KR101420010B1

KR101420010B1 - 알파―이소―쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101420010B1
Application number: KR1020120094114A
Authority: KR
Inventors: 배외식; 이성균; 최영환
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-07-17
Also published as: KR20140028253A

Abstract

본 발명은 오미자로부터 추출한 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol) 및 그 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 살균 효과를 갖는 동시에 전염증성 사이토카인 생산을 저하시키고 백혈구의 세포자살을 억제하는 효과가 있다. 따라서 패혈증을 비롯한 감염성 질환 및 염증성 질환의 치료에 중요하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

알파―이소―쿠베베놀을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating infectious and inflammatory disease comprising α―iso―cubebenol as effective ingredient}

본 발명은 오미자로부터 추출한 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol)을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

패혈증은 세균 또는 lipopolysaccharide(LPS)와 같은 세균 산물에 의해 일어나는 전신적인 염증반응을 말한다. 미국에서 매해 750,000명 이상의 사람들에게 패혈증이 발병하며, 해마다 약 1.5% 씩 발병률이 상승하고 있다. 20년 이상 연구에도 불구하고 패혈증은 중환자 병동에서 주된 사망 원인이 되고 있으며, 패혈증과 관련된 전반적인 사망률(mortality rate)은 30~70%에 달한다. 그러나 이러한 상황에도 불구하고 적절한 패혈증 치료제가 시중에 나와 있지 않은 실정이다. Xigris 가 US FDA에 의해 승인을 받고 패혈증 치료제로서 시판되고 있었으나, 최근 절판된 바 있다.

패혈증에 의한 사망은 침입한 병원균에 대해 적절한 면역반응이 일어나지 않는 것과 관련이 깊다. 특히 초기 패혈증(첫 6시간) 기간 동안 선천성 면역 시스템이 작동하지 않아 사망률이 높아진다. 패혈증 시에는 또한 과도한 양의 림프구의 세포자살(apoptosis)가 일어나는데, 이는 다장기 부전(multi organ failure)을 초래한다. 게다가 TNF와 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인의 수치가 크게 증가한다. 이를 종합할 때, 패혈증을 치료하기 위해서는 살균(bactericidal) 활성을 강화시키고 전염증성 사이토카인의 생산을 막고 림프구의 세포자살이 확산되는 것을 막는 방향으로 접근해야 함을 알 수 있다.

종래 연구에서, 본 발명자들은 Schisandra chinensis로부터 신규한 천연 화합물인 α-iso-cubebenol을 분리하고, 이 화합물이 LPS로 자극된 대식세포에서 Nitric Oxide 합성이 유도되는 것을 저해하고 cyclooxygenase-2가 발현되는 것을 억제시킨다고 보고한 바 있다. 또한 α-iso-cubebenol은 heme oxygenase-1 발현을 유도하고 Porphyromonas gingivalis의 LPS로 자극된 대식세포에서 항염증 활성을 보이는 것으로 보고된 바 있다.

본 발명자들은 패혈증을 효과적으로 치료할 수 있는 물질에 대해 연구하던 중, α-iso-cubebenol의 효능 및 보호 기전을 패혈증의 전임상 마우스 모델에서 최초로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 α-iso-cubebenol 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 살균 활성(bactericidal activity)을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 전염증성 사이토카인의 생산을 감소시키는 것을 특징으로 한다. 여기서 전염증성 사이토카인은 IL-1β, IL-6, IL-10 등이 될 수 있다.

상기 조성물은 활성 산소종(Reactive Oxygen Species) 생산을 증가시키며, 백혈구의 세포자살(apoptosis)을 저해하는 특징을 가진다. 따라서 비장세포 또는 흉선세포의 감소를 저해할 수 있다.

본 발명의 조성물은 염증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 일 예로, 패혈증 등 감염성 질환의 경우 기본적으로 항생제를 투여하게 되는데, 이와 병용하여 본 발명의 조성물을 투여하게 되면 항생제의 효과를 증강시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 감염성 및 염증성 질환은 패혈증 또는 패혈증 쇼크인 것을 특징으로 한다. 감염은 박테리아에 의한 것일 수 있으며, 염증은 박테리아의 내독소(endotoxin)에 의해 유발된 것일 수 있다. 그러나 질환의 종류는 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물을 개체에 투여하여 암 등 세포증식성 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있으며, 다양한 제형으로 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설 율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러 번에 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 식품 조성물은 염증의 예방 및 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 식품 첨가물로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 가능하며, 그 외 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 α-iso-cubebenol을 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물은 살균 효과를 갖는 동시에 전염증성 사이토카인 생산을 저하시키고 백혈구의 세포자살을 억제하므로, 패혈증을 비롯한 감염성 질환 및 염증성 질환에 탁월한 치료 효과가 있다.

도 1은 α-iso-cubebenol에 의한 패혈증 치료 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 α-iso-cubebenol의 bactericidal activity 증강 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 α-iso-cubebenol의 백혈구 사멸 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 α-iso-cubebenol의 염증성 사이토카인 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 α-iso-cubebenol에 의한 LPS-유도 염증성 사이토카인 생성 저해 효과를 나타낸 도이다.

α-iso-cubebenol의 구조는 하기 화학식 1과 같으며, 화학식(chemical formula)는 C₁₅H₂₄O 이고, 분자량은 220.3505 이다.

[화학식 1]

survival에 대한 실험은 log-rank test로 분석하였다. 그 외 모든 실험은 t-test로 평가하였다. 비교를 위해 Bonferroni test를 수행하였고, 통계적 유의성은 P < 0.05으로 설정하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. α- iso - cubebenol 정제 및 마우스 동물 모델 준비

1-1. α- iso - cubebenol 정제

오미자 분쇄물 2.5 kg을 상온에서 n-hexane, 클로로폼, 메탄올을 이용하여 추출하였다. hexane 추출물 308 g을 진공상태에서 증류하고, 40μm, 농도 경사가 0, 5%, 20%인 에틸 아세테이트를 hexane에 녹인 수용액과 CHCl₃ 수용액에 녹인 5% 메탄올로 구성된 실리카겔(40μm) 칼럼(100 x 10 cm)에서 크로마토그래피를 수행하여 38 분획을 얻었다.분획 9(KH9, 4866 mg)를 농도 경사가 1%, 10%, 15%인 아세톤을 디클로로메탄(CHCl₂)에 녹인 용액으로 구성된 실리카겔 칼럼(100 × 3.0 cm)에서 크로마토그래피를 수행하여 21 분획을 얻었다. 분획 2(KH91G, 529.9 mg) 는 아세톤을 디클로로메탄(CHCl₂)에 녹인 5% 용액으로 구성된 실리카겔 칼럼(100 × 3.0 cm)에서 크로마토그래피를 수행하여 α-iso-cubebenol(162.9 mg)을 얻었다. 순수한 α-iso-cubebenol 을 메탄올-아세토니트릴 경사로 구성된 Phenomenex Luna C18 column (150 × 4.6 mm internal diameter; 5 μm particle size)에서 유속 1.0 ml/min로 high-performance liquid chromatography를 수행하여 얻었다.

1-2. 질환 모델동물 준비

수컷 WT ICR 마우스를 패혈증 질환 모델 동물로 사용하였다(Kim SD, Lee HY, Shim JW, Kim HJ, Yoo YH, Park JS, et al. Activation of CXCR2 by extracellular matrix degradation product acetylated Pro-Gly-Pro has therapeutic effects against sepsis. Am J Respir Crit Care Med 2011;184:243-51.에 기술된 질환 모델 동물). 맹장 결찰과 천자(cecal ligation and puncture, CLP)를 위해서, 마우스를 Zoletil (50 mg/kg)과 Rompun (10 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 복선을 따라 작게 절개하여 맹장을 노출시키고, 맹장을 맹결장 밸브 아래에서 결찰하고, 22-gauge 주사바늘을 이용하여 양쪽 면을 2회 천자하였다. 그리고 복강을 닫았다.

sham군 마우스에는 맹장을 결찰하고 천자하는 과정을 제외한 나머지 동일한 과정을 수행하였다. 생존 여부는 10일 동안 매일 1회 확인하였다.

실시예 2. α- iso - cubebenol 에 의한 패혈증에 의한 사망의 방지 효과 확인

비히클 (0.8% DMSO 함유 PBS) 또는 α-iso-cubebenol을 각각 5, 15 mg/kg의 농도로 CLP 마우스의 피하에 CLP 2, 14, 26, 38 시간 후에 한 번씩 주사하였다. α-iso-cubebenol이 CLP로 유발된 패혈증 시 마우스의 사망을 방지하는 효과가 크고, 효과는 농도 의존적으로 나타남을 도 1에서 알 수 있다. 도 1에서, α-iso-cubebenol 5 mg/kg 또는 15 mg/kg을 CLP 2시간 후에 투여하고, 12 시간 간격으로 3회 추가적으로 투여했을 때 생존률이 70 ~ 80%까지 증가함을 알 수 있다.

ANOVA에 의한 비히클(vehicle) 투여군과 비교하여, ***는 p<0.001을 의미한다. 각 군의 개체수는 n=10마리/군이다.

실시예 3. α- iso - cubebenol 에 의한 살균 활성( bactericidal activity ) 증강 효과 확인

3-1. 말초 혈액 또는 복강액 내 세균 확인

패혈증에 의한 사망 시 말초 혈액 및 복강액 내에 세균 콜로니 수가 증가한다. α-iso-cubebenol이 살균 활성(bactericidal activity) 증강 효과를 보이는지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

α-iso-cubebenol(15mg/kg)을 CLP 후 2시간, 14시간 후에 2회 주사하였다. 주사 후 24시간 후에 말초혈액 또는 복강세척액을 sham 군, CLP + 비히클 (0.8% DMSO 함유 PBS)을 투여한 군 또는 CLP +α-iso-cubebene을 투여한 군으로부터 채취하고, 혈액배지( Trypticase Soy Agar Deeps ; Becton Dickinson , Franklin Lakes , NJ, USA )에 37℃에서 배양하였다. colony forming units(CFU)를 계산하였다. 도 2B에서 말초 혈액 내 세균이 거의 제거된 것을 알 수 있으며, 도 2A에서 복강액 내의 세균은 80%까지 감소했음을 알 수 있다.

데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. n=8이고, *는 t-test에서 sham군 또는 비히클을 투여한 군과 비교하여 P < 0.05, ***는 P < 0.001을 의미한다. CLP만을 수행한 군과 비교에서 #은 P < 0.05를 의미한다.

3-2. 활성산소종 ( Reactive Oxygen Species ) 확인

과산화수소를 비롯한 활성산소종은 살균 작용을 수행한다. 따라서 α-iso-cubebenol이 활성산소종의 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

갓 분리한 인간 호중구(2 x 10⁶ cells. RPMI 1640 배지)를 50μM의 cytochrome c를 첨가하여 37℃에서 5분간 전배양한 후, 비히클(0.1% DMSO 함유 PBS) 또는 α-iso-cubebenol(10μg/ml 또는 100μg/ml)로 5분 동안 자극하였다. microtiter 96-well plate ELISA reader로 1분 간격으로 550nm에서 5분 이상 광흡수 변화를 측정하여 cytochrome c 의 환원을 계측하는 방법으로 활성산소 생산량을 측정하였다. 도 2C에서, α-iso-cubebenol이 활성산소 생산을 크게 증가시켰음을 알 수 있다.

데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. n=8이고, *는 t-test에서 sham군 또는 CLP + 비히클을 투여한 군과 비교하여 P < 0.05, ***는 P < 0.001을 의미한다. CLP만을 수행한 군과 비교에서 #은 P < 0.05를 의미한다.

실시예 4. α- iso - cubebenol 의 백혈구 사멸 저해 효과 확인

4-1. 세포자살( apoptosis ) 확인

패혈증에 의한 사망시, 비장과 흉선에서 다수의 림프구의 세포자살(apoptosis)이 관찰된다. 따라서 α-iso-cubebenol이 이를 저해할 수 있는지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

α-iso-cubebenol(15mg/kg)을 CLP 후 2시간, 14시간 후에 2회 주사하였다. 비장과 흉선을 sham군, CLP+비히클 (0.8% DMSO 함유 PBS)를 투여한 군 또는 CLP +α-iso-cubebenol을 투여한 군으로부터 적출하고 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) assay를 수행하였다. 동결조직 절편들을 4°C에서 Triton X-100에 2분간 투과시킨 후 TUNEL 용매에 37°C에서 60분 동안 담궜다. 조직 사진에서, CLP +α-iso-cubebenol을 투여한 군에서, 패혈증으로 인한 세포자살이 크게 감소하였음을 알 수 있었다(도 3A).

또한 TUNEL assay 후에, 광현미경 하에서 500개의 비장세포와 흉선세포를 계수하여 그 중 세포자살(apoptosis)이 일어난 세포들(TUNEL-양성)의 백분율을 확인하였다. 세포 계수 결과를 나타낸 그래프(도 3B)에서도, CLP +α-iso-cubebenol을 투여한 군에서, 패혈증으로 인한 세포자살이 sham군 수준으로 감소하였음을 알 수 있었다.

데이터는 평균 ± SEM(n=8)으로 나타내었다. sham군과 비교할 때 t-test상에서, *는 P < 0.05를 의미한다. CLP만을 유발한 군과 비교에서 #는 P < 0.05를 의미한다.

4-2. caspase -3의 활성화 확인

세포자살이 일어날 때 caspase-3 효소가 cleavage되어 활성화된다. α-iso-cubebenol이 이 효소의 활성화를 억제하는지 여부를 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

실시예 4-1에서 얻은 마우스 비장과 흉선을 Cleaved-caspase-3 항체(magnification, x100)로 면역조직화학법으로 염색하였다. Cleaved caspase-3에 대한 1차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 첨가하여 배양한 후, 모든 절편을 horseradish peroxidase와 포함된 2차 항체로 염색하였다. 도 3C에서, α-iso-cubebenol이 caspase-3 효소의 cleavage를 거의 완전히 억제함을 알 수 있다.

실시예 5. CLP 에 의해 유도된 사이토카인 생산에 있어서 α- iso - cubebenol 의 효과

α-iso-cubebenol이 염증과 관련된 사이토카인에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

α-iso-cubebenol(15mg/kg)을 CLP 유발 후 2시간 및 14시간 후에 주사하였다. 대조군, CLP + 비히클 (0.8% DMSO 함유 PBS)을 투여한 군 또는 CLP +α-iso-cubebenol을 투여한 군에 CLP 24시간 후에 걸쳐 복강세척액을 채취하였다. 복강세척액 내 사이토카인의 양을 ELISA 분석으로 결정하였다. 도 4A-4C에서 CLP 24시간 내에 α-iso-cubebenol 투여시 IL-1β, IL-10, IL-6의 양이 감소함을 알 수 있다. 그러나 도 4D-4F에서는 α-iso-cubebenol이 IL-17, IL-22, IL-23의 수치를 크게 증가시켰음을 알 수 있다.

데이터는 평균 ± SEM(n=8)로 나타내었고, sham군과 비교할 때 t-test상에서, *는 P < 0.05를 의미한다. CLP만을 유발한 군과 비교할 때 #는 P < 0.05를 의미한다.

실시예 6. α- iso - cubebenol 에 의한 LPS -유도 염증성 사이토카인 생성 저해 효과 확인

실시예 5에서 α-iso-cubebenol이 CLP로 유발된 패혈증에서 전염증성 사이토카인 생산을 감소시킨다는 것을 확인했으므로, α-iso-cubebenol이 백혈구에 직접 작용하여 LPS-유도 전염증성 사이토카인 생성을 저해하는지 여부를 확인하고자 하기의 실험을 수행하였다.

갓 분리한 비장세포(3x10⁶cells/0.3ml)를 5% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 0.1% DMSO 함유 PBS 또는 α-iso-cubebenol과 함께 30분 동안 전배양하고(25 또는 100μg/ml), PBS 또는 LPS(100ng/ml)로 3시간 동안 자극하였다. IL-1β, IL-6, IFN-γ의 수치를 ELISA로 측정하였다(도 5A~5C). CLP에 의해 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 수치 가 크게 증가했으며, α-iso-cubebenol이 이 수치를 크게 감소시켰음을 도 5A~5C에서 알 수 있다. 이는 α-iso-cubebenol이 LPS 자극시 TLR4에 의해 매개되는 신호 전달을 차단할 수 있음을 의미한다.

데이터는 평균 ± SEM(n=8)으로 나타내었다. LPS 처리하지 않은 군과 비교에서 *는 P < 0.05를 의미한다. LPS만을 처리한 군과 비교에서 #는 P < 0.05를 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

알파-이소-쿠베베놀(α-iso-cubebenol) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 살균 활성(bactericidal activity)을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 활성 산소종(Reactive Oxygen Species) 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 백혈구의 세포자살(apoptosis)을 저해하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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제 1항에 있어서,
상기 조성물은 비장세포 또는 흉선세포의 감소를 저해하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 패혈증 또는 패혈증 쇼크는 박테리아 감염으로 인한 것임을 특징으로 하는 조성물.
삭제