KR20210145152A - 단백질-함유 제제들의 안정화를 위한 조성물들 및 방법들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료적으로 유용한 제제들에서 항체들 및 다른 단백질들의 저장 안정성을 향상시키기 위한 조성물들을 포함하는 특정 콜레이트 계면활성제의 사용에 관한 것이다.

Description

단백질-함유 제제들의 안정화를 위한 조성물들 및 방법들
본 발명은 치료적으로 유용한 제제들에서 항체들 및 다른 단백질들의 저장 안정성을 향상시키기 위한 조성물들을 포함하는 특정 콜레이트 계면활성제의 사용에 관한 것이다.
진탕, 교반, 전단 및 동결 해동 시 또는 계면에서의 정지 상태에서 단백질을 변질로부터 보호하기 위해 단백질 제제용 안정제가 필요한 경우, 비이온성 용제(즉, 계면활성제)가 종종 사용된다(예컨대, 미국 특허 제5,183,746호를 참조). 이는 많은 단백질 함유 제품에 폴리소르베이트를 사용하는 것으로 예시된다. 예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 80(트윈(Tween)® 20 및 트윈® 80으로도 공지됨)은 표면 흡착을 방지할 뿐만 아니라 단백질 응집에 대한 안정제로서 생물치료제의 제제에 사용된다(Kerwin, J. Pharm. Sci. 97(8):2924-2936 (2008)). 폴리소르베이트는 폴리옥시에틸렌(POE) 소르비탄의 지방산 에스테르로 구성된 양친매성 비이온성 계면활성제로서, 폴리소르베이트 20의 경우 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 및 폴리소르베이트 80의 경우 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다.
안타깝게도, 폴리소르베이트는 산화 또는 가수분해를 통해 분해될 수 있다. 폴리소르베이트 분자가 분해되면, 예를 들어 유리 지방산, POE 소르비탄, PEG, PEG 에스테르 및 알킬산을 포함한 다양한 분해 부산물이 생성된다. 유리 지방산(FFA)을 포함한 상기 부산물들 중 일부는 단백질 함유 제제에서 탁도 및 단백질 응집을 증가시킬 수 있고, 상기 제제 내 단백질을 응집 또는 산화로부터 보호할 수 있는 원형 폴리소르베이트의 양을 감소시킬 수 있다. 따라서, 폴리소르베이트는 일반적으로 단백질 안정제로 사용되는 반면, 시간이 지남에 따라 폴리소르베이트 분해로부터 방출되는 지방산 및 다른 분해 부산물들은 폴리소르베이트가 단백질 함유 제제들에서 나타내는 보호 효과에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
단백질은 정제 및 저장 중에 다양한 정도의 분해를 겪으며, 여기서 산화(광유도 산화를 포함)는 단백질 안정성 및 효능에 파괴적인 영향을 미치는 주요 분해 경로 중 하나이다. 산화 반응은 아미노산 잔기의 파괴, 펩티드 결합 가수분해를 유발함으로써, 단백질의 3차 구조 변경 및 단백질 응집으로 인한 단백질 불안정성을 초래한다(Davies, J. Biol. Chem. 262: 9895-901 (1987)). 단백질 의약품의 산화는 Nguyen(Chapter 4 in Formulation and Delivery of Protein and Peptides (1994)), Hovorka(J. Pharm Sci. 90:25369 (2001)) 및 Li(Biotech Bioengineering 48:490-500 (1995))에 의해 검토되었다.
이러한 상황에서, 단백질-함유 제제들에서 안정성을 향상시키고 단백질의 응집 및/또는 산화를 방지하는데 유용한 조성물들을 식별할 필요가 있음이 분명하다.
본 개시는 특정 콜레이트 계면활성제가 치료적으로 유용한 제제들에서 항체들 또는 다른 단백질들의 응집을 안정화 및/또는 감소시키고 또한 상기 제제들에서 폴리소르베이트 계면활성제의 분해를 감소시키는데 유용하다는 신규 발견에 기초한다. 또한, 본원에서 콜레이트 계면활성제는 단백질 안정화 또는 응집 감소제로서 임계 미셀 농도(CMC) 값이 약 2.0 mM 이상 또는 약 0.2% 이상인 농도(중량 부피, w/v)에서 단백질-함유 치료 제제들을 안정화하는 데 유용할 수 있다. 특정 구현예들에서, 콜레이트계 계면활성제는 또한 치료 단백질 제제를 CMC 값 미만의 농도들에서 알킬글리코시드 계면활성제보다 더 효과적으로 보호할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시는 단백질 제제들, 예컨대 25℃의 수중에서 측정된 CMC 값 미만의 농도에서 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제를 포함하는 치료 용도로 의도된 단백질들에 관한 것이다. 특정 구현예들에서, 물질의 조성물에 존재하는 단백질은 항체이고, 이는 임의적으로 단클론성 항체일 수 있다. 본 개시는 상기 제제들을 담는 용기들, 상기 용기들을 포함하는 물품들, 및 상기 제제들을 제조하는 방법들에 관한 것이다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 수성일 수 있고, 약 2~8℃의 온도에서 적어도 1년 동안 안정적일 수 있고/있거나 약 30℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머를 포함하지 않는다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 폴리소르베이트 및/또는 폴록사머를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 알킬글리코시드를 포함하지 않는다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 알킬글리코시드를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 콜레이트 이외의 다른 계면활성제를 포함하지 않는다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 다른 계면활성제들을 포함한다.
그 중에서도 본 개시는 단백질 및 25℃의 수중에서 임계 미셀 농도(CMC) 값이 2.0 mM 이상 또는 0.2%(w/v) 이상인 하나 이상의 콜레이트 계면활성제를 포함하는 단백질 제제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 단백질은 항체, 예컨대 단클론성 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 계면활성제는 양쪽성 이온성, 비이온성, 음이온성이거나, 또는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS), 소듐 글리코콜레이트 수화물(SGH), 소듐 타우로콜레이트 수화물(STH), 소듐 콜레이트 수화물(SCH), SdTH, SdCH, ScdCH 및 N,N'-비스-(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드(BigCHAP)로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 CHAPS를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 CHAPS를 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 BigCHAP를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 BigCHAP를 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 SGH, STH, 또는 SCH를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 SGH, STH, 또는 SCH를 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 하나 이상의 콜레이트 계면활성제는 25℃의 수중에서 이의 CMC 값보다 낮은 농도로 존재한다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 양쪽성 이온성 또는 비이온성 콜레이트 계면활성제를 포함하고, 낮은 이온 강도의 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 50 mM 미만의 염, 40 mM 미만의 염, 30 mM 미만의 염, 또는 25 mM 미만의 염, 예컨대 나트륨, 아르기닌 또는 히스티딘 염을 함유한다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 음이온성 콜레이트 계면활성제를 포함하고, 높은 이온 강도의 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 175 mM 이상의 염, 200 mM 이상의 염, 225 mM 이상의 염, 또는 250 mM 이상의 염, 예컨대 나트륨, 아르기닌 또는 히스티딘 염을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 치료 용도에 적합하다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 동결건조를 거치지 않은, 예컨대 바로 사용할 수 있는 액체 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 재구성된 동결건조 제제이다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 어떠한 폴리소르베이트, 폴록사머, 플루로닉, 브리쥐(Brij), 또는 알킬글리코시드 계면활성제도 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 어떠한 비콜레이트 계면활성제도 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제, 적어도 하나의 단백질 종, 적어도 하나의 완충제 종, 및 적어도 하나의 비계면활성제 안정제(예컨대, 당, 당 알코올, 아미노산, 펩티드, 염, 또는 기타 단백질)로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 적어도 하나의 폴리소르베이트 또는 폴록사머, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 폴리소르베이트 20 또는 80을 1.0% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 또는 0.01% 이하로 포함한다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 상기 콜레이트 계면활성제 및 상기 폴리소르베이트 20 또는 80 이외에 어떠한 계면활성제도 포함하지 않는다.
본 개시는 또한 치료 단백질 제제로서, 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 또는 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025 내지 0.05%의 농도(w/v)의 CHAPS를 본질적으로 구성된 계면활성제를 포함하고, 임의적으로 완충제, 염, 동결보호제, 또는 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 안정제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 치료 단백질 제제로서, 임의적으로: (a) 상기 제제는 낮은 이온 강도를 갖고; (b) 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고; 및/또는 (c) 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제인, 치료 단백질 제제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 0.01 내지 0.05% 또는 0.025 내지 0.05%(w/v)의 CHAPS로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예들에서, 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025 내지 0.05%의 농도(w/v)의 BigCHAPS로 본질적으로 구성된 계면활성제를 포함하고, 임의적으로 완충제, 염, 동결보호제, 또는 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질들 종 중 하나 이상을 포함하는 안정제 중 하나 이상을 추가로 포함하고, 임의적으로 (a) 상기 제제는 낮은 이온 강도를 갖고; (b) 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고; 및/또는 (c) 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제인, 치료 단백질 제제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 0.01 내지 0.05% 또는 0.025 내지 0.05%(w/v)의 BigCHAP로 본질적으로 구성된다.
본 개시는 또한 치료 단백질 제제로서, 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025 내지 0.05%의 농도(w/v)의 STH, SGH, 또는 SCH로 본질적으로 구성된 계면활성제를 포함하고, 여기서 상기 제제는 이온 강도가 높은 제제이고, 임의적으로 완충제, 염, 동결보호제, 또는 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 안정제 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 임의적으로: (a) 상기 제제는 낮은 이온 강도를 갖고; (b) 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고; 및/또는 (c) 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제인, 치료 단백질 제제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 0.01 내지 0.05% 또는 0.025 내지 0.05%(w/v)의 STH, SGH, 또는 SCH로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 하기의 특성들 중 하나 이상을 갖는 제제로서: (a) 상기 제제는 실온에서 100 rpm(분당 회전수)으로 24시간 동안 교반한 후에 가시적인 응집체를 나타내지 않고; (b) 상기 제제는 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 2% 이하의 고분자량 단백질 응집체를 나타내고; (c) 상기 제제는 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 2% 이하의 고분자량 단백질 응집체를 나타내고; (d) 상기 제제 내 고분자량 단백질 응집체는 교반되지 않은 대조물질과 비교하여 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 0.2% 초과하여 증가하지 않고; (e) 상기 제제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 경우, 상기 제제 내의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80은 동일한 성분들 및 농도들을 갖지만 콜레이트를 포함하지는 않는 제제보다 40℃에서 2주 보관 후 또는 칸디다 안타티카 리파아제 B(CALB, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) CAS# 9001-62-1)로 처리한 후 더 높은 정도로 손상없이 유지된다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 제제들을 포함하는 용기들, 및 상기 제제들을 포함하는 용기들을 포함하는 물품들을 포함한다.
본 개시는 본원의 단백질 제제들을 제조하는 방법들로서, 상기 단백질을 상기 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제와 혼합하여 콜레이트-함유 수용액을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 본 개시는 또한 수용액에 존재하는 단백질의 응집을 억제하는 방법들로서, 상기 방법은 25℃의 수중에서 임계 미셀 농도(CMC) 값이 약 2.0 mM 이상 또는 0.2%의 농도(w/v)이고, 25℃의 수중에서 이의 CMC 값 미만의 농도인 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제를 상기 수용액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 상기 구현예들에서, 상기 단백질은 항체, 예컨대 단클론성 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 방법들은 콜레이트-함유 수용액을 동결건조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법들은 콜레이트-함유 수용액을 동결건조하는 단계를 포함하지 않는다.
도 1은 0.05%(w/v)의 콜레이트 계면활성제 또는 대조 계면활성제(콜레이트 CHAPS, SGH 또는 STH, 폴리소르베이트 20(PS20) 또는 폴록사머 188(PX188))를 예시적인 단클론성 항 PDL1 항체와 pH 5.5에서 20 mM의 히스티딘 아세테이트 및 240 mM의 자당 중 1 mg/mL로 혼합한 결과를 도시한다. 용액은 15 mL 유리 바이알에서 5 mL의 부피였다. 상기 성분들을 포함하지만 계면활성제는 포함하지 않는 대조 용액들을 또한 제조하였다. 도는 암 셰이커(글라스-콜(Glas-Col) 벤치 탑 암 셰이커)에서 100 rpm(분당 회전수)으로 주변 온도에서 24시간 동안 교반한 후 가시적인 응집체가 형성되는지 여부를 도시한다.
도 2는 pH 5.8의 200 mM 아르기닌 숙시네이트 용액에서 예시적인 모노클로날 항 트립타아제 항체를 1 mg/mL로 혼합하는 것을 도시한다. 용액은 15 mL 유리 바이알에서 5 mL의 부피였다. 상기 성분들을 포함하지만 계면활성제는 포함하지 않는 대조 용액들을 또한 제조하였다. 도면은 암 셰이커에서 100 rpm으로 주변 온도에서 24시간 동안 교반한 후 가시적인 응집체가 형성되는지 여부를 도시한다.
도 3은 콜레이트가 단백질 용액의 유리 지방산을 침전으로부터 보호할 수 있음을 도시한다. pH 5.8에서 5 mg/mL의 항 트립타아제 항체 및 200 mM의 아르기닌 숙시네이트 및 0.02% PS20을 함유하는 용액들을 다양한 농도의 콜레이트 계면활성제와 혼합한 다음, 5°C에서 0.04 유닛/mL의 CALB로 스파이크(spike)하였다. 콜레이트가 PS20를 FFA로 분해되지 않도록 보호하는 경우, 단백질 용액에서 가시적인 FFA 침전 입자가 형성되어서는 안 되며, 이러한 입자가 일단 형성되면 콜레이트를 첨가 시 재가용화되어야 하는 반면, 콜레이트가 보호 또는 가용화를 제공하지 않는 경우, 가시적인 FFA 침전 입자는 콜레이트가 첨가되지 않은 단백질 용액과 동일한 정도로 형성되어야 한다. 결과는 0.5% SCH, SGH 또는 CHAPS의 첨가가 용액에서 가시적인 미립자 형성을 방지하는 반면, 상기 미립자는 각각의 첨가된 계면활성제의 0.02% 내지 0.1%에서 여전히 형성된다는 것을 보여준다.
도 4는 첨가된 CALB 리파아제에 의해 유도된 PS20 분해에 대해 콜레이트 계면활성제를 상이한 농도로 배양한 결과를 요약하여 도시한다. 그래프의 점선은 "리파아제 단독"의 대조 용액에서 볼 수 있는 바와 같이 완전한 분해 시 관찰된 PS20 농도를 제공한다.
본 발명은 이하에 포함되는 구체적인 구현예 및 실시예에 대한 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다.
본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 다중 종속항의 맥락에서, "또는"의 사용은 단지 선택적으로 하나 초과의 선행하는 독립 또는 종속항을 다시 지칭한다. 또한, "요소" 또는 "구성요소"와 같은 용어는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 요소 및 구성요소 그리고 하나 초과의 하위단위를 포함하는 요소 및 구성요소 모두를 수반한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 이의 분수(예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
단위, 접두사 및 기호는 SI(Syst
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me International de Unites) 승인 형식으로 표시한다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 측정값은 유효 숫자 자리수 및 측정과 관련된 오류를 고려하여 근사치로 이해한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 백분율("%")은 달리 명시되지 않는 한 중량 대 부피("w/v")의 백분율이다.
본 개시는 제제들을 포함하는 단백질 및 콜레이트에 관한 것이다. 상기 "제제들"는 또한 본원에서 "조성물들" 또는 "제재들"로 상호 호환가능하게 지칭될 수 있다.
본원의 일부 구현예들에서, 제제는 "낮은 이온 강도" 또는 "높은 이온 강도"일 수 있다. "이온 강도"는 용액 내 전기장의 강도를 나타내며, 존재하는 각 유형의 이온 몰 농도의 합에 전하의 제곱을 곱한 것과 같다. 본원에서 사용된 바와 같이, "낮은 이온 강도"의 제제는 50 mM 이하, 예컨대 20 mM 내지 50 mM의 염 농도(예컨대, 나트륨, 아르기닌, 히스티딘 또는 유사한 염)를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 높은 이온 강도의 제제는 150 mM 이상, 예컨대 150 mM 내지 300 mM의 염 농도(예컨대, 나트륨, 아르기닌, 히스티딘 또는 이와 유사한)를 갖는다.
“등장성” 제제는 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 제제이다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 갖을 수 있다. 용어 "저장성(hypotonic)"은 인간 혈액보다 낮은 삼투압을 갖는 제제를 지칭한다. 이에 상응하여, 용어 "고장성(hypertonic)"은 인간 혈액보다 높은 삼투압을 갖는 제제를 지칭하기 위해 사용된다. 등장성은, 예를 들어 증기압 또는 빙점강하 삼투압계를 사용하여 측정할 수 있다. 본 개시의 제제는 염 및/또는 완충제를 첨가한 결과로서 고장성일 수 있다.
"동결건조된" 제제는 동결건조되거나 동결건조 공정을 거친 것이다. 본원의 제제들은 저장을 위해 동결건조될 수 있거나, 또는 대안적으로 액체 용액으로서 저장을 위해 의도될 수 있다. "재구성된" 제제는 단백질이 재구성된 제제 내에 분산되도록 동결건조된 단백질 또는 항체 제제를 희석제에 용해시켜 제조한 것이다. 재구성된 제제는 관심 단백질로 치료될 환자에게 투여하는 것과 같은 용도에 적합할 수 있다.
"계면활성제"는 극성 및 비극성 영역이 잘 정의된 분자로서 용액 내에서 응집하여 미셀을 형성한다. 극성 영역의 특성에 따라, 계면활성제는 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 이온성일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "콜레이트" 또는 "콜레이트 계면활성제"는 콜산 골격을 기반으로 하는 분자를 지칭하며, 콜레이트 골격의 C7 및 C12 중 하나 또는 둘 모두의 히드록실기의 제거함으로써, 콜릴-CoA로부터 유도체화되어 접합 부위에서 기능화될 수 있다. 본원에서, 콜레이트는 일종의 계면활성제이다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 사슬 길이가 3차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산들의 서열을 의미한다. 따라서, 본원의 단백질은 일반적으로 어떠한 3차 구조도 갖지 않는 짧은 아미노산 기반 분자인 "펩티드"와 구별된다. 전형적으로, 본원에서의 사용을 위한 단백질은 적어도 약 5-20 kD, 대안적으로는 적어도 약 15-20 kD, 바람직하게는 적어도 약 20 kD의 분자량을 가지게 된다. 본원에서 폴리펩티드 또는 단백질은, 예를 들어 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “항체”는 단클론성 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체를 포함함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체, 이중체, 및 단일-사슬 분자뿐만 아니라 항체 결합 단편들(예컨대, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함한다. 본원의 항체는 특정 항원을 집합적으로 인식하는 중쇄(H) 및 경쇄(L) 가변 도메인에 위치한 일련의 상보적 의존 영역(CDR)들을 포함한다. 본원에서 항체는 항원 인식을 위한 일련의 CDR들을 포함하기에 충분한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열들의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예들에서, 항체는 전장 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에서, 항체는 전장일 수 있거나 아닐 수도 있는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 항체와 교환가능하게 사용한다.
용어 "약학적 제제" 또는 "치료적 제제" 또는 "치료적 제재"는 하나 이상의 활성 성분(예컨대, 단백질) 및 하나 이상의 추가 성분 또는 부형제 물질을 포함하는 제재 또는 조성물을 지칭하고, 이는 활성 성분의 생물학적 활성이 포유동물 대상체에서 효과적이도록 하고 "치료적 용도에 적합"하거나 또는 "약학적 용도에 적합"하게 하는 형식이며, 이는 상기 제제가 전체적으로 포유동물 대상체에게 허용할 수 없을 정도로의 독성이 없고, 제제가 투여되는 포유동물 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있거나 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 되는 농도의 성분을 함유하지 않음을 의미한다.
“안정적인” 제제는 이의 단백질이 저장시 물리적 및/또는 화학적 안정성을 본질적으로 보유하는 것이다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 바람직하게는, 제제는 실온(~30℃) 또는 40℃에서 적어도 1개월 동안 안정적이고/거나 약 2~8℃에서 적어도 1년 동안, 바람직하게는 적어도 2년 동안 안정적이다. 예를 들어, 저장 중의 중 응집 정도가 단백질 안정성의 지표로서 사용될 수 있다. 따라서, “안정적인” 제제는 단백질의 약 10%(w/v) 미만 및 바람직하게 약 5% 미만, 3% 미만, 또는 2% 미만이 제제 중 응집체로서 존재하는 것일 수 있다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기법이 당해 분야에서 입수 가능하고, 예를 들어 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29/-90 (1993)에서 검토된다.
단백질 함유 제제의 "안정성"을 증가시키는 것은 상기 제제에서 단백질 응집체의 형성 또는 상기 제제의 다른 성분들의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나(미처리된 단백질 함유 제제와 비교하여) 방지함으로써 상기 다른 성분들이 계속 작용하여 단백질의 안정성을 유지하는 것을 수반할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정화제" 또는 "안정제"는 제제를 안정적이거나 변하지 않는 상태로 유지하기 위해 제제에 첨가되는 화학물질 또는 화합물이다. 일부 경우들에서, 안정제는 응집, 산화 또는 색 변화 등의 방지를 돕기 위해 첨가할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "응집체" 또는 "응집"은, 예컨대 단백질 분자들의 응집에서와 같이 덩어리 또는 전체로서 함께 모이거나 모으는 것을 의미한다. 응집체는 다른 요인들, 예컨대 응집 작용제의 존재, 침전 작용제, 교반, 또는 단백질을 함께 모이게 하는 기타 수단 및 방법으로 인해 자가 응집 또는 응집체일 수 있다. “응집에 민감한” 단백질은, 특히 교반 시에 다른 단백질 분자들과 함께 응집하는 것으로 관찰된 것이다. 응집은 용액 내 이전에 투명했던 단백질 제제가 탁해지거나 침전물을 함유하는 경우와 같이 시각적으로 관찰되거나, 또는 제제 내 단백질을 크기별로 분리하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 같은 방법들에 의해 관찰될 수 있다.
응집체는 단백질 종의 이량체, 삼량체 및 다량체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "고분자량 종"(HMWS)은, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 관찰될 수 있고 원하는 단백질 분자들의 적어도 이량체를 나타내는, 즉, 제제 내에서 원하는 단백질 종의 분자량의 적어도 2배를 갖는 단백질의 응집체를 지칭한다. 단백질 종, 예컨대 정상 또는 원하는 형태로 이미 다량체, 예컨대 이량체 또는 사량체인 항체의 경우, HMWS는 단백질의 정상적인 원하는 다량체 형태의 적어도 이량체를 나타내게 된다.
교반 유도 응집을 "억제" 또는 "방지"한다는 것은 교반 유도 응집의 하나 이상의 억제제를 포함하는 단백질 함유 용액 내에 존재하는 응집체의 양을 교반 유도 응집의 하나 이상의 억제제를 포함하지 않는 단백질 함유 용액 내에 존재하는 응집체의 양과 비교함으로써 측정된 교반 유도 응집의 양을 방지, 감소 또는 축소시키는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
"임계 미셀 농도"(CMC)는 계면활성제가 용액 내에서 응집하여 미셀이라고 하는 클러스터를 형성하는 임계 농도이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 임의의 특정 계면활성제에 대한 CMC 값은 수중 25℃에서 측정하며, mM 또는 백분율(w/v)의 단위로 표시할 수 있다. 구성 단량체로부터 미셀의 형성은 평형을 수반하기 때문에, 미셀에 대한 좁은 농도 범위, 즉 그 범위 미만에서는 용액에 무시해도 될 정도의 양의 미셀이 포함되고 그 범위의 초과에서는 실질적으로 모든 추가 계면활성제가 추가 미셀의 형태로 발견되는, 미셀에 대한 좁은 농도 범위가 설정되었다. 수용액 내에서 수백 가지의 화합물에 대한 CMC의 편집은 Mukerjee, P. 및 Mysels, K.J. (1971) Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems, NSRDS-NBS 36. Superintendent of Documents, U.S. Government Printing Office, Washington, DC에 따라실시되었다. 또한, http://www.anatrace.com/docs/detergent_data.pdf를 참조한다.
본원에서 개시된 다양한 폴리펩티드 및 항체를 설명하기 위해 사용될 때, "단리된"은 이의 생산 환경의 구성요소로부터 확인, 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드 또는 항체를 의미한다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 이의 생산 환경으로부터의 다른 모든 성분과의 회합이 없다. 재조합 형질주입 세포에서 유래된 것과 같은 생산 환경의 오염 성분들은 일반적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은염색을 사용한 비환원 또는 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제된다. 하지만, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원의 일부 구현예들에서, 약학적 제제는 하나 이상의 비콜레이트 계면활성제와 같은 하나 이상의 유형의 부형제 또는 성분을 "포함하지 않는다". 상기 문맥에서 "포함하지 않는다"라는 표현은, 예를 들어 다른 의도적으로 첨가된 성분에서 발견되는 오염 또는 불순물로 인해 제외된 성분이 미량 수준을 초과하여 존재하지 않음을 의미한다.
본원에서 제제의 성분들의 혼합물을 언급할 때 용어 "본질적으로 구성되는"은 명시적으로 열거된 것 이외의 성분이 존재할 수 있지만, 상기 성분은 미량으로만 발견되거나 그렇지 않으면 단백질 농도, 단백질 응집 수준, 단백질 산화 수준, 점도, 열 안정성, 삼투압 농도 및 pH를 포함한 제제의 근본적인 특성이 변하지 않을 만큼 충분히 낮은 양으로 발견된다는 것을 나타낸다.
단백질 응집
단백질의 응집은 주로 소수성 상호작용으로 인해 결국 변성으로 이어진다. 부분적으로 또는 완전히 펼쳐진 단백질의 소수성 영역이 물에 노출되면, 정상적으로 묻혀 있는 소수성 내부가 이제 친수성 수성 환경에 노출된다는 사실로 인해 열역학적으로 불리한 상황이 발생한다. 결과적으로, 소수성 영역 주변의 물 분자 구조화로 인한 엔트로피의 감소는 주로 노출된 소수성 영역을 통해 변성된 단백질이 응집하도록 한다. 따라서, 단백질의 용해도 또한 손상될 수 있다. 일부 경우들에는, 자연적이거나 잘못 접힌 단백질 하위단위들의 자가 결합이 특정 조건하에서 발생할 수 있고, 이는 침전 및 활성의 손실로 이어질 수 있다.
용액에서 단백질 응집에 영향을 미치는 요인들에는 일반적으로 단백질 농도, pH, 온도, 기타 부형제 및 기계적 응력이 포함된다. 일부 요인들(예컨대, 온도)은 다른 요인들(예컨대, 기계적 응력)보다 정제, 배합, 제조, 보관 및 사용 중에 더 쉽게 제어할 수 있다. 제제 연구는 응집을 유도하지 않거나 실제로 응집 방지에 도움이 되는 pH 및 부형제의 적절한 선택을 지시하게 된다. 단백질 농도는 필요한 치료적 용량에 의해 결정되며, 상기 농도에 따라 더 높은 관련 상태(이량체, 사량체 등)가 존재할 가능성이 있는지 여부를 결정하여 용액 내에서 응집을 유발할 수 있다. 어떤 요인이 단백질 응집에 영향을 미치고 이러한 요인을 제거하거나 제어할 수 있는지를 결정하기 위해 제제 개발 중에 주의 깊은 연구를 실시해야 한다.
비경구 또는 기타 투여에 사용하기 위한 항체 또는 기타 단백질의 안정적인 용액 제제를 확인하려는 열망은 물리적 안정성에 대한 다양한 첨가제의 영향을 평가하기 위한 시험 방법론의 개발로 이어질 수 있다. 단백질 응집에 영향을 미치는 공지된 요인 및 이러한 응용 분야의 요구 사항을 기반으로 단백질 용액의 교반 또는 회전을 수반하는 기계적 절차를 사용하여 물리적 안정성을 평가할 수 있다. 응집을 방지하기 위한 다양한 첨가제의 능력을 확인하기 위한 물리적 스트레스 시험 방법론은 수평면에서 흔들림 또는 교반에 대한 노출 또는 수직면에서 "n" rpm으로 회전하는 휠 축으로부터 "x” cm 회전에 대한 노출을 수반할 수 있다. 응집으로 인한 탁도는 일반적으로 육안 검사 또는 광산란 분석에 의해 시간의 함수로 결정된다. 대안적으로, 침전으로 인한 가용성 단백질 함량의 감소는 시간의 함수로서 HPLC 분석에 의해 정량화될 수 있다.
물 표면 상의 단백질은, 특히 교반될 때 단백질 단층의 풀림 및 이후의 응집으로 인해 응집될 것이다. 계면활성제는 단백질을 변성시킬 수 있지만 표면 변성으로부터 단백질을 안정화시킬 수도 있다. 일반적으로, 이온성 계면활성제는 단백질을 변성시킬 수 있다. 하지만, 비이온성 계면활성제는 일반적으로 1%(w/v)의 비교적 높은 농도에서도 단백질을 변성시키지 않는다. 본 개시는 특정 콜레이트 계면활성제가 치료적으로 유용한 제제에서 항체 또는 다른 단백질들의 응집을 안정화 또는 감소시키는데 유용하다는 신규 발견에 기초한다.
콜레이트 계면활성제 및 제제
본 개시는 특정 콜레이트 계면활성제가 치료적으로 유용한 제제에서 항체 또는 다른 단백질들의 응집을 안정화 또는 감소시키는데 유용하다는 신규 발견에 기초한다. 예시적인 콜레이트는 양쪽성 이온성 콜레이트, 예컨대 임계 미셀 농도(CMC)가 25℃의 수중에서 약 8~10 mM 또는 0.5~0.6%인 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS, CAS 75621-03-3), 음이온성 콜레이트, 예컨대 글리코콜산나트륨 수화물(SGH, CAS 338950-81-5, CMC가 25℃의 수중에서 약 13 mM 또는 약 0.6%임), 타우로콜산나트륨 수화물(STH, CAS 345909-26-4, CMC가 25℃의 수중에서 약 3-11 mM 또는 0.2-0.6%임) 및 염화나트륨 수화물(SCH, CMC가 25℃의 수중에서 약 9-15 mM 또는 약 0.4% 내지 약 0.7%임) 뿐만 아니라 비이온성 콜레이트, 예컨대 N,N'-비스-(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드("BigCHAP", CAS 86303-22-2, CMC가 25℃의 수중에서 약 2.9-3.4 mM 또는 약 0.26%임)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 콜레이트는 25℃의 수중에서 CMC가 1 mM 이상, 또는 2 mM 이상, 또는 0.1%(w/v) 이상, 또는 0.2%(w/v) 이상일 수 있다.
특정 콜레이트는 항체 또는 다른 단백질 안정화제로서 단독으로 사용할 수 있거나, 다른 콜레이트들과 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 상기 콜레이트(단일 작용제로서 사용하는 경우) 또는 콜레이트들(조합하여 사용하는 경우)는 0.01% 내지 0.5%의 농도로 수성 항체 또는 기타 단백질 함유 제제 내에 존재할 수 있고, 이는 사용된 콜레이트의 CMC 값들보다 낮을 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 또는 콜레이트들은 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 또는 콜레이트들은 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 또는 콜레이트들은 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 또는 콜레이트들은 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 구현예들에서, 특정 콜레이트는 25℃의 수중에서 이의 각각의 CMC 값보다 낮은 농도로 항체 또는 기타 단백질 안정화제로 사용할 수 있다. 일부 구현예들에서, 콜레이트는 25℃의 수중에서 CMC가 1 mM 이상, 또는 2 mM 이상, 또는 0.1%(w/v) 이상, 또는 0.2%(w/v) 이상일 수 있다. 일부 구현예들에서, 콜레이트의 혼합물은 25℃의 수중에서 CMC 값보다 낮은 전체 농도가 되도록 사용할 수 있다. 일부 상기 구현예들에서, 콜레이트 또는 콜레이트들은 조성물에 존재하는 유일한 유형의 계면활성제일 수 있고; 따라서 다른 계면활성제가 존재한다.
현재 가장 많이 사용되는 치료학적으로 허용되는 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴리에테르 기들로부터 유래한다. 폴리소르베이트 20 및 80은 시판되는 치료용 단백질 제제들에서 최신의 계면활성제 안정제이다. 하지만, 치료 단백질 제제들에 사용되는 다른 계면활성제에는 플루로닉(Pluronic)® F-68 및 "브리쥐(Brij)" 부류의 구성요소들 및 폴록사머 및 알킬글리코시드가 포함된다. 본원의 일부 구현예들에서, 상기 다른 계면활성제 중 어느 것도 제제 내에 존재하지 않는 반면, 다른 구현예들에서 상기 다른 부류의 계면활성제 중 하나 이상이 포함된다.
일부 구현예들에서, 조성물은 폴리소르베이트, 플루로닉, 브리쥐, 폴록사머, 또는 알킬글리코시드 계면활성제를 포함하지 않는다. 다른 구현예들에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 다른 구현예들에서, 상기 조성물은 또한 PS20 또는 PS80과 같은 하나 이상의 폴리소르베이트를 포함하거나, 또는 알킬글리코시드 또는 알킬글리코시드의 조합을 포함할 수 있다. 제제가 폴리소르베이트 계면활성제 및/또는 알킬글리코시드 계면활성제를 포함하는 일부 상기 경우들에서, 상기 제제는 콜레이트 및 폴리소르베이트 및/또는 알킬글리코시드 계면활성제 이외의 다른 계면활성제들을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 계면활성제는 CHAPS이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 CHAPS를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도(w/v)로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 CHAPS는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 CHAPS는 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 CHAPS는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제 계면활성제는 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도의 CHAPS로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 CHAPS는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 CHAPS는 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 CHAPS는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재한다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 적어도 하나의 치료 단백질 종, 그리고 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하, 0.01% 내지 0.5%, 또는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 CHAPS로 본질적으로 구성된 계면활성제를 포함하고, 상기 제제는 임의적으로 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종 중 하나 이상을 포함하는 완충제, 염, 동결보호제, 또는 안정제 중 하나 이상을 포함하고, 임의적으로 상기 제제는 이온 강도가 낮고; 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고; 및/또는 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제이다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 폴리소르베이트, 예컨대 PS20 또는 PS80를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 계면활성제는 BigCHAPS이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 BigCHAP를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 BigCHAP는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 BigCHAP는 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 BigCHAP는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제 계면활성제는 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도의 BigCHAP로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 BigCHAP는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 BigCHAP는 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 BigCHAP는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재한다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및 BigCHAP를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하, 0.01% 내지 0.5%, 또는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 본질적으로 구성된 계면활성제, 및 임의적으로 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 완충제, 염, 동결보호제, 또는 안정제 중 하나 이상을 포함하고, 임의적으로 상기 제제는 낮은 이온 강도를 갖고; 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고; 및/또는 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제이다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 폴리소르베이트, 예컨대 PS20 또는 PS80를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 콜레이트 계면활성제는 SGH, STH, 또는 SCH이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 SGH, STH, 또는 SCH를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 SGH, STH, 또는 SCH는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 SGH, STH, 또는 SCH는 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 SGH, STH, 또는 SCH는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제 계면활성제는 SGH, STH, 또는 SCH를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하의 농도로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 SGH, STH, 또는 SCH는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.025% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.1%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 SGH, STH, 또는 SCH는 0.01% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. 일부 구현예들에서, 상기 SGH, STH, 또는 SCH는 0.025% 내지 0.05%의 농도로 존재한다. SGH, STH, 또는 SCH 계면활성제들을 포함하는 상기 구현예들 중 일부에서, 용액은 높은 이온 강도를 가진다.
일부 구현예들에서, 상기 제제는 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및 콜레이트를 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 또는 0.02% 이하, 0.01% 내지 0.5%, 또는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)로 본질적으로 구성된 계면활성제, 및 임의적으로 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 완충제, 염, 동결보호제, 또는 안정제 중 하나 이상을 포함하고, 임의적으로 상기 제제는 낮은 이온 강도를 갖고; 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고; 및/또는 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제이다. 다른 구현예들에서, 상기 제제는 폴리소르베이트, 예컨대 PS20 또는 PS80를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 전체 제제는 낮은 이온 강도를 갖는다. 본원에서 낮은 이온 강도의 제제는, 예를 들어 50 mM 이하, 예컨대 10~50 mM, 20~50 mM, 20~40 mM, 20~30 mM, 15~30 mM, 15~25 mM, 40 mM 이하, 30 mM 이하, 25 mM 이하, 또는 20 mM 이하 염 농도(예컨대, 나트륨, 아세테이트, 포스페이트, 아르기닌, 히스티딘, 시트레이트)를 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, 예를 들어 음이온성 콜레이트 종들을 사용하는 경우, 전체 제제는 높은 이온 강도를 갖는다. 본원에서 높은 이온 강도의 제제는 150 mM 이상의 염 농도, 예컨대 175 mM 이상, 200 mM 이상, 250 mM 이상, 150~300 mM, 200~300 mM, 200~250 mM, 175~250 mM, 또는 150~250 mM을 가질 수 있다.
예시적인 단백질들
본 제제들은 매우 다양한 단백질 또는 폴리펩티드와 타이드와 호환될 수 있다.
본원의 정의 내에 수반되는 폴리펩티드의 예는 포유류 단백질들, 예컨대 다양한 항체들, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자들, 예컨대 VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자들, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나아제; RANTES(활성화 시에 조절된 정상적으로 T-세포 발현 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안 억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마아제; DN 분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예컨대 CTLA-4; 억제 호르몬; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자(EGF); 전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함한 TGF-베타; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBPs); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈 유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자(CSFs), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨(ILs), 예컨대 IL-1 내지 IL-10; 초과산화물 디스무타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어, AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 폴리펩티드 중 임의의 것의 단편 및/또는 변이들 뿐만 아니라 상기 열거된 단백질 중 임의의 것에 결합하는 항체 단편을 포함하 항체들을 포함한다.
제제화된 단백질은 바람직하게는 본질적으로 순수하고 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (예컨대, 오염 단백질이 없음). “본질적으로 순수한” 단백질은 조성물의 총 중량에 근거하여, 중량으로 적어도 약 90%, 바람직하게는 중량으로 적어도 약 95%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. “본질적으로 균질한” 단백질은 조성물의 총 중량에 근거하여, 중량으로 적어도 약 99%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다.
주어진 시간에 단백질의 생물학적 활성이 제제가 제조될 때 나타난 생물학적 활성의 약 10% 이내(분석 오차 이내)인 경우, 단백질은 약학적 제제 내에서 "생물학적 활성"을 유지한다. 표적 분자 또는 항원에 결합하여 기능하도록 의도된 항체 또는 단백질의 경우, 생물학적 활성은 시험관내 또는 생체내에서 단백질이 항원에 결합하여 측정 가능한 생물학적 반응을 일으키는 능력에 의해 결정될 수 있다.
본원의 단백질은 자연 발생 단백질 뿐만 아니라, 예를 들어 2개의 별개의 단백질을 함께 공유적으로 연결함으로써 형성된 융합 단백질, 및 다른 단백질 또는 핵산, 소분자 약물 또는 고체상과 같은 비단백질 분자에 공유적으로 연결된 단백질을 포함하는 단백질 접합체를 광범위하게 수반한다. 용어 "고체상"은 본 발명의 단백질이 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 설명한다. 본원에 수반되는 고체상의 예는 부분적으로 또는 전체적으로 유리(예컨대, 조절된 기공 유리), 다당류(예컨대, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 형성된 것들을 포함한다. 특정 구현예들에서, 문맥에 따라, 상기 고체상은 검정 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 경우에는 정제 컬럼(예컨대, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 상기 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 불연속적인 개별 입자들의 고체상을 포함한다. 상기 용어는 또한 용액 내에 현탁될 수 있는 비드 또는 칩을 수반한다.
본원에서 단백질은 또한 항체들을 수반한다.
예시적 항체
항체는 일반적으로 관심 "항원"에 대응되는 것이다. 주어진 항원에 대해 “대응되는" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인" 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 해당하는 특정 항원에 결합하는 항체이다. 특정 폴리펩티드 항원 상의 특정 폴립펩티드 또는 에피토픕에 대해 “대응되는" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인" 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴립펩티드 항원 상의 해당하는 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 항체이다.
바람직하게는, 상기 항원은 생물학적으로 중요한 분자이고 질병 또는 장애를 앓는 포유동물에 대한 항체의 투여는 해당 포유동물에서 치료적 이점을 유발할 수 있다. 단백질 항원 및 비단백질 항원(예컨대, 종양 관련 당지질 항원; 미국 특허 제5,091,178호를 참조) 모두에 대해 대응되는 항체들이 고려된다. 상기 항원이 단백질인 경우, 이는 막관통 분자(예컨대, 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원들은 상기 논의된 단백질들을 포함한다. 본 발명에 수반되는 항체에 대한 예시적인 분자 표적은 CD 폴리펩티드들, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; HER 수용체 계열의 구성요소들, 예컨대 EGF 수용체(HER1), HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자들, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 이의 a 또는 b 하위단위들 중 하나를 포함하는 av/b3 인테그린(예컨대, 항 CD11a, 항 CD18 또는 항 CD11b 항체); VEGF와 같은 성장 인자들; IgE; 혈액형 항원들; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 폴리펩티드 C 등을 포함한다. 임의적으로 다른 분자들에 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막관통 분자들, 예컨대 수용체들의 경우에, 이의 단편들(예컨대, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막관통 분자를 발현하는 세포들을 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 세포들은 자연 공급원(예컨대, 암 세포주)로부터 유래될 수 있거나, 또는 막관통 분자를 발현하기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다.
본원에서 정제할 항체들의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 트라스투주맙을 포함한 HER2 항체(허셉틴(HERCEPTIN)®)(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289(1992), 미국특허 제5,725,856호) 및 퍼투주맙(옴미타그(OMNITARG)™)(WO01/00245); CD20 항체(하기를 참조); IL-8 항체(St John et al., Chest, 103:932 (1993), 및 국제공개공보 제WO 95/23865호); 인간화 및/또는 친화성 성숙 VEGF 항체, 예컨대 인간화 VEGF 항체 huA4.6.1 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN)®) 및 라니비주맙(루센티스(LUCENTIS)®)를 포함한 VEGF 또는 VEGF 수용체 항체(Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), 국제공개공보 제WO 96/30046호 및 WO 98/45331호, 1998년 10월 15일에 공개); PSCA 항체(WO01/40309); 에팔리주맙(랍티바(RAPTIVA)®)을 포함한 CD11a 항체(미국특허 제6,037,454호, 미국특허 제5,622,700호, WO 98/23761호, Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), 및 Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); 오말리주맙(졸래어(XOLAIR)®)을 포함한 IgE에 결합하는 항체(Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), 및 국제공개공보 제WO 95/19181호; 1998년 2월 3일자에 발행된 미국특허 제5,714,338호, 또는 1992년 2월 25일에 발행된 미국특허 제 5,091,313호, 1993년 3월 4일에 공개된 제WO 93/04173호, 또는 1998년 6월 30일에 출원된 국제출원 제PCT/US98/13410호, 미국특허 제5,714,338호); CD18 항체(1997년 4월 22일에 발행된 미국특허 제5,622,700호, 또는 1997년 7월 31일 공개된 제WO 97/26912호); Apo-2 수용체 항체(1998년 11월 19일에 공개된 제WO 98/51793호); 조직 인자(TF) 항체(1994년 11월 9일에 등록된 유럽특허 제0 420 937 B1호); α4-α7 인테그린 항체(1998년 2월 19일 공개된 WO 98/06248호); EGFR 항체(예컨대, 키메라 또는 인간화 225 항체, 세툭시맙, 1996년 12월 19일 공개된 WO 96/40210호에서와 같은 얼비툭스(ERBUTIX)®); CD3 항체, 예컨대 OKT3(1985년 5월 7일에 발행된 미국특허 제4,515,893호); CD25 또는 Tac 항체, 예컨대 CHI-621(씨뮬렉트(SIMULECT)®) 및 제나팍스(ZENAPAX)®(1997년 12월 2일에 발행된 미국특허 제5,693,762호를 참조); CD4 항체, 예컨대 cM-7412 항체(Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); CD52 항체, 예컨대 CAMPATH-1H(ILEX/버렉스(Berlex))(Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); Fc 수용체 항체, 예컨대 Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002(1995)에서와 같이 FcγRI에 대응하는 M22 항체); 암배아 항원(CEA) 항체, 예컨대 hMN-14(Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s(1995)); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 포함하는 유방 상피 세포에 대응하는 항체(Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); 및 Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); 결장암 세포에 결합하는 항체, 예컨대 C242(Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)); CD38 항체, 예컨대 AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937(1995)); CD33 항체, 예컨대 Hu M195(Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl.):5908s-5910s (1995)) 및 CMA-676 또는 CDP771; EpCAM 항체, 예컨대 17-1A(파노렉스(PANOREX)®); GpIIb/IIIa 항체, 예컨대 아브식시맙 또는 c7E3 Fab(리오프로(REOPRO)®); RSV 항체, 예컨대 MEDI-493(시나지스(SYNAGIS)®); CMV 항체, 예컨대 프로토비어(PROTOVIR)®; HIV 항체, 예컨대 PRO542; 간염 항체, 예컨대 B형 간염 항체 오스타비어(OSTAVIR)®; 항 MUC16을 포함한 CA125 항체(제WO2007/001851호; Yin, BWT 및 Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375 (2001)) 및 오바렉스(OvaRex); 개별특이형 GD3 에피토프 항체 BEC2; αvβ3 항체(예컨대, 비타신(VITAXIN)®; 메디뮨(Medimmune)); 인간 신장세포 암종 항체, 예컨대 ch-G250; ING-1; 항인간 17-1An 항체(3622W94); 항인간 결장직장 종양 항체(A33); GD3 강글리오시드에 대응하는 항인간 흑색종 항체 R24; 항인간 편평세포 암종(SF-25); 인간 백혈구 항원(HLA) 항체, 예컨대 스마트(Smart) ID10 및 항HLA DR 항체 온콜림(Oncolym, Lym-1); CD37 항체, 예컨대 TRU 016(트루비온(Trubion)); IL-21 항체(지모지네틱스(Zymogenetics)/노보 노디스크(Novo Nordisk)); 항 B 세포 항체(임페론(Imferon)); B 세포 표적화 MAb(이뮤노겐(Immunogen)/아벤티스(Aventis)); 1D09C3(모르포시스(Morphosys)/GPC); 림포래드(LymphoRad) 131(HGS); Lym-1 항체, 예컨대 Lym-1Y-90(USC) 또는 항 Lym-1 온콜림(USC/페레그린(Peregrine)); LIF226(인핸시드 라이프사이(Enhanced Lifesci.)); BAFF 항체(예컨대, WO 03/33658); BAFF 수용체 항체(예컨대, WO 02/24909호를 참조); BR3 항체; Blys 항체, 예컨대 벨리무맙; 림포스타트(LYMPHOSTAT)-B™; ISF 154(UCSD/로쉐(Roche)/트라겐(Tragen));
고밀릭시마(아이덱 152(Idec 152); 바이오젠 아이덱(Biogen Idec)); IL-6 수용체 항체, 예컨대 아틀리주맙(악템라(ACTEMRA)™; 슈가이(Chugai)/로쉐); IL-15 항체, 예컨대 HuMax-Il-15(겐맙(Genmab)/암젠(Amgen)); 케모카인 수용체 항체, 예컨대 CCR2 항체(예컨대, MLN1202; 밀리에늄(Millieneum)); 항보체 항체, 예컨대
C5 항체(예컨대, 에쿨리주맙, 5G1.1; 알렉시온(Alexion)); 인간 이뮤노글로불린의 경구 제제(예컨대,
IgPO; 프로테인 테라퓨틱스(Protein Therapeutics)); IL-12 항체, 예컨대 ABT-874(CAT/애보트(Abbott)); 테넬릭시맙(BMS-224818; BMS); S2C6 및 이의 인간화 변이체(WO00/75348) 및 TNX 100(키론(Chiron)/타녹스(Tanox))을 포함한 CD40 항체; cA2 또는 인플릭시맙(레미케이드(REMICADE)®), CDP571,
MAK-195, 아달리무맙(휴미라(HUMIRA)™), 페길화 TNF-α 항체 단편, 예컨대 CDP-870(셀테크(Celltech)), D2E7(크놀(Knoll)), 항 TNF-α 다클론성 항체(예컨대, PassTNF; 베리겐(Verigen))을 포함한 TNF-α 항체; CD22 항체, 예컨대 에프라투주맙 Y-90 및
에프라투주맙 I-131, 아바이오겐(Abiogen)의 CD22 항체(아바이오겐, 이탈리아), CMC 544(와이어쓰(Wyeth)/셀
테크), 콤보톡스(UT 사우트웨스턴(UT Soutwestern)), BL22(NIH), 및 림포스칸 Tc99(LympoScan Tc99, 이뮤노메딕스)를 포함한 LL2
또는 에프라투주맙(림포시드(LYMPHOCIDE)®; 이뮤노메딕스(Immunomedics)).
CD20 항체의 예는 하기를 포함한다: 현재 "리툭시맙"("리툭산(RITUXAN)®")이라고 불리는 "C2B8"(미국 특허 제5,736,137호); IDEC 파마슈티칼즈 사(IDEC Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수 가능한 "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab Tiuxetan)"(제발린(ZEVALIN)®)으로 명시되는 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린(murine) 항체(미국 특허 제5,736,137호; 1993년 6월 22일에 ATCC에 관리 번호 HB11388로 기탁된 2B8); "토시투모맙(Tositumomab)"이라고도 불리고 임의적으로 131I로 표지되어 코릭사(Corixa)로부터 상업적으로 입수 가능한 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모맙" 항체(벡사르(BEXXAR)™)를 생성하는 뮤린 IgG2a "B1"(또한, 미국 특허 제5,595,721호를 참조); "프레임워크 패치된" 또는 인간화 1F5(WO 2003/002607 (Leung, S.), ATCC 기탁 번호 Hb-96450)를 포함한 뮤린 단클론성 항체 "1F5"(Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)) 및 이의 변이체; 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체(미국 특허 제5,677,180호); 인간화 2H7(WO 2004/056312, Lowman et al.); B-세포의 세포막에서 CD20분자에 표적화된 완전 인간 고친화도 항체인 2F2(HuMax-CD20)(젠맙(Genmab, 덴마크; 예를 들어, Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) 및 Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607, 미국 2004/0167319를 참조); WO2004/035607 및 미국 2004/0167319 (Teeling et al.)에 기재된 인간 단클론성 항체; 미국 2004/0093621
(Shitara et al.)에 기재된 Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코시드-연결 당 사슬을 갖는 항체; CD20에 결합하는 단클론성 항체 및 항원 결합 단편(WO 2005/000901, Tedder et al.), 예컨대 HB20-3, HB20-4, HB20-25 및 MB20-11; CD20 결합 분자, 예컨대 AME 계열의 항체, 예컨대 WO 2004/103404 및 미국 2005/0025764(Watkins et al., 일라이 릴리(Eli Lilly)/어플라이드 몰레큘라 에볼루션(Applied Molecular Evolution), AME)에 기재된 AME 33 항체; CD20 결합 분자, 예컨대 미국 2005/0025764(Watkins et al.)에 기재된 것; A20 항체 또는 이의 변이체, 예컨대 키메라 또는 인간화 A20 항체(각각 cA20, hA20) 또는 IMMU-106(미국 2003/0219433, 이뮤노메딕스); 미국 2005/0069545 A1 및 WO 2005/16969(Carr et al)에서와 같이 IL-2와 임의적으로 접합된 에피토프 결핍 Leu-16, 1H4 또는 2B8을 포함한 CD20 결합 항체; CD22 및 CD20에 결합하는 이중특이적 항체, 예를
들어 hLL2×hA20(WO 2005/14618, Chang et al.); 인터내셔널 류코사이트 타이핑 워크샵(International
Leukocyte Typing Workshop)에서 입수가능한 단클론성 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2(Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4(Haisma et al., Blood 92:184 (1998)); 항 CD20 아우리스타틴 E 접합체(시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)); 항 CD20-IL2(EMD/바이오베이션(Biovation)/시티 오브 호프(City of Hope)); 항 CD20 mAb 테라피(에피사이트(EpiCyte)); 항 CD20 항체 TRU 015(트루비온).
예시적인 항체 구조
기본적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄로 불리우는 추가 폴리펩티드와 함께 염기성 이종사량체 단위 중 5개로 구성되고, 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, IgA 항체는 J 쇄와 조합하여 다가 집합체를 형성하기 위해 중합될 수 있는 염기성 4쇄 단위의 2 내지 5개를 포함한다. IgG의 경우, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 쇄에 연결되어 있고, 2개의 H 쇄는 H 쇄 동형에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 가교를 갖는다. 각 H 쇄는 N 말단에서, 가변 도메인(VH), 그 이후에 α 및 γ 쇄 각각에 대해 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 동형에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N 말단에서, 가변 도메인(VL)에 이어서 이의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. VL 은 VH와 함께 정렬되고 CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH 및 VL이 함께 쌍을 형성하는 것은 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 상이한 부류의 구조 및 성질에 대해서는, 예컨대 Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 및 Chapter 6을 참조한다.
임의의 척추동물 종으로부터 L 쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파 및 람다로 불리는 2가지 명확하게 구분되는 유형 중에서 하나에 배정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입에 배정될 수 있다. 5개 주요 부류의 면역글로불린이 있다: α, δ, ε, γ 및 μ, 각각으로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 부류는 추가로 CH 서열 및 기능의 상대적으로 미세한 차이를 기준으로 하여 하위부류, 예컨대 하기의 하위부류를 발현하는 인간으로 나눠진다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 또는 "V 도메인" 또는 "V 영역"은 중쇄 및 경쇄의 특정 분절이 항체 중들에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 이의 특정 항원에 대해 특정 항체의 특이성을 정의한다. 하지만, 가변성은 전체 가변 도메인에 걸쳐 고르게 분포되지는 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9~12개 아미노산 길이를 갖는 “초가변 영역”(HVRs) 또는 때때로 “상보성 결정 영역”(CDRs)으로 불리는 극도의 가변성을 갖는 더욱 짧은 영역에 의해 분리된 15~30개 아미노산 잔기의 프레임워크 영역(FRs)으로 불리는 상대적으로 불변인 스트레치로 구성된다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β-시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FRs를 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FRs에 의해 매우 근접하여 묶여지고, 다른 사슬로부터 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)를 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관여하지는 않지만, 다양한 작동체 기능, 예컨대 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"(또한 "상보성 결정 영역" 또는 CDR로도 공지됨)은 항원 결합 부위를 형성하고 항원 특이성의 주요 결정 인자인 면역글로불린의 V 영역 도메인 내에(일반적으로 극도의 서열 가변성의 짧은 영역 3개 또는 4개) 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. CDR 잔기를 식별하는 방법에는 적어도 두 가지가 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기반한 접근법(즉, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, M S 1991), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근법(Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). 하지만, 2개의 잔기 식별 기법들이 동일하지는 않지만 중복되는 영역들을 정의하는 한, 상기 기법들이 조합되어 잡종 CDR을 정의할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “단클론성 항체”는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하고, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예컨대, 이성질체화, 아미드화, 탈아미드화)을 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원성 부위에 대응한다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대응하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인(다클론성) 항체 제재들과 대조적으로, 각 단클론성 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대응된다. 이의 특이성 외에도, 단클론성 항체는 다른 면역글로불린에 의해서 오염되지 않고 하이브리도마 배양에 의하여 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제4,816,567호를 참조). “단클론성 항체”는 또한, 예를 들어 Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원의 단클론성 항체는 구체적으로 “키메라” 항체(면역글로불린)를 포함하고, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편 내에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(미국 특허 No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심의 키메라 항체는 비인간 영장류(예컨대, 긴꼬리원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 “영장류화” 항체를 포함한다.
"원형" 또는 "전장" 항체는 항원 결합 부위 뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 도메인, CH1, CH2 및 Ch3을H3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 자연 서열 불변 도메인(예컨대, 인간 자연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 원형 항체는 하나 또는 그 이상의 작동체 기능을 갖는다.
용어 "항체"는 "항체 단편" 및 "항원 결합 단편"을 포함한다. "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항원 결합 부분 및/또는 원형 항체의 가변 영역을 포함하고 항원에 특이적으로 결합하는 원형 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 이중체; 선형 항체(미국 특허 No. 5,641,870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]를 참조); 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 “Fab” 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 “Fc” 단편을 생성한다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인(VH) 및 일 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L 쇄로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합에 대하여 일가이고, 즉 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원 결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하고 여전히 항원과 가교 결합할 수 있는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 추가의 소수 잔기들을 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인들의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 수반하는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편들은 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 상기 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편 또는 “Fc”는 이황화물에 의해 함께 묶인 양쪽 H 쇄의 카르복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 작동체 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의하여 결정되며, 상기 영역은 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의하여 또한 인식된다.
“Fv”는 완전 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 단편은 단단한, 비공유 결합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 두 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 쇄 각각으로부터 3개의 루프)가 발산된다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
또한 “sFv” 또는 “scFv”로서 약칭되는 “단일 사슬 Fv”는 단일 폴리펩티드 사슬 내로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv 단편에 관한 검토에 대해, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
용어 "이중체"는 VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개의) 잔기를 갖는(선행하는 문단을 참조) sFv 단편을 구성함으로써 V 도메인의 쇄 내가 아닌 쇄 간의 쌍형성이 달성되어, 2가 단편, 즉 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 유발함으로써 제조되는 소형 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 이중체는 2개 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "크로스오버(crossover)" sFv 항체 단편의 이종이량체이다. 이중체는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)에서 더욱 자세히 기재된다.
"인간화" 형태의 비인간(예컨대, 뮤린) 항체는 비인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 인간 서열 대부분의 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 대부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서 수용자의 초가변 영역(또한 CDR)으로부터의 잔기들은 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 경우들에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기들(FR)은 상응하는 비인간 잔기들에 의해 대체된다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, "인간화 항체"는 수용자 항체도 공여자 항체에서도 발견되지 않는 잔기들을 또한 포함할 수 있다. 이 같은 변형들은 항체 성능을 더욱 정밀화하고 최적화하기 위해 만들어진다. 인간화 항체는 또한 임의적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함하게 된다. 추가적인 세부사항에 대해서는, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)를 참조한다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 인간 항체에서 발견되는 프레임워크 및 불변 도메인 서열들을 함유하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “면역부착소”는 이종성 단백질(“부착소”)의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 작동체 기능과 조합하는 항체 유사 분자를 명명한다. 구조적으로, 면역부착소는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌(즉, “이종성”) 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열, 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역부착소 분자의 부착소 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA(IgA-1 및 IgA-2를 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내에 적어도 하나의 가변 영역을 대신하여 본원에서 기재된 폴리펩티드 또는 항체의 도메인을 치환하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합의 생성을 위해, 또한 1995년 6월 27일에 발행된 미국 특허 제 5,428,130호를 참조한다.
단백질 제제 및 추가 부형제
본원의 개시는, 예를 들어 치료 용도를 위한 특정 단백질 제제에 관한 것이다. 본원의 제제는 적어도 하나의 단백질 종 및 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제를 포함하지만, 또한 하기에 기재된 바와 같이 다른 부형제들 또는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원의 제제는 약학적으로 허용가능한 산 또는 염기, 완충제, 염, 동결보호제(제제가 동결건조되는 경우), 당, 당 알코올, 아미노산, 추가 단백질 종, 희석제, 보존제, 다가 금속염, 그리고 어떤 경우들에는 다른 계면활성제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예들에서, 제제는 단백질, 콜레이트 계면활성제, 및 적어도 하나의 완충제 또는 염을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 제제는 제제화될 단백질의 필요에 따라 하나 이상의 안정제, 예컨대 당 알코올, 아미노산 또는 다가 금속 염을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 제제는 추가의 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 플루로닉, 브리쥐 또는 알킬글리코시드 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원에서 "안정제"는 제제를 안정적이거나 변하지 않는 상태로 유지하도록 돕기 위해 제제에 첨가되는 임의의 첨가된 부형제를 의미한다. 일부 경우들에서, 안정제는 응집, 산화 또는 색 변화 등의 방지를 돕기 위해 첨가할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 산"은 제제화된 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기산을 포함한다. 예를 들어, 적합한 무기산은 염산, 과염소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 설폰산, 설핀산, 설파닐산, 인산, 탄산 등을 포함한다. 적합한 유기산은 직쇄 및 측쇄 알킬, 방향족, 사이클릭, 지환족, 아릴지방족, 이종 고리식, 포화, 불포화, 모노, 디- 및 트리-카복실산을 포함하고, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 2-히드록시아세트산, 트리플루오로아세트산, 페닐아세트산, 트리메틸아세트산, t-부틸 아세트산, 안트라닐산, 프로판산, 2-히드록시프로판산, 2-옥소프로판산, 프로판디오산, 시클로펜탄프로피온산, 시클로펜탄 프로피온산, 3-페닐프로피온산, 부탄산, 부탄디온산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 아스코브산, 신남산, 라우릴 황산, 스테아르산, 뮤콘산, 만델산, 숙신산, 엠본산, 푸마르산, 말산, 말레산, 히드록시말레산, 말론산, 젖산, 구연산, 주석산, 글리콜산, 글리콘산, 글루콘산, 피루브산, 글리옥살산, 옥살산, 메실산, 숙신산, 살리실산, 프탈산, 팔모산, 팔메산, 티오시안산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-히드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, p-톨루엔설폰산, 캄포르설폰산, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵탄산, 4,4’-메틸렌비스-3-(히드록시-2-엔-1-카르복실산), 히드록시나프토산을 포함한다.
“약학적으로 허용가능한 염기”는 제제화된 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기 염기를 포함한다. 예를 들어, 적합한 염기는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, N-메틸글루카민, 모르폴린, 피페리딘과 같은 금속을 형성하는 무기 염기 및 1차, 2차 및 3차 아민, 치환된 아민, 시클릭아민 및 염기성 이온 교환 수지[N(R')4+ (여기서 R'은 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬, 예컨대 암모늄, 트리스임)], 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 및 폴리아민 수지 등을 포함하는 유기 비독성 염기로부터 형성되는 것들을 포함한다. 특히 바람직한 유기 비독성 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
본 발명에 사용될 수 있는 추가의 약학적으로 허용가능한 산 및 염기는 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 글리신, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신 및 아스파라긴으로부터 유래되는 것들을 포함한다.
본원의 제제는 또한 하나 이상의 완충제 또는 염을 포함할 수 있다. 완충제 및 염은 상기 지시된 산 및 염기의 산 및 염기 부가염 둘 모두로부터 유래된 것들을 포함한다. 특정 완충제 및/또는 염은 아르기닌, 히스티딘, 숙시네이트 및 아세테이트를 포함한다.
제제가 동결건조되는 경우, 동결보호제를 첨가할 수 있습니다. "동결보호제"는 관심의 단백질과 결합할 때 동결건조 및 이후 저장 시 단백질의 물리화학적 불안정성을 유의적으로 방지하거나 감소시키는 분자이다. 예시적인 동결보호제는 당 및 이의 상응하는 당 알코올; 아미노산, 예컨대 글루탐산모노나트륨 또는 히스티딘; 메틸아민, 예컨대 베타인; 친액성 염, 예컨대 황산마그네슘); 폴리올, 예컨대 3가 또는 그 이상의 분자량의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉(PLURONICS)®; 및 이들의 조합을 포함한다. 추가의 예시적인 동결보호제는 글리세린 및 젤라틴과, 당 밀리비오즈, 말레지토즈, 라피노즈, 만노트리오즈 및 스타키오즈를 포함한다. 환원당의 예는 글루코스, 말토스, 락토스, 말툴로즈, 이소-말툴로즈 및 락툴로스를 포함한다. 비환원당의 예는 당 알콜 및 다른 직쇄 폴리알콜로부터 선택되는 폴리히드록시 화합물의 비환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알콜은 모노글리코시드, 특히 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로즈의 환원에 의해 수득되는 화합물이다. 글리코시드 측쇄 군은 글루코시딕 또는 갈락토시딕일 수 있다. 당 알콜의 추가적인 예는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말툴로즈이다. 바람직한 동결보호제는 비환원당 트레할로스 또는 수크로스이다.
동결보호제는 "동결보호량"으로 사전동결건조된 제제에 첨가되며, 이는 동결보호제의 동결보호량의 존재하에 단백질의 동결건조 후, 단백질이 동결건조 및 저장 시 이의 물리화학적 안정성을 본질적으로 유지함을 의미한다.
“약학적으로 허용가능한 당”은 관심의 단백질과 배합되는 경우 저장시 단백질의 물리화학적 불안정성을 유의적으로 방지하거나 감소시키는 분자이다. 제제가 동결건조된 다음 재구성되는 경우에, "약학적으로 허용가능한 당"은 또한 "동결건조보호제"로서 공지될 수 있다. 예시적인 당 및 이의 상응하는 당 알콜은 하기를 포함한다: 아미노산, 예컨대 글루탐산모노나트륨 또는 히스티딘; 메틸아민, 예컨대 베타인; 친액성 염, 예컨대 황산마그네슘; 폴리올, 예컨대 3가 또는 그 이상의 분자량의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉(PLURONICS)®; 및 이들의 조합. 추가의 예시적인 동결보호제는 글리세린 및 젤라틴과, 당 밀리비오즈, 말레지토즈, 라피노즈, 만노트리오즈 및 스타키오즈를 포함한다. 환원당의 예는 글루코스, 말토스, 락토스, 말툴로즈, 이소-말툴로즈 및 락툴로스를 포함한다. 비환원당의 예는 당 알콜 및 다른 직쇄 폴리알콜로부터 선택되는 폴리히드록시 화합물의 비환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알콜은 모노글리코시드, 특히 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로즈의 환원에 의해 수득되는 화합물이다. 글리코시드 측쇄 군은 글루코시딕 또는 갈락토시딕일 수 있다. 당 알콜의 추가적인 예는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말툴로즈이다. 바람직한 약학적으로 허용가능한 당은 비환원당 트레할로스 또는 수크로스이다.
약학적으로 허용가능한 당은 "보호량"으로 제제에 첨가되며(예컨대, 동결건조 전에), 이는 단백질이 이의 물리화학적 안정성을 저장 중에(예컨대, 재구성 및 저장 후에) 본질적으로 유지함을 의미한다.
본원에서 관심의 “희석제”는 약학적으로 허용가능하고(인간에게 투여하기에 안전하고 비독성인) 동결건조 후 재구성된 제제과 같은 액체 제제의 제조에 유용하다. 예시적 희석제는 멸균수, 세균증식억제 주사용수(BWFI), pH 완충 용액(예컨대, 인산 완충 식염수), 멸균 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 희석제는 염 및/또는 완충제의 수용액을 포함할 수 있다.
“보존제”는 세균 활성을 감소시키기 위해 본원의 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중 용도(다중-용량) 제제의 제조를 촉진시킬 수 있다. 잠재적 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 헥사메토늄 염화물, 벤잘코늄 염화물(알킬벤질디메틸암모늄 염화물의 혼합물, 여기서 알킬기는 긴 사슬 화합물임) 및 벤제토늄 염화물을 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알콜이다.
본원에 기재된 제제는 재구성된 동결건조 제제로서 제조될 수 있다. 본원에 기재된 단백질 또는 항체는 동결건조된 후 재구성되어 본 발명의 액체 제제를 생성한다. 상기 특정 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 관심 단백질을 제조한 후, "사진 동결건조된 제제"가 생성된다. 사전 동결건조된 제제 내에 존재하는 단백질의 양은 원하는 용량 부피, 투여 방식(들) 등을 고려하여 결정된다. 예를 들어, 원형 항체의 시작 농도는 약 2 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 바람직하게는 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 20~30 mg/ml일 수 있다.
제제화될 단백질은 일반적으로 용액 내에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 액체 제제에서, 단백질은 약 4~8, 바람직하게는 약 5~7의 pH의 pH 완충 용액 내에 존재할 수 있다. 완충제 농도는, 예를 들어 완충제 및 제제(예컨대, 재구성된 제제)의 원하는 장성(tonicity)에 따라 약 1 mM 내지 약 20 mM, 대안적으로 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 예시적인 완충액 및/또는 염은 "약학적으로 허용가능한" 산, 염기 또는 완충제에 정의된 것과 같이 약학적으로 허용가능하고 적합한 산, 염기 및 이의 염으로부터 생성될 수 있는 것들이다.
일부 구현예들에서, 동결보호제는 사전 동결건조된 제제에 첨가된다. 사전 동결건조된 제제에서 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성 시 생성된 제제가 등장성이 되도록 하는 양이다. 하지만, 고장성 재구성 제제도 적합할 수 있다. 또한, 동결보호제의 양은 동결건조시 허용할 수 없는 양의 단백질 분해/응집이 발생하지 않도록 너무 낮아서는 안 된다. 하지만, 사전 동결건조된 제제에서 예시적인 동결보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 대안적으로 약 30 mM 내지 약 300 mM, 대안적으로 약 50 mM 내지 약 100 mM이다. 예시적인 동결보호제는 수크로스, 만노스, 트레할로스, 글루코스, 소르비톨, 만니톨과 같은 당 및 당 알코올을 포함한다. 하지만, 특정 상황들에서 특정 동결보호제는 제제의 점도 증가에 기여할 수도 있다. 이와 같이, 상기 효과를 최소화하거나 중화하는 특정 동결보호제를 선택하도록 주의를 기울여야 한다. 추가의 동결보호제는 "동결보호제"의 정의 하에 상기 기재되어 있으며, 또한 본원에서 "약학학적으로 허용가능한 당"으로도 지칭된다.
동결보호제에 대한 단백질의 비율은 각각의 특정 단백질 또는 항체 및 동결보호제 조합에 따라 가변될 수 있다. 높은 단백질 농도를 갖는 등장성 재구성 제제를 생성하기 위한 동결보호제로서 선택되는 단백질로서의 항체 및 당(예컨대, 수크로스 또는 트레할로스)의 경우, 동결보호제 대 항체의 몰비는 약 100 내지 약 1500몰의 동결보호제 대 1몰의 항체, 바람직하게는 약 200 내지 약 1000몰의 동결보호제 대 1몰의 항체, 예를 들어 약 200 내지 약 600몰의 동결보호제 대 1몰의 항체일 수 있다.
동결보호제(예컨대, 수크로스 또는 트레할로스) 및 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신)의 혼합물은 사전 동결건조 제제의 제조에 사용될 수 있다. 상기 증량제는 내부에 과도한 구멍이 없이 균질하게 동결건조된 케이크를 생성할 수 있다. 다른 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재된 것은 제제의 원하는 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는 한 사전 동결건조된 제제(및/또는 동결건조된 제제 및/또는 재구성된 제제)에 포함될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 추가 완충제; 보존제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물); 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머; 및/또는 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨을 포함한다.
동결건조된 제제의 경우, 단백질 이후에 선택적인 동결보호제 및 기타 선택적 성분들을 함께 혼합하고, 제제를 동결건조한다. 많은 상이한 동결 건조기들, 예컨대 훌(Hull)50TM(미국 소재의 훌) 또는 GT20 TM(독일 소재의 레이볼드-헤라우스(Leybold-Heraeus)) 동결 건조기가 상기 목적으로 사용 가능하다. 동결건조는 제제를 동결한 다음 1차 건조에 적합한 온도에서 동결된 내용물로부터 얼음을 승화시켜 달성된다. 상기 조건하에서, 생성물 온도는 공융점(eutectic point) 또는 제제의 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조를 위한 저장 온도는 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr에 이르는 적합한 압력에서 (생성물이 1차 건조 동안 동결된 채로 유지된다면) 약 -30 내지 25℃ 범위를 갖는다. 시료를 보유하는 용기의 조성, 크기 및 종류(예컨대, 유리 바이알) 및 액체의 부피는 주로 건조에
필요한 시간을 지시하게 되며, 이는 수시간 내지 수일(예컨대, 40 내지 60시간)의 범위일 수 있다. 임의적으로, 생성물 중 원하는 잔류 수분 수준에 따라 2차 건조 단계가 실시될 수도 있다. 2차 건조가 실시되는 온도는 주로 용기의 종류 및 크기 및 사용되는 단백질의 유형에 따라 약 0~40℃ 범위에 이른다. 예를 들어, 동결건조의 전체 수분 제거 단계에 걸쳐 저장 온도는 약 15~30℃(예컨대, 약 20℃)일 수 있다. 2차 건조에 필요한 시간 및 압력은 적합한 동결건조 케익을 생성하는 시간 및 압력일 것이며, 이는, 예컨대 온도 및 다른 매개변수들에 의존적이다. 2차 건조 시간은 생성물 내 원하는 잔류 수분 수준에 의해 결정되며, 전형적으로는 적어도 약 5시간(예컨대, 10~15시간)이 소요된다. 압력은 1차 건조 단계 동안 사용되는 압력과 동일할 수 있다. 동결건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 따라 가변될 수 있다.
환자에게 투여하기 전에, 동결건조된 제제를 약제학적으로 허용가능한 희석제로 전형적으로 재구성하여, 재구성된 제제 중 단백질의 농도가 약 50 mg/ml 이상, 예를 들어 약 50 mg/ml 내지 약 400 mg/ml, 대안적으로 약 80 mg/ml 내지 약 300 mg/ml, 대안적으로 약 90 mg/ml 내지 약 150 mg/m가 되게 한다. 재구성된 제제에서 이러한 높은 단백질 농도는 재구성된 제제의 피하 전달이 의도되는 경우에 특히 유용한 것으로 간주된다. 하지만, 정맥내 투여와 같은 다른 투여 경로들의 경우, 재구성된 제제에서 보다 낮은 농도의 단백질이(예를 들어, 재구성된 제제에서 약 5~50 mg/ml, 또는 약 10~40 mg/ml의 단백질) 바람직할 수 있다. 특정 구현예들에서, 재구성된 제제의 단백질 농도는 사전 동결건조된 제제의 단백질 농도보다 유의적으로 높다. 예를 들어, 재구성된 제제에서 단백질 농도는 사전 동결건조된 제제의 약 2~40배, 대안적으로 3~10배, 대안적으로 3~6배(예컨대, 적어도 3배 또는 적어도 4배)일 수 있다.
재구성은 일반적으로 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25°C의 온도에서 실시하지만, 원하는 경우 다른 온도를 사용할 수도 있다. 재구성에 필요한 시간은, 예컨대 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따라 달라지게 된다. 예시적인 희석제는 멸균수, 세균증식억제 주사용수(BWFI), pH 완충 용액(예컨대, 인산 완충 식염수), 멸균 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 상기 희석제는 선택적으로 보존제를 포함한다. 예시적인 보존제가 상기에 기재되었으며, 벤질 또는 페놀 알콜과 같은 방향족 알콜이 바람직한 보존제이다. 사용된 보존제의 양은 단백질과의 호환성 및 보존제 효능 시험을 위해 상이한 방부제 농도들을 평가하여 결정한다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알코올(예컨대, 벤질 알코올)인 경우, 보존제는 약 0.1~2.0%, 바람직하게는 약 0.5~1.5%의 양으로 존재할 수 있지만, 가장 바람직하게는 약 1.0~1.2%의 양으로 존재할 수 있다.
바람직하게는, 재구성된 제제는 크기가 >10㎛인 바이알당 6000개 미만의 입자를 갖는다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나를 초과하는 단백질, 바람직하게는 다른 단백질에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단일 제제로 원하는 표적(예컨대, 수용체 또는 항원)에 결합하는 2개 초과의 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 단백질은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 병용하여 적절히 존재한다.
알부민(예을 들어, 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민) 또는 면역글로불린(예를 들어, IgG 불변 영역)과 같은 추가적인 단백질을 첨가하여 관심 단백질을 추가로 안정화할 수 있다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 무균이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 멸균은, 예를 들어 약 120℃에서 약 30분 동안 단백질을 제외한 성분들을 고압멸균함으로써 달성될 수 있다.
치료적 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 추가의 선택적인 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990]). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨과 같은 항산화제, 보존제, 등장화제, 안정제, 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물), 및/또는 EDTA와 같은 킬레이트제를 포함한다.
치료제가 항체 단편인 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 단편이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편 또는 심지어 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다(예컨대, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 [1993]을 참조).
완충제는 특히 안정성이 pH 의존적인 경우 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는데 사용된다. 완충제는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 및 이들의 염을 모두 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트이다. 추가로, 완충제는 트리스(Tris)와 같은 히스티딘 및 트리메틸아민 염으로 구성될 수 있다.
보존제는 미생물의 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있으며, 일반적으로 0.2%~1.0%(w/v) 범위로 존재한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 할라이드(예컨대, 염화물, 브롬화물, 요오드화물), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
강장제는 또한, 예를 들어 액체 조성물의 장성을 조정하거나 유지하기 위해 포함될 수 있다. 큰, 하전된 생체분자, 예컨대 단백질 및 항체와 함께 사용될 때, 상기 작용제는 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용함으로써 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 가능성을 줄일 수 있다. 강장제는 다른 성분의 상대적 양을 고려하여, 중량으로 0.1% 내지 25% 사이에, 바람직하게는 1% 내지 5% 사이에 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 강장제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 삼가 또는 그 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
본원의 일부 제제들에서, 추가의 계면활성제가 포함된다. 본원의 다른 제제들에서, 콜레이트 계면활성제만 포함되고 다른 유형의 계면활성제는 포함되지 않는다.
추가 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 20(PS20) 및 폴리소르베이트 80(PS80)과 같은 폴리소르베이트를 포함한다. 다른 추가 계면활성제는 폴록사머 및 플루로닉, 예컨대 폴록사머 188 또는 플루로닉 F68, 또는 브리쥐를 포함할 수 있다. 다른 추가적인 계면활성제는 옥틸 말토시드, 데실 말토시드, 도데실 말토시드, 또는 옥틸 글루코시드와 같은 알킬글리코시드를 포함할 수 있다. 보다 일반적으로, "알킬글리코시드"는 당업계에 공지된 바와 같이 임의의 소수성 알킬에 연결됨으로써 결합된 임의의 당을 포함한다. 소수성 알킬 사슬 및 친수성 당류 사이의 연결은 다른 가능성들 중에서 글리코시드, 에스테르, 티오글리코시드, 티오에스테르, 에테르, 아미드 또는 우레이드 결합 또는 연결을 포함할 수 있다. 예시적인 알킬글리코시드는, 예를 들어 WO 2011/163458에 제공된다.
추가 부형제에는 다음 중 하나 이상으로 작용할 수 있는 작용제를 포함한다: (1) 증량제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정제 및 (4) 변성 또는 용기 벽 부착 방지제. 상기 부형제는 다가 당 알코올(상기 열거됨); 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 수크로오스, 락토오스, 락티톨, 트레할로오스, 스타키오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 리보오스, 리비톨, 미오이니시토오스, 미오이니시톨, 갈락토오스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨(예컨대, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 요소, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 기타 면역글로불린; 친수성 고분자, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류(예컨대, 자일로오스, 만노오스, 과당, 포도당); 이당류(예컨대, 유당, 말토오스, 수크로오스); 삼당류, 예컨대 라피노오스; 및 다당류, 예컨대 덱스트린 또는 덱스트란을 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 1개 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 세포독성제, 사이토카인 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이와 같은 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 병용하여 적절히 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, supra에 개시되어 있다.
서방형 제재가 제조될 수 있다. 서방형 제재의 적합한 예들에는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품의 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사형 마이크로구형체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 지속 방출을 위한 재조합 단백질의 미세 캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터루킨-2 및 MN rpg 120으로 성공적으로 실시되었다. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; 및 미국 특허 제5,654,010호.
상기 단백질들의 서방형 제제는 생체 적합성 및 광범위한 생분해성 특성으로 인해 폴리 락트산-코글리콜산(PLGA) 폴리머를 사용하여 개발될 수 있다. PLGA의 분해 산물인 젖산 및 글리콜산은 인체 내에서 빠르게 제거될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해성은 분자량 및 조성에 따라 수개월에서 수년까지 조정할 수 있다. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin and R. Langer (Eds.) pp. 1-41.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 동안 신체에 잔류하는 경우, 이들은 37°C에서의 수분 노출의 결과로서 변성되거나 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 가능한 변화를 유도할 수 있다. 관련된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적당한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
리포솜 또는 프로티노이드 조성물은 또한 본원에 개시된 단백질 또는 항체를 제제화하는데 사용될 수 있다. 미국 특허 제4,925,673호및 제5,013,556호를 참조한다.
본원에 기재된 단백질 및 항체의 안정성은 무독성 "수용성 다가 금속 염"의 사용을 통해 향상될 수 있다. 예로는 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Sn3+, Al2+ 및 Al3+가 포함된다. 상기 다가 금속 양이온들과 함께 수용성 염을 형성할 수 있는 음이온의 예는 무기산 및/또는 유기산으로부터 형성된 것을 포함한다. 상기 수용성 염은 적어도 약 20 mg/ml, 대안적으로는 적어도 약 100 mg/ml, 대안적으로는 적어도 약 200 mg/ml의 물(20℃)에서의 용해도를 갖는다.
"수용성 다가 금속 염"을 형성하기 위해 사용될 수 있는 적합한 무기산은 염산, 아세트산, 황산, 질산, 티오시안산 및 인산을 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 유기산은 지방족 카르복실산 및 방향족 산을 포함한다. 상기 정의 내에서 지방족 산은 포화 또는 불포화 C2-9 카르복실산(예컨대, 지방족 모노-, 디- 및 트리-카르복실산)으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 상기 정의 내의 예시적인 모노카르복실산은 포화 C2-9 모노카르복실산 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 에난트산, 카프릴산 펠라곤산 및 카프리온산, 및 불포화 C2-9 모노카르복실산 아크릴산, 프로피올산 메타크릴산, 크로톤산 및 이소크로톤산을 포함한다. 예시적인 디카르복실산은 포화 C2-9 디카르복실산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산 및 피멜산을 포함하는 반면, 불포화 C2-9 디카르복실산은 말레산, 푸마르산, 시트라콘산 및 메사콘산을 포함한다. 예시적인 트리카르복실산은 포화 C2-9 트리카르복실산 트리카르발릴산 및 1,2,3-부탄트리카르복실산을 포함한다. 추가로, 상기 정의의 카르복실산은 또한 1개 또는 2개의 히드록실 기를 함유하여 히드록시 카르복실산을 형성할 수 있다. 예시적인 히드록시 카르복실산은 글리콜산, 락트산, 글리세린산, 타르트론산, 말산, 타르타르산 및 시트르산을 포함한다. 상기 정의 내의 방향족 산은 벤조산 및 살리실산을 포함한다.
본 발명의 캡슐화된 폴리펩티드의 안정화를 돕기 위해 사용될 수 있는 일반적으로 사용되는 수용성 다가 금속 염은, 예를 들어: (1) 할로겐화물(예컨대, 염화아연, 염화칼슘), 황산염, 질산염, 인산염 및 티오시아네이트의 무기산 금속염; (2) 지방족 카르복실산 금속 염(예컨대, 칼슘 아세테이트, 아연 아세테이트, 칼슘 프로피오네이트, 아연 글리콜레이트, 칼슘 락테이트, 아연 락테이트 및 아연 타르트레이트); 및 (3) 벤조에이트(예컨대, 벤조산아연) 및 살리실레이트의 방향족 카르복실산 금속염을 포함한다.
제제의 특성
콜레이트 계면활성제를 포함하는 본원의 특정 제제는 저장 후 또는 교반 또는 고온 저장과 같은 스트레스 후의 가시적인 응집체 또는 고분자량 종(HMWS)의 존재와 같이, 저장되거나 스트레스를 받지 않은 대조 용액과 비교하여 감소된 정도의 단백질 응집체를 나타낼 수 있다.
콜레이트의 "교반 유도 응집을 억제하는" 양은 본원의 일부 제제들에 포함될 수 있다. 이는 실온에서 24시간 동안 100 rpm에서의 교반과 같은 특정한 일련의 조건하에서 콜레이트 없이 동일하게 처리된 단백질과 비교하여 단백질의 교반 유도된 응집을 검출가능하게 억제하는 콜레이트의 양이다. 예를 들어, 제제 내 응집은 가시적인 응집 또는 HMWS의 존재를 조사하기 위해 교반되지 않은 대조 용액과 비교할 수 있다.
본원의 일부 구현예들에서, 제제는 교반 유도된 응집 실험 후 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는다. 하기의 예들에 기재된 바와 같은 실험은 100 rpm과 같은 속도로 적합한 실험실 진탕 장치에서 실시될 수 있다. 구체적으로, 제제는 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 가시적인 응집체를 나타내지 않을 수 있고; 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 2% 이하의 고분자량 단백질 응집체를 나타낼 수 있고; 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 1% 이하의 고분자량 단백질 응집체를 나타낼 수 있고; 및/또는 제제 내 고분자량 단백질 응집체는 교반되지 않은 대조물질과 비교하여 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 0.2% 초과하여 증가하지 않을 수 있다. 예를 들어, 용액의 혼탁이나 침전물의 존재를 통해 가시적인 응집체의 존재를 확인하기 위해 간단한 육안 검사를 사용할 수 있다. 고분자량 종은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 검출될 수 있다. 고분자량 종을 검출할 수 있거나 크기, 전하, 소수성 또는 질량에 따라 제제에서 종을 분리할 수 있는 다른 수단에는 겔 전기영동, 등전초점조절, 모세관 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 펩티드 매핑, 올리고당 매핑, 질량 분석, 자외선 흡광도 분광법, 형광 분광법, 원형 이색성 분광법, 등온 적정 열량법, 시차 주사 열량법, 분석 초원심분리, 동적 광산란, 단백질 분해 및 가교, 탁도 측정, 필터 지연 분석, 면역학적 분석, 형광 염료 결합 분석, 단백질 염색 분석, 현미경 검사 및 ELISA 또는 기타 결합 분석을 통한 응집체 검출이 포함된다.
일부 구현예들에서, 제제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 경우, 제제 중 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80은 동일한 성분 및 농도를 가지지만 콜레이트를 포함하지 않은 제제보다 40℃에서 2주간 저장 후 또는 대안적으로 CALB 리파아제로 처리한 후 더 큰 정도로 온전하게 유지된다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 예를 들어 0.05% 내지 0.5% 콜레이트 계면활성제의 첨가는 40℃에서 2주간 저장 후 또는 CALB 리파아제로 처리한 후에 제제로부터 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 유리 지방산의 가시적 침전을 감소 또는 제거한다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 0.05% 내지 0.5% CHAPS의 첨가는 40℃에서 2주간 저장 후 또는 CALB 리파아제로 처리한 후에 제제로부터 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 유리 지방산의 가시적 침전을 감소 또는 제거한다.
본 개시의 제제를 이용한 치료적 처치
“치료”는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 개체는 장애를 이미 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 개체를 포함한다. 치료에는 장애의 증상 감소, 대상체의 삶의 질 개선 뿐만 아니라 장애의 안정화, 개시 내용의 악화 방지, 치료, 재발의 위험 감소 등과 같은 대상체에 대한 모든 완화 또는 개선이 포함된다.
"대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 치료를 받는 포유동물을 지칭한다. 치료 목적상 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 게르빌루스쥐, 마우스, 흰 족제비, 랫트, 고양이 등을 포함하는 포유류로 분류된다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 인간이다.
“장애”는 단백질을 이용한 치료로부터 이익을 얻게 될 임의의 상태이다. 이는 포유동물을 문제되는 장애에 취약하게 만드는 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적 예는 암종 및 염증을 포함한다.
"치료학적 유효량"은 특정 장애의 측정 가능한 치료에 영향을 미치는데 필요한 적어도 최소한의 농도이다. 공지된 단백질 약물의 치료학적 유효량은 당업계에 일반적으로 공지되어 있지만, 이하에서 발견되는 단백질의 유효량은 일반 의사와 같은 숙련된 기술자의 기술에 속하는 표준 기법에 의해 결정될 수 있다.
항체 및 기타 단백질은 액체 또는 동결건조 형태로 본 발명에 따라 제제화될 수 있다. 투여 경로는 공지되고 용인된 방법, 예컨대 장기간에 걸쳐 적합한 방식으로 단일 또는 복수의 일시 주사 또는 주입, 예컨대 피하, 정맥내, 복막내, 근육내, 동맥내, 병소내 또는 관절내, 국소 투여, 흡입에 의한, 또는 지속된 방출 또는 연장된 방출 수단에 의한 주사 또는 주입에 따른다.
장애의 치료를 위한, 활성제의 적절한 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 작용제가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 상기 작용제는 적합하게는 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다.
본원의 방법은 병용의 또는 추가적인 치료 단계로서 또는 치료 제제의 추가 성분으로서 공지된 장애 치료 방법과 병용될 수 있다. 본원에서 약학적 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 가변될 수 있다.
동결건조되지 않은 액체 제제 및 재구성된 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본 발명의 제제는 단백질을 사용한 치료가 필요한 포유동물, 예를 들어 인간에게 공지된 방법에 따라, 예컨대 일시 주사 또는 일정 기간 동안의 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 피하(즉, 피부 아래) 투여에 의해 포유동물에게 투여된다. 이러한 목적을 위해, 상기 제제는 주사기를 이용하여 주사될 수 있다. 하지만, 제제를 투여하기 위한 다른 장치들, 예컨대 주사 장치(예컨대, 인젝트-이지(Inject-ease)™ 및 젠젝트(Genject)™ 장치); 주사기 펜(예컨대, 젠펜(GenPen)™); 바늘없는 장치인 자동-주사기 장치(예컨대, 메디젝터(MediJector)™ 및 바이오젝터(BioJector)™); 및 피하 패치 전달 시스템이 입수 가능하다.
일부 특정 구현예들에서, 본 개시는 본 발명의 제제를 포함하는 용기에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 제제는 단일 사용 또는 다중 사용 바이알로 또는 단일 용량 투여 단위용 키트로 포장될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 제제를 포함하는 용기를 포함하고 이의 사용 지침을 또한 제공할 수 있는 제조 물품이 제공된다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알(예컨대, 이중 챔버 바이알), 주사기(예컨대, 단일 또는 이중 챔버 주사기) 및 시험관을 포함한다. 상기 용기는 다양한 재료들, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기 또는 키트는 단일 또는 다중 챔버의 사전충전형 주사기를 모두 포함한다. 예시적인 사전충전형 주사기는 독일 라벤스부르크 소재의 베터 게엠베하(Vetter GmbH)로부터 입수가능하다. 제제를 담는 용기 상에 있거나 이와 관련된 라벨은 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 나타낼 수 있다. 상기 라벨은 제제가 피하 투여에 유용하거나 의도된 것임을 추가로 나타낼 수 있다. 제제를 담는 용기는 반복 투여(예컨대, 2~6회 투여)를 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 제조 물품은, 예를 들어 동결건조된 제제의 재구성을 위해 적합한 희석제(예컨대, BWFI)를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하여 상업적 관점 및 이용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.
단백질의 적당한 용량(“치료학적 유효량”)은, 예를 들어 치료될 조건, 병태의 중증도 및 과정, 상기 단백질이 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는 지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 단백질에 대한 반응, 사용되는 단백질의 유형 및 담당의의 재량에 의존할 것이다. 단백질은 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여되고, 환자에게 진단 이후 임의의 시점에 투여될 수 있다. 단백질은 단독 치료법으로서 투여하거나 또는 문제의 질환을 치료하는 데에 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여할 수 있다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예를 참조하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 하지만, 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 단백질/항체의 응집을 방지하기 위한 콜레이트 계면활성제의 조사
일반적인 방법
진탕 또는 교반 유도 응집
일련의 본 연구에서, 단클론성 항체의 완충 용액(20 mM 히스티딘 아세테이트 또는 200 mM 아르기닌 석시네이트 또는 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5~5.8)을 실온에서 100 rpm의 암 진탕기(arm shaker)에서 진탕시켰다. 상기 연구는 15 cc 유리 바이알에 채워진 5 mL 항체 용액을 사용하여 실시하였다. 샘플을 일정한 시간 간격으로 회수하고 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 크기 변이체 분포를 분석하였다. 콜레이트 부류의 다양한 계면활성제를 진탕 중에 단백질 응집을 방지하는 효과에 대해 평가하였다. 계면활성제는 각각의 임계 미셀 농도(CMC)보다 낮거나 높은 농도에서 사용하였다.
실험 및 결과
본 발명자들은 먼저 0.05%(w/v)의 콜레이트가 낮거나 높은 이온 강도의 제제 조건에서 가혹한 교반 조건으로부터 단클론성 항체를 보호하기에 충분한지 여부를 조사하였다. 0.05%(w/v)의 콜레이트 계면활성제(CHAPS, SGH, 또는 STH) 또는 대조 계면활성제(PS20 또는 PX188)를 pH 5.5의 20 mM 히스티딘 아세테이트 및 240 mM 수크로스의 낮은 이온 강도의 용액 중 1 mg/mL의 예시적인 단클론성 항체(항 PDL1)와 또는 pH 5.8의 200 mM 아르기닌 석시네이트의 높은 이온 강도의 용액 중 1 mg/mL의 다른 예시적인 단클론성 항체(항트립타아제)와 함께 혼합하였다. 두 용액은 모두 5 mL의 충전 부피로 15 cc 유리 바이알 내에 채웠다. 상기 성분들을 포함하지만 계면활성제는 포함하지 않는 대조 용액들을 또한 제조하고 충전하였다. 용액을 암 진탕기(글라스-콜(Glas-Col) 벤치 탑 암 진탕기)에서 주위 온도에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반하였다. 도 1 및 도 2에서 도시된 바와 같이, 비계면활성제 대조 용액을 교반하면 용액이 눈에 띄게 탁해지는 반면, 다른 모든 용액은 눈에 띄게 투명하게 유지되었다.
각 용액에서 HMWS의 백분율은 또한 단백질 응집 정도를 결정하는 수단으로서 24시간 교반 후 SEC로 측정하였다. 결과를 하기의 표 1 및 표2에 제시한다.
표 1 - 교반 연구 - 낮은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 PDL1 항체 - HMWS(%)
계면활성제 부류 계면활성제 유형 총 HMWS %
대조물질 교반되지 않음 1.00
비이온성 PS20 1.05
Px188 1.03
양쪽성 이온성 CHAPS 0.97
음이온성 SGH 1.87
STH 5.93
계면활성제 없음, 대조물질 교반됨, 계면활성제 없음 23.13
표 1은 pH 5.5의 20 mM 히스티딘 아세테이트 및 240 mM 수크로스의 낮은 이온 강도 용액 중 1 mg/mL의 항 PDL1 항체를 24시간 교반한 후 HMWS의 총 백분율을 도시한다. 음이온성 SGH 및 STH 계면활성제는 대조물질 및 다른 계면활성제 부류들보다 적어도 약 2배 더 높은 총 퍼센트 HMWS를 나타낸다. 계면활성제가 없는 대조 샘플은 퍼센트 HMWS의 유의적인 증가를 보여준다.
표 2 - 교반 연구 - 높은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 트립타아제 항체 - HMWS(%)
계면활성제 부류 계면활성제 유형 총 HMWS %
대조물질 교반되지 않음 0.99
비이온성 PS20 1.03
PX188 1.01
양쪽성 이온성 CHAPS 0.96
음이온성 SGH 0.96
STH 0.97
계면활성제 없음, 대조물질 교반됨, 계면활성제 없음 65.01
표 2은 pH 5.8의 200 mM 아르기닌 석시네이트를 포함한 높은 이온 강도 용액 중 1 mg/mL의 항 트립타아제 항체를 24시간 교반한 후 HMWS의 총 퍼센트를 도시한다. 표 2에 도시된 바와 같이, 모든 계면활성제는 높은 이온 강도 완충 조건에서 교반 유도된 가용성 응집체 형성으로부터 저농도 항 트립타아제 항체를 보호하였다.
양쪽성 이온성 CHAPS 계면활성제는 낮은 이온 강도 완충액(표 1; 도 1) 및 높은 이온 강도 완충액(표 2; 도 2) 모두에서 가용성 응집체 형성에 대한 항체 보호를 잘 수행하였기 때문에, 이온 강도 제제는 음이온성 계면활성제(SGH 및 STH)가 효과적으로 작용하도록 하는 역할을 수행하는 것이 가능하다. 제제 내 높은 이온 강도의 존재는 전하 차폐를 생성하여 SGH 및 STH와 같은 음이온성 계면활성제가 주로 계면활성제로 작용할 수 있게 된다. 상기 가설을 시험하기 위해, 두 용액의 항체를 바꾸고 실험을 반복하였다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
표 3: 교반 연구 - 높고 낮은 이온 강도의 완충액(HMWS(%))에서 제제화된 항트립타아제 항체(표 2를 참조)
계면활성제 부류 계면활성제 유형 총 HMWS %
(높은 이온 강도)		 총 HMWS %
(낮은 이온 강도)
대조물질 교반되지 않음 0.99 1.12
비이온성 PS20 1.03 1.10
Px188 1.01 1.02
양쪽성 이온성 CHAPS 0.96 1.05
음이온성 SGH 0.96 8.35
STH 0.97 28.33
표 3은 교반되지 않은 대조물질과 비교한 각 완충액에서의 총 HMWS 백분율을 제공한다. 결과는 CHAPS, PS20 및 PX188이 모두 이온 강도에 관계없이 교반 유도 응집으로부터 항트립타아제를 보호한다는 것을 보여준다. 음이온성 콜레이트 계면활성제, SGH 및 STH는 이온 강도가 높은 제제에서 항트립타아제를 가용성 응집체 형성으로부터 보호하지만, 이온 강도가 낮은 제제에서는 그렇지 않다. 유사한 결과가 표 4에서 항 PDL1에 대해 제시된다.
표 4: 교반 연구 - 높고 낮은 이온 강도의 완충액(HMWS(%))에서 제제화된 항 PDL1 항체(표 1를 참조)
계면활성제 부류 계면활성제 유형 총 HMWS %
(높은 이온 강도)		 총 HMWS %
(낮은 이온 강도)
대조물질 교반되지 않음 0.88 1.00
비이온성 PS20 1.02 1.05
Px188 0.90 1.03
양쪽성 이온성 CHAPS 1.03 0.97
음이온성 SGH 0.95 1.87
STH 0.87 5.93
실시예 2: 콜레이트 계면활성제에 의한 응집 보호에 미치는 이온 강도의 영향에 대한 시험
낮은 이온 강도의 제제(20 mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 수크로스, pH 5.5) 및 높은 이온 강도의 제제(20 mM 히스티딘 아세테이트, 272 mM NaCl, pH 5.5)에서 1 mg/mL의 항 Tau 단클론성 항체를 포함하는 용액에서 하기의 계면활성제의 농축된 모 용액으로부터의 0.01%, 0.025% 또는 0.05%(w/v) 스파이크-인(spike-in)된 다양한 콜레이트 계면활성자와 함께 교반한 후 가시적인 미립자를 평가하였다: 나트륨 글리코콜레이트 수화물(SGH), 나트륨 타우로콜레이트 수화물(STH), 나트륨 콜레이트 수화물(SCH), 나트륨 데옥시타우로콜레이트 수화물(SDTH), 나트륨 데옥시콜레이트 수화물(SDCH), 나트륨 체노데옥시콜레이트 수화물(SCDCH), CHAPS 및 BigCHAP. 모든 제제는 히스티딘 아세테이트 완충액을 사용하여 제조되었고, 높은 이온 강도의 제제는 아르기닌 숙시네이트 대신에 염화나트륨을 사용하여 제조되었다. 이는 완충제 종을 동일하게 유지하기 위한 것이다. 상기 목적은 이온 강도가 실제로 HMWS 형성을 방지하는 역할을 하지만 제제에 사용된 완충제 종(예컨대, 아르기닌)은 그렇지 않음을 이해하는 것이다.
특정 조건하에서 가시적인 미립자가 관찰되었는지 여부는 하기 표 5 및 표 6에 나타내었고, 교반되지 않은 대조물질과 비교하여 HMWS의 형성은 하기 표 7 및 표 8에 나타내었다.
표 5: 교반 연구 - 낮은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 Tau - 가시적 미립자 분석
계면활성제 부류 계면활성제 유형 가시적 미립자의 관찰 여부? (Y/N)
0.01% 0.025% 0.05%
음이온성 SGH Y Y N
STH Y Y N
SCH Y N N
SdTH Y Y N
SdCH Y Y Y
ScdCH Y Y Y
양쪽성 이온성 CHAPS Y N N
BigCHAP N N N
Y = 예; N = 아니오
표 6: 교반 연구 - 높은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 Tau - 가시적 미립자 분석
계면활성제 부류 계면활성제 유형 가시적 미립자의 관찰 여부? (Y/N)
0.01% 0.025% 0.05%
음이온성 SGH Y N N
STH Y N N
SCH Y N N
SdTH Y N N
SdCH Y Y Y
ScdCH Y Y Y
양쪽성 이온성 CHAPS Y N N
BigCHAP N N N
Y = 예; N = 아니오
표 5 및 표 6의 결과는 음이온성 계면활성제가 0.025% 또는 0.05%(w/v)의 농도에서 시험될 때 더 높은 이온 강도의 제제에서 교반 유도된 불용성 응집체 형성(가시적인 입자 형성)으로부터 항 Tau 항체를 더 잘 보호한다는 것을 보여준다. 모든 음이온성 계면활성제 및 양쪽성 이온성 CHAPS는, 시험된 농도들 중 그 어떤 것에서도 가시적 입자 형성으로부터 항 Tau를 보호하지 못했던 SdCH 및 ScdCH를 제외하고는, 0.025%(w/v) 이상의 농도에서 가시적 입자 형성으로부터 항체를 잘 보호하였다. BigCHAP는 제제의 이온 강도에 관계없이 시험된 모든 농도에서 교반 유도된 가시적 입자 형성으로부터 항 Tau를 보호하였다.
표 7: 교반 연구 - 낮은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 Tau - HMWS(%)
계면활성제 부류 계면활성제 유형 총 HMWS(%)
대조물질(교반되지 않음) 0.01% 계면활성제 0.025% 계면활성제 0.05% 계면활성제
음이온성 SGH 0.19 NA NA 0.27
STH 0.15 NA 27.24 6.13
SCH 0.19 NA 0.14 0.14
SdTH 0.19 NA 20.88 0.78
SdCH NA NA NA NA
ScdCH NA NA NA NA
양쪽성 이온성 CHAPS 0.17 2.96 0.15 0.13
BigCHAP 0.18 2.82 0.16 0.16
NA = 단백질이 용액에서 완전히 침전됨
표 8: 교반 연구 - 높은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 Tau - HMWS(%)
계면활성제 부류 계면활성제 유형 총 HMWS(%)
대조물질(교반되지 않음) 0.01% 계면활성제 0.025% 계면활성제 0.05% 계면활성제
음이온성 SGH 0.73 20.41 0.74 0.74
STH 0.72 NA 0.93 0.73
SCH 0.75 20.3 0.73 0.67
SdTH 0.84 NA 0.83 0.82
SdCH NA NA NA NA
ScdCH NA NA NA NA
양쪽성 이온성 CHAPS 0.83 12.65 0.85 0.85
BigCHAP 0.84 7.41 0.82 0.84
NA = 단백질이 용액에서 부분적으로 또는 완전히 침전됨
표 7 및 표 8의 결과는 음이온성 계면활성제가 0.025% 또는 0.05%(w/v)의 농도에서 시험될 때 더 높은 이온 강도의 제제에서 교반 유도된 가용성 응집체 형성으로부터 항 Tau 항체를 더 잘 보호한다는 것을 보여준다. 양쪽성 이온성 CHAPS, BigCHAP 및 음이온성 STH는 0.025%(w/v) 또는 0.05%(w/v) 농도의 낮은 이온 강도 및 높은 이온 강도의 제제 모두에서 가용성 응집체 형성으로부터 항 Tau를 보호한다. 모든 음이온성 계면활성제는, 시험된 농도들 중 그 어떤 것에서도 가용성 응집체 형성으로부터 항 Tau를 보호하지 못했던 SdCH 및 ScdCH를 제외하고는, 0.025%(w/v) 이상의 농도에서 가용성 응집체 형성으로부터 항체를 잘 보호하였다.
상기 연구들의 결과는 음이온성 계면활성제가 단클론성 항체를 교반 유도된 물리적 불안정성으로부터 보호할 수 있게 한 것이 제제의 이온 강도이지만 제제에 사용된 부형제 유형(염화나트륨 아르기닌)은 아니라는 것을 확인시켜 준다.
실시예 3: 단백질 전하 비균질성(iCIEF)에 대한 콜레이트 계면활성제의 효과 - 교반 연구
항체 전하 변이체 분포는 콜레이트가 시험된 항체의 상대적 전하 변이체 분포에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 영상화된 모세관 등전초점조절(iCIEF)을 사용하여 실시예 2에 기재된 교반 실험에 따라 평가하였다. 하기의 표 9 및 표10에 나타난 결과는 교반 후에도 전하 변이체 분포가 유지되었고, 콜레이트가 하전된 종이었음에도 불구하고 항체의 전하 비균질성을 변경하지 않았음을 나타낸다. 항 PDL1(1 mg/mL)을 20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 5.5의 낮은 이온 강도 완충액에서 0.05% 계면활성제와 함께 배양하였다(표 9). 항 트립타아제(1 mg/mL)을 200 mM 아르기닌 히스티딘 숙시네이트 pH 5.8의 높은 이온 강도 완충액에서 0.05% 계면활성제와 함께 배양하였다(표 10).
표 9: 교반 연구 - 낮은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 PDL1 - 전하 변이체 분석 결과(icIEF)
계면활성제 부류 계면활성제유형 산성
(%)		 주요 피크(%) 염기성
(%)
대조물질 교반되지 않음 26.7 68.7 4.4
비이온성 PS20 24.8 70.2 5.0
Px188 26.0 69.2 4.8
양쪽성 이온성 CHAPS 26.1 69.0 5.0
음이온성 SGH 26.5 68.7 4.9
STH 27.6 67.2 5.2
표 10: 교반 연구 - 낮은 이온 강도의 완충액에서 제제화된 항 트립타아제 - 전하 변이체 분석 결과(icIEF)
계면활성제 부류 계면활성제유형 산성
(%)		 주요
피크(%)		 염기성
(%)
대조물질 교반되지 않음 46.9 50.4 2.6
비이온성 PS20 46.5 50.4 3.1
Px188 47.0 50.4 2.6
양쪽성 이온성 CHAPS 46.8 50.6 2.6
음이온성 SGH 47.3 50.0 2.7
STH 45.2 46.4 8.4*
*예기치 않은 변경 또는 값이며 분석 결과물일 수 있다.
본원의 실시예 1 내지 실시예 3의 결과에 기초하여, 모든 순전하 콜레이트 계면활성제는 24시간 진탕 스트레스 후 0.05%(w/v) 농도에서 가용성 응집체 형성을 방지한다. 음이온성 계면활성제(SGH, STH, SCH 및 SDTH)는 20 mM 히스티딘 아세테이트(HisOAc)와 같은 낮은 이온 강도의 완충액에 비해 200 mM 아르기닌 석시네이트와 같은 높은 이온 강도의 완충액에서 가용성 응집체 형성을 더 잘 방지하는 것으로 보인다. 이와 대조적으로, 양쪽성 이온성 계면활성제 CHAPS는 높거나 낮은 이온 강도에 대한 선호도를 나타내지 않았으며, 이는 이온 강도가 음이온성 콜레이트 계면활성제에서 보이는 차이에서 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 단백질 제제에서 폴리소르베이트 20의 효소적 분해에 미치는 콜레이트 계면활성제의 효과
장기간 보관 시, 폴리소르베이트 20(PS20)은 용액에서 침전될 수 있는 유리 지방산 종(FFA)으로 분해될 수 있으며, 결과적으로 용액 내 단백질에 대한 보호 기능이 저하될 뿐만 아니라 단백질 제제 내에서 또는 재구성 시 형성되는 PS20 관련 미립자의 존재는 바람직하지 않을 수 있다. 상기 분해는 치료적 단백질 제제를 함유하는 PS20의 저장 수명을 제한할 수 있다. 낮은 농도의 콜레이트 계면활성제의 첨가가 PS20 분해를 가속화된 방식으로 모방하는 조건하에서 폴리소르베이트 안정성에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해, PS20을 함유하는 제제에 콜레이트를 스파이크하고, 리파아제를 사용하여 PS20 분해를 강제하고, PS20 분해를 측정하였다.
구체적으로, pH 5.8에서 200 mM 아르기닌 석시네이트, 0.02%(w/v) PS20에서 제제화된 5mg/mL 항 트립타아제 항체를 함유하는 용액을 다양한 농도의 콜레이트 계면활성제와 혼합한 다음, 0.04 단위/mL의 CALB로 스파이킹하고 5°C에서 12시간 동안 배양하였다. 상기 제제 내의 콜레이트의 존재가 PS20이 FFA로 분해되는 것을 방지하거나 형성된 FFA를 가용화하는 경우, 단백질 용액에서 가시적인 FFA 관련 입자가 관찰되지 않아야 한다. 콜레이트가 보호 또는 가용화를 제공하지 않는 경우, 가시적인 FFA 관련 입자는 콜레이트가 첨가되지 않은 단백질 용액과 동일한 정도로 형성되어야 한다.
상기 실험의 결과는 도 3 및 도 4에 제시된다.
결과는 0.5% SCH, SGH 또는 CHAPS의 첨가가 용액에서 가시적인 미립자 형성을 방지하는 반면, 상기 미립자는 각각의 첨가된 계면활성제의 0.02% 내지 0.1%에서 여전히 형성된다는 것을 보여준다(도 3).
PS20의 양은 0.25 mg/mL의 표준 곡선 방법으로 HPLC-ELSD(Hewitt et al., Journal of Chromatography A. 1215 (2008) 156-160)에 의해 대조물질 최대량을 제공하기 위해 출발 물질에서 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 리파아제 처리 후 원형 PS20의 농도는 0.1 mg/mL 미만으로 떨어진다. 이와 대조적으로, CHAPS, SGH 및 STH는 0.1% 내지 0.5%(w/v) 농도에서 용액의 PS20이 분해되지 않도록 보호하였다. 구체적으로, PS20의 시작 농도는 0.25 mg/mL를 약간 초과하는 것으로 측정되었고, 계면활성제를 첨가하지 않은 리파아제 분해 후에는 0.05 mg/mL로 떨어졌다. 0.1% 내지 0.5%(w/v)의 CHAPS의 첨가는 리파아제 처리시 PS20 농도가 약 0.13% 내지 0.17%(w/v)로 유지되도록 하였다. 0.1% 내지 0.5%(w/v)의 SGH의 첨가는 리파아제 처리시 PS20 농도가 약 0.06% 내지 0.13%(w/v)로 유지되도록 하였다. 0.1% 내지 0.5%(w/v)의 STH의 첨가는 리파아제 처리시 PS20 농도가 0.10%의 약간 초과 내지 약 0.16%(w/v)로 유지되도록 하였다.
실시예 5: 제제에서 폴리소르베이트 20의 열적 분해에 미치는 콜레이트 계면활성제의 효과
콜레이트가 PS20 함유 단백질 용액을 안정화할 수 있는지 여부를 추가로 시험하기 위해 PS20이 함유된 단백질 용액에 CHAPS 또는 SGH를 추가하고 용액을 40℃에서 2주 동안 열 스트레스에 노출시켰다. 샘플을 0일(D0), 7일 및 14일에 채취하여 원형 PS20 HPLC-ELSD 정량 방법을 사용하여 시험하였다. 하기의 두 가지 단클론성 항체를 기본 제제로 시험하였다: pH 5.5의 20 mM 아세트산나트륨 중 30 mg/mL의 항 PDL1 및 pH 5.8의 200 mM 아르기닌 숙시네이트 중 항 트립타아제. 항 PDL1 및 항 트립타제 항체를 사용한 시험에 대한 계면활성제 스파이크-인 설정 및 결과가 표 11에 제시된다.
표 11: 항체 용액 내에 공동 제제화된 계면활성제 - 40°C에서 2주 동안 열 스트레스 받음
샘플 조건 PS20 농도의 변화(mg/mL)
항 PDL1(30 mg/mL)
(낮은 이온 강도의 완충액에서)		 항 트립타아제(150 mg/ml)(높은 이온 강도의 완충액에서)
1:1 (0.05:0.05%) PS20:CHAPS 0.008 0.085
1:2 (0.05:0.1%) PS20:SGH 0.027 0.086
PS20 단독 0.028 0.10
PS20의 시작 농도는 0.05%(w/v)이다.
데이터는 CHAPS가 PS20과 함께 공동 제제화될 때 열적 분해로부터 PS20을 보호하는 데 특히 효과적임을 암시한다.

Claims (41)

  1. 단백질 및
    25℃의 수중에서 임계 미셀 농도 (CMC) 값이 2.0 mM 이상 또는 0.2%(w/v) 이상인 하나 이상의 콜레이트 계면활성제
    를 포함하는 단백질 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 항체인 제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체인 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레이트 계면활성제가
    양쪽성 이온성, 비이온성, 음이온성이거나, 또는
    CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), SGH (소듐 글리코콜레이트 수화물), 소듐 타우로콜레이트 수화물 (STH), 소듐 콜레이트 수화물 (SCH), SdTH, SdCH, ScdCH 및 BigCHAP (N,N'-비스-(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드)로부터 선택되는 것인
    제제.
  5. 제4항에 있어서,
    0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 CHAPS
    를 포함하는 제제.
  6. 제5항에 있어서,
    0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 CHAPS
    를 포함하는 제제.
  7. 제4항에 있어서,
    0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 BigCHAP
    를 포함하는 제제.
  8. 제7항에 있어서,
    0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 BigCHAPS
    를 포함하는 제제.
  9. 제4항에 있어서,
    0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 SGH, STH, 또는 SCH
    를 포함하는 제제.
  10. 제9항에 있어서,
    0.025% 내지 0.05%의 농도의 SGH, STH, 또는 SCH
    를 포함하는 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 콜레이트 계면활성제가 25℃의 수중에서 이의 CMC 값보다 낮은 농도로 존재하는 것인 제제.
  12. 제1항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    양쪽성 이온성 또는 비이온성 콜레이트 계면활성제를 포함하고,
    낮은 이온 강도의 제제인
    제제.
  13. 제12항에 있어서,
    50 mM 미만의 염, 40 mM 미만의 염, 30 mM 미만의 염, 또는 25 mM 미만의 염, 예컨대 나트륨, 아르기닌 또는 히스티딘 염
    을 포함하는 제제.
  14. 제1항 내지 제4항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    음이온성 콜레이트 계면활성제를 포함하고,
    높은 이온 강도의 제제인
    제제.
  15. 제14항에 있어서,
    175 mM 이상의 염, 200 mM 이상의 염, 225 mM 이상의 염, 또는 250 mM 이상의 염, 예컨대 나트륨, 아르기닌 또는 히스티딘 염
    을 포함하는 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 용도에 적합한 제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조를 거치지 않은 제제.
  18. 제17항에 있어서, 바로 사용할 수 있는(ready-to-use) 액체 제제인 제제.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 재구성된 동결건조 제제인 제제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 폴리소르베이트, 폴록사머, 플루로닉, 브리쥐(Brij), 또는 알킬글리코시드 계면활성제도 포함하지 않는 제제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 비콜레이트 계면활성제도 포함하지 않는 제제.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    적어도 하나의 콜레이트 계면활성제,
    적어도 하나의 단백질 종,
    적어도 하나의 완충제 종, 및
    적어도 하나의 비계면활성제 안정제 (예컨대, 당, 당 알코올, 아미노산, 펩티드, 염, 또는 다른 단백질)
    로 본질적으로 구성된 제제.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 폴리소르베이트 또는 폴록사머
    를 추가로 포함하는 제제.
  24. 제23항에 있어서,
    폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80
    을 추가로 포함하는 제제.
  25. 제24항에 있어서,
    0.05% 이하 또는 0.01% 이하의 폴리소르베이트 20 또는 80
    을 포함하는 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 콜레이트 계면활성제 및 상기 폴리소르베이트 20 또는 80 이외에 어떠한 계면활성제도 포함하지 않는 제제.
  27. 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및
    0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 CHAPS로 본질적으로 구성된 계면활성제
    를 포함하고,
    임의적으로 완충제, 염, 동결보호제, 또는 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 안정제 중 하나 이상
    을 추가로 포함하는 치료 단백질 제제이며,
    임의적으로
    a. 상기 제제는 이온 강도가 낮고,
    b. 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고/이거나,
    c. 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제인
    치료 단백질 제제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 계면활성제가 0.01% 내지 0.05% 또는 0.025% 내지 0.05%(w/v)의 CHAPS로 본질적으로 구성된 것인 제제.
  29. 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및
    0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 BigCHAPS로 본질적으로 구성된 계면활성제
    를 포함하고,
    임의적으로 완충제, 염, 동결보호제, 또는 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 안정제 중 하나 이상
    을 추가로 포함하는 치료 단백질 제제이며,
    임의적으로
    a. 상기 제제는 이온 강도가 낮고,
    b. 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고/이거나,
    c. 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제인
    치료 단백질 제제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 계면활성제가 0.01 내지 0.05% 또는 0.025 내지 0.05%(w/v)의 BigCHAPS로 본질적으로 구성된 것인 제제.
  31. 적어도 하나의 치료 단백질 종, 및
    0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.025% 이하, 0.02% 이하, 0.01 내지 0.5%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.025% 내지 0.05%의 농도(w/v)의 STH, SGH, 또는 SCH로 본질적으로 구성된 계면활성제
    를 포함하고,
    이온 강도가 높고,
    임의적으로 완충제, 염, 동결보호제, 또는 당, 당 알코올, 아미노산, 또는 다른 단백질 종들 중 하나 이상을 포함하는 안정제 중 하나 이상
    을 추가로 포함하는 치료 단백질 제제이며,
    임의적으로
    a. 상기 적어도 하나의 치료 단백질은 항체이고/이거나,
    b. 상기 제제는 사용 전에 동결건조되지 않은 액체 제제인
    치료 단백질 제제.
  32. 제27항에 있어서, 상기 계면활성제가 0.01 내지 0.05% 또는 0.025 내지 0.05%(w/v)의 STH, SGH, 또는 SCH로 본질적으로 구성된 것인 제제.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 가시적인 응집체를 나타내지 않는 특성,
    b. 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 2% 이하의 고분자량 단백질 응집체를 나타내는 특성,
    c. 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 1% 이하의 고분자량 단백질 응집체를 나타내는 특성,
    d. 실온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반한 후 제제 내 고분자량 단백질 응집체가, 교반되지 않은 대조물질과 비교하여 0.2% 초과만큼 증가하지 않는 특성,
    e. 제제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 경우, 상기 제제 내의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이, 동일한 성분 및 농도를 갖지만 콜레이트는 포함하지 않는 제제보다 40℃에서 2주 보관 후 또는 CALB 리파아제로 처리한 후 더 높은 정도로 손상없이 유지되는 특성
    중 하나 이상을 갖는 제제.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하는 용기.
  35. 제34항에 따른 용기를 포함하는 제조 물품.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 단백질 제제를 제조하는 방법이며,
    상기 단백질을 상기 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제와 혼합하여 콜레이트 함유 수용액을 형성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  37. 수용액에 존재하는 단백질의 응집을 억제하는 방법이며,
    25℃의 수중에서 임계 미셀 농도 (CMC) 값이 약 2 mM 이상 또는 0.2%(w/v)이고 25℃의 수중에서 이의 CMC 값 미만의 농도로 존재하는 적어도 하나의 콜레이트 계면활성제를 상기 수용액에 첨가하는 단계
    를 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 단백질이 항체인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체인 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜레이트 함유 수용액을 동결건조하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레이트 함유 수용액을 동결건조하는 단계를 포함하지 않는 방법.
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