KR20210130991A

KR20210130991A - 헤르바세틴을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증 또는 신경퇴행 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210130991A
Application number: KR1020200049218A
Authority: KR
Inventors: 김희정; 황영란
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-11-02

Abstract

본 발명은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 피로카르핀(pilocarpine)에 의한 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 뇌전증지속증에서 발작 감수성(seizure susceptibility)을 감소시키고, 해마신경세포의 시냅스 손상 및 신경독성을 억제하며, 신경염증을 개선시키는 효과를 발휘한다.

Description

헤르바세틴을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증 또는 신경퇴행 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for prevention or treatment of status epilepticus or neurodegeneration comprising herbacetin}

본 발명은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 또는 신경퇴행(neurodegeneration) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

뇌전증지속증(status epilepticus)은 단일 발작이 최소 30분 이상 지속되거나, 의식의 회복없이 30분 이상 발작이 반복될 때로 정의되며, 심각한 병적상태와 사망을 동반하는 신경학적 질환이며(Cheung-Ter Ong et al., 2015;F. Rosenow et al., 2007; S. Shinnar et al., 2001), 특히, 동물과 사람 모두에서 변연계 시스템에 상당한 신경손상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Laxmikant S et al., 2007; F.W. Drislane, 2000).

뇌전증지속증은 발작의 시작 후, 발작 억제 기전의 작동에 의해 수분 이내에 멈추게 되는데, 뇌전증지속증 발작의 시간이 길면 길수록 후유증의 발생 및 사망률이 높아지게 된다 (DeLorenzo RJ et al., 1999). 항경련제의 치료에도 불구하고, 일반적인 뇌전증지속증(status epilepticus) 환자의 최소 20%가 이에 불응성을 가지며(Laxmikant S et al., 2007; Treiman, D.M et al., 1998), 불응성 뇌전증지속증의 치료를 위한 보다 효과적인 치료방법 및 신경학적 후유증을 최소화하는 신약개발을 위한 연구 결과는 아직 부족한 실정이다.

한국공개특허 제10-2018-0129692호(2018.12.05.)에는, 홍경천 및 연자육을 포함하는 수면 장애 개선용 조성물에 관하여 개시되어 있다. 미국등록특허 제09629863호(2017.04.25)에는, 우수한 CDK 저해 활성을 가진 홍경천 뿌리 부탄올 분획 및 이를 포함하는 급성 및/또는 만성 통증, 신경병증 통증, 당뇨병, 암, 신경 퇴행성 질환 및 신경병리학적 장애 예방 및 치료용 조성물에 관하여 개시되어 있다.

본 발명은 헤르바세틴(herbacetin)이 뇌전증지속증 또는 뇌전증지속증에 의한 신경퇴행에 대한 예방 및 치료 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 헤르바세틴을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 헤르바세틴(herbacetin)은, 바람직하게 홍경천(hongkyungcheon) 유래인 것이 좋다.

본 발명의 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 뇌전증지속증 관련 질환은, 일 예로 뇌전증지속증(status epilepticus) 또는 신경퇴행성 질환일 수 있다

이때, 상기 신경퇴행성 질환은, 일 예로 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

한편, 본 발명은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

한편, 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 조성물은 뇌전증지속증에서 발작 감수성(seizure susceptibility)을 감소시키고, 해마신경세포의 시냅스 손상 및 신경독성을 억제하며, 신경염증을 개선시키는 효과를 발휘한다.

도 1은 헤르바세틴 처리에 의한 세포독성 유도 대뇌 피질 세포에서의 세포 증식률을 확인한 결과이다.
도 2는 헤르바세틴 처리에 의한 세포독성 유도 뇌해마 신경세포의 시냅스 상의 변화를 확인한 결과이다 (A: 신경세포의 형태학적 변화(MAP2) 및 시냅스의 발현 변화 확인, B: PSD95 발현에 따른 시냅스 접점의 정량적 분석에서 Nulin-3 처리에 의한 시냅스 접점에서의 효과 수준 C: PSD95 발현에 따른 시냅스 접점의 정량적 분석에서 헤르바세틴 농도별 처리에 의한 시냅스 접점에서의 효과 수준).
도 3은 헤르바세틴 처리에 의한 마우스 미세아교세포 BV2 세포주의 LPS에 의한 활성화로 유도되는 산화질소(nitric oxide; NO) 방출에서의 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 헤르바세틴 처리에 의한 뇌전증지속증 마우스 모델의 발작 단계 지연 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 헤르바세틴 처리에 의한 뇌전증지속증 마우스 모델의 신경보호 효과를 확인한 결과이다 (A: 뇌전증지속증 모델의 신경 세포 Fluoro Jade B 염색 사진, B: CA1 영역 및 CA3 영역에서 Fluoro Jade B 양성 세포의 수, C: 문(hillus) 영역에서 Fluoro Jade B 양성 세포의 수, D: 뇌전증지속증 모델의 신경 세포 크레실 바이올렛 염색 사진, E: CA1 영역 및 CA3 영역에서 크레실 바이올렛 양성 세포의 수, F: 문(hillus) 영역에서 크레실 바이올렛 양성 세포의 수).
도 6은 헤르바세틴 처리에 의한 뇌전증지속증 마우스 모델의 신경교세포 활성 완화 효과를 확인한 결과이다 (A: 신경교세포의 면역염색, B: CD11b(microglia) 강도, C: GFAP (astrocyte) 강도 확인).
도 7은 헤르바세틴 처리에 의한 뇌전증지속증 마우스 모델의 염증 사이토카인 발현 조절 효과를 확인한 결과이다 (A: 웨스턴 블롯 결과, B: TNF-α/β-actin 정량 결과).
도 8은 헤르바세틴 처리에 의한 뇌전증지속증 마우스 모델의 iNOS 활성 완화 효과를 확인한 결과이다 (A: 신경교세포의 면역염색, B: 문(hillus) 영역에서 iNOS 양성 세포 수).

헤르바세틴(herbacetin)은 홍경천에서 유래한 물질로 기존에 항암, 항염증 효과가 있다고 보고되면서(Liang Li et al., 2015; Dong Joon Kim et al., 2017) 화학요법(chemotherapeutic)의 이점을 나타낸다. 하지만, 신경질환에서 세포 손상에 대한 효과 연구는 아직 미비하며, 뇌전증지속증 질환에서의 연구는 아직 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명은 헤르바세틴이 화학 경련제(chemoconvulsant)에 의한 뇌전증지속증 모델에서 유도되는 뇌전증지속증(status epilepticus)의 발작 감수성(seizure susceptibility)을 줄이고, 신경보호 효과 및 신경염증의 저해 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

즉, 헤르바세틴은 난치성 질환인 뇌전증지속증에서 발생되는 시냅스 손상을 포함한 신경퇴행에서 연이어 발생되는 신경독성단계를 모두 저해하여 신경보호활성을 나타내며, 신경염증을 저해하는 조성물로서 활용될 수 있다.

이에, 본 발명은 헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

뇌전증지속증 중에서 측두엽 간질은 다른 국소성 뇌전증에 비해 가장 큰 부분에 속하며, 많은 선행연구를 통해 측두엽 뇌전증의 병리학적 소견과 치료적인 접근이 시도되었다. 대표적으로, 카이닌산(kainic acid)이나 필로카르핀(pilocarpine)과 같은 화학경련제(chemoconvulsant)를 이용한 측두엽 뇌전증 동물모델들이 소개되어졌으며 (Shibley and Smith, 2002), 카이닌산(kainic acid)이나 필로카르핀(pilocarpine)에 의한 뇌전증지속증은 해마에서의 신경독성, 신경교증(gliosis), 비정상적으로 증가되는 신경발생, 이끼섬유발아(mossy fiber sprouting) 등이 유도된다고 알려져 있다(Turski et al., 1984; Parent and Lowenstein, 2002; Buckmaster, 2004).

홍경천은 골든루트(golden root) 또는 로즈루트(rose root)라고 불리며, 돌나무와 비슷하게 생겼다. 피레네산맥, 로키산맥을 포함한 북반구에서 가장 추운 지역의 고도 1,000미터 이상의 절벽 또는 바위산에 주로 자라는 강인한 식물이다. 홍경천은 마치 다육이처럼 생겼는데, 끝에 핀 꽃이 곤충을 유인한다. 잎은 손가락으로 문지르면 푸린빛을 뜬 막으로 덮혀있고, 꽃이 핀 상태에서는 30㎝까지 높이 자라고, 잎은 타원형으로 5㎝, 폭은 약 1.2㎝까지 자란다. 꽃은 녹색을 띠는 노란색이나 끝이 붉은색인 경우도 있다. 자르면 달콤한 장미향이 나는 뿌리가 약재로 이용된다. 홍경천은 면역력 증진, 피로개선, 혈소판 응집 억제, 기억력 개선 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 뇌전증지속증 관련 질환은, 일 예로 뇌전증지속증(status epilepticus) 또는 신경퇴행(neurodegeneration)일 수 있다.

이때, 상기 신경퇴행(neurodegeneration)은, 일 예로 시냅스 손상(synaptic damage), 신경독성(neurotoxicity) 또는 신경염증(neuroinflammation)을 포함하는 것일 수 있다.

또한 상기 신경퇴행은 신경퇴행성 질환을 포함하며, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 헤르바세틴을 30분 전처리하였을 때, 뇌해마신경세포에서 화학경련제를 통해 유도되는 시냅스 손상이 억제됨을 신경세포의 수상돌기의 형태학적인 변화에서 면역염색을 통해 확인하였고, 연이어 나타나는 신경독성작용에서도 신경사멸을 억제함을 MTT 분석을 통해 확인하였다. 이후 진행한 동물실험에서 1일, 1시간 전처리 또는 1, 2일 후처리 하였을 때, 헤르바세틴이 화학경련제에 의한 뇌전증지속증을 감소시켰고, Cresyl violet staining과 Fluoro Jade B staining을 통해 신경세포 사멸을 억제한다는 사실을 확인하였다. 또한, 신경교세포 활성화(glial activation) 및 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine) 발현 및 iNOS 활성에서 헤르바세틴의 저해작용을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 헤르바세틴을 포함하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 헤르바세틴 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 헤르바세틴은 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어, 상기 헤르바세틴은 바람직하게 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 대비 0.00001~50 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.

본 발명의 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 일 예로 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 조성물의 투여로 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 있어서, 헤르바세틴의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 생체외( in vitro ) 뇌전증지속증 모델에서 헤르바세틴의 효과 구명]

BV2 미세아교세포(BV2 microglial cell)는 페놀레드(phenol red)가 포함된 DMEM 배지(with 5% FBS, 100IU/㎖의 페니실린(penicillin), 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin), 0.025㎍/㎖의 암포테리신 B(amphotericin B))에서 Kim et al., J Neurosci. 28(48):12604-12613의 방법으로 배양하였다.

일차배양을 위한 뇌 해마 신경세포는 18일된 Sprague-Dawley 생쥐의 태아에서 얻었다. 이를 위해 먼저 어미쥐를 16.5% 우레탄(Urethane, 0.8㎖/100g)으로 마취하고, 해마조직을 Ca²⁺와 Mg²⁺이 없는 HHSS(HEPES-buffered Hanks' slat solution, pH 7.45)에서 절개하였다. HHSS의 조성은 20mM HEPES, 137mM NaCl, 1.3mM CaCl, 0.4mM MgSO, 0.5mM MgCl, 5.0mM KCl, 0.4mM KH₂PO, 0.6mM Na₂HPO, 3.0mM NaHCO, 및 5.6mM glucose이다.

절개된 해마를 flame-narrowed Pasteur pipette으로 분쇄한 뒤, 원심분리하여 얻은 시료에 Neurobasal 배지(without L-glutamine and with 2% B27 supplement, 0.25% Glutamax I, 00IU/㎖의 페니실린(penicillin), 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin), 0.025㎍/㎖의 암포테리신 B(amphotericin B))를 첨가하여 골고루 섞어 주었다. 분리된 해마 신경세포를 Matri gel (0.2㎎/㎖; BD Biocsience)로 코팅된 25㎜ round cover glass에 80,000개씩 깔아주었다. 이후, 신경세포를 10% CO₂, pH 7.4, 37℃의 환경에서 배양하며, 배양 3일, 7일, 10일되는 시점에 배양액의 75%를 각각 교체해주었다.

대뇌 피질 신경세포의 분리과정은 뇌 해마 신경세포와 동일하게 진행되었으며, 분리된 대뇌 피질 신경세포를 matri gel (0.2 mg/ml; BD Biocsience)로 코팅된 96웰 플레이트(well plate)에 씨딩(seeding)한 후, 10% CO₂, pH 7.4, 37℃의 조건으로 설정한 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 배양 3일, 7일, 10일되는 시점에 배양액의 75%를 각각 교체해주었다.

1.1 신경세포 보호 효과

헤르바세틴(herbacetin)의 뇌전증지속증 모델에서의 신경독성 억제 효과를 확인하기 위하여, 대뇌 피질 세포에 헤르바세틴이 농도별(5μM, 10μM, 20μM, 40μM)로 첨가된 Neurobasal 배지(with 2% B27)와 헤르바세틴이 첨가되지 않은 배지 각각을 30분 동안 전처리하였다. 그 후, 신경독성 유발을 위하여 100μM의 NMDA (N Methyl D Asparate)을 처리한 후, 24시간째에 MTT(0.5㎎/㎖)을 20㎕씩 처리하여 4시간 동안 세포배양기에서 배양하였다. 그 후, microplate reader(Bio-Rad)를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 헤르바세틴 처리에 의해, 세포독성을 유도한 대뇌 피질 세포의 세포 증식률이 증가하였음을 확인하였다. 이러한 결과는 헤르바세틴이 뇌 신경세포 보호 효과를 가짐을 보여주는 결과이다.

1.2 형태학적 변화

NMDA 처리에 의해 유도된 뇌해마 신경세포의 시냅스 상의 변화를 확인하기 위하여, 일차배양한 뇌해마 신경세포에 헤르바세틴을 농도별(10μM, 20μM, 40μM)로 30분 동안 전처리하고, 100μM의 NMDA (N Methyl D Asparate)을 4시간 동안 처리하였다. 또한, 시냅스 손상에 대한 신경보호효과 확인을 위해 양성대조군으로 Nutlin-3을 처리하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고, -20℃에 보관된 저온의 메탄올을 넣어 고정시켰다. 그 후 메탄올을 씻어내기 위해 PBS로 3회 세척하고, 0.3% Triton X-100을 5분 동안 처리하였다. 이후, PBS로 3회 세척 후 10% BSA로 상온에서 한 시간 동안 블록킹(blocking)하였다.

블록킹(blocking) 이후 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 사용된 항체는 신경세포의 형태적 변화를 확인하기 위해 mouse anti-MAP2(sigma-aldrich)를, 시냅스 접점을 확인하기 위해 rabbit anti-PSD95(Abcanm)을 사용하였다. 면역염색된 신경세포들을 시각화하기위해 2차 항체를 반응시켰는데, Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG(invitrogen)와 Alexa Fluor 555 anti-mouse IgG(invitrogen)을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 3회 세척하고, 커버스립(coverslip)은 VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)을 사용해 봉입하였다. 세포관찰을 위해 Alexa Fluor 488(excitation, 488nm; emission, >519nm)과 Alexa Fluor 555(excitation, 555nm; emission, >565nm)로 염색된 신경세포들을 공초점 현미경을 사용해 관찰하였다.

이를 위하여, 봉입한 신경세포를 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)의 재물대로 옮기고, 60 배율의 대물렌즈 (numerical aperture, 0.8)를 통해 관찰하였다. z-stack imaging기법을 사용하여 세포의 z-axis를 1㎛ 간격으로 총 7개의 단면을 촬영하고, 7개의 단면을 하나로 합쳐 하나의 이미지를 얻었다. GFP는 이르곤 이온 레이저(argon ion laser)를 사용했을 때, 488㎚에서 여기(excitation)되고, 519㎚(10㎚ 통과대역(bandpass))에서 이미션(emission)되었다. RFP는 555㎚에서 여기(excitation, HeNe laser)되고, 565㎚에서 이미션(emission)되었다.

도 2의 (A)에 나타난 바와 같이, 뇌 해마세포에 신경독성을 유발하자, 신경세포 수상돌기의 위축, 수상돌기 가지 감소 및 가지치기 (prunning)의 형태학적 변화가 확인되었으며, 이러한 신경형태학적 변화는 헤르바세틴 30분 전처리를 통해 개선됨을 확인하였다. 도 2 (A)의 her 10, her20 및 her40은 각각 헤르바세틴의 처리 농도를 의미한다.

도 2의 (B)에서는 시냅스 손상 유발에 의해 감소된 PSD95에 의해 발현된 시냅스 접점 수가 Nutlin-3의 처리에 의해 현저히 증가하였음을 확인하였다. 또한, 도 2의 (C)에서는 헤르바세틴의 처리에 의하여, PSD95 발현으로 확인된 시냅스 접점 수가 Nutlin-3의 처리와 비슷한 수준으로 증가하였음을 확인하였다. PSD95는 시냅스 구성의 핵심적 역할을 하는 단백질로, 이러한 결과는 헤르바세틴이 신경세포 보호 효과를 가짐을 다시 한 번 증명한 결과이다.

1.3 산화질소(nitric oxide; NO) 방출 감소 효과

아질산염(nitrite) 측정을 위해 BV2 세포를 24웰 플레이트에 씨딩(seeding)한 후, 5% CO₂와 95% air, pH 7.4, 37℃의 세포 배양기에서 배양해 주었다. 헤르바세틴 (5, 10, 20, 40μM)이 들어간 5% FBS를 포함한 DMEM 배양액과 헤르바세틴이 첨가되지 않은 배양액을 세포에 각각 30분 동안 전처리 하였다.

이후, LPS(Lipopolysaccharide) 2㎍/㎖를 처리한 후, 24시간 째에 그리스 시약(griess reagent)을 처리한 후, 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 베지클(vehicle)에서 증가된 아질산염의 농도가 헤르바세틴의 전처리에 의해 헤르바세틴 20, 40μM에서 개선되었음을 확인하였다.

[실시예 2: 생체내( in vivo ) 뇌전증지속증 모델에서 헤르바세틴의 효과 구명]

생체뇌전증지속증 모델에서 헤르바세틴의 효과를 구명하기 위하여, 7~8주령된 수컷 C57BL/6 마우스를 상온에서 한 케이지 안에 3-4 마리씩 유지하였고, 음식과 물은 자율급식으로 진행하였다. 헤르바세틴 5㎎/㎏ 또는 25㎎/㎏을 각각 구강투여한 후, 30분 뒤에 아스트로핀(atropine) 1.2㎎/㎏을 복강투여 하였고, 다시 30분 뒤에 필로카르핀(pilocarpine) 320㎎/㎏을 복강투여 하였다. Stage 6 단계가 30분 이상 지속되는, 뇌전증지속증을 확인하고, 뇌전증지속증 후 1일째와 2일째 헤르바세틴 5㎎/㎏ 또는 25㎎/㎏을 각각 구강투여하였다. 이후, 3일째 되는 날부터 하기 실험을 수행하였다.

2.1 발작 단계 지연 효과

하기 표 1 및 도 4에 나타난 바와 같이, 1-6단계로 분류되는 racine scale을 기준으로 stage 5,6 단계로 발달하는 시간 및 빈도를 측정한 결과, 헤르바세틴 전처리를 통해 stage 6, 즉, 뇌전증지속증(status epilepticus) 발달이 지연되어 발작감수율(seizure susceptibility)을 감소시킨 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 필로카르핀(pilocarpine)에 의해 유도된 뇌전증지속증 모델에서, 뇌전증지속증 발달에 대한 헤르바세틴의 지연효과를 의미하는 결과이다.

하기 표 1에서 헤르바세틴 처리군의 'Stage 5 seizure Latency to onset'의 수치는 발작발생 시간을 의미하며, 'Stage 6 seizure latency to onset'의 수치는 뇌전증지속증 발생 시간을 나타낸다. 이는, 'Stage 6 seizure latency to onset'에 대하여 헤르바세틴 처리가 뇌전증지속 발생을 유의하게 지연시켰음을 의미한다.

Animals	Number of mice	stage 5 seizure		stage 6 seizure (SE)		Mortality (%)
Animals	Number of mice	Latency to onset (min)	Percentage (%)	Latency to onset (min)	Percentage (%)	Mortality (%)
pilocarpine	18	32.6±1.5	93.3±6.67	43.4±1.9	79±12.4	14.3±14.3
pilocarpine+Herbacetin 5㎎/㎏	25	34.6±1.9	100	49.7±2.8	83.7±8.6	16.2±8.4
pilocarpine+Herbacetin 25㎎/㎏	25	35.8±1.9	100	55.8±3.2^*	71.9±11.1	23.3±14.5

Data are expressed as mean ±SEM. *p<0.05 compared to vehicle.

2.2 신경보호 효과

헤르바세틴의 신경세포 보호 효과를 확인하기 위하여, Fluoro Jade-B 염색 및 Cresyl violet 염색을 수행하였다. 뇌 조직은 사용하기 전 날에 젤라틴이 코딩된 슬라이드에 붙인 후 상온에 보관하였다. 우선, Fluoro Jade-B 염색을 위하여, 뇌조직에 0.06% KMnO₄을 상온에서 10분 동안 처리하였고, 그 이후 수돗물에 세척한 후, 0.0004% Fluoro-Jade B을 상온에서 15분 동안 처리하였다. 이후, 조직을 증류수로 세척하고, DPX로 봉입하였다.

Cresyl violet 염색을 위하여, 뇌 조직을 미리 워밍업시킨 0.3% 크레실 바이올렛(Cresyl violet) 용액을 상온에서 20분 동안 처리하였다. 이후, 뇌 조직을 수돗물로 세척하고, 0.3% 빙초산(acetic acid glacial)을 5분 동안 처리하였다. 그후, 100% 에탄올을 처리하고, 곧바로 100% 자일렌을 처리하여 조직을 탈수시켰다. 이후 조직을 DPX로 봉입하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 필로카르핀(pilocarpine)에 의해 유도된 뇌전증지속증 모델에서 신경세포 사멸의 변화를 확인하였는데, 죽은 혹은 죽어가는 세포를 표지하는 Fluoro Jade B 염색의 결과로 베지클(vehicle)에서 증가된 양성세포(positive-cell)의 수는, 헤르바세틴 전처리에 의해 CA1 영역과 문(hilus)영역에서 감소하였음을 확인하였다 (도 5의 A, B, C). 또한, 그 후 진행된 살아있는 세포를 표지하는 크레실 바이올렛 염색(Cresyl Violet staining)을 통해 베지클(vehicle)에서 감소된 신경세포(neuronal cell)의 수가 CA1 영역과 문(hilus)영역에서 개선되었음을 확인하였다 (도 5의 D, E, F).

2.3 신경교세포 활성 완화 효과

신경교세포 활성을 확인하기 위하여, 뇌 조직을 PBS로 세척하고, 0.5% Triton X-100을 30분 동안 처리하였다. 이후, 뇌 조직을 5% BSA(in 0.4% Triton X-100)를 처리하여 블록킹(blocking)하였고, 이후 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 사용된 항체는 활성화된 미세아교세포(activated microglia)를 확인하기 위해 rat anti-CD11b(abcam)를, 활성화된 성상교세포(reactive astrocyte)를 확인하기 위해 mouse anti-GFAP(millipore)를 사용하였다.

면역염색된 신경세포들을 시각화하기 위해 2차 항체(Alexa Fluor 488 anti-rat IgG(invitrogen)와 Alexa Fluor 555 anti-mouse IgG(invitrogen))를 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 3회 세척하고, 커버슬립(coverslip)은 VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)을 사용해 봉입하였다. 세포관찰을 위해 Alexa Fluor 488(여기(excitation): 488㎚, 이미션(emission): >519㎚)과 Alexa Fluor 555(여기(excitation): 555㎚, 이미션(emission): >565㎚)로 염색된 신경세포들을 공초점 현미경(confocal microscope)을 사용해 관찰하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 필로카르핀(pilocarpine)에 의해 유도된 뇌전증지속증 모델에서 신경교세포 활성의 변화를 확인한 결과, 베지클(vehicle)에서 증가되는 CD11b(microglia, 도 6의 A, B)와 GFAP(astrocyte, 도 6의 A, C)의 강도(intensity)가 헤르바세틴의 전처리를 통해 해마 조직 문(hilus) 영역에서 유의하게 완화되었음을 확인하였다.

2.4 염증 사이토카인 발현 조절 효과

염증 사이토카인 발현을 확인하기 위하여, SE time을 기준으로 4시간째 마우스의 해마를 뇌 조직으로부터 분리하였다. 각 조직은 프로테아제 억제제(protease inhibitor)와 포스파타아제(phosphatase inhibitor)를 포함한 용해 완충액(lysis buffer)으로 균질화(homogenize)하였고, 13,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후, 상층액만을 추출해 실험에 사용되었다.

이후, BCA assay kit를 사용해 단백질 농도를 정량하였다. 단백질은 전기영동을 수행하여 각 사이즈 별로 분리하였고, PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 이후, 1차 항체(anti-IL-1β, anti-TNF-α, anti-iNOS 및 anti-β-actin)를 처리하고, 이차항체를 처리하여 상온에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 그 후, 웨스턴 블롯 디텍션 버퍼(western blotting detection buffers)를 사용해 화학발광(chemiluminescence)을 향상시킨 후, 현상하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 필로카르핀(pilocarpine)에 의해 유도된 뇌전증지속증 모델에서 염증 사이토카인의 단백질 발현 변화를 확인한 결과, 베지클(vehicle)에서 증가된 염증 사이토카인의 발현이 헤르바세틴의 전처리를 통해 감소됨을 확인하였다.

2.5 iNOS 활성 완화 효과

조직에서 iNOS 발현도 확인을 위해 뇌 조직을 PBS로 세척하고, 0.5% Triton X-100을 30분 동안 처리하였다. 이후, 뇌 조직을 5% BSA(in 0.4% Triton X-100)를 처리하여 블록킹(blocking)하였고, 이후 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 항체는 rabbit anti-iNOS(abcam), mouse anti-NeuN(millipore)을 사용하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 베지클(vehicle)에서 증가된 iNOS-양성세포(iNOS-positive cells) 수가 헤르바세틴의 전처리에 의해 해마 조직의 문(hilus) 영역에서 유의하게 감소되었음을 확인하였다.

Claims

헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 헤르바세틴(herbacetin)은,
홍경천(hongkyungcheon) 유래인 것을 특징으로 하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 뇌전증지속증 관련 질환은,
뇌전증지속증(status epilepticus) 또는 신경퇴행성 질환인 것을 특징으로 하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 신경퇴행성 질환은,
파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증지속증(status epilepticus) 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
헤르바세틴(herbacetin)을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 건강기능식품.