CN116019839A - 乳酸肠球菌jdm1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了乳酸肠球菌JDM1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用以及活性成分包括乳酸肠球菌JDM1的药物组合物，涉及药物技术领域。实验表明，乳酸肠球菌JDM1具有减轻DSS诱导的小鼠结直肠炎症，包括体重减轻程度、结直肠缩短程度、炎症活动指数评分、保护直结肠黏膜、降低结直肠上皮细胞多种促炎症因子的转录水平保护和调节小鼠肠道菌群等作用，具有预防或治疗炎症性肠病的潜在价值。

Description

乳酸肠球菌JDM1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及乳酸肠球菌JDM1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病是一种胃肠道慢性炎症性疾病，主要分为两种类型，溃疡性结肠炎和克罗恩病。溃疡性结肠炎通常发生在结肠和直肠，而克罗恩病发生在整个消化道，炎症经常扩散到受影响的组织深处。炎症性肠病的直接原因和病理机制尚不完全清楚，但是存在几个公认的因素对其发生发展具有重大影响，包括环境、遗传因素、免疫失衡、肠道屏障完整性以及肠腔内共生微生物群的状态等。

大量基于细胞、动物和临床的研究结果表明，肠道微生态失调和炎症性肠病之间存在密切关联。基于此，使用抗生素、益生菌、益生元、粪便微生物移植等来调节肠道微生物群成为预防和治疗炎症性肠病的新策略。有研究提供证据表明，在小鼠和大鼠疾病模型中，益生菌可以在治疗和预防炎症性肠病的方面发挥有益作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了乳酸肠球菌JDM1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用以及活性成分包括乳酸肠球菌JDM1的药物组合物。实验显示，乳酸肠球菌JDM1有效减轻了葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结直肠炎，具有包括体重减轻程度、结直肠缩短程度、炎症活动指数评分、直结肠黏膜损伤程度、降低结直肠上皮细胞多种促炎症因子的转录水平保护和调节小鼠肠道菌群等作用，具有预防或治疗炎症性肠病的潜在价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供了乳酸肠球菌JDM1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

优选地，所述预防或治疗炎症性肠病的药物包括预防或治疗炎症性肠病导致的体重减轻、稀便、便血、直肠/结肠缩短、肠上皮黏膜损伤、炎症细胞浸润、促炎症因子释放和肠道微生物菌群失调中的一种或多种的药物。

优选地，所述的促炎症因子包括IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β中的一种或多种；进一步优选地，所述的促炎症因子包括TNF-α和IL-1β。

优选地，所述的肠道微生物菌群失调包括微生物多样性降低和/或有害菌丰度增高。

优选地，所述的微生物多样性降低包括产短链脂肪酸的微生物丰度降低，产短链脂肪酸的微生物包括罗氏菌、克里斯滕森菌、异杆菌和拟杆菌中一种或多种。

本发明一种药物组合物，包括至少一种活性组分以及一种或多种药学上可接受的辅料；所述活性组分包括乳酸肠球菌JDM1。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂和甜味剂中的一种或多种。

优选地，乳酸肠球菌JDM1的浓度不低于5×10⁸cfu/mL。

本发明所述药物组合物可以制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液及注射用药等多种形式，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明所述药物组合物中的活性组分还可以与其他具有治疗效果或增强治疗效果、降低毒副作用、延长代谢时间的有效成分共同组成药物组合物。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明观察了乳酸肠球菌JDM1对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结直肠炎的影响，结果显示，乳酸肠球菌JDM1有效减轻了DSS诱导的小鼠结直肠炎，具有预防或治疗炎症性肠病的潜在价值。具体表现在：

(1)乳酸肠球菌JDM1减轻了DSS处理后小鼠的体重降低程度，结直肠缩短程度和炎症活动指数评分；

(2)乳酸肠球菌JDM1减轻了DSS处理后小鼠的结直肠黏膜损伤程度；

(3)乳酸肠球菌JDM1降低了结直肠上皮包括IL-β和TNF-α在内的促炎因子转录水平。

(4)对小鼠肠道细菌群的分析表明，乳酸肠球菌JDM1可以保护肠炎小鼠肠道细菌群，使其更接近健康小鼠的肠道细菌群。

附图说明

图1为实施例1的实验方案示意图；

图2为实施例1中乳酸肠球菌JDM1对DSS诱导的结肠炎的保护作用；其中，a为各组小鼠在DSS处理后的体重变化图；b为各组小鼠结直肠长度结果图；c为各组小鼠在DSS处理后DAI评分变化；*p<0.05，**p<0.01；

图3为实施例1中小鼠结肠组织HE染色；

图4为实施例1中各组小鼠肠道炎症因子mRNA转录水平；

图5为实施例1中各组小鼠肠道细菌群结构差异分析图；其中a为分类学组成分析图；b为Alpha多样性分析图，图中每个点代表一个样本；c为Beta多样性PCoA分析图，图中每个点代表一个样本；

图6为实施例1中各组小鼠肠道细菌群LEfSe分析图；其中，a为LDA柱状图；b为分支图；

图7为实施例1中各组样本物种组成热图。

具体实施方式

本发明所称的“乳酸肠球菌JDM1”为发明人前期研究中从中国一名7岁健康男孩粪便样本中分离得到的，乳酸肠球菌JDM1的部分研究成果已于2022年2月发表在名为《Safetyassessment and probiotic characteristics of Enterococcus lactis JDM1》的文章中(Fu X,Lin L,Wang Y,et al.Safety assessment and probiotic characteristics ofEnterococcus lactis JDM1[J].Microbial Pathogenesis,2022,163:105380)。乳酸肠球菌JDM1的全基因组序列已经上传至NCBI，登录号为CP078094(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP078094.1/)，乳酸肠球菌JDM1的质粒序列信息登录号为CP078095(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP078095)。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1乳酸肠球菌JDM1对DSS诱导的小鼠结肠炎保护作用研究一、实验方法

1.实验流程

将40只C57BL/6小鼠(雄性，四周龄)随机分为四组，每组10只，分为PBS组(仅灌胃PBS)，PBS+DSS组(DSS处理且灌胃PBS)，JDM1组(仅灌胃乳酸肠球菌JDM1)，JDM1+DSS组(DSS处理且灌胃乳酸肠球菌JDM1)。实验方案如图1所示。

(1)实验前准备

挑取乳酸肠球菌JDM1菌株单克隆接种至5ml无菌BHI培养基中，在37℃厌氧箱中培养至对数生长期，以1％的比例将对数期菌液接种至新鲜BHI培养基，置于厌氧箱培养，过夜。取适量菌液于1.5ml无菌EP管，离心(4000rpm,5min)。弃去上清，使用两倍体积的PBS缓冲液重悬菌液，现配现用，灌胃前混匀。

小鼠适应性饲养一周后，在饮水中添加克林霉素(0.1g/L)和链霉素(5g/L)，持续供小鼠饮用一周，期间更换一次抗生素水。

(2)灌胃处理

所有分组更换为正常饮水，JDM1组和JDM1+DSS组每天灌胃JDM1(200μl/次，5×108CFU/ml)，PBS组和PBS+DSS组小鼠每天灌胃等体积PBS，持续两周。

(3)DSS处理

将PBS+DSS组和JDM1+DSS组的饮水更换为含有2.5％DSS的饮水，三天更换一次，PBS组和JDM1组仍为正常饮水，持续一周，期间每组小鼠每天灌胃剂量同前两周，同时记录小鼠体重变化及炎症活动指数，结束后收集小鼠粪便。将收集到的粪便样品保存于-80℃冰箱待用。

(4)小鼠组织样品提取

所有分组更换为正常饮水两天，第三天将小鼠安乐死，解剖小鼠，分离并取出小鼠结肠(含盲肠)，测量并记录长度后去除盲肠，使用PBS缓冲液将结肠内容物清理干净，用眼科剪将肠段纵向切开，放入干净PBS缓冲液清洗。取1cm左右组织浸泡于含有福尔马林固定液EP管中，用于组织切片染色；再取部分结肠组织放入含有RNA稳定保存液EP管中并保存在-80℃冰箱，用于RNA提取分析；剩余部分直接放入EP管中在液氮中速冻后-80℃保存待用。

2.炎症活动指数(disease activity index，DAI)评分

在给予DSS水后每日对小鼠进行DAI评分，评分标准见下表。DAI计算公式为：

DAI＝(体重下降得分+大便性状得分+便血程度得分)/3

表1小鼠DAI评分

3.小鼠结直肠HE染色

将浸泡于福尔马林固定液的小鼠结直肠组织送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。在显微镜下观察小鼠结直肠组织染色切片。

4.提取小鼠结直肠组织RNA，合成cDNA并进行Real-time PCR

使用试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)及7500Fast实时荧光定量PCR仪系统进行扩增。本实验所用引物见表2。

表2 Real-time PCR引物信息

5.小鼠粪便16S rDNA测序

(1)细菌16S rDNA基因V3～V4区扩增和测序

将收集的小鼠粪便送至派森诺公司进行DNA提取及测序，采用Illumina平台对粪便菌群DNA片段进行双端(Paired-end)测序，测序区域为细菌16sV3～V4区。引物信息为：

F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA

R:TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT

(2)序列处理分析

使用QIIME2软件，DADA2方法去噪，再使用Vsearch软件进行聚类。聚类时，在97％相似度水平对高质量序列聚类，输出OTU表。选用Greengenes数据库进行物种分类学注释。使用QIIME2软件的qiime feature-table rarefy功能对产生的ASV/OTU的丰度表进行抽平，抽平的深度设为最低样本序列量的95％。

6.菌群分析流程

根据得到的OTU丰度表进行后续分析。分别进行物种组成分析、alpha多样性分析、beta多样性分析、绘制物种组成热图和线性判别分析(LDA Effect Size，LEfSe)分析。

7.统计分析

统计学分析均以均值±标准差(SD)表示。使用GraphPad Prism 8.0.1版本进行统计分析。以Tukey的多重比较作为事后检验，采用单因素方差分析，两组样品之间的差异统计采用t检验。在p<0.05时认为具有显著性差异。

二、实验结果

1.乳酸肠球菌JDM1减轻小鼠肠炎症状

如图2所示，在小鼠饮水中添加DSS后，PBS+DSS对照组小鼠体重从第3天开始明显下降，而JDM1+DSS组小鼠在第7天才出现轻度下降。JDM1组小鼠体重增加程度略高于PBS对照组。DAI评分结果显示，PBS+DSS对照组小鼠在第七天分数达到最高，而JDM1+DSS组小鼠同样在第七天达到最高的炎症活动指数，但是评分显著低于PBS+DSS对照组。在第9天时，PBS+DSS组小鼠结直肠长度显著低于PBS对照组和IDM1+DSS组。此外，JDM1组小鼠没有不良症状出现。

2.乳酸肠球菌JDM1肠道黏膜损伤

以往研究表明，肠黏膜损伤，炎症细胞浸润是DSS诱导肠炎的重要病理表现。通过对各组小鼠的结肠组织进行切片HE染色观察小鼠肠道黏膜损伤情况。如图3所示，PBS组和JDM1组小鼠肠道粘膜形态正常。DSS处理后，DSS+PBS组小鼠结肠上皮可见明显的溃疡形成和部分上皮细胞脱落，黏膜下层见大量炎症细胞浸润，而JDM1+DSS组小鼠结肠炎症浸润较少，也未见明显溃疡形成。

3.乳酸肠球菌JDM1抑制促炎因子的释放

对各组小鼠结肠组织中的炎症因子IL-1β，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α的mRNA水平进行了差异分析。结果显示，如图4所示，与PBS+DSS组相比，JDM1+DSS组IL-1β和TNF-α水平显著降低；虽然IL-6和IFN-γ没有显示出显著性差异，但是从图4中可看出二者降低的趋势。各组的IL-10表达水平没有差异。

4.乳酸肠球菌JDM1对小鼠肠道细菌群的调节

如图5a的门水平的分类学组成分析图所示，在DSS处理后，厚壁菌门细菌在PBS对照组丰度最高，其次为JDM1组，JDM1+DSS组；PBS+DSS组丰度最低。PBS+DSS组中变形菌门丰度显著升高，放线菌门丰度显著降低。生态学家使用alpha多样性和beta多样性指数，分别表征物种在生境内和生境间的多样性，以综合评价其总体多样性。图5b中，Chao1和Observed species指数表征丰富度，JDM1组丰富度最高，PBS+DSS组最低，两者间具有显著性差异；Shannon和Simpson指数表征多样性，JDM1组多样性最高，PBS+DSS组最低，但各组间没有显著性差异。通过主坐标分析(Principal coordinate analysis，PCoA)来分析各组的群落多样性。如图5c所示，与PBS+DSS组相比，JDM1组和JDM1+DSS组的细菌群落与PBS对照组更相似。

通过LEfSe分析寻找各组间在丰度上具有差异的物种(图6)。JDM1组中乳球菌属(Lactococcus)、魏斯氏菌属(weissella)、罗氏菌属(Roseburia)等丰度更高。JDM1+DSS组中拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、链球菌属(Streptococcus)、Allobaculum、萨特氏菌属(Sutterella)、Christensenellaceae等丰度更高。PBS+DSS组中副拟杆菌属(Parabacteroides)、颤螺菌属(Oscillospira)、真杆菌属(Eubacterium)、副球菌属(Paracpccus)、梭菌属(Clostridium)、粪芽胞菌属(Coprobacillus)、不动杆菌属(acinetobacter)、肠球菌属等丰度更高。PBS对照组中双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、普氏菌属(prevotella)等丰度更高。

热物种组成分析热图进一步比较了样本间的物种组成差异，展示了各样本的物种丰度分布趋势(图7)。

三、结果分析

许多由化学物质诱导或基因缺乏引起的结肠炎小鼠模型可以用来模拟IBD的病理或免疫学特征。DSS诱导结肠炎的形态学特征是上皮细胞损伤、溃疡、黏膜下水肿、粒细胞和单核免疫细胞的浸润。因此，DSS结肠炎模型被认为具有与人类溃疡性结肠炎相关的特征。在本实验中，我们成功建立了DSS诱导肠炎小鼠模型：在接受2.5％DSS饮水后，小鼠出现了体重减轻，稀便，血便的症状；解剖后观察到结直肠明显缩短，结肠组织上皮损伤。与以往报道DSS结肠炎模型相一致。

在本实施例中，乳酸肠球菌JDM1有效缓解了DSS诱导的小鼠结直肠炎，小鼠体重降低程度、结直肠缩短程度、DAI评分及肠上皮损伤程度均减轻。然而，乳酸肠球菌的作用机制仍不清楚。益生菌的作用机制可能包括改变肠道微生物群的组成和功能和促进肠道黏膜生理和免疫等方面，我们推测乳酸肠球菌JDM1发挥了类似的作用。

促炎细胞因子导致肠道炎症和腹泻，是IBD发病机制的关键。在本实施例中，DSS处理小鼠IFN-γ和IL-6轻微上调，TNF-α和IL-1β水平显著上调，而同时使用乳酸肠球菌JDM1的小鼠下调了这些炎症因子的表达。有研究显示IL-10是抑制免疫和炎症细胞释放促炎细胞因子的关键免疫调节因子。在Kanda等人的研究中，坚韧肠球菌TN-3可能通过诱导调节性T细胞，促进IL-10的表达来减轻DSS诱导肠炎。但是在本实施例中，各组间IL-10的表达没有显著性差异。

以往研究表明与健康人相比，IBD患者的微生物组成发生了改变。在各种细菌的丰度上已经确定了特定的变化。IBD患者中发生丰度降低的菌属包括拟杆菌属、双歧杆菌属、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、罗氏菌属和萨特氏菌属等；丰度升高的菌属包括梭杆菌属(Fusobacterium)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、韦荣球菌科(Veillonellaceae)及巴斯德杆菌Pasturellaceae等。普拉梭菌被认为是肠道微生物群中的主要丁酸产生菌之一，这可能有助于其抗炎活性。一项关于IBD患者肠道细菌群变化的系统综述显示，与对照组相比，IBD患者的微生物群多样性降低或没有差异；普拉梭菌和Christensenellaceae丰度减少。Christensenellaceae是厚壁菌门的一个科，也是产生丁酸的细菌。肠道细菌群代谢产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)，如乙酸、丙酸、丁酸，不仅是肠细胞的关键信号分子，也是其能量的重要来源。这些物质一起维持了肠道健康。一旦被吸收，这些SCFAs也会通过进入体循环来刺激其他一些组织中的细胞表面受体。因此，SCFAs、免疫系统和宿主肠道稳态之间的相互作用与肠道微生物群密切相关。肠道微生物群的失调减少了一些典型的细菌类群，如罗氏菌，增加了一些典型的细菌类群，如脆弱拟杆菌，这通常在IBD患者和小鼠模型中被观察到。在本研究中乳酸肠球菌JDM1的使用增加了小鼠肠道微生物群落的丰富度和多样性，并使DSS小鼠的菌群组成更倾向于健康对照组。本实施例结果表明，乳酸肠球菌JDM1单独灌胃小鼠肠道细菌群中产丁酸的菌属如罗氏菌属丰度增加，在DSS处理同时给予乳酸肠球菌JDM1灌胃的小鼠肠道中丰度增加的菌属包括产SCFAs的Christensenellaceae、Allobaculum和拟杆菌属，乳酸肠球菌JDM1可能通过调节肠道微生物群落，促进肠道中有益菌的生长来发挥保护肠道黏膜的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.乳酸肠球菌JDM1在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗炎症性肠病的药物包括预防或治疗炎症性肠病导致的体重减轻、稀便、便血、直肠/结肠缩短、肠上皮黏膜损伤、炎症细胞浸润、促炎症因子释放和肠道微生物菌群失调中的一种或多种的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促炎症因子包括IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肠道微生物菌群失调包括微生物多样性降低和/或有害菌丰度增高。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的微生物多样性降低包括产短链脂肪酸的微生物丰度降低，产短链脂肪酸的微生物包括罗氏菌、克里斯滕森菌、异杆菌和拟杆菌中一种或多种。

6.一种药物组合物，包括至少一种活性组分以及一种或多种药学上可接受的辅料；所述活性组分包括乳酸肠球菌JDM1。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂和甜味剂中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，乳酸肠球菌JDM1的浓度不低于5×10⁸cfu/mL。

9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂和口服液中的一种或多种。

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