하여 준비하였다.
blastn 프로그램을 이용하여 분석을 통해, Site-specific DNA-methyltransferase (dam)가 다른 미생물에서는 검색되지 아니하여 F.cancerinhibens CLCCL 에 특이적인 것을 확인하였다. 보다 더 용이하고 신속 정확하게 실시간으로 F.cancerinhibens CLCCL 특이적 검출 확인을 위해, 상기 dam 유전자 서열에 기초하여, 정방향 및 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 시료에 실시간 (real-time) PCR 증폭 반응을 실시하였다.
9-2: 커브 값(Ct 값)을 이용한 검출
실시간 (real-time) PCR 증폭 반응은 Bio-rad사의 CFX96 실시간 PCR 시스템(CFX96 Real-time PCR system; Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하여 실시하였으며, 실시간 PCR 증폭 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 상기 프라이머를 각각 10 pM을 함유하는 실시간(real-time) PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 실시간 PCR 혼합액에 첨가한 균주들의 게놈 DNA 양은 약 25 ng이었다. 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃에서 5초, 60℃에서 30초로 40회(40 cycles) 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응하였다. 이후, 융해 곡선(melting curve)과 융해 피크(melting peak)를 도출하기 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다. 사이클 수에 따른 상대적 형광(Relative Fluorescence Uints; RFU)을 측정하였다.
F.cancerinhibens CLCCL DNA를 포함하는 시료에서만 특이적으로 커브 값(Ct 값)이 확인되었고, 상기 결과로부터 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 F.cancerinhibens 를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
9-3: 정량 분석
Site-specific DNA-methyltransferase (dam) 유전자를 활용하여 패칼리박테리움 캔서인히벤스 양을 이미 양을 측정해 놓은 물질 (예. 플라스미드, or genomic DNA)을 이용하여, standard curve를 잡은 후 이를 활용하여 농도를 측정하였다.
전체 박테리아의 양은 16S universal primer 를 이용하여 분변 시료의 전체 미생물의 게놈을 추출 한 후, 이를 마찬가지로, 이미 양을 측정해 놓은 물질 (예, 플라스미드, genomic DNA)을 이용하여, standard curve를 잡은 후 이를 활용하여 농도를 측정하였다.
상대 정량을 위해서 앞에서 계산한 F.cancerinhibens CLCCL 양을 전체 박테리아의 양으로 나눈 값을 이용하였다.
실시예 10: 메타게놈 분석을 이용한 미생물검출
분석에 이용된 데이터는 대변 미생물에 대해 샷건 메타게놈 염기서열 분석법을 수행하여 얻어진 데이터로 분석에 이용된 데이터 중 Colorectal Cancer 및 Colorectal Cancer 집단대비 건강군(Healthy control중 SampleId가 ERR로 시작하는 데이터)의 경우 논문으로 발표된(https://gut.bmj.com/content/66/1/70) 공개 데이터를 다운로드 받았고 이외의 궤양성 대장염, 크론병 및 건강군 데이터는 공동연구를 통해 자체적으로 수집한 대변 미생물 샷건 메타게놈 염기서열 데이터를 이용하였다.
각각의 시료 데이터는 샷건 메타게놈 데이터를 이용하여 종 수준에서 미생물 종에대한 풍부도를 계산하는 코어유전자에 대한 K-mer 완전 일치 방법(한국특허공개공보 10-2020-0027900)으로 분석하여 시료 내 미생물 종의 풍부도에 대한 프로파일을 얻어내었다. F.cancerinhibens CLCCL 균주의 풍부도 분석을 위해서 우선 종 수준으로 기존의 유전체와 구별됨을 확인하기 위하여 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768의 유전체와 ANI(Average Nucleotide Frequency)분석을 수행하여 종 수준의 기준 유사도인 95에 비해 확연히 낮은 85.74의 수치로 신종임을 확인하여 참조 미생물 유전체 데이터베이스에 추가하였다.
각 시료에 대해서 패칼리박테리움 캔서인히벤스 CLCC1의 유전체가 포함된 상기 참조 데이터베이스를 사용하여 각각의 질병군과 건강군에서의 분포를 비교하였다. 상기 실험결과를 하기 표 19와 도 18에 나타냈다.
구분 평균 표준편차 최소값 최대값 p-value
건강 대조군 3.589 4.315 0 26.521 -
Ulcerative Colitis 2.363 2.980 0 19.872 0.006402
Crohn's Disease 3.436 7.651 0 55.056 6.71E-06
본 발명에 따른 CLCC1 균주는 건강군과 궤양성 대장염 군, 건강군과 크론병 군 사이에서 유의하게 차이가 나는 결과를 보여주었으며, 이는 장내 미생물로 상재하면서 분포량의 차이로 질병군을 구분할 수 있음을 보여준다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM13783BP 20190103
<110> ChunLab, Inc. <120> Composition for diagnosis or treatment of inflammatory disease including microorganism <130> DPP20212800KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 16S rRNA sequence <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgcgc ctaacacatg caagtcgaac 60 gagcgagaga gagcttgctt tctcgagcga gtggcgaacg ggtgagtaac gcgtgaggaa 120 cctgcctcaa agagggggac aacagttgga aacgactgct aataccgcat aagcccacgg 180 ctcggcatcg agcagaggga aaaggagcaa tccgctttga gatggcctcg cgtccgatta 240 gctagttggt gaggtaatgg cccaccaagg cgacgatcgg tagccggact gagaggttga 300 acggccacat tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360 ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag gtcttcggat 420 tgtaaactcc tgttgttggg gaagataatg acggtaccca acaaggaagt gacggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aaaacgtagg tcacaagcgt tgtccggaat tactgggtgt 540 aaagggagcg caggcgggaa gacaagttgg aagtgaaatc tatgggctca acccataaac 600 tgctttcaaa actgtttttc ttgagtagtg cagaggtagg cggaattccc ggtgtagcgg 660 tggaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg ggcaccaact 720 gacgctgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacacc 780 gtaaacgatg attactaggt gttggaggat tgaccccttc agtgccgcag ttaacacaat 840 aagtaatcca cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900 cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaagtct 960 tgacatccct tgacagacat agaaatatgt tttctcttcg gagcaaggag acaggtggtg 1020 catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080 cttatggtca gttactacgc aagaggactc tggccagact gccgttgaca aaacggagga 1140 aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc tttatgactt gggctacaca cgtactacaa 1200 tggcgttaaa caaagagaag caagaccgcg aggtggagca aaactcagaa acaacgtccc 1260 agttcggact gcaggctgca actcgcctgc acgaagtcgg aattgctagt aatcgtggat 1320 cagcatgcca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga 1380 gccgggggga cccgaagtcg gtagtctaac cgcaaggagg acgccgccga aggtaaaact 1440 ggtgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtaggaga acctgcggct ggatcacct 1499

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 98%이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 포함하는 박테리아 균주(bacteria srain)의 균체; 상기 미생물의 배양물; 상기 미생물의 파쇄물; 및 상기 미생물, 배양물 및 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출물;로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 위장관 질환인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 염증성 위장관 질환은, 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC) 또는 크론병(Crohn`s disease, CD)인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 면역 조절능 또는 항염 활성을 갖는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 사이토카인의 조절에 의한 면역 조절능을 갖는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-10으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주는, 조성물 총 중량을 기준으로 1×103　내지 1×1015CFU/g로 포함하는 것이 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 살아있는 박테리아 또는 동결건조물인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은, 항-염증제, 부신피질호르몬제, 면역조절제, 항생제, 종양 괴사인자 억제제, 야누스키나아제 억제제, 항인테그린제제, 및 인터루킨억제제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 약물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 하기 특성 중에서 선택된 1종 이상을 갖는 것인 조성물:
    상기 미생물은 17:0 iso 3OH 지방산을 포함하지 않는 것,
    상기 미생물은 종양의 성장 억제 활성 또는 암 세포의 세포사멸사(apoptosis)을 유발하는 항암 활성을 갖는 것,
    상기 미생물을 암 세포주를 이식한 동물 모델에 투여하였을 때, 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비하여 상대적인 종양 부피의 감소율은 5% 이상,
    상기 미생물을 암 세포주를 이식한 동물 모델에 투여하였을 때, 미생물을 투여하지 않은 대조군에 비하여 종양 무게에 따른 종양 성장 억제율이 5%이상, 및
    상기 미생물은 25 내지 40℃의 온도 및 혐기 조건 하에서 배양되는 것.
  11. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 수탁번호 KCTC 13783BP로 기탁된 패칼리박테리움 캔서인히벤스인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로키, 좌약, 현탁액 인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 프로바이오틱스인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 프로바이오틱스와 프리바이오틱스를 포함하는 것인 조성물.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019520340A (ja) * 2016-06-01 2019-07-18 クレストヴォ・ホールディングス・エルエルシー 炎症性腸疾患（ｉｂｄ）および他の障害を治療するための組成物および方法
KR20200114996A (ko) * 2019-03-28 2020-10-07 주식회사 천랩 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주 및 이를 포함하는 대장암에 대한 항암 조성물

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016511272A (ja) 2013-03-05 2016-04-14 レイクスユニフェルシテイト フローニンゲン 炎症を抑制するためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィーｈｔｆ−ｆ（ｄｓｍ２６９４３）の使用
FR3046934B1 (fr) * 2016-01-25 2018-01-26 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Souche de faecalibacterium prausnitzii cncm i-4573 pour le traitement et la prevention d'une inflammation gastro-intestinale
PE20210322A1 (es) * 2018-01-05 2021-02-18 Nubiyota Llc Composiciones que comprenden microbiota coseleccionada y metodos para su uso
BR112020023933A2 (pt) * 2018-05-24 2021-04-27 Seres Therapeutics, Inc. composições bacterianas projetadas e usos destas
KR102349921B1 (ko) 2018-09-05 2022-01-12 주식회사 천랩 시료 미생물의 동정 및 분류 방법
MX2021006674A (es) * 2018-12-05 2021-07-07 Seres Therapeutics Inc Composiciones para estabilizar bacterias y usos de las mismas.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019520340A (ja) * 2016-06-01 2019-07-18 クレストヴォ・ホールディングス・エルエルシー 炎症性腸疾患（ｉｂｄ）および他の障害を治療するための組成物および方法
KR20200114996A (ko) * 2019-03-28 2020-10-07 주식회사 천랩 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주 및 이를 포함하는 대장암에 대한 항암 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ferreira-Halder 등, Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 31(6), 페이지643-648, 2017.* *
NCBI GenBank 접근 번호 CP022479 (2017.10.27.)* *

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