CN116615561A - 用于诊断或治疗炎性疾病的包含微生物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种粪杆菌属(Faecalibacterium sp.)微生物和用于诊断或治疗肠道疾病的包含该微生物的组合物。

Description

用于诊断或治疗炎性疾病的包含微生物的组合物
技术领域
本发明涉及用于诊断或治疗炎性疾病的包含粪杆菌属(Faecalibacterium spp.)微生物的组合物。
背景技术
当生物体的免疫系统试图防御有害物质(例如侵入性病原体)时，炎症就会发生。免疫调节机制包括免疫调节细胞、细胞因子和细胞凋亡，调节由抵御病原体的过度反应引起的免疫应答。该机制的缺陷表现为炎性疾病，包括炎性肠病(IBD)。炎性疾病包含例如选自由炎症肠病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)、肠易激综合征、慢性消化失调(乳糜泻)、感染性结肠炎(例如，由艰难拟梭菌(C.difficile)引起的)、白塞氏病、其他胃肠道相关疾病和其任意组合所组成的组中的炎性胃肠道疾病。
炎性肠病(IBD)是胃肠道的慢性炎性病症，其特征是粘膜屏障破坏、肠道微生物组成改变和全身生化异常。根据临床特征和炎症在肠道中的定位，IBD分为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。IBD的确切病因尚不清楚，但已知由改变的肠道菌群或致病微生物的环境因素引发的过度免疫应答是主要的病因学原因。
IBD是一种由复杂且未知的病因导致的疾病，IBD的治疗非常有限，并且该治疗集中于诱导缓解和通过改善症状而不是治疗来维持缓解。最佳治疗方法可以考虑病变的区域范围、严重程度和临床特征、并发症等来选择。
IBD的治疗剂通过多种作用机制发挥作用，因此治疗剂根据详细的临床指南逐步使用，5-氨基水杨酸盐和皮质类固醇通常用作轻度至中度IBD的主要治疗剂，并且生物制剂例如TNF-α抑制剂(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗等)推荐作为对主要的治疗没有反应或失败的患者的二级药物。然而，在疾病早期施用高剂量TNF-α抑制剂的患者急剧增加。长期使用强效免疫抑制剂具有严重的副作用问题，因此，一直存在对于替代治疗剂的临床需求。
IBD与肠道菌群之间的关系已在许多研究中得到广泛证实，并且已知在IBD患者中，出现以有益肠道细菌的缺乏为特征的小型生物群失调，并且小型生物群失调被认为是IBD的免疫发病机制。
发明内容
技术问题
本发明的实施方式是提供一种用于预测发生炎性疾病(特别是炎性胃肠道疾病)的风险，或使用粪杆菌属微生物用于诊断炎性疾病(具体地，诊断炎性胃肠道疾病，例如，炎性肠病)，或使用该微生物用于预测或评估对炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如炎性肠病)的预防、改善或治疗的响应性的组合物、试剂盒或方法。
技术方案
本发明的实施方式提供了一种用于预防、改善或治疗炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如炎性肠病)的组合物，包含选自以下所组成的组中的至少一种：粪杆菌属微生物的微生物细胞；所述微生物的培养物；所述微生物的裂解物；和选自由微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物。所述组合物可以是药物组合物或食品组合物。
此外，本发明涉及炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如炎性肠病)的诊断，包括待施用的受试者的选择，或炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如炎性肠病)的预防、改善或治疗功效的评估。
本发明的实施方式提供了一种用于肠病的诊断的方法、组合物或试剂盒，包含选自由以下所组成的组中的至少一种：粪杆菌属微生物的微生物细胞；所述微生物的培养物；所述微生物的裂解物；和选自由微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物；一种用于选择施用粪杆菌属微生物的微生物细胞等的受试者的方法、组合物或试剂盒；或一种通过将粪杆菌属微生物的微生物细胞施用于受试者来评价对炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如，炎性肠病)的预防、改善或治疗功效的方法、组合物或试剂盒。
本发明的实施方式涉及一种用于预防、改善或治疗炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病或炎性肠病)的组合物，除了选自由以下所组成的组中的至少一种外：粪杆菌属微生物的微生物细胞；所述微生物的培养物；所述微生物的裂解物；和选自由微生物细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物，还包含选自由抗炎剂、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素、肿瘤坏死因子抑制剂(肿瘤坏死因子-α剂抑制剂、TNF-α抑制剂)、Janus激酶抑制剂(例如，托法替尼等)、抗整合素剂(例如，维多珠单抗等)、白细胞介素抑制剂(例如，优特克单抗等)等所组成的组中的至少一种。抗炎剂的实例包括5-氨基水杨酸盐、柳氮磺胺吡啶和奥沙拉嗪。类固醇的实例包括皮质类固醇、糖皮质类固醇、强的松、氢化可的松、甲基强的松龙、地塞米松和促肾上腺皮质激素(下文中，缩写为“ACTH”)。免疫调节剂的实例包括脱糖脂(deglycolipidated)、脱糖脂的牝牛分枝杆菌(deglycolipidated Mycobacteriumvaccae，下文中，缩写为“PVAC”)、抗肿瘤坏死因子受体超家族成员5(下文中，缩写为“抗-CD40”)配体、抗-CD40、那他珠单抗(AntegrenTM)、抗血管粘附分子1(下文中，缩写为“抗-VCAM1”)和抗细胞间粘附分子-1(下文中，缩写为“抗-ICAM1”)。细胞因子的实例包括白细胞介素-10(下文中，缩写为“IL-10”)。TNF拮抗剂的实例包括英夫利昔单抗(Remicade0)、依那西普(EnbrelOO)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(下文中，缩写为“CDP870”)。Janus激酶抑制剂的实例包括托法替尼(Xeljanz)，抗整合素剂的实例包括维多珠单抗(KyntelesR)和白细胞介素抑制剂的实例包括优特克单抗(Stelara pfs)。
本发明的实施方式提供了一种用于选择待施用粪杆菌属微生物的受试者的组合物、试剂盒或方法。具体地，本发明通过检测受试者样品中的抑癌粪杆菌(Faecalibacterium cancerinhibens)，预测发生炎性胃肠道疾病(例如炎性肠病)的风险，或诊断胃肠道疾病(例如炎性肠病)，或根据微生物的施用预测或评价对炎性胃肠道疾病(例如，炎性肠病)的预防、改善或治疗的响应性，据此，可以确定受试者是否可以接受胃肠道疾病(例如，炎性肠病)的改善或治疗疗法。
本发明的实施方式提供了一种使用粪杆菌属微生物用于评价抑癌粪杆菌在施用了抑癌粪杆菌的受试者中的功效或响应性的组合物、试剂盒或方法。具体地，本发明的实施方式涉及一种用于预测发生胃肠道疾病(例如，炎性肠病)的风险、或诊断胃肠道疾病(例如，炎性肠病)、或预测或评价对胃肠道疾病(例如，炎性肠病)的预防、改善或治疗的响应性的组合物或试剂盒，其包含用于检测受试者的生物样品中的抑癌粪杆菌的试剂。
本发明的另一种实施方式涉及一种用于预测发生炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如，炎性肠病)的风险，或诊断炎性疾病(具体地，炎性胃肠道疾病，例如，炎性肠病)，或预测或评价对胃肠道疾病(例如，炎性肠病)的预防、改善或治疗的响应性的方法，包括检测受试者的生物样品中的抑癌粪杆菌。
本发明提供了一种用于预防、改善或治疗与健康对照组中抑癌粪杆菌的水平相比抑癌粪杆菌的水平降低相关的疾病或紊乱的方法，其中，所述方法包括确定受试者具有降低的抑癌粪杆菌水平，并且当确定受试者具有降低的抑癌粪杆菌水平时施用包含抑癌粪杆菌的组合物。
本发明的实施方式涉及一种抗炎试剂，包含选自由以下所组成的组中的至少一种：粪杆菌属微生物的微生物细胞；所述微生物的培养物；所述微生物的裂解物；和选自由微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物。粪杆菌属微生物具有抗炎活性。
所述组合物可以是药物组合物或食物组合物，并且可以包含单独的益生菌，或与益生元组合的益生菌。
本文中，炎性疾病可以包含各种炎症，例如其可以是炎性胃肠道疾病，优选地，选自由炎性肠病(克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、肠易激综合征、慢性消化系统失调(乳糜泻)、感染性结肠炎(例如，由艰难拟梭菌引起的)、白塞氏病、其他胃肠道相关疾病和其任意组合所组成的组中的炎性胃肠道疾病。此外，炎性疾病是炎性自身免疫性疾病，并且在本文中，平衡失调的微生物群和低度粘膜炎症可以与疾病的病因学原因有关，例如糖尿病(1型和2型)、哮喘和特应性疾病。
在本发明中，本发明的菌株所表现出的免疫调节性疾病或炎性疾病的改善、治疗或预防的作用可以表征为由参与炎症抑制和免疫调节的细胞因子的增加或减少所诱导，具体地，可以是IFN-γ、IL-8、IL-6和TNF-α等的分泌减少，IL-10的分泌增加中的任意一种或多种作用。
IFN-γ的作用代表性地为NK细胞活化、巨噬细胞活化和MHC的表达增加等，已知慢性暴露于IFN-γ与多种非感染性病症(例如自身免疫性疾病和炎性疾病)有关。
当炎症发生时，中性粒细胞可以通过肠上皮细胞之间的紧密连接迁移至肠腔，并可以在额外的炎症恶化中起作用。在这个阶段，IL-8作为炎性细胞因子是重要的因素，它起到吸引这种中性粒细胞到炎症部位，并通过将中性粒细胞浸润到固有层粘膜并分泌炎症介质来引起组织损伤的作用。
IL-6由多种细胞分泌，例如T淋巴细胞、巨噬细胞等，来刺激免疫应答，在这种情况下，它可以引起导致感染、外伤、特别是烧伤或炎症的组织损伤。此外，已知IL-6可以通过诱导Th17细胞分化和促进RORγt或IL-17的分泌而起到加速炎症的作用。
引发炎症的主要因素之一TNF-α主要由活化的巨噬细胞分泌，由多种细胞分泌例如辅助性T细胞、自然杀伤细胞和受损神经元等。此外，TNF-α最重要的作用是调节免疫细胞，其可以诱导产生IL-1和IL-6，并已知在促进多种炎性疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎等)中的炎症反应中发挥作用。
此外，IL-10是在多种细胞(例如辅助性T细胞、B细胞、单核细胞等)中生产的重要的免疫调节细胞因子，IL-10最重要的作用是抑制炎症反应，并且具有免疫抑制和抗炎活性，例如抑制包括IL-6和TNF-α等的促炎细胞因子的生产。
炎性肠病(IBD)是以腹泻、血便、腹痛和体重减轻为特征的胃肠道的慢性炎性疾病，并且是病因不明的慢性、反复的炎症。IBD包含两种主要疾病病症：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，更具体地，包含慢性或急性溃疡性结肠炎和克罗恩病。UC主要影响大肠或结肠的粘膜层。相反，CD被定义为透壁肉芽肿性炎症，可以包含小肠和大肠段。
本发明提供一种抗炎(益生菌)组合物，例如含有益生菌的功能性食品、保健品或药物组合物，以及一种用于促进在胃肠道中益生菌的存活的方法。
在本发明中，粪杆菌属微生物可以是例如包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高的序列同一性的16S rDNA序列的细菌，并且可以是包含具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的16SrDNA基因的细菌，优选地，抑癌粪杆菌菌株CLCC1的保藏号为KCTC 13783BP。微生物或细菌可以具有选自由以下特征所组成的组中的至少一种特征：
(1)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的16S rRNA或包含具有98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高的核苷酸序列同一性的核苷酸序列的16S rRNA；
(2)脂质生产模式，具体而言，不包含17:0iso 3OH脂肪酸，更具体地，包含选自由15:1ω8c脂肪酸、19:0cycloω10c/19ω6脂肪酸、20:1ω9c脂肪酸、14:0 3OH/16:1iso I脂肪酸、15:0 3OH脂肪酸、16:0iso脂肪酸和16:0iso 3OH脂肪酸所组成的组中的至少一种脂肪酸，并且包含不存在于普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)中的PL3；
(3)与抑癌粪杆菌菌株CLCC1的基因组序列相比，平均核苷酸相似度(ANI)的值为95％或更低；
(4)免疫调节活性和/或抗炎症活性，例如，降低选自由IFN-γ、IL-6、IL-8和TNF-α所组成的组中的至少一种炎性细胞因子的水平，和/或增加选自由IL-10和TNF-β所组成的组中的至少一种抗炎细胞因子的水平，以具有抗炎活性和免疫调节活性，例如免疫抑制活性；
(5)抗癌活性，具体地，预防癌症发生、延缓或抑制肿瘤生长、减少肿瘤大小或体积、或抑制或延缓癌症转移的活性，例如，当向皮下移植癌细胞系的小鼠施用抑癌粪杆菌时，与未施用微生物的对照组相比，减小肿瘤体积10％至90％的活性；
更具体地，肿瘤生长的抑制活性或导致癌细胞凋亡的抗癌活性；
与未施用微生物的对照组相比，当施用至移植有癌细胞系的动物模型时，肿瘤体积的相对减少率为5％或更多；或者
与未施用微生物的对照组相比，当施用至移植有癌细胞系的动物模型时，肿瘤重量的肿瘤生长抑制率为5％以上；
(6)在培养温度为20℃～40℃下或在厌氧条件下培养，具体地，在20℃～40℃、25℃～40℃、30℃～40℃、35℃～40℃或37℃的温度下培养；以及
(7)高含量的丁酸，具体地，丁酸含量是普拉梭菌ATCC 27768菌株的丁酸含量的2倍～50倍。
本发明的抑癌粪杆菌可以具有选自上述特征中的至少一种特征。例如，具有上述(1)～(7)的所有特征的菌株，以及抑癌粪杆菌CLCC1是之前未被分离的和未报道的新物种。通过上述方法鉴定粪杆菌属微生物菌株，命名为抑癌粪杆菌(Faecalibacteriumcancerinhibens)CLCC1，保藏于韩国生命工学研究院(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)，韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection forType Cultures)，保藏号为KCTC 13783BP。
更具体地，作为抑癌粪杆菌菌株CLCC1的基因组分析和与近缘物种比较的结果，抑癌粪杆菌菌株CLCC1在基因组水平上与最接近的近缘物种(普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii))显示出85.99％的平均核苷酸同一性(ANI)值，所以抑癌粪杆菌菌株CLCC1是之前未被分离的和未报道的新物种。
更具体地，根据本发明的抗癌活性可以是对结直肠癌和/或肝癌的抗癌活性，例如，可以是抑制肝癌和/或结直肠癌的发生或进展的活性。具体而言，抗癌活性可以延迟肿瘤的发生或抑制肿瘤的生长速度，并且由于抑制肿瘤的生长速度，该抗癌活性可以进一步具有防止癌症转移的活性。
根据本发明的粪杆菌属微生物是从健康成年男性的粪便中分离的微生物，该微生物的作用是抑制在人类癌细胞系，皮下移植癌细胞系的小鼠模型，或具有移植癌细胞系的相应组织的小鼠模型中的癌症发生和肿瘤生长。具体地，在本发明的实例中，从健康成年男性的粪便中分离出抑癌粪杆菌菌株CLCC1，并证实该菌株对被诱导为结直肠癌或肝癌或移植结直肠癌或肝癌的小鼠中的肿瘤生长具有抑制作用。可以通过使用例如肿瘤体积/大小或肿瘤重量来测量抑制肿瘤生长的活性。
当将本发明提供的抑癌粪杆菌施用于皮下移植有癌细胞系的动物模型时，与未施用该微生物的对照组相比，根据肿瘤重量的肿瘤生长抑制率可以是5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上，并且根据肿瘤重量的肿瘤生长抑制率可以通过以下等式1计算。
[等式1]
IR(％)＝(1-(T1/C1))×100
在等式1中，IR为根据肿瘤重量的肿瘤生长抑制率(IR)，T1为各实验组中的平均肿瘤重量，C1为阴性对照组中的平均肿瘤重量。
当将本发明提供的抑癌粪杆菌施用至皮下移植有癌细胞系的动物模型时，与未施用该微生物的对照组相比，肿瘤体积的相对减少率可以为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上，并且根据肿瘤体积的肿瘤生长抑制率可通过以下等式2计算。
[等式2]
肿瘤体积的相对减少率(％)＝(1-(T2/C2))×100
在等式2中，T2为各实验组中的平均肿瘤体积，C2为阴性对照组中的平均肿瘤体积。
当将抑癌粪杆菌菌株CLCC1施用于根据本发明实例的移植有癌细胞系的肿瘤动物模型时，基于未施用该微生物的阴性对照组的肿瘤体积为100％，肿瘤体积可以是90％以下、85％以下、80％以下、77％以下、70％以下、67％以下，并且肿瘤体积可以具有结合选自为10％以上、15％以上、18％以上和20％以上的下限的值，与选自为90％以下、85％以下、80％以下、77％以下、70％以下和67％以下的上限的值的数值范围。
在癌症是结直肠癌的情况下，当施用微生物时，基于未施用该微生物的阴性对照组的肿瘤体积为100％，抑癌粪杆菌菌株CLCC1可以具有将肿瘤体积减少10％～90％、10％～85％、10％～80％、10％～77％、10％～70％、10％～67％、20％～90％、20％～80％、20％～70％、20％～67％、30％～90％、30％～80％、30％～70％、30％～67％、40％～90％、40％～80％、40％～70％、40％～67％、50％～90％、50％～80％、50％～70％、50％～67％或60％～67％的水平的活性。
具体而言，确认当开始在使用人结直肠癌细胞系的小鼠皮下肿瘤模型中施用微生物时，当天(第1天)的平均肿瘤大小与未施用微生物的阴性对照组相比具有约60％～67％的肿瘤体积，从而确认抑癌粪杆菌对抑制结直肠癌生长的作用。
在癌症是肝癌的情况下，当施用微生物时，基于未施用微生物的对照组的肝肿瘤体积为100％，本发明提供的抑癌粪杆菌CLCC1可以具有将肿瘤体积减少90％以下、85％以下、80％以下、77％以下、10％～90％、10％～85％、10％～80％、10％～77％、15％～90％、15％～85％、15％～80％、15％～77％、18％～90％、18％～85％、18％～80％或18％～77％的水平的活性。
在根据本发明的肝癌的肿瘤体积减小中，与对照组相比，肝癌的体积是19.5％～75.3％，并且在口服施用CLCC1的实验组中肝癌的平均体积降低约32.9％。因此，可以发现口服施用CLCC1微生物具有抑制肝癌中肿瘤的发生和进展的活性。
根据本发明的抑癌粪杆菌可以具有显示出与粪杆菌属微生物的普拉梭菌不同的脂质生产模式的特征。
根据本发明的抑癌粪杆菌不包含17:0iso 3OH脂肪酸。在本发明的实例中，作为分析抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌的极性脂质含量的结果，确认CLCC1另外具有不存在于普拉梭菌中的PL3(图3b)。根据本发明的抑癌粪杆菌可以包含选自由15:1ω8c脂肪酸、19:0cycloω10c/19ω6脂肪酸、20:1ω9c脂肪酸、14:0 3OH/16:1iso I脂肪酸、15:0 3OH脂肪酸、16:0iso脂肪酸和16:0iso 3OH脂肪酸所组成的组中的一种或多种脂肪酸。
在本发明的实例中，作为通过进行气相色谱分析来比较抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌的脂肪酸组成的结果，可以看出两种微生物之间的主要脂肪酸组成存在差异。具体地，15:1ω8c脂肪酸、19:0cycloω10c/19ω6脂肪酸、20:1ω9c脂肪酸、14:0 3OH/16:1iso I脂肪酸、15:0 3OH脂肪酸、16:0iso脂肪酸和16:0iso 3OH脂肪酸仅在CLCC1微生物中检测到，而17:0iso 3OH脂肪酸仅在普拉梭菌ATCC 27768中检测到。
本发明提供的抑癌粪杆菌在短链脂肪酸(SCFA)中具有高产量的丁酸。具体地，与普拉梭菌物种相比，本发明的抑癌粪杆菌菌株CLCC1的丁酸生产量可以是普拉梭菌物种的丁酸生产量的2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、6.5倍以上或7倍以上，具体地，其可以是2倍～50倍、2倍～40倍、2倍～30倍、2倍～20倍、2倍～15倍、2倍～10倍、5倍～50倍、5倍～40次、5倍～30次、5倍～20次、5倍～15次或5倍～10倍。在一种具体实施方式中，抑癌粪杆菌菌株CLCC1和普拉梭菌的培养上清液的SCFA分析结果表明，抑癌粪杆菌菌株CLCC1的丁酸含量是普拉梭菌的丁酸含量的7.8倍(图3c至图3d)。
根据本发明的抑癌粪杆菌菌株当涂抹在琼脂培养基上并培养时，形成3mm以内或2mm以内的菌落，在光学显微镜下观察时，呈长杆状细胞形状。在本发明的实例中，抑癌粪杆菌基因组的大小为2.9Mbp，蛋白质编码区(CDS)的数量为2695个，GC比例为56.1％，rRNA基因的数量为21个，tRNA基因的总数量为69个。在根据本发明的抑癌粪杆菌CLCC1中，检测到的丁酸(butanoic acid)含量是普拉梭菌检测到的丁酸含量的7.8倍(图3c至图3d)。
在本发明的具体实施方式中，由DSS诱导的结肠炎模型在隐窝形态的改变和丧失、溃疡形成、炎症细胞浸润等方面与人溃疡性结肠炎(UC)在组织学上相似，并广泛应用于结肠炎模型。通过以2×107个细胞/头和2×108个细胞/头的剂量、以一次/天的频率施用根据本发明的抑癌粪杆菌CLCC1，持续24天，来确认根据剂量的差异，通过以2×108个细胞/头的剂量、以一次/天的频率施用抑癌粪杆菌CLCC1，持续10天，来确认根据给药时间的差异，以及通过以2×108个细胞/头的死细胞的剂量、以一次/天的频率施用抑癌粪杆菌CLCC1，持续24小时，来确认根据活细胞和死细胞改善结肠炎的作用。
结果，其中用3％DSS诱发结肠炎的阴性对照组的体重迅速下降，观察到包括血便的软便和腹泻，并且大肠的长度减少，病理组织学上，隐窝结构被破坏，参与粘膜形成的杯状细胞消失，并发生全层炎症，并且观察到炎症细胞。此外，在阴性对照组中，炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的表达增加。
将抑癌粪杆菌CLCC1活细胞重复施用于BALB/c小鼠的DSS-诱导的结肠炎动物模型中，减少了结肠炎引起的体重减轻，改善了大肠长度的减少，并减少了对结直肠粘膜的组织损伤，以及抑制炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的表达，从而起到改善结肠炎的作用。具体地，与阴性对照组相比，炎症细胞因子IFN-γ和IL-6的表达在统计学上显著降低，并且TNF-α也显示了减少的趋势。所有测量都获得了相似的结果，根据细菌数量和施用持续时间没有显著变化。施用24次2×108个细胞/头的死细胞组的体重减轻和大肠长度与阴性对照组相似。此外，与阴性对照组相比，炎症细胞因子IFN-γ和IL-6减少。
根据本发明的用于预防、改善或治疗炎性胃肠道(例如IBD)的组合物可以包含微生物细胞本身或者是不包含微生物细胞的无细胞形式。裂解物是指通过粉碎粪杆菌属微生物细胞获得的裂解物或通过离心所述裂解物获得的上清液。在本文中，除非另有说明，具有抗癌活性的粪杆菌属微生物用于指选自由以下组成的组中的一种或多种：微生物的微生物细胞；微生物的培养物；微生物的裂解物；以及选自由微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组的一种或多种提取物。
根据本发明的组合物可以包含冷冻干燥的微生物细胞。微生物的微生物细胞的冷冻干燥可以通过本领域技术人员已知的方法进行。或者，本发明的组合物可以包含活微生物的培养物。在实施方式中，当粪杆菌属微生物自身包含微生物细胞时，本发明的微生物可以是活细胞、死细胞或其混合物。
根据本发明的用于预防、改善或治疗IBD的组合物，包含治疗有效量的本发明的微生物。治疗有效量的微生物足以对患者表现出有益效果。配制细菌或提取物从而以治疗有效量施用于受试者，治疗有效量取决于例如受试者的类型、疾病的严重程度和施用途径。例如，基于用于预防、改善或治疗炎性胃肠道(例如IBD)的组合物的总重量，对于成年人来说，细菌的适当每日剂量可以是约1×103～约1×1011菌落形成单位(CFU)，例如，约1×103～约1×1015CFU、约1×103～约1×1014CFU、约1×103～约1×1013CFU、约1×103～约1×1012CFU、约1×103～约1×1011CFU、约1×105～约1×1015CFU、约1×105～约1×1014CFU、约1×105～约1×1013CFU、约1×105～约1×1012CFU、约1×105～约1×1011CFU、约1×107～约1×1015CFU、约1×107～约1×1014CFU、约1×107～约1×1013CFU、约1×107～约1×1012CFU、约1×107～约1×1011CFU，所述细菌剂量的单位可以是/g菌落形成单位(CFU)，即CFU/g。
可以通过任何合适的途径施用细菌。例如，本发明的特定粪杆菌属微生物可以以口服可消化的形式施用于动物(包括人)。在食品组合物或保健品的情况下，所述细菌可以简单地包含在常规食品或食品补充剂中。代表性的药物剂型包括胶囊剂、微胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、锭剂、丸剂、栓剂、混悬剂和糖浆剂。在另一种实施方式中，所述组合物是作为直肠栓剂或灌肠剂施用于动物(包括人类)直肠的形式。可以使用常规有机添加剂和无机添加剂，通过常规方法制备合适的制剂。药物组合物中活性成分的量可以在达到所需治疗效果的水平。
可以将本发明的组合物封装以用于在肠道中运输粪杆菌属微生物。封装保护所述组合物直到它被运输到目标位点，例如，通过化学或物理刺激，例如可以由压力、酶活性或pH的变化引起的物理破坏来破裂。可以使用任何合适的封装方法。示例性封装技术包括在多孔基质中的捕获、固体载体表面的附着或粘附、交联剂的聚集或自凝集以及在微孔膜或微胶囊之后的机械封闭。
根据本发明的用于预防、改善或治疗炎性疾病(例如，炎性胃肠道疾病)的药物组合物包含选自由以下所组成的组中的至少一种：粪杆菌属微生物的微生物细胞；微生物的培养物；微生物的裂解物；以及选自由作为活性成分的微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物，并且可以包含可接受的载体、稀释剂或赋形剂。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知的。
本发明的药物组合物的剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、给药类型、健康状况和疾病程度而变化，并且可以根据医生或药剂师的判断，按一定的时间间隔每天一次至数次分剂量施用。例如，基于活性成分的含量，每日剂量可以为0.1mg/kg～500mg/kg，优选0.5mg/kg～300mg/kg。以上剂量为平均情况的实例，根据个体差异剂量可以更高或更低。
本发明的组合物可以是益生菌，并且益生菌可以与至少一种合适的益生元化合物混合。益生元化合物通常是不易消化的碳水化合物，例如低聚糖或多糖或糖醇，其在上消化道中不被降解或吸收。已知的益生元包含市售产品，例如菊粉和低聚反式半乳糖。合生元代表以协同形式结合益生菌和益生元的营养补充剂。
本发明的实施方式涉及一种用于预防或改善炎性肠病的食品组合物，例如用于预防或改善炎性肠病的食品组合物或抗癌功能性食品组合物，所述食品组合物包含选自由以下所组成的组中的至少一种：粪杆菌属微生物的微生物细胞；所述微生物的培养物；所述微生物的裂解物；以及选自由微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物。
旨在包括常规意义上的所有食品、食品添加剂、保健功能食品、饮料和饮料添加剂等。本文中，所述饮料是指用于解渴或享受味觉的饮品的总称，旨在包括功能性饮料。所述饮料可以是液体、糖浆和/或凝胶形式。
作为食品组合物中包含的活性成分，粪杆菌属微生物的含量没有特别限制，适当地根据食物的类型、所需用途等，并且例如，选自由粪杆菌属微生物的微生物细胞、所述微生物的培养物、所述微生物的裂解物和所述微生物的提取物所组成的组中的至少一种，其作为食品总量的活性成分，可以加入的量为0.00001重量％～100重量％、0.001重量％～99.9重量％、0.1重量％～99重量％，更优选地，1重量％～50重量％、0.01重量％～15重量％。例如，基于100ml，食品组合物可以以0.02g～10g的比例添加，优选0.3g～1g。
可以配制本发明的组合物。例如，除了本发明作为营养补充剂的治疗效果之外，食品还可以提供营养益处。
在此，术语“风险预测”或“发生可能性预测”是指确定受试者是否具有患上特定疾病的可能性，临床上可用于对特定疾病有高发生风险的患者通过特殊和适当的管理来延缓或预防发生，或通过选择最合适的治疗方法来决定治疗。此外，“诊断”是指确认病理状态的存在或特征，并且为了本发明的目的，诊断可以指确认疾病的发生。
“受试者”是指用于预测炎性肠病的发生风险或癌症的诊断、预测或评估对粪杆菌属微生物的治疗响应、或具有施用微生物的可能性的受试者，或者需要接受微生物的给药并监测微生物的功效的受试者，例如，他可以是怀疑有炎性肠病发生风险的受试者，接受炎性肠病诊断的受试者，或接受抗炎性肠病治疗的受试者。受试者优选是人类。
在本说明书中，受试者的生物样品可以包含从受试者分离的细胞提取物、任何器官、组织、细胞、唾液或粪便等，例如从患有炎性肠病或怀疑患有炎性肠病的哺乳动物分离的样品。例如，样品可以包括但不限于来自胃肠道(例如，来自活组织检查或尸检)的任何部分(包括但不限于结肠、胃、粪便、肛门、直肠和十二指肠)的细胞或组织，从患者(人或动物)、实验受试者或实验动物获得的胃的细胞裂解物，或受试者的排泄物。优选地，样品可以是粪便。
在本发明的实施方式中，检测抑癌粪杆菌包括确认样品中微生物的存在或不存在、识别微生物、测量微生物的水平和分析相对占有率。具体地，抑癌粪杆菌的检测或受试者的样品中微生物水平的测量可以包括使用核酸序列、氨基酸序列、代谢物或微生物本身作为抑癌粪杆菌特异性的生物标志物进行，或通过获得全基因组的序列信息或样品中存在的微生物群落中的至少一种特定基因来评价微生物的水平。
具体来说，使用PacBio测序文库试剂盒构建测序文库后，可以使用PacBio RS II平台进行全基因组测序，使用我们的基因组数据分析平台BIOiPLUG的全基因组分析流水线(Whole Genome analysis pipeline)来分析基因组测序信息，并且作为结果，抑癌粪杆菌菌株CLCC1的全基因组大小为约2.9Mbp，蛋白质编码区(CDS)的数量为2695个，以及抑癌粪杆菌特异性区域，例如CDS区或内含子(Intron)区等，被选择并用作生物标志物。
例如，可以通过计算在属或种水平上区分的微生物相对于受试者的肠道微生物群落和这些微生物中的抑癌粪杆菌的相对丰度，并测量抑癌粪杆菌的水平来进行微生物的检测。
微生物水平的测量可以是由受试者样品(例如肠活组织检查或粪便样品)测量抑癌粪杆菌菌株的比率。测定菌株的比率的方法可以由本领域技术人员根据本领域的技术常识适当地选择和使用，例如，可以使用选自由定量聚合酶链式反应(qPCR)、大规模平行测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA所组成的组中的分子方法来进行，但不限于此。
例如，当受试者的微生物水平低于参考受试者的微生物水平时，通过测量受试者样品中抑癌粪杆菌微生物的水平，并将其与参考受试者中的微生物的水平进行比较，可以确定受试者处于发展肠病的风险中。
所述方法可以进一步包括当受试者的微生物水平低于参考对象的微生物水平时，通过测量受试者样品中的抑癌粪杆菌微生物水平，并将该微生物水平与参考受试者的微生物水平进行比较，确定受试者处于发展肠病的风险中。
通过使用根据本发明的人类来源样品的宏基因组分析来提前预测发展癌症的风险，可以早期诊断和预测癌症的风险组，并且通过适当的管理可以延迟发病时间或者可以预防发作，甚至在发作之后，也可以降低发病率，并提高治疗效果。此外，通过对诊断患有癌症的患者进行宏基因组分析，避免暴露于致病因素，可以改善癌症的进程，或者可以预防复发。
用于检测来自受试者的样品中的抑癌粪杆菌或测量微生物水平的方法，将在下文更详细地描述。
作为本发明的实施方式，可以提供一种使用特定基因(例如16S rRNA基因序列)检测微生物或测量水平的方法。
具体地，微生物的水平可以优选通过确定样品中特定核酸序列的水平来测定，所述核酸序列可以优选为上述一种或多种细菌的16S rRNA基因序列，更优选地，16S rRNA基因序列的区域，例如16S rRNA基因序列的可变区V1和/或V6中的至少一个。
因此，微生物的检测可以通过获得相对于受试者的肠道微生物群落，在物种水平上区分的微生物物种和这些微生物物种中抑癌粪杆菌的相对丰度来进行，并测量抑癌粪杆菌的相对水平。可以包含从所述肠道微生物的基因组信息中获得16S rRNA遗传信息；和分析肠道微生物的16S rRNA信息，并且获得受试者的肠道微生物群落中所包含的微生物物种的丰度。
受试者的基因组信息可以是存储在存储介质中的遗传信息，或从受试者的样品中分离出的微生物的基因组信息。获得16S rRNA遗传信息，可以是使用新一代基因组测序(NGS)平台对提取的DNA进行16S rRNA基因序列分析。
分析提取的DNA的16S rRNA基因序列可以包括使用能够特异性扩增16SrRNA可变区域的引物组进行PCR，优选地，使用能够特异性扩增16S rRNA的V3至V4区域的引物组进行PCR，更具体地，使用具有以下序列的通用引物进行PCR以生产扩增子。
通过分析肠道微生物的16S rRNA信息，可以分析获得相对于受试者的肠道微生物群落在物种水平上区分的微生物物种的肠道微生物群落信息以及这些微生物物种的丰度。
分析微生物群落可以包括使用16S rRNA数据库在属或种水平鉴定和分类微生物和/或分析每个微生物群落种群。用于微生物的鉴定和分类的数据库可以必要时由本领域技术人员适当地选择和使用，例如，它可以是选自由Ezbiocloud、SILVA、RDP和Greengene所组成的组中的至少一个数据库，但不限于此。
微生物群落种群可以表示为特定微生物群落在总肠道微生物菌群中所占的比率(％)。微生物群落所占的比率(％)可以表示为特定微生物的16S rRNA读长数量占测序读长总数的频率的百分比。具体微生物为本发明提供的抑癌粪杆菌。
当通过进行微生物群落分析知道存在哪种微生物时，通过使用扩增子测序方法可以减少分析的成本和时间，所述扩增子测序方法仅选择性地扩增用于物种鉴定的标记基因，然后分析扩增产物的核苷酸序列，分析所需的成本和时间可以减少。对于细菌群落分析，所述16S rRNA基因用作标记基因，并且该基因存在于所有细菌中，适当包含保守区和突变区(v1-v9)，所以所述基因适用于系统发育分析和生态学研究。
作为本发明的额外实施方式，提供了一种使用对抑癌粪杆菌特异性的生物标志物用于检测微生物或测量水平的方法。
在本发明中，作为抑癌粪杆菌特异性生物标志物，该生物标志物可以包括核酸序列、氨基酸序列和代谢物。因此，作为能够检测本发明的生物标志物的试剂，可以使用引物、探针、反义寡核苷酸、适体和抗体等，可以特异性地检测特异性地存在于样品中相应微生物中有机生物分子例如蛋白质、核酸、脂质、糖脂、糖蛋白或糖(单糖、双糖、寡糖等)。
作为实施方式，在本发明中，能够检测微生物的试剂可以是能够检测相应微生物的探针，或者是用于扩增该探针的引物。优选地，引物特异性地检测相应微生物的特异性探针基因，而不与另一种微生物的基因组序列特异性结合。
本发明的一种具体实施方式涉及检测抑癌粪杆菌的探针、引物组、试剂盒、组合物和方法，通过区别于其他微生物种或亚种能够特异性检测抑癌粪杆菌，并灵敏地检测样品中少量存在的抑癌粪杆菌。用于检测抑癌粪杆菌的探针的实例可以是位点特异性DNA-甲基转移酶(dam)，但不限于此。此外，所述探针可以与检测标记连接。检测标记可以是可以通过本领域已知的任何方法检测的任何化学部分。本发明的引物还可以使用能够直接或间接提供可检测信号的标记来修饰。标记的实例包含放射性同位素、荧光分子、生物素等。作为使用引物来扩增序列的方法，可以使用本领域已知的各种方法。
在本发明的实施方式中，所述分析可以进行选自由凝胶电泳、毛细管电泳、测序、DNA芯片、放射性测量、荧光测量和磷光测量所组成的组中的至少一种方法。
有益效果
本发明涉及一种包含粪杆菌属微生物的用于诊断或治疗炎性疾病(例如，炎性胃肠道疾病)的组合物。
附图说明
图1a是显示在强化梭菌培养基(RCM)中培养抑癌粪杆菌CLCC1 3天后形成的菌落形式的照片，以及在液体培养过程中的指数生长期用光学显微镜观察的细胞外观照片。
图1b是在抑癌粪杆菌CLCC1的液体培养过程中的指数生长期拍摄的细胞的扫描电镜照片。
图2a是显示通过抑癌粪杆菌CLCC1的16S rRNA分析获得的系统发育位置图。
图2b是显示使用存在于抑癌粪杆菌CLCC1基因组中的92个核心基因的系统发育位置图。
图2c是基于平均核苷酸同一性(ANI)值的抑癌粪杆菌菌株CLCC1和近缘物种的关系图。
图2d是比较抑癌粪杆菌CLCC1和近缘物种的ANI值的表格。
图3a是显示抑癌粪杆菌菌株CLCC1的脂肪酸组成的气相色谱分析结果的图。
图3b是显示普拉梭菌菌株的脂肪酸组成的气相色谱分析结果的图。
图3c是显示比较抑癌粪杆菌菌株CLCC1的极性脂质而进行的二维色谱分析的结果的照片。
图3d是显示比较普拉梭菌菌株的极性脂质而进行的二维色谱分析的结果的照片。
图3e是对抑癌粪杆菌CLCC进行短链脂肪酸分析的GC-MS分析的图。
图3f是对普拉梭菌进行短链脂肪酸分析的GC-MS分析的图。
图4a至图4c是诱导肝癌后肿瘤体积随时间变化的图，以测量在根据实施例3-1的诱导肝癌的小鼠中抑癌粪杆菌CLCC1对癌症发生的抑制作用。图4a是显示每个有胶的受试者的点状图，图4b是比较实验组和对照组的平均值的图，图4c是分别显示每个受试者的肿瘤体积变化的多边形图。
图5a至图5c为根据实施例3-2的肝移植模型中抑癌粪杆菌CLCC1对癌症发生的抑癌作用的试验结果及各结果的点状图和多边形图。图5a表示直接比较肿瘤大小的结果，图5b表示用倍数表示肿瘤大小变化的结果，和5c表示δ值。
图6a显示根据实施例4-1在皮下移植了人类结直肠癌细胞系的小鼠中，肿瘤体积根据抑癌粪杆菌菌株CLCC1的剂量的变化，图6b显示肿瘤重量的变化，以及图6c是视觉观察肿瘤大小变化的结果。
图6d为根据实施例4-1在皮下移植了人类结直肠癌细胞系的小鼠中，抑癌粪杆菌菌株CLCC1的给药时间结束后，分离和视觉观察阴性对照组(G1)和各实验组(G2～G4)中肿瘤组织的结果。
图6e是根据在皮下移植了人类结直肠癌细胞系的小鼠的肿瘤组织中抑癌粪杆菌菌株CLCC1的施用，进行H&E染色来确认细胞坏死的结果。
图6f是根据在皮下移植了人类结直肠癌细胞系的小鼠的肿瘤组织中抑癌粪杆菌菌株CLCC1的施用，进行TUNEL染色来确认细胞凋亡的结果。
图7是根据在皮下移植了小鼠结直肠癌细胞系的小鼠的肿瘤组织中抑癌粪杆菌菌株CLCC1的施用，观察肿瘤大小的变化的结果。
图8是显示根据实施例5使用具有急性DSS-结肠炎动物模型，再结肠炎预防和治疗作用的实验中动物模型的体重变化的图。
图9显示了根据实施例5使用具有急性DSS-结肠炎动物模型，在结肠炎预防和治疗作用的实验中测量DAI(疾病活动指数)的结果。
图10显示了根据实施例5使用具有急性DSS-结肠炎动物模型，在完成结肠炎预防和治疗作用的实验后提取的大肠长度。
图11a至图11c是根据实施例5使用具有急性DSS-结肠炎的动物模型，在结肠炎预防和治疗作用的实验中，测量细胞因子表达水平的结果。
图12是显示根据实施例5使用具有急性DSS-结肠炎的动物模型，在完成结肠炎预防和治疗作用的实验后，提取的大肠组织的病理检查结果的照片。
图13显示了根据实施例7通过ELISA分析的HT-29细胞中的抑癌粪杆菌对人类IL-8的影响。
图14显示了根据实施例7通过ELISA分析的RAW 264.7细胞中的抑癌粪杆菌对小鼠IL-6的影响。
图15显示了根据实施例7通过ELISA分析的RAW 264.7细胞中的抑癌粪杆菌对小鼠TNF-α的影响。
图16显示了根据实施例8分析的HPBMC中抑癌粪杆菌对人类IL-10的影响。
图17显示了根据实施例8分析的HPBMC中抑癌粪杆菌对人类IL-6的影响。
图18是显示根据本发明的一种实施方式的正常对照组、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病患者的肠道微生物样品中抑癌粪杆菌的相对丰度的图。
具体实施方式
将通过下文说明性的实施例更详细地描述本发明，但并不意味着本发明的范围受下文实施例的限制。
实施例1.微生物的分离与鉴定
1-1：微生物的分离
将20多岁健康成年男性的粪便稀释和涂布在强化梭菌介质(RCM)培养基中，然后在厌氧条件下、于37℃的室温下进行培养，来分离抑癌粪杆菌菌株CLCC1。
具体而言，在RCM琼脂培养基中培养3天时，抑癌粪杆菌CLCC1具有最大形成2mm～3mm的菌落，当在光学显微镜下观察时显示长杆状细胞形状的特征。图1a显示了使用光学显微镜观察菌落形成和细胞形状的结果，和图1b显示了用扫描电子显微镜拍摄细胞形状的照片。
1-2：使用16S rRNA分析的系统发育分析
通过实施例1的方法分离的抑癌粪杆菌菌株CLCC1在室温37℃、厌氧培养条件下在RCM液体培养基中培养1天，然后进行离心以获得微生物。使用土壤DNA快速提取试剂盒(MP生物医疗公司)(FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals))，从获得的微生物中分离出总基因组。
使用PacBio测序文库试剂盒生产测序文库后，使用PacBio RS II平台进行全基因组测序，并使用我们的基因组数据分析平台BIOiPLUG的全基因组分析流水线来分析基因组测序信息。
在下表1中，显示了抑癌粪杆菌菌株CLCC1的基因组特征。结果表明，抑癌粪杆菌菌株CLCC1的总基因组大小约为2.9Mbp，蛋白质编码区(CDS)的数量为2695个，并且GC比率(％)为56.1％。显示了，总rRNA基因为21个，总tRNA基因为69个。
通过分析由该方法测序的抑癌粪杆菌菌株CLCC1的rRNA进行系统发育分析。抑癌粪杆菌菌株CLCC1的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
具体地，利用EzBioCloud数据库的原核生物流水线的基于16S的鉴定进行16SrRNA的相似性分析，并使用MEGA程序进行系统发育分析。图2a中，显示了通过分析16S rRNA基因核苷酸序列分离的抑癌粪杆菌菌株CLCC1的系统发育位置。
1-3：使用核心基因的系统发育分析
使用通过实施例2-1的方法获得的基因组序列数据，通过在基因序列之间的分析来进行系统发育分析。具体地，使用可以用作细菌分类学标记物的92个基因(最新细菌核心基因(UBCG))的相似性进行系统发育分析。所述92个基因是指由UBCG(最新细菌核心基因)流水线提供的基因(Na,S.I.,Kim,Y.O.,Yoon,S.H.,Ha,S.M.,Baek,I.和Chun,J.(2018))。在图2b中，显示了通过分析92个核心基因获得的近缘物种的系统发育位置图。
1-4：使用平均核苷酸同一性(ANI)进行关系分析
使用通过实施例1-2的方法获得的基因组分析数据，通过比较抑癌粪杆菌菌株CLCC1和近缘物种的ANI值来分析关系。
具体而言，使用Chunlab提供的分析平台，原核生物(TrueBAC ID)流水线的基于基因组的鉴定，通过比较抑癌粪杆菌菌株CLCC1和近缘物种的全基因组序列，来分析基因组相似性的值。
在图2c中，显示了基于ANI值的抑癌粪杆菌菌株CLCC1和近缘物种的关系图。在图2d中，显示了抑癌粪杆菌菌株CLCC1和近缘物种的ANI值的比较表。各行各列中，1表示抑癌粪杆菌菌株CLCC1，2表示普拉梭菌ATCC 27768(T)，3表示马西里福尔涅氏菌(Fournierellamassiliensis)AT2(T)，4表示产丁酸肠单胞菌(Intestinimonas butyriciproducens)DSM26588(T)，5表示马西里肠单胞菌(Intestinimonas massiliensis)GD2(T)，6表示毛藓假黄酮分枝杆菌(Pseudoflavonifractor capillosus)ATCC 29799(T)，7表示产乳酸俄罗斯小杆菌(Ruthenibacterium lactatiformans)585-1(T)，8表示可变罕见小球菌(Subdoligranulum variabile)DSM 15176(T)，9表示甲酸芽殖菌(Gemmiger formicilis)ATCC 27749(T)。(T)在每个特定名称之后表示一种菌株类型。
对抑癌粪杆菌菌株CLCC1的基因组进行解码并与近缘物种比较的结果表明，CLCC1菌株在基因组水平上与总基因组水平中最接近的近缘物种普拉梭菌的平均核苷酸同一性(ANI)值为85.99％，并且可以发现CLCC1菌株是新物种，常规上未被分离和报道。将通过上述方法鉴定的粪杆菌属菌株命名为抑癌粪杆菌CLCC1。
实施例2.微生物的理化特性分析
2-1：脂肪酸含量分析
为了分析抑癌粪杆菌菌株CLCC1的分子生物学特性，比较了抑癌粪杆菌菌株CLCC1和普拉梭菌的脂肪酸组成。
具体地，将抑癌粪杆菌菌株CLCC1菌株和粪杆菌菌株分别在RCM培养基中于37℃的温度下、厌氧条件下培养，然后使用40mg微生物细胞，根据米勒的方法(Miller,L.T.(1982)J.Clin.Microbiol.18,861-867)获得脂肪酸。
提取的脂肪酸的分析中，使用安捷伦科技(Agilent technologies)6890气相色谱仪，使用A30m×0.320mm×0.25μm交联甲基硅氧烷柱(HP-1)作为分离柱。在图3a中，显示了比较抑癌粪杆菌菌株CLCC1和普拉梭菌菌株(ATCC 27768)的脂肪酸组成的气相色谱分析结果的图。在图3a的图中，图中各个峰所指的脂肪酸名称及其数值(％，w/v)如下表1所示。
表1
如表1所示，15:1ω8c脂肪酸、19:0cycloω10c/19ω6脂肪酸、20:1ω9c脂肪酸、14:0 3OH/16:1iso I脂肪酸、15:0 3OH脂肪酸、16:0iso脂肪酸和16:0iso3OH脂肪酸仅在CLCC1菌株中检测到，而17:0iso 3OH脂肪酸仅在普拉梭菌ATCC 27768中检测到。
作为分子生物学特性的比较分析的结果，可以确认抑癌粪杆菌菌株CLCC1与包含在粪杆菌属微生物中的已知物种普拉梭菌是不同的物种。在比较两种微生物的脂肪酸组成时，可以发现两种微生物之间的主要脂肪酸组成存在差异，相应的结果如图3a和表2所示。
2-2：极性脂质的分析
为了比较极性脂质的组成，进行了薄层色谱(TLC)分析。
具体地，通过Minikin的方法(Minikin,D.E.等人(1984).J Microbial Meth2,233-241.)从50mg的微生物冻干样品中提取极性脂质。此外，在具有氯仿、甲醇和水的比例为65:25:3.8(v/v)(氯仿:甲醇:水＝65:25:3.8(v/v))的溶剂中进行一次显影。然后，在具有氯仿、甲醇、乙酸和水的比例为40:7.5:6:1.8(v/v)(氯仿:甲醇:乙酸:水＝40:7.5:6:1.8(v/v))的溶剂中进行二次显影。二次显影后，用5％(w/v)乙醇钼磷酸染色。
此外，比较极性脂质的组成时，证实了抑癌粪杆菌菌株CLCC1和普拉梭菌具有一种磷脂酰甘油(PG)、两种未知的未鉴定磷脂(PL1、PL2)和多种未鉴定脂质(L)。此外，确认了菌株CLCC1还具有普拉梭菌中不存在的未鉴定磷脂(PL3)，并且相应的结果显示在图3b中。从结果可以确认，可以发现根据本发明的抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌的极性脂质生产模式是不同的。
2-3：短链脂肪酸(SCFA)分析
为检验普拉梭菌和抑癌粪杆菌CLCC1微生物的短链脂肪酸生产模式的差异，通过向韩国生物医学科学研究所(Korea Research Institute of Bio medical Science)请求分析，进行了短链脂肪酸分布的分析。
具体地，将普拉梭菌和本发明的抑癌粪杆菌菌株CLCC1在RCM培养基中培养16小时后，通过离心(4℃、4,000rpm、10min)沉淀细胞，来收集上清液。收集的上清液经0.22um过滤器过滤后冷藏。使用Takeshi Furuhashi(Takeshi Furuhashi等人,AnalyticalBiochemistry,Volume 543,2018,51-54页)的方法从上清液中制备用于SCFA分析的GC-MS样品，安捷伦的6890系列仪器用于使用GC-MS进行短链脂肪酸分析。
作为对存在抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌(粪杆菌属微生物的其他已知物种)的培养上清液中的短链脂肪酸(SCFA)比较分析的结果，在两个样品中，作为SCFA，只检测到丁酸(butanoic acid)。此外，与普拉梭菌样品相比，在抑癌粪杆菌CLCC1样品中检测到的丁酸(butanoic acid)含量是普拉梭菌样品的7.8倍。在图3c至图3d中，代表了GC-MS分析的图。
此外，当观察每个样品中丁酸的比例时，抑癌粪杆菌CLCC1的培养上清液的91.64％是丁酸，而普拉梭菌的培养上清液中的76.40％是丁酸。抑癌粪杆菌菌株CLCC1的短链脂肪酸分析的结果如表2所示，普拉梭菌的短链脂肪酸分析的结果如表3所示。下表2～表3表示的其他物质是在物质库数据库中检测到的，但由于他们的匹配率(质量)很低，被归类为无法准确识别物质的噪声信号。在下表2和表3中，RT表示保留时间。
表2
表3
可以预测，与普拉梭菌相比，由于在短链脂肪酸中丁酸的产量更高，本发明的抑癌粪杆菌菌株CLCC1表现出优异的抗癌活性。
实施例3.对于肝癌的功效评价
3-1：皮下肿瘤模型中癌症发生的抑制功效的测试
为了确认抑癌粪杆菌菌株CLCC1的癌症发生抑制能力，使用小鼠肝癌细胞系在皮下肿瘤模型中测试了癌症发生的抑制作用。在10只6周龄的雄性C57BL/6小鼠中，通过肝癌细胞系(HEP55.1C)的皮下肿瘤移植实验，引起肝癌，在肝癌发生55天的过程中，检查了抑癌粪杆菌菌株CLCC1的口服给药对肝癌细胞生长的作用。肝癌细胞系Hep55.1c是小鼠衍生的肝细胞癌(肝癌)。
具体而言，在将小鼠肝癌细胞系移植到小鼠皮下组织中的4天之前，口服施用了抑癌粪杆菌CLCC1。在口服给药后的第4天，将小鼠肝癌细胞系(Hep55.1c)移植到右侧皮下组织中，以产生2.0×106个细胞。
对于使用小鼠肝癌细胞系的皮下肿瘤模型，抑癌粪杆菌菌株CLCC1口服施用每天一次，每周5次，持续55天。然后，从移植当天(第0天)到第55天，以7天的间隔使用磁共振(MR)成像测量肝癌肿瘤的大小(肿瘤体积)。
在RCM培养基中培养抑癌粪杆菌菌株CLCC1，然后使用PBS缓冲液和甘油浓缩并冷冻储存至最终甘油浓度为15％(v/v)。另外，在对小鼠给药之前立即解冻后，每只动物200μl(2×108个细胞)口服施用。作为对照组，使用10只未施用菌株CLCC1的小鼠。对于对照组，口服施用不含菌株的PBS和甘油(15％，v/v)溶液各200μl。
在下表4和表5中，显示了在皮下肿瘤模型中分离菌株对肝癌发生的抑制功效的测试中，对照组的肿瘤大小和测试组的肿瘤大小的结果。表5是对照组的肿瘤体积变化的结果，表6是施用抑癌粪杆菌菌株CLCC1的实验组的肿瘤大小(体积)变化的结果。在表中，S.D表示标准偏差。
表4
表5
在图4中，在小鼠诱导癌症后，根据时间变化的肿瘤体积如图所示，并且在表5至表6中，肿瘤体积的变化显示为数值。
作为实验结果，确认与对照组相比，在口服施用CLCC1的实验组中肝癌的发生和进展在统计学上显著被抑制。与对照组相比，在口服施用CLCC1的实验组中肿瘤体积平均减少约19.5％～75.3％，平均减少32.9％，因此确认在施用抑癌粪杆菌菌株CLCC1的实验组中，延迟肝癌发生，并且肿瘤生长进度被抑制。在第4天(手术后测量肿瘤大小的第一天)，与对照组相比，在施用抑癌粪杆菌菌株CLCC1的实验组中肿瘤大小是确定很小，可以确认癌症发生的抑制作用。因此，可以发现口服施用菌株CLCC1具有抑制肝癌的发生和进展的活性。
3-2：肝移植模型中癌症发生抑制功效的测试
为了检查抑癌粪杆菌菌株CLCC1对肝癌细胞生长的作用，在4只8周龄的雄性C57BL/6小鼠中，通过肝癌细胞系的肝脏移植实验，引起肝癌，在肝癌发生39天的过程中，检查了抑癌粪杆菌菌株CLCC1的口服给药对肝癌细胞生长的作用。
具体而言，作为肝癌细胞系，使用Hep55.1c，并将8周龄雄性C57BL/6小鼠的上腹部打开，将肝癌细胞系移植到肝脏左叶中，为5.0×105个细胞。在将肿瘤细胞系移植到肝脏后4天的恢复期后，通过MRI扫描确认了肿瘤的大小，并选择了其中肿瘤形成良好的4只小鼠，用于随后的实验。
从移植当天(第0天)开始的39天，菌株CLCC1通过与实施例4相同的方法制备，并口服施用于完成移植手术的4只小鼠，并且菌株CLCC1未施用于4只对照小鼠。对于对照组，口服施用不含菌株的PBS和甘油(15％，v/v)溶液各200μl。此后，定期测量肿瘤的大小和相对大小及生长相对值。
通过7天间隔的磁共振(MR)成像来测量肿瘤大小，并通过计算对于移植当天肿瘤大小的相对大小来绘制肿瘤大小的相对值。在图5a到图5c中，显示了菌株CLCC1在肝移植模型中癌症发生的抑制作用的试验结果和图。
图5a是直接比较肿瘤大小的点状图和多边形图，图5b是表示肿瘤大小按倍数变化的点状图和多边形图，图5c是表示肿瘤大小的变化量(测量当天的肿瘤大小与在先前测量当天的肿瘤大小之间的差异)的点状图和多边形图。
作为结果，确认与未施用分离细胞系的对照组相比，在口服施用CLCC1的实验组中，肝癌的发生和进展在统计学上显著被抑制。抑制肝癌发生的结果和肿瘤大小变化的数据显示在图5a至5c中。
肿瘤大小的相对数据表(相对生长；倍数)在表6中显示，肿瘤生长的相对数据表(相对生长；δ)在表7中显示。
表6
表7
如表6和表7以及图5a至5b中可以确认的那样，可以确认与对照组相比，口服施用菌株CLCC1的小鼠的肿瘤生长被显著抑制。因此，可以确认抑癌粪杆菌菌株CLCC1具有优异的肿瘤生长抑制能力。
实施例4.对于结直肠癌的功效评价
4-1.皮下肿瘤模型中癌症的抗癌确认
为了确认抑癌粪杆菌菌株CLCC1的癌症发生的抑制能力，使用人类结直肠癌细胞系在皮下肿瘤模型中测试了癌症发生的抑制功效。作为结直肠癌细胞系，使用HCT-116细胞，并且作为小鼠，使用裸鼠(CANN.Cg-Foxn1nu/CrlOri，SPF)。HCT-116是对应于人类来源的结直肠癌的癌细胞系。
具体而言，将结直肠癌细胞系HCT-116(2.5×107个细胞/mL)施用于经过1周纯化期的小鼠，通过使用一次性注射器向小鼠右背部皮下注射0.2mL/头进行移植。当癌细胞移植后癌细胞大小增长到约85mm3～119mm3时，每组10只小鼠分为未施用CLCC1的阴性对照组和按浓度施用菌株CLCC1的3个实验组。具体地，实验组根据菌株CLCC1的浓度分为低、中、高3组，并且抑癌粪杆菌菌株CLCC1施用的浓度为：低浓度为2×106个细胞/头、中浓度为2×107个细胞/头、高浓度为2×108个细胞/头。菌株的给药是每天一次用注射器口服给药，持续36天。对于阴性对照组，仅施用赋形剂(包含甘油15％(v/v)的PBS溶液)。在下表8中，显示了阴性对照组的信息和各实验组的信息。
表8
(1)肿瘤大小变化及生长抑制率
为了确认抑癌粪杆菌菌株CLCC1的抗结直肠癌作用，确认了肿瘤大小的变化。具体地，开始菌株给药的试验后，每天一次观察全身症状例如外观、行为、排泄等，每周测量一次体重，并且测量肿瘤大小，每周计算两次体积。在图6c和6d中，显示了视觉观察肿瘤大小的结果。
通过分别测量肿瘤的垂直宽度(W)和最大长度(L)，通过下文等式3的方法计算肿瘤体积(Tv)。
[等式3]
Tv(mm3)＝L(mm)×W2(mm2)×1/2
确认贯穿36天的肿瘤体积变化的结果在下文表9和图6a中显示。证实，与阴性对照组(G1)相比，在所有施用菌株CLCC1的实验组中，肿瘤大小在统计学上显著减小。在下表9中，平均值指平均体积，S.D.表示标准偏差。
表9
*p<0.05，通过Dunnett-t检验，与阴性对照组(G1))有显著差异。
**p<0.01，通过Dunnett-t检验，与阴性对照组(G1))有显著差异。
具体而言，开始施用微生物的当天(第1天)的平均肿瘤大小在所有4组中均为105mm3，但在第36天时，阴性对照组中的平均肿瘤体积显示为4330mm3，另一方面，在施用菌株CLCC1的所有实验组中显示出3000mm3以下的体积，因此，确认与对照组相比，具有约60％～67％的肿瘤体积，由此，证实了抑癌粪杆菌对结直肠癌生长的抑制作用。
此外，基于重量测量的结果，在每个实验组中通过以下等式1的方法来计算肿瘤生长抑制率(IR)。
[等式1]
IR(％)＝(1-(T1/C1))×100
在等式1中，T为各实验组的平均肿瘤体积，C为阴性对照组的平均肿瘤重量。
在下表10和图6b中，显示了各组在菌株给药实验结束后测量肿瘤重量的结果，下表11中，显示了根据实验的进展测量各组小鼠的平均体重的结果。
表10
**p<0.01，通过Dunnett-t检验，与阴性对照组(G1)有显著差异
表11
阴性对照组(G1)中，尸检后取出的肿瘤重量为约3.21g，而在实验组中低、中和高浓度分别显示为1.94g、2.17g和1.95g，因此，肿瘤组织的重量显示出显著地降低。另一方面，各组中的总体重在对照组和实验组之间没有显示出显著的差异。
在低浓度实验组中肿瘤生长抑制率为39.6％，在中浓度实验组中肿瘤生长抑制率为32.4％，并且在高浓度实验组中肿瘤生长抑制率为39.3％，因此，确认在所有实验组中肿瘤生长被抑制30％或更多。
(2)肿瘤细胞的坏死和凋亡
在完成菌株CLCC1给药36天后进行尸检，进行H&E染色(苏木精和伊红染色法)以观察肿瘤组织中肿瘤细胞的坏死并且进行TUNEL测定以观察细胞凋亡。
在图6e中，显示了用于分析肿瘤细胞坏死的H&E染色结果的照片。肿瘤细胞坏死程度在阴性对照组与实验组之间未观察到明显差异。因此，可以发现本申请的抑癌粪杆菌细胞系不通过肿瘤坏死诱导炎症反应。
在图6f中，显示了用于分析肿瘤细胞凋亡的TUNEL染色分析结果的照片。证实与阴性对照组相比，粪杆菌属施用组中肿瘤细胞的凋亡在统计学上显著增加。因此，证实了每个粪杆菌属施用组中肿瘤体积的减小不是由肿瘤坏死引起的，而是由肿瘤细胞凋亡引起的，并且不诱导炎症反应。
在下表12中，显示了比较肿瘤细胞的坏死和凋亡的结果。在下表中，根据细胞凋亡的程度，±代表最小，+代表轻度，++代表中度，+++代表显著，++++代表重度。在每个符号下方，指示对应于相应阶段的杀死细胞的数量。
表12
##p<0.01，通过Steel的t检验与阴性对照组(G1)有显著差异。
由表12可以确认，对照组(对照，G1)显示细胞凋亡率约为10.33％，在低浓度(G2)实验组中显示细胞凋亡率与对照组相近，但在中浓度(G3)和高浓度(G4)的实验组中观察到12.4％以上的细胞凋亡。因此，确认通过抑癌粪杆菌微生物的给药，增加了肿瘤细胞的凋亡。
4-2：使用结直肠癌皮下肿瘤模型评价功效
为证实CLCC1菌株给药期间对结直肠癌的抗癌作用，使用其中皮下移植结直肠癌细胞的小鼠，并在美国非临床委托检测机构Champion's oncology进行了试验。作为结直肠癌细胞，使用小鼠来源的结直肠癌细胞系MC38细胞，作为小鼠菌株，使用C57BL/6。MC38细胞是对应小鼠来源的结直肠癌的癌细胞系。试验组如下，每组包括10只小鼠。
具体来说，通过结直肠癌细胞系MC38细胞系的皮下肿瘤移植实验，在6周龄的雄性C57BL/6小鼠中引起结直肠癌，并检查了在结直肠癌发生过程中口服给药抑癌粪杆菌菌株CLCC1对结直肠癌细胞生长的影响。
通过与实施例4-1的对照组和实验组试验制剂的制备方法基本相同的方法，在RCM培养基中培养实施例1的抑癌粪杆菌菌株CLCC1，然后使用PBS缓冲液和甘油来浓缩并冷冻保存至最终甘油浓度为15％(v/v)。此外，在对小鼠给药之前立即解冻后，口服施用每只动物200μl(2×107个细胞/剂量)含量的低浓度活细胞(样品1对应于实施例8-1的G3)，和每只动物200μl(2×108个细胞/剂量)含量的高浓度活细胞(样品2对应于实施例8-1的G4)。作为对照组，使用10只未施用菌株CLCC1的小鼠。
通过将制备的样品2在烘箱中于100℃的温度下处理2小时，样品3用作高浓度死细胞(2×108个细胞/剂量)。
具体地，通过从接种癌细胞前2周开始给药，对照组和样品1至3的试验制剂每天施用一次，共持续40天。具体地，对照组和样品1～3的试验制剂每天口服施用一次，持续40天，并且从开始给药的日期起14天后，向左侧腹的皮下组织接种结直肠癌细胞(在0.1ml PBS中的5×105MC38细胞)，移植一周后，从第22天至第40天观察肿瘤大小，持续18天。第22天，肿瘤观察的开始日期被视为第0天，并使用磁共振(MR)成像测量结直肠癌肿瘤的大小(肿瘤体积)，持续18天。肿瘤大小的变化通过在癌细胞植入后22天，测量肿瘤的最大长度(L)和垂直宽度(W)，并将它们引入以下等式3来计算。18天测量的肿瘤体积显示在下表13和图7中。
[等式3]
Tv(mm3)＝L(mm)×W2(mm2)×1/2
[等式2]
肿瘤体积的相对减少率(％)＝(1-T2/C2))×100
在下表13中，平均值表示平均肿瘤体积，S.D.表示标准偏差。表13是移植有结直肠癌细胞系的皮下肿瘤模型中的肿瘤体积变化的结果，该皮下肿瘤模型中施用了根据对照组和样品1～3的分离菌株。
表13
结果，与对照组相比，在施用样品1至3的菌株的组中获得的肿瘤体积变化分别显示在图7中。基于最后一天的测量，通过将对照组的肿瘤体积设为100％，以百分比计算样品1～样品3的肿瘤体积的结果，样品1为89.9％(减少10.1％)，样品2为74.2％(减少25.8％)，样品3为75.9％(减少24.1)，因此，作为试验结果，证实与对照组相比，施用CLCC1的小鼠在结直肠癌模型中肿瘤生长在统计学上显著被抑制。
确认即使在施用CLCC1菌株的死细胞时，肿瘤生长也是在统计学上显著被抑制。此外，关于使用菌株CLCC1的活细胞但浓度不同的样品1和样品2的肿瘤体积的减少，证实在相同实验条件下抗癌活性以浓度依赖性方式增加。
此外，在施用试验制剂的当天后，以1天～3天的间隔，观察全身症状例如外观、体重、行为、排泄等。在试验制剂给药后该试验共进行40天，并在癌细胞移植后观察18天。实验动物测量的体重(Kg)如下表14所示。
表14
观察日期 对照组 样品1 样品2 样品3
1 20.60 20.79 20.60 21.17
4 20.03 20.62 21.31 21.64
7 20.24 20.47 21.42 21.55
8 20.26 20.41 21.22 21.52
11 20.05 20.44 21.06 21.22
13 20.42 20.44 21.17 21.28
15 20.54 20.77 21.13 21.38
18 20.50 20.93 21.27 21.09
对于实验动物的总体重，在癌细胞移植后，对应于对照组的小鼠的体重比试验组的小鼠体重有降低的趋势，但总体而言，对照组和试验组之间没有显著差异。
实施例5:急性DSS-结肠炎动物模型的预防功效的评价
5-1：模型动物准备和样品管理
雌性BALB/c小鼠(约6周龄)由供应商提供，并在适应期(约7天)后进行实验。适应期后，在试验物质给药的第3周连续7天，正常对照组提供正常阴性水，除正常对照组外的所有组均在饮水瓶中提供3％DSS，自由地提供水来诱发结肠炎。雌性BALB/c小鼠(6周龄)经过6天的适应期，每组6只小鼠(7周龄)用于本实验。试验动物共分6组进行，各组构成如下。
表15
将对照组设置为正常对照组(G1)、阴性对照组(G2)和阳性对照组(G3)。从试验开始时，G1和G2施用15％的甘油作为赋形剂，并且G3施用200mg/kg的柳氮磺胺吡啶(SASP)。试验物质给药组分为活细胞组(G4、G5)和死细胞组(G7)。从试验开始到结束，活细胞组(G4和G5)以及死细胞组(G7)每天施用一次CLCC1，持续24天，以确认CLCC1的预防作用。结肠炎是通过将3％ DSS放入饮水瓶中并在试验物质给药的第3周提供7天的自由饮水引起的。
在本实验中，测量了重量损失评价，疾病活动指数(DAI)和大肠长度，并进行了大肠组织的组织病理学检查。
5-2：重量损失评价
从给药开始到试验结束，体重每周测量两次，并且在每个给药日的给药前测量。基于3％ DSS供应之前测量的体重，体重的变化被计算为百分比，结果在图8中显示。
当提供DSS时，与供水前相比，6天后所有组(G2～G7)的体重开始降低，并且降低率趋于增加直到试验结束。体重损失是炎性肠病的重要并且潜在危险的副作用。与G2相比，在G4和G5组中，体重的减小率是统计学上显著降低的(*p<0.05和**p<0.01，独立t检验)。G7与G2显示没有差异。因此，确认CLCC1活细胞的给药改善因结肠炎引起的体重损失。
5-3：DAI(疾病活动指数)
DAI是从3％DSS给药的当天，根据体重、粪便一致性和粪便血液的存在来评分的，并表示为总和。具体而言，疾病活动指数是基于体重损失(例如，与基线相比，体重增加或维持在1％以内(评分0)；1.5％体重损失(评分1)；5％～10％的体重损失(评分2)；10％～15％体重损失(评分3)；>15％的体重损失(评分4))；粪便一致性(例如，正常(评分0)；松散粪便(评分2)；腹泻(评分4))；和出血(例如，没有出血(评分0)，中度出血(评分2)，严重出血(评分4))进行评分的。
评估结果在图9中显示。在G3～G6中，在DSS给药后DAI评分提高，但在试验结束时，与G2相比，显示评分较低。在试验结束时，G3、G4和G6的平均评分为7.0分以及6.7分，在统计学上显著低于G2(*p<0.05和**p<0.01，独立t检验)。在试验结束时G5的DAI评分平均为7.3分，低于G2，但没有统计学上的显著差异。试验结束时，G7的DAI评分平均为11.3分，显示与G2没有差异。
因此，确认与G2相比，由于CLCC1活细胞的给药，DAI评分在统计学上显著地降低，这意味着改善了例如体重、粪便状况以及粪便中血液的存在或不存在的症状。
5-4：大肠长度的测量
完成试验后，对动物进行麻醉，进行剖腹手术并流血致死，然后单独的提取大肠组织。拍摄提取的大肠，并测量其长度。测量的结果如图10所示。
用DSS诱导的结肠炎降低了大肠的长度。与G1相比，G2的大肠长度在统计学上显著降低(p<0.01，独立t检验)。活细胞给药组G4和G5的大肠长度减小，在统计学上显著地小于G2(*p<0.05，独立t检验)。这意味着与G2相比，活细胞给药组抑制了大肠萎缩，从而预防或改善大肠长度的减小。
因此，证实CLCC1活细胞的给药抑制了结肠萎缩，并改善了大肠长度的减小。
5-5：细胞因子分析
从大肠中提取RNA，并通过RT-qPCR分析IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达，。
将提取的大肠组织用PBS洗涤，然后存储在RNAlater中(批号：00833281，Invitrogen，马萨诸塞州，美国)。根据总RNA提取试剂盒(批号：157031929，Qiagen，德国)的手册，提取总RNA。通过使用核酸定量仪(IFNinite M200 pro，Tecan，奥地利)测量在260nm和280nm的吸光度来定量提取的总RNA。在以下条件下，使用实时PCR机(CFX384，BIO-RAD，CA,美国)进行TNF-α，IFN-γ和IL-6的RT-qPCR。
RT-qPCR混合物的组成在下表16中显示，RT-qPCR条件在下表17中显示。作为RT-qPCR的结果，使用2-ΔΔCT方法比较基因表达水平。
表16
名称 组成(μL)
iTaq通用SYBR绿色反应混合物(2x) 8.0
iScript逆转录酶 0.2
正向引物(3μmole) 1.0
反向引物(3μmole) 1.0
RNA(20ng/μL) 5.0
无水、RNase和DNase的PCR标准溶液 0.8
总量 16.0
表17
/>
测量的结果在图11a至图11c中显示。
当通过DSS诱导结肠炎时，炎性细胞因子(TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1和IL-23等)的表达增加，并且抗炎细胞因子(IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、TGF-β等)的表达降低。其中，在本实验中，测量IFN-γ、IL-6和TNF-α作为炎性细胞因子的表达水平。
在所有活细胞给药组(G4～G5)中，与阴性对照组(G2)相比，IFN-γ和IL-6的水平在统计学上显著地低。在CLCC1高浓度活细胞给药组(G5)中，TNF-α水平在统计学上显著低于G2(*p<0.05，独立t检验)。因此，证实CLCC1活细胞的给药降低了炎性细胞因子(例如IFN-γ、IL-6和TNF-α)的水平。
5-6：组织病理学检查
将提取的组织固定在10％中性福尔马林中。将提取并固定的大肠组织切成厚度为4μm～5μm的组织切片，切割并附着到载玻片上。H&E染色后，该组织用封片剂(FisherScientific，NJ，美国)密封，在显微镜下观察(CKX41，Olympus，日本)，并进行拍照。
在试验组G2的大肠粘膜中，失去隐窝结构，失去分泌粘液的杯状细胞，并发生透壁炎症。在组织中观察到大量的红细胞和白细胞。在G3～G5中，观察到维持的隐窝结构和减少的炎症。观察结果在图12中显示。因此，确认CLCC1活细胞的给药改善了受损的肠道组织病况。
实施例6:急性DSS-结肠炎动物模型的治疗功效的评价
6-1：模型动物准备和样品管理
雌性BALB/c小鼠(约6周龄)由供应商提供，并在适应期(约7天)后进行实验。适应期后，在试验物质给药的第3周连续7天，正常对照组提供正常阴性水，除正常对照组外的所有组均在饮水瓶中提供3％DSS，自由地提供水，以诱发结肠炎。雌性BALB/c小鼠(6周龄)经过6天的适应期，每组6只小鼠(7周龄)用于本实验。试验动物共分4组进行，各组构成如下。
表18
分别将对照组设置为正常对照组(G1)、阴性对照组(G2)和阳性对照组(G3)，并且处理组(试验物质给药组4)设置为活细胞组G6。从试验开始时，G1和G2施用15％的甘油作为赋形剂，并且G3施用200mg/kg的柳氮磺胺吡啶(SASP)。试验物质给药组G6从DSS诱导结肠炎的时间开始，施用CLCC1每天一次，持续10天，作为活细胞组，以观察CLCC1的治疗作用。结肠炎是通过将3％ DSS放入饮水瓶中并在试验物质给药开始的第3周提供7天的自由饮水引起的。
通过与实施例5基本相同的方法，测量了重量损失评价，疾病活动指数(DAI)和大肠长度，并进行了大肠组织的组织病理学检查。
6-2：重量损失评价
通过与实施例5基本相同的方法，从给药开始到试验结束，体重每周测量两次，并且在每个给药日的给药前测量。基于3％ DSS供应之前测量的体重，体重的变化被计算为百分比，结果在图8中显示。
当提供DSS时，与供水前相比，6天后所有组(G2～G7)的体重开始降低，并且降低率趋于增加直到试验结束。体重损失是炎性肠病的重要并且潜在危险的副作用。与G2相比，在G4和G5组中，体重的减小率是统计学上显著降低的(*p<0.05和**p<0.01，独立t检验)。因此，证实了CLCC1活细胞的给药改善因结肠炎引起的体重损失。
6-3：DAI(疾病活动指数)
通过与实施例5基本相同的方法，DAI给出了评分，评价结果在图9中显示。在G6中，在DSS给药后DAI评分提高，但在试验结束时，与G2相比，显示评分较低。在试验结束时，G6的平均得分为6.2分，统计学上显著地低于G2(*p<0.05和**p<0.01，独立t检验)。
因此，确认与G2相比，由于CLCC1活细胞的给药DAI评分在统计学上显著地降低，这意味着改善了例如体重、粪便状况以及粪便中血液的存在或不存在的症状。
6-4：大肠长度的测量
通过与实施例5基本相同的方法，提取实验动物的大肠组织，拍摄提取的大肠，并测量长度。测量的结果如图10所示。用DSS诱导的结肠炎降低了大肠的长度。
与G1相比，G2的大肠长度在统计学上显著降低(p<0.01，独立t检验)。活细胞给药组G6的大肠长度降低，在统计学上显著地小于G2(*p<0.05，独立t检验)。这意味着与G2相比，活细胞给药组抑制了大肠萎缩，从而预防或改善大肠长度的减小。
因此，证实CLCC1活细胞的给药抑制了结肠萎缩，并改善了大肠长度的减小。
6-5：细胞因子分析
通过与实施例5基本相同的方法，从大肠中提取RNA，通过RT-qPCR分析IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达。测量的结果在图11a至图11c显示。
当通过DSS诱导结肠炎时，炎性细胞因子(TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1和IL-23等)的表达增加，并且抗炎细胞因子(IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、TGF-β等)的表达降低。其中，在本实验中，测量IFN-γ、IL-6和TNF-α作为炎症细胞因子的表达水平。
在所有活细胞给药组(G6)中，与阴性对照组(G2)相比，IFN-γ和IL-6的水平在统计学上显著地低。在CLCC1高浓度活细胞给药组(G6)中，TNF-α水平在统计学上显著低于G2(*p<0.05，独立t检验)。因此，证实CLCC1活细胞的给药降低了炎性细胞因子(例如IFN-γ、IL-6和TNF-α)的水平。
6-6：组织病理学检查
通过与实施例5基本相同的方法，使用(CKX41，Olympus，日本)观察到提取并固定的大肠组织的切片，并进行拍照。
在试验组G2的大肠粘膜中，失去隐窝结构，失去分泌粘液的杯状细胞，并发生透壁炎症。在组织中，观察到大量的红细胞和白细胞。在G6中，观察到维持的隐窝结构和减少的炎症。观察结果在图12中显示。因此，证实CLCC1活细胞的给药改善了受损的肠道组织病况。
实施例7：评价炎症细胞因子的降低(HT-29和RAW 264.7)
7-1：HT-29和RAWN264.7细胞系的培养
HT-29(韩国细胞系库，KCLB 30038)和RAW 264.7(韩国细胞系库，KCLB 40071)细胞在RPMI 1640培养基中培养，在该培养基中在37℃下加入10％FBS(牛胎儿血清)、青霉素(100μg/ml)、链霉素(100μg/ml)，在5％CO2条件，并且每2～3天进行一次传代培养。
7-2：菌株的培养和恢复
本实验中使用的普拉梭菌A2-165从DSMZ(DSMZ Collection，Braunschweig，Gress，德国)(DSM N°17677)中获得。
使用的粪杆菌属微生物，抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌A2-165是专性厌氧菌株，所有培养过程均在厌氧培养室中进行，在mRCM的培养基中培养，以18小时～23小时的间隔共两次传代培养来激活，并在实验中使用。将获得的培养液在3200×g条件下离心5分钟，回收除沉淀外的上清液，用于实施例7和实施例8的实验中。
7-3：IL-8在HT-29细胞中的功效评价
使用HT-29细胞进行免疫调节特性的评价(ELISA)。
具体地，使用人类大肠上皮细胞HT-29，以5×10^4个细胞/孔在24孔板中培养后，与CLCC1和A2-165的上清液共培养的前一天，更换为含有10％FBS的RPMI1640培养基。共培养当天，向RPMI1640(+10％ FBS)培养基中加入10％的CLCC1和A2-165上清液或mRCM培养基。在37℃下5％ CO2培养箱中处理TNF-α(5～10ng/ml；Peprotech,NJ)6小时后，进行培养。所有样品以一式三份进行。共培养后，收集培养上清液，通过ELISA(Invitrogen，美国)测定白细胞介素8(IL-8)。结果以pg/ml表示，使用IL-8参考值进行归一化，仅使用mRCM的一种处理过的唯一培养基作为阴性对照。
通过ELISA分析的来自HT-29细胞的人类IL-8的分泌量在图13中显示。通过该检查，可以证实与仅用来自HT-29细胞的mRCM培养基处理的对照组相比，在抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌A2-165的上清液中，IL-8在统计学上显著减少。
这表明抑癌粪杆菌CLCC1可以降低由TNF-α增加的炎症反应，此外，这意味着通过抑制中性粒细胞对肠粘膜的浸润和炎症介质的分泌，抑癌粪杆菌CLCC1可以用作炎性肠病的治疗剂(图13)。
7-4：RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α的功效评价
使用RAW 264.7评价免疫调节特性(ELISA)。
具体地，使用小鼠巨噬细胞来源的细胞系RAW 264.7，以5×10^4个细胞/孔在24孔板中培养后，与抑癌粪杆菌CLCC1和A2-165的上清液共培养的前一天，更换为含有10％ FBS的RPMI1640培养基。共培养当天，向RPMI1640(+10％ FBS)培养基中加入10％的CLCC1和A2-165上清液或mRCM培养基。在37℃下5％ CO2培养箱中处理LPS(100ng/ml；Sigma，L4391)6小时后，进行培养。所有样品以一式三份进行。共培养后，收集培养上清液，通过ELISA(Invitrogen，美国)测定白细胞介素6(IL-6)和TNF-α。结果以pg/ml表示，使用IL-6和TNF-α参考值进行归一化，仅使用mRCM的一种处理过的唯一培养基作为阴性对照。
通过ELISA分析的来自RAW 264.7细胞的小鼠IL-6和TNF-α的分泌量在图14和图15中显示。通过该检查，可以确认，与仅用来自RAW 264.7细胞的mRCM培养基处理的对照组相比，在抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌A2-165的上清液中，IL-6和TNF-α在统计学上显著减少。
这表明CLCC1可以减轻由LPS增加的炎症反应，并且根据可以由IL-6诱导的Th17细胞分化，可以预期通过抑制RORγT或IL-17的分泌来改善炎症，此外，意味着通过调节TNF-α中的各种免疫细胞参与炎症相关细胞因子的表达，CLCC1可以用作炎性肠病的治疗剂(图14和15)。
实施例8：炎性细胞因子(HPBMC)抑制活性的评价
8-1：HPBMC培养
HPBMC(Lonza,4W-270)在其中添加10％ FBS(牛胎儿血清)的LGM-3TM(Lonza,CC-3211)培养基中，在37℃下、5％ CO2条件下培养，从而进行实验。
8-2：HPBMC中人类IL-10的功效评价
使用HPBMC进行免疫调节特性的评价。
具体地，以1×106个细胞/孔在12孔板中培养人外周血单核细胞(HPBMC)后，加入10％的CLCC1和A2-165的上清液和PBS。在37℃下5％ CO2培养箱中反应24小时后，进行培养。所有样品以一式三份进行。共培养后，收集培养上清液，通过ELISA(Invitrogen，美国)测定白细胞介素10(IL-10)。结果以pg/ml表示，使用IL-10参考值进行归一化，仅使用一种仅PBS处理过的作为阴性对照。
HPBMC中人类IL-10的功效分析结果在图16中显示。通过该检查，可以证实，通过比较抑癌粪杆菌CLCC1和普拉梭菌A2-165的上清液与HPBMC中仅用PBS处理的对照组，在CLCC1的上清液中IL-10在统计学上显著增加。
这表明抑癌粪杆菌CLCC1可以通过参与人外周血单核细胞中抗炎相关细胞因子中的IL-10的表达而发挥抗炎作用，这意味着抑癌粪杆菌CLCC1可以用作炎性肠病的治疗剂(图16)。
8-3：HPBMC中IL-6的功效评价
使用HPBMC进行免疫调节特性的评价。
具体地，以1×106个细胞/孔在24孔板中培养人外周血单核细胞(HPBMC)后，加入10％的CLCC1上清液和PBS。在37℃下5％ CO2培养箱中处理LPS(100ng/ml；Sigma，L4391)6小时后，进行培养。所有样品以一式三份进行。共培养后，收集培养上清液，通过ELISA(Invitrogen，美国)测定白细胞介素6(IL-6)。结果以pg/ml表示，使用IL-6参考值进行归一化，仅使用一种仅PBS处理过的作为阴性对照。
HPBMC中人类IL-6的功效分析结果在图17中显示。通过该检查，可以确认，与HPBMC中仅用PBS处理的对照组相比，在抑癌粪杆菌CLCC1的上清液中IL-6在统计学上显著减少。
这表明抑癌粪杆菌CLCC1可以通过参与人外周血单核细胞中抗炎相关细胞因子中的IL-6的表达而抑制抗炎应答，这意味着抑癌粪杆菌CLCC1可以用作炎性肠病的治疗剂(图17)。
实施例9：使用PCR进行微生物检测
9-1：样品和引物的制备
简要描述样品制备。使用DNA制备试剂盒(例如，MO BIO的PowerSoil DNA分离试剂盒)制备菌株基因组DNA。
通过使用blastn程序的分析，证实了位点特异性DNA-甲基转移酶(dam)对抑癌粪杆菌CLCCL具有特异性，因为它在其他微生物中没有发现。为了更容易、快速、准确地实时确认抑癌粪杆菌CLCCL特异性检测，基于dam基因序列，采用由正向和反向引物组成的引物对对样品进行实时PCR扩增反应。
9-2：使用曲线值(Ct值)检测
使用Bio-rad的CFX96实时PCR系统(Bio-Rad laboratories,Inc.,美国)，总量为20μl，使用含有SYBR预混物Ex Taq(2x)(TAKARABio,Inc.，日本)的实时PCR混合溶液和10pM的每个上述引物进行实时PCR扩增反应。加入实时PCR混合溶液的菌株的基因组DNA量约为25ng。实时PCR扩增反应在95℃下变性30秒，在95℃下5秒，并且在60℃下持续30秒，进行40个循环，然后在95℃下反应15秒。此后，每5秒升高0.5℃，至65℃～95℃，来获得出熔解曲线和熔解峰。根据循环数测量相对荧光单位(RFU)。
该曲线值(Ct值)仅在包含抑癌粪杆菌CLCCL DNA的样品中特异性确认，从以上结果可以看出本发明的引物组和探针可以特异性检测抑癌粪杆菌。
9-3：定量分析
使用位点特异性DNA-甲基转移酶(dam)基因，使用已经测量了抑癌粪杆菌量的物质(例如，质粒或基因组DNA)，设置标准曲线，然后用于测量浓度。
对于总细菌的量，在使用16S通用引物提取粪便样品中所有微生物的基因组后，像这样使用已经测量了量的物质(例如质粒、基因组DNA)，制作标准曲线，然后用它来测量浓度。
对于相对的定量，使用将上面计算的抑癌粪杆菌CLCCL量除以总细菌量的值。
实施例10：使用宏基因组分析进行微生物检测
该分析中使用的数据是通过对粪便微生物进行鸟枪法宏基因组测序方法获得的，并且在该分析使用的数据中，在结直肠癌，以及健康组与结直肠癌组相比(健康对照中SampleId以ERR开头的数据)的情况下，发布的开放数据作为论文(https://gut.bmj.com/content/66/1/70)下载，其他溃疡性结肠炎、克罗恩病和健康组数据的情况下，使用通过联合研究独立地收集的粪便微生物鸟枪宏基因组序列数据。
通过K-mer精确匹配方法(韩国专利公开第10-2020-0027900号)分析每个样本数据，用于计算在物种水平微生物物种丰度的核心基因，从而获得样品中微生物物种丰度的概况。为了分析抑癌粪杆菌CLCCL菌株的丰度，首先，为了确认它在物种水平上与现有基因组有区别，对普拉梭菌ATCC 27768的基因组进行ANI(平均核苷酸频率)分析，确认与在物种水平95的标准相似性相比，该菌株是具有显著较低的值85.74的新物种，因此将其添加到参考微生物基因组数据库中。
对于每个样品，使用包含抑癌粪杆菌CLCC1基因组的参考数据库比较在每个疾病组和健康组中的分布。试验结果在下表19和图18中显示。
表19
分类 平均值 标准偏差 最小值 最大值 p值
健康对照组 3.589 4.315 0 26.521 -
溃疡性结肠炎 2.363 2.980 0 19.872 0.006402
克罗恩病 3.436 7.651 0 55.056 6.71E-06
根据本发明的CLCC1菌株在健康组和溃疡性结肠炎组、健康组和克罗恩病之间表现出显著不同的结果，这表明疾病组可以根据作为肠道微生物存在时分布量的差异进行分类。
(中文译文)
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格
至：全钟植(CHUN,Jongsik)
千实验室株式会社
首尔市瑞草区南部循环路，2477
韩国
上述翻译文本与原文没有相违之处
<110> 希杰生物科技株式会社（CJ Bioscience, Inc.）
<120> 用于诊断或治疗炎性疾病的包含微生物的组合物
<130> DPP20212800KR
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抑癌粪杆菌（Faecalibacterium cancerinhibens）CLCC1 16S rRNA序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgcgc ctaacacatg caagtcgaac 60
gagcgagaga gagcttgctt tctcgagcga gtggcgaacg ggtgagtaac gcgtgaggaa 120
cctgcctcaa agagggggac aacagttgga aacgactgct aataccgcat aagcccacgg 180
ctcggcatcg agcagaggga aaaggagcaa tccgctttga gatggcctcg cgtccgatta 240
gctagttggt gaggtaatgg cccaccaagg cgacgatcgg tagccggact gagaggttga 300
acggccacat tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360
ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag gtcttcggat 420
tgtaaactcc tgttgttggg gaagataatg acggtaccca acaaggaagt gacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aaaacgtagg tcacaagcgt tgtccggaat tactgggtgt 540
aaagggagcg caggcgggaa gacaagttgg aagtgaaatc tatgggctca acccataaac 600
tgctttcaaa actgtttttc ttgagtagtg cagaggtagg cggaattccc ggtgtagcgg 660
tggaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg ggcaccaact 720
gacgctgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacacc 780
gtaaacgatg attactaggt gttggaggat tgaccccttc agtgccgcag ttaacacaat 840
aagtaatcca cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaagtct 960
tgacatccct tgacagacat agaaatatgt tttctcttcg gagcaaggag acaggtggtg 1020
catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttatggtca gttactacgc aagaggactc tggccagact gccgttgaca aaacggagga 1140
aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc tttatgactt gggctacaca cgtactacaa 1200
tggcgttaaa caaagagaag caagaccgcg aggtggagca aaactcagaa acaacgtccc 1260
agttcggact gcaggctgca actcgcctgc acgaagtcgg aattgctagt aatcgtggat 1320
cagcatgcca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga 1380
gccgggggga cccgaagtcg gtagtctaac cgcaaggagg acgccgccga aggtaaaact 1440
ggtgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtaggaga acctgcggct ggatcacct 1499

Claims (16)

1.一种用于预防或治疗炎性疾病的组合物，包含选自由以下所组成的组中的至少一种：细菌的微生物细胞，其包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有98％或更高序列同一性的16S rRNA序列；微生物的培养物；微生物的裂解物；和选自由微生物的细胞、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述炎性疾病为炎性胃肠道疾病。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述炎性胃肠道疾病为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌具有免疫调节活性或抗炎活性。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌通过调节细胞因子而具有免疫调节活性。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述细胞因子是选自由TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10所组成的组中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，基于所述组合物的总重量，所包含的细菌为1×103CFU/g～1×1015CFU/g。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌是活的或冻干产物。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含选自由抗炎剂、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素、肿瘤坏死因子抑制剂、Janus激酶抑制剂、抗整合素剂和白细胞介素抑制剂所组成的组中的至少一种药物。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌具有选自以下特征中的至少一种：
不包括17:0iso 3OH脂肪酸；
导致癌细胞凋亡的肿瘤生长抑制活性或抗癌活性；
当将微生物施用到移植有癌细胞系的动物模型中时，与未施用所述微生物的对照组相比，肿瘤体积的相对减少率为5％或更多；
当将微生物施用到移植有癌细胞系的动物模型中时，与未施用所述微生物的对照组相比，肿瘤重量的肿瘤生长抑制率为5％或更多；以及
在25℃～40℃的温度和厌氧条件下培养。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述细菌是保藏号为KCTC 13783BP的抑癌粪杆菌(Faecalibacterium cancerinhibens)。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物是胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、锭剂、栓剂或混悬剂。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物是益生菌。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含益生菌和益生元。
16.一种用于预防或治疗炎性肠病(IBD)的方法，包括将选自由以下所组成的组中的至少一种施用于受试者：细菌的微生物细胞，其包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有98％或更高序列同一性的16S rRNA序列；微生物的培养物；微生物的裂解物；和选自由微生物、培养物和裂解物所组成的组中的至少一种提取物。
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