KR20230140344A - 등검은말벌 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
등검은말벌 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독의 인지기능 개선용, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 등검은말벌 유래 말벌독은 산화적 스트레스를 억제하며, 학습 또는 기억 능력을 개선하여 인지기능을 개선할 수 있으며, 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 조성물은 인지기능 개선용 건강기능식품, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 약침 조성물로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대사 과정에서 발생하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 산화적 스트레스로 알려진 반응성 분자로, 정상상태에서는 세포 내 항상성을 유지하고 있으나 자외선 등 외부 자극에 의해 과도하게 생성될 경우 세포 손상을 유발한다. Nrf2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2)는 산화 스트레스를 감지 역할을 하며, 항산화 효소 및 2상(Phase Ⅱ) 해독효소의 활성을 조절하는 전사인자이다. 정상상태에서 Nrf2는 keap1(Kelch-like ECH associated protein 1)과 복합체를 이루며 프로테아좀 경로(proteasome pathway)에 의해 분해되어 세포질 내에서 낮은 수준으로 존재하지만, 외부자극이나 산화적 스트레스에 의해 keap1 단백질로부터 분리되어 핵으로 이동한다. 핵에서 Nrf2는 small Maf 단백질과 이합체를 형성하여 항산화 반응 요소(antioxidant response element; ARE)에 결합해 ARE 의존성 항산화 효소들의 발현을 촉진시킨다. Nrf2에 의해 발현이 증가되는 대표적인 항산화 효소로서 heme oxygenase-1(HO-1), NAD(P)H:quinone oxidoreductase(NQO1), glutathione reductase(GR), gamma glutamylcysteine ligase(GCL) 등이 있다.
HO-1은 세포 내 Phase Ⅱ 효소 군의 구성원으로 ROS 생성과 산화적 스트레스에 대한 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. HO-1은 heme 분자를 분해하여 일산화탄소와 biliverdin으로 전환시키며, 자극이 없는 상태에서는 낮은 수준으로 발현된다. 외부 자극에 의해 ROS의 생성이 유발되면 HO-1이 발현되며, HO-1은 산화적 스트레스에 대한 보호 작용을 하고 세포와 조직의 항염증 활성에 기여한다. 또한 HO-1의 효소작용의 산물인 bilirubin은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 생성을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
한편, 봉독은 꿀벌의 독낭에서 인체에 과민반응을 일으키는 알러젠을 제거하고 치료물질만을 정제하여 만든 것으로, 소염진통 효과가 있다고 알려져 있다. 멜리틴(melittin)은 봉독의 40~50%에 해당하는 주요 성분으로, 26개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 항염증 활성이 우수하다고 알려져 있다. 그러나 멜리틴은 비특이적으로 세포에 작용하여 정상세포의 인지질층까지 분해할 수 있으며, 저농도에서도 적혈구에 빠르게 작용하여 강한 용혈작용을 유도하는 등 강한 독성이 있다.
본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독의 Nrf2 핵 이동 증가 및 HO-1 전사 활성화에 따른 산화적 스트레스 억제 효과, 스코폴라민 유도 학습 또는 기억 장애의 개선 효과를 확인하여, 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 봉독에 비해 부작용 우려가 현저하게 낮을 뿐만 아니라 항산화 효과가 우수하여 건강기능식품 또는 의약품 조성물로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병 마우스 모델에서 학습 또는 기억 장애의 개선 효과를 확인하여, 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 등검은말벌 유래 말벌독은 알츠하이머병 개선, 예방 또는 치료 효과가 있는 건강기능식품 또는 의약품 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명은 강한 독성을 가진 멜리틴을 대체하기 위해 등검은말벌 유래의 말벌독을 포함하는 인지기능 개선 효과가 우수한 건강기능식품, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과가 우수한 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 DPPH 라디칼 소거 활성 또는 ABTS 라디칼 소거 활성이 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 글루타메이트 유도 세포독성을 완화하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 Nrf2 또는 HO-1의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 세포 내 ROS 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 해마 조직의 손상을 예방 또는 완화하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 간 또는 대뇌 피질 조직의 지질 과산화를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 C99 및 COX-2의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등검은말벌 유래 말벌독은, 바람직하게는 아밀로이드베타의 응집을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은, 바람직하게는 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은, 바람직하게는 지질과산화에 따라 말론디알데히드(malondialdehyde)가 증가하여 발병하는 질환인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은, 바람직하게는 혈장 내 8-OHdG가 증가하여 발병하는 질환인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은, 바람직하게는 아밀로이드 베타의 응집이 증가하여 발병하는 질환인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약침 조성물을 제공한다.
본 발명은 등검은말벌 유래 말벌독의 인지기능 개선 효과, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 보이는 조성물을 제공하고자 한다. 본 발명의 등검은말벌 유래 말벌독은 산화적 스트레스를 억제하며, 학습 또는 기억 능력을 개선하여 인지기능을 개선할 수 있으며, 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 조성물은 인지기능 개선용 건강기능식품, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 약침 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 ABTS+ 라디칼 소거능을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 HT22 세포에 대한 세포독성을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 글루타메이트 유래 세포독성 완화 효과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 루시퍼라제 활성 증가 효과를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 Nrf2 및 HO-1 발현 증가 효과를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 HT22 세포 내 ROS 수준 감소 효과를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 동물모델 실험 과정을 도시한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 동물모델 실험에 따른 마우스 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수동 회피 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수중 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 Y- 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 해마 조직 H&E 염색 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 해마 조직에 대한 웨스턴블럿 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 대뇌 피질 조직의 지질 과산화(a)와 간 조직의 지질 과산화(b)를 확인한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델(5xFAD 형질전환 마우스)에서의 행동시험 과정을 도시한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 시료 처치에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수동 회피 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수중 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 Y- 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 대뇌 피질에서 염증 마커 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 해마 조직에서 아밀로이드베타 생성 지표 및 염증 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 혈장 내 8-OHdG를 확인한 도이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 간 및 대뇌에서 지질 과산화를 확인한 도이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 해마의 조직학적 손상 정도를 H&E 염색을 통해 확인한 도이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 해마 내 아밀로이드베타 응집 수준을 Thioflavin S 및 DAPI 염색을 통해 확인한 도이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 유래 말벌독 투여가 알츠하이머병 마우스(5xFAD)에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 ABTS+ 라디칼 소거능을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 HT22 세포에 대한 세포독성을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 글루타메이트 유래 세포독성 완화 효과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 루시퍼라제 활성 증가 효과를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 Nrf2 및 HO-1 발현 증가 효과를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독의 HT22 세포 내 ROS 수준 감소 효과를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 동물모델 실험 과정을 도시한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 동물모델 실험에 따른 마우스 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수동 회피 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수중 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 Y- 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 해마 조직 H&E 염색 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 해마 조직에 대한 웨스턴블럿 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 대뇌 피질 조직의 지질 과산화(a)와 간 조직의 지질 과산화(b)를 확인한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델(5xFAD 형질전환 마우스)에서의 행동시험 과정을 도시한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 시료 처치에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수동 회피 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 수중 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스 모델에서 등검은말벌독 또는 봉독 투여군의 Y- 미로 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 대뇌 피질에서 염증 마커 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 해마 조직에서 아밀로이드베타 생성 지표 및 염증 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 혈장 내 8-OHdG를 확인한 도이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 간 및 대뇌에서 지질 과산화를 확인한 도이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 해마의 조직학적 손상 정도를 H&E 염색을 통해 확인한 도이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 알츠하이머병 마우스의 해마 내 아밀로이드베타 응집 수준을 Thioflavin S 및 DAPI 염색을 통해 확인한 도이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 등검은말벌독 유래 말벌독 투여가 알츠하이머병 마우스(5xFAD)에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)일 수 있다.
등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax)은 노랑다리말벌(yellow-legged hornet)이라고도 불리며, 유럽과 아시아 전역에서 발견된다. 등검은말벌은 서양 꿀벌 등 유익한 수분 곤충 개체군을 포식하는데, 등검은말벌의 개체군이 점차 증가함에 따라 새로운 문제가 대두되고 있다.
일반적으로 봉독(bee venom)은 항염증 효과가 있다고 알려져 있으나, 봉독에는 독성이 강한 멜리틴(melittin)이 다량 포함되어 있어, 정상세포까지 독성을 미칠 우려가 있다. 이에 본 발명은 독에 비해 세포독성이 현저하게 낮을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 보이는 등검은말벌 유래 말벌독을 이용하여 인지기능 개선, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 보이는 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 등검은말벌 유래 말벌독을 포함하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 등검은말벌독 유래 말벌독에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(Adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 당 업계에서 일반적으로 활용되는 봉침으로 사용할 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(TweenW) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 포함하는 신경염증 약침 조성물을 제공한다. 본 발명의 약침 조성물은 유효성분인 등검은말벌 유래 말벌독을 포함하는 것 외에 통상의 클로로크레졸(chlorocresol) 등 여러 가지 보존제, 부형제를 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
약침요법은 경혈에 물리적인 자극을 주던 침구요법 치료 형태에서 화학적인 자극을 경혈에 추가한 한의학 고유의 치료 행위로, 약물을 경혈 자리에 극소량으로 주입함으로써 침의 작용과 약물의 작용을 병행하여 치료를 보다 극대화하는 요법이다. 즉, 의약 분야에서 사용되는 주사는 일정한 부위에 다량의 화학 약물을 주입하여 약물의 약효를 얻게 되는데 반해, 약침은 천연약물을 경혈 부위에 소량 주입함으로써 침의 지속적 자극 효과와 약물의 치료 효과를 함께 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약침 조성물은 생체 내 약물 전달에 사용하는 마이크로 니들에 적용할 수 있으며, 이 때 마이크로 니들을 단독으로 사용하거나, 마이크로 니들이 복수개 부착된 마이크로 니들 패치 등으로 사용할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<실시예 1> 등검은말벌독 추출
등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax)의 독낭을 제거하고, Spin-X 0.45 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 원심분리 튜브 필터(Corning Inc., Salt Lake City, UT, USA)를 이용하여 독을 추출하여 동결 건조하였다. 650마리의 성체 암컷 말벌로부터 124 mg의 말벌독을 수득하였다.
동결건조된 말벌독을 100 mg/㎖의 농도가 되도록 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해한 후 적정 농도로 희석하여 이하 실험에서 사용하였다.
<실험예 1> 등검은말벌독의 라디칼 소거능 확인
마우스 유래 해마 신경 세포주인 HT22 세포는 10% 열 비활성화 우태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에서 배양되었다. 세포 배양은 5% CO2/95% air 및 37℃의 humidified incubator에서 수행하였다. 세포는 0.05% EDTA(trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid) 나트륨염 용액을 사용하여 confluency가 약 70%에 도달했을 때 계대배양 하였다.
DPPH 라디칼소거능은 Hatano 등의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 각 농도별(0 ~ 500 μg/mL)로 에탄올에 희석한 시료 100 μL와 60 μM DPPH 용액 100 μL를 96 well plate에 분주하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼소거능은 다음식에 따라 계산하였다. As는 농도별시료를 첨가한 실험군, Ab는 blank를 첨가한 대조군, Ac는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 뜻한다.
[수학식 1]
DPPH 라디칼 소거 활성(%) = 100 - [(As - Ab) × 100 / Ac]
ABTS assay 방법은 Re et al.(1999)의 방법을 변형하여 실험하였다. 7.4 mM ABTS+ 용액을 제조한 후 여기에 potassium persulfate를 최종농도 2.6 mM가 되도록 용해시킨 다음, 빛이 들지 않은 암실에서 16시간 반응시켜 ABTS 시약을 제조하였다. ABTS 시약은 흡광도 734 nm에서 측정하여 흡광도 0.70으로 조정하여 사용하였다. ABTS 용액에 시료를 혼합하여 실온에서 6분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 즉, ABTS+ 라디칼 소거능은 blank 대비 시료의 감소된 흡광도의 비율로 계산되었다. 비교군으로 (주)청진바이오텍의 정제봉독을, 대조군으로 비타민 C를 사용하였다.
[수학식 2]
ABTS+ radical scavenging activity = (1 - Atest / Acontrol) × 100
도 1에 DPPH 항산화 실험 결과를, 도 2에 ABTS+ 실험 결과를 나타내었다. 도 1 및 도 2에서 보듯이, 본 등검은말벌독 유래 말벌독은 봉독과 유사한 수준의 항산화 효과를 보였다.
<실험예 2> 글루타메이트 유도 세포독성 완화 효과
마우스 유래 HT22 세포를 96 well plate에 3 × 103 cells/well로 분주하고 10%(v/v) FBS 함유 DMEM에서 24시간 배양하였다. 이후 각 well에 글루타메이트의 최종농도가 5 mM 되도록 미처리 또는 처리한 뒤 상기 실시예 1의 말벌독 또는 봉독을 추가 처리하였다. 봉독은 (주)청진바이오텍의 정제봉독을 사용하였다. 세포 생존율은 D-plusTM CCK cell viability assay kit (Dongin LS, Seoul, South Korea)를 이용하여 분석하였다.
도 3은 글루타메이트 미처리군의 세포독성 실험 결과이다. IC50 값은 본 발명의 말벌독이 > 120 ㎍/mL, 봉독이 > 6~12 ㎍/mL 로 확인되었으며, 이로부터 본 발명의 말벌독은 봉독에 비해 HT22 세포에 대한 세포독성이 낮음을 확인할 수 있었다.
도 4는 글루타메이트 처리군의 세포독성 실험 결과이다. 글루타메이트 처리에 따라 세포 내 산화 스트레스가 증가하여 세포독성이 유발되는데, 본 발명의 말벌독은 ≤ 40 ㎍/mL 처리에 따라 글루타메이트 유도 세포독성을 완화하였으며, 80 ㎍/mL 이상의 말벌독 처리는 오히려 독성을 유발하는 것으로 나타났다. 반면, 봉독은 ≤ 4 ㎍/mL 처리에 따라 글루타메이트 유도 세포독성을 완화하였다.
<실험예 3> 등검은말벌독의 항산화 효과
3-1. 루시퍼라제 리포터 분석(Luciferase reporter assay)
마우스 유래 HT22 세포를 TurboFect Transfection Reagents(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 pGL4.37[luc2P/ARE/Hyg] 벡터(Promega Corp., Madison, MA, USA)로 형질감염하였다. 이후, 400 μM hydromycin B를 포함하는 유지 배지에서 배양하였으며, 형질감염 세포를 HT22-ARE로 명명하였다.
6 well plate에 HT22-ARE 세포를 5 × 105 cells/well로 분주하고, 본 발명의 말벌독 5~30 ㎍/㎖와 (주)청진바이오텍의 봉독 0.5~3 ㎍/㎖을 각각 24시간 처리하였다. 이후, 세포를 회수하고 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해하였다. 용해물을 루시퍼라제 분석 기질인 루시페린과 혼합하고, 혼합물을 96 well 플레이트의 각 웰로 옮긴 뒤, Glomax 96 마이크로 플레이트 발광계를 사용하여 분석하였다. 루시퍼라제 분석 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 NRE-루시퍼라제 활성을 측정하였다. SFN(sulforaphane) 1 μM를 ARE 활성화제로 사용하였다.
도 5에서 보듯이, 본 발명의 말벌독은 농도 의존적으로 루시퍼라제 활성을 증가시켰으며, 이는 본 발명의 말벌독이 Nrf2 신호 전달 경로와 HO-1과 같은 다운스트림(downstream) 항산화 효소 유전자를 활성화했음을 시사한다.
3-2. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
마우스 유래 HT22 세포를 5 × 105 세포 밀도로 100 ㎜ 배양 접시에 플레이팅하고, 본 발명의 말벌독과 (주)청진바이오텍의 봉독을 24시간 처리하였다. HT22 세포를 회수하고, NE-PER® 핵 및 세포질 추출 시약 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분획화(fractionation) 하였다. 분획을 브래드포드 분석에 의해 정량화하고 동일한 양의 단백질을 로딩한 뒤 10% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하였다. 이후, 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮긴 뒤, 1차 및 2차 항체와 순차적으로 반응하도록 하였다. SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce, Cheshire, UK) 및 LAS4000 Mini(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)를 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였다. 디지털화 된 블롯 이미지는 Image-Studio Lite version 5.2 (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA)를 사용하여 분석하였다. SFN(sulforaphane) 5 μM을 대조군으로 사용하였다.
도 6에서 보듯이, 본 발명의 말벌독 처리에 따라 Nrf2와 HO-1의 발현이 증가하였으며, 특히 HO-1의 발현이 현저하게 증가하였다.
3-3. DCFDA 분석
세포 투과성 염료인 H2DCFDA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)는 세포 에스테라제에 의해 탈아세틸화되고, ROS에 의해 산화되어 형광성 물질인 DCF(dichlorofluorescein)를 생성한다. 따라서, 세포 내 ROS 수준은 H2DCFDA 처리 후 형광 수준을 기반으로 분석할 수 있다.
세포 내 ROS 수준을 측정하기 위해, HT22 세포를 10% poly-L-lysine 용액으로 코팅된 12 mm 커버글라스를 포함하는 24 well 플레이트에 3 × 104 cells/well로 분주하였다. 5 mM 글루타메이트 또는 말벌독을 6시간 처리한 뒤, 세포에 30 μM H2DCFDA를 로딩하였다. 커버글라스 위에 놓인 세포를 현미경 슬라이드에 장착한 뒤, 형광 현미경(Eclipe TE2000-U; Nikon, Tokyo, Japan)으로 형광 이미지를 촬영하였다.
도 7에서 보듯이, 글루타메이트에 처리에 따라 ROS 수준이 증가하였으며, 본발명의 말벌독 처리에 따라 ROS 수준이 감소하는 것으로 나타났다.
<실험예 4> 스코폴라민 유도 단기기억 장애 마우스 모델에서 등검은말벌독의 학습 및 기억력 개선 효과
6주령 수컷 C57BL/6J 마우스는 Orient Bio Inc. (Seongnam, South Korea)에서 구입하였다. 1주간 순응 후, 총 56마리의 마우스를 하기 표 1과 같이 각 그룹당 7마리 씩 8개의 그룹으로 분류하였다. SCO(scopolamine)은 치매증상의 하나인 기억력 감소를 유발하는 물질이다. Donepezil은 알츠하이머형 치매에 효과를 나타내는 약물로, 본 실험에서는 양성 대조군으로 사용하였다.
| Group | Treatment | |
| Sample | SCO (1 mg/kg BW) | |
| 1 | Vehicle | - |
| 2 | Vehicle | + |
| 3 | Donepezil(5 mg/kg BW) | + |
| 4 | BV at 5 ㎍/kg BW | + |
| 5 | BV at 50 ㎍/kg BW | + |
| 6 | WV at 50 ㎍/kg BW | + |
| 7 | WV at 250 ㎍/kg BW | + |
| 8 | WV at 500 ㎍/kg BW | + |
동결건조된 봉독(BV, 정제봉독, (주)청진바이오텍)과 말벌독(WV, 실시예 1의 등검은말벌 유래 말벌독)을 DMSO에 용해하여 사용하였다. Vehicle은 0.5 % DMSO 및 5% Tween® 80을 포함하는 생리식염수이다. SCO, 봉독, 말벌독은 모두 복강 내 주사하였으며, 봉독과 말벌독은 매일 SCO 주입 30분 후에 주입되었다. 행동시험(behavioral test)를 수행한 뒤, 마우스를 경추탈골로 희생시키고 뇌, 간 조직 및 혈액을 회수하였다. 실험 과정을 도 8에 기재하였다.
4-1. 수동 회피 실험
수동 회피 실험은 조명이 없는 어두운 공간과 조명이 있는 밝은 공간을 나누고 두 공간은 작은 개폐가 가능한 통로로 이루어져 있는 챔버에서 수행되었다. 마우스를 밝은 공간에서 1분간 조명을 켜지 않은 채로 적응시킨 후, 조명을 켠 후 2분간 적응시켰다. 이후 통로를 개방하고 마우스가 어두운 챔버로 이동하면 전기충격(0.5 mA, 1초)을 가하여 공포학습을 시켰다. 학습시킨 후 하루 뒤, 마우스에 기억시험을 실시하였으며, 마우스의 네 발이 챔버 내로 모두 들어가는데 걸리는 시간을 300초까지 측정하였다.
4-2. Morris 수중 미로 실험
Morris 수중 미로 실험은 반지름 75 cm, 높이 60 cm의 원형 수조에 물을 23 ± 2℃의 온도로 30 cm 높이로 채운 후, 수조를 사분면(N, S, E, W)으로 나누었다. 실험 첫날에는 도피대 없이 자유롭게 60초간 수영하여 적응훈련을 시켰다. 그 후 나흘 동안 사분면 중 한 구역(W 구역)에 도피대를 설치한 후, 마우스를 일정한 위치에서 입수시켜 60초 안에 도피대를 찾도록 훈련하였다. 4일간 반복 훈련하였으며, 마우스가 도피대를 찾지 못할 경우에는 손으로 도피대의 위치를 안내해 주어 도피대에 20초간 머물도록 훈련시켰다. 실험 5일째(probe test)에는 도피대의 높이를 낮추어 수면 아래 1 cm로 설치하고 독성이 없는 흰색 물감을 풀어 도피대가 보이지 않게 한 후, 마우스가 도피대를 찾는 시간을 60초간 video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain)을 이용하여 기록하였다.
4-3. Y-미로 실험
Y-미로는 길이 33 cm, 높이 15 cm, 너비 10 cm인 검은색 플라스틱으로, 3개의 구역이 120도의 각도로 위치하고 있다. 각 구역을 A, B, C로 구분한 후 한쪽 구역에 마우스를 위치하도록 하고 5분간 마우스의 이동 경로를 video tracking system(SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain)으로 측정하였다. 각 구역으로 입장 모든 행동 중, 연속적으로 3개의 서로 다른 구역에 들어가는 행동을 자발적 행동변화로 규정하고, 변경 행동력은 [자발적 행동변화의 횟수 / (모든 구역 입장 행동 횟수 - 2)] × 100으로 계산하였다.
4-4. 실험결과
도 9에서 보듯이, SCO, 봉독 또는 말벌독의 투여는 마우스의 체중 변화에 영향을 미치지 않았다.
수동 회피 실험 결과에서 보듯이, SCO에 의해 학습 및 기억력 저하된 마우스는 말벌독 투여에 따라 공포조건화에 따른 연합 기억력이 개선되었고(도 10), Morris 수중 미로 실험 결과에서 보듯이, 말벌독 투여에 따라 공간 학습 및 기억력이 개선되었고(도 11), Y-미로 실험 결과에서 보듯이, 말벌독 투여에 따라 단기기억능력이 개선되었다(도 12). 이러한 학습 또는 기억에 관여하는 부분은 뇌의 해마(hippocampus), 전뇌기저부(basal forebrain), 전전두엽 피질(prefrontal cortex) 등이다.
<실험예 5> 스코폴라민 유도 단기기억 장애 마우스에서 등검은말벌독 투여에 따른 조직 또는 혈장의 변화 분석
5-1. 해마 조직 분석
희생된 마우스의 뇌 조직을 포르말린 용액과 파라핀을 이용하여 고정한 뒤, microtome(RM-2025 RT; Leica, Nussloch, Germany)을 사용하여 파라핀 블록을 5 ㎛ 두께로 절단하였다. 해마의 일부를 포함하는 절편을 Superfrost microscope slides(Marienfeid, Lauda-Konigshfen, Germany)에 놓고 37℃에서 12시간 공기 건조한 뒤, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색하였다.
도 13에서 보듯이, SCO에 의해 해마 조직의 CA1 영역에서 조직학적 손상이 확인되었으며, 본 발명의 말벌독을 투여한 경우에는 SCO 투여 마우스에서 관찰되는 해마 조직의 손상이 예방 또는 개선되었다.
5-2. 해마 조직 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
마우스 해마 조직을 균질화하고, 상기 실험예 3과 같이 웨스턴 블럿을 수행하였다.
도 14에서 보듯이, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 Nrf2의 핵 전위가 증가하고, 후속적으로 다운스트림(downstream) 유전자인 HO-1의 발현 증가가 확인되었다.
5-3. 대뇌 피질 조직 및 간 조직의 지질 과산화 분석
마우스로부터 대뇌 피질 및 간 조직을 회수하여 균질화하고 OxiSelect TBARS Assay Kit(Enzo Life Science, Inc., NY, USA)를 사용하여 thiobarbituric acid 반응성 물질(TBARS) 분석을 통해 지질 과산화에 대한 바이오마커인 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)를 정량화 하였다.
도 15에서 보듯이, 본 발명의 등검은말벌독 투여에 따라 말론디알데히드가 감소하여, 지질 과산화가 감소하였다.
<실험예 6> 알츠하이머 마우스 모델에서 등검은말벌독의 효과 확인
5xFAD 계통의 마우스는 알츠하이머병 마우스 모델로, 아밀로이드베타의 축적과 노르아드레날린성(noradrenergic) 및 콜린성(cholinergic) 뉴런의 선택적 손실을 나타내며, 인지 장애(cognitive impairments)와 행동 이상(behavioral abnormalities)을 보인다.
수컷 5xFAD 마우스(6.5개월령, 평균 체중 32.9 g)는 표준 조건(20-25℃, 상대 습도 45±5%, 12시간 명암 주기)에서 대한바이오링크(서울, 한국)의 규칙적인 식이를 공급하여 준비하였다. C57BL/6J 야생형(WT) 마우스 7마리를 대조군으로 사용하였다. 35마리의 수컷 5xFAD 마우스를 하기 표 2와 같이 각 그룹당 7마리씩 5개의 그룹으로 분류하였다. 도네페질(Donepezil)은 알츠하이머형 치매에 효과를 나타내는 약물로, 본 실험에서는 양성 대조군으로 사용하였다.
| Group | Experimental groups (n=7/groups) | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Mouse type | Wild type (C57BL/6J) |
5xFAD Transgenic | ||||
| Sample Treatment (i.p.) |
Vehicle | Vehicle | Donepezil | BV | WV | |
| - | - | 5 mg/kg BW | 25 μg/kg BW | 250 μg/kg BW | 400 μg/kg BW | |
동결건조된 봉독(BV, 정제봉독, (주)청진바이오텍)과 말벌독(WV, 실시예 1의 등검은말벌 유래 말벌독)을 DMSO에 용해하여 사용하였다. Vehicle은 0.5% DMSO 및 5% Tween® 80을 포함하는 생리식염수이다. 14주간, 주 1회 도네페질, 봉독, 말벌독을 복강 내 주사하였다. 마우스의 체중은 샘플 투여가 시작된 후 14주간 모니터링하였다. 행동시험(behavioral test)를 수행한 뒤, 마우스를 경추탈골하여 희생시키고 뇌, 간 조직 및 혈액을 회수하였다. 실험 과정을 도 16에 기재하였다.
6-1. 수동 회피 실험(PAT, Passive avoidance task)
수동회피실험은 조명이 없는 어두운 공간과 조명이 있는 밝은 공간을 나누고 두 공간은 작은 개폐가 가능한 통로로 이루어져 있는 챔버에서 수행되었다. 마우스를 밝은 공간에서 1분간 조명을 켜지 않은 채로 적응시킨 후, 조명을 켠 후 2분간 적응시켰다. 이후 통로를 개방하고 마우스가 어두운 챔버로 이동하면 전기충격(0.5 mA, 1초)을 가하여 공포학습을 시켰다. 실험 당일 마우스를 밝은 공간에 놓고 10초 후에 통로를 열어 300초 동안 마우스의 움직임을 모니터링하였다. 밝은 공간에 머무는 시간을 대기 시간으로 측정하였다. 밝은 공간에 머무는 시간이 길수록 학습 및 기억 능력이 좋은 것으로 판단하였다.
6-2. Morris 수중 미로 실험(MWM, Morris water maze)
Morris 수중 미로 실험은 반지름 75 cm, 높이 60 cm의 원형 수조에 물을 23 ± 2℃의 온도로 30 cm 높이로 채운 후, 수조를 사분면(N, S, E, W)으로 나누었다. 실험 첫날에는 도피대 없이 자유롭게 60초간 수영하여 적응훈련을 시켰다. 그 후 나흘 동안 사분면 중 한 구역(W 구역)에 도피대를 설치한 후, 마우스를 일정한 위치에서 입수시켜 60초 안에 도피대를 찾도록 훈련하였다. 4일간 반복 훈련하였으며, 마우스가 도피대를 찾지 못할 경우에는 손으로 도피대의 위치를 안내해 주어 도피대에 20초간 머물도록 훈련시켰다. 실험 5일째(probe test)에는 도피대의 높이를 낮추어 수면 아래 1 cm로 설치하고 독성이 없는 흰색 물감을 풀어 도피대가 보이지 않게 한 후, 마우스가 도피대를 찾는 시간을 60초간 video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain)을 이용하여 기록하였다. 도피대에 도달 시간이 짧을수록 공간 기억력이 좋은 것으로 판단하였다.
6-3. Y 미로 실험(YMT, Y-maze task)
Y-미로는 길이 33 cm, 높이 15 cm, 너비 10 cm인 검은색 플라스틱으로, 3개의 구역이 120도의 각도로 위치하고 있다. 각 구역을 A, B, C로 구분한 후 한쪽 구역에 마우스를 위치하도록 하고 5분간 마우스의 이동 경로를 video tracking system(SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain)으로 측정하였다. 각 구역으로 입장 모든 행동 중, 연속적으로 3개의 서로 다른 구역에 들어가는 행동을 자발적 행동변화로 규정하고, 변경 행동력은 [자발적 행동변화의 횟수 / (모든 구역 입장 행동 횟수 - 2)] × 100으로 계산하였다.
[수학식 1]
Spontaneous alternation (%) = [number of alternations / (total arm entries - 2)] × 100
6-4. 실험 결과
도 17은 14주간의 마우스 체중 변화를 나타낸 도이다. 14주간 체중에 유의한 차이가 없었기 때문에, 봉독(BV) 및 말벌독(WV) 투여는 독성이 없는 것으로 간주되었다.
도 18은 수동 회피 실험 결과를 나타낸 도이다. 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 Latency time이 짧았으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 Latency time이 증가하여, 공포조건화에 따른 연합기억력이 개선되는 것으로 확인되었다.
도 19는 Morris 수중 미로 실험 결과를 나타낸 도이다. 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 플랫폼에 도달하는 시간이 길게 나타났으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 플랫폼에 도달하는 시간이 점차 짧아져, 공간 학습 및 기억력이 개선되는 것으로 확인되었다.
도 20은 Y 미로 실험 결과를 나타낸 도이다. 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 자발적 변화(%) 수치가 낮았으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 자발적 변화(%) 수치가 증가하여, 단기 작업기억 능력이 개선되는 것으로 확인되었다.
<실험예 7> 알츠하이머 마우스 모델에서 등검은말벌독 투여에 따른 염증 마커 단백질 발현 확인
마우스 대뇌 피질 또는 해마 조직을 145 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% Nonidet, 1% Triton-X 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics, Mannheim Germany)을 포함하는 저온 용해 완충액에서 균질화하였다. 4℃에서 15분간 10,000 × g 조건으로 원심분리(1730MR, Gyrozen)하고 상등액을 회수하였다. NE-PER™ 핵 및 세포질 단백질 추출 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 핵 및 세포질 분획으로 분리하였다. 조직을 세포질 분리 완충액 CER1에서 균질화하고, 균질액을 CER2와 혼합한 뒤, 4℃에서 10분간 10,000 × g 조건으로 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 세포질 분획 샘플을 표시한 뒤, 추가 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 잔류물은 핵 추출 시약과 혼합하고 얼음 위에서 30분간 반응시켰다. 4℃에서 30분간 10,000 × g 조건으로 원심분리한 뒤, 상등액을 핵 분획 샘플로 표시하고, 추가 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 각 분획의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 분석하였다. 단백질 추출물을 로딩 버퍼(RIPA buffer, 0.312 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 25% β-mercaptoethanol, 0.05% bromophenol blue, 10% glycerol 포함 5×sample buffer)에 희석하고 95℃에서 10분간 변성시켰다. 이후, 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리하고 PVDF 멤브레인(Merck Millipore Corp)으로 옮겼다. 멤브레인은 Tris-buffered saline(TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl)에 용해된 1% BSA(bovine serum albumin)로 차단하였다. PVDF 멤브레인은 COX-2, NF-κB, C99, BACE1, β-actin, lamin B에 대한 1차 항체와 반응시켰다. HRP(horse radish peroxidase)와 접합된 마우스 2차 항체는 각 1차 항체와 반응에 사용되었다. 항체 결합 단백질은 SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 개발되었고 ImageQuant™ Las 4000 mini(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)를 사용하여 디지털화되었다. 단백질 밴드의 강도는 Image Studio Lite version 5.2(Ll-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA)에 의해 측정되었다.
도 21에서 보듯이, 마우스 대뇌 피질에서, 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 COX-2 및 NF-κB 발현 수준이 증가하였으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 COX-2의 발현이 감소되었다. 도네페질과 봉독 투여군의 경우에는 발현 감소 효과가 미미하였다. 또한, NF-κB 발현 수준은 실험군 간에 유의한 차이가 없었다.
도 22에서 보듯이, 마우스 해마 조직에서, 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 C99, BACE1, COX-2 발현이 증가하였으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 C99, COX-2의 발현이 감소하였다. BACE1 효소 수준에는 영향을 미치지 않았다. C99와 COX-2는 알츠하이머 및 염증의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 보고된 바 있으며, 따라서 본 발명의 말벌독은 알츠하이머 진행에 대한 예방 가능성을 의미한다.
<실험예 8> 알츠하이머 마우스 모델에서 등검은말벌독 투여에 따른 산화적 스트레스 감소 효과 확인
DNA damage ELISA kit(Enzo Life Sciences International, Inc., Plymouth Meeting, PA, USA)를 사용하여 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) 혈장 수준을 측정하여 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 검사하였다. 50 μL의 혈장 샘플 및 일련의 표준 희석액을 사전 코팅된 8-OHdG 면역분석 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 실온에서 마우스 8-OHdG에 대한 1차 항체와 함께 1시간 반응시킨 뒤, HRP-접합된 항-마우스 IgG를 웰의 각 혼합물 100 μL에 첨가하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 23에서 보듯이, 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 8-OHdG 수준이 증가하였으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 8-OHdG 수준이 감소하여, DNA 손상을 효과적으로 억제하며 산화적 스트레스 수준을 감소시키는 것으로 확인되었다.
<실험예 9> 알츠하이머 마우스 모델에서 등검은말벌독 투여에 따른 항산화 활성 확인
마우스로부터 간 및 대뇌 피질 조직을 채취하고, lysis buffer(0.1 M phosphate buffer, pH 7.4)에 균질화하였다. 이후, 4℃에서 30분간 10,000 × g 조건으로 원심분리하였다. OxiSelect TBARS Assay Kit(Cat # ALX-850-087; Enzo Life Science, Inc.)를 사용하여 티오바르비투르산(thiobarbituric acid) 반응성 물질(TBARS)의 함량을 정량하기 위해 상층액을 회수하였다. 100 μL의 조직 상층액과 표준물질을 100 μL의 SDS 용해 용액과 혼합하였다. 2.5 mL의 TBA 시약을 첨가하고 95℃에서 1시간 반응시켰다. 흡광도는 532 nm에서 측정하였다. 결과는 Bradford assay로 보정되었다.
도 24에서 보듯이, 알츠하이머 마우스(5xFAD)는 일반 마우스(C57BL/6J)에 비해 간 및 대뇌 피질에서 MDA 수준이 증가하였으나, 본 발명의 말벌독 투여에 따라 MDA 수준이 현저하게 감소하여 지질 과산화 정도가 감소하였다. 즉, 본 발명의 말벌독은 간 및 뇌에서 항산화 활성이 있음을 의미한다.
<실험예 10> 알츠하이머 마우스 모델 조직화학적 분석
실험이 끝난 후 마우스를 경추탈골로 희생시킨 후 조직학적 분석을 위해 뇌 조직을 채취하였다. 채취한 조직은 10% 포르말린 용액에 고정하였다. 탈수 및 투명화 후 파라핀에 포매하여 시편을 준비하고 microtome(RM-2125 RT; Leica, Nussloch, Germany)을 사용하여 5 μm 두께로 절편하였다. 뇌 조직 절편을 관찰하고, 광학 현미경(microscope 80i, Nikon, Tokyo, Japan)으로 영상화하였다.
10-1. H&E 염색
Xylene(OCI, Seoul, Korea)으로 투명화 과정을 거친 조직 슬라이드를 hematoxylin 용액에 5분간 담가 핵을 염색하였다. 흐르는 물에 1분간 세척한 뒤, 조직 슬라이드를 eosin 용액에 2분간 담가 세포질을 염색하였다. 이후, 반대 방향으로 염색을 진행한 뒤, 투명화(클리어) 공정을 진행하였다. 커버 글라스 위에, xylene에 1:1로 희석된 malinol(Muto pure chemical, Tokyo, Japan) 용액을 떨어뜨린 후, 그 위에 염색된 조직 슬라이드를 덮어 마운팅하였다.
도 25에서 보듯이, 본 발명의 말벌독 투여에 따라, 마우스 해마 CA1 및 DG 영역에서 손상이 완화된 것을 확인하였다.
10-2. Thioflavin S 및 DAPI 염색
조직 절편을 thioflavin S(Sigma-Aldrich)와 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI) 염료로 염색하였다. xylene으로 수화시킨 조직에 아밀로이드베타 플라크를 염색하기 위해 thioflavin S 용액을 2시간 처리하였다. 80%(v/v) 에탄올로 세척한 뒤, DAPI 용액을 처리하였다. 이후, 증류수로 3회 세척하였다. 염색된 조직 절편에 mounting medium(Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark)을 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮어 마운팅하였다.
도 26에서 보듯이, thioflavin S 염색 결과, 본 발명의 말벌독은 해마 조직의 손상을 억제하고, 아밀로이드베타의 응집을 억제하여 알츠하이머 마우스(5xFAD)의 인지 결함(cognitive deficits)이 개선되는 것을 확인하였다.
도 27은 본 발명의 등검은말벌독 유래 말벌독 투여가 알츠하이머 마우스(5xFAD)에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 본 발명은 상기 알츠하이머 마우스(5xFAD) 모델 실험 결과에서 보듯이, 말벌독 투여에 따라 항산화, 항염증, 아밀로이드베타 생산 및 응집 억제를 통해 알츠하이머의 진행을 완화함을 확인하였다.
Claims (17)
- 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
DPPH 라디칼 소거 활성 또는 ABTS 라디칼 소거 활성이 있는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
글루타메이트 유도 세포독성을 완화하는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
Nrf2 또는 HO-1의 발현을 증가시키는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
세포 내 ROS 수준을 감소시키는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
해마 조직의 손상을 예방 또는 완화하는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
간 또는 대뇌 피질 조직의 지질 과산화를 억제하는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
혈장 내 8-OHdG를 감소시키는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
C99 및 COX-2의 발현을 감소시키는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
염증 마커 단백질의 발현을 감소시키는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 등검은말벌 유래 말벌독은,
아밀로이드베타의 응집을 억제하는 것인, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물. - 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax) 유래 말벌독을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은,
알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)인 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은,
지질 과산화에 따라 말론디알데히드(malondialdehyde)가 증가하여 발병하는 질환인 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은,
혈장 내 8-OHdG가 증가하여 발병하는 질환인 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은,
아밀로이드 베타의 응집이 증가하여 발병하는 질환인 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제12항의 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약침 조성물.
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