KR20210121388A

KR20210121388A - 수소음이온을 갖는 피부보습용 조성물

Info

Publication number: KR20210121388A
Application number: KR1020200037941A
Authority: KR
Inventors: 최태호; 정영혁; 인영용; 최진솔
Original assignee: 보비씨엔이(주)
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-10-08
Also published as: KR102403488B1

Abstract

본 발명은 피부보습용 조성물에 관한 것이며, 이는 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 포함하는 알칼리 토금속 화합물을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 포함하는 알칼리 토금속 산화물을 수소(H₂) 분위기 하에서 소성하여 수소음이온(H^－)을 갖는 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조되고, 특히 소성체에 흡장결합되어 있는 수소음이온(H^－)을 이용하여 피부세포 내에서 히알루론산의 생성을 효과적으로 증가시킬 수 있음과 동시에, 고온 소성을 통하여 수소음이온(H^－)을 패각칼슘 소성체에 흡장(occlusion)결합시킴으로써 장기간 실온보존에도 피부세포 내 히알루론산의 생성효율이 저하되지 않는 효과를 발휘한다.

Description

수소음이온을 갖는 피부보습용 조성물 {SKIN MOISTURING COMPOSITION HAVING HYDRIDE ION}

본 발명은 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물에 관한 것으로, 수소음이온(H^－)을 이용하여 피부세포 내에서 히알루론산의 생성을 효과적으로 촉진시킬 수 있음과 동시에, 고온 소성을 통하여 수소음이온(H^－)을 패각칼슘 소성체에 흡장(occlusion)결합시킴으로써 장기간 실온보존시에도 피부세포 내 히알루론산의 생성효율이 저하되지 않는 효과를 발휘하는 피부보습용 조성물에 관한 것이다.

피부세포 내의 수분은 피부의 노화를 방지함과 동시에 피부의 탄력을 유지하기 위하여 요구된다.

이와 같이, 피부세포 내의 수분의 농도를 높게 유지시키기 위하여 각종 피부 보습제가 연구 개발되고 있다.

한편, 하기 특허문헌 1은 수소수와 감마-폴리글루탐산이 함유된 피부 보습용 미스트 조성물을 개시하고 있으나, 특허문헌 1 조성물에 함유되는 수소수는 물의 전기분해를 통해 생성된 수소기체(H₂)를 이용하여 세포내의 활성산소를 제거하는 것으로서, 특허문헌 1 조성물의 수소기체(H₂)는 세포내 히알루론산을 생성하지는 못하는 것일 뿐만 아니라, 수소기체(H₂)의 특성상 수소수로부터 수소기체(H₂)가 쉽게 대기중으로 이탈됨으로서 장기간 실온보존시 수소수의 수소기체(H₂) 농도가 낮아지게 되는 문제가 있었다.

또한, 특허문헌 1 조성물에 함유되는 감마-폴리글루탐산이 세포내 히알루론산의 농도와 관련이 있으나 (단락 [0061]), 이는 단순히 세포내 히알루론산 분해효소의 활성을 억제하여 히알루론산의 농도가 감소되는 것만 어느 정도 방지할 수 있을뿐, 적극적으로 히알루론산의 세포내 합성을 유도하여 그 농도를 증가시킬 수는 없다는 한계를 지니고 있었다.

따라서, 피부세포 내에서 히알루론산을 적극적으로 생성시킴으로써 세포내 히알루론산의 농도를 높이고, 장기간 실온보존시에도 히알루론산 생성효율이 감소하지 않는 신규한 보습용 조성물의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

특허문헌 1: 한국 등록특허 제10-1748093호(2017.06.27)

본 발명의 목적은 수소음이온(H^－)을 이용하여 피부세포 내에서 히알루론산의 생성을 효과적으로 촉진시킬 수 있음과 동시에, 고온 소성을 통하여 수소음이온(H^－)을 패각칼슘 소성체에 흡장(occlusion)결합시킴으로써 장기간 실온보존에도 피부세포 내 히알루론산의 생성효율이 저하되지 않는 효과를 발휘하도록 하는 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물은 수소음이온(H^－)을 갖는 것이며, 피부세포 내에서 히알루론산 생성을 촉진시키고, 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 포함하는 알칼리 토금속 화합물을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 포함하는 알칼리 토금속 산화물을 수소(H₂) 분위기 하에서 소성하여 수소음이온(H^－)을 갖는 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물에 있어서, 상기 제2소성체에는 수소음이온(H^－)이 흡장(occlusion)결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 유기탄산칼슘은 굴패각 또는 조개패각 등과 같은 패각칼슘인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 제2소성체에 유기산을 더욱 배합할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 유기산으로는 예를 들어 구연산을 사용할 수 있으며, 이는 조성물의 수소이온농도를 조절하기 위하여 배합되는 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 제1소성단계는 300 내지 1,000℃의 고온에서 2 시간 내지 10 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 제2소성단계는 300 내지 1,000℃의 고온에서 2 시간 내지 10 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물은 소성체에 흡장결합되어 있는 수소음이온(H^－)을 이용하여 피부세포 내에서 히알루론산의 생성을 효과적으로 증가시킬 수 있음과 동시에, 고온 소성을 통하여 수소음이온(H^－)을 패각칼슘 소성체에 흡장(occlusion)결합시킴으로써 장기간 실온보존에도 피부세포 내 히알루론산의 생성효율이 저하되지 않는 효과를 발휘한다.

도 1은 본 발명의 항염증성 조성물을 용해시킨 수용액의 사진이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

종래에는 피부보습을 위하여 히알루론산을 함유한 피부보습제를 피부에 도포하여 히알루론산이 피부세포 내로 침투되도록 함으로써 피부세포 내의 히알루론산의 농도를 높여 피부 보습효과를 유도하는 방법이 사용되었다.

그러나, 이와 같이 히알루론산을 피부에 도포하여 직접 피부세포로 침투시키는 원리를 이용하는 경우는 히알루론산이 피부침투 효과가 매우 미미하며, 침투된 히알루론산의 피부세포내 유지효율 또한 낮다는 문제점이 있었다.

한편, 전술한 바와 같이 한국 등록특허 제10-1748093호에서는 피부세포 내의 히알루론산의 농도가 감소되는 것을 방지하기 위한 조성물을 개시하고 있으나, 한국 등록특허 제10-1748093호에서 개시하고 있는 조성물에 함유되는 수소기체(H₂)는 세포내 히알루론산을 생성하지는 못하는 것일 뿐만아니라, 수소기체(H₂)의 특성상 수소수로부터 수소기체(H₂)가 쉽게 대기중으로 이탈됨으로서 장기간 실온보존시 수소수의 수소기체(H₂) 농도가 낮아지게 되는 문제가 있었고, 감마-폴리글루탐산이 세포내 히알루론산의 농도와 관련이 있기는 하나, 이는 단순히 세포내 히알루론산 분해효소의 활성을 억제하여 히알루론산의 농도가 감소되는 것만 어느 정도 방지할 수 있을뿐, 적극적으로 히알루론산의 세포내 합성을 유도하여 그 농도를 증가시킬 수는 없다는 한계를 지니고 있었다.

한편, 본 발명자는 수소 음이온 함유물에 관한 등록특허 제10-1405431호의 특허물질을 연구하던 중에 상기 특허물질을 피부에 처리하였을 때, 피부세포 내에서 히알루론산의 농도를 적극적으로 증가시킨다는 것을 점을 우연히 발견하게 되었다.

특히, 본 발명자는 상기 등록특허 제10-1405431호의 특허물질은 등록특허 제10-1748093호의 물질과 달리 피부세포 내의 히알루론산 농도를 일정하게 유지하는 것에 그치지 않고, 히알루론산의 농도를 적극적으로 향상시킨다는 점을 우연히 발견하게 되었으며, 추가적인 검증 실험을 통하여 등록특허 제10-1405431호의 특허물질이 피부세포 내의 히알루론산 합성효소의 활성을 증가시킴으로써 피부세포 내 히알루론산의 농도를 적극적으로 증가시키는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명자는 등록특허 제10-1405431호의 특허물질을 피부 보습용 물질로 사용함으로써 피부의 보습력을 향상시키는데 활용할 수 있음을 발견하였고, 본 특허출원에 이르게 되었다.

즉, 본 발명은 본 출원인에 의하여 출원되고 등록된 대한민국 특허 제10-1405431호의 수소 음이온 함유물에 기초하며, 특허 제10-1405431호의 수소 음이온 함유물에 대하여 새롭게 발견된 신규한 용도에 관한 발명이다.

본 발명에 따른 피부보습용 조성물은 수소음이온(H^－)을 갖는 것이며, 피부세포 내에서 히알루론산 생성을 촉진시키고, 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 포함하는 알칼리 토금속 화합물을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 포함하는 알칼리 토금속 산화물을 수소(H₂) 분위기 하에서 소성하여 수소음이온(H^－)을 갖는 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조될 수 있다.

즉, 기존의 등록특허 제10-1748093호의 조성물이 수소수 내에 수소기체(H₂)를 포함하고 있는 것과 달리, 본 발명의 조성물은 수소음이온(H^－)을 이용하는 점에 기술적 특징이 있는 것이다.

특히, 본 발명의 조성물은 패각칼슘 (굴패각 또는 조개패각 등)을 2차례에 걸쳐 고온으로 소성시키되, 2차 소성시에 수소(H₂) 분위기 하에서 소성시킴으로써 수소음이온(H^－)이 제2소성체에서 흡장(occlusion)결합되는 점에 특징이 있는 것이다.

즉, 이와 같이 제2소성체에 흡장결합되어 있는 수소음이온(H^－)은 수소기체(H₂) 또는 수소양이온(H⁺) 등과 달리, 제2소성체에 결합된 채로 피부에 도포될 경우 피부세포 내로 침투하여 피부세포 내에 존재하는 히알루론산 합성효소(HAS)의 활성을 증가시키며, 그 결과 세포내 히알루론산의 농도를 적극적으로 증가시키게 된다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 전술한 제1소성단계 및 제2소성단계를 거쳐 제조되는 것이며, 수소음이온(H^－)이 결합된 제2소성체와 더불어 일반 보습용 화장료 조성물에 포함되는 화장료 성분을 추가로 포함하는 것도 가능하다.

한편, 본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 제2소성체에 유기산을 더욱 배합할 수도 있고, 이 경우 유기산으로는 예를 들어 분말상태의 구연산 등을 사용하는 것이 가능하다.

구연산 등의 유기산을 추가로 배합함으로써 조성물의 수소이온농도를 조절하는 것이 가능해진다.

기타, 본 발명에 따른 수소음이온(H^－)이 결합된 제2소성체를 제조할 수 있는 더욱 구체적인 방법은 등록특허 제10-1405431호의 등록공보를 참고하는 것이 가능하다.

즉, 본 발명의 일 구현 예에 따른 피부보습용 조성물을 제조함에 있어서, 상기 제1소성단계 및 제2소성단계는 각각 300 내지 1,000℃의 고온에서 2 시간 내지 10 시간 동안 수행될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 보습용 조성물을 제조하는 구체적인 실시예 및 본 발명의 효과를 비교하여 검증할 수 있도록하는 비교예를 설명하기로 한다.

실시예 1

세척한 굴 껍질 100g을 대기 분위기 하에서 700℃의 온도로 4 시간 동안 소성하여 제1소성체를 얻었다. 상기 제1소성체에는 칼슘 산화물이 56.08g이 포함되어 있었다.

이어서, 상기 제1소성체가 담긴 반응용기에 4.45g의 마그네슘 산화물(CaO : MgO = 92.6 중량% : 7.4 중량% = 100 mol : 11mol)을 첨가하였다. 그 후, 제1소성체와 마그네슘 산화물을 포함하는 알칼리 토금속 산화물을 수소 분위기 하에서 650℃의 온도로 약 4시간 소성하여 수소음이온(H^－)이 결합된 제2소성체를 얻었다.

이어서 상기 제2소성체에 전체 수소음이온 함유물에 대하여 17.5 중량%의 비율로 구연산을 혼합하여 분말 형태의 피부보습용 조성물을 제조하였다.

*실시예 1과 관련한 더욱 구체적인 제조방법은 등록특허 제10-1405431호의 등록공보 기재내용을 참고하는 것이 가능함.

비교예 1 - 제2소성단계를 생략

이어서, 상기 제1소성체가 담긴 반응용기에 4.45g의 마그네슘 산화물(CaO : MgO = 92.6 중량% : 7.4 중량% = 100 mol : 11mol)을 첨가하고, 이어서 상기 제1소성체에 전체 수소음이온 함유물에 대하여 17.5 중량%의 비율로 구연산을 혼합하여 분말 형태의 피부보습용 조성물을 제조하였다.

비교예 2 - 수소음이온(H^－) 대신 수소기체(H₂)가 포함되도록 함

상기 비교예 1을 통하여 제조된 조성물 10g을 수소수 (물의 전기분해를 통하여 발생된 수소기체(H₂)를 함유하는 물) 1,000㎖에 용해시킴으로서 피부보습용 조성물을 제조하였다.

비교예 3 - 수소음이온(H^－) 대신 감마-폴리글루탐산이 포함되도록 함

상기 비교예 1을 통하여 제조된 조성물 10g을 물 1,000㎖에 용해시키고, 여기에 감마-폴리글루탐산 1㎎을 혼합용해시킴으로써 피부보습용 조성물을 제조하였다.

비교예 4 - 수소음이온(H^－) 대신 수소기체(H₂)와 감마-폴리글루탐산이 포함되도록 함

상기 비교예 1을 통하여 제조된 조성물 10g을 수소수 (물의 전기분해를 통하여 발생된 수소기체(H₂)를 함유하는 물) 1,000㎖에 용해시키고, 여기에 추가적으로 감마-폴리글루탐산 1㎎을 혼합용해시킴으로써 피부보습용 조성물을 제조하였다.

이하, 본 발명에 따른 피부보습용 조성물의 피부보습 개선 효능을 평가하기 위하여 수행한 실험에 대하여 설명한다.

Ⅰ. 실험의 재료 및 방법

1. 시험물질

상기 실시예 1과 비교예 1 내지 4를 통하여 제조된 물질을 시험물질로 사용하였다.

2. 각질형성세포의 세포배양 및 분화 유도

인간 각질형성 세포주인 HaCaT 세포는 CLS Cell Line Service GmbH에서 구입하여 사용하였다. HaCaT 세포는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Welgene)에 10% FBS, 100 units/㎖의 페니실린(penicillin)과 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기 (5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, 인산완충생리식염수(PBS, phosphate buffer saline, pH 7.4)로 세포 단층을 씻어낸 후 세포배양액을 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.

3. 세포 생존율 측정

HaCaT 세포의 세포 생존율은 MTT Assay 방법 (Denizot F and Lang R. J Immunological Method 89: 271-277, 1986)으로 측정하였다. HaCaT 세포를 5×10⁴ cells/well로 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 다양한 농도 (0, 200, 400, 600㎍/㎖)의 시험물질이 함유된 배지로 세포 배양액을 교환하여 세포를 24, 48시간 배양하였다. 그 후 1㎎/㎖의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (MTT, Amresco) 용액으로 세포배양액을 교환하여 2시간 동안 추가 배양한 후 살아있는 세포에서 형성된 formazan을 isopropanol로 용출하여 SpectraMaxM2 Microplate reader (Molecular Devices)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다.

4. Hyaluronic Acid (HA) 생성 측정

HaCaT 세포가 생성한 HA를 측정하기 위해 세포를 5×10⁴ cells/well로 24-well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 이 후 다양한 농도 (0, 200, 400 및 600㎍/㎖)의 시험물질이 함유된 배지로 세포배양액을 교환하여 24시간 배양하였다. 세포 배양액을 수거하여 5,000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 취해 －70℃에 보관하였다. 세포 배양액 내의 HA 함량은 HA 측정용 ELISA kit (R&D Systems)을 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 측정하였다.

5. 히알루론산 합성효소 (Hyaluronic acid synthase) HAS2 및 HAS3의 mRNA 발현 측정

HaCaT 세포에서 HA 생성에 관여하는 유전자인 HAS2와 HAS3 mRNA의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 2×10⁵cells/well로 6-well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 이 후 다양한 농도 (0, 200, 400 및 600㎍/㎖)의 시험물질이 함유된 배지로 세포배양액을 교환하여 24시간 배양하였다. 세포에서 RNA를 추출하기 위해 RNeasy kit (Qiagen)을 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 RNA를 추출하였다. Total RNA (2㎍)로부터 HyperScript^TM RT master mix kit (GeneAll biotechnology)을 이용하여 cDNA를 얻은 후, Rotor-Gene^TM SYBR Green Kit (Qiagen)을 사용하여 real-time PCR을 수행하여 HAS2, HAS3의 mRNA 발현 수준을 조사하였다. 실험에 사용한 프라이머(primer) 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며 유전자의 정량 분석은 Rotor gene 6000 series system software 1.7 program (Corbett Research)을 이용하였다.

Gene	Primer	Product length
HAS2	(Sense) 5'-ATCCCATGGTTGGAGGTGTT-3' (Antisense) 5'-TGCCTGTCATCACCAAAGCT-3'	252 bp
HAS3	(Sense) 5'-AGCCTTTTTGCCTTCCTGGA-3' (Antisense) 5'-AAGTTGCTGCGCCACACAA-3'	286 bp
GAPDH	(Sense) 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (Antisense) 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'	140 bp

(표 1: Real-time RT-PCR용 PCR primer정보)

6. 통계처리

모든 분석 수치는 mean±SEM으로 나타내었다. 대조군과 시험물질처리군의 차이를 비교하기 위하여 분산분석 (ANOVA)로 분석 후 SAS software version 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA)에서 Duncan's multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다. p< 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.

Ⅱ. 연구 결과

1. 실시예 1의 시험 대상 물질이 HaCaT 세포의 세포 생존율 (cell viability) 에 미치는 영향

HaCaT 세포에서 실시예 1의 시험 대상 물질의 세포독성을 조사하기 위해 다양한 농도 (0, 200, 400 및 600㎍/㎖)의 실시예 1 시험 대상 물질을 세포배양액에 처리하여 세포를 각각 24시간, 48시간 배양한 후 MTT assay를 실시하여 살아있는 세포수를 측정하였다. 각각의 실시예 1 시험 대상 물질을 24시간 처리하였을 때 실시예 1 시험 대상 물질을 처리하지 않은 대조군 (0㎍/㎖)과 비교하여 600㎍/㎖ 농도에서 세포증식이 유의적으로 증가하였다. 48시간 처리하였을 때 대조군과 비교하여 실시예 1 시험 대상 물질의 처리는 살아있는 세포수에 유의적인 차이를 보이지 않았다 (표 2). 이 결과는 HaCaT 세포에서 실시예 1 시험 대상 물질을 600㎍/㎖ 이하의 농도로 처리한 경우 세포 독성이 나타나지 않음을 제시한다.

처리 시간	세포 생존율 (Cell viability) (Absorbance at 570nm)
처리 시간	0㎍/㎖	200㎍/㎖	400㎍/㎖	600㎍/㎖
0h	0.299±0.011	0.299±0.011	0.299±0.011	0.299±0.011
24h	0.423±0.011^b	0.445±0.012^b	0.437±0.006^b	0.483±0.007^a
48h	0.797±0.011	0.769±0.012	0.775±0.014	0.800±0.004

(표 2: HaCaT 세포의 세포 생존율에 미치는 영향)

Values are expressed as mean±SEM.Means with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan's multiple range test.

2. 각각의 시험 대상 물질이 히알루론산 (hyaluronic acid, (HA)) 생성(합성)에 미치는 영향

HA는 분자량이 20 내지 40만에 이르는 고분자 화합물로써 표피의 수분증발을 막아 피부의 탄력성을 유지할 뿐만 아니라, 영양성분의 저장과 확산, 세포 이동 등에 관여한다. HA가 피부 보습에 중요한 역할을 담당하므로 실시예 1 및 비교예 1 내지 4를 통하여 제조된 물질의 피부 보습 개선 효능을 평가하기 위해 HaCaT 세포에서 각각의 물질이 HA의 생성에 미치는 영향을 조사하였다.

구분		물질의 처리농도
구분		0㎍/㎖	200㎍/㎖	400㎍/㎖	600㎍/㎖
히알루론산(HA) (ng/㎖)	실시예 1	92.6±2.3^b	99.3±6.2^b	119.4±4.5^a	123.7±6.7^a
	비교예 1	92.6±2.3	92.7±2.0	93.1±2.1	93.6±2.2
	비교예 2	92.7±2.1	92.7±1.9	92.8±2.0	93.1±2.4
	비교예 3	92.6±2.3	92.6±2.2	92.9±2.2	93.0±1.9
	비교예 4	92.5±2.2	92.7±2.4	92.8±2.1	92.6±2.3

(표 3: 히알루론산 (hyaluronic acid) 생성에 미치는 영향)

Values are expressed as mean±SEM.Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

상기 표 3에 나타난 바와 같이 대조군 (0㎍/㎖)의 HA 함량은 92.6±2.3ng/㎖이었으며, 실시예 1 물질의 처리농도 증가에 따라 99.3±6.2ng/㎖, 119.4±4.5ng/㎖, 123.7±6.7ng/㎖로 HA 생성이 유의적으로 증가하였으나, 비교예 1 내지 4의 경우는 물질 처리 농도의 증가에도 불구하고 세포내 HA농도에 거의 변화가 없음을 확인할 수 있다.

3. 각각의 시험 대상 물질이 HAS2 및 HAS3 mRNA 발현 수준에 미치는 영향

HAS는 세포막에 존재하여 글루쿠론산(glucuronic acid)과 N-아세틸-글루코사민(N-acetyl-glucosamine) 구성단위들을 교대로 배열하여 β-1,3 결합을 할 수 있도록 매개하여 HA를 합성하는 역할을 하는 효소이다. HAS-1과 HAS-2는 2~4×10⁶Da 크기의 HA를 생성하고 HAS-3는 0.4~2.5×10⁵ Da 크기의 HA를 형성한다. HAS가 활성화되면 진피층 내 보습인자인 HA의 함량이 늘어나 피부 보습력이 증가되므로, 보습 효과 검증에 중요한 효소라고 할 수 있다. 따라서 각각의 시험 대상 물질 처리에 의한 HSA2, HAS3 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 평가하기 위해 real-time RT-PCR을 수행하였다.

구분		물질의 처리농도
구분		0㎍/㎖	200㎍/㎖	400㎍/㎖	600㎍/㎖
실시예 1	HAS2 mRNA	1^b	18.16±4.62^a	6.51±4.01^b	3.37±1.86^b
실시예 1	HAS3 mRNA	1^b	5.01±1.62^b	18.94±6.40^b	119.08±57.16^a
비교예 1	HAS2 mRNA	1	1	1	1
비교예 1	HAS3 mRNA	1	1	1	1
비교예 2	HAS2 mRNA	1	1	1	1
비교예 2	HAS3 mRNA	1	1	1	1
비교예 3	HAS2 mRNA	1	1	1	1
비교예 3	HAS3 mRNA	1	1	1	1
비교예 4	HAS2 mRNA	1	1	1	1
비교예 4	HAS3 mRNA	1	1	1	1

(표 4: HAS2 및 HAS3 mRNA 발현 수준에 미치는 영향)

Each of the control levels (0μg/mL) was set to 1. Values are expressed as mean±SEM.

Means with the different letters are significantly different (p <0.05) by Duncan's multiple range test.

실시예 1의 경우, 상기 표 4에 나타난 바와 같이 HAS2 mRNA 수준은 대조군 (0㎍/㎖)과 비교하여 200㎍/㎖의 농도에서 18.16배로 현저히 증가하였고, 처리농도가 증가함에 따라 mRNA 수준이 감소되었다. HAS3 mRNA 수준은 기능성칼슘의 처리농도 증가에 따라 증가하였고, 600㎍/㎖의 농도에서 119.1배 증가하여 HAS3 mRNA 수준이 현저히 증가하였다.

그러나, 비교예 1 내지 4의 경우는 처리농도의 증가에도 불구하고 HAS2 mRNA 및 HAS3 mRNA의 발현수준에 전혀 영향을 미치지 못함을 확인할 수 있다.

결론적으로, 실시예 1의 물질의 처리는 100㎍/㎖의 농도에서 HAS2 mRNA 발현 수준을 증가시키고, 600㎍/㎖의 농도에서 HAS3 mRNA 발현 수준을 증가시켰으며, 처리농도 증가에 따라 HA의 생성량을 증가시켰음을 실험을 통하여 확인하였다.

이러한 실험의 결과에 따라, 본 발명에 따른 실시예 1의 물질은 결국 HAS2 및 HAS3의 mRNA 발현 수준을 증가시켜 HA 생성증가를 유도함을 나타내는 것이며, 본 발명에 따른 물질을 피부보습용으로 화장품 등에 이용할 수 있음을 시사한다.

[실온보존에 따른 물성변화여부 실험]

장기간 실온보존에 따라 본 발명에 따른 물질의 활성이 변화하는지 확인하는 실험을 수행하였다.

실시예 1을 통하여 제조된 물질을 25℃의 실온에 장기간 (0 ~ 120일) 보관한 후, 히알루론산 (hyaluronic acid, (HA)) 생성(합성) 효과가 변화하는 지 여부를 관찰하였다 (HaCaT 세포에서 각각의 물질이 HA의 생성에 미치는 영향을 조사함).

구분		물질의 처리농도
구분		0㎍/㎖	200㎍/㎖	400㎍/㎖	600㎍/㎖
히알루론산(HA) (ng/㎖)	0일	92.6±2.3^b	99.3±6.2^b	119.4±4.5^a	123.7±6.7^a
	30일	92.7±2.1^b	99.2±6.1^b	118.9±4.2^a	124.7±6.6^a
	60일	92.6±2.2^b	99.3±6.3^b	119.3±4.4^a	123.5±6.2^a
	90일	92.7±2.3^b	99.1±5.2^b	119.7±4.5^a	123.2±6.5^a
	120일	92.6±2.4^b	99.3±5.8^b	119.3±4.1^a	123.8±5.9^a

상기 표 5에 나타난 바와 같이 실시예 1의 경우 실온에 장기간 방치 보관하더라도 히알루론산의 생성 효능에 거의 변화가 없음을 확인할 수 있다.

실시예 1을 통하여 제조된 물질을 25℃의 실온에 장기간 (0 ~ 120일) 보관한 후, HAS2 및 HAS3 mRNA 발현 수준에 미치는 영향이 변화하는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다 (Real-time RT-PCR을 수행함).

구분		물질의 처리농도
구분		0㎍/㎖	200㎍/㎖	400㎍/㎖	600㎍/㎖
0일	HAS2 mRNA	1^b	18.16±4.62^a	6.51±4.01^b	3.37±1.86^b
0일	HAS3 mRNA	1^b	5.01±1.62^b	18.94±6.40^b	119.08±57.16^a
30일	HAS2 mRNA	1^b	18.17±4.52^a	6.53±4.11^b	3.36±1.88^b
30일	HAS3 mRNA	1^b	5.02±1.58^b	18.93±6.39^b	119.06±56.17^a
60일	HAS2 mRNA	1^b	18.21±4.55^a	6.51±4.02^b	3.35±1.83^b
60일	HAS3 mRNA	1^b	5.03±1.72^b	18.92±6.41^b	119.07±55.16^a
90일	HAS2 mRNA	1^b	18.15±4.59^a	6.52±4.02^b	3.38±1.87^b
90일	HAS3 mRNA	1^b	5.02±1.81^b	18.94±6.38^b	119.11±57.11^a
120일	HAS2 mRNA	1^b	18.18±4.61^a	6.53±4.03^b	3.39±1.85^b
120일	HAS3 mRNA	1^b	5.01±1.63^b	18.89±6.39^b	119.09±58.21^a

상기 표 6에 나타난 바와 같이 실시예 1의 경우 실온에 장기간 방치 보관하더라도 HAS2 mRNA 및 HAS3 mRNA의 발현 수준에 거의 변화가 없음을 확인할 수 있으며, 이는 본 발명 물질의 우수한 실온 보존성을 뒷받침하는 결과이다.

[피부 안전성 테스트]

실시예 1에 따라 제조된 조성물을 시험참가자인 성인 10명에게 24시간 첩포한 후, 제거하여 피부 이상상태 발생여부를 확인하는 실험을 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

시험참가자 번호	이상 유무 (피부발진, 가려움증 등)
1	이상 없음
2	이상 없음
3	이상 없음
4	이상 없음
5	이상 없음
6	이상 없음
7	이상 없음
8	이상 없음
9	이상 없음
10	이상 없음

상기 표 7의 결과를 살펴보면, 본 발명의 실시예 1에 따른 조성물의 피부 안전성을 확인할 수 있다.

Claims

난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 포함하는 알칼리 토금속 화합물을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및
상기 제1소성체를 포함하는 알칼리 토금속 산화물을 수소(H₂) 분위기 하에서 소성하여 수소음이온(H^－)을 갖는 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조되며 피부세포 내의 히알루론산 생성을 촉진시키는 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 제2소성체에는 수소음이온(H^－)이 흡장결합되어 있는 것을 특징으로 하는 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 유기탄산칼슘은 패각칼슘인 것을 특징으로 하는 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 제2소성체에 유기산이 더욱 배합된 것을 특징으로 하는 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 유기산은 구연산이며 조성물의 수소이온농도를 조절하기 위하여 배합되는 것을 특징으로 하는 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 제1소성단계는 300 내지 1,000℃에서 2 시간 내지 10 시간 동안 수행되는 것인 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 제2소성단계는 300 내지 1,000℃에서 2 시간 내지 10 시간 동안 수행되는 것인 수소음이온(H^－)을 갖는 피부보습용 조성물.
청구항 1 내지 7의 어느 한 항에 따른 피부보습용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
청구항 8에 있어서,
상기 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크 로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저 중 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.