KR20210143253A

KR20210143253A - 안정한 펩티드 제제의 제조 방법

Info

Publication number: KR20210143253A
Application number: KR1020217034137A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 넬슨 브라운; 쿠르트 가드 반 스코이크
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2021-11-26
Also published as: BR112021018325A2; WO2020219391A1; JP2023075249A; AU2020261941A1; MX2021012852A; ECSP21079422A; EP3958838A1; CO2021014034A2; IL286426A; AR118690A1; AU2020261941B2; TW202108599A; TWI771669B; CL2021002690A1; JP7245926B2; JP2022529614A; EA202192475A1; SG11202110413YA; CN113727700A; CA3134757A1

Abstract

본 발명은 펩티드를 함유하는 분말 제제를 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 글루카곤 또는 글루카곤 유사체를 함유하는 분말 제제를 제조하는 개선된 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 분말 제제는 비강 투여에 적합하다.

Description

안정한 펩티드 제제의 제조 방법

본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 펩티드를 함유하는 분말 제제를 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 글루카곤 또는 글루카곤 유사체를 함유하는 분말 제제를 제조하는 개선된 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 분말 제제는 비강 투여에 적합하다.

펩티드는 제조 과정 동안 및 후에 물리적 불안정성, 예컨대 응집을 일으키기 쉽다. 응집은 여러 상이한 메카니즘에 의해 발생하는 복잡한 과정이다. 응집은 전형적으로 소형 및 가용성 응집체를 형성하는 몇몇 펩티드 또는 단백질의 핵형성에 의해 유도될 수 있고; 이들은 이어서 보다 큰 불용성 응집체의 후속 성장을 위한 핵형성 초점으로서 작용한다. 핵형성-성장 과정은 시간, 온도, 단백질 농도 및 다른 파라미터에 따라 증가할 수 있다. 제조 동안, 단백질은 한외여과, 친화성 크로마토그래피, 선택적 흡수 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 동결건조, 투석, 및 침전 또는 "염석"과 같은 다양한 수단을 사용하여 정제 및 농축된다. 이러한 농축 공정은 응집으로 이어질 수 있다 (Maggio, BioProcess International 2008; 6(10): 58-65). 이들 응집체의 제거 또는 가용화는 비용이 많이 들 수 있고 전체 생성물 수율을 손상시킬 수 있는 추가의 공정 단계를 필요로 한다. 응집의 효과는 물질의 손실, 감소된 효능, 변경된 약동학, 감소된 안정성 및 제품 보관 수명, 및 원치 않는 면역원성의 유도를 포함할 수 있다.

응집은 특히 고농도 용액에 대한 현재의 경향이 단백질-단백질 상호작용의 가능성을 증가시키고, 이는 다시 응집을 촉진하기 때문에 생물제약 제조자의 주요 문제가 되었다 (Maggio, BioProcess International 2008; 6(10): 58-65). pH, 완충제 조건, 이온 강도의 조정, 및/또는 다른 부형제, 예컨대 시클로덱스트린의 첨가를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 펩티드의 응집을 제한하는 다양한 접근법이 연구되었다.

글루카곤은 수용액에서 응집되는 그의 경향에 대해 공지되어 있으며 (Pedersen JS., J Diabetes Sci Technol. 2010; 4(6): 1357-1367; Beaven et al., The European J. Biochem. 1969; 11(1): 37-42; Matilainen et al., European J. of Pharmaceutical Sciences 2009; (36): 412-420), 이는 글루카곤 분말 제제의 제조 동안 문제를 야기할 수 있다. 비강 투여에 적합한 글루카곤 분말 제제를 제조하는 이전 방법은 WO2016/133863에 개시되어 있다.

펩티드 분말 제제, 특히 글루카곤 또는 글루카곤 유사체 분말 제제를 제조하는 대안적 방법에 대한 필요가 존재한다. 특히, 수용액에서 펩티드의 응집을 감소 또는 제거하는 방법이 필요하다. 응집을 감소시키거나 또는 바람직하게는 제거함으로써, 최종 분말 제제는 매우 높은 백분율의 활성 펩티드를 보유할 것이며, 이는 매우 유리하다. 바람직하게는, 방법은 건조 전의 연장된 기간, 예를 들어 최대 24 시간 동안 물리적으로 및 화학적으로 안정한 수용액을 생성한다. 이러한 확장된 안정성은 공정을 대규모 제조에 훨씬 더 적용가능하게 한다. 또한, 긴 저장-수명, 바람직하게는 약 최대 24 개월의 저장-수명을 갖는 최종 분말 제제를 생성하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.

따라서, 본 발명은 분말 제제의 제조 동안 펩티드의 응집을 감소시키는 개선되고 비용 효과적인 방법을 제공한다. 이 방법은 이중 여과 단계를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 이러한 펩티드 중 하나는 글루카곤 또는 글루카곤 유사체이다. 본 방법에 따라 제조된 분말 제제는 비강 투여에 특히 적합하다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 펩티드 분말 제제를 제조하는 방법이 제공된다. 이 방법은

a. 수성 담체 중에서 산, 인지질 계면활성제 및 시클로덱스트린의 제1 혼합물을 형성하는 단계;

b. 제1 혼합물을 제1 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계;

c. 펩티드를 제1 여과 생성물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 제2 혼합물을 제2 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계; 및

d. 제2 여과 생성물을 건조시켜 고체 제제를 형성하고, 고체 제제를 가공하여 최종 분말 제제를 생성하는 단계

를 포함한다.

한 실시양태에서, 펩티드는 글루카곤 또는 글루카곤 유사체이다. 특히, 이는 글루카곤이다.

한 실시양태에서, 산은 시트르산 또는 아세트산이다. 특히, 이는 아세트산이다. 보다 특히, 아세트산은 1 M의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 계면활성제, 시클로덱스트린 및 펩티드는 함께 제2 혼합물의 약 1.5 중량% 내지 약 3 중량%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이들은 제2 혼합물의 약 2 중량%를 구성한다. 추가 실시양태에서, 이들은 제2 혼합물의 약 2.5 중량%를 구성한다.

한 실시양태에서, 계면활성제는 도데실포스포콜린 (DPC), 디데실포스파티딜콜린 (DDPC), 리소라우로일포스파티딜콜린 (LLPC), 디옥타노일포스파티딜콜린 (D8PC), 또는 디라우로일포스파티딜글리세롤 (DLPG)이다. 특히, 계면활성제는 DPC이다.

한 실시양태에서, 시클로덱스트린은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, 히드록시프로필 β-시클로덱스트린, 또는 γ-시클로덱스트린이다. 특히, 시클로덱스트린은 β-시클로덱스트린이다.

한 실시양태에서, 최종 분말 제제 중 펩티드의 98 % 초과는 역상-HPLC에 의해 측정 시 비-응집된 펩티드이다. 바람직하게는, 펩티드의 99 % 초과가 비-응집된 펩티드이다. 보다 바람직하게는, 펩티드의 100 %가 비-응집된 펩티드이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면,

a. 수성 담체 중에서 인지질 계면활성제 및 시클로덱스트린의 제1 혼합물을 형성하는 단계;

를 포함하는, 펩티드 분말 제제를 제조하는 방법이 제공된다.

한 실시양태에서, 계면활성제는 DPC, DDPC, LLPC, D8PC 또는 DLPG이다. 특히, 계면활성제는 DPC이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라,

a. 수성 담체 중에서 아세트산, DPC 및 β-시클로덱스트린의 제1 혼합물을 형성하는 단계;

c. 글루카곤을 제1 여과 생성물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 제2 혼합물을 제2 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계; 및

를 포함하는, 글루카곤 분말 제제를 제조하는 방법이 제공된다.

한 실시양태에서, 글루카곤, DPC 및 β-시클로덱스트린은 함께 제2 혼합물의 약 1.5 중량% 내지 약 3 중량%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이들은 제2 혼합물의 약 2 중량%를 구성한다. 추가 실시양태에서, 이들은 제2 혼합물의 약 2.5 중량%를 구성한다.

한 실시양태에서, 아세트산의 농도는 1 M이다.

한 실시양태에서, 역상-HPLC에 의해 측정 시 최종 분말 제제 중 글루카곤의 98 % 초과가 비-응집된 글루카곤이다. 바람직하게는, 글루카곤의 99 % 초과가 비-응집된 글루카곤이다. 보다 바람직하게는, 글루카곤의 100 %가 비-응집된 글루카곤이다.

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 분말 제제를 추가로 제공한다.

구체적 실시양태에서, 제2 여과 생성물의 건조는 동결-건조 (동결건조) 또는 분무-건조에 의해 수행될 수 있다.

구체적 실시양태에서, 제1 및 제2 여과 단계 둘 다에서의 필터 막은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE, 테플론), 폴리비닐 클로라이드, 폴리에테르술폰, 또는 cGMP 제조 환경에서 사용하기에 적합한 다른 필터 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 필터 막은 PVDF를 포함한다.

구체적 실시양태에서, 제1 및 제2 여과 단계 둘 다에서의 필터 막은 약 0.45 μm의 세공 크기를 갖는 막이다. 바람직한 실시양태에서, 필터 막은 0.45 μm의 세공 크기를 갖는 PVDF 막이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 동안 용액의 pH는 2 내지 3으로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 용액 상은 15 내지 30 ℃, 바람직하게는 18 내지 25 ℃, 보다 바람직하게는 약 20 ℃의 온도에서 수행된다.

본 발명의 방법은 분말 제제의 제조 동안 응집하는 경향이 있는 펩티드에 사용될 수 있다. 특히, 방법은 아밀린, 아밀린 유사체, 재조합 인간 인자 VIII (rfVII), 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP), 칼시토닌, GLP-1 유사체, GLP-1-GLP 이중 효능제, GIP 효능제, 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), 옥타펩티드 CCR5 억제제 D-Ala-펩티드 T-아미드, 재조합 인간 인슐린, 인슐린 유사체, PTH 1-31 시클릭 펩티드 유사체, 인터페론-β, 인터페론 β-1a 및 β-1b, 인터류킨-2 (IL-2), 에리트로포레틴 (EPO), 프람린티드 아세테이트 및 효소, 예컨대 우로키나제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 펩티드에 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 방법은 글루카곤 분말 제제를 제조하는데 사용될 수 있다. 글루카곤은 병원 환경 밖 및 내 둘 다에서 중증 저혈당증에 대한 매우 효과적인 치료이다. 글루카곤은 주사에 의한 투여 직전에 희석제와 혼합되어야 하는 분말 제제로서 이용가능하다. 글루카곤의 액체 제제가 또한 공지되어 있다 (Pontiroli et al., Br Med J (Clin Res Ed) 1983; 287: 462-463). 중증 저혈당증의 치료를 위한 비강 투여용 글루카곤 분말이 개발되었고, WO2016/133863에 기재되어 있으며, 이는 최근 미국 및 유럽에서 명칭 바크시미 (Baqsimi)^TM로 승인되었다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 글루카곤 또는 글루카곤 유사체 제제는 비강 투여에 특히 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 제제는 하기 중 하나 이상을 갖는다:

ㆍ 폐에 도달할 수 있는 작은 입자의 낮은 비율

ㆍ 단일 비공 내로의 단일 용량으로서 치료 효과를 달성하는데 필요한 약물의 총 용량을 제공하기에 적절한 약물 함량

ㆍ 수십 밀리그램의 총 용량, 또는 전달 장치에 의해 허용되는 최대치를 전달하기에 적절한 약물 함량

ㆍ 알레르기 또는 감기와 연관될 수 있는 비강 울혈의 존재에도 불구하고 효과적인 적절한 약물 함량 및 흡수 특징

ㆍ 연장된 기간, 바람직하게는 적어도 24 개월 동안 주위 조건 하에 저장 동안 안정성

ㆍ 우수한 안전성 및 내약성 프로파일.

본원에 사용된 용어 "응집"은 소형 올리고머 전구체, 예컨대 펩티드의 시드 핵, 핵형성 초점, 피브릴 또는 겔의 축적, 뭉침, 응집, 이량체화, 중합 또는 형성을 지칭한다. 응집체 크기는 가용성 이량체 및 다른 다량체 (겉보기 구상 직경이 대략 5-10 nm) 내지 비가시적인 및 가시적인 미립자 (겉보기 구상 직경이 대략 20-50 μm)로서 확인된 보다 큰 불용성 종의 범위이다. 가용성 응집체 군으로부터, 고분자량 종과 같은 보다 큰 것은 유해한 임상 결과를 가질 수 있는 면역원성 반응을 도출할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "시드 핵" 또는 "핵형성 초점"은 보다 큰 응집체가 이로부터 형성되는 최소 응집체 크기를 지칭한다.

역상 HPLC를 사용하여 최종 분말 제제 중 비-응집된 펩티드의 양을 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 조건, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 것을 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "글루카곤"은 하기 서열의 폴리펩티드를 지칭한다:

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr (서열 1).

글루카곤은 화학적으로 합성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 천연 공급원으로부터 추출될 수 있다. 용어 "글루카곤 유사체"는 생체내 혈액 글루코스의 증가를 자극하는 능력을 보유하는 이 서열의 변이체를 지칭한다.

천연 서열의 1개의 아미노산이 알라닌으로 대체된 글루카곤 유사체 뿐만 아니라 다중 치환을 갖는 유사체의 예는 문헌 [Chabenne et al., Molecular Metabolism 2014; 3: 293-300]에 개시되어 있다. 3개의 아미노산이 변형되어 증진된 생물학적 활성을 갖는 글루카곤 유사체를 생성하는 예시적인 유사체는 [Lys^17,18, G1u²¹] 글루카곤이다. 질랜드 파마 (Zealand Pharma)는 예를 들어 미국 특허 공개 20140080757, 2014001733, 20130316941, 20130157935, 20130157929, 20120178670, 20110293586, 20110286982, 20110286981, 및 20100204105에 다수의 글루카곤 유사체를 개시하였다. 이들 유사체는 글루카곤 수용체보다 GLP 수용체에 대해 더 큰 결합 친화도를 갖지만, 그럼에도 불구하고 글루카곤의 활성을 보유하는 것으로 보고되어 있다. 질랜드 파마는 또한 ZP4207로 지정된 저혈당증의 치료를 위한 글루카곤 유사체의 임상 시험을 시작하였다. 미국 특허 공개 20130053310은 저혈당증의 치료에 유용한 다른 글루카곤 유사체를 개시한다.

인지질 계면활성제는 비강 점막을 포함하는 인체 내의 세포 및 조직의 일부인 생물학적 막의 편재성 성분이다. 세포 내의 가장 보편적인 인지질 계면활성제는 포스파티딜콜린 및 포스포콜린 (PC)이지만, 포스파티딜글리세롤 (PG)은 생물학적 막의 중요한 성분이다. 아실 기 중 하나의 제거에 의해 디아실 PC 또는 PG로부터 유래된 리소인지질이 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 예시적인 인지질 계면활성제는 도데실포스포콜린 (DPC), 디데실포스파티딜콜린 (DDPC 또는 1,2-디데실-sn-글리세로-3-포스포콜린), 리소라우로일포스파티딜콜린 (LLPC 또는 1-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 디옥타노일포스파티딜콜린 (D8PC 또는 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 및 디라우로일포스파티딜글리세롤 (DLPG 또는 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포(1'-rac-글리세롤))이다.

바람직한 인지질 계면활성제는 분말 제제의 제조 동안 사용되는 농도에서 이중층보다는 미셀을 형성하는 것들이다. 이는 DPC, DDPC, LLPC 및 D8PC를 포함하지만, DLPG는 포함하지 않는다. DPC가 가장 바람직하다.

본 발명의 구체적 실시양태에서, 단일 유형의 인지질 계면활성제가 사용된다. 다른 실시양태에서, 인지질 계면활성제 성분은, 예를 들어 상기 확인된 계면활성제 중 임의의 2, 3 또는 4종의 조합을 포함한 인지질 계면활성제의 혼합물로부터 제조될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "시클로덱스트린"은 원추 형상을 생성하는 고리 내에 6, 7 또는 8개의 글루코스 잔기를 함유하는 시클로덱스트린, 즉:

α (알파)-시클로덱스트린: 6-원 당 고리 분자

β (베타)-시클로덱스트린: 7-원 당 고리 분자

γ (감마)-시클로덱스트린: 8-원 당 고리 분자

를 지칭한다.

임상 시험에서 노보 노르디스크 (Novo Nordisk)의 분말 제제 (하이포곤 (HypoGon)® 비강)에 α-CD를 사용하였다 (Stenniger et al., Diabetologia 1993; 36: 931-935; Rosenfalck AM, et al., Diabetes Res Clin Pract 1992; 17: 43-50). α-CD의 수용해도는 약 5 중량%인 것으로 보고된다.

2종의 다른 시클로덱스트린, 즉 α-CD의 수용해도보다 낮은 수용해도를 갖는 시클로덱스트린 (β-CD, 1.85 중량%) 및 α-CD보다 높은 수용해도를 갖는 시클로덱스트린 (HP-β-CD)이 또한 본 발명에 사용하기에 적합하며, 물에 자유롭게 가용성인 γ-시클로덱스트린도 마찬가지이다.

제제 중 시클로덱스트린은 충전제로서 작용하고, 또한 비강 점막 표면에 부착하고, 글루카곤의 흡수를 보조한다. 비공으로의 전달시, 주요 성분 (90 중량% 내지 70 중량%), 즉 시클로덱스트린은 분말이 점막 표면에 부착하는 것을 돕는다.

시클로덱스트린은 개별적으로, 또는 임의의 2종 이상의 시클로덱스트린의 혼합물로서 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 방법에 따라 제조된 글루카곤 분말 제제는 글루카곤, DPC 및 β-시클로덱스트린을 포함한다. 바람직하게는, 분말 제제는 글루카곤, DPC 및 β-시클로덱스트린을 10:10:80 (글루카곤: DPC: β-시클로덱스트린)의 중량비로 포함한다. 바람직하게는, 글루카곤은 단일 비공에서 단일 용량으로 투여될 때 효과적인 치료량으로 존재한다. 한 실시양태에서, 글루카곤의 용량은 약 3 mg이다.

혼합은 정적 및 동적 혼합을 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 동적 혼합은, 샤프트에 부착되고 모터에 의해 회전되는, 액체 내로 삽입된 블레이드의 사용에 의해 수행될 수 있다. 정적 혼합은 정적 혼합기 내부의 구불구불한 경로를 통해 액체를 유동시킴으로써 수행될 수 있다. 고속 혼합 조건 하에서의 혼합 동안 공기-물 계면의 존재는 발포를 초래할 수 있다. 고속 혼합은 또한 결국 전단 응력으로 인해 단백질의 탈안정화를 초래할 수 있다. 발포를 최소화하고, 바람직하게는 제거하기 위해, 저속 혼합 조건이 바람직하다. 동적 혼합의 경우에, 속도는 교반기의 분당 회전수 (rpm)에 의해 결정된다. 바람직한 rpm 값은 50 내지 300, 보다 바람직하게는 50 내지 250, 보다 더 50 내지 100이다.

제2 여과 생성물을 건조시켜 용매를 제거하고 고체 생성물을 남긴다. 건조는 동결-건조, 분무-건조, 트레이-건조 또는 다른 기술에 의해 수행될 수 있다. 생성물의 거시적 물리적 특징은 건조 기술에 따라 달라질 것이고, 동결 건조로부터의 박편상 고체 또는 건조된 고체 케이크의 형태일 수 있다.

과도한 수분 함량을 갖는 분말은 점착성일 수 있고, 덩어리를 형성하여 투여 장치의 충전을 위해 조작하기 어려운 분말을 생성할 수 있다. 중요하게는, 잔류 수분 함량의 수준은 안정성에 직접적인 영향을 미친다. 벌크 분말 중 5 % 초과의 잔류 수분 함량 수준은 5 % 미만의 잔류 수분 함량을 갖는 분말과 비교하여 감소된 안정성을 초래한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 제조된 분말 제제는 바람직하게는 5 % 미만의 잔류 수분 함량을 갖는다.

특정한 실시양태에서, 본 발명에 따라 제조된 분말 제제 중 산의 양은 10 % w/w 미만, 바람직하게는 6 % w/w 미만이다.

비강 투여에 적합한 분말은 비강 배출 장치로의 충전을 가능하게 하는 적절한 유동성을 허용하는 물리적 특징을 필요로 한다. 유동성은 입자 크기, 형상, 밀도, 표면 텍스쳐, 표면적, 밀도, 응집, 접착, 탄성, 다공도, 흡습성 및 파쇄성을 포함하는 다양한 파라미터에 의해 결정된다.

적절한 입자 크기 및 유동성 특징을 갖는 분말은 너무 작거나 너무 큰 입자를 제거하기 위해 벌크 분말을 가공함으로써 제조될 수 있다. 벌크 분말을 가공하여 너무 작거나 너무 큰 입자를 제거하는 방법은 벌크 분말을 밀링하여 더 큰 입자를 부수고 체질하여 원하는 입자 크기 범위의 입자를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 스로-액션 (throw-action) 체질, 수평 체질, 탭핑 체질, 초음파 체질 및 공기 순환 제트 체질을 포함하는 다양한 체질 방법이 수행될 수 있다. 체는 고정된 공칭 구멍의 단일 체로서 사용될 수 있거나, 또는 벌크 분말은 원하는 입자 크기 분포를 얻기 위해 점진적으로 더 작은 구멍의 일련의 체를 통해 가공될 수 있다. 체는 25 내지 1000 μm 범위의 공칭 구멍을 갖는 직조 와이어 메쉬 체일 수 있다.

실시예

실시예 1 - 글루카곤 분말 제제의 제조 - 이중 여과 단계

DPC를 교반을 통해 1 M 아세트산 용액에 용해시켰다. 이어서, β-시클로덱스트린을 DPC 용액에 첨가하고, 용해될 때까지 교반하여 제1 용액을 형성한다. 제1 용액을 0.45 μm PVDF 필터를 통해 제1 여과 단계에 적용하였다. 여과 생성물 (부형제 용액)을 새로운 깨끗한 탱크에 수집하고, 탱크의 온도를 20 ℃ ± 2 ℃로 조정하여 용액 중 물질의 용해도를 보장하였다. 탱크 내의 표적 온도가 달성되면, 용액을 교반하면서 글루카곤 또는 글루카곤 유사체를 탱크에 첨가한다. 글루카곤이 용해되는 것으로 보이자마자, (시각적 확인을 통해) 교반을 즉시 종결하였다. 이어서, 글루카곤 용액을 0.45 μm 제2 PVDF 필터를 통해 여과시켰고, 필터 물질을 깨끗한 제2 탱크에 수집하였다. 이 제2 필터 물질 (제2 여과 생성물)은 97.5 % w/w 1 M 수성 아세트산, 0.25 % w/w DPC, 2 % w/w β-시클로덱스트린, 및 0.25 % w/w 글루카곤 (총 2.5 % w/w 고체 (중량 기준))을 함유하였다. 이어서, 물질을 동결건조시키고, 치밀화 단계를 거쳐 최종 글루카곤 분말 제제를 제조한다.

비교 실시예 - 글루카곤 분말 제제의 제조 - 단일 여과 단계

DPC를 교반을 통해 1 M 아세트산 용액 (8 리터)에 용해시켰다. 용액을 교반하면서 글루카곤을 첨가하였다. 글루카곤이 용해되는 것으로 보이자마자, (시각적 확인을 통해) β-시클로덱스트린을 교반하면서 첨가하였다. 모든 첨가된 고체가 용해된 것으로 보이면, 용액을 0.45 μm PVDF 필터를 통해 여과하였다. 단일 필터 막의 막힘 또는 오손이 발생하면 다중 필터의 사용이 필요할 수 있다. 여과된 물질은 0.3 % w/w DPC, 2.4 % w/w β-시클로덱스트린 및 0.3 % w/w 글루카곤 (총 3 % w/w 고체)을 함유하였다. 여과된 물질을 수집하고, 동결건조시켰다.

1차 여과 후 부형제 용액의 안정성

부형제 용액 (아세트산, DPC 및 β-시클로덱스트린)을 본질적으로 실시예 1에 제시된 바와 같이 2.5 % w/w 고체 농도로 제조하였다. 용액을 연구 기간 동안 25 ℃에서 유지하였다. 데이터는 표 1에 요약되어 있다. 22-시간에 걸쳐 함량에서 유의한 변화가 발생하지 않았고, 질량 균형이 확인되었다.

표 1.

글루카곤을 함유하는 수용액의 안정성

용액 검정

글루카곤 용액을 본질적으로 실시예 1에 제시된 바와 같이 제조하였다 (제2 여과 생성물). 제조 후, 글루카곤 용액을 교반 없이 정치시켰다. 용액 샘플을 미리 결정된 시간에 취하고, 검정 전에 0.45 μm 필터에 통과시켰다. 응집체로 변형된 임의의 글루카곤을 이 여과 단계에 의해 제거하고, 따라서 이 검정은 응집 정도의 추정치를 제공한다.

형광 검정

형광 방법의 기초는 글루카곤 분자 내의 단일 트립토판 잔기의 방출 파장의 이동을 이용하는 것이다 (Pedersen JS., J Diabetes Sci Technol. 2010; 4(6): 1357-1367). 글루카곤 분자가 그의 입체형태를 랜덤 코일 또는 알파 나선에서 응집된 형태로 변화시킴에 따라, 트립토판 분자의 국소 환경은 방출 스펙트럼의 청색-이동의 형태로 변화한다. 따라서, 섬유 광학 커플링된 후방 산란 형광 프로브를 사용하여 시간 경과에 따른 글루카곤의 방출 형광 신호의 파장의 변화를 모니터링함으로써, 응집되지 않은 글루카곤의 방출 피크 대 분자의 응집된 형태의 비를 계산하는 것이 실시간 기준으로 응집을 모니터링하는 도구로서 사용될 수 있다.

글루카곤 용액을 본질적으로 실시예 1에 제시된 바와 같이 제조하였다 (제2 여과 생성물). 형광 프로브를 사용하여 시간에 따른 방출 스펙트럼의 변화를 모니터링하였다. 용액을 교반하지 않고, 실온에서 24 시간 동안 모니터링하였다.

소규모 실험 (100 mL)에서, 이러한 24 시간 내에 글루카곤 형광 비의 변화가 관찰되지 않았다.

추가 실험에서, 글루카곤 용액을 본질적으로 실시예 1에 제시된 바와 같이 제조하고 (제2 여과 생성물), 상이한 온도에서 유지하였다. 비교 목적으로, 이를 제2 여과 단계를 거치지 않은 글루카곤 용액과 비교하였다. 결과를 표 2에 요약하였다.

표 2.

글루카곤 용액 여과 및 유지 온도 연구

연구 결과는 글루카곤 용액이 제2 여과 단계를 거치고 5 ℃ 또는 20 ℃에서 교반 없이 유지될 때, 시스템으로부터 응집에 의해 글루카곤이 손실되지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 용액이 여과되지 않은 경우, 이는 24 시간에 걸쳐 그의 글루카곤 함량의 대략 8 %를 상실한다.

본질적으로 실시예 1에 제시된 바와 같이 제조된 글루카곤 용액의 화학적 안정성은 또한 본질적으로 하기 제시된 바와 같은 역상 HPLC를 사용하여 시험될 수 있다.

100 리터만큼 많은 양의 이중 여과 (2.5 % w/w 고체)를 사용하여 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 제조에서, 놀랍게도, 제2 여과 단계 후에 수집된 용액은 임의의 검출가능한 응집 없이 24 시간까지 물리적으로 및 화학적으로 안정한 것으로 밝혀졌다 (상기 제시된 방법 중 하나 이상에 의해 결정됨). 반면에, 단지 1회의 여과 단계에 적용된 글루카곤 용액 물질 (비교 실시예 - 8 리터 및 3 % w/w 고체)은 글루카곤의 첨가 약 15 분 내에 가시적 응집을 나타내었다.

비강 글루카곤 분말 제제의 HPLC 화학적 안정성 분석

실시예 1에 따라 제조된 비강 글루카곤 분말 제제의 외부의 잘 정의된 참조 표준물에 대한 안정성을 상용 RP-HPLC 기술을 사용하여 결정하였다. 간략하게, HPLC 역상 칼럼 (C18, 3.0 mm i.d. x 150 mm, 2.6- μm 입자 크기)을 214 nm의 UV 검출 파장을 갖는 인산칼륨 완충제:아세토니트릴 이동상과 함께 이용하였다. 구배 이동상 조성을 54 %, 80:20 150 mM 인산칼륨 완충제:아세토니트릴에서 3 분 유지로 개시하고, 8 분에 걸쳐 70 %, 60:40 인산칼륨 완충제:아세토니트릴 조성으로 종결시켰다.

본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따라 제조된 비강 글루카곤 분말 제제 (100 L)의 3개의 상이한 배치로부터의 대표적인 샘플은 실험 정밀도 내에서 약 100 %의 글루카곤 활성을 보유하였다.

비강 글루카곤 분말 제제의 효능 생물검정

글루카곤에 대한 세포-표면 수용체 및 CRE-루시페라제 리포터 유전자 둘 다를 안정하게 발현하도록 조작된 배아 신장 세포주 HEK293을 이용하여 최종 비강 글루카곤 제제 생성물의 상대적 효력을 결정하였다. 이 세포-기반 검정에서, CRE-프로모터로부터의 루시페라제의 전사는 내인성 시클릭 AMP (cAMP) 신호전달 경로를 따라 반응을 촉발함으로써 조절된다. 따라서, 세포 표면 수용체에 대한 글루카곤의 결합은 cAMP 생산을 유도한다. 이는 cAMP 반응성 요소 결합 단백질 (CREB)의 인산화 및 활성화로 이어져, CRE-루시페라제 리포터 유전자에 의한 루시페라제의 발현을 초래한다. 루시페라제 생산은 루시페린 기질을 반응 혼합물에 첨가하고 발광측정기를 사용하여 루시페린 산화를 정량화함으로써 결정된다. 발광 신호는 세포를 유도하는데 사용된 글루카곤의 양에 정비례하는 존재하는 루시페라제의 양에 비례한다. 시험 샘플의 상대 효력은 참조 표준물의 전형적인 8-포인트 용량-반응 곡선을 샘플의 것과 비교함으로써 결정된다. 반응 데이터를 4-파라미터 로지스틱 모델에 피팅하여 참조 표준물의 EC₅₀ 및 샘플의 EC₅₀을 결정하였으며, 여기서 이들 EC₅₀ 값 사이의 비는 시험 물질의 상대적 효력을 나타낸다.

HEK293 세포를 성장 배지 (1.0 mg/mL 제네테신 (Genetecin)® 및 125 μg/ml 히그로마이신 B를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS). 페니실린 및 스트렙토마이신은 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신의 최종 농도로 첨가될 수 있음) 중 96-웰 세포 배양 플레이트 상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 30 분 내지 2.5 시간 동안 부착되도록 하였다. 성장 배지를 세척하고, 0.5 % 소 혈청 알부민, 1 x 페니실린/스트렙토마이신, 및 0.00032 ng/mL 내지 25 ng/mL 범위의 농도의 글루카곤을 함유하는 DMEM 중 0.25 % FBS로 이루어진 검정 배지로 대체하였다. 플레이트를 37 ℃에서 4.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 웰당 100 μL의 스테디글로 (SteadyGlo)®를 첨가한 다음, 웰을 주위 온도에서 30 분 동안 연속적으로 교반하였다. 플레이트를 발광측정기 상에서 판독하였다.

본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 세포-기반 검정을 통해 측정된 글루카곤의 퍼센트 상대 효력은 94 % 내지 102 %인 것으로 밝혀졌으며, 이는 실시예 1에 따른 제제 (100 L)의 제조 동안 응집이 발생하지 않았음을 입증한다. 이들 결과는 동일한 참조 표준물을 사용한 글루카곤 화학적 기반 검정 결과와 대등하였다.

비강 글루카곤 분말 제제의 불순물 분석

비강 글루카곤 분말 제제 내의 잠재적인 불순물의 확인 및 정량화는 상용 RP-HPLC 기술을 사용하여 수행된다. 불순물은 제조 공정 또는 최종 제제 중 물질의 화학적 분해로 인해 발생할 수 있다. 방법은 USP41-NF36에 요약된 조건에 기초한다. 이러한 분석은 글루카곤 분말 제제의 안정성의 지표를 제공한다.

본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 배치 방출에서의 총 불순물 수준은 약 0.4 % 내지 약 0.56 % 범위이다. 추가로, 실시예 1에 따라 제조된 비강 글루카곤 분말 제제에 대해 제안된 저장 수명 규격 분석은 최대 약 24개월 동안 약 20 % (a/a) 이하의 총 불순물 수준을 갖는다. 놀랍게도, 비강 글루카곤 분말 제제는, 현재 USP 논문 (USP41-NF36)이 총 불순물 및 관련 화합물의 31 % (a/a) 이하가 존재하는 한계를 명시하는 시장의 현재 글루카곤 응급 키트에 대해 권장된 것보다 상당히 낮은 총 불순물 수준을 갖는다.

표 3.

비강 글루카곤 분말 제제 화학적 안정성, 생물검정 및 불순물 분석.

비강 글루카곤 분말 제제의 임상 효능

실시예 1의 2단계 여과 공정을 사용한 대규모 품질 제어 제조 배치로부터의 비강 글루카곤 분말 제제의 임상 효능을 NCT03339453 임상 시험 연구 (Suico et al., EASD-2008; 초록 150)에서 연구하였다. 간략하게, 비강 글루카곤 분말 제제 (NG)의 효능 및 안전성을 제어된 인슐린-초래 저혈당증 동안 제1형 당뇨병을 앓는 성인 환자에서 근육내 글루카곤 (IMG)과 비교하였다. 비강 글루카곤 분말 제제를 3.0 mg의 용량으로 한쪽 비공으로 전달하기 위한 장치 내로 패키징하였다.

표 4에 나타낸 결과는 환자의 100 %가 NG 또는 IMG로 성공적으로 치료되고, NG 활성이 본 연구에서 IMG 활성에 필적함을 입증한다.

표 4.

(서열 1)
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Method for Preparing Stable Peptide Formulations <130> X21945 <150> 62/839246 <151> 2019-04-26 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25

Claims

a. 수성 담체 중에서 산, 인지질 계면활성제 및 시클로덱스트린의 제1 혼합물을 형성하는 단계;
b. 제1 혼합물을 제1 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계;
c. 펩티드를 제1 여과 생성물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 제2 혼합물을 제2 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계; 및
d. 제2 여과 생성물을 건조시켜 고체 제제를 형성하고, 고체 제제를 가공하여 최종 분말 제제를 생성하는 단계
를 포함하는, 펩티드 분말 제제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 펩티드가 글루카곤 또는 글루카곤 유사체인 방법.
제2항에 있어서, 펩티드가 글루카곤인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제, 시클로덱스트린 및 펩티드가 함께 제2 혼합물의 약 1.5 중량% 내지 약 3 중량%를 구성하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 계면활성제, 시클로덱스트린 및 펩티드가 함께 제2 혼합물의 약 2 중량%를 구성하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 계면활성제, 시클로덱스트린 및 펩티드가 함께 제2 혼합물의 약 2.5 중량%를 구성하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 여과 단계 둘 다에서의 막이 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 여과 단계 둘 다에서의 막이 약 0.45 μm의 세공 크기를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 산이 시트르산 또는 아세트산인 방법.
제9항에 있어서, 산이 아세트산인 방법.
제10항에 있어서, 아세트산의 농도가 1 M인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 도데실포스포콜린, 디데실포스파티딜콜린, 리소라우로일포스파티딜콜린, 디옥타노일포스파티딜콜린, 또는 디라우로일포스파티딜글리세롤인 방법.
제12항에 있어서, 계면활성제가 도데실포스포콜린인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 시클로덱스트린이 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, 히드록시프로필 β-시클로덱스트린, 또는 γ-시클로덱스트린인 방법.
제14항에 있어서, 시클로덱스트린이 β-시클로덱스트린인 방법.
a. 수성 담체 중에서 인지질 계면활성제 및 시클로덱스트린의 제1 혼합물을 형성하는 단계;
b. 제1 혼합물을 제1 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계;
c. 펩티드를 제1 여과 생성물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 제2 혼합물을 제2 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 단계; 및
d. 제2 여과 생성물을 건조시켜 고체 제제를 형성하고, 고체 제제를 가공하여 최종 분말 제제를 생성하는 단계
를 포함하는, 펩티드 분말 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 분말 제제 중 펩티드의 98 % 초과가 역상-HPLC에 의해 측정시 비-응집된 펩티드인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 분말 제제.
a. 수성 담체 중에서 아세트산, 도데실포스포콜린 및 β-시클로덱스트린의 제1 혼합물을 형성하는 단계;
b. 제1 혼합물을 제1 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계;
c. 글루카곤을 제1 여과 생성물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 제2 혼합물을 제2 여과 단계에 적용하며, 여기서 필터는 약 0.4 μm 내지 약 0.5 μm의 세공 크기를 갖는 막을 포함하는 것인 단계; 및
d. 제2 여과 생성물을 건조시켜 고체 제제를 형성하고, 고체 제제를 가공하여 최종 분말 제제를 생성하는 단계
를 포함하는, 글루카곤 분말 제제의 제조 방법.
제19항에 있어서, 계면활성제, 시클로덱스트린 및 펩티드가 함께 제2 혼합물의 약 2.5 중량%를 구성하는 것인 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 제1 및 제2 여과 단계 둘 다에서의 막이 PVDF 막을 포함하는 것인 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 여과 단계 둘 다에서 막이 약 0.45 μm의 세공 크기를 포함하는 것인 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아세트산이 1 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 역상-HPLC에 의해 측정하였을 때, 최종 분말 제제 중 글루카곤의 98 % 초과가 비-응집된 글루카곤인 방법.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 분말 제제.
제25항에 있어서, 역상-HPLC에 의해 측정시 최종 분말 제제 중 글루카곤의 98 % 초과가 비-응집된 글루카곤인 분말 제제.