KR20210087044A - 항-CD79b 항체, 약물 컨쥬게이트 및 그의 응용 - Google Patents

항-CD79b 항체, 약물 컨쥬게이트 및 그의 응용 Download PDF

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Abstract

항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 그의 약물 컨쥬게이트 및 그의 용도가 본원에 개시된다. 본원에서 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.

Description

항-CD79b 항체, 약물 컨쥬게이트 및 그의 응용
본 발명은 항-CD79b 항체, 약물 컨쥬게이트 및 그의 용도에 관한 것이다.
CD79b(즉, Igβ 또는 B29)는 B 세포 수용체의 신호전달 성분이며, CD79a(즉, Igα 또는 mb-1)와 공유적 이종이량체를 형성함으로써 작용한다. CD79b는 세포외 면역글로불린(Ig) 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호 도메인을 포함한다. CD79b의 표면 발현이 유세포분석에 의해 비-호지킨 림프종(NHL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 갖는 거의 모든 환자에서 검출된 바 있다. 신호전달 기능에 더하여, B 세포 수용체가 교차-결합되는 경우, 그것은 B 세포에 의한 클래스 II 항원 제시의 일부분인 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 구획(리소좀-유사 구획)에 표적화된다.
이 CD79b 생물학의 특징은 CD79b를 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)에 대한 표적이 되게 하는데, 이는 CD79b에 대한 항체가 내재화되고, 세포독성 약물을 방출시키는 프로테아제를 함유하는 것으로 알려져 있는 리소좀 구획으로 운반되기 때문이다. 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)는 종양으로의 약물의 표적화된 운반이 가능하며, 그 내에서 세포내 축적이 발생한다. ADC의 치료적 지수를 증가시키기 위한 노력(즉, 최소의 독성과 함께 가장 높은 효능)은 폴리클로널 및 모노클로널 항체의 특이성, 및 약물 결합 및 약물 방출 프로파일에 집중되어 왔다.
NHL의 치료에 임상적으로 유효한 다양한 ADC, 예컨대, 프로테아제 절단 가능한 링커에 의해 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)에 커플링된 인간화된 항-CD79b 항체(인간화된 SN8)가 제조된 바 있다.
항-CD79b 항체 또는 그의 기능적 단편, 그의 약제학적 조성물 또는 약물 컨쥬게이트, 및 혈액 종양의 치료에서의 그들의 용도가 본원에 제공된다.
일 양태에서,
SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
SEQ ID NO: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
SEQ ID NO: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다.
하나 이상의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD79b 항체는 모노클로널 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다.
하나 이상의 구현예에서, 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시되며; HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시되며; HCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시되며; LCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시되며; LCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시되며; LCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된다.
하나 이상의 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7 또는 11에 제시되고/제시되거나 본원의 항-CD79b 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8 또는 12에 제시된다.
하나 이상의 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13 내지 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되고/선택되거나 본원의 항-CD79b 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18 내지 22 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 본원의 항-CD78b 항체는 (a) SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 또는 33과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 서열 상동성을 갖는 중쇄, (b) SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 또는 34와 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 서열 상동성을 갖는 경쇄, 또는 (c) (a)의 중쇄 및 (b)의 경쇄를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 및 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되고/선택되거나 본원의 항-CD79b 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 및 34 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체는 하기의 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 25에 제시되며, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 26에 제시되고;
(2) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 27에 제시되며, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 28에 제시되고;
(3) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 29에 제시되며, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 30에 제시되고;
(4) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 31에 제시되며, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 32에 제시되고;
(5) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 33에 제시되며, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 34에 제시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트인 항체-약물 컨쥬게이트가 본원에 제공된다.
하나 이상의 구현예에서, 세포독성제는 화학치료적 약물, 성장 저해제, 독소 또는 방사성동위원소이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 용기 및 용기 내에 함유된 조성물을 포함하는 물품이 본원에 제공되며, 조성물은 본원에 기재된 CD79b 항체 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 물품은 본원에 기재된 CD79b 항체 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 완충제를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트이다.
또 다른 양태에서, CD79b-매개의 질병의 치료 또는 예방용 의약의 제조에서의 본원에 기재된 CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 질병은 혈액 종양, 특히 B 세포 증식성 장애이다. 특정 구현예에서, 질병은 림프종 또는 백혈병이다. 특정 구현예에서, 질병은 비-호지킨 림프종(NHL), 공격적 NHL, 재발성 공격적 NHL, 재발성 무통증 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통증 NHL, 소림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발상 세포 백혈병(HCL) 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다.
또 다른 양태에서, CD79b를 발현하는 세포의 성장의 저해 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 세포를 본원에 기재된 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트와 접촉시킴으로써, 세포의 성장의 저해를 유발하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 B 세포이다.
또 다른 양태에서, CD79b-매개의 질병의 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트를 CD79b-매개의 질병의 치료를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, CD79b-매개의 질병은 암이다.
또 다른 양태에서, CD79b를 함유하는 것으로 의심되는 시료 내의 CD79b의 존재의 결정 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 시료를 본원에 기재된 항체에 노출시키는 단계 및 시료 내의 CD79b로의 항체의 결합을 결정하는 단계로서, 시료 내의 CD79b로의 항체의 결합이 시료 내의 단백질의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, CD79b를 발현하는 세포, 예컨대 B 세포의 증가와 연관된 세포 증식성 장애의 진단 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 생물학적 시료 내의 시험 세포를 본원에 기재된 항체와 접촉시키는 단계; CD79b로의 상기 항체의 결합을 시험함으로써 시료 내의 시험 세포에 결합된 항체의 수준을 결정하는 단계; 및 대조군 시료 내의 세포에 결합된 항체의 수준과 비교하는 단계로서, 결합된 항체의 수준이 시험 및 대조군 시료 내의 CD79b를 발현하는 세포의 수와 관련시킴으로써 정규화되며, 대조군 시료보다 더 높은 시험 시료에서의 결합된 항체의 수준이 CD79b를 발현하는 세포와 연관된 세포 증식성 장애의 존재를 나타내는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다.
도 1: 인간화된 항체에 대한 친화성 시험 결과.
도 2: 누드 마우스 내의 인간 B-세포 림프종 Ramos의 피하 이종이식편에 대한 AS11259-ADC-001, 002, 004의 치료적 효과.
도 3: 누드 마우스 내의 인간 B-세포 림프종 Ramos의 피하 이종이식편에 대한 AS11259-ADC-010, 0012, 011, 008의 치료적 효과.
도 4: 누드 마우스 내의 인간 림프종 Granta-519의 피하 이종이식편에 대한 AS11259-ADC-001, 002, 004의 치료적 효과.
도 5: 누드 마우스 내의 인간 림프종 Granta-519의 피하 이종이식편에 대한 AS11259-ADC-001, 0012, 011, 010의 치료적 효과.
도 6: 누드 마우스 내의 인간 림프종 WSU-DLCL2의 피하 이종이식편에 대한 AS11259-ADC-001, 004의 치료적 효과.
도 7: 누드 마우스 내의 인간 림프종 WSU-DLCL2의 피하 이종이식편에 대한 AS11259-ADC-001, 0012, 011, 010의 치료적 효과.
본 발명의 범주 내에서, 본 발명의 상기 언급된 다양한 기술적 특징 및 하기의 부분에(예컨대 구현예에) 구체적으로 기재된 기술적 특징을 서로 조합하여 새로운 기술적 해결책을 구성할 수 있는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 실시는 달리 정의되지 않는 한, 해당 분야의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이들 기법은 문헌, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook et al., 1989)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, ed., 1984)]; 문헌[Animal Cell Culture (RI Freshney, ed., 1987)]; 문헌[Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds. 1987, and regularly updated)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR: Polymerase Chain Reaction), (Mullis et al., ed., 1994)]; 문헌[A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988)]; 문헌[Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)]에 완전히 설명되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단리된" 항체는 확인되고, 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 항체가 로우리(Lowry) 방법에 따라 중량이 95% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과이고, (2) 회전식 컵 시퀀서(rotary cup sequencer)를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도 또는 (3) 환원 또는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE와 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 또는 바람직하게는 은을 사용한 염색에 따른 균질성까지 정제된다.
용어 "CD79b"는 달리 나타내지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간, 마카크) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원 유래의 임의의 천연 CD79b를 지칭한다. 용어 "CD79b"는 "전장", 비가공된 CD79b 및 세포로부터 가공된 임의의 형태의 CD79b를 포함한다. 상기 용어는 또한, CD79b의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체 및 아이소폼(isoform)을 포함한다. 본원에 기재된 CD79b 폴리펩티드는 다양한 공급원, 예컨대 인간 조직 유형 또는 기타 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. "고유 서열 CD79b 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 CD79b 폴리펩티드 중 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 고유 서열 CD79b 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "고유 서열 CD79b 폴리펩티드"는 구체적으로 특정 CD79b 폴리펩티드의 자연 발생하는 절단된 또는 분비된 형태(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 자연 발생 변이체 형태(예를 들어, 대안적인 스플라이싱 형태) 및 자연 발생 대립형질 변이체를 포함한다.
CD79b 폴리펩티드의 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막횡단 및 세포질 도메인이 실질적으로 없는 CD79b 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 전형적으로, CD79b 폴리펩티드 ECD는 1% 미만의 이러한 막횡단 도메인 및/또는 세포질 도메인, 바람직하게는 0.5% 미만의 이러한 도메인을 갖는다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 달라질 수 있으며, 바람직하게는, CD79b 폴리펩티드의 세포외 도메인은 실시예 또는 명세서에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인 경계의 어느 하나의 측의 약 5개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 CD79b ECD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:35에 제시되어 있다.
용어 "항체"는 모노클로널 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 다중-에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 디아바디(diabody) 및 단일 쇄 분자, 및 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig) 및 "항체"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
용어 "CD79b 항체" 등은 CD79b와 충분한 친화성으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, CD79b 항체는 예를 들어, 방사성면역검정(RIA)에 의해 측정되는 바와 같이, CD79b로의 항체의 결합의 약 10% 미만의 정도로 비관련 비-CD79b 단백질에 결합한다. 특정 구현예에서, CD79b에 결합하는 항체는 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-CD79b 항체는 상이한 종 유래의 CD79b 간에 보존되는 CD79b 에피토프에 결합한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 전형적으로 (동일한 유형의 다른 항체에 비하여) 항체의 가장 가변적인 부분이며, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 서열에서 매우 상이한 위치를 지칭한다. 가변 도메인은 항원 결합을 매개하며, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인에 걸쳐 있는 110개 아미노산에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 사실상, 가변 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 15 내지 30개 아미노산 길이의 상대적으로 불변의 세그먼트 및 "고도의 가변 영역(HVR)"으로 지칭되는, 프레임워크 영역을 분리하는 각각 9 내지 12개 아미노산의 길이의 매우 가변적인 더 짧은 영역으로 이루어진다. 고유 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이의 대부분은 베타-시트(beta-sheet) 입체형태를 채용한다. 각각의 쇄에서 HVR은 FR 영역에 의해 매우 가까이 함께 유지되며, 다른 쇄의 HVR과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 도메인은 항원으로의 항체의 결합에 직접 연루되지 않지만, 다수의 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로널 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성질화, 아미드화)를 제외하고, 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하다. 모노클로널 항체는 고도로 특이적이며, 단일의 항원 부위를 표적화한다. 각각의 모노클로널 항체는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로널 항체 제형에 비하여 항원 상의 단일의 결정기에 대해 유도된다. 그들의 특이성에 더하여, 모노클로널 항체의 이점은 그들이 하이브리도마 배양에 의해 합성되며, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에 있다. "모노클로널"은 항체가 실질적으로 균질한 집단의 항체로부터 수득되는 것을 나타내며, 임의의 특정한 항체의 생성 방법을 필요로 하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 본원에서 사용될 모노클로널 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법(예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]), DNA 재조합(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호), 파지 디스플레이 기술(예를 들어, 문헌[Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)]) 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 부분 또는 전체 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자를 갖는 동물로부터 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하기 위한 기법(예를 들어, WO1998/24893호)을 포함하는 다양한 기법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 또는 "완전한 항체"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 항원 결합 부위, 및 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체를 지칭한다. 불변 도메인은 고유 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 고유 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호 참조); 단일 쇄 항체(scFv) 분자; 및 항체 단편에 의해 형성되는 다중특이적 항체가 포함된다. 파파인을 사용한 항체의 분해는 "Fab" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. Fab 단편은 전체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(VH) 및 하나의 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합이 1가이며, 즉, 그것은 단일의 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 대략적으로 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편에 상응하는 더 큰 F(ab')2 단편을 생성하며, 이는 상이한 항원 결합 활성을 갖고, 여전히 항원과 교차-결합할 수 있다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하여, CH1 도메인의 카복실 말단에서의 일부 추가의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한 쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 컨쥬게이트도 알려져 있다. Fc 단편은 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 중쇄의 카복실 말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 특정 유형의 세포 상에서 관찰되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 영역이기도 한 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정된다.
"Fc 영역" 또는 Fc 단편은 고유 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 본원에서 사용된다. 면역글로불린 중쇄 Fc 영역의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 그의 Cys226 또는 Pro230 위치에서의 아미노산 잔기로부터 카복시 말단까지의 세그먼트로서 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따라 잔기 447)은 예를 들어, 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 컨쥬게이트는 모든 K447 잔기가 제거된 항체 컨쥬게이트, 제거된 임의의 K447 잔기가 없는 항체 컨쥬게이트, 또는 K447 잔기가 있는 또는 K447 잔기가 없는 혼합된 항체 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. "기능적 Fc 영역"은 고유 서열 Fc 영역의 이펙터 기능을 보유한다. 예시적인 이펙터 기능은 C1q 결합, CDC, Fc 수용체 결합, ADCC, 식세포작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절 등을 포함한다. "고유 서열 Fc 영역"은 자연에서 관찰되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 고유 서열 인간 Fc 영역은 고유 서열 인간 IgGl Fc 영역; 고유 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 고유 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 고유 서열 인간 IgG4 Fc 영역; 및 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 고유 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지며, 예를 들어, 고유 서열 Fc 영역에서 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 고유 서열 Fc 영역 및/또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역에 대하여 적어도 약 80% 상동성, 가장 바람직하게는 그들에 대하여 적어도 약 90% 상동성, 더욱 바람직하게는 그들에 대하여 적어도 약 95% 상동성을 갖는다.
"Fv"는 전체 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 가까이 비-공유적으로 결합된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 6개의 초가변 루프(중쇄 및 경쇄의 각각에 대하여 3개의 루프)가 이들 2개의 도메인의 폴딩으로부터 돌출되어, 항원-결합 아미노산 잔기에 기여하고, 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일의 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 오직 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고, 이에 결합하는 능력을 갖지만, 친화성이 무손상 결합 부위보다 더 낮다.
"단일-쇄 Fv"는 또한 "scFv"로서 약칭될 수 있으며, 이는 항체의 VH 및 VL 도메인이 단일의 폴리펩티드 쇄로 연결된 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 sFv가 원하는 항원 결합 구조를 형성하도록 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
"디아바디"는 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 연결된 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 작은 항체 단편은 짧은 링커(약 5 내지 10개 잔기)를 사용하여 VH와 VL 도메인 사이에 scFv 단편을 구축함으로써 제조되며, 짧은 링커 때문에, 가변 도메인은 쇄 내측보다는 쇄 사이에서 쌍형성을 겪는다. 이는 2가 단편, 즉, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 초래한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 이중특이적 디아바디는 두 항체 모두의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "크로스오버(crossover)" scFv 단편의 이종이량체이다.
본원에 기재된 항체의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 전형적으로 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역, 또는 변경된 FcR 결합 능력을 보유하거나 이를 갖는 항체의 Fc 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체의 기능성 단편의 예에는 선형 항체, 단일-쇄 항체(scFv), 및 항체 단편, 특히 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아바디, 또는 화학적 변형에 의해 또는 리포좀 내로의 혼입에 의해 반감기를 증가시킬 수 있는 임의의 단편에 의해 생성되는 다중특이적 항체가 포함된다. 화학적 변형은 폴리(알킬렌)글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 부가, 즉, CD79b 결합 활성을 갖는 PEG화 변형(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG의 PEG화 단편으로 지칭됨)을 포함한다.
바람직하게는, 본원에 기재된 항체의 기능적 단편은 그것이 유래된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 부분적인 서열로 이루어지거나, 또는 이를 포함하며, 부분적인 서열은 그것이 유래된 항체와 동일한 결합 특이성 및 충분한 친화성을 보유하기에 충분하다. 이러한 기능적 단편은 그들이 유래된 항체 서열 중 최소 5개의 아미노산, 바람직하게는 10, 15, 25, 50 및 100개의 연속 아미노산을 포함할 것이다.
모노클로널 항체는 본원에서 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다. 키메라 항체에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이며, 또 다른 부분은 또 다른 특정 종으로부터 유래되거나, 또 다른 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 또 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이다.
"인간화된 항체"는 "키메라 항체"의 특정 부류이다. 비-인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 최소한으로 비-인간 항체로부터 유래된 서열을 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 대부분, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수여자 항체)의 초가변 영역 잔기가 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대 원하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역 잔기에 의해 대체된 면역글로불린을 지칭한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수여자 항체에서 또는 공여자 항체에서 관찰되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체의 성능을 추가로 개선시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개, 실질적으로 전체의 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부분도 또한 포함할 것이다. 인간화된 항체는 파지 디스플레이 기술과 조합하여 컴퓨터 시뮬레이션 설계를 통해 마우스를 면역화시킴으로써 생성되는 마우스-유래의 항체로부터 수득될 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 인간 항체를 생성하기 위한 해당 분야에 알려져 있는 임의의 기법을 사용하여 생성되는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 구체적으로 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일의 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 모든 비-공유적 상호작용을 합한 세기를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 달리 나타내지 않는 한, 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표현될 수 있다. 저-친화성 항체는 전형적으로 항원에 천천히 결합하며, 용이하게 해리하는 경향이 있는 한편, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 훨씬 더 신속하게 결합하며, 더 긴 결합을 유지하는 경향이 있다. 친화성은 방사성표지된 항원 결합 검정(RIA)을 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
"제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 선택적인 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 그것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있다면, "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 리더 서열 또는 분비성 리더 DNA가 폴리펩티드의 분비에 연루되는 전구-단백질로서 발현된다면, 그것은 폴리펩티드의 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미친다면, 그것은 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위의 위치가 번역을 용이하게 한다면, 그것은 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"이란, 연결된 DNA 서열이 인접한 것을 의미하며, 분비성 리더의 경우에, 그것은 인접하며, 판독 가능한 상태인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 라이게이션은 편리한 제한 부위에서의 연결에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위의 부재 하에, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 관례에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서, 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제할 수 있다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "재조합 벡터")로서 지칭된다. 전형적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔한 형태의 벡터이기 때문에, 상호교환 가능하게 사용된다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 DNA 및 RNA를 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 지칭하기 위하여 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체일 수 있거나, DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 폴리머 내로 혼입된 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조의 변형은 존재한다면, 폴리머의 어셈블리 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 예컨대 표지로의 커플링에 의해 추가로 변형될 수 있다.
"올리고뉴클레오티드"는 필수적은 아니지만 일반적으로 약 200개 미만의 뉴클레오티드의 길이의, 전형적으로 단일 가닥의, 합성의, 짧은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 질환을 지칭한다. 종양은 양성 종양 및 악성 종양으로 나뉠 수 있으며, 악성 종양은 암으로도 지칭된다. 종양은 고형 종양 또는 혈액 종양으로 나뉠 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 특히 조혈계의 암 또는 혈액-관련 암의 치료에 관한 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "조혈계"는 흉선 및 골수 및 말초 림프 조직, 예컨대 비장, 림프절, 점막과 연관된 림프 조직, 예컨대 장-관련 림프 조직, 편도, 파이어반(Peyer's patch) 및 다른 점막-관련 부착 및 림프 조직, 예컨대 기관지 내막을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 조혈계의 암 또는 혈액-관련 암은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프 악성종양, 및 비장의 암 및 림프절의 암을 포함할 수 있다. 조혈계의 암 또는 혈액-관련 암의 더욱 구체적인 예는 B-세포 림프종을 포함하는, 예를 들어, 진행성, 중등 및 저-등급 림프종을 포함하는 B-세포-관련 암, 예컨대 점막-관련 림프 조직 B-세포 림프종 및 비-호지킨 림프종(NHL), 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 소림프구성 림프종, 변연대 림프종, 미만성 대 세포 림프종, 여포성 림프종, 및 호지킨 림프종 및 T 세포 림프종; 및 이차성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 예컨대, B 세포 백혈병(CD5+ B 림프구), 골수성 백혈병, 예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프성 백혈병, 예컨대, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 척수형성이상증을 포함하는 백혈병; 및 다른 혈액학적 및/또는 B 세포 또는 T 세포 관련 암을 포함한다. 조혈계의 암 또는 혈액-관련 암은 또한, 다형핵 백혈구, 예컨대, 호염기구, 호산구, 호중구 및 단핵구, 수지상 세포, 혈소판, 적혈구 및 자연 살해 세포를 포함하는 다른 조혈 세포의 암을 포함한다. 구체적으로, 그것은 비-호지킨 림프종(NHL), 공격적 NHL, 재발성 공격적 NHL, 재발성 무통증 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통증 NHL, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종, 모발상 세포 백혈병(HCL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암성 B 세포 증식성 장애를 포함할 수 있다.
본원에서, 암은 또한 암, 모세포종 및 육종을 포함한다. 따라서, 암의 다른 예는 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간육종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암 및 다양한 유형의 두경부암 등을 포함한다.
"치료" 또는 "완화"는 지시된 병리학적 질환 또는 장애의 완화(감소) 또는 치유를 지칭한다. 환자가 본원에 기재된 방법에 따른, 치료적 양의 항-CD79b 항체를 제공받은 이후에 하기 중 하나 이상의 관찰 가능한 및/또는 측정 가능한 감소 또는 소실을 나타낸다면, 대상체에서는 CD79b 폴리펩티드를 발현하는 종양(특히 암)을 성공적으로 "치료한다": 감소된 종양 세포의 수 또는 종양 세포의 소실; 감소된 종양 부피; 종양 세포 침윤의 저해; 종양 전이의 저해; 소정의 정도로의 종양 성장의 저해; 및/또는 소정의 정도로의 특정 종양과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 이환율 및 사망률의 감소; 및 삶의 질의 개선. 항-CD79b 항체가 종양 세포 성장을 방지하고/방지하거나 기존의 종양 세포를 사멸시키는 경우에, 그것은 세포를 억제하고/억제하거나 세포를 해할 수 있다. 이들 징후 또는 증상의 완화는 또한 환자가 자각할 수 있다.
"치료적 유효량"은 그것이 투여되는 대상체에게 그의 이익을 나타내기에 충분한 용량을 의미한다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 시간 경과는 치료 중인 대상체의 질환 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료에 대한 처방(예를 들어, 용량의 결정 등)은 궁극적으로 GP 및 다른 의사의 책무이며, 그들이 통상 치료 중인 질병, 개별 환자의 상태, 운반 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려져 있는 기타 인자를 고려하여 결정을 내리는 것에 의존한다. 종양의 경우에, 치료적 유효량의 약물은 종양 세포의 수를 감소시키고/감소시키거나; 종양 부피를 감소시키고/감소시키거나; 주변 기관 내로의 암 세포의 침윤을 저해하고/저해하거나; 종양 전이를 저해하고/저해하거나; 종양 성장을 소정의 정도로 저해하고/저해하거나; 종양과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 감소시킬 수 있다. "예방적 유효량"이란, 필요한 용량 및 시간에 원하는 예방적 효과를 달성하기에 유효한 양을 의미한다. 필수적은 아니지만 보통, 예방적 용량은 질병의 발병 이전에 또는 질병의 조기에 대상체에게 투여되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 낮을 것이다.
항-CD79b 항체의 "성장 저해 양"은 시험관 내 또는 생체 내에서 세포, 특히 종양, 예컨대 암 세포의 성장을 저해할 수 있는 양을 지칭한다. 신생 세포 성장을 저해하기 위한 항-CD79b 항체의 "성장 저해 양"은 실험적으로, 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
항-CD79b 항체의 "세포독성 양"은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 종양 세포, 예컨대 암 세포의 파괴를 유발할 수 있는 양을 지칭한다. 신생물 세포 성장을 저해하기 위한 항-CD79b 항체의 "세포독성 양"은 실험적으로, 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "개체" 또는 "대상체"는 척추동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 가축(예컨대, 소), 스포츠 동물, 애완 동물(예컨대, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 랫트를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 포유동물은 인간을 지칭한다.
하나 이상의 다른 치료제와 "조합되는" 투여는 동시적인(동시-) 투여 및 임의의 순서로의 순차적인 투여를 포함한다.
참조 폴리펩티드 서열의 "서열 동일성"에 관하여, 그것은 최대 서열 동일성 백분율을 수득하기 위해 서열을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하는 경우, 그리고 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 비교는 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 해당 분야의 기술 내의 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 경쇄(특히, 본원에 구체적으로 언급된 개별 서열)에 대하여 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 본원에 포함된다. 바람직하게는, 돌연변이는 예를 들어, 미국 특허 제5,364,934호에 기재된 바와 같은 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 위한 기법 및 지침 중 임의의 것을 사용하여, 본원에 기재된 항-CD79b 항체에서 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 변이는 본원에 SEQ ID NO: 1 내지 6으로서 제시된 CDR 내에서 발생하지 않는다. 변이는 고유 서열 항체에 비하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는 항체 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 선택적으로, 변이는 항-CD79b 항체의 하나 이상의 도메인 내의 적어도 하나의 아미노산의 임의의 다른 아미노산에 의한 치환이다. 항-CD79b 항체의 서열을 알려져 있는 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고, 고도의 상동성 영역에서 이루어지는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써, 예상되는 활성에 대한 유해한 영향 없이 아미노산 잔기가 삽입되거나, 대체되거나, 결실되는 원리를 찾을 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체한, 예컨대 류신을 세린으로 대체한, 즉, 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1 내지 5개 아미노산의 범위일 수 있다. 용인 가능한 변이는 서열에서 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 체계적으로 수행하고, 생성된 변이체를 전장 또는 성숙 고유 서열에 의해 나타나는 활성에 대하여 시험함으로써 결정될 수 있다.
변이는 해당 분야에 알려져 있는 방법, 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개의(위치-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 수행될 수 있다. 클로닝된 DNA를 위치-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 제한 선택적 돌연변이유발 또는 다른 알려져 있는 기법으로 처리하여, 항-CD79b 항체 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
항-CD79b 항체의 올바른 입체형태를 유지하는데 연루되지 않는 임의의 시스테인 잔기를 또한, 통상 세린에 의해 치환하여, 분자의 산화 안정성을 개선시키고, 비정상적인 교차결합을 방지할 수 있다. 그와 반대로, (특히, 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우) 시스테인 결합을 항-CD79b 항체에 부가하여, 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 대용 변이체는 모체 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택되는 생성된 변이체는 그들이 생성되는 모체 항체에 비하여 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 대용 변이체의 통상적인 생성 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화성 성숙을 포함한다. 요약하여, 몇몇의 초가변 영역 부위(예를 들어, 6 내지 7개의 부위)를 돌연변이시켜, 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이에 따라 생성되는 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13 유전자 III 생성물과의 융합물로서 사상 파지 입자 상에 1가 형태로 디스플레이된다. 이어서, 파지 디스플레이 변이체를 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대하여 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 항원 결합에 중요하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여, 항체와 CD79b 폴리펩티드 사이의 접촉점을 확인한다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에 상세화된 기법에 따라 치환되는 후보 부위이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 관련 검정 중 하나 이상에서 뛰어난 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다. "세포독성제"는 세포의 기능을 저해하거나 방지하고/방지하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 하기를 포함한다: 방사성동위원소, 예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사능 동위원소; 화학치료제, 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid)(예컨대, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신(mitomycin) C, 클로람부실(chlorambucil) 또는 다우노루비신(daunorubicin); 효소 및 그의 단편, 예컨대 리소자임; 항생제; 및 독소, 예컨대 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소; 및 해당 분야에 널리 알려져 있는 항종양 또는 항암 약물.
"약제학적 조성물"은 적어도 하나의 약물 및 선택적으로, 특정 목적을 달성하기 위하여 함께 조합되는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제의 조합을 의미한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 그들이 본 발명의 목적을 달성하기 위해 함께 작용할 수 있는 한, 시간 및/또는 공간이 분리된 조합을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물에 함유된 성분(예를 들어, 항체, 핵산 분자, 핵산 분자 조합 및/또는 본원에 기재된 컨쥬게이트)은 전체로서 또는 개별적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 약제학적 조성물에 함유된 성분이 개별적으로 대상체에게 투여되는 경우, 성분은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 물, 완충된 수용액, 등장성 염수 용액, 예컨대 PBS(인산염 완충제), 글루코스, 만니톨, 덱스트로스, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 0.3% 글리세롤, 히알루론산, 에탄올 또는 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리프로필렌 글리콜, 트리글리세리드 등이다. 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 담체의 유형은 특히 본 발명에 따른 조성물이 경구, 비강, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여를 위해 제형화되는지에 좌우된다. 본 발명에 따른 조성물은 습윤화제, 유화제 또는 완충 물질을 첨가제로서 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 경구로, 비강으로, 피내로, 피하로, 근육내로 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
항-CD79b 항체 또는 그의 기능적 단편, 그의 약제학적 조성물 또는 항체-약물 컨쥬게이트 및 조혈 종양의 치료에서의 그의 이용 방법이 본원에 제공된다.
본원에서 항체는 종양의 치료에서 이용되는 CD79b에 특이적으로 결합하는 항체이며, 모노클로널 항체, 항체 단편(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편 포함), 디아바디, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일 쇄 항체 또는 그의 상응하는 항원 에피토프로의 항-CD79b 폴리펩티드 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체일 수 있다. 본원에 기재된 항체는 선택적으로, 세포독성제, 예컨대, 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin), 마이탄시노이드(maytansinoid), 돌라스타틴(dolastatin) 유도체 또는 칼리키아미신(calicheamicin)을 포함하는 독소, 항생제, 방사성동위원소, 리소자임 등에 컨쥬게이트될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 선택적으로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있으며, 바람직하게는 그에 결합된 세포에 대하여 세포사를 유도한다. 검출을 위하여, 본원에 기재된 항체는 검출 가능하게 표지되고, 고체 지지체에 부착될 수 있다.
본원에서 항-CD79b 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 6에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 6개 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 임의의 1개, 임의의 2개 또는 3개 모두를 포함하고/포함하거나 그의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4 내지 6 중 임의의 1개, 임의의 2개 또는 3개 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 CD79b 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1 내지 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나 그의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4 내지 6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1 내지 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4 내지 6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체는 하기를 포함한다: SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3. 특정 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원의 항체는 뮤린 항체 104E1이고/이거나, 그의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 바와 같을 수 있고/있거나, 그의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8에 제시된 바와 같을 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 항체는 인간화된 항체이며, 여기서, SEQ ID NO: 1 내지 6 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 6개 모두가, 인간 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 내의 상응하는 CDR 영역을 대체하기 위하여 사용된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역을 제조하기 위해 사용되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9에 제시되며, 인간화된 항체의 경쇄 가변 영역을 제조하기 위해 사용되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10에 제시된 바와 같다다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11에 제시되고/제시되거나, 인간화된 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12와 같다.
특정 구현예에서, 항체 친화성에서 중요한 역할을 수행하는 뮤린 FR 영역 내의 아미노산 위치를 찾기 위하여, PDC 데이터베이스에서, 본원에 기재된 뮤린 항체 104E1에 대한 상동성이 유사한 결정 구조에 대하여 검색한다. 결과적으로, 항-폴리시알산 항체 Ab735의 scFv 결정 구조를 찾았으며, 이는 104E1 항체 서열과 77%의 상동성을 가지며, 충분히 높은 분해능(resolution)을 갖는다. 본원에서, 이 결정을 구조적 주형으로서 사용하여, 2개의 서열을 비교하여 104E1 항체의 3WBD scFv의 상동성 모델을 확립하였다. 이 상동성 모델에 따라, 5Å 미만의 CDR 도메인으로부터의 거리 이내이거나, CDR 도메인에 의해 둘러싸인 104E1 서열의 FR 도메인 내의 아미노산 부위를 찾은 다음, 항체 친화성에서 중요한 역할을 수행할 수 있는 이들 아미노산 부위를 글리코실화, 탈아미드화, 산화 부위 등을 피하면서 CDR-그라프팅된 서열(SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12)에서 역 돌연변이시켰다. A24T, RV67KA, S84R, T98K, K12A, S16A, V20L, A24T, R38K, M48I, V68A, I70L, Y95F, T98K 및 V113L을 포함하는, 역 돌연변이시킬 필요가 있을 수 있는 총 15개의 부위가 중쇄 가변 영역에서 확인되었으며; V3L, F41Y, RR50KL, FQ41YL, R51L, V88L 및 V109L을 포함하는, 역 돌연변이시킬 필요가 있을 수 있는 총 7개의 부위가 경쇄 가변 영역에서 확인되었다. 이어서, Fab 라이브러리를 킹슬리(Kingsley)의 표준 프로토콜에 따라 구축하고, 파지 디스플레이 플랫폼에 의해 스크리닝하였다. 뮤린 104E1 항체 이상의 친화성을 갖는 인간화 이후의 서열을 스크리닝하고, 서열 확인을 위하여 시퀀싱하였다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13 내지 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로부터 선택될 수 있고/있거나 그의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18 내지 22 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 또한, 중쇄 가변 영역에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열, 및 경쇄 가변 영역에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내의 돌연변이는 FR 내에서 발생하며, CDR에서 발생하지 않는다.
본원에 기재된 항체는 또한 불변 영역을 함유할 수 있다. 불변 영역은 인간 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 불변 영역일 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 또는 IgA2의 불변 영역일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD79b 항체의 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 Fc 영역을 포함하며, 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 Fc 영역을 포함한다. 예시적인 중쇄 Fc 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23에 제시된 바와 같을 수 있으며, 예시적인 경쇄 Fc 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 24에 제시된 바와 같을 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 Fc 영역을 추가로 포함하고/포함하거나 본원에 사용하기에 적합한 경쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 Fc 영역을 추가로 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역의 이펙터 기능을 변경시키는 해당 분야에 알려져 있는 돌연변이는 중쇄 및/또는 경쇄 Fc 영역에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 감소된 이펙터 기능을 갖는 Fc 영역은 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329(US 6,737,056호 참조) 중 하나 이상에서 치환 돌연변이를 갖는다. 개선된 ADCC를 갖는 하나 이상의 아미노산 치환은 Fc 영역의 잔기 298, 333 및/또는 334에서 발생할 수 있다(잔기는 EU 넘버링에 의해 넘버링된다).
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD79b 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 및 33 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택될 수 있고/있거나 그의 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 및 34 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 95% 서열 동일성으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본원의 항-CD79b 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: (1) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 25에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 26에 제시된 항체; (2) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 27에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 28에 제시된 항체; (3) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 29에 제시되고, 경쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 30에 나타낸 바와 같은 항체; (4) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 31에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 32에 제시된 항체; 및 (5) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 33에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 34에 제시된 항체.
또한, CDR, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 및 중쇄에 대한 코딩 서열, 및 그의 상보성 서열(핵산 서열), 코딩 서열 또는 그의 상보성 서열을 포함하는 벡터, 및 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 예시적인 코딩 서열은 SEQ ID NO: 36, 37, 38 및 39에 제시되며, 이는 각각 SEQ ID NO: 33, 34, 7 및 8의 코딩 서열이다.
표준 재조합 기법을 사용하여 본원에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 항체 생성 세포, 예컨대 하이브리도마 세포로부터 단리하고, 시퀀싱할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기법을 사용하여 합성할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 일단 수득되면, 이를 원핵 숙주에서 복제하고 이종 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입한다. 본원의 목적을 위하여, 해당 분야에서 이용 가능하며 알려져 있는 다양한 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 선택은 주로 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터를 형질전환시킬 특정 숙주 세포에 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 그것이 존재하는 특정 숙주 세포와 그의 양립 가능성에 따라 다양한 빌딩 블록을 함유한다.
벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 박테리오파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 전형적으로, 관심 DNA 서열은 해당 분야에 알려져 있는 기법을 사용하여 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내에 삽입된다. 벡터 성분은 전형적으로 하기의 것들 중 하나 이상을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 이들 성분 중 하나 이상을 포함하는 적합한 운반체는 숙련자에게 알려져 있는 표준 라이게이션 기법을 사용하여 구축될 수 있다. 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.
CD79b는 재조합에 의해 직접적으로 생성될 수 있을 뿐만 아니라, 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생성될 수 있다. 전형적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 그것은 벡터 내에 삽입되는 항-CD79b 항체를 인코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 장독소 II 리더 서열로부터 선택되는 원핵 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위하여, 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버테이스(invertase) 리더 서열, 알파 인자 리더 서열(사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)의 α-인자 리더 서열 포함) 또는 산 포스파타제 리더 서열, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 글루코아밀라제 리더 서열 등일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예컨대 동일한 또는 관련된 종의 분비된 폴리펩티드 유래의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더 서열을 사용하여 단백질 분비를 지시할 수 있다.
일반적으로, 포유동물 발현 벡터는 복제 원점 성분을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, SV40 원점은 그것이 조기 프로모터를 함유하기 때문에, 통상적으로 간단하게 사용될 수 있다. 발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택 마커로도 지칭되는 선택 유전자를 함유할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나; (b) 영양요구주를 보충하거나; 또는 (c) 바실러스(Bacillus)에 있어서 D-알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 유전자와 같이, 복합 배지로부터 수득될 수 없는 주요 영양소를 제공하는 단백질을 인코딩한다.
선택 프로토콜의 일 예는 숙주 세포의 성장을 차단하기 위한 약물을 사용한다. 이종 유전자에 의해 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 저항성을 부여하는 단백질을 생성하며, 이에 따라, 선택 프로토콜로부터 남겨진다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이드로마이신을 사용한다.
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 항-CD79b 항체를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하여, mRNA 합성을 지시한다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 널리 알려져 있다. 효모 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대 에놀라제(enolase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이성질화효소, 3-포스포글리세레이트 뮤타제(mutase), 피루베이트 키나제, 트리오스 포스페이트 이성질화효소, 포스포글루코스 이성질화효소 및 글루코키나제의 프로모터를 포함한다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터에 의한 항-CD79b 항체의 전사는 예를 들어, 바이러스(예를 들어, 폴리오마바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2형), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)) 게놈으로부터 수득되는 프로모터, 이종 포유동물 프로모터(예컨대 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터) 및 열 충격 프로모터의 제어 하에 있다. 특정 구현예에서, SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터가 사용되며, 이는 SV40 바이러스 복제 원점을 추가로 포함한다.
고등 진핵 세포에 의한 항-CD79b 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 프로모터에서 작용하여 전사를 증가시키는 보통 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용 요소이다. 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아단백질 및 인슐린) 유래의 많은 인핸서 서열이 알려져 있다. 그러나, 진핵 바이러스 유래의 인핸서가 흔히 사용된다. 예에는 SV40 복제 원점의 후기 측(late side) 상의 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 폴리오마바이러스의 복제 원점의 후기 측 상의 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 항-CD79b 항체 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내에 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터의 5' 위치에 위치한다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용하기 위한 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 전형적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA 비번역 영역의 5' 말단 및 간헐적으로 3' 말단으로부터 수득된다. 이들 영역은 항-CD79b 항체를 인코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 하나의 유용한 전사 종결 구성원은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다.
본원에 기재된 핵산 서열을 함유하는 벡터는 해당 분야에 널리 알려져 있는 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 시험관 내에서 숙주 세포 내로 핵산을 전달하기에 적합한 기법은 리포좀의 이용, 전기천공법, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 등을 포함한다.
숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포일 수 있다. 적합한 원핵생물은 고세균(archaea) 및 진정세균(eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예컨대 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아 콜라이(E. coli)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 시겔라(Shigella) 및 바실러스(Bacillus), 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라 파라코커스(Vitreoscilla Paracoccus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다.
전장 항체, 항체 단편 및 항체 융합 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않는 경우, 예컨대 치료적 항체가 세포독성제(예를 들어, 독소)에 컨쥬게이트되고, 면역컨쥬게이트 그 자체가 종양 세포 파괴의 효능을 보이는 경우, 박테리아에서 제조될 수 있다. 전장 항체는 순환계에서 더 긴 반감기를 갖는다. 에스케리키아 콜라이에서의 제조는 더욱 신속하며, 더욱 경제적이다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위하여, 예를 들어, US 5,648,237호, US 5,789,199호 및 US 5,840,523호를 참조하며, 이에는 발현 및 분비를 최적화시키기 위한 번역 개시 영역(TIR) 및 신호 서열이 기재되어 있다. 발현 후에, 항체를 에스케리키아 콜라이 세포 페이스트(paste)로부터 가용성 분획에서 단리하고, 예를 들어, 그의 아이소타입에 기초하여 단백질 A 또는 G 컬럼에 의해 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어, CHO 세포에서 발현되는 항체를 정제하기 위해 사용되는 방법과 유사한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 또한 항-CD79b 항체를 인코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 흔히 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것들에는 스키조사카로마이세스 세레비지애(Schizosaccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이스세스(Kluyveromyces) 등이 포함된다.
글리코실화된 항-CD79b 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 녹투이다에(Noctuidae) Sf9 및 식물 세포, 예컨대 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 담배의 세포 배양물이 포함된다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있으며, 이는 숙주, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti), 아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터 유래된다.
유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL1651), 인간 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCCCCL10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(TM4), 원숭이 신장 세포(CV1, ATCCCCL70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCCCRL-1587), 인간 자궁경부 암 세포(HELA, ATCCCCL2), 개의 신장 세포(MDCK, ATCCCCL34), 버팔로랫트(buffalorat) 간세포(BRL3A, ATCCCRL1442), 인간 폐 세포(W138, ATCCCCL75), 인간 간세포(HepG2, HB8065), 마우스 유방 종양(MMT060562, ATCCCCL51), TRI 세포, MRC5 세포, FS4 세포 및 인간 간육종(HepG2)이 있다.
본원에 기재된 항-CD79b 항체의 생성을 위한 숙주 세포는 해당 분야에 널리 알려져 있는 배양 조건 하에서 다양한 배지 중에 배양될 수 있다.
다양한 형태의 항-CD79b 항체는 배양액으로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막에 결합된다면, 그것을 적합한 세제 용액(예를 들어, 트리톤(Triton)-X100)을 사용하여 또는 효소적 용해에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항-CD79b 항체의 발현에서 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 사이클, 초음파분해, 기계적 파괴 또는 용해제에 의해 파괴될 수 있다.
세포로부터 제조되는 항체 조성물은 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 바람직한 정제 기법은 친화성 크로마토그래피이다. 회수할 항체에 따라, 다른 단백질 정제 기법, 예컨대 이온 교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피(예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토그래픽 포커싱(focusing), SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전도 또한 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포독성제에 컨쥬게이트된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC), 및 그의 이용 및 제조 방법이 본원에 제공된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 세포독성제는 약물(예를 들어, 화학치료 약물), 성장 저해제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성동위원소(즉, 방사성컨쥬게이트)일 수 있다. 전형적으로, 면역컨쥬게이트는 세포독성제 또는 검출 가능한 작용제에 공유적으로 연결된 상기 항-CD79b 항체 중 임의의 것을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "약물"은 바람직한 생물학적 활성을 갖는 임의의 화합물을 지칭한다. 바람직한 생물학적 활성은 인간 또는 다른 동물에서 질병을 진단하는 것, 치유하는 것, 완화시키는 것, 치료하는 것, 예방하는 것을 포함한다. 따라서, 용어 "약물"은 공식 국가 약전 및 예를 들어, 미국 공식 동종요법 약전, 공식 국가 처방전 또는 그의 임의의 보충판에 의해 인식되는 화합물을 지칭한다. 전형적인 약물은 미국의사약전(physician's desk medication reference; PDR) 및 미국 식품의약국(FDA) 오렌지 북(Orange Book)에 열거되어 있다. 새로운 약물이 계속 발견되고 개발되기 때문에, 이들 약물도 또한 본원에 기재된 약물-컨쥬게이트된 전구약물에 포함되어야 한다. 바람직하게는, 약물은 그것이 본원에 기재된 바와 같이 컨쥬게이트를 제조하기 위해 사용될 수 있도록 반응성 작용기를 갖는다.
본원에 사용하기에 적합한 예시적인 약물은 암 치료용 세포독성 약물; 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 독소, 예컨대 아카시아 독소, 리신(ricin) A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소 및 디프테리아(diphtheria) 독소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 단백질은 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직-유형 플라스미노겐 성장 인자 및 생물학적 반응 조절제, 예컨대 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-6(IL-6), 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 또는 다른 성장 인자를 포함한다.
예시적인 약물은 하기의 것을 포함한다: 메이탄신(maytansine); 메이탄시노이드(maytansinoid); 아우리스타틴(auristatin) 약물(예컨대, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)); 칼리키아미신류(예컨대, 칼리키아미신); 독소루비신류(예컨대, 독소루비신); 벤조디피롤 항생제(예컨대, 두오카마이신(duocarmycin), CC-1065 등) 및 다른 사이클로프로필피롤-4-온(CPI) 유도체, 예컨대 사이클로프로필벤조인돌-4-온 유사체, 예컨대:
Figure pct00001
; 및
피롤로벤조디아제핀(PBD) 또는 PBD 이량체, 예컨대:
Figure pct00002
항체는 직접적으로 또는 링커를 통해 약물에 커플링될 수 있다. 링커는 2가지 부류로 나뉠 수 있다: 비-절단 가능한 링커 및 절단 가능한 링커. 비-절단 가능한 링커를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서, 약물 방출 메커니즘은 하기와 같다: 컨쥬게이트가 항원에 결합하고, 세포에 의해 내재화된 후에, 항체는 리소좀 내에서 가수분해되며, 소분자 약물, 링커 및 항체의 아미노산 잔기로 구성된 활성 분자가 방출된다. 약물의 분자 구조의 생성된 변화는 그의 세포독성을 감소시키지 않지만, 활성 분자가 하전되기 때문에(아미노산 잔기), 그것은 인접 세포 내로 침윤할 수 없다. 따라서, 이러한 활성 약물은 표적 항원을 발현하지 않는 인접 종양 세포(항원-음성 세포)를 사멸시킬 수 없다(방관자 효과)(문헌[Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21: 5-13]). 절단 가능한 링커는 표적 세포 내에서 절단되고, 활성 약물을 방출시킬 수 있다. 절단 가능한 링커는 2가지 주요 부류로 나뉠 수 있다: 화학적 불안정성 링커 및 효소 불안정성 링커. 화학적 불안정성 링커는 혈장과 세포질 특성의 차이로 인하여 선택적으로 절단할 수 있다. 이러한 특성은 pH, 글루타티온 농도 등을 포함한다. 산-절단 가능한 링커로 종종 지칭되는 pH-감수성 링커는 혈액의 중성 환경(pH 7.3 내지 7.5)에서 상대적으로 안정하지만, 약산성 엔도좀(pH 5.0 내지 6.5) 및 리소좀(pH 4.5 내지 5.0)에서 가수분해될 것이다. 글루타티온-감수성 링커에 있어서, 그것은 이황화물 링커로도 지칭된다. 약물 방출은 고농도(밀리몰 범위)의 세포내 글루타티온과 상대적으로 낮은 농도(마이크로몰 범위)의 혈 중 글루타티온 간의 차이에 기초한다. 이것은 특히 종양 세포에 대하여 그러하며, 낮은 산소 수준은 향상된 환원효소 활성을 초래하여, 이에 따라, 더 높은 글루타티온 농도를 초래한다. 이황화 결합은 열역학적으로 안정하며, 이에 따라 혈장에서 더 나은 안정성을 갖는다. 효소-불안정성 링커, 예컨대 펩티드 링커는 더 나은 약물 방출의 제어를 제공한다. 펩티드 링커는 리소좀 내에서 프로테아제, 예컨대 카텝신(cathepsin) B 또는 플라스민(plasmin)(일부 종양 조직에서 이러한 효소의 양의 증가)에 의해 효율적으로 절단될 수 있다. 이 펩티드 연결기는 혈장 순환에서 매우 안정한 것으로 여겨지는데, 이는 세포외 pH 및 혈청 프로테아제 저해제가 프로테아제를 일반적으로 비활성이 되게 하기 때문이다. 높은 혈장 안정성 및 우수한 세포내 절단 선택성 및 효율성을 고려하여, 효소-불안정성 링커가 항체-약물 컨쥬게이트를 위한 절단 가능한 링커로서 널리 사용된다. 전형적인 효소 불안정성 링커는 Val-Cit(vc), Phe-Lys 등을 포함한다. 자가-희생(immolative) 링커는 전형적으로 절단 가능한 링커와 활성 약물 사이에 통합되거나, 그들 자체가 절단 가능한 링커의 일부이다. 자가-희생 링커의 작용 메커니즘은 절단 가능한 링커가 적합한 조건 하에서 절단되는 경우에, 자살 링커가 구조를 자발적으로 재배열하고, 그에 연결된 활성 약물을 방출시킬 수 있는 것이다. 일반적인 자가-희생 링커는 p-아미노벤질 알콜(PAB) 및 베타-글루쿠로니드를 포함한다.
링커는 하나 이상의 링커 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 링커의 구조는 V-L일 수 있으며, V 구성원은 트리덴테이트 링커 구성원 또는 테트라말레이미드 링커 구성원에 대하여 하기 기재된 바와 같이, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며; L 구성원은 상기 기재된 바와 같은 비-절단 가능한 링커 및 절단 가능한 링커, 예컨대 산 불안정성 링커(예를 들어, 하이드라진), 프로테아제 감수성(예를 들어, 펩티다제 감수성) 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커 등일 수 있다. 예시적인 링커 구성원은 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로피오닐프롤린-시트룰린, 알라닌-페닐알라닌, p-아미노벤질옥시카보닐, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트, N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카복실레이트 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조레이트를 포함한다. 다른 예시적인 링커 구성원은 추가로 프로테아제 절단을 가능하게 함으로써, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀 효소로의 노출 후에 면역컨쥬게이트로부터 약물의 방출을 용이하게 하도록 아미노산 유닛을 포함하는 링커일 수 있다. 예시적인 아미노산 유닛은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 및 펜타펩티드를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린; 알라닌-페닐알라닌; 페닐알라닌-라이신; 또는 N-메틸-발린-시트룰린을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 및 글리신-글리신-글리신을 포함한다.
예시적인 트리덴테이트(또는 비스말레이미드 유형) 링커 구성원은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00003
예시적인 테트라말레이미드 유형 링커 구성원은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00004
Figure pct00005
적합한 링커, 약물 또는 링커-약물의 다른 예는 CN 103933575A호 및 CN 107652219 A호에서 찾을 수 있으며, 이는 CN 103933575 A호에 개시된 항체-약물 컨쥬게이트 H-1-vcMMAE, H-1-MMAF, H-3-vcMMAE, H-3-MMAF, H-4-vcMMAE, H-4-MMAF에 제시된 바와 같은 링커-약물, 및 1-vcMMAE로부터 12-vcMMAE까지 넘버링되는 CN 107652219 A호에 개시된 것들을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 두 출원 모두의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원의 항체-약물 컨쥬게이트는 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00006
상기 식에서, A는 본원에 개시된 항체이며; V-L은 링커이며; V는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 상기 기재된 바와 같은 트리덴테이트 링커 구성원 또는 테트라말레이미드 링커 구성원 중 임의의 것일 수 있으며, L은 절단 가능한 링커 또는 비-절단 가능한 링커이며, V 및 L 중 적어도 하나가 존재하며; D는 관심 세포독성제이며; n은 1 내지 4의 정수이다.
특정 구현예에서, L은 프로테아제 절단을 가능하게 하도록 이전에 기재된 바와 같은 아미노산 유닛을 포함하는 링커이다.
본원의 예시적인 항체-약물 컨쥬게이트의 예는 본 출원의 예에서 찾을 수 있으며, 이는 AS11259-ADC-001, AS11259-ADC-002, AS11259-ADC-003, AS11259-ADC-004, AS11259- ADC-005, AS11259-ADC-006, AS11259-ADC-007, AS11259-ADC-008, AS11259-ADC-010, AS11259-ADC-011 및 AS11250-ADC-0012를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 면역컨쥬게이트는 고도의 방사능 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성동위원소가 방사성컨쥬게이트된 항체의 생성을 위해 이용 가능하다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성동위원소가 포함된다. 면역컨쥬게이트가 검출을 위해 사용되는 경우, 그것은 섬광조영술 연구를 위한 방사능 원자, 예컨대 Tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화(MRI)로도 알려져 있음)를 위한 스핀 표지(spin label), 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 세슘, 망간 또는 철을 함유할 수 있다.
방사능 또는 기타 표지는 알려져 있는 방식으로 면역컨쥬게이트 내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 예를 들어, 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여, 생물학적으로 합성되거나, 또는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 표지, 예컨대 Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111은 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. Y-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다.
본원의 ADC는 하기를 포함하는 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 몇몇의 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 약물과의 반응 이전에 공유 결합을 통해 항체-링커를 형성하는, 공유 결합을 통한 항체의 친핵성 기와 2가 링커 시약의 반응; 및 (2) 공유 결합을 통해 약물-링커를 형성하기 위한 약물 모이어티의 친핵성 기와 2가 링커 시약의 반응에 이어서, 항체의 친핵성 기와의 반응.
항체, 그의 기능적 단편 또는 그의 항체-약물 컨쥬게이트는 경구, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외를 포함하는, 치료할 질환에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위하여, (단독으로 또는 다른 작용제, 예컨대 화학치료 약물 중 하나 이상과 조합하여 사용되는 경우) 본원에 기재된 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 적절한 용량은 질병의 유형, 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 유형, 질병의 중증도와 진행, 예방적 또는 치료적 목적을 위한 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 투여, 이전의 치료, 환자의 임상 병력 및 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트에 대한 반응, 그리고 주치의의 판단에 좌우될 것이다. 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 투여된다. 환자에게 투여되는 초기 후보 용량은 질병의 유형과 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)의 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트일 수 있다. 전형적인 1일 용량은 상기 기재된 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상 동안 지속되는 반복 투여에 있어서, 치료는, 질병에 따라, 질병 증상이 바람직하게 저해될 때까지 보통 계속된다. 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 수 있다. 이와 같이, 항체, 그의 기능적 단편 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 1회 이상의 용량이 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 임의의 조합)으로 환자에게 투여될 수 있다. 이들 용량은 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20회 용량, 예컨대 약 6회 용량의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들어, 주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다. 더 높은 초기 로딩 용량이 투여된 후에, 1회 이상의 더 낮은 용량으로 이어질 수 있다. 예시적인 투여 섭생법은 약 4 mg/kg의 항체의 초기 로딩 용량에 이어서 주마다 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여 섭생법도 또한 유용할 수 있다. 이 치료법의 과정은 통상적인 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
환자로의 항체 단백질의 투여에 더하여, 본 출원은 유전자 요법에 의한 항체의 투여를 고려한다. 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 이용은 예를 들어, WO 96/07321호에서 찾을 수 있다. (선택적으로 벡터에 포함된) 핵산이 환자의 세포에 유입되게 하기 위한 주요한 2가지, 즉 생체 내 및 생체 외 방법이 존재한다. 생체 내 전달에 있어서, 핵산은 전형적으로 항체가 필요한 부위에서 환자 내로 직접 주사된다. 생체 외 치료에 있어서, 환자의 세포를 수집하고, 핵산을 단리된 세포 내에 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접적으로 투여하거나, 예를 들어, 다공성 막 내로 삽입하고, 환자 내로 이식한다(예를 들어, 미국 특허 4,892,538호 및 5,283,187호 참조). 핵산을 생 세포 내에 도입하기 위한 다양한 기법이 이용 가능하다. 이들 기법은 핵산이 시험관 내 배양된 세포로 전달되는지 또는 의도된 숙주의 생체 내 세포로 전달되는지에 따라 달라진다. 시험관 내에서 핵산을 포유동물 세포 내로 전달하는데 적합한 기법은 리포좀의 이용, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 등을 포함한다. 유전자의 생체 외 운반을 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체 내 핵산 전달 기법은 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 제I형 단순 포진 바이러스 또는 아데노-연관 바이러스) 및 지질-기반 시스템(지질-매개의 유전자 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)의 이용에 의한 트랜스펙션을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 적어도 하나의 항-CD79b 항체 및/또는 적어도 하나의 그의 면역컨쥬게이트 및/또는 적어도 하나의 본원에 기재된 항-CD79b 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 하기를 포함한다: (1) 본원의 항-CD79b 항체 및/또는 그의 면역컨쥬게이트, 및 (2) 약제학적으로 허용 가능한 담체. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 하기를 포함한다: (1) 본원의 항-CD79b 항체 및/또는 그의 면역컨쥬게이트, 및 선택적으로 (2) 적어도 하나의 알려져 있는 치료적 제형, 예컨대 CD79b-매개의 질병의 치료에 사용될 수 있는 치료적 제형.
본원에 사용되는 바와 같이, 항-CD79b 항체 또는 항-CD79b 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 원하는 순도의 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트를 선택적인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 보관을 위한 수용액 또는 동결건조된 투여형으로 제조될 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 아세트산염, 트리스, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질암모늄 클로라이드; 클로르헥시딘 암모늄; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탄올 또는 벤질 알콜); 하이드로카빌 파라벤, 예컨대 메틸파라벤 또는 프로필파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 단백질, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 장성 조절제, 예컨대 트레할로스 및 염화나트륨; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트위(TWEE)®, 플루로닉스(PLURONICS)® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 생체 내 투여를 위한 약제학적 제형은 일반적으로 멸균성이다. 이것은 멸균 필터를 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원의 항-CD79b 항체를 사용하여 포유동물에서 CD79b를 발현하는 종양을 치료하거나, 그의 하나 이상의 증상을 완화시킬 수 있다. 이러한 종양은 조혈계의 암 또는 혈액-관련 암, 예컨대, 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프성 악성종양 뿐만 아니라 비장의 암 및 림프절의 암을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. CD79b를 발현하는 종양은 특히 B 세포-연관 암을 포함하며, 이의 구체적인 예는 예를 들어, 진행성, 중등 및 저-등급 림프종(B-세포 림프종, 예컨대, 예를 들면, 점막-연관 림프 조직 B-세포 림프종 및 비-호지킨 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 소림프구성 림프종, 변연대 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 호지킨 림프종 및 T-세포 림프종 포함) 및 백혈병(이차 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 예컨대, B 세포 백혈병(CD5+ B 림프구), 골수성 백혈병, 예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프성 백혈병, 예컨대, 급성 림프구성 백혈병 및 척수형성이상증 포함)을 포함한다. 암은 상기 언급된 전이성 암 중 임의의 것을 포함한다. 항체는 포유동물에서 CD79b 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포의 적어도 일부분에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 시험관 내 또는 생체 내에서 세포 상의 CD79b 폴리펩티드에 결합되는 경우, CD79b를 발현하는 종양 세포를 효율적으로 파괴하거나 이를 사멸시키거나, 이러한 종양 세포의 성장을 저해한다. 이러한 항체는 (임의의 작용제에 커플링되지 않은) 네이키드(naked) 항-CD79b 항체를 포함한다. 세포독성 또는 세포정지 특성을 갖는 네이키드 항체는 세포독성제와 추가로 협동하여, 그들이 종양 세포를 파괴하는데 더욱 효율적이게 만들 수 있다. 항-CD79b 항체는 예를 들어, 세포독성제로의 항체의 커플링에 의해 본원에 기재된 바와 같은 면역컨쥬게이트를 형성함으로써 세포독성이 되게 할 수 있다.
또한, CD79b를 발현하는 종양을 치료하고/치료하거나, 예방하고/예방하거나, 진단하기 위해 유용한 물질을 포함하는 물품이 본원에 제공된다. 물품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 종양 질환을 치료하고/치료하거나, 예방하고/예방하거나, 진단하는데 유효한 조성물을 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사 니들로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성 작용제는 본원의 항-CD79b 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 종양을 치료하고/치료하거나, 예방하고/예방하거나, 진단하기 위해 사용되는 것을 나타낸다. 표지 또는 포장 삽입물은 종양, 특히 암을 갖는 환자에게 항체 조성물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 추가로, 제조 물품은 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 그것은 또한, 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들 및 시린지를 포함하는, 상업용 및 사용자 관점에서 필요한 다른 물질을 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예컨대 CD79b를 발현하는 세포에 대한 세포독성 검정을 위해, 세포로부터 CD79b 폴리펩티드를 정제하거나 면역침전시키기 위해 사용될 수 있는 키트도 또한 제공된다. CD79b의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드(예를 들어, 세파로스 비드)에 컨쥬게이트된 항-CD79b 항체를 포함할 수 있다. 항체를 포함하는 키트는 예컨대 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서의 CD79b 폴리펩티드의 시험관 내 검출 및 정량화를 위해 제공될 수 있다. 물품과 동일하게, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본원의 항-CD79b 항체 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 함유한다. 예를 들어 희석제 및 완충제, 대조 항체가 내부에 존재하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명 및 의도된 시험관 내 또는 시험 용도를 위한 설명서를 제공할 수 있다.
실시예
본 발명은 특정 구현예와 함께 하기에 추가로 예시된다. 실시예가 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해될 것이다. 구체적인 조건을 특정하지 않는 하기의 실시예에서의 실험 방법은 보통 통상적인 조건에 따라 또는 제조업체에 의해 권고되는 조건에 따라 수행된다. 모든 반응을 질소 하에 수행하였다(수소화 반응 제외).
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 전문 및 과학 용어는 해당 분야의 숙련자에게 친숙한 것들과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 기재된 것들과 유사하거나, 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 물질은 오직 예시의 목적을 위한 것일 뿐이다.
약어
Ab 항체
ACN 아세토니트릴
ADC 항체 약물 컨쥬게이트
BOC(Boc) tert-부톡시카보닐
DCM 디클로로메탄
DIPEA 디이소프로필에틸아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
ELISA 효소-연결 면역흡착 검정
EtOAc 에틸 아세테이트
Eq(eq) 당량
g 그램
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트
HOSu N-하이드록시숙신이미드
HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
LC-MS 액체 크로마토그래피-질량 분광법
mAb 모노클로널 항체
min 분
mL mL
MS 질량 분광법
nm 나노미터
μL 마이크로리터
PE 석유 에테르
rt 실온
Rt 머무름 시간
SDS-PAGE 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
SEC 크기 배제 크로마토그래피
TEA 트리에틸아민
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
달리 언급되지 않는 한, 모든 무수 시약을 공급업체로부터 직접 구입하고, 질소 하에 보관하였다. 구입한 모든 다른 시약 및 용매는 고순도의 것이었으며, 사용 전에 추가로 정제하지 않았다.
핵 자기 공명 스펙트럼을 브루커(Bruker) 어밴스(Avance) III 500 M NMR 분광광도계 상에서 획득하였다. 화학적 이동(δ) 단위는 ppm이며, 테트라메틸실란은 기준계로서 사용된다(화학적 이동이 0이다).
액체 크로마토그래피-질량 분광 방법에서, 저해상도 질량 분광법 데이터를 HP 아질런트(Agilent) 1200 고성능 액체 크로마토그래피와 인터페이스로 접속된 아질런트 6110(산 방법) 또는 6120B(염기 방법) 질량 분광계 상에서 획득하였다.
방법 1: 산성 고성능 액체 크로마토그래피를 2.0 mL/분의 유량과 함께, 1.4분 내에 A 상(수성 상, 0.01% TFA 함유) 중 5% 내지 95% B 상(아세토니트릴, 0.01% TFA 함유)의 용리 기울기를 사용하여, 워터스(Waters) 선파이어(Sunfire) C18 역상 컬럼(4.60x50 mm, 3.5 μm) 상에서 수행하였으며, 컬럼 온도는 50℃이다;
방법 2: 산성 고성능 액체 크로마토그래피를 포로쉘(Poroshell) 120 EC-C18 역상 컬럼(4.60x30 mm, 2.7 μm) 상에서 수행하였다. 용리 기울기는 1.5 mL/분의 유량과 함께, 2분 내에 A 상(수성상, 0.01% TFA 함유) 중 5% 내지 95% B 상(아세토니트릴, 0.01% TFA 함유)이었으며, 컬럼 온도는 50℃이다;
방법 3: 염기성 고성능 액체 크로마토그래피를 2.0 mL/분의 유량과 함께, 1.5분 내에 A 상(수성 상, 10 mM 중탄산암모늄 함유) 중 5% 내지 95% B 상(아세토니트릴)의 용리 기울기를 사용하여, 워터스 엑스브리지(Xbridge) C18 역상 컬럼(4.60x50 mm, 3.5 μm) 상에서 수행하였으며, 컬럼 온도는 40℃이다.
제조를 워터스 선파이어 C18 역상 컬럼(250x19 mm, 10 μm)을 사용하여 길슨(Gilson) 기기 상에서 역상-고성능 액체 크로마토그래피(prep-RP-HPLC)에 의해 수행하였다.
방법 4: 산성 방법에 의해 제조. 이동상: A: 0.1% TFA를 함유하는 수성 상; B: ACN. 유량: 20 mL/분.
방법 5: 염기성 방법에 의한 제조. 이동상: A: 10 mM 중탄산암모늄을 함유하는 수성 상; B: ACN. 유량: 20 mL/분.
실시예에 언급된 상업적으로 이용 가능한 시약은 달리 언급되지 않는 한 제조업체의 설명에 따라 사용하였다.
1. 항원-항체 결합 검정(ELISA)
본 실시예에서, CD79b 항원에 대한 항-CD79b 항체(마우스 혈청, 하이브리도마 상청액 또는 재조합에 의해 발현되는 모노클로널 항체 등 포함)의 친화성을 효소-연결된 면역흡착 검정에 의해 시험하였다.
실험 절차는 하기와 같았다: 96-웰 플레이트(코닝(Corning), CAT #9018)를 PBS(10 mM 인산염, 138 mM NaCl, pH 7.2) 중 1 μg/mL의 항원(인간 CD79b-ECD, 노보프로테인(novoprotein), CA29) 100 μL/웰로 4℃에서 하룻밤 코팅한 다음, 25℃에서 1 내지 3시간 동안 250 ul/웰의 블로킹 용액(PBS + 1%BSA(산곤(Sangon), CAT #A0332))으로 블록킹하였다. 플레이트를 세척 용액(PBS + 0.05% 트윈(Tween)-20(산곤, CAT #TB0560))으로 3회 세척한 다음, 25℃에서 2시간 동안 2벌의 웰에서 블로킹 용액 중 단계 희석액의 100 μL의 항-CD79b 항체와 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 25℃에서 1시간 동안 1:10,000 이차 항체(항-마우스 IgG(Fc)-HRP, 시그마(Sigma), CAT#A00168 또는 항-인간 IgG F(ab')2-HRP, 시그마, CAT#A0293) 100 μL와 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 100 μL의 TMB(산곤, CAT #TB0954)를 각각의 웰에 첨가하고, 색이 발색될 때까지(대략 15분), 25℃에서 인큐베이션시켰다. 100 μl/웰의 정지 용액(1N H2SO4)의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다. OD450/630 nm를 10분 내에 플레이트 판독기에서 판독하였다.
2. 세포 표면 CD79b로의 항체의 결합에 대한 FACS 검출
본 실시예에서, 유세포분석(FACS)을 사용하여 시험관 내에서 암 세포의 표면 상의 고유 CD79b 세포외 도메인에 결합하는 항-CD79b 항체(마우스 혈청, 하이브리도마 항체 등 포함)의 능력을 검출하였다.
CD79b를 양성으로 또는 음성으로 발현하는 암 세포 비드를 DSMZ 또는 ATCC로부터 구입하였으며, 세포 표면 CD79b를 세포막 표면 수용체 정량화 키트 퀴피키트(QIFIKIT)(다코(DAKO), K0078)를 사용하여 정량화하였다. 결과는 하기와 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
면역화된 마우스 및 하이브리도마 상청액의 검출 및 스크리닝을 SU-DHL-4 세포주를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 대수적 성장기의 SU-DHL-4 세포를 수집하고, PBS로 세척한 다음, 튜브당 약 100,000개 세포로, 1.5 ml EP 튜브 내로 분배하였다. 희석된 마우스 혈청 또는 하이브리도마 상청액을 100 μl/튜브로 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS-2% BSA로 2회 세척한 후에, PBS-2% BSA 1:400(몰레큘라 프로브즈(Molecular probes), Cat#A11001) 중에 제형화된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-마우스 IgG(H+L)를 100 μl/튜브로 첨가한 다음, 용액을 4℃에서 암 중에 45분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS-2% BSA로 2회 세척한 다음, 500 μl의 PBS-2% BSA 중에 재현탁화시키고, 유세포분석법 구아바(Guava)(밀리포어(Millipore), 8HT) 상에서 분석하였다. 세포 표면 CD79b 수용체에 대한 항체의 결합 세기를 형광 세기(MFI 값)에 기초하여 결정하였다.
3. 약물 컨쥬게이트의 제조
항-CD79b 항체의 효능을 입증하기 위하여, 항체를 상이한 링커를 사용하여 상이한 소분자 약물과 컨쥬게이트시켜, 약물 컨쥬게이트를 제조하였으며, 구체적인 커플링 방법은 하기와 같다:
트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, 10 당량, 10 mM의 원액)를 항체 용액(20 mM 인산이수소나트륨-인산수소이나트륨 완충제, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2)에 첨가하였다. 반응 용액을 37℃ 써모스탯(thermostat) 수조에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 용액을 대략 실온까지 냉각시키고, 한외여과(밀리포어(Millipore) 아미콘(Amicon)® 울트라(Ultra), 50000 MWCO) 또는 겔 여과에 의해 완충제(100 mM 인산이수소 포타슘-인산수소 다이포타슘, 100 mM 염화나트륨, 1 mM 에틸렌 트리아민 펜타아세트산, pH 7.0 내지 8.0) 또는 완충제(20 mM 시트르산-시트르산삼나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산, pH 6.0)로 대체하였다. 디메틸 술폭시드 및 상응하는 링커-약물 화합물(디메틸 술폭시드 원액, 항체에 비하여 3 내지 10 당량)을 첨가하고, 반응 용액 중 디메틸 술폭시드의 부피가 약 10 내지 15%인 것을 보장하였다. 커플링 반응을 10℃에서 0.5시간 동안 수행하였다.
과량의 시스테인 용액을 반응 용액에 첨가하여, 미반응된 링커-약물 화합물을 켄칭하고, 켄칭 반응을 10℃에서 30분 동안 수행하였다. 반응 용액을 먼저 한외여과(밀리포어 아미콘® 울트라, 50000 MWCO) 또는 겔 여과로 처리하여, 링커-약물 시스테인 부가물 및 과잉의 시스테인을 제거한 다음, 시료를 보관 완충제(20 mM 인산이수소나트륨-인산수소이나트륨 완충제, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2) 내로 완충제-교환하였으며, 이를 추가로 0.22 μm 포어 크기 필터 디바이스(밀렉스(Millex)-GV 필터)를 통해 멸균시켜, 항-CD79b-ADC를 제공하고, 4℃에 보관하였다.
약물 컨쥬게이트를 위한 상기 방법에 의해 제조되는 항체는 본원에 언급된 다른 대조 항체를 포함하여, 랫트 항-마우스 HB58 항체(ATCC® HB-58TM), 항-CD79b 인간-마우스 키메라 항체 및 인간화 이후의 상이한 변이체를 포함한다.
4. 림프종 세포 BJAB에 대한 하이브리도마 상청액의 증식 저해 효과의 검출을 위한 이차 ADC 검정
소량이거나 정제하기 어려운 항체에 있어서, 링커 및 소분자 독소와의 커플링 실험을 완료하기 위하여 충분한 양이 존재하지 않는다. 이를 위하여, 항체를 먼저 링커 및 독소의 소분자에 컨쥬게이트된 항체에 결합시킨 다음, 암 세포와 동시-인큐베이션시키고, 그에 결합된 항체 약물 컨쥬게이트를 세포 내로 운반하여 표적 항체의 세포내이입에 의해 암 세포를 사멸시킨다. 이러한 간접적으로 반응성인 항체의 세포내이입 특성 및 암 세포에 대한 증식 저해 효과는 이차 ADC 실험으로 지칭된다.
이차 ADC 실험을 수행하기 위하여, HB58 세포주(ATCC® HB-58TM)를 ATCC로부터 구입하였다. 세포주는 랫트 B 세포를 P3X63Ag8.653 골수종 세포와 융합시킴으로써 수득되는 하이브리도마 세포였다. 분비된 항체는 뮤린 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 충분한 HB58 항체를 HB58 세포주 배양 배지의 정제에 의해 수득하였다. 항체 약물 컨쥬게이트 HB58-ADC를 제조하였다.
인간 림프종 세포 BJAB를 1×105개의 세포/100 ul/웰로 96-웰 세포 배양 플레이트(비디 팔콘(BD falcon), Cat# 353072) 내로 접종하였으며, 배지는 ATCC-변형된 RPMI1640 배지(집코(Gibco), Cat#A10491) + 10% 우태아혈청(FBS)(집코, Cat# 10099141)이었다. 37℃ 인큐베이터(산요(SANYO), MC0018AIC)에서 1일 인큐베이션시키고, HB58-ADC와 1:1 농도 비로 사전혼합시킨 항-CD79b 항체 및 관련 대조군을 함유하는 하이브리도마 상청액을 3배 희석, 기울기 농도를 갖는 총 9개의 웰 + 1개의 대조군 웰을 사용하여 다음날 100 ul/웰로 첨가하였다. 인큐베이션을 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 수행하였다. 제5일에, 세포 계수(Cell Counting) 키트-8(DOJINDO, CK04)을 색을 발색시키기 위하여 사용하였다. 세포 증식을 키트 설명에 따라 측정하였다. 450/630 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(BioTek Synergy MX)를 사용하여 판독하여, IC50 및 저해율을 계산하였다.
5. 항체 친화성의 결정을 위한 표면 플라스몬 공명 방법
본 실시예에서, 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 시험관 내에서 재조합 CD79b 세포외 도메인 단백질에 대한 항-CD79b 항체(인간-마우스 키메라 항체 및 인간화된 항체 등 포함)의 결합 능력을 검출하였다.
검정을 비아코어(Biacore) T200(GE) 장치 상에서 수행하였으며, 시험할 항체를 아민-커플링 키트(GE, BR-1000-50)의 설명서에 따라 HBS-EP(GE, BR100826) 완충제를 사용하여 10 ug/ml로 희석하였다. 시험할 항체를 300초의 고정 시간 및 10 ul/분의 유량으로 CM5 칩(GE, BR-1006-68) 상에 고정시켰다. HBS 완충제 기울기로 희석시킨 상이한 농도(0.25 nm, 0.5 nm, 1 nm, 2 nm, 4 nm, 8(×2) nm, 16 nm)의 재조합 CD79b 세포외 도메인 단백질을 300초로 설정된 항원-항체의 결합 시간, 900초로 설정된 해리 시간, 30 ul/분의 항원 단백질의 유량을 사용하는 동역학(Kinetics) 프로그램에 의해 포획 반응으로 처리하였다. 해리 곡선을 핏팅시켜, 상이한 항체의 KD 값을 계산하였다. 상기 실험을 모두 25℃에서 수행하였다.
실시예 1: 인간 CD79b에 대한 마우스 모노클로널 항체 세포주의 생성 및 스크리닝
마우스-유래의 항-인간 CD79b 모노클로널 세포주를 마우스 면역화, 비장 세포 융합 및 하이브리도마 스크리닝 방법에 의해 수득하였으며, 이를 난징 진수이 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드(Nanjing Jinsui Biotechnology Co., Ltd)에 위임하여 완료하였다. 면역화를 위해 사용되는 항원은 재조합 인간 CD79b 세포외 도메인 단백질(재조합 인간 CD79B의 제품 명칭 하에 상하이 노보프로테인, 리미티드(Shanghai Novoprotein, Ltd.), lot# CA29, SEQ ID NO: 35로서 나타낸 아미노산 서열)이었으며, 4가지의 마우스 종(각각 Balb/C, C3H, SJL, C57BL/6)을 선택하여, 각각의 종의 6마리의 마우스를 면역화시켰다. 면역학적 애쥬번트는 관례적인 프레운트 애쥬번트(Freund's adjuvant)이며, 일차 면역화의 용량은 마우스당 50 ug의 항원이다. 면역화를 25 ug으로 감소시킨 용량을 사용하여 2주의 간격으로 부스팅하였다. 제1 부스터 면역화로부터, 마우스의 혈청을 각각의 부스터 면역화 이후 7일에 수집하였다. 역가를 ELISA에 의해 결정하였다(방법에 대하여 "재료 및 방법"의 1번 참조). FACS 검출을 제2 부스터 면역화 7일 후에 수집된 마우스의 혈청 상에서 수행하여("재료 및 방법" 섹션의 2번 참조), 그것이 CD79b의 양성 발현을 보였던 SU-DHL4 세포주의 표면 상의 CD79b에 결합할 수 있는 지를 알아보았다. 각각의 마우스의 결합 역가를 동시에 결정하였다.
2회의 부스터 면역화 후에, ELISA 및 FACS의 결과에 따라, 가장 높은 역가를 갖는 마우스를 (전기융합에 의한) 세포 융합을 위해 선택하였으며, 융합 효율은 하나의 하이브리도마 세포 내로 융합되는 약 3,000개의 비장 B 세포였다. 모든 융합된 세포를 96-웰 플레이트 내로 플레이팅하였으며, 융합마다 40개의 플레이트를 사용하였다. ELISA 검정을 1주 이후에 수행하였다(방법에 대하여 재료 및 방법 섹션의 1번 참조). ELISA 검정에서 양성 클론의 상청액을 FACS 검출을 위해 수집하였다(방법에 대하여 재료 및 방법 섹션의 2번 참조). FACS 검출에서 양성인 모든 클론을 서브클로닝하였다. 1회의 서브클로닝 후에 단일클론을 갖는 웰 내의 상청액을 이차 ADC 검출을 위해 수집하였다(재료 및 방법 섹션의 3번 참조). 이차 ADC 검정에서 CD79b의 양성 발현을 보였던 BJAB 암 세포의 증식을 저해할 수 있었던 클론을 안정한 모노클로널 세포주가 형성할 때까지 연속 서브클로닝으로 처리하였다.
본 실시예에서, 3가지 유효한 융합이 수행되었다. 총 31개의 FACS 양성 클론을 스크리닝 후에 수득하였다. 마지막으로, 최적의 증식 저해 효과(하기 표 1 참조)를 갖는 18개의 균주를 완전한 서브클로닝을 위해 선택하였다.
[표 1]
Figure pct00009
실시예 2: 항-CD79b 하이브리도마 항체의 시퀀싱 및 재조합 키메라 항체의 구축
하이브리도마 시퀀싱을 실시예 1의 표 1에 열거된 18개의 모노클로널 세포주에 대하여 행한 다음, 인간 IgG1의 불변 영역을 갖는 키메라 항체를 재조합에 의해 발현하고, 그들의 활성에 대하여 시험하였다. 본 실시예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자를 역전사 PCR에 의해 증폭시키고, 벡터 내로 라이게이션시키고, 모노클로널 항체 경쇄 및 중쇄 서열을 시퀀싱하였다. 구체적으로, 각각의 모노클로널 세포 균주의 전체 RNA를 먼저 RNA 정제 키트(퀴아젠(Qiagen), Cat#74104)를 사용하여 추출하였다. 이어서, cDNA 단일 가닥, 올리고-dT 프라이머 cDNA를 cDNA 합성 키트(인비트로겐, 카탈로그 번호 18080-051)를 사용하여 역전사시켰다. 이를 주형으로서 사용하여, 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 PCR에 의해 합성하였으며, PCR 생성물을 TA 벡터 pMD-18T 내로 클로닝한 다음, 시퀀싱하였다.
중쇄 및 경쇄의 CDR 영역의 서열을 분석함으로써, 가능한 번역후 변형을 위한 부위를 갖는 항체를 배제하였다. 마지막으로, 6개의 클론(35B5, 78B6, 85G11, 88B12, 104A2 및 104E1)을 항체의 재조합 발현을 위해 선택하였다. 먼저, 항체의 경쇄 및 중쇄 서열을 전체 유전자 합성을 위하여 코돈-최적화시켰다. HindIII/NheI 제한 부위를 중쇄의 양 말단에 부가하였으며, HindIII/BsiWI 제한 부위를 경쇄의 양 말단에 부가하였다. 중/경쇄 가변 영역 유전자를 이들 2개의 제한 부위의 쌍을 통해 인간 IgG1 불변 영역 서열 또는 K-쇄 불변 영역 서열을 함유하는 발현 벡터 PTT5로 라이게이션시켜, 키메라 항체를 위한 발현 벡터를 구축하였다. 재조합 항체를 293F 세포에서의 일시적인 발현에 의해 발현시켰다.
실시예 3: 항-CD79b 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독성 분석
6개의 재조합 키메라 항체(35B5, 78B6, 85G11, 88B12, 104A2 및 104E1)를 BMP-vcMMAE(링커-약물 1)에 개별적으로 컨쥬게이트시켜, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제조하였다. 증식 저해 검정을 7개의 CD79b 양성 발현 림프종 세포주 BJAB, Ramos, DoHH2, SU-DHL-4, U-698-M, Granta-519, WSU-DLCL2, 및 2개의 CD79b 음성 발현 림프종 세포주 Raji 및 Jurkat 상에서 수행하였다. 암 세포의 배양 조건은 모두 동일하였다(재료 및 방법 섹션의 섹션 3 참조). 상이한 암 세포주에 대한 세포 플레이팅 밀도 및 ADC의 초기 농도는 하기 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
Figure pct00010
다양한 암 세포주에 대한 6개의 ADC의 증식 저해 효과의 결과는 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure pct00011
실시예 4: 항-CD79b 항체의 인간화
104E1에 의해 발현되는 재조합 키메라 항체의 약물 컨쥬게이트는 상대적으로 낮은 CD79b 발현 수준을 갖는 림프종 세포 Granta-519 및 WSU-DLCL2의 증식을 저해할 수 있으며, 다른 5가지의 항체보다 유의미하게 더 낫다. 따라서, 104E1을 인간화를 위해 선택하였다.
항체 104E1의 서열 정보(카바트(Kabat) 시스템에 기초함)는 하기와 같다:
HCDR1:
Figure pct00012
HCDR2:
Figure pct00013
HCDR3:
Figure pct00014
LCDR1:
Figure pct00015
LCDR2:
Figure pct00016
LCDR3:
Figure pct00017
mVH:
Figure pct00018
mVL:
Figure pct00019
104E1의 서열을 인간화시키기 위하여 난징 진스크립트 바이오테크 코포레이션(Nanjing GenScript Biotech Corp.)에게 위임하였다. 구체적인 절차는 하기와 같다: 뮤린 항-CD79b 모노클로널 항체 104E1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 인간 생식계열 서열 데이터베이스에서 비교하였으며, 104E1 중쇄 가변 영역에 대하여 64.3%의 상동성으로 가장 높은 상동성을 갖는 인간 생식계열 서열 IGHV1-69*02를 찾았다. 또한, 104E1 경쇄 가변 영역에 대하여 79.0%의 상동성으로, 가장 높은 상동성을 갖는 인간 생식계열 서열 IGKV2-30*02를 찾았다. 다음으로, 이들 2개의 생식계열 서열로부터 생성된 항체 AGC78785.1(중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 9) 및 BAC01734.1(경쇄 가변 영역, SEQ ID NO:10)을 인간 항체 라이브러리에서 찾았으며, 이의 서열 정보는 하기와 같다:
AGC78785.1 면역글로불린 중쇄 가변 영역[호모 사피엔스(Homo sapiens)]
Figure pct00020
BAC01734.1 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역[호모 사피엔스]
Figure pct00021
이들 2개의 인간-유래 항체의 FR 영역을 프레임워크로서 사용하여, CDR 영역 서열을 뮤린 104E1의 상응하는 CDR 영역 서열로 교체하여, CDR-그라프팅된 인간화된 항체를 생성하였으며, 서열은 하기와 같았다:
HCDR-그라프팅된 VH:
Figure pct00022
LCDR-그라프팅된 VL:
Figure pct00023
항체 친화성에서 중요한 역할을 수행하는 뮤린 FR 영역 내의 아미노산 부위를 찾기 위하여, 뮤린 104E1 항체에 대하여 유사한 상동성을 갖는 결정 구조를 PDB 데이터베이스에서 검색하였다. 결과적으로, 항-폴리시알릭 항체 Ab735의 scFV 결정 구조가 104E1 항체 서열과 77%의 상동성을 가지며, 충분히 높은 분해능을 갖는 것으로 관찰되었다. 구조적 주형으로서 이 결정을 사용하여, 2개의 서열을 정렬하여 104E1 항체의 3WBD scFv의 상동성 모델을 확립하였다. 이 상동성 모델에 따라, 104E1 서열의 FR 도메인에서 CDR 도메인에 의해 둘러싸이거나, CDR 도메인에 대하여 5Å 이내인 아미노산 부위를 확인하였다. 이어서, 항체 친화성에서 중요한 역할을 수행할 수 있는 이들 부위를 글리코실화, 탈아미드화 및 산화 부위 등을 회피하면서, CDR-그라프팅된 서열(SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12)에서 역-돌연변이시킨다. A24T, RV67KA, S84R, T98K, K12A, S16A, V20L, A24T, R38K, M48I, V68A, I70L, Y95F, T98K 및 V113L을 포함하는, 중쇄 가변 영역에서 역 돌연변이될 필요가 있을 수 있는 총 15개의 부위가 발견되었으며, V3L, F41Y, RR50KL, FQ41YL, R51L, V88L 및 V109L을 포함하는, 경쇄 가변 영역에서 역-돌연변이될 필요가 있을 수 있는 총 7개의 부위가 발견되었다. 이어서, Fab 라이브러리를 진스크립트의 표준 프로토콜에 따라 구축하고, 파지 디스플레이 플랫폼에 의해 스크리닝하였다. 뮤린 104E1 항체 이상의 친화성을 갖는 인간화 이후의 서열을 스크리닝하고, 서열 확인을 위하여 시퀀싱하였다.
인간화 이후의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 하기와 같다:
1. 중쇄 가변 영역
AS11161:
Figure pct00024
AS11164:
Figure pct00025
AS11252:
Figure pct00026
AS11254:
Figure pct00027
AS11259:
Figure pct00028
2. 경쇄 가변 영역
AS11161:
Figure pct00029
AS11164:
Figure pct00030
AS11252:
Figure pct00031
AS11254:
Figure pct00032
AS11259:
Figure pct00033
인간화 이후의 경쇄 중쇄 및 IgG1 Fc 세그먼트를 재조합하여, 본원에 기재된 인간화된 항-CD79b 모노클로널 항체를 수득하였다. 사용되는 Fc 서열은 하기와 같다:
중쇄 불변 영역:
Figure pct00034
경쇄 불변 영역:
Figure pct00035
상기 항체를 유전자 클로닝 및 재조합 발현 방법에 의해 클로닝하고, 발현시키고, 정제하였으며, 항체의 친화성을 비아코어(진스크립트에 의해 완료)에 의해 결정하였다. 마지막으로, 최적의 활성을 갖는 인간화된 항체 AS11161, AS11164, AS11252, AS11254 및 AS11259를 선택하였다. 서열은 하기와 같다:
인간화된 항체 AS11161
중쇄
Figure pct00036
경쇄
Figure pct00037
인간화된 항체 AS11164
중쇄
Figure pct00038
경쇄
Figure pct00039
인간화된 항체 AS11252
중쇄
Figure pct00040
경쇄
Figure pct00041
인간화된 항체 AS11254
중쇄
Figure pct00042
경쇄
Figure pct00043
인간화된 항체 AS11259
중쇄
Figure pct00044
경쇄
Figure pct00045
인간화 이후의 항체의 친화성을 "재료 및 방법" 섹션의 섹션 4에 기재된 방법에 의해 시험하였다. 결과는 하기 표 4 및 도 1에 나타나 있다.
[표 4]
Figure pct00046
결과는 시험관 내에서 CD79b 항원으로의 본 개시내용의 인간화된 항체의 결합 KD 값이 인간-마우스 키메라 항체와 유사한 약 0.02 nM이었으며(비아코어 검정에 의해 측정, 진스크립트), 인간화가 항체 친화성의 큰 변화를 야기하지 않았음을 보여주었다.
실시예 5: 인간 CD79b 세포외 도메인에 대한 항-CD79b 인간화된 항체의 시험관 내 결합 활성, 및 림프종 세포의 증식에 대한 그의 약물 컨쥬게이트의 저해 효과에 대한 검정
인간 CD79b의 세포외 도메인에 대한 항-CD79b 인간화된 항체의 시험관 내 결합 활성을 재료 및 방법 섹션의 섹션 1에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 시험하였다. 결과는 표 5에 나타나 있다.
[표 5]
Figure pct00047
인간화된 항체의 항체 약물 컨쥬게이트를 제조하였으며, 시험관 내에서 림프종 암 세포에 대한 상응하는 증식 저해 효과(방법에 대하여 실시예 3 참조)는 표 6에 나타나 있다.
[표 6]
Figure pct00048
실시예 6: 항-CD79b 인간화된 항체의 생물-물리학적 안정성 연구
항체의 안정성을 평가하기 위하여, 5개의 인간화된 항체를 최대 26일 동안 40℃에서 4.5, 6.0 또는 7.4의 pH를 갖는 상이한 완충제에 보관하였다. 시료의 특성을 상기 스트레스 상태에서 1, 6, 12 및 26일의 보관 후에 분석하였으며, 대조군으로서 시료를 4℃에 배치하였다. 분취액을 ELISA 및 SEC-HPLC에 의해 분석한다(TOSOH, TSKgel, G3000SWXL).
결과는 3가지 상이한 pH 조건 하에 40℃에서 26일 동안 배치된 5가지 인간화된 항체가 ELISA에 의해 결정되는 활성에서 유의미한 차이를 갖지 않았음을 보여주었다. 순도 수준은 SEC 검정에서 모두 98% 초과였다. 유의미한 응집물이 관찰되지 않았다.
실시예 7: 마우스 내의 림프종 종양에 대한 항-CD79b 인간화된 항체-약물 컨쥬게이트의 생체 내 효능 평가
항-CD79b 인간화된 항체의 효능을 입증하기 위하여, 변이체 AS11259를 선택하였으며, 약물 컨쥬게이트 AS11259-ADC를 재료 및 방법 3에 기재된 방법에 따라 제조한 다음, Ramos, DoHH2, Granta519 및 WSU-DLCL2를 포함하는 다중 이종이식편 모델에서 종양을 퇴행시키는 ADC의 능력을 시험하였다.
링커-약물 합성
링커-약물 1의 합성:
Figure pct00049
링커-약물 1을 WO 2014114207호에 기재된 바와 같이 제조하였다.
링커-약물 2의 합성:
Figure pct00050
링커-약물 2를 WO 2014114207호에 기재된 바와 같이 제조하였다.
링커-약물 3의 합성:
Figure pct00051
합성식:
Figure pct00052
N-tert-부톡시카보닐에틸렌디아민(710 mg, 4.43 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(1.55 mL, 8.86 mmol)을 디클로로메탄(10 mL) 중에 용해시킨 다음, 클로로아세틸 클로라이드(500 mg, 4.43 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 염화메틸렌으로 희석하고, 포화 수성 염화암모늄, 포화 수성 탄산수소암모늄, 물 및 포화 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜, 미정제 화합물 11을 백색 고체로서 수득하였다.
생성된 미정제물 11을 아세톤(10 mL) 중에 용해시킨 다음, 요오드화나트륨(3.32 g, 22.2 mmol)을 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 16시간 동안 교반한 다음, 디클로로메탄으로 희석하고, 물 및 포화 염수로 세척하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 수득되는 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 1:1)로 정제하여, 화합물 12(400 mg)를 백색 고체로서 수득하였다. (LC-MS(방법 1): 머무름 시간 1.61분; [M+Na]+ 351.0.
화합물 DM1(40 mg, 0.054 mmol) 및 화합물 12(35.4 mg, 0.108 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(2 mL) 중에 용해시킨 다음, 디이소프로필에틸아민(29 μL, 0.163 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 4: 8분 내에 50% 내지 80% B로부터 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 화합물 13(40 mg)을 백색 고체로서 제공하였다.
화합물 13(40 mg, 0.043 mmol)을 디클로로메탄(3 mL) 중에 용해시킨 다음, 트리플루오로아세트산(97 mg, 0.852 mmol)을 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물 및 화합물 14(18.7 mg, 0.0639 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(2 mL) 중에 용해시킨 다음, HATU(32.4 mg, 0.0852 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(74 μL, 0.426 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 2시간 동안 실온에서 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 4: 8분 내에 50% 내지 80% B로부터 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 링커-약물 3(8.3 mg)을 백색 고체로서 제공하였다. LCMS (A018): 머무름 시간 1.92분, [M+Na]+ 1134.3.
링커-약물 4의 합성
Figure pct00053
합성식:
Figure pct00054
화합물 15(0.25 g, 0.305 mmol, WO2014114207호에 기재된 바와 같이 제조), 화합물 16(0.20 g, 0.208 mmol, WO2016192527호에 기재된 바와 같이 제조) 및 HOBt(28.1 mg, 0.208 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 중에 용해시킨 다음, 피리딘(1 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 5: 8분 내에 50% 내지 80% B에 이어서, 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 링커-약물 4(45 mg)를 연분홍색 고체로서 제공하였다. LCMS(방법 3): 머무름 시간 2.127분, 1/2 [M+2H]2+ 822.0.
링커-약물 5의 합성
Figure pct00055
합성식:
Figure pct00056
화합물 15(14 mg, 0.017 mmol), 화합물 17(14 mg, 0.014 mmol, WO2016192527호에 기재된 바와 같이 제조) 및 HOBt(3 mg, 0.017 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(2 mL) 중에 용해시킨 다음, 피리딘(0.5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 5: 8분 내에 45% 내지 75% B에 이어서, 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 링커-약물 5(1.8 mg)를 적색 고체로서 제공하였다. LCMS(방법 2): 머무름 시간 1.40분, 1/2 [M+2H]2+ 843.9.
링커-약물 6의 합성
Figure pct00057
합성식:
Figure pct00058
화합물 15(14 mg, 0.017 mmol), 화합물 18(14 mg, 0.013 mmol, WO2016192527호에 기재된 바와 같이 제조) 및 HOBt(3 mg, 0.017 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(2 mL) 중에 용해시킨 다음, 피리딘(0.5 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 5: 8분 내에 45% 내지 75% B에 이어서, 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 링커-약물 6(2.0 mg)을 적색 고체로서 제공하였다. LCMS(방법 2): 머무름 시간 1.40분, 1/2 [M+2H]2+ 865.3.
링커-약물 7의 합성
Figure pct00059
합성식:
Figure pct00060
화합물 15(10 mg, 0.012 mmol) 및 화합물 19(8 mg, 0.024 mmol, WO2013/149948A1호에 기재된 바와 같이 제조)를 N,N-디메틸포름아미드(1 mL) 및 피리딘(0.2 mL)의 혼합물 중에 용해시킨 다음, HOBt(3.2 mg, 0.024 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 4: 8분 내에 60% 내지 90% B에 이어서, 4분 내에 95% B)를 사용하여 정제하여, 화합물 20(6.0 mg)을 백색 고체로서 제공하였다. LC-MS(방법 3): 머무름 시간 2.24분, [M+Na]+ 1028.3.
화합물 20(6.0 mg, 0.006 mmol)을 디클로로메탄(1 mL) 중에 용해시킨 다음, 디클로로아세트산(15 mg, 0.12 mmol)을 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 농축시켜, 용매를 제거하였다. 잔류물을 n-헥산/에테르(1 ml/ml)로 세척하고, 여과하고, 건조시켜, 화합물 21(4.5 mg)을 백색 고체로서 제공하였다. LC-MS(방법 3): 머무름 시간 1.57분, [M+H] + 768.3.
화합물 21(4.5 mg, 0.005 mmol) 및 화합물 22(5 mg, 0.008 mmol, US8389697 B2호에 기재된 바와 같이 제조)를 N,N-디메틸포름아미드(1 mL) 중에 용해시킨 다음, 디이소프로필에틸아민(2.6 mL, 0.02 mmol) 및 HATU(3.8 mg, 0.01 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 분취용 고성능 크로마토그래피(방법 5: 8분 내에 50% 내지 80% B에 이어서, 4분 내에 95% B)를 사용하여 정제하여, 링커-약물 7(0.9 mg)을 적색 고체로서 제공하였다. LCMS(방법 3): 머무름 시간 2.05분, [M+H]+ 1378.3.
링커-약물 8의 합성
Figure pct00061
합성식:
Figure pct00062
화합물 15(100 mg, 0.122 mmol), 화합물 23(60 mg, 0.071 mmol, WO2016192527호에 기재된 바와 같이 제조) 및 HOBt(10 mg, 0.071 mmol)를 무수 DMF(2 mL) 중에 용해시킨 다음, 피리딘(0.5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 분취용 고순도 액체 크로마토그래피(방법 5: 8분 내에 50% 내지 80% B에 이어서, 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 화합물 24(30 mg)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS(방법 3): 머무름 시간 2.41분, 1/2 [M+2H]2+ 762.0.
화합물 24(30 mg, 0.0197 mmol)를 디클로로메탄(1.5 mL) 중에 용해시킨 다음, 트리플루오로아세트산(0.5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 농축시켜, 용매를 제거하였다. 잔류물을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 X)에 의해 정제하여, 화합물 25(15 mg)를 백색 분말상 고체로서 제공하였다.
화합물 25(15 mg, 0.0197 mmol) 및 화합물 26(7 mg, 0.0189 mmol, 문헌[Journal of Organic Chemistry, 2001, 66, 4494-4503]에 기재된 바와 같이 제조)을 무수 DMF(0.4 mL) 중에 용해시킨 다음, HATU(7.2 mg, 0.0189 mmol) 및 DIPEA(3.7 mg, 0.0286 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 5: 8분 내에 50% 내지 80% B에 이어서, 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 링커-약물 8(4.8 mg)을 백색 분말상 고체로서 수득하였다. LCMS(방법 2): 머무름 시간 1.37분, 1/2 [M+2H]2+ 909.5.
링커-약물 9의 합성
Figure pct00063
합성식:
Figure pct00064
화합물 27(165 mg, 0.132 mmol, WO2007011968호에 기재된 바와 같이 제조) 및 화합물 28(90 mg, 0.231 mmol, WO 2014114207호에 기재된 바와 같이 제조)을 DMF(2 mL) 중에 용해시킨 다음, DIPEA(51 mg, 0.395 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반한 다음, 빙초산(50 μL)의 첨가에 의해 켄칭시켰다. 혼합물을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(방법 4: 8분 내에 50% 내지 80% B에 이어서, 4분 내에 95% B)에 의해 정제하여, 링커-약물 9(128 mg)를 백색 분말상 고체로서 제공하였다. LCMS(방법 2): 머무름 시간 1.51분, 1/2 [M+2H]2+ 702.8.
링커-약물 10의 합성
Figure pct00065
링커-약물 10의 합성을 CN 201710691056.X호에 기재된 바와 같이 제조하였다.
항체-약물 컨쥬게이트의 제조
트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, 10 당량, 원액 농도 10 mM)를 항체 AS11259(IgG1)의 용액(20 mM 인산이수소나트륨-인산수소이나트륨 완충제, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2)에 첨가하였다. 반응물을 37℃ 써모스탯 수조에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 용액을 대략 실온까지 냉각시킨 다음, 한외여과(머크 밀리포어 아미콘(Merck Millipore Amicon)® 울트라, 50000 MWCO) 또는 겔 여과에 의해 완충제(100 mM 인산이수소 포타슘-인산수소 다이포타슘, 100 mM 염화나트륨, 1 mM 디에틸렌트리아민 펜타아세트산, pH 7.0 내지 8.0) 또는 완충제(20 mM 시트르산-시트르산삼나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산, pH 6.0)로 완충제-교환하였으며, 디메틸 술폭시드 및 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 링커-약물 1(디메틸 술폭시드 원액, 항체에 비하여 3 내지 10 당량)을 첨가하여, 반응 용액 중 디메틸 술폭시드의 부피가 약 10 내지 15%인 것을 보장하였다. 컨쥬게이션 반응을 10℃에서 0.5시간 동안 수행하였다.
과잉의 시스테인 용액을 상기 컨쥬게이션 용액에 첨가하여, 미반응된 링커-약물 1을 켄칭하고, 켄칭을 10℃에서 30분 동안 수행하였다. 반응 용액을 먼저 한외여과(머크 밀리포어 아미콘® 울트라, 50000 MWCO) 또는 겔 여과로 처리하여, 링커-약물 1-시스테인 부가물 및 과잉의 시스테인을 제거한 다음, 시료를 보관 완충제(20 mM 인산이수소나트륨-이염기성 인산나트륨 완충제, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2)로 완충제-교환하였다. 수득된 용액을 0.22 μm 포어 크기 필터(머크 밀렉스-GV 필터)를 통해 멸균시켜, 항체-약물 컨쥬게이트 AS11259-ADC-001을 수득하였으며, 이를 4℃에 보관하였다.
본 발명의 다른 항체-약물 컨쥬게이트, AS11259-ADC-002 내지 AS11259-ADC-011을 각각 링커-약물 2 내지 10을 사용하여 링커-약물 1을 교체하여 상기 제조 절차에 따라 제조하였다. 항체 AS11259를 링커-약물 1과 컨쥬게이트시킴으로써 항체-약물 컨쥬게이트 AS11259-ADC-0012를 수득하였으며, 여기서, 항체는 부분 환원 방식을 통해 환원되었으며, 평균 2개의 쌍의 이황화 결합이 환원된다.
표 6은 본 개시내용에서 제조된 항체 약물 컨쥬게이트의 요약을 보여준다.
[표 6]
Figure pct00066
항체-약물 컨쥬게이트의 특성화
1) 평균 DAR 값의 결정
평균 DAR 값을 소수성 크로마토그래피 HIC(문헌[Anal. Chem. 2013, 85, 1699-1704] 참조)를 사용하여 계산하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피를 아질런트 1100(아질런트 1100) 상에서 수행하였다. 정지상은 TSKgel 부틸-NPR 컬럼(4.6x35 mm, 2.5 μm, 토소(상하이) 바이오테크 컴퍼니, 리미티드(Tosoh (Shanghai) Biotech Co., Ltd.))이었다. 용리 기울기는 25분 내에 100% 완충제 A[50 mM 인산칼륨(pH 7.0) + 1.5 M 황산암모늄]로부터 100% 완충제 B[80% v/v 50 mM 인산칼륨(pH) 7.0) + 20% v/v 이소프로판올]로 대체되는 선형 기울기였다. 유량은 0.8 mL/분이었으며, 컬럼 온도를 30℃로 설정하였고, 검출 파장을 230 nm 및 280 nm로 설정하였다.
본 개시내용에서 항체 약물 컨쥬게이트의 평균 DAR 값의 측정의 결과는 표 7에 나타나 있다.
[표 7]
Figure pct00067
항원에 대한 항체-약물 컨쥬게이트의 친화성 검정
간접적 ELISA 방법을 사용하여, 상응하는 항원에 대한 항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트의 결합 능력을 결정하였다: CD79b 항원을 고체상 운반체(96-웰 ELISA 플레이트)에 라이게이션시켜, 고체상 항원을 형성한 다음, 미결합 항원을 세척하고 제거하고; 본 발명에 의해 제조되는 기울기-희석된 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그의 상응하는 항체를 첨가하였으며, 여기서, 특이적인 항체는 항원에 결합하여 고체상 항원-항체 복합체를 형성하며, 고체상 항원에 결합하지 않았던 항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트를 세척에 의해 제거하였다. ELISA 항-항체를 첨가하여, 고체상 항원에 결합된 항체 또는 ADC 항체와 결합시켰으며, 미결합 항-항체를 세척에 의해 제거하였다. 기질 용액을 첨가한 다음, 450 nm/630 nm에서 광학 밀도(OD) 값을 마이크로플레이트 판독기 T로 판독하였으며, 이에 기초하여, 곡선을 플롯팅하고, EC50을 계산하였다.
CD79b 항원에 대한 본원에서 제조된 항체 약물 컨쥬게이트의 친화성의 측정치는 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
Figure pct00068
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 본원에서 제조된 항체 약물 컨쥬게이트는 네이키드 항체 AS11259에 비하여 항원에 대한 친화성에서 유의미한 차이를 갖지 않는다.
항체-약물 컨쥬게이트에 의한 세포 증식 저해
항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트의 세포정지 활성을 하기의 방법에 의해 결정하였다: 종양-연관 항원 또는 수용체 단백질을 발현하는 포유동물 세포(본 발명의 검정은 CD79b 항원을 발현하는 Ramos 세포를 사용함)를 96-웰 플레이트에 접종하였는데, 각각의 웰에는 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지(집코) 100 μL 중에 현탁화시킨 40,000개의 세포를 접종하였으며; ADC 시료의 초기 농도는 2 μg/mL이었으며, 3-배 단계 희석을 2% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지(집코)를 사용하여 수행하고; 원래의 배지에서, 100 μL의 기울기-희석된 ADC 시료를 각각의 웰에 첨가하였으며, 약물의 초기 농도는 1 ug/ml였고; 인큐베이션을 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 계속하고; 50 μL의 원래 배지를 제거한 다음, 70 μL의 CCK-8 현상 용액(CCK-8: RPMI 1640 = 2:5)을 각각의 웰에 첨가한 후, 60 내지 75분 동안 추가로 배양하고; 450 nm / 630 nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 판독하였으며, 이에 기초하여, 곡선을 플롯팅하고, IC50을 계산하였다. 본원에서 제조된 항체 약물 컨쥬게이트에 의한 세포 증식의 저해의 결과는 표 9에 나타나 있다.
[표 9]
Figure pct00069
결과는 본 개시내용에서 제조된 항체 약물 컨쥬게이트가 모두 우수한 세포 증식 저해 효과를 갖는 것을 보여주었다.
Ramos 모델
Ramos 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 우태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 배양하였다. 세포를 대수 성장기에 계수하고 수집하고, 1:1 PBS 및 매트리겔(Matrigel) 중에 재현탁화시킨 후, 마우스(CB17/SCID 마우스, 암컷, 8 내지 9주, 평균 체중 18.4 g, 상하이 링창 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드(Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.)로부터 구입, 동물 인증 번호: 2013001832088; 급식 환경: SPF 수준)의 우측에 피하 접종하였다. 마우스당 접종되는 세포의 부피는 0.1 ml였으며, 접종되는 세포의 양은 마우스당 1 × 107개 세포였다. 평균 종양 크기가 197 mm3에 도달하는 경우, 체중을 칭량하였으며, 마우스를 무작위로 그룹화시킨 후, 투여를 개시하였다. 투여는 꼬리 정맥을 통해 이루어졌으며, 투여 빈도는 오직 1회였다.
결과 평가 기준
상대 종양 저해율 TGI(%): TGI = 1- T/C(%). T/C%는 상대 종양 성장률, 즉, 특정 시점에 대조군에 대한 치료군의 상대적 종양 부피 또는 종양 중량의 백분율 비이다. T 및 C는 각각 특정 시점에서의 처리군 및 대조군의 상대 종양 부피(RTV)이다.
식은 하기와 같다: T/C% = TRTV / CRTV*100%(TRTV: 처리군에서의 평균 RTV; CRTV: 비히클 대조군에서의 평균 RTV; RTV = Vt/V0, V0는 그룹화 시의 동물의 종양 부피이며, Vt는 처리 후의 동물의 종양 부피이다).
종양 부피 계산 식은 긴 직경 × 짧은 직경2/2이다. 종양 세포 접종일을 제0일로서 정의하였다. 종양을 투여 후에 주 2회 측정하였다.
비히클 대조군의 평균 종양 부피는 투여 후 제14일(PG-D14)에 3003 mm3에 도달하였다. 안락사를 수행하였으며, 투여 후 제14일에 다른 약물 군의 상대 종양 저해율을 계산하였다. 투여 후 제45일에, 실험을 종결시키고, 계속 관찰한 나머지 마우스 모두를 안락사시키고, 각각의 군에서 종양이 완전히 퇴행한 마우스의 수를 기록하였다.
실험 결과
실험 결과는 표 10 및 도 2 및 도 3에 나타나 있다.
[표 10]
Figure pct00070
Figure pct00071
비히클 대조군의 평균 종양 부피는 투여 후 제14일(PG-D14)에 3003 mm3에 도달하였다.
시험 약물 AS11259-ADC-001 처리군은 비히클 대조군과 비교하여 3가지 용량(1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg)에서 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 이는 유의미한 용량-반응 관계를 뒷받침한다. 3가지 투여군에 있어서 투여 후 제14일(PG-D14)의 평균 종양 부피는 각각 1558 mm3, 337 mm3 및 14 mm3였으며, 종양 성장 저해(TGI)는 각각 48.7%, 90.1% 및 99.6이었고, 이는 대조군과 통계적으로 유의미하게 상이하였다(p 값은 각각 0.023, 0.001, 0.001이다). 고-용량(5 mg/kg) 군에 있어서, 종양 성장은 투여 후에 마우스에서 유의미하게 저해되었다. 투여 후 제10일(PG-D10)에, 6마리의 마우스 중 3마리의 마우스에서 종양이 소실되기 시작하였으며, 투여 후 제24일(PG-D24)에 6마리 마우스 모두에서 완전히 소실되었다. 실험의 마지막(PG-D45)에, 마우스 종양의 퇴행이 존재하지 않았다.
시험 약물 AS11259-ADC-002 처리군은 비히클 대조군과 비교하여, 1 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량에서 소정의 항-종양 효과를 야기하였다. 투여 후 제14일(PG-D14)에, 평균 종양 부피는 각각 2171 mm3 및 1986 mm3였으며, 종양 성장 저해(TGI)는 각각 28.4% 및 33.2%였지만, 상대적 비히클 대조군과 통계적으로 유의미한 차이가 존재하지 않았다(각각 0.195 및 0.126의 p 값). AS11259-ADC-002 처리군은 5 mg/kg의 용량에서 비히클 대조군에 비하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 평균 종양 부피는 투여 후 제14일(PG-D14)에 1294 mm3였다. 종양 성장 저해(TGI)는 60.1%였으며, 이는 대조군과 통계적으로 유의미하게 상이하였다(p = 0.014). 시험 약물 AS11259-ADC-002의 항-종양 효과는 유의미한 용량-반응 관계를 보였다.
시험 약물 AS11259-ADC-004 처리군은 1 mg/kg의 용량에서 비히클 대조군과 비교하여 소정의 항-종양 효과를 야기하였다. 투여 후 제14일(PG-D14)에 평균 종양 부피는 1762 mm3였다. 상대 종양 저해율은 42.6%였지만, 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 존재하지 않았다(p = 0.075). 시험 약물 AS11259-ADC-004는 2.5 mg/kg 및 5 mg/kg의 용량에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였다. 투여 후 제14일(PG-D14)에, 평균 종양 부피는 각각 1835 mm3 및 1030 mm3였으며, 종양 성장 저해(TGI)는 각각 41.2% 및 66.0%였으며, 둘 모두 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(각각 0.027 및 0.003의 p 값). 시험 약물 AS11259-ADC-004의 항-종양 효과는 유의미한 용량-반응 관계를 보였다.
시험 약물 AS11259-ADC-010 처리군은 3가지 농도(1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg)에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 유의미한 용량-반응 관계를 보였다. 투여 후 제14일(PG-D14)에 평균 종양 부피는 각각 1241 mm3, 15 mm3 및 12 mm3였으며, 종양 성장 저해(TGI)는 각각 57.8%, 99.5% 및 99.6%였다. 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 존재하였다(각각 0.014, 0.001, 0.001의 p 값). 중등-용량(2.5 mg/kg) 군에서, 종양 성장은 투여 후에 유의미하게 저해되었다. 투여 후 제10일(PG-D10)에, 6마리 중 2마리의 마우스의 종양이 소실되기 시작하였다. 투여 후 제28일(PG-D28)에, 6마리 마우스 모두의 종양이 소실되었으며, 이어서, 실험의 마지막(PG-D45)에 1마리의 마우스의 종양이 퇴행된 한편, 다른 5마리의 마우스는 종양 퇴행을 갖지 않았다. 고-용량(5 mg/kg) 군에서, 종양 성장은 투여 후에 유의미하게 저해되었다. 투여 후 제10일(PG-D10)에, 6마리 중 1마리의 마우스의 종양이 소실되기 시작하였다. 투여 후 제24일(PG-D24)에, 6마리 마우스 모두의 종양이 소실되었다. 실험의 마지막(PG-D45)에, 마우스의 종양은 퇴행을 보이지 않았다.
시험 약물 AS11259-ADC-0012 처리군은 비히클 대조군과 비교하여 5 mg/kg의 용량에서 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 투여 후 제14일(PG-D14)에 평균 종양 부피는 13 mm3였다. 종양 성장 저해(TGI)는 99.6%였으며, 이는 대조군과 통계적으로 유의미하게 상이하였다(p = 0.001). 종양 성장은 투여 후에 이 처리군의 마우스에서 유의미하게 저해되었으며, 투여 후 제10일(PG-D10)에, 6마리의 마우스 중 2마리에서 종양이 소실되기 시작하였으며, 투여 후 제31일(PG-D31)에, 6마리의 마우스 중 5마리에서 종양이 소실되었다. 실험의 마지막(PG-D45)에, 5마리의 마우스의 종양은 퇴행을 보이지 않았다.
시험 약물 AS11259-ADC-011 처리군은 2 mg/kg 및 5 mg/kg의 용량에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 항-종양 효과는 유의미한 용량-반응 관계를 보였다. 투여 후 제14일(PG-D14)에, 평균 종양 부피는 각각 818 mm3 및 17 mm3였다. 상대 종양 저해율은 각각 73.8% 및 99.4%였으며, 대조군과 통계적으로 유의미한 차이가 존재하였다(둘 모두의 p 값은 0.001이다). 고-용량(5 mg/kg) 군에서, 종양 성장은 투여 후에 유의미하게 저해되었다. 투여 후 제10일(PG-D10)에, 6마리의 마우스 중 1마리에서 종양이 소실되기 시작하였다. 투여 후 제28일(PG-D28)에, 6마리 마우스 모두의 종양이 소실되었다. 실험의 마지막(PG-D45)에, 마우스의 종양은 퇴행을 보이지 않았다.
시험 약물 AS11259-ADC-008 처리군은 2.5 mg/kg의 용량에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 평균 종양 부피는 투여 후 제14일(PG-D14)에 1390 mm3였다. 종양 성장 저해(TGI)는 54.8%였으며, 이는 대조군과 통계적으로 유의미하게 상이하였다(p = 0.009).
Granta-519 모델
Granta-519 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 우태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 배양하였다. 대수 성장기의 세포를 계수하고 수집하고, 1:1 PBS 및 매트리겔 중에 재현탁화시키고, 마우스 NOD/SCID 마우스(암컷, 8 내지 9주, 평균 체중 20.5g, 베이징 안카이 이보 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드(Beijing Ankai Yibo Biotechnology Co., Ltd.)로부터 구입, 동물 인증 번호: 11402400012442; 급식 환경: SPF 수준)의 우측에 피하 접종하였다. 마우스당 접종되는 세포의 부피는 0.1 ml였으며, 접종되는 세포의 양은 마우스당 1 × 107개 세포였다. 평균 종양 크기가 200 mm3에 도달하는 경우, 체중을 칭량하였으며, 마우스를 무작위로 그룹화시킨 후, 투여를 개시하였다. 투여는 꼬리 정맥을 통해 이루어졌으며, 투여 빈도는 오직 1회였다.
결과 평가 기준
제1 뱃치의 실험의 비히클 대조군의 평균 종양 부피는 투여 후 제17일(PG-D17)에 2744 mm3에 도달하였다. 안락사를 대조군에서 수행하였으며, 약물 처리군의 TGI를 제17일에 계산하였다. 투여 후 제45일에, 실험을 종결시키고, 나머지 마우스 모두를 안락사시키고, 각각의 군에서 종양이 완전히 퇴행된 마우스의 수를 기록하였다.
실험 결과
결과는 하기 표 11 및 표 12, 및 도 4 및 도 5에 나타나 있다.
[표 11]
Figure pct00072
[표 12]
Figure pct00073
제1 뱃치의 비히클 대조군에서, 평균 종양 부피는 투여 후 제17일(PG-D17)에 2744 mm3에 도달하였다.
시험 약물 AS11259-ADC-001 처리군은 3가지 농도(3.5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg)에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였다. 3가지 투여 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에 평균 종양 부피는 각각 68 mm3, 68 mm3 및 49 mm3였으며, 종양 성장 저해(TGI)는 각각 97.5%, 97.6% 및 98.2%였으며, 대조군과 통계적으로 매우 유의미하게 상이하였다(p 값이 0.001 미만이다). 투여 후 제45일(PG-D45)에, 3가지 투여 군의 평균 종양 부피는 각각 1268 mm3, 536 mm3 및 184 mm3에 도달하였으며, 이는 시험 물질이 항-종양 효과에서 유의미한 용량-반응 관계를 보여주었음을 나타낸다.
시험 약물 AS11259-ADC-002 처리군은 3가지 농도(3.5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg)에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 유의미한 용량-반응 관계를 제시하였다. 저 용량(3.5 mg/kg) 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에 평균 종양 부피는 871 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 68.5%였으며, 비히클 대조군에 비하여 통계적으로 매우 유의미한 차이를 가졌다(p < 0.001). 중등 용량(7 mg/kg) 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에, 평균 종양 부피는 246 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 90.8%였으며, 비히클 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(p < 0.001). 고 용량(14 mg/kg) 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에 평균 종양 부피는 101 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 96.3%였으며, 비히클 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(p < 0.001).
시험 약물 AS11259-ADC-004 처리군은 3가지 용량(3.5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg)에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 유의미한 용량-반응 관계를 보였다. 저-용량(3.5 mg/kg) 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에 평균 종양 부피는 703 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 74.3%였으며, 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 매우 유의미한 차이를 가졌다(p < 0.001). 중등 용량(7 mg/kg) 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에 평균 종양 부피는 222 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 92.1%였으며, 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(p < 0.001). 고 용량(14 mg/kg) 군에서, 투여 후 제17일(PG-D17)에 평균 종양 부피는 117 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 95.7%였으며, 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(p < 0.001).
제2 뱃치의 실험에서, 비히클 대조군의 평균 종양 부피는 투여 후 제17일(PG-D17)에 2535 mm3에 도달하였다.
시험 약물 AS11259-ADC-001(2.5 mg/kg), AS11259-ADC-0012(6 mg/kg), AS11259-ADC-011(5 mg/kg) 및 AS11259-ADC-010(2.5 mg/kg) 처리군은 투여 후에 종양 성장을 유의미하게 저해하였다. 투여 후 제17일(PG-D17)에, 평균 종양 부피는 각각 17 mm3, 6 mm3, 11 mm3 및 9 mm3였다. 종양 성장 저해(TGI)는 99.3%, 99.8%, 99.6% 및 99.6%였으며, 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(모든 p 값은 0.001이다).
WSU-DLCL2 모델
WSU-DLCL2 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 우태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 배양하였다. 대수 성장기의 세포를 수집하고, NOD/SCID 마우스(암컷, 베이징 안카이 이보 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드로부터 8 내지 9주령, 동물 인증 번호: 11402400012441; 급식 환경: SPF 수준)의 우측 허벅지 내로의 주사에 의해 피하 접종하였다. 마우스당 접종되는 세포의 부피는 0.1 ml였으며, 접종되는 세포의 양은 마우스당 1 × 107개였다. 평균 종양 크기가 200 mm3에 도달하는 경우, 체중을 칭량하였으며, 마우스를 무작위로 그룹화시키고, 투여를 개시하였다. 투여는 꼬리 정맥을 통해 이루어졌으며, 투여 빈도는 오직 1회였다.
결과 평가 기준
제1 뱃치의 비히클 대조군에서, 평균 종양 부피는 투여 후 제32일(PG-D32)에 2146 mm3에 도달하였다. 안락사를 대조군에서 수행하였으며, 약물 처리군의 TGI를 제32일에 계산하였다. 투여 후 제43일에, 실험을 종결시키고, 나머지 마우스 모두를 안락사시키고, 각각의 군에서 종양이 완전히 퇴행된 마우스의 수를 기록하였다.
제2 뱃치의 비히클 대조군에 있어서, 평균 종양 부피는 투여 후 제35일(PG-D35)에 2360 mm3에 도달하였다. 안락사를 대조군에서 수행하였으며, 약물 처리군의 TGI를 제35일에 계산하였다. 투여 후 제42일에, 실험을 종결시키고, 나머지 마우스 모두를 안락사시키고, 각각의 군에서 종양이 완전히 퇴행된 마우스의 수를 기록하였다.
실험 결과
실험 결과는 하기 표 13, 표 14 및 도 6 및 도 7에 나타나 있다.
[표 13]
Figure pct00074
[표 14]
Figure pct00075
제1 뱃치 이종이식편 모델에서, 시험 약물 AS11259-ADC-001 처리군은 3가지 용량(3.5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg)에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 항-종양 효과를 야기하였으며, 유의미한 용량-반응 관계를 제시하였다. 저 용량(3.5 mg/kg) 군에서, 투여 후 제32일(PG-D32)에 평균 종양 부피는 845 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 60.4%였으며, 비히클 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(p = 0.004). 중등 용량(7 mg/kg) 군에서, 투여 후 제32일(PG-D32)에, 평균 종양 부피는 273 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 87.6%였으며, 비히클 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이를 가졌다(p = 0.001). 고 용량(14 mg/kg) 군에서, 투여 후 제32일(PG-D32)에 평균 종양 부피는 132 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 93.7%였으며, 비히클 대조군에 비하여 통계적으로 매우 유의미한 차이를 가졌다(p = 0.001).
시험 약물 AS11259-ADC-004 처리군은 3가지 투여 군(3.5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg)에서 비히클 대조군과 비교하여 약간의 항-종양 효과를 야기하였지만, 유의미한 통계적 차이가 없었다. 3가지 투여 군에서, 투여 후 제32일(PG-D32)에 평균 종양 부피는 각각 1526 mm3, 1632 mm3 및 1521 mm3였고, 종양 성장 저해(TGI)는 각각 28.3%, 24.0% 및 28.6이었다. p 값은 각각 0.080, 0.123 및 0.080이었다.
제2 뱃치 이종이식편 모델에서, 시험 약물 AS11259-ADC-001(3.5 mg/kg), AS11259-ADC-0012(8.4 mg/kg), AS11259-ADC-011(7 mg/kg) 및 AS11259-ADC-010(3.5 mg/kg) 처리군은 모두 투여 후에 종양 성장을 유의미하게 저해하였다. 투여 후 제35일(PG-D35)에, 평균 종양 부피는 각각 912 mm3, 840 mm3, 700 mm3 및 913 mm3였다. 종양 성장 저해(TGI)는 각각 61.0%, 64.4%, 71.4% 및 62.0%였으며, p 값은 각각 <0.001, <0.001, <0.001 및 0.001이었다. 시험 약물은 모든 용량 군의 마우스에 의해 잘 용인되었다.
본 출원에서 언급된 모든 문헌은 임의의 단일의 문헌이 그의 전문이 참조되는 것처럼 그들 전체가 본원에 참조로 포함된다. 또한, 다양한 변형 및 변화가 해당 분야의 숙련자에 의해 이루어질 수 있으며, 이는 모두 첨부된 청구범위의 범주 내에 속할 것임을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> NEWBIO THERAPEUTICS, INC. <120> Anti-CD79b Antibodies, Drug Conjugates, and Applications thereof <150> 201811296100.8 <151> 2018-11-01 <130> 17A472 <160> 39 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 2 Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 3 Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 5 Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 6 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mVH <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mVL <400> 8 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 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Artificial Sequence <220> <223> BAC01734.1 immunoglobulin kappa light chain Variable region <400> 10 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser 20 25 30 Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn 65 70 75 80 Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 165 170 175 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 180 185 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Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 30 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of AS11252 <400> 30 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 31 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of AS11254 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 32 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of AS11254 <400> 32 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 33 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of AS11259 <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 34 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of AS11259 <400> 34 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 35 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD79b ECD <400> 35 Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser 1 5 10 15 Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr 20 25 30 Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp 35 40 45 Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu 50 55 60 Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr 115 120 125 Leu Lys Asp Val Asp His His His His His His 130 135 <210> 36 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of heavy chain of AS11259 <400> 36 caagttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60 tcctgcaaga ccagcggcaa cacctttacc agctacggca tcaactgggt caagcaggcc 120 cctggacaag gcttggagtg gatcggcgag atcttcccca ggagcggcaa catctactac 180 aacgagaaat tcaagggccg cgtgaccatc accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actattgtgc caagggcggc 300 acaggcgact tcgactactg gggacagggc acactggtca cagtgtctag cgcaagcact 360 aaaggacctt ccgtgttccc actggcacca tcctctaaga gcacttccgg aggaaccgcc 420 gctctgggat gtctggtgaa ggactacttc ccagagcccg tcacagtgtc atggaacagc 480 ggggccctga ccagcggagt ccatacattt cctgctgtgc tgcagagttc aggcctgtat 540 agcctgagct ccgtggtcac tgtcccatct agttcactgg ggactcagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaaaccatc taataccaag gtcgacaaga aagtggaacc caaaagttgt 660 gataagacac atacttgccc accttgtcct gcaccagagc tgctgggagg accaagcgtg 720 ttcctgtttc cacccaaacc taaggacacc ctgatgatta gccgcacacc agaagtcact 780 tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggat cccgaagtca agtttaactg gtacgtggat 840 ggcgtcgagg tgcataatgc caaaacaaag cccagggagg aacagtataa ctctacatac 900 cgcgtcgtga gtgtcctgac tgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggaatacaaa 960 tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgcc cctatcgaga agaccatttc taaagccaag 1020 gggcagcctc gagaaccaca ggtgtataca ctgcctccaa gccgggacga gctgactaaa 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag gggttctacc cctccgatat tgctgtggag 1140 tgggaatcta atggacagcc tgagaacaat tataagacca caccccctgt gctggactcc 1200 gatggatctt tctttctgta ctcaaaactg accgtggata agagccgatg gcagcagggc 1260 aatgtctttt cttgtagtgt gatgcacgag gcactgcaca accactacac ccagaagtca 1320 ctgtcactgt caccaggcaa gtga 1344 <210> 37 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of light chain of AS11259 <400> 37 gacgtggtca tgacccagtc tccactgagc ctgccagtga cactgggaca gccagccagc 60 atctcctgtc ggagctccca gaacatcgtg cacagcgacg gcaataccta cctggagtgg 120 tatcagcagc ggcctggcca gtccccaaga ctgctgatct acaaggtgtc cttcaggctg 180 tctggagtgc cagaccgctt ttctggcagc ggctccggca ccgatttcac actgaagatc 240 tctcgggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgct tccagggcag ccatgtgccc 300 tggacctttg gcggcggcac aaaggtggag atcaagagaa ccgtggccgc ccctagcgtg 360 ttcatctttc cccctagcga cgagcagctg aagagcggca cagcctccgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctaccctag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggataa cgccctgcag 480 tccggcaatt ctcaggagag cgtgaccgag caggactcca aggattctac atatagcctg 540 tctagcaccc tgacactgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta tgcatgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc ctctcccgtg acaaagagct ttaaccgcgg cgagtgttag 660 <210> 38 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of mVH <400> 38 caggttcagc tgcagcagtc tggatctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaaga cttctggcaa caccttcaca agttatggta taaactgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttttccta gaagtggtaa tatttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcgtac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aaaaggggga 300 actggggact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 39 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of mVL <400> 39 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtgatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaaa ctcctgattt acaaagtttc cttccgactt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatccggga cagatttcac actcaagatc 240 agaagagtgg aggctgagga tctgggaact tattattgtt ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

Claims (19)

  1. 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; SEQ ID NO: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; SEQ ID NO: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 HCDR1의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1에 제시되며, HCDR2의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2에 제시되며, HCDR3의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 3에 제시되며, LCDR1의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 4에 제시되며, LCDR2의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5에 제시되며, LCDR3의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 6에 제시된 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-CD79b 항체가 모노클로널 항체이고/항체이거나, 상기 항-CD79b 항체가 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체인 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 7 또는 11에 제시되고/제시되거나 상기 항-CD79b 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 8 또는 12에 제시되거나; 또는
    상기 항-CD79b 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 13 내지 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되고/선택되거나, 상기 항-CD79b 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 18 내지 22 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로부터 선택되는 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-CD79b 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 및 33에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군 중 어느 하나에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되고;
    상기 항-CD79b 항체의 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 및 34에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군 중 어느 하나에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-CD79b 항체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 25에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 26에 제시된 항체;
    (2) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 27에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 28에 제시된 항체;
    (3) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 29에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 30에 제시된 항체;
    (4) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 31에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 32에 제시된 항체;
    (5) 중쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 33에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 34에 제시된 항체.
  7. 항체-약물 컨쥬게이트로서, 상기 컨쥬게이트가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 세포독성제의 컨쥬게이트인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 구조가 하기와 같은 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00076

    상기 식에서,
    A는 항체이며;
    V-L은 링커이며, V는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 비스말레이미드 또는 테트라말레이미드 유형 링커 구성원이며;
    L은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 절단 가능한 링커 또는 비-절단 가능한 링커일 수 있으며;
    V 및 L 중 적어도 하나가 존재하며;
    D는 관심 세포독성제이며;
    n은 1 내지 4의 정수이다.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세포독성제가 화학치료 약물, 성장 저해제, 독소 또는 방사성동위원소인 항체-약물 컨쥬게이트.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 약물과의 그의 컨쥬게이트, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열:
    (1) SEQ ID NO: 1 내지 8, 11 내지 22 및 25 내지 34에 제시된 어느 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (2) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    (3) (1) 또는 (2)의 폴리뉴클레오티드 서열의 상보성 서열.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열:
    (a) SEQ ID NO: 36 내지 39 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (b) (a)의 폴리뉴클레오티드 서열의 상보성 서열.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보성 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 벡터.
  15. CD79b-매개의 질병의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 약물의 컨쥬게이트로서,
    바람직하게는 상기 컨쥬게이트가 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 약물의 컨쥬게이트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 질병이 조혈계의 암, 바람직하게는 B 세포 증식성 장애이며; 바람직하게는, 상기 질병이 림프종 또는 백혈병이며; 더욱 바람직하게는, 상기 질병이 비-호지킨 림프종(NHL), 공격적 NHL, 재발성 공격적 NHL, 재발성 무통증 NHL, 불응성 NHL, 불응성 무통증 NHL, 소림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발상 세포 백혈병(HCL) 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL)으로부터 선택되는 용도.
  17. CD79b의 증가된 발현과 연관된 세포 증식성 장애를 위한 진단제의 제조에서의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
  18. 제1 용기를 포함하는 물품으로서, 상기 제1 용기가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 약물의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물, 또는 상기 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 상기 컨쥬게이트의 약제학적 조성물을 포함하는, 물품.
  19. 제18항에 있어서, 상기 물품이 약제학적으로 허용 가능한 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함하거나; 또는
    상기 조성물이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-CD79b 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며,
    상기 물품이 희석제, 완충제 또는 검출용 대조 항체를 함유하는 용기를 추가로 포함하는 물품.
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