KR101637429B1 - 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경 질환용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알파-이소-쿠베베놀은 단백질의 발현 및 신경전달의 조절을 통해서 신경세포 보호함으로써, 신경질환을 개선, 치료 또는 예방하는 효과가 뛰어나고, 장기간 식품의 원료로 사용된 식물의 추출물에서 분리된 천연물로써 안정성이 뛰어나, 장기간 치료용 의약 또는 건강식품에 포함하여도 부작용이 일어나지 않는 효과를 갖는다.

Description

알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease containing α-iso-cubebenol}

본 발명은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

해마(Hippocampus)는 뇌의 기억 영역에서 중요한 부분으로, 신경 질환(neurodegenerative diseases)에 대한 치료는 해마의 역할인 것으로 알려져 있다. 해마 HT22 세포는 쥐과(Family)의 해마에서 분리되고, 글루타메이트(glutamate)에 유도된 신경 세포 독성과 관련된 많은 연구가 진행되고 있다. 글루타메이트는 중추신경(central nervous system, CNS)에서 주요 신경전달물질(neurotransmitter)이지만, 고농도에서는 신경 세포 독성 및 세포 사멸을 일으킨다. 해마 세포에서 글루타메이트는 세포 내 산화 방지 분자인 글루타티온(glutathione)을 감소시켜 N-아세틸-시스테인(N-acetyl-cysteine)의 흡수를 저해하며, 산화 스트레스 및 세포 사멸을 야기한다. 게다가, 뇌졸중(stroke) 및 허혈(ischemia)을 포함하는 일부 신경 질환 발생에 관여한다고 여겨진다.

또한, 신경 세포 독성을 유도하는 6-OHDA(6-hydroxydopamine)는 도파민의 하이드록실화된 아날로그로서, 6-OHDA를 처리하면 도파민 작동성 뉴런 손상으로 이어지는 산화 스트레스 또는 미토콘드리아 손상이 강화된다. 게다가, 상기 6-OHDA는 미토콘드리아 손상을 막음으로써 세포 사멸을 감소시키는 것으로 알려진 BCL-2를 감소시키고, 미토콘드리아 손상을 유발하여 세포 사멸을 일으키는 BAX를 유발함으로써 신경 독성을 일으킨다(Glinka et al., (1997), J. Neural Transm Suppl, 50, 55-66).

상기 글루타메이트 및 6-OHDA의 주요 메커니즘은 과도한 유입 칼슘(influx calcium) 분비 및 ROS(reactive oxygen species)의 형성, 아폽토시스의 유도, 미토콘드리아의 기능장애(dysfunction) 및 미토콘드리아에서 세포 기질 및 핵으로의 AIF(Apoptosis-inducing factor) 전위(translocate)와 관련되어 있다. 또한, ERK(extracelluar-regulated kinase), JNK(c-Jun NH2-terminal kinase) 및 p38을 포함하는 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)를 활성화 시킨다. 상기 ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPKs는 염증 사이토카인, 흥분세포독성(excitotoxicity) 및 산화스트레스 같은 다양한 세포의 스트레스 자극에 의하여 활성화된다. MAPKs의 활성은 전사 활성 조절 및 생성; 또는 조절 분자에 따라 다양한 세포의 기능을 조절할 수 있으며, 모든 인자는 신경 질환과 높은 연관성이 있다. 또한, 상기 MAPK 경로는 자외선, 사이토카인 및 신경독성에 의해 활성화되고, 신경 세포 사멸 및 분화를 유도한다(Klintworth et al., (2007), Toxicol Sci, 97, 149-62; Gomez-Lazaro et al., (2008), J Neurochem, 104, 1599-612). 상기 AIF는 미토콘드리아의 막간 공간(intermembrane spaces)에서 분비되고, 핵으로 이동됨으로서 DNA 분절 및 세포 사멸을 일으킨다(Hong et al.,(2004), Trends Pharmacol. Sci. 25, 259-264).

신경 세포에는 상기 글루타메이트 또는 6-OHDA에 의한 신경세포 독성을 방지하기 위한 보호 메커니즘이 발달되어 있으며, 이는 HO-1(heme oxygenase-1) 및 NQO-1(NAD(P)H quinone oxidoreductase-1)과 같은 단계 II 해독/산화방지 효소(phase II detoxifying/antioxidant enzymes)와 관련이 있다. 신경 보호 메커니즘은 결과적으로, ROS의 형성을 방지하거나 또는 ROS를 해독하는 것이다. CREB 및 Nrf-2 전사 인자의 유발을 통한 단계 II 해독/산화방지 효소는 신경 보호 메커니즘의 집합성(convergence)을 조절한다. 최근 연구에서, CREB 및 Nrf-2의 활성은 PKA, PI3K/Akt 및 MAPKs와 같은 몇몇의 신호 도입 경로의 활성을 요구한다고 보고되었다. 전사 인자 CREB 및 Nrf-2의 활성화는 근본적인 신경세포 보호 메커니즘의 과정에 대한 주요한 기여 인자로 여겨지고 있다.

상기 Nrf2 활성은 항산화와 관련된 유전자를 발현시킨다. 정상조건에서는, Nrf2는 Kelch-유사 ECH-관련된 protein 1(Keap1)에서 격리되고(sequestered) 유비퀴틴-의존적 26S 프로테아솜 시스템에 의해 분해된다. 활성화시에는, Nrf2는 Keap1에서 분비되고, 핵을 전위시키며, HO-1 및 NQO1(Chen et al., (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 2933-2938; Innamorato et al.,(2008), J. Immunol. 181, 680-689; Li et al.,(2007), Toxicol Lett, 171, 87-98; Scapagnini et al., (2011), Mol. Neurobiol. 44, 192-201)을 포함하는 항산화-관련된 유전자의 프로모터 지역에 위치한 항산화 반응 성분(antioxidant response elements, AREs)을 결합한다. 또한, 상기 CREB는 신경보호 메커니즘 및 세포 생존과 관련된 주요 전사 인자로 알려져 있다. 상기 CREB는 전사 활성을 조절하기 위한 프로모터의 cAMP 반응 성분(cAMP response element, CRE)과 특이적으로 결합한다(Cheng et al., (2007), Future Oncol. 3, 475-480; Katoh et al.,(2001), Genes Cells. 6, 857-868; Lee et al.,(2005), The Journal of biological chemistry, 280, 40398-40401). CREB/Nrf2 경로는 PKA, PKB 및 MAPKs에 의해 활성화된다. 하지만, CREB/Nrf2 활성으로 이어지는 상기 신호 경로는 세포 타입 및 자극에 따라 달라진다(Park et al.,(2013), Toxicol Appl Pharmacol, 268, 68-78; Baxter et al.,(2011), Journal of neurochemistry,118, 365-378; Nakaso et al.,(2008), Neurosci. Lett. 432, 146-150)

신경세포 손상으로 인해 발병되는 주요 질병으로 알려진 알츠하이머(alzheimer)는 치매를 일으키는 대표적인 질환으로, 뇌의 신경세포가 퇴화되고 뇌가 축소되어, 점진적인 정신장애를 일으키는데 기억장애, 판단장애, 추상적 사고의 장애 및 인격변화 등을 포함한 지적 기능의 손실을 특징으로 한다. 알츠하이머병 환자의 경우, 베타아밀로이드 단백질이 과도하게 만들어져 뇌에 축적되며, 이 단백질이 활성산소를 만들어 뇌세포를 장기간에 걸쳐 손상시키는 것으로 알려져 있다. 아세틸콜린에스터라제 억제제는 경도 및 중등도의 알츠하이머병에서 효과를 인정받고 있으나, 미국 식품의약국에서 공식적으로 효과가 인정되어 널리 사용되고 있는 성분으로는 타크린, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 등 중 일부는 간 독성을 보여 현재 거의 사용되지 않는 것으로 알려져 있다.

한편, 오미자(Schisandra chinensis)는 한국, 중국, 러시아 및 일본에서 광범위하게 퍼져있는 목본성 덩굴(woody vine)로서, 야뇨증(enuresis), 천식(asthma), 성적 약점(sexual weakness), 발기 부전(impotence), 임질(gonorrhea), 이질(dysentery), 장기화된 설사(protracted diarrhea), 갈증(thirst) 및 당뇨병(diabetes)에 대한 전통적인 약재로서 사용되어 왔다. 일부 연구에서는 상기 오미자의 열매가 주요 성분이 생물학적 및 의약적 특징이 있는 것을 확인하였다. (Choi et al.,(2006) J Nat Prod, 69, 356-9; Guo et al., (2008), Eur J Pharmacol, 591, 293-9; Kim et al., (2010), Phytother Res, 24, 193-7). 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol)은 상기 오미자에서 추출한 리그난(lignin)이다.

따라서, 부작용을 나타내지 않는 천연물질 유래의 신경질환 치료제의 개발이 요구되고 있으며, 뇌의 신경세포의 특성을 고려할 때, 부작용이 없어 지속적으로 섭취가 가능한 천연물질 유래 물질 중에서 신경세포의 재생을 효과적으로 상승시킬 수 있는 물질의 개발과, 이를 이용한 신경질환의 예방 필요성이 새롭게 인식되고 있다.

KR 10-0981649

본 발명의 목적은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol)은 디벤조사이클로옥타디엔(dibenzocyclooctadiene)계 리그난(lignan)으로 인공적으로 합성하거나, 천연물에서 추출된 것을 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 오미자(Schizandra chinensis)로부터 추출된 것 일 수 있다.

상기 오미자로부터 알파-이소-쿠베베놀을 추출하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.

상기 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 알파-이소-쿠베베놀의 농도는 전체 조성물에 대하여 1 μM이상으로 포함될 일 수 있고, 바람직하게는 10 μM이상의 농도로 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 알파-이소-쿠베베놀은 손상된 신경세포의 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)의 분비를 막아 세포 독성으로부터 신경세포를 보호하여, 신경질환의 예방 또는 치료하는 효과를 가진다. 또한, 세포 내 ROS(Intracellular Reactive oxygen species) 및 칼슘의 축적을 저해하고, 신경세포의 sub-G1 분율을 감소시켜 아폽토시스(apoptosis)를 저해하며, 미토콘드리아에서 분비된 세포사멸 유도인자(apoptosis inducing factor, AIF)를 저해하여 신경세포를 보호함으로써, 신경 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.

또한, 알파-이소-쿠베베놀은 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및 p38을 포함하는 MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 신호전달 단백질의 활성화를 억제시키고, CREB(cAMP response element-binding protein)단백질의 인산화 반응 및 Nrf2(NF-E2-related factor-2)의 핵 축적을 유도하며, ARE 및 CREB 단백질의 프로모터 활성을 증가시키고, HO-1 및 NQO-1 단백질 발현을 증가시켜 신경 세포를 보호함으로써, 신경질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.

상기 조성물은 알파-이소-쿠베베놀을 단독으로 포함하거나, 신경질환의 치료, 예방 또는 개선에 효과가 있는 물질을 유효성분으로 더 포함할 수 있고, 상기 유효성분 외에도 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분, 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 통상의 것을 모두 사용 가능하고, 일 예로 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 성분들은 유효성분 즉, 알파-이소-쿠베베놀에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 신경 질환은 신경 또는 신경세포에 문제가 생겨 유발될 수 있는 질환을 모두 포함하는 것으로. 바람직하게는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증, 뇌졸증, 국소빈혈, 척수손상 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 신경 질환일 수 있다. 알파-이소-쿠베베놀을 문제가 유발된 신경 또는 신경세포에 처리하는 경우 신경세포를 보호하는 작용에 의하여 신경 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 신경 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 알파-이소-쿠베베놀의 일일 투여량은 0.01 내지 10000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 1 내지 20 ㎎/㎏이고, 하루 1회 내지 3회에 나눠 투여하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 신경 질환 장애로 인한 질병의 개선을 목적으로 하는 건강식품에 포함될 수있으며, 본 발명의 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 합성 또는 추출물로부터 분리된 것을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 또한 상기 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적절하게 조절하여 사용 될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 보조 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 조성물을 건강 식품에 포함하는 경우 신경세포의 보호효과를 통해서 신경 질환의 유발을 예방하거나, 유발된 신경 질환을 개선하는데 효과적 일 수 있다.

본 발명에 따른 알파-이소-쿠베베놀은 단백질의 발현 및 신경전달의 조절을 통해서 신경세포 보호함으로써, 신경질환을 개선, 치료 또는 예방하는 효과가 뛰어나고, 장기간 식품의 원료로 사용된 식물의 추출물에서 분리된 천연물로써 안정성이 뛰어나, 장기간 치료용 의약 또는 건강식품에 포함하여도 부작용이 일어나지 않는 효과를 갖는다.

도 1은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 MTT 검정을 통하여 세포 생존률을 측정한 값을 나타낸 도이다. 그래프의 세로축은 세포의 생존률을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 2는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트(GLU)로 자극한 후 MTT 검정을 통하여 세포 생존률을 측정한 값을 나타낸 도이다. 그래프의 세로축은 세포의 생존률을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 3은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 분비를 확인한 그래프로, 그래프의 세로축은 LDH 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 4는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트GLU)로 자극한 후 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 분비를 확인한 그래프로, 그래프의 세로축은 LDH 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 5는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 세포 내 ROS를 측정한 값을 나타낸 그래프로, 그래프의 세로축은 ROS 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 6은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 세포내 칼슘을 측정한 값을 나타낸 그래프로, 그래프의 세로축은 세포내 칼슘을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 7은 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트(GLU)로 자극한 후 세포내 ROS를 측정한 값을 나타낸 그래프로, 그래프의 세로축은 ROS 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 8은 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트(GLU)로 자극한 후 세포내 칼슘을 측정한 값을 나타낸 그래프로, 그래프의 세로축은 세포내 칼슘을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이고, 가로축은 알파-이소-쿠베베놀의 처리량을 나타낸 것이다.
도 9는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 유세포 분석을 통하여 Sub-G1 분율 피크를 측정한 값을 나타낸 도이다. Con은 대조군을 나타내고, CLU 는 글루타메이트만 처리한 군, α-iso-cubebenol+GLU는 알파-이소-쿠베베놀을 처리 후 글루타메이트를 처리한 군을 나타낸다.
도 10은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 TUNEL 분석한 값을 나타낸 도이다. Con은 대조군을 나타내고, 6-OHDA는 6-OHDA 만 처리한 군, α-iso-cubebenol+6-OHDA는 알파-이소-쿠베베놀을 처리 후 6-OHDA를 처리한 군을 나타낸다.
도 11은 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 TUNEL 분석한 값을 나타낸 도이다. Con은 대조군을 나타내고, CLU 는 글루타메이트만 처리한 군, α-iso-cubebenol+GLU는 알파-이소-쿠베베놀을 처리 후 글루타메이트를 처리한 군을 나타낸다.
도 12는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 유세포 분석을 통하여 JC-1을 측정한 값을 나타낸 도이다. Con은 대조군을 나타내고, 6-OHDA는 6-OHDA 만 처리한 군, α-iso-cubebenol+6-OHDA는 알파-이소-쿠베베놀을 처리 후 6-OHDA를 처리한 군을 나타낸다.
도 13은 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 유세포 분석을 통하여 JC-1을 측정한 값을 나타낸 도이다. Con은 대조군을 나타내고, CLU 는 글루타메이트만 처리한 군, α-iso-cubebenol+GLU는 알파-이소-쿠베베놀을 처리 후 글루타메이트를 처리한 군을 나타낸다.
도 14는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통하여 AIF의 발현을 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 15는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통하여 AIF의 발현을 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 16은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통하여 ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPKs의 발현 수준을 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 17은 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통하여 ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPKs의 발현 수준을 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 18은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통해 p-PKA, PKA, p-CREB 및 CREB의 발현, Nrf-2 핵 분포를 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 19는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통해 p-PKA, PKA, p-CREB 및 CREB의 발현, Nrf-2 핵 분포를 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 20은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 듀얼-루시퍼라제(ARE/CREB Relative Luciferse) 활성을 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 21은 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 듀얼-루시퍼라제(ARE/CREB Relative Luciferse) 활성을 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 22는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통해 HO-1 및 NQO-1 발현을 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 23은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극한 후 HO-1 프로모터-루시퍼라제 활성을 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 24는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 웨스턴 블랏을 통해 HO-1 및 NQO-1 발현을 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 25는 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극한 후 HO-1 프로모터-루시퍼라제 활성을 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 26은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 CREB 및 Nrf-2 siRNA를 이입한 후, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극하고, 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 분비 검사한 값을 나타낸 도이다.
도 27은 마우스의 해마 HT22 세포에 CREB 및 Nrf-2 siRNA를 이입한 후, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극하고, 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 분비 검사한 값을 나타낸 도이다.
도 28은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 CREB 및 Nrf-2 siRNA를 이입한 후, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 6-OHDA로 자극하고, TUNEL 검사한 값을 나타낸 도이다.
도 29는 마우스의 해마 HT22 세포에 CREB 및 Nrf-2 siRNA를 이입한 후, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하고 글루타메이트로 자극하고, TUNEL 검사한 값을 나타낸 도이다.

이하, 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 시약 준비 및 세포 배양

실험예 1-1. 시약의 준비

본 발명에서 사용된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Gibco/BRL(Grand Island, NY, USA)에서, MTT(3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) 및 다른 시약은 Sigma-Aldrich(MO, USA)에서 구입하였다. 또한, CREB(cAMP response element-binding protein)에 대한 siRNAs 및 Nrf-2, 알파-튜불린(α-tubulin), TBP, ERK, JNK, p38, Nrf-2, HO-1 및 NQO1 항체는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입하였다. AIF 및 COXIV에 대한 항체와 인산화된 p-ERK, p-JNK, p-p38, p-PKA, PKA, p-CREB 및 CREB에 대한 항체는 Cell signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하였다. FuGENE HD 형질주입(transfection) 시약 및 X-treme GENE siRNA 형질주입 시약은 Roche(Indianapolis, IN)에서, 세포독성 검출 키트(Cytotoxicity detection kit)(LDH assay)는 Roche Applied Science(Rotkreuz, Switzerland)에서, APO-BrdU™ TUNEL 검정 키트는 Invitrogen(CA, USA)에서, 핵 추출 키트는 Active Motif(San Diego, CA, USA)에서, 미토콘드리아 추출 키트는 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서 각각 구입하였다.

실험예 1-2. 세포 배양

본 발명의 세포를 배양하고 실험에 이용하기 위하여, 원광대학교(Iksan, Korea)에서 분양받은 해마(Hippocampal) HT22 세포주는 5% 열-비활성화된 FBS를 첨가한 DMEM 배지의 단분자막(monolayer)에 넣어 5% CO₂가 포함한 가습된 대기(atmosphere)에서 37℃로 배양하였다. 세포 배양이 연장되면서 발생할 수 있는 세포 특성의 변화를 막기 위하여, 모든 실험은 15 내지 25 계대(passages) 사이에 수행하였다. 각 세포 현탁(cell suspension)은 지수증식(exponential growth)을 측정하기 위하여, 2일 마다 트립신(trypsin)/EDTA 처리하여 계대배양(subculture)하였다.

또한, 인간 신경모세포종(Human neuroblastoma) SH-SY5Y 세포주는 American Type Culture collection (ATCC, USA)에서 분양받았고, 15% FBS가 첨가된 MEM 배지에서 상기 해마(Hippocampal) HT22 세포주와 동일한 방법으로 배양하였다.

실험예 2. 자극제에 의해 유도된 신경세포 사멸에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 신경세포 보호 효과 검증

2-1. 세포 생존율 검사(Cell viability assay)

자극제에 의해 유도된 신경세포 사멸에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 세포보호 효과를 검증하기 위하여, 하기와 같이 신경 세포 생존율 검사를 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마(Hippocampal) HT22 세포 및 인간 신경모세포종(Human neuroblastoma) SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 24시간 처리한 후, 알파-이소-쿠베베놀이 상기 각 신경세포에 유해성이 없음을 확인하였다. 그 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 각각 0, 5, 10 및 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 상기 세포에 마우스의 해마 HT22 세포에는 신경 세포 손상을 유발하는 자극제(stimulator)로써 5 μM 농도의 글루타메이트(glutamate)를 12시간 처리하였고, 인간 신경모세포종(Human neuroblastoma) SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-하이드록시도파민(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)을 24시간 처리하였다.

그 후, 상기 처리된 세포를 4x10⁴ cells/well의 농도로 24-웰 플레이트에 넣어 배양하고, MTT 용액(50g/ml)를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 5% CO_2, 37℃가 유지되는 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 상층액을 제거하였다. 생존한 세포에서 형성된 포르마잔 크리스탈(Formazan crystals)을 다이메틸설폭시화물(dimethylsulfoxide, DMSO)를 용매로 이용하여 가용화(solubilized)하였다. 각 웰의 흡광도(absorbance)를 마이크로 플레이트 리더(Wallace, Boston, MA, USA)를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 증가함에 따라, 6-OHDA가 처리된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포 생존율이 증가함을 확인하였다. 따라서 알파-이소-쿠베베놀은 농도의존적으로 신경세포를 보호하는 효과를 가짐을 확인하였고, 특히 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 20 μM 이상인 경우부터 생존률이 현저히 상승하는 것을 확인할 수 있었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀이 처리된 마우스의 해마 HT22 세포와 비교하였을 때, 글루타메이트에 의해 자극된 마우스의 해마 HT22 세포는 53.1% 만이 생존하나, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 증가함에 따라, 세포의 생존량이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 알파-이소-쿠베베놀이 농도의존적으로 뇌의 해마세포도 보호하는 효과를 가짐을 확인하였고, 특히 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 10 μM 이상인 경우부터 생존률이 현저히 상승하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀의 농도의존적으로 손상된 신경세포의 생존율을 증가시킴을 확인하였다.

2-2. 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 분비 검사

자극제에 의해 유도된 신경 세포 사멸에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 세포보호 효과를 검증하기 위하여, 하기와 같이 LDH 분비 검사를 수행하였다.

보다 구체적으로, 세포외 LDH 활성은 세포독성 진단 키트를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분광광도법을 실시하여 측정하였다. 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 5 내지 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 상기 세포에 마우스의 해마 HT22 세포에는 신경 세포 손상을 유발하는 자극제로서 5 μM 농도의 글루타메이트를 12시간 처리하였고, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-OHDA를 24시간 처리하였다. 그 후, 상등액을 각 웰에서 추출한 뒤, 촉매 용액을 웰에 첨가한 뒤 실온에서 30분 동안 배양하였다. 각 웰의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(Wallace, Boston, MA, USA)를 이용하여 490 nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀 처리 농도가 증가함에 따라, 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포의 젖산탈수소효소 분비가 유의적으로 저해되었음을 확인하였다. 특히, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 20 μM 이상인 경우부터 젖산탈수소효소 분비가 유의적으로 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀 처리 농도가 증가함에 따라, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포의 젖산탈수소효소 분비가 유의적으로 저해되었음을 확인하였다. 특히, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 10 μM 이상인 경우부터 젖산탈수소효소 분비가 유의적으로 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀은 손상된 신경세포의 젖산탈수소효소의 분비를 저해하여 세포 독성으로부터 신경세포를 보호함을 확인하였다.

2-3. 세포내의 ROS 및 칼슘 측정

자극제에 의해 유도된 신경 세포 사멸에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 세포보호 효과를 검증하기 위하여, 하기와 같이 세포내의 ROS 및 칼슘을 측정하였다.

보다 구체적으로, 세포내의 ROS 및 칼슘 수준을 평가하기 위하여, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 0, 5, 10 및 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 마우스의 해마 HT22 세포에는 5 μM 농도의 글루타메이트를 12시간 처리하였고, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-OHDA를 24시간 처리하였다. 그 후, 상기 세포에 ROS-민감한 형광 지표인 CM-H2DCFDA 또는 Ca²⁺ 민감한 형광 지표인 Fluo 4-AM을 5% CO_2, 37℃하에서 1시간동안 처리하였다. 상기 세포를 수득하고, PBS로 3회 세척하였다. 형광강도(fluorescence intensity)는 유세포분석기로 488 nm의 여기 파장(excitation wavelength) 및 525 nm의 방사 파장(emission wavelength)으로 측정하였다. 데이터 분석은 CXP software 2.0(Beckman Coulter)을 이용하여 수행하였다. 그 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 증가함에 따라, 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포내의 ROS 및 칼슘의 축적이 감소됨을 확인하였다. 특히, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 20 μM 이상인 경우부터 ROS 및 칼슘의 축적이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀처리 농도가 증가함에 따라, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포내의 ROS 및 칼슘의 축적이 감소됨을 확인하였다. 특히, 알파-이소-쿠베베놀의 처리 농도가 20 μM 이상인 경우부터 ROS 및 칼슘의 축적이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀은 신경세포의 세포내의 ROS 및 칼슘의 축적을 감소시켜 신경보호능을 가짐을 확인하였다.

실험예 3. 자극제에 의해 유도된 sub-G1 분율(fraction) 및 아폽토시스 세포 사멸(apoptotic cell death)에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 신경세포 보호 효과 검증

3-1. Sub-G1 분석

자극제에 의해 유도된 sub-G1 분율 및 아폽토시스 세포 사멸에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 세포보호 효과를 검증하기 위하여, 하기와 같이 Sub-G1 분율을 측정하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 12시간 처리하였다. 그 후, 마우스의 해마 HT22 세포에는 5 μM 농도의 글루타메이트를 12시간 처리하였고, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-OHDA를 24시간 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 800 rpm에서 3분 원심분리하여 수득하고, PBS로 2회 세척한 뒤, 75% 에탄올에 하루 종일 두어 고정시켰다. 세포계수 분석을 실시하기 전에, 상기 고정된 세포를 PBS로 세척하고, 최종 농도 50 ㎍/ml인 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 암조건에서 10분간 처리하여 배양하였다. 아폽토시스(apoptosis)의 비율은 CXP software 2.0 (Beckman Coulter)로 측정한 sub-G1 피크의 백분율로 계산되었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

그 결과, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포를 6-OHDA로 자극하였을 때, 대조군에 비해 sub-G1 분율이 증가하고, 유도된 사멸 세포의 증가함을 확인하였다. 그러나, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 6-OHDA 로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서의 아폽토시스는 감소함을 확인하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 마우스의 해마 HT22 세포를 글루타메이트로 자극하였을 때, 대조군에 비해 sub-G1 분율이 증가하고, 사멸 세포가 증가함을 확인하였다. 그러나, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서의 아폽토시스는 감소함을 확인하였다

따라서, 6-OHDA 또는 글루타메이트로 유도되는 아폽토시스 세포 사멸에 대하여 신경 세포의 보호 효과가 있음을 확인하였다.

3-2. DNA 분절 검정을 통한 아폽토시스 세포 사멸 측정

자극제에 의해 유도된 sub-G1 분율 및 아폽토시스 세포 사멸에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 세포보호 효과를 검증하기 위하여, 하기와 같이 TUNEL 분석을 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 12시간 처리하였다. 그 후, 마우스의 해마 HT22 세포에는 5 μM 농도의 글루타메이트를 12시간 처리하였고, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-OHDA를 24시간 처리하였다. 그 후, 세포는 APO-BrdU™TUNEL 분석 키트 (Invitrogen, San Diego, CA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 TUNEL 분석하여 측정하였다. 이 때 유세포 분석기(플루오레세인이소티오시안산염 시약, 488 nm 여기 및 520 nm의 방출)를 이용하여 수행하였다. 데이터 분석은 CXP 2.0(Beckman Coulter)를 이용하여 수행하였다. TUNEL 염색된 세포는 세포괴사 신호 케스케이드(cascades)에 의해 야기되는 핵 DNA 분절을 나타낸다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하지 않고 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서는 DNA 분절된 TUNEL-염색된 세포의 수가 5.5%에서 28.1%로 증가함을 확인하였으나, 알파-이소-쿠베베놀을 처리한 경우, 6-OHDA 자극의 효과를 억제시킴을 확인하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서 DNA 분절은 유의적으로 증가됨을 확인하였으나, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서의 DNA 분절은 일반적인 수준임을 확인하였다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀은 손상된 신경세포의 DNA가 분절되는 것을 방지함으로써 손상된 신경세포의 세포사멸을 방지하여, 신경세포를 보호하는 효과를 가짐을 확인하였다.

실험예 4. 자극제에 의해 유도된 미토콘드리아 세포막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm) 분열 및 미토콘드리아 AIF 수준에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 효과

4-1. 미토콘드리아 세포막 전위(MMP, ΔΨm)의 검정

미토콘드리아의 손상을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하여 분자 프로브 JC-1을 이용하여 미토콘드리아 세포막 전위를 확인하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 상기 마우스의 해마 HT22 세포에는 신경 세포 손상을 유발하는 자극제로서 5 μM 농도의 글루타메이트를 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-OHDA를 각 0, 4, 8, 12, 16 및 24시간처리하였다. 그 후, 상기 세포의 미토콘드리아 세포막 전위는 친유성기 양이온 프로브(lipophilic cationic probe) JC-1(5,5', 6,6'-tetrachloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide)로 이루어진 J-화합체(J-aggregate)를 이용하여 유세포 분석기로 분석하였다. 세포를 JC-1으로 염색한 후, CXP software 2.0 (Beckman Coulter)을 이용하여 subsequent 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 완전한(intact) 미토콘드리아 세포막 전위(ΔΨm)를 나타내는 JC-1 붉은 형광(fluorescence)은 488 nm에서 여기되었고, 방출은 613±20 nm 밴드 패스 필터(band pass filter)를 이용하여 검출하였다. 각 샘플마다 10,000개의 세포를 획득하고, 유세포 분석기로 분석하였다. 데이터는 분석된 세포 개체의 형광 강도(fluorescence intensity)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서는 미토콘드리아 세포막 전위가 낮아지거나, 붕괴(collapse)되었음을 확인하였다. 그러나, 알파-이소-쿠베베놀을 전 처리한 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서는 미토콘드리아 세포막 전위가 낮아지거나, 붕괴되는 것이 억제되었음을 확인하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서 미토콘드리아 세포막 전위 감소를 나타내는 초록 형광-양성 세포의 비율이 증가한 것을 확인하였다. 그러나, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 뒤 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서는 초록 형광-양성 세포가 복구됨을 확인하였다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀은 손상된 신경세포에서 미토콘드리아 세포막 전위가 감소되어 사멸되는 것을 방지함을 확인하였다.

4-2. AIF 단백질 수준 측정

자극제가 AIF 단백질의 미토콘드리아 분포(mitochondrial localization)를 달라지게 하므로, 알파-이소-쿠베베놀이 AIF의 전위(translocation)를 조절하는지를 알아보기 위하여, 미토콘드리아, 세포기질 및 핵의 AIF 단백질 수준을 하기와 같이 측정하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 마우스의 해마 HT22 세포에는 5 μM 농도의 글루타메이트를, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 150 μM 농도의 6-OHDA를 각 0, 4, 8, 12, 16 및 24시간처리하였다. 그 후, 세포기질(cytosol), 핵 및 미토콘드리아는 핵 추출 키트를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출되었다. 세포 용해물(lysates)의 단백질 함량은 Bradford reagent (Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 각 샘플의 단백질은 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의해 분해되었으며, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidenedifluoride, PVDF) 막에 이입시키고, 적절한 항체에 노출시켰다. 상기 항체에 노출된 단백질은 호스래디시(horseradish) 퍼옥시다제-공역된(peroxidase-conjugated) 항-래빗 혹은 항-마우스 이차항체를 이용하여 증가된 화학발광 검출 시스템(enhanced chemiluminescence detection system)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 시각화하였다. 도면은 ImageQuant 350 analyzer (Amersham Biosciences)을 이용하여 얻었다. 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서는 미토콘드리아로부터 AIF의 방출이 억제되고, 미토콘드리아에서 AIF의 발현이 유지됨을 확인하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서 미토콘드리아 AIF 수준이 감소되었으나, 세포 기질 및 핵의 AIF 수준은 증가됨을 확인하였다. 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서의 AIF 단백질 수준은 상기 결과와 반대로, 미토콘드리아 AIF 수준이 증가되었고, 세포 기질 및 핵의 AIF 수준은 감소됨을 확인하였다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀을 처리 시, 미토콘드리아에서 AIF의 방출을 억제시켜, 상기 6-OHDA 및 글루타메이트 자극제에 의한 미토콘드리아의 기능 장애를 방지하여, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포 및 마우스의 해마 HT22 세포를 보호함을 확인하였다.

실험예 5. 자극제에 의해 유도된 ERK, JNK 및 p38를 포함하는 MAPKs 인산화에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 억제 효과

ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPKs는 뉴런의 플라크(neuronal plaque) 발생에 대한 주요 조절자이기 때문에, 신경 질환(neurodegenerative diseases)의 과정을 나타낼 것으로 여겨지므로, 알파-이소-쿠베베놀이 자극제에 의해 유도된 MAPKs의 인산화 반응을 감소시키는지 알아보기 위하여, 하기와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 마우스의 해마 HT22 세포에는 5 μM 농도의 글루타메이트를, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 5 μM 농도의 6-OHDA를 0, 4, 8, 12, 16, 및 24시간 처리하여 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 수득하여 ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPKs에 대한 인산화-특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 상기 실험예 4-2의 방법과 동일하게 수행하였다. 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 6-OHDA로 자극된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서의 ERK의 인산화 강도 및 기간이 감소되었고, JNK 및 p38의 인산화 반응도 억제됨을 확인하였다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 후, 글루타메이트로 자극된 마우스의 해마 HT22 세포에서 ERK의 인산화 반응 강도 및 기간이 감소되었고, JNK 및 p38의 인산화 반응도 억제됨을 확인하였다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀이 자극제에 의해 유도된 ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPKs의 인산화 반응을 감소시킴으로써 세포의 염증성 반응을 억제하는 방법으로 신경세포를 보호함을 확인하였다.

실험예 6. 신경세포에서 HO-1 및 NQO 1 발현을 조절하는 PKA/CREB/Nrf-2의 활성을 유도하는 알파-이소-쿠베베놀의 효과

6-1. PKA 및 CREB 인산화 반응 활성에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 효과

PKA 및 CREB 인산화 반응 활성에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y에 알파-이소-쿠베베놀을 0 내지 20 μM 처리한 후 상기 실험예 4-2의 방법과 동일하게 웨스턴 블랏을 수행하여, PKA, PKB, CREB, Nrf-2 및 TBP의 인산화반응 및 활성을 측정하였다. PKA 및 PKB 신호 경로는 신경 세포 생존에 주요 역할을 하는 것이 밝혀져 있고, 상기 PKA 및 PKB는 다양한 신경독성에 대항하는 신경보호 효과와 대한 주요 전사 인자인 CREB 및 Nrf-2의 활성을 조절과 관련되어 있음이 알려져 있다. 웨스턴 블랏 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.

도 18에 나타낸 바와 같이, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y에 알파-이소-쿠베베놀을 처리 시, 농도의존적으로 PKA 및 PKB의 인산화를 유도함을 확인하였다. 또한, CREB 인산화반응 및 Nrf-2의 핵 전좌(translocation)를 유도함을 확인하였다.

도 19에 나타낸 바와 같이, 마우스의 해마 HT22 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 처리하면 PKA 및 CREB의 인산화 반응을 유의적으로 유도함을 확인하였다. 또한, 알파-이소-쿠베베놀을 4시간 처리하였을 때, Nrf-2 핵 축적이 유의적으로 증가됨을 확인하였으며, Nrf-2 핵 내 이동은 알파-이소-쿠베베놀의 농도의존적으로 유도됨을 확인하였다.

6-2. 일시적 주입 및 듀얼 루시퍼라제 검정(dual luciferase assay)

상기 실험예 6-1의 전사 활성을 확인하기 위하여, CREB 및 Nrf-2 각 반응 요소에 의해 유도되는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 CRE 및 ARE-LUC 플라스미드 DNA를 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 도입하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 FuGENE-HD 시약을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 CRE 및 ARE-리포터 플라스미드 또는 HO-1 프로모터 리포터 플라스미드를 포함하여 주입하였다. 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 컨트롤 플라스미드인 pRL-CMV는 주입 효율에 대한 내부 컨트롤(internal control)로서 보조-주입(co-transfected)되었다. 상기 주입된 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 0, 5, 10 및 20μM 농도로 처리하였다. 그 후, 루시퍼라아제 활성은 듀얼-루시퍼라아제 분석 키트를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석되었다. 발광(Luminescence)은 발광측정기(microplate luminometer)(Wallac 1420)로 측정하였다. 그 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 이입된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 전처리한 것은 CREB 및 Nrf2 프로모터 활성에서 5.2- 및 4.6-폴드(fold) 상승을 유도하였으며, 루시퍼라제 활성은 알파-이소-쿠베베놀의 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. 특히, 알파-이소-쿠베베놀은 10 μM 농도로 처리된 경우 그 효과가 현저히 상승하는 것을 확인 하였다.

도 21에 나타낸 바와 같이, 마우스의 해마 HT22 세포에서 루시퍼라제 활성은 알파-이소-쿠베베놀의 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. 특히, 알파-이소-쿠베베놀은 10 μM 농도로 처리된 경우 그 효과가 현저히 상승하는 것을 확인 하였다.

6-3. HO-1 및 NQO1 단백질 발현과 HO-1 프로모터 활성 측정

Nrf-2 및 CREB 전사촉진(transactivation)은 HO-1 및 NQO1 단백질을 포함하는 ARE-관련된 산화방지 유전자의 발현과 관련되었음을 확인; 상기 HO-1 및 NQO1 단백질 발현에 대한 알파-이소-쿠베베놀의 효과 확인; 및 HO-1 프로모터 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스의 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y에 알파-이소-쿠베베놀을 각각 0, 5, 10 및 20 μM 농도로 12시간 처리한 후, 상기 실험예 4-2의 방법과 동일하게 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 22 내지 도 25에 나타내었다.

도 22 및 도 23에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀을 농도 의존적으로 처리한 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서는 50 μM 농도에서부터 HO-1 및 NQO1 단백질의 발현 수준이 증가하였고, 특히 10 μM 이상부터 그 효과가 현저히 우수함을 확인하였다. 또한, HO-1 프로모터 활성도 알파-이소-쿠베베놀 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

도 24 및 도 25에 나타낸 바와 같이, 알파-이소-쿠베베놀을 농도 의존적으로 처리한 마우스의 해마 HT22 세포에서는 5 μM 농도에서부터 HO-1 및 NQO1 단백질의 발현 수준이 증가함을 확인하였고, 특히 20 μM에서 그 농도가 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 또한, HO-1 프로모터 활성도 알파-이소-쿠베베놀 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

실험예 7. 자극제에 의해 유도된 신경 세포에서 알파-이소-쿠베베놀의 항-아폽토시스 특성과 관련된 CREB 및 Nrf-2

CREB/Nrf-2-관련된 단계 II 해독/산화방지(phase II detoxifying/antioxidant)효소 신호 경로를 통해 발생된 알파-이소-쿠베베놀의 산화방지 및 신경보호 작용 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 CREB 및 Nrf-2 siRNA를 이용하여 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, small interfering RNA (siRNA)를 포함한 세포의 주입은 X-treme GENE siRNA Transfection Reagent (Roche Applied Science)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 상업적으로 구입할 수 있는 마우스 CREB- 및 Nrf-2-specific siRNAs(Santa Cruz, Heidelberg, Germany)와 음성대조군 siRNAs (Santa Cruz)이 주입하기 위해 사용되었다. 간단하게, X-treme GENE siRNA Transfection Reagent (10 μl)를 각 2 ㎍ siRNA가 포함된 100 μl 무혈청 배지(serum-free medium)에 첨가한 후, 실온에서 20분간 배양하였다. 그 후, 상기 마우스 해마 HT22 세포 및 인간 신경모세포종 SH-SY5Y를 96 웰 플레이트에 각각 접종한 후, 상기 각 세포에 알파-이소-쿠베베놀을 20 μM 농도로 12시간 처리하였다. 그 후, 상기 마우스 해마 HT22 세포에는 글루타메이트를 12시간 처리하였고, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에는 6-OHDA를 24시간 처리하였다. 유전자 사일런싱(Gene silencing)은 웨스턴 블랏을 통해 48시간 후에 측정하였다. 또한, 상기 실험예 2-2의 방법과 동일하게 LDH 분비를 검사하여, 그 결과를 도 26 및 도 27에 나타내었다. 또한, 실험예 3-2의 방법과 동일하게 TUNEL 분석을 실시하여, 그 결과를 도 28 및 도 29에 나타내었다.

도 26 및 도 27에 나타낸 바와 같이, CREB 및 Nrf2 siRNAs를 이입한 세포는 CREB 및 Nrf2 단백질 발현 수준을 억제시킴을 확인하였다. 또한, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하였을 때, 대조군 siRNA이 이입된 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에 대한 6-OHDA의 사멸이 억제됨을 확인하였으나, CREB 및 Nrf2 siRNAs를 이입한 SH-SY5Y 세포에서는 그 효과가 적음을 확인하였다.

도 28 및 도 29에 나타낸 바와 같이, CREB 및 Nrf2 siRNAs를 이입한 세포는CREB 및 Nrf2 단백질 발현 수준을 억제시킴을 확인하였다. 또한, 알파-이소-쿠베베놀을 처리하였을 때 CREB 및 Nrf2 siRNA가 이입된 세포를 제외하고 글루타메이트로 자극된 아폽토시스 세포 사멸은 억제되었음을 확인하였다.

따라서, 알파-이소-쿠베베놀은 신경보호작용 효과를 나타내고, CREB/Nrf2의 신호 경로의 활성에 의해 상기 6-OHDA 및 글루타메이트 자극에 의한 신경 세포 사멸을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

알파-이소-쿠베베놀 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

알파-이소-쿠베베놀 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

알파-이소-쿠베베놀 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

알파-이소-쿠베베놀 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

알파-이소-쿠베베놀 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 조성물의 제조

2-1. 건강식품의 제조

알파-이소-쿠베베놀 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실험예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2-2. 건강음료의 제조

알파-이소-쿠베베놀 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃ 에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실험예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol)을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증, 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 알파-이소-쿠베베놀은 오미자(Schizandra chinensis)로부터 추출된 것을 특징으로 하는 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증, 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 삭제
4. 알파-이소-쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증, 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 알파-이소-쿠베베놀은 오미자(Schizandra chinensis)로부터 추출된 것을 특징으로 하는 파킨슨병, 근위축성 측면경화증, 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
   
   
6. 삭제

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