TW202108599A - 製備穩定胜肽調配物之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於製備含有胜肽之粉末調配物的改良方法。本發明進一步提供一種用於製備含有升糖素或升糖素類似物之粉末調配物的改良方法，其中該粉末調配物適用於經鼻投與。

Description

製備穩定胜肽調配物之方法
本發明係關於藥物領域。更特定言之，本發明提供一種用於製備含有胜肽之粉末調配物的改良方法。本發明進一步提供一種用於製備含有升糖素或升糖素類似物之粉末調配物的改良方法，其中該粉末調配物適用於經鼻投與。
胜肽在製程期間及之後易於發生物理不穩定性，諸如聚集。聚集係源於若干不同機制之複雜過程。聚集通常係因形成少量及可溶性聚集體之若干胜肽或蛋白質之成核誘導；其隨後充當後續較大不溶性聚集體生長之成核焦點。成核生長過程可隨時間、溫度、蛋白濃度及其他參數而增加。在製造期間，蛋白質使用多種方法(諸如超濾、親和性層析法、選擇性吸收層析法、離子交換層析法、凍乾、透析及沈澱或「鹽析」)進行純化及濃縮。此類濃縮過程可導致聚集(Maggio,BioProcess International 2008 ；6(10)：58-65)。移除或溶解此等聚集體需要額外方法步驟，其成本高的且損害總體產物產率。聚集效應可包括材料損失、功效降低、藥物動力學改變、穩定性及產物存放期降低，且誘發不合需要之免疫原性。
聚集已成為生物醫藥製造商之主要問題，特定言之，其係因為朝向高濃度溶液之現有傾向會增加蛋白質間相互作用(protein-protein interaction)之可能性，其轉而有利於聚集。(Maggio,BioProcess International 2008 ；6(10)：58-65)。已研究限制胜肽聚集之各種方法，包括但不限於調節pH、緩衝條件、離子強度，及/或添加其他賦形劑，諸如環糊精。
已知升糖素在水溶液中聚集之傾向(Pedersen JS.,J Diabetes Sci Technol. 2010 ；4(6)：1357-1367；Beaven等人,The European J. Biochem. 1969 ；11(1)：37-42；Matilainen等人,European J. of Pharmaceutical Sciences 2009 ；(36)：412-420)，其可在製造升糖素粉末調配物期間引起問題。製備適用於經鼻投與之升糖素粉末調配物的先前方法揭示於WO2016/133863中。
存在對用於製備胜肽粉末調配物，尤其升糖素或升糖素類似物粉末調配物之替代方法的需要。詳言之，需要對減少或消除胜肽在水溶液中之聚集的方法。藉由減少或較佳消除聚集，最終粉末調配物將保留高度有利的極高百分比之活性胜肽。較佳地，該方法在乾燥之前產生水溶液，其物理及化學穩定持續經延長之時段，例如至多24小時。此延長之穩定性使得該方法更適用於大規模製造。此外，需要一種產生具有長存放期，較佳至多約24個月之最終粉末調配物的方法。
因此，本發明提供一種在粉末調配物製造期間減少胜肽聚集之改良且具成本效益的方法。此方法併有雙重過濾步驟。本發明中所用之一種此類胜肽為升糖素或升糖素類似物。根據本發明方法製備之粉末調配物尤其適用於經鼻投與。
根據本發明之一個態樣，提供一種用於製備胜肽粉末調配物之方法。此方法包含以下步驟： a.在水性載劑中形成酸、磷脂界面活性劑及環糊精之第一混合物； b.對該第一混合物進行第一過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜； c.向第一過濾產物中添加胜肽以形成第二混合物，且對該第二混合物進行第二過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜；及 d.乾燥第二過濾產物以形成固體調配物且加工該固體調配物以產生最終粉末調配物。
在一實施例中，該胜肽為升糖素或升糖素類似物。詳言之，其為升糖素。
在一實施例中，該酸為檸檬酸或乙酸。詳言之，其為乙酸。更特定言之，該乙酸之濃度為1 M。
在一實施例中，該界面活性劑、該環糊精及該胜肽以該第二混合物重量計共組成約1.5%與約3%之間。在一特定實施例中，其以該第二混合物重量計約2%。在另一實施例中，其以該第二混合物重量計約2.5%。
在一實施例中，該界面活性劑為十二烷基磷酸膽鹼(DPC)、二癸基磷脂醯膽鹼(DDPC)、溶血月桂醯基磷脂醯膽鹼(LLPC)、二辛醯基磷脂醯膽鹼(D8PC)或二月桂醯基磷脂醯甘油(DLPG)。詳言之，該界面活性劑為DPC。
在一實施例中，該環糊精為α-環糊精、β-環糊精、羥丙基β-環糊精或γ-環糊精。詳言之，該環糊精為β-環糊精。
在一實施例中，如藉由逆相HPLC所量測，該最終粉末調配物中大於98%之該胜肽為非聚集胜肽。較佳地，大於99%之該胜肽為非聚集胜肽。更佳地，100%之該胜肽為非聚集胜肽。
根據本發明之另一態樣，提供一種用於製備胜肽粉末調配物之方法，其包含以下步驟： a.在水性載劑中形成磷脂界面活性劑及環糊精之第一混合物； b.對該第一混合物進行第一過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜； c.向第一過濾產物中添加胜肽以形成第二混合物，且對該第二混合物進行第二過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜；及 d.乾燥第二過濾產物以形成固體調配物且加工該固體調配物以產生最終粉末調配物。
在一實施例中，該界面活性劑、該環糊精及該胜肽以該第二混合物重量計共組成約1.5%與約3%之間。在一特定實施例中，其以該第二混合物重量計約2%。在另一實施例中，其以該第二混合物重量計約2.5%。
在一實施例中，該界面活性劑為DPC、DDPC、LLPC、D8PC或DLPG。詳言之，該界面活性劑為DPC。
在一實施例中，該環糊精為α-環糊精、β-環糊精、羥丙基β-環糊精或γ-環糊精。詳言之，該環糊精為β-環糊精。
在一實施例中，如藉由逆相HPLC所量測，該最終粉末調配物中大於98%之該胜肽為非聚集胜肽。較佳地，大於99%之該胜肽為非聚集胜肽。更佳地，100%之該胜肽為非聚集胜肽。
根據本發明之另一態樣，提供一種用於製備升糖素粉末調配物之方法，其包含以下步驟： a.在水性載劑中形成乙酸、DPC及β-環糊精之第一混合物； b.對該第一混合物進行第一過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜； c.向第一過濾產物中添加升糖素以形成第二混合物，且對該第二混合物進行第二過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜；及 d.乾燥第二過濾產物以形成固體調配物且加工該固體調配物以產生最終粉末調配物。
在一實施例中，升糖素、DPC及β-環糊精以該第二混合物重量計共組成約1.5%與約3%之間。在一特定實施例中，其以該第二混合物重量計約2%。在另一實施例中，其以該第二混合物重量計約2.5%。
在一實施例中，該乙酸之濃度為1 M。
在一實施例中，如藉由逆相HPLC所量測，該最終粉末調配物中大於98%之該升糖素為非聚集升糖素。較佳地，大於99%之該升糖素為非聚集升糖素。更佳地，100%之該升糖素為非聚集升糖素。
本發明進一步提供一種根據本發明方法製備之粉末調配物。
在特定實施例中，第二過濾產物之乾燥可藉由冷凍乾燥(凍乾)或噴霧乾燥進行。
在一特定實施例中，該第一及該第二過濾步驟兩者中之過濾膜包含但不限於聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙酸纖維素、硝酸纖維素、聚四氟乙烯(PTFE，鐵氟龍(Teflon))、聚氯乙烯、聚醚碸或其他適用於cGMP製造環境中之過濾材料。在一較佳實施例中，該過濾膜包含PVDF。
在一特定實施例中，該第一及該第二過濾步驟兩者中之過濾膜為孔徑為約0.45 µm之膜。在一較佳實施例中，該過濾膜為孔徑為0.45 µm之PVDF膜。
在一實施例中，在本發明之方法期間，溶液之pH保持在2與3之間。
在一實施例中，本發明方法之溶液相在15與30℃之間、較佳地18與25℃之間、更佳地約20℃的溫度下實施。
本發明之方法可用於在粉末調配物製造期間具有聚集之傾向的胜肽。詳言之，該等方法可用於胜肽，包括但不限於澱粉素、澱粉素類似物、重組人類因子VIII (rfVII)、抑鈣素基因系胜肽(CGRP)、抑鈣素、GLP-1類似物、GLP-1-GLP雙重促效劑、GIP促效劑、重組人類生長激素(rhGH)、八肽CCR5抑制劑D-Ala-胜肽T-醯胺、重組人類胰島素、胰島素類似物、PTH 1-31環狀胜肽類似物、干擾素-β、干擾素β-1a及β-1b、介白素-2 (IL-2)、紅血球生成素(EPO)、乙酸普蘭林肽(pramlintide acetate)及酶，諸如尿激酶。
詳言之，本發明之方法可用於製備升糖素粉末調配物。升糖素在醫院環境外部及醫院環境內兩者均為嚴重低血糖的高效治療。升糖素可以粉末調配物形式使用，該調配物必須在藉由注射投藥之前立即與稀釋劑混合。升糖素之液體調配物亦為已知的(Pontiroli等人,Br Med J ( Clin Res Ed ) 1983；287：462-463)。已研發出用於經鼻投與以治療嚴重低血糖之升糖素粉末且描述於WO2016/133863中，此近年來已以名稱BaqsimiTM 在美國及歐洲得到批准。
根據本發明方法產生之升糖素或升糖素類似物調配物尤其適用於經鼻投與。在較佳實施例中，根據本發明方法產生之調配物具有以下特徵中之一或多者： •  可能夠到達肺部之低比例之小粒子 •  以單次劑量注入單個鼻孔中以提供達成治療作用所需之藥物之總劑量的足夠藥物含量 •  以數十毫克或投遞裝置允許之最大值投遞總劑量的足夠藥物含量 •  儘管存在可能與過敏症或普通感冒相關之鼻充血，但仍有效的足夠的藥物含量及吸收特徵 •  在環境條件下儲存持續經延長之時段，較佳至少24個月期間之穩定性 •  良好安全性及耐受性概況
本專利申請案主張2019年4月26日申請之美國申請案第62/839,246號之優先權。以上申請案係以引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「聚集」係指小寡聚前驅體(諸如胜肽)之積聚、凝集、聚結、二聚、聚合或形成基核、成核焦點、原纖維或凝膠。聚集體尺寸介於可溶性二聚體及其他多聚體(表觀球形直徑大約5-10 nm)至經鑑別為顯微可見及可見微粒之較大不溶性物種(表觀球形直徑大約20-50 μm)範圍內。可溶性聚集體群中之較大者(諸如高分子量物種)可能能夠引發具有不良臨床結果之免疫原性反應。
如本文所用，術語「基核」或「成核焦點」係指形成較大聚集體之最小聚集體尺寸。
逆相HPLC可用於測定最終粉末調配物中之非聚集胜肽之量。可使用彼等熟習此項技術者已知之標準條件，例如以下實例中陳述之彼等條件。
如本文所用，「升糖素」係指序列His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO:1)之多肽。
升糖素可以化學方式合成、藉由重組DNA技術產生或自天然來源提取。術語「升糖素類似物」係指此序列之變異體，其保留活體內刺激血糖升高之能力。
其中天然序列中之一個胺基酸經丙胺酸替換之升糖素類似物以及具有多個取代之類似物之實例揭示於Chabenne等人,Molecular Metabolism 2014；3：293-300中。其中三種胺基酸經修飾以產生具有增強之生物活性之升糖素類似物的例示性類似物為[Lys17 , 18 , G1u21 ]升糖素。Zealand Pharma已在例如美國專利公開案20140080757、2014001733、20130316941、20130157935、20130157929、20120178670、20110293586、20110286982、20110286981及20100204105中揭示多種升糖素類似物。此等類似物據報導與升糖素受體相比對GLP受體具有更大結合親和力，但仍然保留升糖素活性。Zealand Pharma亦已開始治療低血糖症之升糖素類似物之臨床試驗，該升糖素類似物稱為ZP4207。美國專利公開案20130053310揭示適用於治療低血糖症之其他升糖素類似物。
磷脂界面活性劑為生物膜普遍存在的組分，其為人體中之細胞及組織之一部分，包括鼻黏膜。細胞中最普遍的磷脂界面活性劑為磷脂醯膽鹼及磷酸膽鹼(PC)，但磷脂醯甘油(PG)為生物膜之重要組分。亦可使用藉由移除醯基中之一者而衍生自二醯基PC或PG的溶血磷脂。
可用於本發明中之例示性磷脂界面活性劑為十二烷基磷酸膽鹼(DPC)、二癸基磷脂醯膽鹼(DDPC或1,2-二癸基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼)、溶血月桂醯基磷脂醯膽鹼(LLPC或1-二癸醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、二辛醯基磷脂醯膽鹼(D8PC或1,2-辛醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)及二月桂醯基磷脂醯甘油(DLPG或1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷酸基(1'-rac-甘油))。
較佳磷脂界面活性劑為在粉末調配物製造期間所用之濃度下形成膠微胞而非雙層之彼等磷脂界面活性劑。此包括DPC、DDPC、LLPC及D8PC，但不包括DLPG。最佳為DPC。
在本發明之特定實施例中，使用單一類型之磷脂界面活性劑。在其他實施例中，磷脂界面活性劑組分可由磷脂界面活性劑之混合物，包括例如上文所鑑別之界面活性劑中之任何兩者、三者或四者之組合構成。
如本文所用，術語「環糊精」係指在環中含有六個、七個或八個葡萄糖殘基以產生圓錐形之環糊精，亦即： •  α (α)-環糊精：6員糖環分子 •  β (β)-環糊精：7員糖環分子 •  γ (γ)-環糊精：8員糖環分子
Novo Nordisk在臨床試驗(Stenniger等人,Diabetologia 1993；36：931-935；Rosenfalck AM等人,Diabetes Res Clin Pract 1992；17：43-50)中將α-CD用於粉末調配物(HypoGon® Nasal)中。α-CD之水溶性據報導為約5重量%。
另外兩種環糊精，一種水溶性小於α-CD(ß-CD，1.85重量%)及另一種水溶性大於α-CD(HP-ß-CD)亦適用於本發明，γ-環糊精同樣可自由地溶於水。
調配物中之環糊精充當填充劑，且亦黏附於鼻黏膜表面且有助於升糖素吸收。在投遞至鼻孔之後，主要成分(90重量%至70重量%)，亦即環糊精有助於粉末黏附於黏膜表面。
環糊精可單獨使用，或以任何兩種或更多種環糊精之混合物形式使用。
在一特定實施例中，根據本發明方法製備之升糖素粉末調配物包含升糖素、DPC及β-環糊精。較佳地，粉末調配物包含10:10:80(升糖素:DPC:β-環糊精)之重量比的升糖素、DPC及β-環糊精。較佳地，升糖素以在單一鼻孔中以單次劑量投與時有效的治療量存在。在一實施例中，升糖素之劑量為約3 mg。
混合可藉由包括靜態及動態混合之方法進行。動態混合可藉由使用插入至液體中之葉片來進行，該葉片附接至轉軸且藉由馬達旋轉。靜態混合可藉由使液體流動通過靜態混合器內部之彎曲路徑來進行。混合期間空氣-水界面之存在在高速混合條件下可導致發泡。高速混合由於剪應力亦可轉而導致蛋白質不穩定。為了使發泡減至最少且較佳消除發泡，較佳為低速混合條件。在動態混合之情況下，速度藉由攪拌器之每分鐘轉數(rpm)測定。較佳rpm值在50至300之間、更佳在50至250之間、甚至更佳在50與100之間。
乾燥第二過濾產物以移除溶劑且留下固體產物。乾燥可藉由冷凍乾燥、噴霧乾燥、塔盤乾燥或其他技術進行。產物之宏觀物理特徵將視乾燥技術而變化，且可呈來自冷凍乾燥之片狀固體形式或呈乾燥固體餅形式。
水分含量過多之粉末可為黏稠的且形成凝集塊，產生難以操縱以填充投藥裝置之粉末。重要的是，殘餘水含量之量對穩定性具有直接影響。與殘餘水含量小於5%之粉末相比，散粉中殘餘水分含量之量超過5%導致穩定性降低。因此，在一特定實施例中，根據本發明製備之粉末調配物較佳具有小於5%之殘餘水含量。
在一特定實施例中，根據本發明製備之粉末調配物中之酸的量小於10%重量比，較佳小於6%重量比。
用於經鼻投與之適合粉末需要准許足夠流動性以使得其可填充至經鼻排出裝置中之物理特徵。可藉由包括粒度、形狀、密度、表面紋理、表面積、密度、內聚力、黏著力、彈性、孔隙率、吸濕性及脆度之各種參數來測定流動性。
具有合適粒度及流動性特徵之粉末可藉由加工散粉以移除過小或過大之粒子來產生。加工散粉以移除過小或過大之粒子的方法可包括研磨散粉以使較大粒子分解及篩分以分離出所需粒度範圍之粒子。可進行各種篩分方法，包括投擲篩分(throw-action sieving)、水平篩分(horizontal sieving)、拍打篩分(tapping sieving)、超音波篩分(super-sonic sieving)及空氣循環噴射篩分(air circular jet sieving)。篩可用作固定標稱孔隙之單個篩，或散粉可經由一系列逐漸變小之孔隙之篩加工以獲得所需粒度分佈。篩可為標稱孔隙在25至1000 μm範圍內之編織金屬絲網篩。
實例 實例 1 - 升糖素粉末調配物之製備 - 雙重過濾步驟 經由攪拌將DPC溶解於1 M乙酸溶液中。隨後，將β-環糊精添加至DPC溶液中，且攪拌直至溶解以形成第一溶液。經由0.45 µm PVDF過濾器對第一溶液進行第一過濾步驟。將過濾產物(賦形劑溶液)收集至新的清潔槽中，且將槽之溫度調節至20℃±2℃以確保材料在溶液中之溶解度。達成槽中之目標溫度後，將升糖素或升糖素類似物添加至槽中同時攪拌溶液。升糖素呈現溶解後，(經由目視確認)立即終止攪拌。升糖素溶液接著經由第二0.45 µm PVDF過濾器過濾，且過濾材料收集於第二清潔槽中。此第二過濾材料(第二過濾產物)含有97.5%重量比之1 M乙酸水溶液、0.25%重量比之DPC、2%重量比之β-環糊精及0.25%重量比之升糖素(總計2.5%重量比之固體)。隨後將材料凍乾且使其經受壓緊步驟以產生最終升糖素粉末調配物。
比較實例 - 升糖素粉末調配物之製備 - 單過濾步驟 經由攪拌將DPC溶解於1 M乙酸溶液(8公升)中。在攪拌該溶液的同時添加升糖素。升糖素呈現溶解後，(經由目視確認)添加β-環糊精，同時攪拌。所有添加之固體均呈現溶解後，溶液經由0.45 µm PVDF過濾器過濾。若單個過濾膜發生堵塞或積垢，則可能需要使用多個過濾器。經過濾之材料含有0.3%重量比之DPC、2.4%重量比之β-環糊精及0.3%重量比之升糖素(總計3%重量比之固體)。收集經過濾之材料且凍乾。
第一次過濾後賦形劑溶液之穩定性 賦形劑溶液(乙酸、DPC及β-環糊精)基本上如實例1中所闡述以2.5%重量比之固體濃度製備。將溶液保持在25℃下持續研究之持續時間。資料概述於表1中。在22小時時段內未出現含量之顯著變化且確認質量平衡。表 1
樣品時間 ( 小時 ) DPC 含量 ( 重量比 %) β - 環糊精含量 ( 重量比 %)
0 0.26 2.02
1 0.26 2.00
2.7 0.26 2.05
3.2 0.26 1.97
7.4 0.25 1.96
22 0.25 1.98
含有升糖素之水溶液之穩定性 溶液分析 升糖素溶液基本上如實例1中所闡述製備(第二過濾產物)。在製備之後，使升糖素溶液靜置而不進行攪拌。溶液樣品在預定時間採集且在分析之前穿過0.45 µm過濾器。任何轉化成聚集體之升糖素藉由此過濾步驟移除，因此此分析提供聚集程度之評估。
螢光分析 螢光方法之基礎為利用升糖素分子中單一色胺酸殘基之發射波長偏移(Pedersen JS.,J Diabetes Sci Technol . 2010；4(6)：1357-1367)。當升糖素分子的構形自無規線圈或α螺旋線變至聚集體形式時，色胺酸分子之局部環境呈發射光譜之藍移(blue-shift)形式變化。因此，藉由用光纖光耦合背散射螢光探針監測升糖素之發射螢光信號的波長隨時間之變化，計算未聚集升糖素與分子之聚集形式之發射峰之比率可用作在即時基礎上監測聚集之工具。
升糖素溶液基本上如實例1中所闡述製備(第二過濾產物)。使用螢光探針來監測發射光譜隨時間之變化。不攪拌溶液且在室溫下監測24小時。
在小規模實驗(100 mL)中，在此24小時時段中未觀測到升糖素螢光比率之變化。
在其他實驗中，升糖素溶液基本上如實例1中所闡述製備(第二過濾產物)且保持在不同溫度下。出於比較之目的，將此與尚未經過第二過濾步驟之升糖素溶液進行比較。結果概述於表2中。表 2 升糖素溶液過濾及保持溫度研究
實驗 過濾 保持溫度，時間 攪拌 結果
A 是 20℃，24小時 否 升糖素溶液分析無變化
B 是 5℃，24小時 否 升糖素溶液分析無變化
C 否 20℃，24小時 否 升糖素溶液分析損失；螢光發射峰比率變化
研究結果顯示，當升糖素溶液經過第二過濾步驟且在不攪拌之情況下保持在5℃或20℃下時，升糖素不會因系統聚集而損失。然而，當溶液未經過濾時，其經24小時損失大約8%之升糖素含量。
基本上如實例1中所闡述製備之升糖素溶液的化學穩定性亦可使用基本上如下文所述之逆相HPLC測試。
在基本上如上文所述用以高達100公升(具有2.5%重量比固體)之數量的雙重過濾進行之製備中，出人意料地發現在第二過濾步驟之後所收集之溶液可物理性地及化學性地穩定至24小時，且無任何可偵測之聚集(如上文所闡述之方法中之一或多者所測定)。然而，僅進行一個過濾步驟(比較實例-8公升及3%重量比固體)之升糖素溶液材料，在添加升糖素約15分鐘內就顯示出可見的聚集作用。
經鼻升糖素粉末調配物之 HPLC 化學穩定性分析 使用常規RP-HPLC技術測定根據實例1製備之經鼻升糖素粉末調配物相對於外部明確定義之參考標準之穩定性。簡言之，在UV偵測波長為214 nm之情況下，經磷酸鉀緩衝劑:乙腈移動相使用HPLC逆相管柱C18，3.0 mm i.d.×150 mm，2.6-µm粒度。梯度移動相組合物以在54%、80:20 150 mM磷酸鉀緩衝劑:乙腈下保持3分鐘起始，且經8分鐘過程以70%、60:40磷酸鉀緩衝劑:乙腈組合物終止。
在基本上如上文所述進行之實驗中，如表3中所示，來自三個不同批次根據實例1製備之經鼻升糖素粉末調配物(100L)的代表性樣品在實驗精確度內保留約100%之升糖素活性。
經鼻升糖素粉末調配物之效能生物分析 採用經工程改造以穩定地表現升糖素之細胞表面受體及CRE-螢光素酶報導基因兩者之胚胎腎細胞株HEK293來測定最終經鼻升糖素調配物產物之相對效能。在此基於細胞之分析中，來自CRE-啟動子之螢光素酶之轉錄藉由觸發沿著內源性環狀AMP(cAMP)信號傳導路徑之反應來調節。因此，升糖素會結合於細胞表面受體誘導cAMP產生。此導致cAMP反應元件結合蛋白(CREB)之磷酸化及活化，引起螢光素酶藉由CRE-螢光素酶報導基因表現。藉由將螢光素受質添加至反應混合物中且使用光度計定量螢光素氧化來測定螢光素酶產生。螢光信號與所存在螢光素酶之量成比例，螢光素酶之量與用於誘導細胞之升糖素之量成正比。藉由比較參考標準之典型8點劑量-反應曲線與樣品之彼曲線來測定測試樣品之相對效能。將反應資料與4參數對數模型擬合以測定參考標準之EC50 及樣品之EC50 ，其中此等EC50 值之間的比率表示測試材料之相對效能。
將HEK293細胞置於含生長培養基之96孔細胞培養盤(含10%胎牛血清(FBS)之達爾伯克氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)上，其中有1.0 mg/mL Genetecin®及125 µg/ml潮黴素B，青黴素及鏈黴素可以100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素之最終濃度添加)且使其在37℃下附著持續30分鐘與2.5小時之間。洗滌生長培養基且用分析培養基替換，該分析培養基由具有0.5%牛血清白蛋白、1倍青黴素/鏈黴素及濃度介於0.00032 ng/mL至25 ng/mL範圍內之升糖素的含0.25% FBS之DMEM組成。在37℃下培育培養盤4.5小時。每孔添加100 µL之SteadyGlo®且隨後在環境溫度下連續攪動孔30分鐘。在光度計上讀取該等培養盤。
在基本上如上文所述進行之實驗中，如表3中所示，發現經由基於細胞之分析所量測的升糖素之相對效能百分比在94%與102%之間，表明在根據實例1之調配物(100L)製備期間未出現聚集。此等結果與使用相同參考標準的基於升糖素化學物質之分析結果相當。
經鼻升糖素粉末調配物之雜質分析 使用常規RP-HPLC技術進行經鼻升糖素粉末調配物中之潛在雜質之鑑別及定量。雜質可由於最終調配物中之材料之製程或化學分解而產生。該方法係基於USP41-NF36中所概述之條件。此分析提供對升糖素粉末調配物之穩定性之指示。
在基本上如上文所述進行之實驗中，如表3中所示，分批釋放時之總雜質量介於約0.4%至約0.56%範圍內。另外，根據實例1製備之經鼻升糖素粉末調配物所建議之存放期規格分析在至多約24個月內具有約20% (a/a)或更低之總雜質量。出人意料地，經鼻升糖素粉末調配物之總雜質量顯著低於市場上當前升糖素急救套組所建議之總雜質量，當前USP專論(USP41-NF36)指定存在的總雜質及相關化合物不超過31% (a/a)之限值。表 3 經鼻升糖素粉末調配物化學穩定性、生物分析及雜質分析 .
批次 # 升糖素化學分析 (%) 升糖素生物分析 ( 相對效能 %) 總雜質 (%)
1 103.1 102 0.40
2 101.1 94 0.39
3 102.1 97 0.56
以上資料係用於已裝載至經鼻投遞裝置中且隨後排出之粉末調配物之批次。
經鼻升糖素粉末調配物之臨床功效 在NCT03339453臨床試驗研究中，研究使用實例1之兩步過濾方法在大規模品質控制之製造批次中之經鼻升糖素粉末調配物之臨床功效(Suico等人, EASD-2008；摘要150)。簡言之，在控制胰島素誘導之低血糖期間，在患有1型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus)之成人患者中比較經鼻升糖素粉末調配物(NG)與肌內升糖素(IMG)之功效及安全性。經鼻升糖素粉末調配物以3.0 mg之劑量封裝於投遞至一個鼻孔之裝置中。
如表4中所示之結果表明100%之患者成功地用NG或IMG治療且NG活性與此研究中之IMG活性相當。表 4
   主要功效分析 IGBI (TID) (N=66)a
NG 3 mg IMG 1 mg
治療成功-n(%) 66 (100%) 66 (100%)
治療差異(雙側95%信賴界限)b 0% ( -1.5%，1.55)c
滿足升糖素標準-n(5) (i)            ≥70 mg/dL(3.9 mmol/L) (ii)          自最低點增加≥20 mg/dL (1.1 mmol/L) (i)與(ii)兩者    66 (100%) 66 (100%) 66 (100%)    66 (100%) 66 (100%) 66 (100%)
a 功效分析群由接受兩種劑量之具有符合條件之葡萄糖濃度之研究藥物的所有患者組成。b 差異計算為(IMG成功百分比)-(NG成功百分比)，非劣性c 根據具有連續調節之瓦爾德(wald)法之雙側95%信賴區間(CI)
序列 (SEQ ID NO：1) His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr
Figure 12_A0101_SEQ_0001

Claims (26)

  1. 一種用於製備胜肽粉末調配物之方法，其包含以下步驟： a.在水性載劑中形成酸、磷脂界面活性劑及環糊精之第一混合物； b.對該第一混合物進行第一過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜； c.向第一過濾產物中添加胜肽以形成第二混合物，且對該第二混合物進行第二過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜；及 d.乾燥第二過濾產物以形成固體調配物且加工該固體調配物以產生最終粉末調配物。
  2. 如請求項1之方法，其中該胜肽為升糖素或升糖素類似物。
  3. 如請求項2之方法，其中該胜肽為升糖素。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該界面活性劑、該環糊精及該胜肽以該第二混合物重量計共組成約1.5%與約3%之間。
  5. 如請求項4之方法，其中界面活性劑、該環糊精及該胜肽以該第二混合物重量計共組成約2%。
  6. 如請求項4之方法，其中界面活性劑、該環糊精及該胜肽以該第二混合物重量計共組成約2.5%。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該第一及該第二過濾步驟兩者中之該膜包含聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該第一及該第二過濾步驟兩者中之該膜包含約0.45 µm之孔徑。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該酸為檸檬酸或乙酸。
  10. 如請求項9之方法，其中該酸為乙酸。
  11. 如請求項10之方法，其中該乙酸之濃度為1 M。
  12. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該界面活性劑為十二烷基磷酸膽鹼、二癸基磷脂醯膽鹼、溶血月桂醯基磷脂醯膽鹼(lysolauroylphosphatidylcholine)、二辛醯基磷脂醯膽鹼或二月桂醯基磷脂醯甘油。
  13. 如請求項12之方法，其中該界面活性劑為十二烷基磷酸膽鹼。
  14. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該環糊精為α-環糊精、β-環糊精、羥丙基β-環糊精或γ-環糊精。
  15. 如請求項14之方法，其中該環糊精為β-環糊精。
  16. 一種用於製備胜肽粉末調配物之方法，其包含以下步驟： a.在水性載劑中形成磷脂界面活性劑及環糊精之第一混合物； b.對該第一混合物進行第一過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜； c.向第一過濾產物中添加胜肽以形成第二混合物，且對該第二混合物進行第二過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜；及 d.乾燥第二過濾產物以形成固體調配物且加工該固體調配物以產生最終粉末調配物。
  17. 如請求項1至3及16中任一項之方法，其中如藉由逆相HPLC所量測，該最終粉末調配物中大於98%之該胜肽為非聚集胜肽。
  18. 一種粉末調配物，其係藉由如請求項1至17中任一項之方法製備。
  19. 一種用於製備升糖素粉末調配物之方法，其包含以下步驟： a.在水性載劑中形成乙酸、十二烷基磷酸膽鹼及β-環糊精之第一混合物； b.對該第一混合物進行第一過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜； c.向第一過濾產物中添加升糖素以形成第二混合物，且對該第二混合物進行第二過濾步驟，其中過濾器包含孔徑為約0.4 µm至約0.5 µm之膜；及 d.乾燥第二過濾產物以形成固體調配物且加工該固體調配物以產生最終粉末調配物。
  20. 如請求項19之方法，其中界面活性劑、該環糊精及該胜肽以該第二混合物重量計共組成約2.5%。
  21. 如請求項19或20之方法，其中該第一及該第二過濾步驟兩者中之該膜包含PVDF膜。
  22. 如請求項19或20之方法，其中該第一及該第二過濾步驟兩者中之該膜包含約0.45 µm之孔徑。
  23. 如請求項19或20之方法，其中該乙酸之濃度為1 M。
  24. 如請求項19或20之方法，其中如藉由逆相HPLC所量測，該最終粉末調配物中大於98%之該升糖素為非聚集升糖素。
  25. 一種粉末調配物，其係藉由如請求項19至24中任一項之方法製備。
  26. 如請求項25之粉末調配物，其中如藉由逆相HPLC所量測，該最終粉末調配物中大於98%之該升糖素為非聚集升糖素。
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