BR112021006919A2 - anticorpos anti-cd79b, conjugados de fármacos e suas aplicações - Google Patents

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Liwei Song
Deqiang An
Di ZENG
Huali LI
Chun Yang
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Abstract

ANTICORPOS ANTI-CD79b, CONJUGADOS DE FÁRMACOS E SUAS APLICAÇÕES. A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-CD79b ou fragmento seu de ligação com antígeno, um conjugado seu de fármaco e sua utilização. O anticorpo anti-CD79b ou fragmento seu de ligação com antígeno nesta invenção compreende: HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-CD79b, CONJUGADOS DE FÁRMACOS E SUAS APLICAÇÕES". Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CD79b, con- jugados de fármacos e seus usos. Antecedentes da Invenção
[0002] CD79b (isto é, Igβ ou B29) é um componente de sinalização do receptor de células B e atua pela formação de um heterodímero co- valente com CD79a (isto é, Igα ou mb-1). CD79b inclui um domínio de imunoglobulina extracelular (Ig), um domínio de transmembrana e um domínio de sinal intracelular. A expressão de superfície de CD79b foi detectada em quase todos os pacientes com linfoma não Hodgkin (NHL) e leucemia linfocítica crônica (CLL) por citometria de fluxo. Além da fun- ção de sinalização, quando o receptor de células B é reticulado, ele é direcionado para o compartimento de complexo de histocompatibilidade principal classe II (um compartimento do tipo lisossômico), que é parte da apresentação de antígeno classe II por células B.
[0003] Essa característica da biologia de CD79b torna-o alvo para conjugados anticorpos-fármacos (ADCs), porque os anticorpos contra CD79b são internalizados e aplicados a compartimentos lisossômicos que são sabidos conter proteases que liberam fármacos citotóxicos. Conjugados anticorpos-fármacos (ADCs) são capazes de liberação di- recionada de um fármaco a um tumor e acúmulo intracelular ocorre nele. Esforços para aumentar o índice terapêutico de ADC (isto é, a eficácia mais alta com toxicidade mínima) foi centralizada na especificidade de anticorpos policlonais e monoclonais, assim como ligação de fármaco e perfis de liberação de fármaco.
[0004] Vários ADCs foram preparados, tal como anticorpo anti-
CD79b humanizado (SN8 humanizado) acoplado a monometilaurosta- tina E (MMAE) por ligante clivável por protease, que é clinicamente efi- caz no tratamento de NHL. Sumário da Invenção
[0005] Aqui são proporcionados anticorpos anti-CD79b ou seus fra- gmentos funcionais, as composições farmacêuticas ou seus conjugados de fármacos, e seu uso no tratamento de tumores hematológicos.
[0006] Em um aspecto, proporcionado aqui é um anticorpo anti- CD79b ou fragmento seu de ligação com antígeno, compreendendo: HCDR1, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; HCDR2, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; HCDR3, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3; LCDR1, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; LCDR2, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5; e LCDR3, compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6.
[0007] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, o anticorpo anti-CD79b descrito aqui é um anticorpo monoclo- nal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
[0008] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, a sequência de aminoácidos de HCDR1 do anticorpo anti- CD79b ou fragmento seu de ligação com antígeno é apresentada na SEQ ID NO: 1; a sequência de aminoácidos de HCDR2 é apresentada na SEQ ID NO: 2; a sequência de aminoácidos de HCDR3 é apresen- tada na SEQ ID NO: 3; a sequência de aminoácidos de LCDR1 é apre- sentada na SEQ ID NO: 4; a sequência de aminoácidos de LCDR2 é apresentada na SEQ ID NO: 5; e a sequência de aminoácidos de LCDR3 é apresentada na SEQ ID NO: 6.
[0009] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD79b neste documento é apresentada na SEQ ID NO: 7 ou 11, e/ou a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD79b neste documento é apresentada na SEQ ID NO: 8 ou 12.
[00010] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD79b neste documento é selecionada a partir das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-17, e/ou a sequência de aminoácidos da região variá- vel da cadeia leve dos anticorpos anti-CD79b neste documento é sele- cionada a partir das sequências de aminoácidos apresentadas em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 18-22.
[00011] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, o anticorpo anti-CD78b neste documento compreende (a) uma cadeia pesada com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, de homologia de sequência com SEQ ID NOs: 25,27,29, 31 ou 33, (b) uma cadeia leve com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo me- nos 98%, de homologia de sequência com SEQ ID NOs: 26,28,30, 32 ou 34, ou (c) a cadeia pesada em (a) e a cadeia leve em (b).
[00012] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD79b neste documento é selecionada de uma sequência de ami- noácidos com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25,27,29, 31 e 33, e/ou a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD79b neste docu- mento é selecionada de uma sequência de aminoácidos tendo pelo me- nos 90%, preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32 e 34.
[00013] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, o anticorpo anti-CD79b neste documento é selecionado do grupo que consiste dos seguintes anticorpos: (1) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresen- tada na SEQ ID NO: 25 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 26; (2) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresen- tada na SEQ ID NO: 27 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 28; (3) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresen- tada na SEQ ID NO: 29 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 30; (4) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresen- tada na SEQ ID NO: 31 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 32, e a sequência de aminoácidos da ca- deia leve é apresentada na SEQ ID NO: 32; e (5) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresen- tada na SEQ ID NO: 33 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 34.
[00014] Em outro aspecto, é fornecido aqui um conjugado anticorpo- fármaco que é um conjugado do anticorpo descrito aqui com um agente citotóxico.
[00015] Em uma ou mais modalidades de realização da presente in- venção, o agente citotóxico é um fármaco quimioterápico, um inibidor de crescimento, uma toxina ou um radioisótopo.
[00016] Em outro aspecto, é fornecido aqui uma composição farma- cêutica que compreende o anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco conforme descrito aqui, e um portador farmaceuticamente aceitável.
[00017] Em outro aspecto, é fornecido aqui um artigo que compre- ende um recipiente e uma composição contida no recipiente, em que a composição compreende um ou mais dos anticorpos CD79b descritos nesta invenção. Em certas modalidades de realização da presente in- venção, o artigo é um kit que compreende um primeiro recipiente que contém uma composição que compreende um ou mais dos anticorpos CD79b descritos aqui e um segundo recipiente que contém um tampão.
[00018] Em outro aspecto, é fornecido aqui o uso do anticorpo CD79b ou fragmento seu de ligação com antígeno descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença mediada por CD79b. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a doença é tumor hematológico, especialmente um distúrbio proliferativo de células B. Em certas modalidades de realização da pre- sente invenção, a doença é linfoma ou leucemia. Em certas modalida- des de realização da presente invenção, a doença é linfoma não Hod- gkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recorrente, NHL recorrente indolor, NHL refratário, NHL refratário indolor, linfoma linfocítico pe- queno, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosas (HCL) ou leucemia linfocítica aguda (ALL).
[00019] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de inibição de crescimento de uma célula que expressa CD79b, o método compre- endendo contatar a célula com um anticorpo ou conjugado anticorpo- fármaco descrito aqui, causando desse modo inibição de crescimento da célula. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a célula é uma célula B.
[00020] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de uma doença mediada por CD79b, o método compreendendo a admi- nistração a um mamífero com necessidade desse tratamento uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou conjugado anticorpo- fármaco descrito aqui. Em certas modalidades de realização da pre- sente invenção, a doença mediada por CD79b é câncer.
[00021] Em ainda outro aspecto, é fornecido aqui um método para determinar a presença de CD79b em uma amostra suspeita de conter CD79b, o método compreendendo expor a amostra a um anticorpo des- crito aqui e determinar a ligação do anticorpo com CD79b na amostra, em que a ligação do anticorpo com CD79b na amostra é indicativa da presença da proteína na amostra.
[00022] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um método de diag- nosticar um distúrbio proliferativo celular associado ao aumento de cé- lulas que expressam CD79b, tais como células B. O método compre- ende contatar células de teste em uma amostra biológica com o anti- corpo descrito aqui; determinar o nível de anticorpos ligados às células de teste na amostra que testa a ligação do anticorpo com CD79b; e comparar com o nível de anticorpos ligados às células na amostra de controle, em que o nível de anticorpos ligados é normalizado por refe- rência ao número de células que expressam CD79b em amostras de teste e de controle, e em que o nível de anticorpos ligados na amostra de teste maior do que a amostra de controle indica a presença de um distúrbio proliferativo celular associado a células que expressam CD79b. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a amostra biológica é sangue ou soro. Breve Descrição dos Desenhos
[00023] Figura 1: resultados de teste de afinidade por anticorpos hu- manizados.
[00024] Figura 2: efeito terapêutico de AS11259-ADC-001, 002, 004 em xenoenxertos subcutâneos de linfoma de células B humanas Ramos em camundongos nus.
[00025] Figura 3: efeito terapêutico de AS11259-ADC-010, 0012, 011, 008 em xenoenxertos subcutâneos de linfoma de células B huma- nas Ramos em camundongos nus.
[00026] Figura 4: efeito terapêutico de AS11259-ADC-001, 002, 004 em xenoenxertos subcutâneos de linfoma humano Granta-519 em ca- mundongos nus.
[00027] Figura 5: efeito terapêutico de AS11259-ADC-001, 0012, 011, 010 em xenoenxertos subcutâneos de linfoma humano Granta-519 em camundongos nus.
[00028] Figura 6: efeito terapêutico de AS11259-ADC-001, 004 em xenoenxertos subcutâneos de linfoma humano WSU-DLCL2 em camun- dongos nus.
[00029] Figura 7: efeito terapêutico de AS11259-ADC-001, 0012, 011, 010 em xenoenxertos subcutâneos de linfoma humano WSU- DLCL2 em camundongos nus. Modalidades Detalhadas
[00030] Deve ser entendido que dentro do escopo da presente inven- ção as várias características técnicas acima mencionadas da presente invenção e as características técnicas especificamente descritas na parte seguinte (tais como nas modalidades) podem ser combinadas umas com as outras para constituir novas soluções técnicas.
[00031] A prática da presente invenção empregará, a menos que de- finido de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (in- cluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquí- mica e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são completamente explicadas na literatura, tal como em Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (RI Fresney, ed., 1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds. 1987, e regularmente atualizado); PCR: The Polymerase Chain Re- action (PCR: Reação em Cadeia da Polimerase), (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V, 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001).
[00032] Conforme usado aqui, um anticorpo "isolado" refere-se a um anticorpo que foi identificado e separado de um componente de seu am- biente natural. Em uma modalidade de realização preferida, o anticorpo é purificado até: (1) que o anticorpo pese mais de 95%, mais preferivel- mente mais de 99%, de acordo com o método de Lowry, e (2) o grau seja suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de ami- noácidos com término N ou interna pelo uso de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) homogeneidade de acordo com SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução e coloração com azul de Coo- massie ou preferivelmente prata.
[00033] O termo "CD79b" refere-se a qualquer CD79b natural de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos, macacos) e roedores (por exemplo, camun- dongos e ratos), a menos que indicado de outro modo. O termo "CD79b" abrange "comprimento total", CD79b não processado e qualquer forma de CD79b processada a partir de células. O termo também abrange va- riantes de ocorrência natural de CD79b, tais como variantes de junção, variantes alélicas e isoformas. Os polipeptídeos CD79b descritos aqui podem ser isolados de uma variedade de fontes, tais como tipos de te- cido humano ou outras fontes, ou preparados por métodos recombinan-
tes ou sintéticos. O "polipeptídeo CD79b de sequência nativa" Inclui po- lipeptídeos que têm a mesma sequência de aminoácidos do polipeptí- deo CD79b correspondente derivado da natureza. Tal polipeptídeo CD79b de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser preparado por recombinação ou métodos sintéticos. O termo "polipeptí- deo CD79b de sequência nativa" abrange especificamente uma forma truncada ou secretada de ocorrência natural de um polipeptídeo CD79b particular (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), as for- mas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas de junção al- ternativas) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo.
[00034] O "domínio extracelular" ou "ECD" do polipeptídeo CD79b refere-se a uma forma de polipeptídeo CD79b substancialmente livre de domínios transmembrana e citoplásmicos. Tipicamente, o polipeptídeo CD79b ECD tem menos de 1% de tais domínios transmembrana e/ou domínios citoplásmicos, preferivelmente menos de 0,5% de tais domí- nios. Os limites precisos do domínio transmembrana podem variar, pre- ferivelmente, o domínio extracelular do polipeptídeo CD79b pode com- preender cerca de cinco ou menos de cinco aminoácidos de qualquer lado do domínio transmembrana/limite de domínio extracelular identifi- cado nos Exemplos ou no relatório descritivo. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a sequência de aminoácidos do CD79b ECD descrita aqui é apresentada na SEQ ID NO: 35.
[00035] O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos de comprimento total que têm regiões Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos que apresentam especificidades multiepíto- pos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecífi- cos), diacorpos e moléculas de cadeia simples, assim como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv). Os termos "imunoglobu- lina" (Ig) e "anticorpo" podem ser usados de forma intercambiável.
[00036] O termo "anticorpo CD79b" ou similar refere-se a um anti- corpo que é capaz de ligar CD79b com afinidade suficiente. Preferivel- mente, o anticorpo CD79b liga-se a proteínas não CD79b irrelevantes em um grau menor do que cerca de 10% da ligação do anticorpo com CD79b, conforme medido, por exemplo, por radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades de realização da presente invenção, o anticorpo que se liga a CD79b tem uma constante de dissociação (Kd) ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ou ≤ 0,1 nM. Em certas modalidades de realização da presente invenção, o anticorpo anti-CD79b liga-se a um epítopo CD79b que é conservado entre CD79bs de espécies diferentes.
[00037] Uma "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se ao domínio término amino da cadeia pesada ou leve de um anticorpo. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve podem ser referidos como "VH" e "VL", respectivamente. Esses domínios são tipi- camente as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros an- ticorpos do mesmo tipo) e contêm sítios de ligação com antígeno.
[00038] O termo "variável" refere-se à situação em que certos seg- mentos dos domínios variáveis diferem amplamente em sequências de anticorpos. Um domínio variável media a ligação com antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular a seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída ao longo dos 110 aminoácidos que abrangem o domínio variável. De fato, a região variável consiste em segmentos relativamente invariáveis de 15-30 ami- noácidos de comprimento chamados de regiões de estrutura (FRs) e regiões mais curtas extremamente variáveis dos comprimentos de 9-12 aminoácidos que separam cada um as regiões de estrutura denomina- das "regiões altamente variáveis (HVRs)”. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem, cada um, quatro regiões FR, a maioria das quais adota uma conformação em folha beta. Os
HVRs em cada cadeia são mantidos juntos muito próximos pelas regi- ões FR, e juntamente com os HVRs da outra cadeia contribuem para a formação do sítio de ligação com antígeno do anticorpo. Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação do anticorpo ao antígeno, mas exibem múltiplas funções efetoras.
[00039] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui refere- se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancial- mente homogêneos, isto é, exceto as mutações de ocorrência natural possíveis e/ou modificações pós-tradução (por exemplo, isomerização, amidação) que podem estar presentes em uma quantidade menor, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos. Os an- ticorpos monoclonais são altamente específicos e alvo para um único sítio antigênico. Cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno quando comparado com formula- ções de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem anticorpos dife- rentes dirigidos contra epítopos diferentes. Além de sua especificidade, a vantagem dos anticorpos monoclonais reside em que são sintetizados por cultura de hibridoma e não são contaminados por outras imunoglo- bulinas. "Monoclonal" indica que os anticorpos são obtidos a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não de- vem ser interpretados como exigindo qualquer método particular para a produção do anticorpo. Por exemplo, anticorpos monoclonais a serem usados aqui podem ser produzidos por uma variedade de técnicas que incluem, por exemplo, métodos de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)), recombinação de DNA (por exem- plo, Patente U.S. Nº 4.816.567), tecnologia de exibição de fagos (por exemplo,, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)), e a técnica para produzir um anticorpo humano ou similar a humano de animal que apre- senta locais de imunoglobulina humana parcial ou inteira ou genes que codificam sequências de imunoglobulina humana (por exemplo,
WO1998/24893).
[00040] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo in- tacto" ou "anticorpo completo" podem ser usados de forma intercambi- ável e se referem a um anticorpo que compreende um sítio de ligação com antígeno, bem como CL, e pelo menos os domínios constantes da cadeia pesada CH1, CH2 E CH3. O domínio constante pode ser um domínio constante de sequência nativa (por exemplo, um domínio cons- tante de sequência nativa humana) ou uma variante de sequência de aminoácidos do mesmo. Em alguns casos, um anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.
[00041] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente compreendendo uma região de li- gação com antígeno e/ou uma região variável de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (veja a Patente U.S.
5.641.870); moléculas de anticorpo de cadeia simples (scFv); e anticor- pos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpos. A digestão do anticorpo com papaína produz dois fragmentos de ligação com antí- geno idênticos denominados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc" re- sidual. O fragmento Fab consiste em todos os domínios variáveis de cadeia leve e pesada (VHs) e um primeiro domínio constante de cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente na ligação com an- tígeno, isto é, ele tem um único sítio de ligação com antígeno. O trata- mento do anticorpo com pepsina produz um fragmento F(ab')2 maior que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por ligações dissulfeto, o qual tem uma atividade de ligação com antígeno diferente e ainda é capaz de reticular antígeno. O fragmento Fab' difere do fragmento Fab pela adição de alguns resíduos adicionais no término carboxila do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. O fragmento de anticorpo F(ab')2 foi original- mente produzido como um par de fragmentos Fab' com uma cisteína de articulação entre os fragmentos Fab'. Outros conjugados químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos. O fragmento Fc compreende a porção terminal carboxila de duas cadeias pesadas man- tidas juntas por uma ligação dissulfeto. A função efetora de um anticorpo é determinada pela sequência na região Fc, que também é a região re- conhecida por um receptor Fc (FcR) encontrada em certos tipos de cé- lulas.
[00042] Uma "região Fc" ou fragmento Fc é usada aqui para definir uma região término C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, inclu- indo uma região Fc de sequência nativa e uma região Fc variante. Em- bora os limites da região Fc de cadeia pesada de imunoglobulina pos- sam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida como um segmento do resíduo de aminoácido em sua posição Cys226 ou Pro230 para o término carbóxi. A lisina com término C da região Fc (resíduo 447, de acordo com o sistema de numeração EU) pode ser eliminada, por exemplo, durante a produção ou purificação de anticorpo, ou por engenharia de recombinação de ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas de anticorpo. Assim, um conjugado de um anticorpo intacto pode incluir um conjugado de anticorpo no qual todos os resíduos K447 são eliminados, um conjugado de anticorpos sem qualquer resíduo K447 eliminado, ou conjugados de anticorpos mistos com um resíduo K447 ou sem resíduo K447. Uma "região Fc funcional" possui uma função efetora da região Fc de sequência nativa. Funções efetoras exemplares incluem ligação de C1q, CDC, ligação de receptor de Fc, ADCC, fagocitose, dessensibilização de receptores de superfície celular (por exemplo, receptores de células B) e similares. Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. A região Fc humana de sequência nativa compreende a re- gião Fc de IgG1 humana de sequência nativa; a região Fc de IgG2 hu- mana de sequência nativa; a região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e a região Fc IgG4 humana de sequência nativa; e variantes de ocorrência natural das mesmas. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere de uma região Fc de sequên- cia nativa por pelo menos uma modificação de aminoácido, preferivel- mente uma ou mais substituições de aminoácido. Preferivelmente, a re- gião Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido com- parada com a região Fc de sequência nativa ou com a região Fc do polipeptídeo original, por exemplo, possuindo na região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de origem cerca de 1 a cerca de 10 substituições de aminoácidos, preferivelmente cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácidos. As regiões Fc variantes preferivelmente têm pelo menos cerca de 80% de homologia com a região Fc de se- quência nativa e/ou com a região Fc do polipeptídeo original, mais pre- ferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com as mesmas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com as mesmas.
[00043] "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém todo o sítio de ligação e reconhecimento de antígeno. Esse fragmento consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve que são estritamente, não covalentemente, liga- dos. Seis alças hipervariáveis (três alças para cada uma das cadeias pesada e leve) são projetadas a partir do enovelamento desses dois domínios, contribuindo para os resíduos de aminoácidos de ligação com antígeno e conferindo especificidade de ligação de antígeno ao anti- corpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora a afinidade seja menor do que a do sítio de ligação intacto.
[00044] "Fv de cadeia simples" também pode ser abreviado como "scFv", que é um fragmento de anticorpo no qual os domínios VH e VL de um anticorpo são unidos em uma cadeia de polipeptídeo simples. Preferivelmente, o polipeptídeo scFv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL de modo que o sFv forme a estrutura de ligação com antígeno desejada.
[00045] "Diacorpo" refere-se a um fragmento de anticorpo que tem dois sítios de ligação com antígeno, compreendendo um domínio variá- vel de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) ligado na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Fragmentos de anti- corpos pequenos são preparados construindo um fragmento scFv com o uso de um ligante curto (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL, e por causa do ligante curto, os domínios variáveis são submetidos a emparelhamento entre em vez de dentro das cadeias. Isso resulta em um fragmento bivalente, um fragmento que apresenta dois sítios de li- gação com antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecifi- cos. Um diacorpo biespecífico é um heterodímero de dois fragmentos scFv de "cruzamento" nos quais os domínios VH e VL de ambos os an- ticorpos estão presentes em cadeias de polipeptídeo diferentes.
[00046] Um "fragmento funcional" ou "fragmento de ligação com an- tígeno" de um anticorpo descrito aqui inclui uma porção de um anticorpo intacto, tipicamente incluindo a ligação com antígeno ou região variável do anticorpo intacto, ou região Fc do anticorpo que retém ou possui a capacidade de ligação de FcR alterada. Exemplos de fragmentos funci- onais do anticorpo incluem anticorpos lineares, anticorpos de cadeia simples (scFv) e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpos, especialmente fragmentos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento que seja capaz de aumen-
tar a meia-vida por modificação química ou por incorporação em lipos- somas. A modificação química inclui a adição de poli(alquileno)glicóis tal como polietilenoglicol, isto é, modificação de PEGilação (referida como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou um fragmento PE- Gilado de Fab'-PEG) com atividade de ligação de CD79b.
[00047] Preferivelmente, um fragmento funcional do anticorpo des- crito aqui consiste em ou compreende uma sequência parcial de uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve do anticorpo a partir do qual é derivada, sendo a sequência parcial sufi- ciente para reter a mesma especificidade de ligação e afinidade com- pleta do anticorpo do qual é derivada. Tais fragmentos funcionais com- preenderão um mínimo de cinco aminoácidos, preferivelmente 10, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos contíguos da sequência do anticorpo do qual são derivados.
[00048] Anticorpos monoclonais incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nesta invenção. Em um anticorpo quimérico, uma porção de uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve é idêntica ou ho- móloga a uma sequência correspondente do anticorpo derivado de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticor- pos particulares, e outra porção é idêntica ou homóloga a uma sequên- cia correspondente de outro anticorpo derivado de outra espécie parti- cular ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpos particulares.
[00049] Um "anticorpo humanizado" é uma classe específica de "an- ticorpos quiméricos". Uma forma "humanizada" de um anticorpo não hu- mano (por exemplo, roedor) refere-se a um anticorpo quimérico que compreende minimamente sequências derivadas de um anticorpo não humano. Em grande grau, anticorpos humanizados referem-se a imu- noglobulinas em que os resíduos da região hipervariável de imunoglo-
bulinas humanas (anticorpos receptores) são substituídos pelos resí- duos da região hipervariável de espécies não humanas (anticorpos do- adores) tais como camundongos, ratos, coelhos ou primatas não huma- nos que têm a especificidade, afinidade e capacidade desejada de anti- corpos. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, um anticorpo humanizado pode compre- ender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são efetuadas para melhorar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo huma- nizado compreenderá pelo menos um, tipicamente dois, substancial- mente todos os domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos laços hipervariáveis de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as FRs são a FR de sequências de imunoglobulinas humanas. O anti- corpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção da região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente uma região constante de uma imunoglobulina humana. Anticorpos hu- manizados podem ser obtidos a partir de anticorpos derivados de ca- mundongo produzidos pela imunização de camundongos por meio de projeto de simulação de computador em combinação de tecnologia de exibição de fagos.
[00050] O termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou é pro- duzido usando qualquer técnica conhecida no estado da técnica para a geração de anticorpos humanos. Anticorpos humanos excluem especi- ficamente anticorpos humanizados que compreendem resíduos de liga- ção com antígeno não humano. Os anticorpos humanos podem ser ge-
rados usando uma variedade de técnicas conhecidas no estado da téc- nica, incluindo bibliotecas de exibição de fagos.
[00051] "Afinidade de ligação" geralmente se refere à intensidade da soma de todas as interações não covalentes entre um sítio de ligação simples de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Conforme usado aqui, o termo "afi- nidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre um membro de um par de ligação (por exem- plo, um anticorpo e um antígeno), a menos que indicado de outro modo. A afinidade da molécula X por seu parceiro Y pode ser geralmente ex- pressa pela constante de dissociação (Kd). Anticorpos de baixa afini- dade tipicamente se ligam a antígeno lentamente e tendem a se disso- ciar facilmente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente se li- gam a antígeno muito mais rapidamente e tendem a manter ligação mais longa. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conheci- dos no estado da técnica, incluindo ensaios de ligação com antígeno radiomarcados (RIA).
[00052] "Sequência de controle" refere-se a uma sequência de DNA necessária para expressão de uma sequência de codificação operavel- mente ligada em um organismo hospedeiro particular. Por exemplo, se- quências de controle adequadas para procarióticas incluem um promo- tor, uma sequência operadora opcional e um sítio de ligação com ribos- somo. Células eucarióticas são sabidas utilizar promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.
[00053] Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" se estiver em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, se a sequência líder ou o DNA líder secretor é expresso como uma pró-proteína envolvida na secreção do polipeptídeo, ela é opera- velmente ligada ao DNA do polipeptídeo; se o promotor ou intensificador afeta a transcrição da sequência de codificação, ele é operavelmente ligado à sequência; ou se a posição do sítio de ligação com ribossomo facilita a tradução, ela é operavelmente ligada à sequência de codifica- ção. Em geral, "operavelmente ligado" significa que as sequências de DNA ligadas são adjacentes, e, no caso de uma ponta-guia secretória, significa adjacente e em um estado legível. Entretanto, os melhoradores não têm que ser adjacentes. A ligação pode ser obtida por conexão em um sítio de restrição conveniente. Na ausência de tais sítios, adaptado- res ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.
[00054] "Vetor", conforme aqui usado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outros ácidos nucleicos aos quais ela está ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um laço de DNA de fita dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor de fagos. Outro tipo de vetor é um vetor viral no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, um vetor bacteriano que tem uma origem de replicação bac- teriana e um vetor de mamífero epissômico). Outros vetores (por exem- plo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma da célula hospedeira quando da introdução na célula hospe- deira, desse modo replicando juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operavelmente ligados. Tais vetores são refe- ridos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simples- mente "vetores recombinantes"). Tipicamente, vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante são frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" são usados de forma intercambiável, na medida em que o plasmídeo é a forma mais comum de vetor.
[00055] "Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" é usado de forma inter- cambiável aqui para se referir a um polímero de nucleotídeos de qual- quer comprimento, incluindo DNA e RNA. O nucleotídeo pode ser um desoxirribonucleotídeo, um ribonucleotídeo, um nucleotídeo ou base modificado, e/ou um análogo do mesmo, ou pode ser qualquer substrato incorporado no polímero por DNA ou RNA polimerase ou por uma rea- ção sintética. Polinucleotídeos podem compreender nucleotídeos modi- ficados, tais como nucleotídeos metilados e análogos dos mesmos. Mo- dificação da estrutura de nucleotídeo, se houver, pode ser realizada an- tes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeo pode ser interrompida por um componente não nucleotídeo. O polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a síntese, tal como por aco- plamento a um marcador.
[00056] "Oligonucleotídeo" refere-se geralmente a um polinucleotí- deo curto, tipicamente de filamento único, sintético, de um comprimento em geral, mas não necessariamente, menor do que cerca de 200 nucle- otídeos.
[00057] Conforme usado aqui, o termo "tumor" refere-se a uma con- dição fisiológica em um mamífero que é tipicamente caracterizado por crescimento celular desregulado. Os tumores podem ser divididos em tumores benignos e tumores malignos, e tumores malignos são também denominados cânceres. Os tumores podem ser divididos em tumores sólidos ou tumores hematológicos. Em certas modalidades de realiza- ção da presente invenção, a invenção refere-se, em particular, ao trata- mento de câncer do sistema hematopoiético ou cânceres relacionados com o sangue. Conforme usado aqui, "sistema hematopoiético" inclui timo e medula óssea e tecidos linfoides periféricos tais como o baço, nódulos linfáticos, tecidos linfoides associados à mucosa, tal como te- cido linfoide associado aos intestinos, amígdalas, emplastros de Peyer e outros anexos relacionados à mucosa e tecidos linfoides, tal como o revestimento brônquico. Assim, o câncer do sistema hematopoiético ou os cânceres relacionados com o sangue aqui descritos podem incluir linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfoides, assim como cân- ceres do baço e cânceres dos nódulos linfáticos. Exemplos mais espe- cíficos de cânceres do sistema hematopoiético ou cânceres relaciona- dos com o sangue incluem cânceres associados às células B, incluindo, por exemplo, linfomas avançados, intermediários e de baixo grau, inclu- indo linfomas de células B, tais como linfomas de células B de tecido linfoide associado à mucosa e linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma marginal, linfoma de células grandes difusas, linfoma folicular e linfoma de Hodgkin, e linfoma de células T; e leucemia, incluindo leucemia se- cundária, leucemia linfocítica crônica (CLL) tal como leucemia de célu- las B (linfócitos CD5+ B), leucemia mieloide tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide tal como leucemia linfocítica aguda (ALL) e displasia espinal; e outros cânceres relaciona- dos hematológicas e/ou relacionados com células B ou células T. Cân- ceres do sistema hematopoiético ou cânceres relacionados com o san- gue também incluem cânceres de outras células hematopoiéticas, inclu- indo leucócitos polimorfonucleares, tais como basófilos, eosinófilos, neutrófilos e monócitos, célula dendrítica, plaquetas, hemácias e células assassinas naturais. Especificamente, pode-se incluir distúrbio prolife- rativo de células B canceroso selecionado do grupo que consiste em linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recorrente, NHL recorrente indolor, NHL refratário, NHL refratário indolor, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) e linfoma de células do manto.
[00058] Aqui, o câncer também inclui câncer, blastoma e sarcoma.
Assim, outros exemplos de câncer incluem carcinoma de células esca- mosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de célu- las escamosas pulmonares, câncer peritoneal, carcinoma hepatocelu- lar, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatossarcoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial ou câncer uterino, câncer de glândula salivar, câncer de rim, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tiroide e vários tipos de cânceres de cabeça e pescoço, etc.
[00059] "Tratamento" ou "alívio" refere-se ao alívio (redução) ou cura da condição patológica ou distúrbio dirigido a ela. Se um paciente apre- sentar uma diminuição ou desaparecimento observável e/ou mensurá- vel em um ou mais dos seguintes após receber uma quantidade tera- pêutica de um anticorpo anti-CD79b de acordo com o método aqui des- crito, o indivíduo "trata" com êxito os tumores (especialmente câncer) que expressam o polipeptídeo CD79b: número reduzido de células de tumor ou desaparecimento de células de tumor; volume de tumor redu- zido; inibição de infiltração de células de tumor; inibição de metástase de tumor; inibição de crescimento de tumor em um certo grau; e/ou o alívio de um ou mais sintomas associados a tumores específicos até certo ponto; redução na morbidez e mortalidade; e a melhoria da quali- dade de vida. No caso em que o anticorpo anti-CD79b impede o cresci- mento das células tumorais e/ou mata as células tumorais existentes, ele pode eliminar células e/ou células venenosas. O alívio desses sinais ou sintomas pode também ser sentido pelo paciente.
[00060] "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma dose su- ficiente para indicar seu benefício ao indivíduo ao qual é administrada. A quantidade real administrada, assim como a taxa e o curso de tempo de administração, dependerá da condição e gravidade do indivíduo que está sendo tratado. A prescrição para o tratamento (por exemplo, a de- terminação da dose etc.) é finalmente a responsabilidade do GP e ou- tros médicos e depende deles para tomar decisões, usualmente consi- derando a doença que é tratada, a condição do paciente individual, o sítio de distribuição, o método de administração e os outros fatores co- nhecidos pelos médicos. No caso de tumores, a quantidade terapeuti- camente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de tumor; reduzir o volume do tumor; inibir a infiltração de células de câncer em órgãos circundantes; inibir metástase do tumor; inibir crescimento do tu- mor em certo grau; e/ou reduzir um ou mais sintomas relacionados com tumores até certo ponto. Por "quantidade profilaticamente eficaz" en- tenda-se uma quantidade eficaz para atingir o efeito profilático desejado na dose e tempo necessários. Usualmente, mas não necessariamente, uma vez que a dose profilática é administrada ao indivíduo antes do início da doença ou no início da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00061] A "quantidade inibidora de crescimento" de um anticorpo anti-CD79b refere-se a uma quantidade capaz de inibir o crescimento de células, particularmente tumores, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. A "quantidade de inibição de crescimento" do anticorpo anti- CD79b a fim de inibir o crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de uma maneira convencional.
[00062] A "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-CD79b refere- se a uma quantidade capaz de causar destruição de células, particular- mente células de tumor, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. A "quantidade citotóxica" do anticorpo anti-CD79b a fim de inibir o cres- cimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de uma maneira convencional.
[00063] Conforme usado aqui, "indivíduo" ou "sujeito" refere-se a um vertebrado. Em certas modalidades de realização da presente invenção,
o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados aos mesmos, animais de criação (tal como gado), animais de esporte, animais de estimação (tais como gatos, cães e cavalos), prima- tas, camundongos e ratos. Preferivelmente, o mamífero refere-se a um ser humano.
[00064] A administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui (co)administração simultânea e administra- ção sequencial em qualquer ordem.
[00065] Com relação a "identidade de sequência" de uma sequência de polipeptídeo de referência, ela é definida como quando se alinha a sequência e introduz espaço se necessário para obter identidade de se- quência percentual máxima, e sem considerar qualquer substituição conservativa como parte de identidade de sequência, a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata é idêntica à dos resí- duos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência. Com- parações com o propósito de determinar a porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos podem ser realizadas de vários modos dentro da habilidade do estado da técnica, por exemplo, usando sof- tware de computador publicamente disponível tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqui incluídas es- tão as sequências de aminoácidos com pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, de identi- dade de sequência com a região variável de cadeia leve, região variável de cadeia pesada ou cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo (em es- pecial as sequências individuais especificamente citadas aqui) como descrito nesta invenção. Preferivelmente, mutações podem ser feitas nos anticorpos anti-CD79b descritos aqui, por exemplo, usando qual- quer uma das técnicas e diretrizes para mutações conservativas e não conservativas como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 5.364.934.
Em certas modalidades de realização da presente invenção, a variação não ocorre nas CDRs apresentadas aqui como SEQ ID NOs: 1-6. A va- riação pode ser substituição, supressão ou inserção de um ou mais có- dons que codificam um anticorpo ou polipeptídeo que resulte em uma mudança na sequência de aminoácidos em relação ao anticorpo de se- quência nativa. Opcionalmente, a variação é a substituição de pelo me- nos um aminoácido em um ou mais domínios do anticorpo anti-CD79b por qualquer outro aminoácido. Comparando a sequência de anticorpo anti-CD79b com a sequência de uma molécula de proteína conhecida homóloga e minimizando o número de alterações de sequência de ami- noácidos feitas na região altamente homóloga, podem ser verificados os princípios segundo os quais resíduos de aminoácidos podem ser in- seridos, substituídos ou suprimidos sem efeito adverso sobre a atividade esperada. Substituições de aminoácido podem ser o resultado de subs- tituição de um aminoácido por outro aminoácido com propriedades es- truturais e/ou químicas similares, tal como substituição de leucina por serina, isto é, substituição de aminoácido conservativa. Inserções ou eli- minações podem opcionalmente estar na faixa de cerca de 1 a 5 ami- noácidos. Uma variação tolerável pode ser determinada pela realização sistemática de inserções de aminoácidos, substituições ou supressões na sequência e teste das variantes resultantes em relação a atividade exibida pelo comprimento total ou sequências nativas maduras.
[00066] A variação pode ser realizada usando métodos conhecidos no estado da técnica, tais como mutagênese mediada por oligonucleo- tídeo (dirigida a sítio), varredura de alanina e mutagênese por PCR. O DNA clonado pode ser submetido a mutagênese direcionada a sítio, mu- tagênese de cassete, mutagênese seletiva de restrição ou outras técni- cas conhecidas para produzir DNA variante de anticorpo anti-CD79b.
[00067] Qualquer resíduo de cisteína que não esteja envolvido na manutenção da conformação correta do anticorpo anti-CD79b também pode ser substituído, usualmente por serina, para melhorar a estabili- dade oxidativa da molécula e impedir reticulação aberrante. Pelo con- trário, a ligação de cisteína pode ser adicionada a um anticorpo anti- CD79b para melhorar a sua estabilidade (especialmente quando o anti- corpo é um fragmento de anticorpo tal como um Fragmento Fv).
[00068] Em certas modalidades de realização da presente invenção, uma variante substituta envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável do anticorpo original (por exemplo, anticorpos humanizados ou humanos). Em geral, as variantes resultantes selecio- nadas para desenvolvimento adicional terão propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo original a partir do qual elas são produzidas. Um método conveniente de gerar tais variantes substitutas envolve maturação de afinidade usando exibição de fagos.Resumida- mente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para produzir todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são exibidas em uma forma monovalente sobre as partículas de fago filamentosas como uma fusão com o produto M13 Gene III embalado dentro de cada partí- cula. As variantes de exibição de fagos são então selecionadas para atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). Para identificar sítios de região hipervariável candidatos a modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de re- gião hipervariável que têm contribuições importantes para ligação com antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, a estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo é analisada para identificar o ponto de contato entre o anticorpo e o polipeptídeo CD79b. Esses resíduos de contato e resíduos adjacentes são sítios candidatos que são substituí- dos de acordo com as técnicas detalhadas aqui. Uma vez produzidas tais variantes, o painel de variantes é selecionado como descrito aqui, e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais dos ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional. O termo "agente citotóxico" refere-se a uma substância que inibe ou im- pede a função das células e/ou causa destruição das células. O termo inclui: radioisótopos tais como isótopos radioativos de At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e Lu; agentes quimioterápicos tais como metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (tais como vincristina, vin- blastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambu- cil ou daunorrubicina; enzimas e seus fragmentos, tais como lisozima; antibióticos; e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou to- xinas ativas enzimáticas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou ani- mal, incluindo fragmentos e/ou suas variantes; e fármacos antitumorais ou anticâncer bem conhecidos no estado da técnica.
[00069] "Composição farmacêutica" significa uma combinação de pelo menos um fármaco e, opcionalmente, um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável que são combinados juntamente para atin- gir um propósito particular. Em certas modalidades de realização da pre- sente invenção, as composições farmacêuticas incluem combinações que são separadas no tempo e/ou espaço, desde que sejam capazes de atuar juntamente para atingir os objetivos da presente invenção. Por exemplo, os componentes contidos na composição farmacêutica (por exemplo, anticorpos, moléculas de ácido nucleico, combinações de mo- léculas de ácidos nucleicos e/ou conjugados descritos aqui) podem ser administrados ao indivíduo como um todo ou separadamente. Quando os componentes contidos na composição farmacêutica são administra- dos separadamente a um indivíduo, os componentes podem ser admi- nistrados ao indivíduo simultaneamente ou sequencialmente. Preferivel- mente, o portador farmaceuticamente aceitável é água, uma solução aquosa tamponada, uma solução salina isotônica tal como PBS (tampão de fosfato), glicose, manitol, dextrose, lactose, amido, estearato de mag-
nésio, celulose, carbonato de magnésio, glicerol a 0,3%, ácido hialurô- nico, etanol ou polialquilenoglicóis tal como polipropilenoglicol, triglicerí- deos e similares. O tipo de portador farmaceuticamente aceitável em- pregado depende especialmente de se a composição de acordo com a invenção é formulada para administração oral, nasal, intradérmica, sub- cutânea, intramuscular ou intravenosa. A composição de acordo com a invenção pode compreender um agente umectante, um emulsificante ou uma substância tampão como aditivo.
[00070] A composição farmacêutica aqui descrita pode ser adminis- trada por qualquer via adequada, por exemplo, oral, nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa.
[00071] Proporcionados aqui são anticorpos anti-CD79b ou seus fra- gmentos funcionais, composições farmacêuticas ou conjugados anticor- pos-fármacos destes, e métodos de uso dos mesmos no tratamento de tumores hematopoiéticos.
[00072] Os anticorpos nesta invenção são anticorpos que se ligam especificamente ao uso de CD79b no tratamento de tumores, e podem ser anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos (incluindo Frag- mentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv), diacorpos, anticorpos de domínio único, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia simples ou anticorpos que inibem competitivamente a ligação de um an- ticorpo de polipeptídeo anti-CD79b com seu epítopo antigênico corres- pondente. Os anticorpos descritos aqui podem opcionalmente ser con- jugados com um agente citotóxico, tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, auristatina, maytansinoides, derivados de dolastatina ou cali- queamicina, antibióticos, radioisótopos, lisozimas e similares. Os anti- corpos descritos aqui podem opcionalmente ser produzidos em células CHO ou células bacterianas, e preferivelmente induzem a morte celular nas células ligadas aos mesmos. Para propósitos de detecção, os anti-
corpos descritos aqui podem ser marcados de forma detectável e liga- dos a um suporte sólido.
[00073] O anticorpo anti-CD79b desta invenção compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todas as seis sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-6. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CD79b desta invenção compreende qualquer uma, quaisquer duas ou todas as três sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1-3, e/ou a região variável de cadeia leve do mesmo compreende qualquer uma, quais- quer duas ou todas as três sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4-6. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a região variável de cadeia pesada do anticorpo CD79b desta invenção compreende as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-3, e/ou a região variável de cadeia leve da mesma compreende as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 4-6. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a região variá- vel de cadeia pesada de um anticorpo anti-CD79b aqui compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 1-3, e a re- gião variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 4-6. Em certas modalidades de realiza- ção da presente invenção, o anticorpo anti-CD79b aqui compreende: HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1; HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3; LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4; LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5; e LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades de realização da presente invenção, o anticorpo anti-CD79b aqui compreende as se- quências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-6.
[00074] Em certas modalidades de realização da presente invenção, o anticorpo aqui é anticorpo murino 104E1, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada da mesma pode ser apresentada na SEQ ID NO: 7, e/ou a sequência de aminoácidos de sua região vari- ável de cadeia leve pode ser conforme apresentada na SEQ ID NO: 8.
[00075] Em certas modalidades de realização da presente invenção, o anticorpo é um anticorpo humanizado, em que pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todos as seis sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1-6 são usadas para substituir as regiões CDR correspondentes na região vari- ável de cadeia pesada e/ou na região variável de cadeia leve de anti- corpo humano. Em certas modalidades de realização da presente in- venção, a sequência de aminoácidos usada para preparar a região va- riável de cadeia pesada do anticorpo humanizado é apresentada em SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos usada para preparar a região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado é como apre- sentada em SEQ. ID NO: 10. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado descrito aqui é apresentada em SEQ ID NO: 11, e/ou a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado é como SEQ ID NO: 12.
[00076] Em certas modalidades de realização da presente invenção, a fim de encontrar uma posição de aminoácido na região FR murina que desempenha um papel importante na afinidade do anticorpo, a base de dados PDC é pesquisada em relação a uma estrutura de cristal similar em homologia ao anticorpo murino 104E1 descrito nesta invenção. Como resultado, foi encontrada a estrutura de cristal scFv do anticorpo antipolisiálico Ab735, que tem uma homologia de 77% com a sequência do anticorpo 104E1 e tem uma resolução suficientemente alta.
Nesta invenção, usando esse cristal como um gabarito estrutural, as duas se- quências foram comparadas para estabelecer um modelo de homologia dos scFvs de 3 WBD do anticorpo 104E1. De acordo com esse modelo homólogo, foram encontrados sítios de aminoácidos no domínio FR da sequência 104E1 que foram circundados pelo domínio CDR, ou dentro da distância do domínio CDR menor que 5 Å, então esses sítios de ami- noácidos que podem desempenhar um papel importante na afinidade do anticorpo foram alterados em sentido inverso nas sequências enxer- tadas em CDR (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12), enquanto se evitava glicosilação, desamidação, sítios de oxidação etc.
Um total de 15 sítios que podem precisar ser alterados de forma inversa foi identificado na região variável de cadeia pesada, incluindo A24T, RV67KA, S84R, T98K, K12A, S16A, V20L, A24T, R38K, M48I, V68A, I70L, Y95F, T98K E V113L; um total de sete sítios que podem precisar ser mutados inver- samente foi identificado na região variável de cadeia leve, incluindo V3L, F41Y, RR50KL, FQ1YL, R51L, V88L e V109L.
Bibliotecas de Fab foram então construídas de acordo com o protocolo padrão de Kingsley e se- lecionadas pela plataforma de exibição de fagos.
As sequências após humanização com uma afinidade não menor que a do anticorpo 104E1 murino foram selecionadas e sequenciadas para confirmação de se- quência.
Consequentemente, em certas modalidades de realização da presente invenção, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CD79b descrito aqui pode ser selecio- nada a partir das sequências de aminoácidos apresentadas em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 13-17, e/ou a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do mesmo pode ser selecionada a partir das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-22. A presente invenção também inclui sequências de região variável de cadeia pesada com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, de identidade de sequência com as regiões variáveis de cadeia pesada, e sequências de região variável de cadeia leve com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, de identidade de sequência com as regiões variáveis de cadeia leve. Em certas modali- dades de realização da presente invenção, mutações na região variável de cadeia pesada e na região variável de cadeia leve ocorrem dentro da FR e não nas CDRs.
[00077] Os anticorpos descritos aqui podem também conter uma re- gião constante. A região constante pode ser a região constante de IgM, IgD, IgG, IgA e IgE humanas. Por exemplo, a região constante pode ser a região constante de IgG1, IgG2, IgG3, lgG4, IgA1 ou IgA2humanas. Em certas modalidades de realização da presente invenção, a cadeia pesada de um anticorpo anti-CD79b descrito aqui compreende uma re- gião variável de cadeia pesada e uma região Fc de cadeia pesada como descrito aqui, a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve e uma região Fc de cadeia leve como descrito aqui. A sequência de aminoácidos de uma região Fc de cadeia pesada exemplar pode ser conforme apresentada na SEQ ID NO: 23, e a sequência de aminoáci- dos de uma região Fc de cadeia leve exemplar pode ser conforme apre- sentada na SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades de realização da presente invenção, uma região Fc de cadeia pesada adequada para uso na invenção compreende ainda uma região Fc de cadeia pesada com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 23, e/ou a região Fc de cadeia leve adequada para uso na in- venção compreende ainda uma região Fc de cadeia leve com pelo me- nos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos como apresentado em SEQ ID NO:
24. Preferivelmente, mutações conhecidas no estado da técnica que al- teram a função efetora da região Fc podem ocorrer nas regiões Fc de cadeia pesada e/ou leve. Por exemplo, uma região Fc com função efe- tora reduzida tem uma mutação por substituição em um ou mais dos resíduos 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (ver US 6.737.056). Uma ou mais substituições de aminoácidos com ADCC melhorada podem ocorrer nos resíduos 298, 333 e/ou 334 da região Fc (resíduos são nu- merados por numeração EU).
[00078] Em certas modalidades de realização da presente invenção, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um anticorpo anti- CD79b descrito aqui pode ser selecionada a partir de sequências de aminoácidos que têm pelo menos 90%, preferivelmente 95%, de identi- dade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31 e 33, e/ou a sequência de aminoácidos de sua cadeia leve pode ser selecionada de pelo menos 90%, preferivelmente 95%, de identidade de sequência com a sequên- cia de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32 e 34.
[00079] Consequentemente, em certas modalidades de realização da presente invenção, um anticorpo anti-CD79b é selecionado do grupo que consiste em: (1) o anticorpo cuja sequência de aminoácidos da ca- deia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 25, e a sequência de ami- noácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 26; (2) o anti- corpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 27, e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 28; (3) o anticorpo cuja sequência de ami- noácidos da cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 29 e a se- quência de aminoácidos da cadeia leve é conforme mostrado em SEQ ID NO: 30; (4) o anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentado na SEQ ID NO: 31, e a sequência de aminoáci- dos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 32; e (5) o anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada na
SEQ ID NO: 33 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve é apre- sentada em SEQ ID NO: 34.
[00080] Também são proporcionadas aqui sequências de codifica- ção para CDRs, regiões variáveis de cadeia leve, regiões variáveis de cadeia pesada, cadeias leve e pesada, e sequências complementares das mesmas (sequências de ácidos nucleicos), vetores que compreen- dem as sequências de codificação ou suas sequências complementa- res, e uma célula hospedeira que contém o ácido nucleico ou vetor. Se- quências de codificação exemplares são apresentadas nas SEQ ID Nos: 36, 37, 38 e 39, que são as sequências de codificação das SEQ ID NOs: 33, 34, 7 e 8, respectivamente.
[00081] Técnicas recombinantes padrões podem ser usadas para obter sequências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou seus fragmentos funcionais aqui descritos. A sequência de polinucleotí- deo desejada pode ser isolada de células produtoras de anticorpos tais como células de hibridoma e ser sequenciada. Alternativamente, o poli- nucleotídeo pode ser sintetizado usando um sintetizador de nucleotídeo ou técnica de PCR. Uma vez obtida, a sequência que codifica o polipep- tídeo é inserida em um vetor recombinante capaz de replicar em um hospedeiro procariótico e expressar o polinucleotídeo heterólogo. Para os propósitos da presente invenção, pode ser usada uma variedade de vetores disponíveis e conhecidos no estado da técnica. A escolha de um vetor adequado dependerá principalmente do tamanho do ácido nu- cleico a ser inserido no vetor e na célula hospedeira particular na qual o vetor será transformado. Cada vetor contém uma variedade de blocos de construção dependendo de sua função (amplificação ou expressão do polinucleotídeo heterólogo, ou ambas) e de sua compatibilidade com a célula hospedeira particular na qual reside.
[00082] O vetor pode estar na forma de, por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, uma partícula viral ou um bacteriófago. A sequência de ácido nucleico adequada pode ser inserida no vetor por uma variedade de métodos. Tipicamente, a sequência de DNA de interesse é inserida em um sítio de endonuclease de restrição adequado usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Os componentes de vetor tipicamente incluem, mas não estão limitados aos mesmos, um ou mais dos seguin- tes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma se- quência de terminação de transcrição. Portadores adequados que com- preendem um ou mais desses componentes podem ser construídos usando técnicas de ligação padrões conhecidas por aqueles versados no estado da técnica. O vetor pode ser um vetor de clonagem ou um vetor de expressão.
[00083] CD79b pode ser produzido não apenas diretamente por re- combinação, mas também como um polipeptídeo de fusão com um po- lipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo que tem um sítio de clivagem específico no término N da proteína ou polipeptídeo maduro. Tipicamente, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser parte do DNA que codi- fica o anticorpo anti-CD79b inserido no vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada de, por exemplo, fosfatase alcalina, penicilinase, 1pp ou uma sequência líder de entero- toxina II termoestável. Para secreção de levedura, a sequência de sinal pode ser, por exemplo, uma sequência líder de invertase de levedura, uma sequência líder de fator alfa (incluindo a sequência líder de fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces) ou uma sequência líder de fosfatase ácida, uma sequência líder de glicoamilase de Can- dida albicans etc. Na expressão de células de mamíferos, sequências de sinal de mamífero podem ser usadas para direcionar a secreção de proteína, tais como sequências de sinal de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou espécies relacionadas, assim como sequências líder de secreção viral.
[00084] Geralmente, os vetores de expressão de mamíferos não exi- gem o componente de origem de replicação. Por exemplo, a origem SV40 pode usualmente ser usada simplesmente porque ela contém um promotor precoce. Vetores de expressão e clonagem tipicamente con- terão um gene de seleção, também referido como marcador de seleção. Um gene de seleção típico codifica uma proteína que: (a) confere resis- tência a um antibiótico ou outra toxina, tal como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b) complementos auxotróficos; ou (c) for- nece nutrientes-chaves não capazes de serem obtidos de um meio com- plexo, tal como um gene que codifica uma D-alanina racemase para Ba- cillus.
[00085] Um exemplo de um protocolo de seleção utiliza fármacos para bloquear o crescimento de células hospedeiras. Aquelas células que foram transformadas com sucesso por um gene heterólogo produ- zem uma proteína que confere resistência ao fármaco e são assim pou- padas do protocolo de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
[00086] Vetores de expressão e clonagem tipicamente compreen- dem um promotor operavelmente ligado a uma sequência de ácido nu- cleico que codifica um anticorpo anti-CD79b para direcionar a síntese de mRNA. Os promotores que são reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Exemplos de se- quências promotoras adequadas para uso em hospedeiros de leveduras incluem promotores de 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glico- líticas tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexo- cinase, piruvato descarboxilase fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato iso- merase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triose fosfato isome- rase, fosfoglutarato isomerase e glicocinase.
[00087] Transcrição de anticorpos anti-CD79b por vetores em células hospedeiras de mamíferos está sob o controle de promotores obtidos a partir de, por exemplo, vírus (por exemplo, poliomavírus, vírus da varí- ola, adenovírus (por exemplo, adenovírus tipo 2), vírus de papiloma bo- vino, vírus de sarcoma de ave, citomegalovírus, retrovírus, vírus da he- patite B e vírus símio 40 (SV40)), promotores de mamíferos heterólogos (tais como promotores de actina ou promotores de imunoglobulina), e promotores de choque térmico. Em certas modalidades de realização da presente invenção, são usados os promotores precoce e tardio do vírus SV40, que adicionalmente compreendem uma origem viral SV40 de replicação.
[00088] A transcrição do DNA que codifica um anticorpo anti-CD79b por células eucarióticas superiores pode ser aumentada pela inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Um intensificador é um ele- mento de atuação cis de DNA, usualmente de cerca de 10 a 300 pb, que atua sobre um promotor para aumentar a transcrição. Muitas sequên- cias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastase, albu- mina, alfa-fetoproteína e insulina) são conhecidas. Entretanto, intensifi- cadores de vírus eucarióticos são comumente usados. Exemplos in- cluem o intensificador no lado tardio da origem de replicação de SV40 (100-270 pb), o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador no lado tardio da origem de replicação de poliomavírus, e intensificadores de adenovírus. O intensificador pode ser emendado no vetor na posição 5' ou 3' da sequência de codificação de anticorpo anti-CD79b, mas é preferivelmente localizado na posição 5' do promo- tor.
[00089] Vetores de expressão para uso em células hospedeiras eu- carióticas (levedura, fungos, insetos, plantas, animais, células humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para terminação de transcrição e para estabili- zação de mRNA. Tais sequências são tipicamente obtidas a partir da extremidade 5' e da extremidade 3' ocasional da região não traduzida eucariótica ou de DNA viral ou cDNA. Essas regiões compreendem seg- mentos de nucleotídeos transcritos em fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo anti-CD79b. Um membro de terminação de transcrição útil é a região de poliadenila- ção do hormônio do crescimento bovino.
[00090] Vetores contendo as sequências de ácido nucleico descritas aqui podem ser transferidos para uma célula hospedeira usando méto- dos bem conhecidos no estado da técnica. As técnicas adequadas para transferir ácidos nucleicos para células hospedeiras in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão de células, DEAE-dextrano, precipitação de fosfato de cálcio e similares.
[00091] A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica e uma célula eucariótica. Procariotas adequadas incluem, mas não são limita- das, arqueia e eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, tais como Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacter, Er- winia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como Salmonella typhimu- rium, Serratia tal como Serratia marcescans, Shigella e Bacillus tais como B. subtilis e Bacillus licheniformis, Pseudomonas tal como P. ae- ruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Streptomyces.
[00092] Anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpos e proteínas de fusão de anticorpos podem ser preparados em bactérias, particularmente quando funções de glicosilação e efetoras Fc não são exigidas, tal como quando um anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o próprio imunoconju- gado mostra a eficácia de destruição da célula tumoral. Os anticorpos de comprimento total têm uma meia-vida mais longa na circulação. A preparação em E. coli é mais rápida e mais econômica. Para a expres- são de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523, que descrevem regiões de iniciação de tradução (TIR) e sequências de sinal para otimi- zar a expressão e a secreção. Após a expressão, o anticorpo é isolado da pasta de células de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purifi- cado, por exemplo, por uma coluna de proteína A ou G, com base em seu isótipo. Purificação final pode ser realizada usando métodos simila- res àqueles usados para purificação de anticorpos expressos, por exem- plo, em células de CHO.
[00093] Microrganismos eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são também hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para vetores que codificam anticorpos anti-CD79b. Saccha- romyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces e similares.
[00094] Células hospedeiras adequadas para expressão de um anti- corpo anti-CD79b glicosilado são derivadas de um organismo multicelu- lar. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos tais como Drosophila S2 e Nocidae Sf9, e culturas de células vegetais tais como algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, tabaco. Várias cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insetos per- missíveis correspondentes que foram identificadas são derivadas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes al- bopictus, Drosophila melanogaster e Bombyx mori.
[00095] Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífe- ros úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco (COS-7, ATCC CRL1651) transformada com SV40, linhagem de rim embrionário hu- mano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão), células de rim de hamster bebê (BHK, ATCCCCL10), célu- las de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO), células de Sertoli de ca-
mundongo (TM4), células de rim de macaco (CV1, ATCCCCL70), célu- las de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCCCRL-1587), cé- lulas de câncer cervical humano (HELA, ATCCCCL2), células de rim canino (MDCK, ATCCCCL34), hepatócitos buffalorat (BRL3A, ATCCCRL1442), células pulmonares humanas (W138, ATCCCCL75), hepatócitos humanos (HepG2, HB8065), tumor de mama de camun- dongo (MMT060562, ATCCCCL51), células TRI, células MRC5, células FS4 e hepatossarcoma humano (HepG2).
[00096] Células hospedeiras para a produção dos anticorpos anti- CD79b descritos aqui podem ser cultivadas em vários meios sob condi- ções de cultura bem conhecidos no estado da técnica.
[00097] Várias formas de anticorpos anti-CD79b podem ser recupe- radas do caldo de cultura ou dos lisados de células hospedeiras. Se ligado à membrana, ele pode ser liberado da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton-X100) ou por lise en- zimática. As células usadas na expressão de anticorpos anti-CD79b po- dem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico ou agentes de lise.
[00098] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxiapa- tita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade. Uma téc- nica de purificação preferida é cromatografia por afinidade. Dependendo do anticorpo a ser recuperado, outras técnicas de purificação de prote- ína também podem ser usadas, tais como fracionamento em uma co- luna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cro- matografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSETM, cro- matografia sobre resina de troca aniônica ou catiônica (por exemplo, coluna de ácido poliaspártico), focalização cromatográfica, SDS-PAGE e precipitação em sulfato de amônio.
[00099] Em outro aspecto, são proporcionados aqui imunoconjuga- dos ou conjugados anticorpos-fármacos (ADCs) que compreendem um anticorpo conjugado com um agente citotóxico, e métodos de uso e pre- paração dos mesmos. Agentes citotóxicos adequados para uso na pre- sente invenção podem ser fármacos (por exemplo, fármacos quimiote- rápicos), inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas enzi- maticamente ativas ou seus fragmentos de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal) ou radioisótopos (isto é, radioconjugados). Tipica- mente, o imunoconjugado compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD79b acima ligados covalentemente a um agente citotóxico ou detectável.
[000100] Conforme usado aqui, "fármaco" refere-se a qualquer com- posto com atividade biológica desejável. Atividades biológicas desejá- veis incluem diagnóstico, cura, alívio, tratamento, prevenção de doen- ças em humanos ou outros animais. Assim, o termo "fármaco" refere-se a compostos que são reconhecidos por farmacopeia nacional oficial, bem como, por exemplo, a Farmacopeia Homeopática Oficial dos EUA, o Formulário Nacional Oficial ou qualquer de seus suplementos. Fárma- cos típicos são listados na referência de medicação de mesa do médico (PDR) e no Livro Laranja da US Food and Drug Administration (Admi- nistração de Alimentos e Medicamentos dos EUA) (FDA). Como novos fármacos continuam a ser descobertos e desenvolvidos, esses fárma- cos também devem ser incluídos nos pró-fármacos conjugados com fár- macos descritos aqui. Preferivelmente, o fármaco tem um grupo funcio- nal reativo de modo que ele possa ser usado para preparar um conju- gado como descrito nesta invenção.
[000101] Fármacos exemplares adequados para uso nesta invenção incluem, mas não estão limitados aos mesmos, fármacos citotóxicos para tratamento de câncer; proteínas ou polipeptídeos que têm ativida- des biológicas desejadas, tais como toxinas, tal como toxina de acácia,
ricina A, exotoxina de pseudomonas e toxina de difteria. Outras proteí- nas adequadas incluem fator de necrose tumoral, alfa-interferon, beta- interferon, fator de crescimento neurogênico, fator de crescimento deri- vado de plaquetas, fator de crescimento de plasminogênio do tipo tecido e agentes de modulação de resposta biológica, tais como linfocinas, in- terleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator esti- mulante de colônia de macrófagos de granulócitos (GM-CSF), Fator es- timulante de colônia de granulócitos ou outros fatores de crescimento.
[000102] Fármacos exemplares incluem: maytansina; maitansinoide; fármacos de aurostatina (tais como monometila auristatina E (MMAE) e monometilauristatina F (MMAF)); caliqueamicinas (tais como caliquea- micina); doxorricinas (tais como doxorrubicina); antibióticos de benzodi- pirrol (tais como duocarmicinas, CC-1065 etc.) e outros derivados de ciclopropilpirrol-4-ona (CPI), tal como um análogo de ciclopropilbenzoi- ndol-4-ona, tal como: e pirrolbenzodiazepinas (PBDs) ou dímeros de PBDs, tais como:
[000103] O anticorpo pode ser acoplado ao fármaco diretamente ou por meio de um ligante. Os ligantes podem ser divididos em duas clas- ses: ligantes não cliváveis e ligantes cliváveis. Para um conjugado anti- corpo-fármaco que compreende um ligante não clivável, o mecanismo de liberação de fármaco é: após o conjugado ligar-se ao antígeno e ser internalizado pela célula, o anticorpo é hidrolisado no lisossomo e a mo- lécula ativa composta de fármaco de moléculas pequenas, ligante e re- síduo de aminoácido do anticorpo é liberada.
A mudança resultante na estrutura molecular do fármaco não reduz sua citotoxicidade, mas uma vez que a molécula ativa é carregada (resíduos de aminoácido), ela não pode se infiltrar em células adjacentes.
Portanto, tais fármacos ativos não podem matar células de tumor adjacentes que não expressam an- tígeno alvo (células negativas a antígenos) (efeito espectador) (Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21: 5-13). Um ligante clivável pode clivar- se dentro da célula-alvo e liberar o fármaco ativo.
Ligantes cliváveis po- dem ser divididos em duas classes principais: ligantes quimicamente instáveis e ligantes lábeis a enzimaa.
Os ligantes quimicamente instá- veis podem clivar-se seletivamente devido às diferenças nas proprieda- des plasmáticas e citoplasmáticas.
Tais propriedades incluem pH, con- centração de glutationa e similares.
Ligantes sensíveis ao pH, frequen- temente referidos como ligantes cliváveis por ácido, são relativamente estáveis no ambiente neutro do sangue (pH 7,3-7,5), mas serão hidroli- sados em endossomos fracamente ácidos (pH 5,0-6 5 ) e lisossomas (pH 4,5-5,0). Para ligantes sensíveis à glutationa, eles são também cha- mados ligantes de dissulfeto.
A liberação de fármaco é baseada na di- ferença entre a concentração elevada (em faixa milimolar) de glutationa intracelular e a concentração relativamente baixa de glutationa (na faixa micromolar) no sangue.
Isso é especialmente verdadeiro para células de tumor, em que baixos níveis de oxigênio resultam em aumento na atividade de reductase, resultando assim em maiores concentrações de glutationa.
As ligações dissulfeto são termodinamicamente estáveis e, portanto, têm melhor estabilidade no plasma.
Ligantes lábeis a enzimas, tais como ligantes de peptídeo, fornecem melhor controle de liberação de fármaco.
Ligantes de peptídeo podem ser clivados eficientemente por proteases tais como catepsina B ou plasmina (um aumento na quan- tidade dessas enzimas em alguns tecidos de tumor) em lisossomo. Acredita-se que essa ligação de peptídeo seja muito estável na circula- ção do plasma porque o pH extracelular e inibidores de protease do soro produzem proteases geralmente inativas. Em vista da alta estabilidade do plasma e boa seletividade e eficácia da clivagem intracelular, os li- gantes lábeis a enzimas são amplamente usados como ligantes clivá- veis para conjugados anticorpos-fármacos. Os ligantes lábeis a enzimas típicos incluem Val-Cit (vc), Phe-Lys e similares. Ligantes autodestruti- vos são tipicamente integrados entre o ligante clivável e o fármaco ativo, ou são eles próprios parte de um ligante clivável. O mecanismo de atu- ação do ligante autodestrutivo é aquele que quando o ligante clivável é clivado sob condições adequadas, o ligante suicida pode rearranjar es- pontaneamente a estrutura e liberar o fármaco ativo ligado à mesms. Os ligantes automolativos comuns incluem álcoois p-aminobenzílicos (PAB) e beta-glicuronídeos.
[000104] Um ligante pode compreender um ou mais membros ligan- tes. Por exemplo, em certas modalidades de realização da presente in- venção, a estrutura do ligante pode ser V-L, na qual o membro V pode ou não estar presente, como descrito abaixo para o membro ligante tri- dentado ou o membro ligante tetramaleimida; o membro L pode ser um ligante não clivável e um ligante clivável como descrito acima, tal como um ligante lábil ácido (por exemplo, hidrazina), um ligante sensível à protease (por exemplo, ligante sensível à peptidase), um ligante fotolá- bil, um ligante de dimetila ou ligantes que contêm dissulfeto e similares. Membros ligantes exemplares incluem 6-maleimidocaproíla, maleimido- propionilprolina-citrulina, alanina-fenilalanina, p-aminobenziloxicarbo- nila, N-succinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoato, N-succinimidil 4-(N-malei- midometil)cicloexano-1-carboxilato e N-succinimidil (4-iodoacetil)amino-
benzoato. Outros membros ligantes exemplares podem ainda ser ligan- tes que compreendem uma unidade de aminoácido para permitir a cli- vagem de protease, facilitando desse modo a liberação de fármaco do imunoconjugado após exposição à protease intracelular, tal como uma enzima lisossômica. Unidades de aminoácidos exemplares incluem, mas sem limitação, dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos e penta- peptídeos. Dipeptídeos exemplares incluem: valina-citrulina; alanina-fe- nilalanina; fenilalanina-lisina; ou N-metil-valina-citrulina. Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina e glicina-glicina-glicina.
[000105] Um elemento ligante tridentado (ou do tipo bismaleimida) exemplar pode ter a seguinte estrutura:
[000106] Um elemento ligante do tipo tetramaleimida exemplar pode ter a seguinte estrutura:
[000107] Outros exemplos de ligantes, fármacos ou ligantes-fármacos adequados podem ser encontrados em CN 103933575A e CN 107652219 A, incluindo, mas sem limitação, o ligante-fármaco como apresentado em conjugados anticorpos-fármacos H-1-vcMMAE, H-1- MMAF, H-3-vcMMAE, H-3-MMAF, H-4-vcMMAE, H-4-MMAF descritos em CN 103933575 A, e aqueles descritos em CN 107652219 A, nume- rados de 1-vcMMAE a 12-vcMMAE. Os conteúdos inteiros de ambos os pedidos são aqui incorporados como referência. Assim, em certas mo- dalidades de realização da presente invenção, um conjugado anticorpo- fármaco desta invenção pode ter a seguinte estrutura: A-(V-L-D)n em que A é um anticorpo aqui apresentado; V-L é um ligante; V pode ou não estar presente, e pode ser qualquer um dos membros ligantes tridentados ou o membro ligante tetramaleimida como descrito acima, e L é um ligante de clivagem ou um ligante não clivável; pelo menos um de V e L está presente; D é um agente citotóxico de interesse; n é um número inteiro de 1 a 4.
[000108] Em certas modalidades de realização da presente invenção, L é um ligante que compreende uma unidade de aminoácido como an- teriormente descrito para permitir a clivagem de protease.
[000109] Exemplos de conjugados anticorpos-fármacos exemplares nesta invenção podem ser encontrados nos exemplos do presente pe- dido, incluindo, mas não limitados aos mesmos, AS11259-ADC-001, AS11259-ADC-002, AS11259-ADC-003, AS11259-ADC-004, AS11259- ADC-005, AS11259-ADC-006, AS11259-ADC-007, AS11259-ADC-008, AS11259-ADC-010, AS11259-ADC-011 e AS11250-ADC-0012.
[000110] Em certas modalidades de realização da presente invenção, o imunoconjugado pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de radioisótopos está disponível para a produção de an- ticorpos radioconjugados. Exemplos incluem os radioisótopos de At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, P212 e Lu. Quando o imu- noconjugado é usado para detecção, ele pode conter um átomo radioa- tivo para estudos de cintigrafia, tais como Tc99m ou I123, ou um marcador de spin para formação de imagem por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética (MRI)), tais como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, car- bono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, césio, manganês ou ferro.
[000111] A radioatividade ou outros marcadores podem ser incorpora- dos no imunoconjugado de uma maneira conhecida. Por exemplo, pep- tídeos podem ser sintetizados biologicamente ou sintetizados por sín- tese química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos ade- quados que envolvem, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Os marcadores podem ser ligados via resíduos de cisteína no peptídeo, tais como Tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111. O Y-90 pode ser ligado via um resíduo de lisina.
[000112] Os ADCs nesta invenção podem ser preparados por várias rotas usando reações químicas orgânicas, condições e reagentes co- nhecidos por aqueles versados no estado da técnica, incluindo: (1) a reação de grupo nucleofílico do anticorpo com um reagente ligante bi- valente por meio de uma ligação covalente, formando um anticorpo-li- gante via ligação covalente, antes de reagir com o fármaco; e (2) a rea- ção do grupo nucleofílico da porção fármaco com o reagente ligante di- valente para formar um fármaco-ligante via uma ligação covalente, se- guido de reação com o grupo nucleofílico do anticorpo.
[000113] Os anticorpos, seus fragmentos funcionais ou seus conjuga- dos anticorpos-fármacos podem ser administrados por qualquer via apropriada para a condição a ser tratada, incluindo administração oral, parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intra- tecal e epidural.
[000114] Para a prevenção ou tratamento de uma doença, a dose apropriada do anticorpo, seu fragmento funcional ou seu conjugado an- ticorpo-fármaco descritos aqui (quando usados sozinhos ou em combi- nação com um ou mais outros agentes tais como fármacos quimioterá- picos), dependerá do tipo de doença, do tipo de anticorpo, seu frag-
mento funcional ou conjugado anticorpo-fármaco, da gravidade e pro- gressão da doença, da administração do anticorpo, seu fragmento fun- cional ou conjugado anticorpo-fármaco para propósitos profiláticos ou terapêuticos, tratamento prévio, do histórico clínico do paciente e res- posta a anticorpos, seus fragmentos funcionais ou conjugados anticor- pos-fármacos, e do julgamento do médico atendente.
Adequadamente, o anticorpo, seu fragmento funcional ou conjugado anticorpo-fármaco é administrado ao paciente, ou uma vez ou por uma série de tratamentos . Dependendo do tipo e da gravidade da doença, a dose candidata inicial administrada ao paciente pode ser de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 20 mg/kg) do anticorpo, seu fragmento funcional ou conjugado anticorpo-fármaco, por exemplo, por uma ou mais admi- nistrações separadas ou por infusão contínua.
Doses diárias típicas po- dem variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores descritos acima.
Para administrações repetidas que duram vá- rios dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é geralmente continuado até que os sintomas da doença sejam desejavelmente inibi- dos.
Dosagens exemplares de anticorpos, seus fragmentos funcionais ou conjugados anticorpos-fármacos podem variar de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.
Como tal, uma ou mais doses de anticorpo, seu fragmento funcional ou conjugado anticorpo-fármaco podem ser ad- ministradas ao paciente sob cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação dos mesmos). Essas doses po- dem ser administradas intermitentemente, por exemplo, semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de cerca de 2 a cerca de 20 doses, tal como cerca de seis doses de anticorpo ou imunoconjugado). Uma dose de carga inicial mais alta pode ser administrada seguida de uma ou mais doses mais baixas.
Um re- gime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg de anticorpo, seguida de uma dose de manutenção de cerca de 2 mg/kg por semana. Entretanto, outros regimes de dosagem também podem ser úteis. O curso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[000115] Além de administrar proteínas de anticorpo a um paciente, o presente pedido contempla a administração de anticorpos por terapia genética. O uso de terapia genética para gerar anticorpos intracelulares pode ser visto, por exemplo, em WO 96/07321. Existem dois métodos primários para permitir que ácidos nucleicos (opcionalmente compreen- didos em um vetor) entrem nas células de um paciente, isto é, in vivo e ex vivo. Para liberação in vivo, o ácido nucleico é tipicamente injetado diretamente no paciente no sítio onde o anticorpo é desejado. Para tra- tamento ex vivo, as células do paciente são colhidas, os ácidos nuclei- cos são introduzidos nas células isoladas e as células modificadas são administradas diretamente ao paciente ou, por exemplo, inseridas em uma membrana porosa e implantadas no paciente (ver, por exemplo, a Patente U.S. 4.892.538 e 5.283.187). Uma variedade de técnicas está disponível para introduzir ácidos nucleicos em células vivas. Essas téc- nicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para as células cultivadas in vitro ou em células in vivo do hospedeiro preten- dido. Técnicas adequadas para transferir ácidos nucleicos para células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, mi- croinjeção, fusão de células, DEAE-dextrano, precipitação em fosfato de cálcio e similares. Um vetor comumente usado para liberação ex vivo de genes é um retrovírus.
[000116] Técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo atual- mente preferidas incluem a transfecção pelo uso de vetores virais (tais como adenovírus, vírus do herpes simplex tipo I ou vírus adenoassoci- ado) e sistemas com base em lipídeos (lipídeos úteis para a transferên- cia de genes mediada por lipídeos são, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol).
[000117] Também são proporcionados aqui composições farmacêuti- cas que compreendem pelo menos um anticorpo anti-CD79b descrito nesta invenção e/ou pelo menos um imunoconjugado do mesmo e/ou pelo menos um conjugado anticorpo-fármaco anti-CD79b descrito aqui. Em certas modalidades de realização da presente invenção, uma com- posição farmacêutica compreende: (1) um anticorpo anti-CD79b desta invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo, e (2) um portador farma- ceuticamente aceitável. Em certas modalidades de realização da pre- sente invenção, a composição farmacêutica compreende: (1) um anti- corpo anti-CD79b desta invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo, e opcionalmente (2) pelo menos uma formulação terapêutica conhecida, tais como aquelas formulações terapêuticas que podem ser usadas no tratamento de doença mediada por CD79b.
[000118] Uma composição farmacêutica que compreende um anti- corpo anti-CD79b ou um conjugado anticorpo anti-CD79b-fármaco, como aqui usado, pode ser preparada em forma de dosagem liofilizada ou uma solução aquosa para armazenamento misturando o anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco de pureza desejada com um portador, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável opcional. Os portadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para o recipiente nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como acetato, Tris, fosfato, citrato e outros ácidos orgâni- cos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; clorexidina amônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butanol ou álcool benzílico); hidrocarbil parabeno tais como metilparabeno ou propilpara- beno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipep- tídeo de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); prote- ína, tal como proteína de soro, gelatina ou imunoglobulina; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina,
glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dex- trina; agentes quelantes tal como EDTA; modificadores de tonicidade tais como trealose e cloreto de sódio; sacarídeos, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; tensoativos tais como polissorbatos; con- traíons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEE®, PLURONICS® ou polietilenoglicóis (PEG). As formula- ções farmacêuticas para administração in vivo são geralmente estéreis. Isso é facilmente realizado por filtração através de um filtro estéril.
[000119] Os anticorpos anti-CD79b nesta invenção podem ser usados para tratar o tumor que expressa CD79b em um mamífero ou aliviar um ou mais sintomas do mesmo. Tais tumores incluem, mas não estão li- mitados aos mesmos, cânceres do sistema hematopoiético ou cânceres relacionados com o sangue, tais como linfomas, leucemias, mieloma ou malignidades linfoides, assim como cânceres do baço e cânceres dos nódulos linfáticos. Os tumores que expressam CD79b incluem particu- larmente cânceres associados às células B, cujos exemplos específicos incluem, por exemplo, linfomas de grau avançado, intermediário e infe- rior (incluindo linfomas de células B tais como, por exemplo, linfomas de células B de tecido linfoide associados à mucosa e linfomas não Hod- gkin, linfoma de células de manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de zona marginal, linfoma de células B grandes difu- sas, linfoma folicular e linfoma de Hodgkin, e linfoma de células T) e leucemia (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica tal como leucemia de células B (linfócitos CD5+ B), leucemia mieloide tais como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia lin- foide tais como leucemia linfocítica aguda e mielodisplasia). Câncer abrange qualquer um dos cânceres metastáticos mencionados anterior- mente. O anticorpo é capaz de se ligar a pelo menos uma porção das células tumorais que expressam um polipeptídeo CD79b em um mamí- fero. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo efetivamente rompe ou mata as células tumorais que expressam CD79b ou inibe o crescimento de tais células tumorais quando ligado ao poli- peptídeo CD79b na célula in vitro ou in vivo. Tais anticorpos incluem anticorpos anti-CD79b nus (não acoplados a qualquer agente). Anticor- pos nus com propriedades citotóxicas ou citostáticas podem também cooperar com agentes citotóxicos, tornando-os mais eficazes na des- truição de células tumorais. O anticorpo anti-CD79b pode ser tornado citotóxico mediante, por exemplo, acoplamento do anticorpo com um agente citotóxico para formar um imunoconjugado como descrito nesta invenção.
[000120] Também são proporcionados aqui artigos que compreendem uma substância útil para tratar, prevenir e/ou diagnosticar tumor que ex- pressa CD79b. O artigo compreende um recipiente e um rótulo ou in- serto de embalagem sobre ou associado ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos, frascos pequenos, seringas e similares. O recipiente pode ser feito de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar uma condição de tumor, e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa ou frasco de solução intravenosa que possui uma rolha perfurável por uma agulha hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na compo- sição é um anticorpo anti-CD79b da invenção. O rótulo ou inserto de embalagem indica que a composição é usada para tratar, prevenir e/ou diagnosticar um tumor. O rótulo ou inserto de embalagem também inclui instruções para administrar a composição de anticorpo a um paciente com um tumor, particularmente um câncer. Adicionalmente, o artigo de fabricação pode incluir um segundo recipiente que contém um tampão farmaceuticamente aceitável tal como água bacteriostática para injeção
(BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e so- lução de dextrose. Ele também pode incluir outros materiais exigidos de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, di- luentes, filtros, agulhas e seringas.
[000121] Também são proporcionados kits que podem ser usados para várias finalidades, tais como ensaios citotóxicos para células que expressam CD79b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptí- deos CD79b a partir de células. Para isolamento e purificação de CD79b, o kit pode compreender um anticorpo anti-CD79b conjugado com contas (por exemplo, contas de sefarose). Kits que compreendem anticorpos podem ser proporcionados para detecção in vitro e quantifi- cação de polipeptídeos CD79b, tal como em ELISA ou Western blotsDo mesmo modo que para o artigo, o kit inclui um recipiente e um rótulo ou inserto de embalagem sobre ou associado ao recipiente. O recipiente contém uma composição que compreende pelo menos um dos anticor- pos anti-CD79b desta invenção. Podem ser incluídos recipientes adici- onais nos quais estão, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controle. O rótulo ou inserto de embalagem pode fornecer uma descri- ção da composição bem como instruções para uso in vitro ou teste. Exemplos
[000122] A invenção é adicionalmente ilustrada abaixo em conjunto com modalidades específicas. Deve ser entendido que os exemplos não pretendem limitar o escopo da invenção. Os métodos experimentais nos exemplos a seguir que não especificam as condições específicas são usualmente realizados de acordo com condições convencionais ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Todas as rea- ções foram realizadas sob nitrogênio (exceto a reação de hidrogena- ção).
[000123] A menos que definido de outro modo, todos os termos pro-
fissionais e científicos aqui usados têm o mesmo significado que aque- les familiares àqueles versados no estado da técnica.
Além disso, quais- quer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos podem ser empregados nos métodos da invenção.
Os métodos e mate- riais aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos.
Abreviaturas Ab anticorpo ACN acetonitrila ADC conjugado anticorpo-fármaco BOC (Boc) terc-butoxicarbonila DCM diclorometano DIPEA di-isopropiletilamina DMF N,N-dimetilformamida ELISA ensaio imunossorvente ligado a enzima EtOAc acetato de etila Eq (eq) equivalente g grama HATU O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N-tetrametilureia he- xafluorofosfato HOSu N-hidroxissuccinimida HIC cromatografia de interação hidrofóbica HPLC cromatografia líquida de alto desempenho LC-MS cromatografia líquida-espectrometria de massa mAb anticorpo monoclonal min minuto mL mL MS espectrometria de massa nm nanômetro μL microlitros PE éter de petróleo rt temperatura ambiente Rt Tempo de retenção SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida SEC cromatografia de exclusão de tamanho TEA trietilamina TFA ácido trifluoracético THF tetraidrofurano
[000124] A não ser que especificado de outra forma, todos os reagen- tes anidros foram comprados diretamente do fornecedor e armazenados sob nitrogênio. Todos os outros reagentes e solventes comprados eram de alta pureza e não foram adicionalmente purificados antes do uso.
[000125] Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obti- dos em um espectrômetro de RMN Bruker Avance III 500 M. A unidade de deslocamento químico (δ) é ppm e tetrametilsilano é usado como um sistema de referência (o deslocamento químico é 0).
[000126] No método de cromatografia líquida-espectrometria de massa, os dados de espectrometria de massa de baixa resolução foram adquiridos em um espectrômetro de massa Agilent 6110 (método do ácido) ou 6120B (método da base) interfaceado com uma cromatografia líquida de alto desempenho HP Agilent 1200.
[000127] Método 1: Cromatografia líquida de alto desempenho ácida foi realizada em uma coluna de fase reversa Waters Sunfire C18 (4,60x50 mm, 3,5 μm) com um gradiente de eluição de 5%-95% fase B (acetonitrila, contendo TFA a 0,01%) na fase A (fase aquosa, contendo TFA a 0,01%) em 1,4 min, com a vazão em 2,0 mL/min, e a temperatura de coluna é de 50%;
[000128] Método 2: Cromatografia líquida de alto desempenho ácida foi realizada em uma coluna de fase reversa Poroshell 120 EC-C18 (4,60x30 mm, 2,7 μm). O gradiente de eluição foi de 5%-95% fase B (acetonitrila, contendo TFA a 0,01%) na fase A (fase aquosa, contendo
TFA a 0,01%) em 2 min, com a vazão a 1,5 mL/min, e a temperatura de coluna é de 50%;
[000129] Método 3: Cromatografia líquida de alto desempenho básica foi realizada em uma coluna de fase reversa Waters Xbridge C18 (4,60x50 mm, 3,5 μm) com um gradiente de eluição de 5%-95% fase B (acetonitrila) na fase A (fase aquosa, contendo bicarbonato de amônio 10 mM) em 1,5 min, com a vazão a 2,0 mL/min, e a temperatura da coluna é de 40%.
[000130] A preparação foi realizada por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (prep-RP-HPLC) em um instrumento Gil- son usando uma coluna de fase reversa Waters Sunfire C18 (250x19 mm, 10 μm).
[000131] Método 4: Preparação por método ácido. Fase móvel: A: fase aquosa contendo TFA a 0,01%; B: ACN. Vazão: 20 mL/minuto.
[000132] Método 5: Preparação por método básico. Fase móvel: A: fase aquosa contendo bicarbonato de amônio 10 mM; B: ACN. Vazão: 20 mL/minuto.
[000133] Reagentes comercialmente disponíveis mencionados no exemplo foram usados de acordo com as instruções do fabricante, ex- ceto onde especificado em contrário.
1. Ensaio de Ligação Antígeno-Anticorpo (ELISA)
[000134] Nos exemplos, a afinidade do anticorpo anti-CD79b (inclu- indo soro de camundongo, sobrenadante de hibridoma ou anticorpo mo- noclonal expresso de forma recombinante etc.) pelo antígeno CD79b foi examinada por ensaio imunossorvente ligado a enzima.
[000135] O procedimento experimental foi como segue: placas de 96 poços (Corning, CAT Nº 9018) foram revestidas com 100 μL/poço de antígeno (CD79b-ECD humano, Novoprotein, CA29) sob 1 μg/mL em PBS (fosfato10 mM, NaCl138 mM, pH 7,2) a 4ºC durante a noite, e então bloqueadas com 250 μL/poço de solução de bloqueio (PBS + BSA a 1%
(Sangon, CAT Nº A0332)) durante uma a três horas a 25ºC. As placas foram lavadas três vezes com uma solução de lavagem (PBS + Tween- 20 a 0,05% (Sangon, CAT Nº TB0560)), e em seguida incubadas com 100 μL de anticorpo anti-CD79b em diluições em série em solução de bloqueio em poços duplicados a 25ºC por 2 h. As placas foram lavadas três vezes com solução de lavagem e então incubadas com 100 μL de anticorpo secundário 1:10.000 (IgG anti-camundongo (Fc)-HRP, Sigma, CAT Nº A00168 ou IgG anti-humana F(ab')2-HRP, Sigma, CAT Nº A0293) a 25ºC por 1 hora. As placas foram lavadas três vezes com so- lução de lavagem, e em seguida 100 μL de TMB (Sangon, CAT Nº TB0954) foram adicionados a cada poço e incubados a 25ºC até que desenvolvimento de cor (aproximadamente 15 minutos). As reações fo- ram interrompidas por adição de 100 μL/poço de solução de parada (H2SO4 1 N). OD450/630 nm foi lido na leitora de placa em 10 minutos.
2. Detecção FACS para a Ligação de Anticorpos à Superfície Celu- lar CD79b
[000136] No exemplo, a citometria de fluxo (FACS) foi usada para de- tectar a capacidade de anticorpos anti-CD79b (incluindo soro de camun- dongo, anticorpos de hibridoma etc.) ligarem-se ao domínio extracelular de CD79b nativo na superfície de células de câncer in vitro.
[000137] As contas de células de câncer expressando positiva ou ne- gativamente CD79b foram compradas da DSMZ ou ATCC, e a superfí- cie celular CD79b foi quantificada usando o Kit de Quantificação de Re- ceptores de Superfície de Membrana Celular QIFIKIT (DAKO, K0078). Os resultados são os seguintes: Linhagens de células Tipo de célula Fonte Numeração Número de receptores de CD79b/célula DOHH -2 Linfoma de células B DSMZ ACC 47 142208 GRANTA -519 Linfoma de células B DSMZ ACC 342 14708 BJAB Linfoma africano DSMZ ACC 757 495110 U-698-M Linfoma de células B DSMZ ACC 4 26226 WSU-DLCL2 Linfoma de células B DSMZ ACC 575 1664 Ramos Linfócito B ATCC CRL-1596TM 12603 SU-DHL -4 Linfócito B ATCC CRL-2957TM 259648 Jurkat Linfócito T ATCC TIB-152TM 0 Raji Linfócito B ATCC CCL-86TM 0
[000138] A detecção e seleção de camundongos imunizados e sobre- nadantes de hibridoma foram realizadas usando a linhagem de células SU-DHL-4. Especificamente, as células de SU-DHL-4 na fase de cres- cimento logarítmico foram coletadas, lavadas com PBS, e então distri- buídas em tubos EP de 1,5 ml, sob cerca de 100.000 células por tubo. O soro de camundongo diluído ou sobrenadante de hibridoma foi adici- onado a 100 μL/tubo e incubado por 1 hora a 4 semanas. Após lavagem duas vezes com PBS-BSA a 2%, IgG de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 488 (H+L) formulada em PBS-BSA a 2% 1:400 (Molecular Probes, Cat Nº A11001) foi adicionada a 100 μL/tubo, e então a solução foi in- cubada a 4ºC por 45 minutos no escuro. As células foram lavadas duas vezes com PBS-BSA a 2% e em seguida ressuspensas em 500 μL de PBS-BSA a 2% e analisadas sob citometria de fluxo Guava (Millipore, 8 HT). A força de ligação do anticorpo ao receptor CD79b de superfície celular foi determinada com base na intensidade de fluorescência (valor de MFI).
3. Preparação de Conjugados de Fármacos
[000139] A fim de verificar a eficácia do anticorpo anti-CD79b, os an- ticorpos foram conjugados com diferentes fármacos de moléculsa pe- quenas usando diferentes ligantes para preparar conjugados de fárma- cos, e o método de acoplamento específico é como segue:
[000140] Cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 10 eq., solu- ção de reserva a 10 mM) foi adicionado à solução de anticorpo (tampão de hidrogenofosfato de sódio-hidrogenofosfato dissódico 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 7,2). A solução de reação foi incubada por duas horas em banho-maria com termostato 37ºC. A solução de reação foi resfriada a temperatura ambiente e substituída por ultrafiltração (Milli- pore Amicon® Ultra, 50.000 MWCO) ou filtração em gel em tampão (hi- drogenofosfato de potássio-hidrogenofosfato dipotássico 100 mM, clo- reto de sódio 100 mM, ácido etilenotriaminapentacético 1 mM, pH 7,0-
8,0) ou tampão (ácido cítrico-citrato trissódico 20 mM, cloreto de sódio 50 mM, ácido dietilenotriaminopentacético 1 mM, pH 6,0). Sulfóxido de dimetila e o composto ligante-fármaco correspondente (solução de re- serva de sulfóxido de dimetila, 3-10 equivalentes em relação ao anti- corpo) foram adicionados, e o volume de sulfóxido de dimetila na solu- ção de reação foi assegurado ser de cerca de 10-15%. A reação de acoplamento foi realizada a 10ºC por 0,5 hora.
[000141] Uma quantidade em excesso de solução de cisteína foi adi- cionada à solução de reação para extinguir o composto ligante-fármaco não reagido, e a reação de resfriamento brusco foi realizada a 10ºC por 30 minutos. A solução de reação foi primeiramente submetida a ultrafil- tração (Millipore Amicon® Ultra, 50.000 MWCO) ou filtração em gel para remover aducto ligante-fármaco-cisteína e cisteína em excesso, e então a amostra foi trocada por tampão em um tampão de armazenamento (tampão de hidrogenofosfato de sódio-hidrogenofosfato dissódico 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 7,2), que foi adicionalmente esterili- zado por meio de um dispositivo de filtro com tamanho de poros de 0,22 μm (Filtro Millex-GV) para fornecer anti-CD79b-ADC, armazenado a 4ºC.
[000142] Os anticorpos preparados pelos métodos acima para conju- gados de fármacos incluem anticorpo anticamundongo de rato HB58 (ATCC® HB-58TM), anticorpo quimérico de camundongo humano anti- CD79b e variantes diferentes após humanização, incluindo outros anti- corpos de controle mencionados aqui.
4. Ensaio de ADC Secundário Para a Detecção do Efeito Inibidor de Proliferação de Sobrenadante de Hibridoma em Células de Linfoma
BJAB
[000143] Para anticorpos que são de pequena quantidade ou difíceis de purificar, não há quantidade suficiente para completar o experimento de acoplamento com o ligante e a toxina de moléculas pequenas. Para isso, o anticorpo é primeiramente ligado a um anticorpo que foi conju- gado com o ligante e a molécula pequena da toxina, e então coincubado com as células de câncer, e o conjugado anticorpo-fármaco ligado a ele é trazido para as células para matar as células de câncer por endocitose do anticorpo-alvo. As propriedades endocíticas desses anticorpos indi- retamente reativos e o efeito inibidor de proliferação nas células cance- rosas são referidas como experimentos ADC secundários.
[000144] A fim de realizar o experimento ADC secundário, a linhagem de células HB58 (ATCC® HB-58TM) foi comprada da ATCC. A linhagem celular foi uma célula de hibridoma obtida por fusão de células B de rato com células de mieloma P3X63Ag8.653. O anticorpo secretado pode ligar-se especificamente a anticorpos murinos. O anticorpo HB58 sufici- ente foi obtido por purificação do meio de cultura de linhagem celular HB58. O conjugado fármaco-anticorpo HB58-ADC foi preparado.
[000145] Célula de linfoma humano BJAB foi inoculada em placas de cultura de células de 96 poços (BD Falcon, Cat Nº 353072) em 1 x 105 células/100 μL/poço, e o meio foi meio RPMI1640 modificado por ATCC (Gibco, Cat Nº A10491) + soro bovino fetal a 10% (FBS) (Gibco, Cat Nº 10099141). Incubou-se um dia em uma incubadora a 37ºC (SANYO, MC0018AIC), e o sobrenadante de hibridoma contendo anticorpo anti- CD79b que foi pré-misturado com HB58-ADC em uma relação de con- centração de 1:1 e controle relevante foi adicionado a 100 μL/poço no dia seguinte com diluição de três vezes, um total de 9 poços com con- centrações de gradiente + 1 poço de controle. Incubação foi realizada durante três dias em uma incubadora a 37ºC. No quinto dia, o kit 8 de contagem de células (DOJINDO, CK04) foi usado para desenvolver a cor. Proliferação celular foi medida de acordo com a instrução do kit. A absorbância a 450/630 nm foi lida com uma leitora de microplaca (Bio- Tek Sinergia MX) para calcular a IC50 e a taxa de inibição.
5. Método de Ressonância de Plasmons de Superfície Para Deter- minação da Afinidade do Anticorpo
[000146] Nos exemplos, a ressonância de plasmons de superfície (SPR) foi usada para detectar a capacidade de ligação de anticorpos anti-CD79b (incluindo anticorpos quiméricos de camundongo humanos e anticorpos humanizados etc.) à proteína de domínio extracelular CD79b recombinante in vitro.
[000147] O ensaio foi realizado em uma máquina Biacore T200 (GE) e o anticorpo a ser testado foi diluído a 10 μg/ml com tampão HBS-EP (GE, BR100826) de acordo com a instrução do Kit de Acoplamento de Amina Amine-Coupling Kit (GE, BR-1000-50). O anticorpo a ser testado foi imobilizado em um chip CM5 (GE, BR-1006-68) sob um tempo de fixação de 300 segundos e uma vazão de 10 μL/min. Concentrações diferentes (0,25 nm, 0,5 nm, 1 nm, 2 nm, 4 nm, 8 (x 2) nm, 16 nm) da proteína de domínio extracelular CD79b recombinante diluída com gra- diente de tampão HBS foi submetida a reação de captura por programa de Kinectics, com o tempo de ligação do antígeno-anticorpo ajustado em 300 segundos, tempo de dissociação ajustado em 900 segundos, vazão da proteína antigênica em 30 μL/min. As curvas de dissociação foram ajustadas para calcular os valores de KD dos diferentes anticor- pos. Os experimentos acima foram todos realizados a 25ºC. Exemplo 1: Geração e Triagem de Linhagens de Células de Anti- corpo Monoclonal de Camundongo Contra CD79b Humano
[000148] As linhagens de células monoclonais de CD79b anti-humano derivadas de camundongo foram obtidas por imunização de camundon- gos, fusão de células de baço e método de triagem de hibridoma, que foi confiado à Nanjing Jinsui Biotechnology Co., Ltd. para completar. O antígeno usado para imunização foi proteína de domínio extracelular CD79b humano recombinante (Shanghai Novoprotein, Ltd., sob o nome de produto de CD79B humano recombinante, lote nº CA29, a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 35), e quatro espécies de camundongos (Balb/C, C3H, SJL, C57BL/6, respectivamente) foram es- colhidas para imunizar seis camundongos de cada espécie. O adjuvante imunológico é um adjuvante de Freund convencional, e a dose da imu- nização primária é de 50 μg de antígeno por camundongo. A imunização foi reforçada em intervalos de duas semanas com a dose reduzida para 25 μg. A partir da primeira imunização de reforço, o soro dos camun- dongos foi coletado sete dias após cada imunização de reforço. O título foi determinado por ELISA (ver o primeiro ponto nos "Materiais e Méto- dos" para o método). A detecção FACS foi realizada no soro de camun- dongos coletados sete dias após a segunda imunização de reforço (veja o segundo ponto dos "Materiais e Métodos") para ver se ela pode ligar- se a CD79b na superfície da linhagem de células SU-DHL4 que mostrou expressão positiva de CD79b. O título de ligação de cada camundongo foi determinado simultaneamente.
[000149] Após duas imunizações de reforço, de acordo com os resul- tados de ELISA e FACS, os camundongos com o título mais alto foram selecionados para fusão celular (por eletrofusão), e a eficiência de fusão foi de cerca de 3.000 células B de baço fundidas em células de hibri- doma. Todas as células fundidas foram plaqueadas em placas de 96 poços, com 40 placas por fusão. Ensaio ELISA foi realizado uma se- mana mais tarde (ver ponto 1 da seção Materiais e Métodos para o mé- todo). O sobrenadante de clones positivos em ensaio ELISA foi coletado para detecção FACS (ver ponto 2 da seção Materiais e Métodos para métodos). Todos os clones positivos na detecção FACS foram subclo- nados. O sobrenadante no poço com monoclones após uma subclona- gem foi coletado para detecção ADC secundária (ver ponto 3 da seção Materiais e Métodos). Os Clones que poderiam inibir a proliferação de células de câncer BJAB, que mostraram expressão positiva de CD79b,
em um ensaio ADC secundário, foram submetidos a subclonagem con- tínua até que uma linhagem de células monoclonais estáveis fosse for- mada.
[000150] No presente exemplo, foram realizadas três fusões eficazes. Um total de 31 clones positivos FACS foram obtidos após triagem. Fi- nalmente, 18 cepas com o melhor efeito de inibição de proliferação (ver Tabela 1 abaixo) foram selecionadas para subclonagem completa. Tabela 1 Número de Clones IC50 contra BJAB (ng/ml) EC50 obtida por ELISA (ng/ml) 35B5 7,89 11,1 38E4 62,1 50,8 33H10 3,25 3,86 50B10 3,52 6,75 34B4 3,36 1,99 82F12 2,23 3,07 75G3 12,4 8,82 81C3 16,0 11,0 85B3 7,9 12,1 85B5 6,25 11,9 83A10 8,87 11,8 85G11 7,64 10,3 78B6 10,7 13,4 88B12 14,0 11,8 104E1 9,3 14,9 104A2 8,64 12,1 110A4 13,4 13,7 110D5 11,1 12,9 Exemplo 2: Sequenciamento de Anticorpo de Hibridoma Anti- CD79b e Construção de Anticorpo Quimérico recombinante
[000151] Sequenciamento de hibridoma foi feito para as 18 linhagens de células monoclonais listadas na Tabela 1 do Exemplo 1, e então an- ticorpos quiméricos com uma região constante de IgG1 humana foram expressos de forma recombinante e testados quanto à sua atividade. Neste exemplo, os genes das regiões variáveis de cadeias pesada e leve do anticorpo foram amplificados por PCR de transcrição reversa, ligados em um vetor e as sequências de cadeias pesada e pesada de anticorpo monoclonal foram sequenciadas. Especificamente, o RNA to- tal de cada cepa de células monoclonais foi primeiramente extraído usando um kit de purificação de RNA (Qiagen, Cat Nº 74104). O fila- mento simples de cDNA, o cDNA de primers Oligo-dT, foi então trans- crito reverso usando um kit de síntese de cDNA (Invitrogen, Cat Nº 18080-051). Usando este como gabarito, as sequências das regiões va- riáveis de cadeias leve e pesada do anticorpo foram sintetizadas por PCR, e o produto de PCR foi clonado no vetor TA pMD -18T e então sequenciado.
[000152] Pela análise das sequências das regiões CDR das cadeias pesada e leve, anticorpos com sítios potenciais para modificação pós- tradução foram excluídos. Finalmente, seis clones (35B5, 78B6, 85G11, 88B12, 104A2 e 104E1) foram escolhidos para a expressão recombi- nante do anticorpo. Em primeiro lugar, as sequências de cadeias leve e pesada do anticorpo foram otimizadas por códons para síntese de gene inteiro. Sítios de restrição HindIII/NheI foram adicionados em ambas as extremidades da cadeia pesada, e sítios de restrição HindIII/BsiWI fo- ram adicionados em ambas as extremidades da cadeia leve. Os genes de região variável de cadeia pesada/leve foram ligados ao vetor de ex- pressão PTT5 contendo a sequência de região constante de IgG1 hu- mana ou a sequência de região constante de cadeia K via esses dois pares de sítios de restrição para construir os vetores de expressão para os anticorpos quiméricos. Anticorpos recombinantes foram expressos por expressão transiente em células 293F. Exemplo 3: Análises de Citotoxicidade de Conjugados Anticorpos- Fármacos Anti-CD79b
[000153] Seis anticorpos quiméricos recombinantes (35B5, 78B6, 85G11, 88B12, 104A2 e 104E1) foram conjugados com BMP-vcMMAE (ligante-fármaco 1) separadamente para preparar conjugados anticor- pos-fármacos (ADCs). O ensaio de inibição de proliferação foi realizado em sete linhagens de células de linfoma BJAB, Ramos, DoHH2, SU- DHL-4, U-698-M, Granta-519, WSU-DL2 que expressam positivamente
CD79b e duas linhagens de células de linfoma Raji e Jurkat que expres- sam negativamente CD79b. As condições de cultura das células de cân- cer foram todas as mesmas (ver Seção 3 da seção Materiais e Méto- dos). A densidade de plaqueamento celular e a concentração inicial de ADCs para diferentes linhagens de células cancerosas são mostradas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Cepa de linfoma Número de plaqueamentos (célula/poço) Concentração inicial de ADC (ng/ml) BAJAB 10.000 400 Ramos 40.000 400 DoHH2 40.000 400 SU-DHL-4 30.000 400 U-698-M 20.000 1.000 Granta-519 50.000 2.000 WSU-DLCL2 20.000 2.000 Raji 40.000 2.000 Jurkat 20.000 2.000
[000154] Os resultados do efeito de inibição de proliferação dos seis ADCs em várias linhagens de células de câncer são mostrados na Ta- bela 3. Tabela 3 Anticorpo quimérico re- Atividade inibitória sobre IC50 (ng/ml) de proliferação de células de linfoma combinante BJAB SU-DHL-4 DoHH2 Ramos U-698-M Granta-519 WSU-DLCL2 35B5 9,31 10,4 12,9 6 10,6 101 77,8 78B6 8,52 10,2 11,1 7,55 12,8 106 64,7 85G11 8,31 8,98 6,45 4,27 10,2 38,1 30,7 88B12 10 15,2 24,1 7,87 14,5 208 99,3 104E1 10,4 11,9 5,75 6,02 9,52 20,8 18,2 104A2 8,55 8,91 6,05 5,3 11,7 57,6 42,7 Exemplo 4: Humanização de Anticorpo Anti-CD79b
[000155] Os conjugados do anticorpo quimérico recombinante com fármaco expresso pelo 104E1 podem inibir a proliferação de células de linfoma Granta-519 e WSU-DLCL2 com níveis de expressão de CD79b relativamente baixos significativamente melhor do que os outros cinco anticorpos. Portanto, 104E1 foi selecionado para humanização.
[000156] A informação de sequência do anticorpo 104E1 (com base no Sistema Kabat) é como segue: HCDR1: GNTFSYGIN (SEQ ID NO: 1)
HCDR2: GEIFPRSGNIYYNEKFKG (SEQ ID NO: 2) HCDR3: AKGGTGDFDY (SEQ ID NO: 3) LCDR1: RSSQNIVC5GNATYLE (SEQ ID NO: 4) LCDR2: KVSFRLS (SEQ ID NO: 5) LCDR3: FQGSHVPWT (SEQ ID NO: 6) mVH: sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 38) mVL: sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 39)
[000157] Nanjing GenScript Biotech Corp. foi confiado para humanizar a sequência de 104E1. O procedimento específico é como segue: as sequências de região variável de cadeia pesada e leve do anticorpo mo- noclonal anti-CD79b murino 104E1 foram comparadas no banco de da- dos de sequências de linhagem germinativa humana, e foi encontrada a sequência de linhagem germinativa humana IGHV1-69*02 com a maior homologia com a região variável de cadeia pesada 104E1, com uma homologia de 64,3%. Também encontrada foi a sequência de li- nhagem germinativa humana IGKV2-30*02 com a maior homologia com região variável de cadeia leve de 104E1 com uma homologia de 79,0%. Em seguida, o anticorpo AGC78785.1 (região variável de cadeia pe- sada, SEQ ID NO: 9) e BAC01734.1 (região variável de cadeia leve, SEQ ID NO: 10) gerados a partir dessas duas sequências de linhagens germinativas foram encontrados na biblioteca de anticorpos humanos, cuja informação de sequência é como segue: Região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AGC78785.1 [Homo sapiens]
Região variável de cadeia leve de imunoglobulina capa BAC01734.1 [Homo sapiens]
[000158] Usando as regiões FR desses dois anticorpos derivados hu- manos como estrutura, as sequências de região CDR foram substituí- das pelas sequências de região CDR correspondentes de 104E1 murino para gerar anticorpos humanizados enxertados com CDR, e as sequên- cias foram como seguem: VH enxertada com HCDR: VL enxertada com LCDR:
[000159] Para encontrar os sítios de aminoácidos nas regiões FR mu- rinas que desempenham um papel importante na afinidade do anticorpo, uma estrutura de cristal com homologia similar ao anticorpo 104E1 mu- rino foi pesquisada na base de dados PDB. Como resultado, a estrutura de cristal de scFV do anticorpo anti-polisiálico Ab735 Foi verificada ter uma homologia de 77% com a sequência do anticorpo 104E1, e com uma alta resolução suficiente. Usando esse cristal como gabarito estru- tural, as duas sequências foram alinhadas para estabelecer um modelo de homologia dos scFvs de 3WBD do anticorpo 104E1. De acordo com esse modelo de homologia, foram identificados os sítios de aminoácido circundados pelo domínio CDR, ou dentro 5 Å para os domínios de CDR no domínio FR da sequência de 104E1. Consequentemente, esses sí- tios que podem desempenhar um papel importante na afinidade do an- ticorpo são mutados em sentido inverso nas sequências enxertadas com CDR (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12), ao mesmo tempo que evita sítios de glicosilação, desamidação e oxidação etc. Foi encontrado um total de 15 sítios que podem precisar ser mutados em sentido in- verso na região variável de cadeia pesada, incluindo A24T, RV67KA, S84R, T98K, K12A, S16A, V20L, A24T, R38K, M48I, V68L, I70L, Y95F, T98K e V113L, e um total de sete sítios que podem precisar ser mutados de forma inversa na região variável de cadeia leve, incluindo V3L, F41Y, RR50KL, FQ41YL, R51L, V88L e V109L. Bibliotecas Fab foram então construídas de acordo com o protocolo padrão do Genscript e selecio- nadas por plataforma de exibição de fagos. As sequências após huma- nização com uma afinidade não menor do que a do anticorpo 104E1 murino foram examinadas e sequenciadas para confirmação de sequên- cia.
[000160] As regiões variáveis de cadeias leve e pesada após humani- zação são como seguem:
1. Região variável de cadeia pesada AS11161: AS11164: AS11252:
AS11254: AS11259:
2. Região variável de cadeia leve AS11161: AS11164: AS11252: AS11254: AS11259:
[000161] As cadeias pesadas e leves após humanização e o seg- mento Fc de IgG1 foram recombinadas para obter o anticorpo monoclo- nal anti-CD79b humanizado descrito aqui. As sequências Fc usadas são como seguem: Região constante de cadeia pesada:
Região constante de cadeia leve:
[000162] Os anticorpos acima foram clonados, expressos e purifica- dos por clonagem de genes e métodos de expressão recombinante, e a afinidade do anticorpo foi determinada por Biacore (completada por Genscript). Finalmente, os anticorpos humanizados A11161, A11164, AS11252, AS11254 e AS11259 com as melhores atividades foram se- lecionados. As sequências são como seguem: Anticorpo humanizado AS11161 Cadeia pesada Cadeia leve Anticorpo humanizado AS11164 Cadeia pesada
Cadeia leve
Anticorpo humanizado AS11252 Cadeia pesada
Cadeia leve
Anticorpo humanizado AS11254 Cadeia pesada
Cadeia leve Anticorpo humanizado AS11259 Cadeia pesada sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 36) Cadeia leve sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 37)
[000163] A afinidade do anticorpo após humanização foi testada pelo método descrito na Seção 4 da seção "Materiais e Métodos". Os resul- tados são mostrados na Tabela 4 abaixo e Figura 1. Tabela 4 Anticorpo AS11161 AS11164 AS11252 AS11254 AS11259 Anticorpo quimérico Análito CD79b ECD (SEQ ID NO:35) Ka(1/Ms) 2,02E+06 1,91E+06 1,48E+06 1,53E+06 1,68E+06 1,62E+06 Kd(1/s) 2,84E-05 2,44E-05 4,22E-05 2,87E-05 3,63E-05 5,52E-05
KD(M) 1,40E-11 1,28E-11 2,85E-11 1,87E-11 2,16E-11 3,41E-11 Rmáx.(RU) 52,24 60,17 59,29 62,25 48,91 63,20 Chi2(RU2) 0,0558 0,0448 0,0583 0,0808 0,0757 0,0751 Valor de U 4 3 2 4 4 2
[000164] Os resultados mostraram que o valor de KD de ligação do anticorpo humanizado da exposição ao antígeno CD79b in vitro foi de cerca de 0,02 nM (medido por ensaio Biacore, GeneScript) que é com- parável ao do anticorpo quimérico de camundongo humano; a humani- zação não produziu grande mudança na afinidade do anticorpo. Exemplo 5: Ensaio para Atividade de Ligação in Vitro de Anticorpo Humanizado Anti-CD79b Para o Domínio Extracelular de CD79b Hu- mano e o Efeito Inibitório Sobre a Proliferação de Células de Lin- foma de seu Conjugado de Fármaco
[000165] A atividade de ligação in vitro do anticorpo humanizado anti- CD79b para o domínio extracelular de CD79b humano foi examinada por ELISA conforme descrito na Seção 1 da seção Materiais e Métodos. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Tabela 5 Anticorpo humanizado EC50 por ELISA (ng/ml) AS11161 43,1 AS11164 64 AS11252 49,9 AS11254 50,1 AS11259 58,3
[000166] Os conjugados anticorpo-fármaco do anticorpo humanizado foram preparados e o efeito de inibição de proliferação correspondente nas células de câncer de linfoma in vitro (ver Exemplo 3 para o método) são mostrados na Tabela 6. Tabela 6 Efeito inibitório sobre a proliferação de células de linfoma IC50 (ng/ml) ADC humanizado WSU- BJAB Ramos SU_DHL-4 DoHH2 U-698-M Granta-519 Raji Jurkat DLCL2 AS11161-ADC 12,2 5,04 15,9 6 18,8 31,5 15,9 - - AS11164-ADC 15,3 8,1 17,6 9,17 20,4 48,6 24,6 - - AS11252-ADC 11,6 4,78 14,2 8,01 24,8 44,6 20,9 - - AS11254-ADC 15,4 8,3 16,5 8,6 19,2 47,7 24 - -
AS11259-ADC 10,4 4,85 16 8,9 21,5 33,4 16,5 - - 104E1-ADC quimérico 8,81 4,42 9,46 4,26 15,9 29,6 16,8 - - Exemplo 6: Estudo de Estabilidade Biofísica de Anticorpos Huma- nizados Anti-CD79b
[000167] A fim de avaliar a estabilidade dos anticorpos, cinco anticor- pos humanizados foram armazenados em tampões diferentes com pH de 4,5; 6,0 ou 7,4 a 40ºC por até 26 dias. As propriedades das amostras foram analisadas após armazenamento 1, 6, 12 e 26 dias nas condições de tensão acima e amostra colocada a 4ºC como controle. As alíquotas são analisadas por ELISA e SEC-HPLC (TOSOH, TSKgel, G3000SWXL).
[000168] Os resultados mostraram que os cinco anticorpos humaniza- dos colocados a 40ºC durante 26 dias sob três condições de pH dife- rentes não apresentaram diferença significativa na atividade determi- nada por ELISA. Os níveis de pureza foram todos superiores a 98% no ensaio SEC. Não foram observados agregados significativos. Exemplo 7: Avaliação de Eficácia in Vivo de Conjugados Anticorpo- Fármaco Humanizado Anti-CD79b Sobre Tumores de Linfoma em Camundongos
[000169] Para verificar a eficácia do anticorpo humanizado anti- CD79b, a variante AS11259 foi selecionada e os conjugados de fármaco A11259-ADCs foram preparados de acordo com o método descrito em Materiais e Método 3, em seguida foi examinada a capacidade dos ADCs em regredir tumores em modelos de xenoenxerto múltiplo, inclu- indo Ramos, DoHH2, Granta-519 e WSU-DLCL2. Síntese de ligante-fármaco Síntese do ligante-fármaco 1:
[000170] O ligante-fármaco 1 foi preparado como descrito em WO
2014114207. Síntese do ligante-fármaco 2
[000171] O ligante-fármaco 2 foi preparado como descrito em WO
2014114207. Síntese do ligante-fármaco 3 Esquema de síntese: acetona
[000172] N-terc-butoxicarboniletilenodiamina (710 mg, 4,43 mmoles) e di-isopropiletilamina (1,55 mL, 8,86 mmoles) foram dissolvidos em di- clorometano (10 mL) e então cloreto de cloroacetila (500 mg, 4,43 mmo- les) foi adicionado em gotas. A mistura de reação foi agitada a tempe-
ratura ambiente por 16 horas e, em seguida, diluída com cloreto de me- tileno e lavada sucessivamente com cloreto de amônio aquoso satu- rado, hidrogenocarbonato de amônio aquoso saturado, água e solução salina saturada. A fase orgânica foi secada com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para obter o composto bruto 11 como um sólido branco.
[000173] O produto bruto resultante 11 foi dissolvido em acetona (10 mL) e então iodeto de sódio (3,32 g, 22,2 mmoles) foi adicionado. A solução de reação foi agitada a 50ºC por 16 horas e, em seguida, diluída com diclorometano e lavada com água e solução salina saturada. A fase orgânica foi secada sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto obtido foi purificado com croma- tografia de coluna de sílica-gel (éter de petróleo/acetato de etila 1:1) para obter o composto 12 (400 mg) como um sólido branco. (LC-MS (Método 1): tempo de retenção, 1,61 minutos; [M+Na]+ 351,0.
[000174] Composto DM1 (40 mg, 0,054 mmol) e composto 12 (35,4 mg, 0,108 mmol) foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (2 mL), e então di-isopropiletilamina (29 μΙ, 0,163 mmol) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por duas horas e em se- guida purificada por cromatografia líquida preparativa de alto desempe- nho (Método 4: 50%-80% de B em 8 min a 95% de B em 4 min) para produzir o composto 13 (40 mg) como um sólido branco.
[000175] O composto 13 (40 mg, 0,043 mmol) foi dissolvido em diclo- rometano (3 mL) e então ácido trifluoracético (97 mg, 0,852 mmol) foi adicionado. A solução de reação foi agitada a temperatura ambiente du- rante três 3 horas e, em seguida, concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto e o composto 14 (18,7 mg, 0,0639 mmol) foram dissolvi- dos em N,N-dimetilformamida (2 mL) e, em seguida, HATU (32,4 mg, 0,0852 mmol) e di-isopropiletilamina (74 μΙ, 0,426 mmol) foram adicio- nados sequencialmente. A solução de reação foi agitada a temperatura ambiente por duas horas e em seguida purificada por cromatografia lí- quida preparativa de alto desempenho (Método 4: 50%-80% de B em 8 min a 95% de B em 4 min) para produzir o ligante-fármaco 3 (8,3 mg) como um sólido branco. LCMS (A018): tempo de retenção, 1,92 min, [M+Na]+ 1134,3. Síntese do ligante-fármaco 4 Esquema de sintetização:
[000176] O composto 15 (0,25 g, 0,305 mmol, preparado como des- crito em WO2014114207), composto 16 (0,20 g, 0,208 mmol, preparado como descrito em WO2016192527) e HOBt (28,1 mg, 0,208 mmol) fo- ram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (4 mL) e então piridina (1 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente durante 16 horas e, em seguida, purificada por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho (Método 5: 50%-80% de B em 8 min, em seguida 95% de B em 4 min) para produzir o ligante-fármaco 4 (45 mg) como um sólido rosa claro. LCMS (Método 3): tempo de retenção, 2,127 minutos, 1/2 [M+2H]2+ 822,0. Síntese do ligante-fármaco 5
Esquema de sintetização: Piridina
[000177] O composto 15 (14 mg, 0,017 mmol), composto 17 (14 mg, 0,014 mmol, preparado como descrito em WO2016192527) e HOBt (3 mg, 0,017 mmol) foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (2 mL), e então piridina (0,5 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 16 horas e, em seguida, purificada por cro- matografia líquida preparativa de alto desempenho (Método 5: 45%- 75% de B em 8 min, então 95% de B em 4 min) para produzir o ligante- fármaco 5 (1,8 mg) como um sólido vermelho. LCMS (Método 2): tempo de retenção 1, 40 min, 1/2 [M+2H]2+ 843,9. Síntese do Ligante-fármaco 6 Esquema de sintetização:
[000178] O composto 15 (14 mg, 0,017 mmol), composto 18 (14 mg, 0,013 mmol, preparado como descrito em WO2016192527) e HOBt (3 mg, 0,017 mmol) foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (2 mL), e então piridina (0,5 mL) foi adicionada. A reação foi agitada a tempera- tura ambiente por 16 horas e, em seguida, purificada por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho (Método 5: 45%-75% de B em
8 min, em seguida 95% de B em 4 min) para produzir o ligante-fármaco 6 (2,0 mg) como um sólido vermelho. LCMS (Método 2): tempo de re- tenção, 1,40 min, 1/2 [M+2H]2+ 865,3. Síntese do ligante-fármaco 7 Esquema de sintetização: Piridina
[000179] O composto 15 (10 mg, 0,012 mmol) e o composto 19 (8 mg, 0,024 mmol, preparado como descrito em WO2013/149948A1) foram dissolvidos em uma mistura de N,N-dimetilformamida (1 mL) e piridina (0,2 mL), e então HOBt (3,2 mg, 0,024 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas, e em seguida purificada usando uma cromatografia líquida preparativa de alto desem- penho (Método 4: 60%-90% de B em 8 min, então 95% de B em 4 min) para produzir o composto 20 (6,0 mg) como um sólido branco. LC-MS (Método 3): tempo de retenção, 2,24 min, [M+Na]+ 1.028,3.
[000180] O composto 20 (6,0 mg, 0,006 mmol) foi dissolvido em diclo- rometano (1 mL) e então ácido dicloroacético (15 mg, 0,12 mmol) foi adicionado. A solução de reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas, e em seguida concentrada para remover solvente. O resíduo foi lavado com n-hexano/éter (1 ml/ml), filtrado e secado para produzir o composto 21 (4,5 mg) como um sólido branco. LC-MS (Método 3): tempo de retenção, 1,57 min, [M+H]+ 768,3.
[000181] O composto 21 (4,5 mg, 0,005 mmol) e composto 22 (5 mg, 0,008 mmol, preparado como descrito em US889697 B2) foram dissol- vidos em N,N-dimetilformamida (1 mL), e então di-isopropiletilamina (2,6 mL, 0,02 mmol) e HATU (3,8 mg, 0,01 mmol) foram adicionados. A mis- tura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora, e em se- guida purificada usando uma cromatografia de alto desempenho prepa- rativa (Método 5: 50%-80% de B em 8 min, em seguida a 95% de B em 4 min) para produzir o ligante-fármaco 7 (0,9 mg) como um sólido ver- melho. LCMS (Método 3): tempo de retenção, 2,05 min, [M+H]+ 1.378,3. Síntese do ligante-fármaco 8 Esquema de sintetização:
[000182] O composto 15 (100 mg, 0,122 mmol), composto 23 (60 mg, 0,071 mmol, preparado como descrito em WO2016192527) e HOBt (10 mg, 0,071 mmol) foram dissolvidos em DMF seco (2 mL), e então piri- dina (0,5 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada a tempera- tura ambiente por 16 horas, e em seguida purificada por cromatografia líquida preparativa de alta pureza (Método 5: 50%-80% de B em 8 min, em seguida a 95% de B em 4 min) para produzir o composto 24 (30 mg) como um sólido branco. LCMS (Método 3): tempo de retenção, 2,41 mi- nutos, 1/2 [M+2H]2+ 762,0.
[000183] O composto 24 (30 mg, 0,0197 mmol) foi dissolvido em di- clorometano (1,5 mL), e então ácido trifluoracético (0,5 mL) foi adicio- nado. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 3 ho- ras, e em seguida concentrada para remover o solvente. O resíduo foi purificado por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho (método X) para produzir o composto 25 (15 mg) como um sólido pulve- rulento branco.
[000184] O composto 25 (15 mg, 0,0197 mmol) e composto 26 (7 mg, 0,0189 mmol, preparado como descrito em Journal of Organic Chemis- try, 2001, 66, 4.494-4.503) foram dissolvidos em DMF Seco (0,4 mL), e então HATU (7,2 mg, 0,0189 mmol) e DIPEA (3,7 mg, 0,0286 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambi- ente por 2 horas, e em seguida purificada por cromatografia líquida pre- parativa de alto desempenho (Método 5: 50%-80% de B em 8 min, em seguida a 95% de B em 4 min) para obter o ligante-fármaco 8 (4,8 mg) como um sólido pulverulento branco. LCMS (Método 2): tempo de re- tenção 1,37 min, 1/2 [M+H]2+ 909,5. Síntese do ligante-fármaco 9
Esquema de sintetização:
[000185] O composto 27 (165 mg, 0,132 mmol, preparado como des- crito em WO2007011968) e composto 28 (90 mg, 0,231 mmol, prepa- rado como descrito em WO 2014114207) foram dissolvidos em DMF (2 mL), e então DIPEA (51 mg, 0,395 mmol) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 0,5 hora e em seguida extinta pela adição de ácido acético glacial (50 μL). A mistura foi purifi- cada por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho (método 4: 50%-80% de B em 8 min, em seguida até 95% de B em 4 min) para produzir o ligante-fármaco 9 (128 mg) como um sólido pulverulento branco. LCMS (método 2): tempo de retenção, 1,51 min, 1/2 [M+2H]2+ 702,8. Síntese do ligante-fármaco 10
[000186] A síntese do ligante-fármaco 10 foi preparada como descrito em CN 201710691056.X. Preparação de Conjugados Anticorpo-Fármaco
[000187] Cloridrato de Tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP, 10 eq, con- centração de reserva 10 mM) foi adicionado a uma solução de anticorpo A11259 (IgG1) (hidrogenofosfato de sódio-hidrogenofosfato dissódico 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 7,2). A reação foi incubada por 2 horas em banho-maria com termostato a 37ºC. A solução de reação foi resfriada a cerca de temperatura ambiente e em seguida trocada por tampão por ultrafiltração (Merck Millipore Amicon® Ultra, 50.000 MWCO) ou filtração em gel em tampão (hidrogenofosfato de potássio- hidrogenofosfato dipotássio 100 mM, cloreto de sódio 100 mM, ácido dietilenotriaminapentacético 1 mM, pH 7,0-8,0) ou tampão (ácido cítrico- citrato trissódico 20 mM, cloreto de sódio 50 mM, ácido dietilenotriami- napentacético 1 mM, pH 6,0), ao qual foram adicionados sulfóxido de dimetila e o ligante-fármaco 1 preparado conforme descrito no Exemplo 1 (solução de reserva de sulfóxido de dimetila, 3-10 equivalentes em relação ao anticorpo), garantindo que o volume de sulfóxido de dimetila na solução de reação fosse de cerca de 10-15%. A reação de conjuga- ção foi realizada a 10ºC por 0,5 hora.
[000188] Um excesso de solução de cisteína foi adicionado à solução de conjugação acima para extinguir ligante-fármaco 1 não reagido, e o resfriamento brusco foi realizado a 10ºC durante 30 minutos. A solução de reação foi primeiramente submetida a ultrafiltração (Merck Milli- pore Amicon® Ultra, 50.000 MWCO) ou filtração em gel para remover o aducto ligante-fármaco 1-cisteína e cisteína em excesso, e então a amostra foi trocada por tampão em um tampão de armazenamento (tampão di-hidrogeofosfato de sódio-fosfato dibásico de sódio 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 7,2). A solução obtida foi esterilizada atra- vés de um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm (filtro Merck Millex-
GV) para obter um conjugado anticorpo-fármaco A11259-ADC-001, que foi armazenado a 4ºC.
[000189] Outros conjugados anticorpo-fármaco da presente invenção, A11259-ADC-002 a A11259-ADC-011, foram preparados de acordo com o procedimento de preparação acima, usando ligantes-fármacos 2- 10 para substituir o ligante-fármaco 1, respectivamente. O conjugado anticorpo-fármaco A11259-ADC-0012 foi obtido conjugando o anticorpo AS11259 com o ligante-fármaco 1, em que o anticorpo foi reduzido via através modo de redução parcial, com uma média de dois pares de li- gações dissulfeto sendo reduzidos.
[000190] A Tabela 6 mostra um resumo dos conjugados anticorpo-fár- maco preparados nesta descrição. Tabela 6 ADC Ligante-fármaco Eq. de ligante-fármaco (para anticorpo) AS11259-ADC -001 1 6 AS11259-ADC -002 2 6 AS11259-ADC -003 3 8 AS11259-ADC -004 4 7 AS11259-ADC -005 5 8 AS11259-ADC -006 6 8 AS11259-ADC -007 7 8 AS11259-ADC -008 8 8 AS11259-ADC -010 9 6,6 AS11259-ADC -011 10 4 AS11250-ADC-0012* 1 4 *: O número de equivalentes de TCEP em relação ao anticorpo é de 3. Caracterização de Conjugados Anticorpo-Fármaco 1 ) Determinação do valor DAR médio
[000191] O valor médio DAR foi calculado usando cromatografia hi- drofóbica HIC (ver Anal. Chem. 2013, 85, 1.699-1.704). Cromatografia de interação hidrofóbica foi realizada em um Agilent 1100 (Agilent 1100). A fase estacionária foi uma coluna TSKgel butyl-NPR (4,6x35 mm, 2,5 μm, Tosoh (Shanghai) Biotech Co., Ltd.). O gradiente de eluição foi um gradiente linear, deslocado de tampão A a 100% [fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) + sulfato de amônio 1,5 M] a tampão B a 100% [80% v/v fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) + 20% v/v isopropanol] em 25 minu- tos. A vazão foi de 0,8 mL/min, a temperatura da coluna foi ajustada em 30ºC, e o comprimento de onda de detecção foi ajustado em 230 nm e 280 nm.
[000192] Os resultados das medições dos valores médios de DAR dos conjugados anticorpo-fármaco na descrição são mostrados na Tabela
7. Tabela 7: Resultados de DAR médio para conjugados anticorpo-fár- maco ADC Valor DAR médio ADC Valor DAR médio AS11259-ADC-001 4,0 AS11259-ADC-007 NA AS11259-ADC-002 NA AS11259-ADC-008 4,1 AS11259-ADC-003 NA AS11259-ADC-010 4,0 AS11259-ADC-004 4,0 AS11259-ADC-011 2,1 AS11259-ADC-005 4,2 AS11259-ADC-0012 1,7 AS11259-ADC-006 4,1 NA: Não detectado, mas com base na comunidade dos ligantes, o valor DAR médio deve também estar próximo de 4. Ensaio de Afinidade de Conjugados Anticorpo-Fármaco por Antí- geno
[000193] Método ELISA indireto foi usado para determinar a capaci- dade de ligação do anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco com o antígeno correspondente: o antígeno de CD79b foi ligado ao portador de fase sólida (placa de ELISA de 96 poços) para formar um antígeno de fase sólida, e então o antígeno não ligado foi lavado e removido; um conjugado anticorpo-fármaco diluído com gradiente preparado pela pre- sente invenção ou um anticorpo seu correspondente foi adicionado, em que um anticorpo específico ligado a um antígeno para formar um com- plexo antígeno-anticorpo de fase sólida, e um anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco que não se ligou a um antígeno de fase sólida foi re- movido por lavagem. Um antianticorpo ELISA foi adicionado para ligar- se ao anticorpo ou anticorpo ADC ligado ao antígeno de fase sólida, e antianticorpo não ligado foi removido por lavagem. Solução de substrato foi adicionada e então o valor de densidade óptica (OD) a 450 nm/630 nm foi lido com uma leitora de microplaca T, com base em que uma curva foi plotada e a EC50 calculada.
[000194] As medições da afinidade do conjugado anticorpo-fármaco preparado aqui pelo antígeno de CD79b são mostradas na Tabela 8. Tabela 8: Resultados de afinidade de conjugados anticorpo-fármaco pelo antígeno de CD79b ADC EC50 (ng/mL) ADC EC50 (ng/mL) AS11259 17,8 AS11259-ADC-006 50,2 AS11259-ADC-001 31,7 AS11259-ADC-007 62,9 AS11259-ADC-002 24,1 AS11259-ADC-008 29,0 AS11259-ADC-003 16,2 AS11259-ADC-010 23,2 AS11259-ADC-004 32,2 AS11259-ADC-011 23,6 AS11259-ADC-005 46,9 AS11259-ADC-0012 31,4
[000195] Como pode ser visto a partir da Tabela 8, os conjugados an- ticorpo-fármaco preparados nesta invenção não têm nenhuma diferença significativa na afinidade pelo antígeno em comparação com o anticorpo nu A11259. Inibição de Proliferação Celular por Conjugados Anticorpo-Fár- maco
[000196] A atividade citostática do anticorpo ou conjugado anticorpo- fármaco foi determinada pelo seguinte método: células de mamífero que expressam um antígeno associado a tumor ou proteína receptora (o pre- sente ensaio usou uma célula de Ramos que expressa antígeno de CD79b) foram inoculadas em uma placa de 96 poços, com cada poço inoculado com 40.000 células, que foram suspensas em 100 μL de meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% (GIBCO); a concentração inicial de amostra de ADC foi de 2 μg/mL e três diluições em série com o tempo foi realizada com meio RPMI 1640 contendo FBS a 2% (GIBCO); no meio original, 100 μL da amostra de ADC diluída com gradiente foram adicionados em cada poço, e a concentração inicial do fármaco foi de 1 μg/ml; a incubação foi continuada a 37ºC e 5% de CO2 durante 72 horas; 50 μL do meio original foram removidos, e então 70 μL de solução de desenvolvimento CCK-8 (CCK-8: RPMI 1640 = 2:5) foram adicionados em cada poço, seguidos de cultura adicional por 60-75 minutos; a ab- sorbância a 450 nm/630 nm foi lida com uma leitora de ELISA, com base na qual uma curva foi plotada e a IC50 foi calculada. Os resultados da inibição de proliferação celular pelo conjugado anticorpo-fármaco pre- parado nesta invenção são mostrados na Tabela 9. Tabela 9: Resultados da inibição de proliferação celular por conjugados anticorpo-fármaco ADC IC50 (ng/mL) ADC IC50 (ng/mL) AS11259-ADC-001 5,5 AS11259-ADC-007 8,1 AS11259-ADC-002 14,5 AS11259-ADC-008 2,4 AS11259-ADC-003 70,2 AS11259-ADC-010 3,9 AS11259-ADC-004 2,9 AS11259-ADC-011 10,2 AS11259-ADC-005 5,2 AS11259-ADC-0012 13,2 AS11259-ADC-006 5,0
[000197] Os resultados mostraram que os conjugados anticorpo-fár- maco preparados nesta invenção possuem todos bons efeitos inibidores de proliferação celular. Modelo Ramos
[000198] Células de Ramos foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10% a 37ºC, 5% de CO2. As células foram contadas e coletadas em fase de crescimento logarítmico, ressuspen- sas em PBS e Matrigel 1:1 e inoculadas subcutaneamente no lado di- reito dos camundongos (camundongos CB17/SCID, fêmeas, 8-9 sema- nas, peso corporal médio 18,4 g, comprada da Shanghai Lingchang Bi- otechnology Co., Ltd., número de certificado animal: 201300182088; ambiente de alimentação: nível SPF). O volume de células inoculadas por camundongo foi de 0,1 ml e a quantidade de células inoculadas foi de 1 x 107 células por camundongo. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 197 mm3, os pesos corporais foram pesados e os camundongos foram agrupados aleatoriamente, seguidos pelo início da administração. A administração foi através de veia da cauda e a frequência de adminis- tração foi apenas uma vez. Padrão de Avaliação do Resultado
[000199] Taxa de inibição de tumor relativa TGI (%): TGI = 1 – T/C (%). T/C % é a taxa de crescimento de tumor relativa, isto é, a razão percentual de volume de tumor relativo ou peso de tumor do grupo de tratamento em relação ao grupo de controle em um certo ponto de tempo. T e C são os volumes de tumor relativos (RTV) do grupo de tra- tamento e do grupo de controle em um ponto de tempo específico, res- pectivamente.
[000200] A fórmula é como segue: T/C % = TRTV/CRTV * 100% (TRTV: RTV médio no grupo de tratamento; CRTV: RTV médio no grupo de con- trole de veículo; RTV = Vt/V0, V0 é o volume do tumor do animal no mo- mento do agrupamento, Vt é o volume do tumor do animal após o trata- mento).
[000201] A fórmula de cálculo do volume do tumor é: diâmetro longo x diâmetro curto2/2. O dia de inoculação de célula no tumor foi definido como dia 0. Os tumores foram medidos duas vezes por semana após a administração.
[000202] O volume médio do tumor do grupo de controle com veículo alcançou 3.003 mm3 no 14° dia após a administração (PG-D14). A eu- tanásia foi realizada e a taxa relativa de inibição de tumor dos outros grupos de fármaco no 14° dia após a administração foi calculada. No 45° dia após a administração, o experimento foi terminado e todos os camundongos em repouso que foram continuamente observados foram submetidos a eutanásia, enquanto foi registrado o número de camun- dongos nos quais os tumores foram regredidos completamente em cada grupo. Resultados Experimentais
[000203] Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 10 e Figuras 2 e 3. Tabela 10: Eficácia terapêutica de A11259-ADC-001, 002, 004, 008,
010, 011 nos xenoenxertos subcutâneos de camundongos nus huma- nos com linfoma de células B de Ramos. Grupo Animais Indivíduo de teste Dosagem PG-D14 TGI PG-D45 P Peso corporal (g) (mg/kg) (mm3) (%) Total resolvido 1 6 Veículo (PBS) -- 3.003±329 -- -- 21,3±0,9 0 2 6 AS11259-ADC-001 1 1.558±234 48,7 0,023 21,1±0,8 0 3 6 AS11259-ADC-001 2,5 333±170 90,1 0,001 20,7±0,4 0 4 6 AS11259-ADC-001 5 14±6 99,6 0,001 20,4±0,2 6 5 6 AS11259-ADC-002 1 2.171±343 28.4 0,195 22,3±0,7 0 6 6 AS11259-ADC-002 2.5 1.986±259 33,2 0,126 21,0±0,4 0 7 6 AS11259-ADC-002 5 1.294±398 60,1 0,014 21,6±0,5 0 8 6 AS11259-ADC-004 1 1.762±412 42.6 0,075 22,0±0,9 0 9 6 AS11259-ADC-004 2,5 1.835±155 41,2 0,027 21,7±0,5 0 10 6 AS11259-ADC-004 5 1.030±201 66,0 0,003 20,8±0,5 0 11 6 AS11259-ADC-010 1 1.241±295 57,8 0,014 21,2±0,2 0 12 6 AS11259-ADC-010 2,5 15±6 99,5 0,001 20,4±0,4 5 13 6 AS11259-ADC-010 5 12±6 99,6 0,001 20,5±0,3 6 14 6 AS11259-ADC-0012 5 13±6 99,6 0,001 19,5±0,3 5 15 6 AS11259-ADC-011 2 818±191 73,8 0,001 20,2±0,5 0 16 6 AS11259-ADC-011 5 17±5 99,4 0,001 19,9±0,5 6 17 6 AS11259-ADC-008 2,5 1.390±179 54,8 0,009 20,4±0,4 0
[000204] O volume médio dos tumores do grupo de controle com veí- culo alcançou 3.003 mm3 no 14° dia após a administração (PG-D14).
[000205] O grupo de tratamento de teste com fármaco AS11259-ADC- 001 produziu efeitos antitumor significativos em três doses (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg) em comparação com o grupo de controle com veículo, sugerindo uma relação dose-resposta significativa. Os volumes médios dos tumores no 14º dia após a administração (PG-D14) para os três grupos de dosagem foram 1.558 mm3, 337 mm3 e 14 mm3, respectiva- mente, e a inibição de crescimento do tumor (TGI) foi de 48,7%, 90,1% e 99,6%, respectivamente, que foram estatística e significativamente di- ferentes do grupo de controle (valores p são 0,023; 0,001; 0,001, res- pectivamente). No grupo de alta dose (5 mg/kg), o crescimento tumoral foi significativamente inibido nos camundongos após a administração. No 10º dia após a administração (PG-D10), o tumor em três de seis ca- mundongos começou a desaparecer, e desapareceu completamente no 24° dia após a administração (PG-D24) em todos os seis camundongos. No fim do experimento (PG-D45), não houve regresso no tumor do ca- mundongo.
[000206] O grupo de tratamento de teste com fármaco AS11259-ADC- 002 produziu um certo efeito antitumor nas doses de 1 mg/kg e 2,5 mg/kg, em comparação com o grupo de controle com veículo. No 14º dia após a administração (PG-D14), o volume médio do tumor foi de
2.171 mm3 e 1.986 mm3, respectivamente, e a inibição de crescimento do tumor (TGI) foi de 28,4% e 33,2%, respectivamente, mas não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa nos grupos de controle de veículo relativos (valores p de 0,195 e 0 126, respectivamente). O grupo de tratamento AS11259-ADC -002 produziu um efeito antitumor significativo em comparação com o grupo de controle com veículo em uma dose de 5 mg/kg, e o volume médio do tumor era de 1.294 mm3 no 14º dia após a administração (PG-D14). A inibição de crescimento do tumor (TGI) foi de 60,1%, que foi estatística e significativamente dife- rente do grupo de controle (p = 0,014). O efeito antitumor do fármaco de teste AS11259-ADC-002 mostrou uma relação dose-resposta significa- tiva.
[000207] O grupo de tratamento de teste com fármaco de teste AS11259-ADC-004 produziu um certo efeito antitumor em comparação com o grupo de controle com veículo na dose de 1 mg/kg. O volume médio do tumor no 14º dia após a administração (PG-D14) foi de 1.762 mm3. A taxa de inibição do tumor relativa foi de 42,6%, mas não houve nenhuma diferença estatística e significativamente em comparação com o grupo de controle com veículo (p = 0,075). O fármaco de teste AS11259-ADC-004 produziu um efeito antitumor significativo compa- rado com o grupo de controle com veículo na dose de 2,5 mg/kg e 5 mg/kg. No 14º dia após a administração (PG-D14), o volume médio do tumor era de 1.835 mm3 e 1.030 mm3, respectivamente, e a inibição de crescimento do tumor (TGI) foi de 41,2% e 66,0%, respectivamente; am- bos tinham diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo de controle com veículo (valores p de 0,027 e 0,003, res- pectivamente). O efeito antitumor do fármaco de teste AS11259-ADC - 004 mostrou uma relação dose-resposta significativa.
[000208] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 010 produziu efeitos antitumor significativos em três concentrações (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg) em comparação com o grupo de controle com veículo, e mostrou uma relação dose-resposta significativa. O vo- lume médio de tumor no 14º dia após a administração (PG-D14) foi de
1.241 mm3, 15 mm3 e 12 mm3, respectivamente, e a inibição de cresci- mento de tumor (TGI) foi de 57,8%, 99,5% e 99,6%, respectivamente. Houve uma diferença estatística e significativamente (valores p de 0,014; 0,001; 0,001, respectivamente) em comparação com o grupo de controle. No grupo de dose média (2,5 mg/kg), o crescimento de tumor foi significativamente inibido após a administração. No 10° dia após a administração (PG-D10), o tumor de dois de seis camundongos come- çou a desaparecer. No 28º dia após a administração (PG-D28), todos os tumores de seis camundongos tinham desaparecido, e então o tumor de um camundongo regrediu, enquanto os outros cinco camundongos não apresentaram regresso de tumor no fim do experimento (PG-D45). No grupo de alta dose (5 mg/kg), o crescimento tumoral foi significativa- mente inibido após a administração. No 10° dia após a administração (PG-D10), o tumor de um de seis camundongos começou a desapare- cer. No 24° dia após a administração (PG-D24), os tumores de todos os seis camundongos tinham desaparecido. No fim do experimento (PG- D45), os tumores dos camundongos não apresentaram regresso.
[000209] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 0012 produziu um efeito antitumoral significativo na dose de 5 mg/kg comparado com o grupo de controle com veículo, e o volume médio do tumor no 14° dia após a administração (PG-D14) foi de 13 mm3. A inibi- ção de crescimento do tumor (TGI) foi de 99,6%, que foi estatística e significativamente diferente do grupo de controle (p = 0,001). Cresci- mento tumoral foi significativamente inibido nos camundongos deste grupo de tratamento após a administração, e no 10º dia após a adminis- tração (PG-D10), o tumor em dois de seis camundongos começou a de- saparecer; no 31° dia após a administração (PG-D31) o tumor em cinco de seis camundongos tinha desaparecido. No fim do experimento (PG- D45), os tumores dos cinco camundongos não mostraram regresso.
[000210] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 011 produziu efeitos antitumor significativos nas doses de 2 mg/kg e 5 mg/kg em comparação com o grupo de controle com veículo, e o efeito anti-tumor mostrou uma relação dose-resposta significativa. No 14º dia após a administração (PG-D14), os volumes médios dos tumores foram de 818 mm3 e 17 mm3, respectivamente. As taxas de inibição de tumor relativas foram de 73,8% e 99,4 %, respectivamente, e houve diferenças estatisticamente significativas do grupo de controle (ambos com valor p de 0,001). No grupo de alta dose (5 mg/kg), o crescimento tumoral foi significativamente inibido após a administração. No 10° dia após a ad- ministração (PG-D10), o tumor em um de seis camundongos começou a desaparecer. No 28° dia após a administração (PG-D28), os tumores de todos os seis camundongos tinham desaparecido. No fim do experi- mento (PG-D45), os tumores dos camundongos não apresentaram re- gresso.
[000211] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 008 produziu um efeito antitumor significativo em comparação com o grupo de controle com veículo em uma dose de 2,5 mg/kg, e o volume médio dos tumores foi de 1.390 mm3 no 14° dia após a administração (PG-D14). A inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 54,8%, que foi estatística e significativamente diferente do grupo de controle (p = 0,009). Modelo Granta-519
[000212] Células Granta-519 foram cultivadas em meio RPMI 1.640 contendo soro bovino fetal a 10% a 37ºC, 5% de CO2. Células em fase de crescimento logarítmico foram contadas e coletadas, ressuspensas em PBS e Matrigel 1:1 e inoculadas subcutaneamente no lado direito dos camundongos NOD/SCID (fêmeas, 8-9 semanas, peso corporal médio de 20 g, compradas da Bejing Ankai Yibo Biotechnology Co., Ltd., número de certificado animal: 11402400012442; ambiente de alimenta- ção: nível de SPF). O volume de células inoculadas por camundongo foi de 0,1 ml e a quantidade de células inoculadas foi de 1 x 107 células por camundongo. Quando o tamanho médio dos tumores alcançou cerca de 200 mm3, os pesos corporais foram verificados e os camundongos agru- pados aleatoriamente, seguidos pelo início da administração. A admi- nistração foi realizada por veia da cauda, e a frequência de administra- ção foi de apenas uma vez. Padrão de Avaliação de Resultado
[000213] O volume médio dos tumores do grupo de controle com veí- culo da primeira batelada de experimentos atingiu 2.744 mm3 no 17° dia após a administração (PG-D17). A eutanásia foi realizada no grupo de controle e a TGI dos grupos de tratamento com fármaco foi calculada no 17° dia. No 45° dia após a administração, o experimento foi termi- nado e todos os camundongos em repouso foram submetidos a eutaná- sia, enquanto foi registrado o número de camundongos nos quais os tumores foram regredidos completamente em cada grupo. Resultados Experimentais
[000214] Os resultados são mostrados nas Tabelas 11 e 12 e Figuras 4 e 5 abaixo Tabela 11: Efeito de A11259-ADC-001, 002 e 004 em xenoenxertos sub- cutâneos de camundongos nus com linfoma humano Granta-519 Dosa- PG-D17 TGI PG-D46 Grupo Animais Indivíduos de teste gem P Peso corporal (g) (mm3) (%) Total resolvido (mg/kg) 1 6 Veículo (PBS) -- 2744±208 -- -- 23,8±0,3 0
2 6 AS11259-ADC-001 3,5 68±22 97,5 <0,001 22,3±0,5 0 3 6 AS11259-ADC-001 7,0 68±11 97,6 <0,001 21,9±0,6 1 4 6 AS11259-ADC-001 14 49±9 98,2 <0,001 21,6±0,5 2 5 6 AS11259-ADC-002 3,5 871±148 68,5 <0,001 22,7±0,6 0 6 6 AS11259-ADC-002 7,0 246±114 90,8 <0,001 22,8±0,5 0 7 6 AS11259-ADC-002 14 101±9 96,3 <0,001 22,0±0,5 0 8 6 AS11259-ADC-004 3,5 703±116 74,3 <0,001 22,4±0,3 0 9 6 AS11259-ADC-004 7,0 222±46 92,1 <0,001 22,0±0,4 0 10 6 AS11259-ADC-004 14 117±14 95,7 <0,001 20,5±1,0 1 Tabela 12: Efeito de A11259-ADC-001, 0012, 0011 e 010 em xenoen- xertos subcutâneos de camundongos nus com linfoma humano Granta- 519 Ani- Dosagem PG-D17 TGI PG-D45 Grupo Indivíduos de teste P Peso corporal g) mais (mg/kg) (mm3) (%) Total resolvido 1 6 Veículo (PBS) -- 2.535±481 -- -- 24,8±0,6 0 2 6 AS11259-ADC-001 2,5 17±8 99,3 0,001 22,6±0,2 0 3 6 AS11259-ADC-0012 6 6±4 99,8 0,001 22,0±0,6 0 4 6 AS11259-ADC-011 5 11±8 99,6 0,001 22,3±0,3 0 5 6 AS11259-ADC-010 2,5 9±6 99,6 0,001 22,2±0,3 0
[000215] Na primeira batelada de grupos de controle com veículo, o volume médio de tumor alcançou 2,744 mm3 no 17º dia após a adminis- tração (PG-D17).
[000216] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 001 produziu efeitos antitumor significativos em três concentrações (3,5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg) em comparação com o grupo de controle com veículo. Nos três grupos de administração, o volume médio de tu- mor no 17º dia após a administração (PG-D17) foi de 68 mm3 e 49 mm3, respectivamente, e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 97,5%, 97,6% e 98,2 %, respectivamente, estatística e extremamente diferentes do grupo de controle (valores p são menores do que 0,001). No 45° dia após a administração (PG-D45), o volume médio de tumor dos três grupos de administração atingiu 1,268 mm3, 536 mm3 e 184 mm3, respectivamente, indicando que a substância de teste mostrou uma relação dose-resposta significativa no efeito antitumor.
[000217] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 002 produziu efeitos antitumor significativos em três concentrações (3,5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg), em comparação com o grupo de controle com veículo, e apresentou uma relação dose-resposta significativa. No grupo de baixa dosagem (3,5 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 871 mm3 no 17° dia após a administração (PG-D17), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 68,5 %, com diferença estatística e extremamente significativa em comparação com o grupo de controle com veículo (p < 0,001). No grupo de dosagem média (7 mg/kg), o vo- lume médio de tumor foi de 246 mm3 no 17º dia após a administração (PG-D17), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 90,8%, com diferença estatisticamente significativa comparada com o grupo de con- trole com veículo (p < 0,001). No grupo de dosagem alta (14 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 101 mm3 no 17º dias após a administra- ção (PG-D17), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 96,3% com diferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle com veículo (p < 0,001).
[000218] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 004 produziu efeitos antitumor significativos em três dosagens (3,5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg) em comparação com o grupo de controle com veículo, e mostrou uma relação dose-resposta significativa. No grupo de baixa dosagem (3,5 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 703 mm3 no 17° dia após a administração (PG-D17), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi 74 3 %, com diferença estatística e ex- tremamente significativa em comparação com o grupo de controle com veículo (p < 0,001). No grupo de dosagem média (7 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 222 mm3 no 17º dia após a administração (PG- D17), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 92,1% com di- ferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle com veículo (p < 0,001). No grupo de dosagem alta (14 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 117 mm3 no 17º dia após a administra- ção (PG-D17), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 95,7%, com diferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle com veículo (p < 0,001).
[000219] Na segunda batelada do experimento, o volume médio de tumor do grupo de controle com veículo atingiu 2,535 mm3 no 17° dia após a administração (PG-D17).
[000220] O fármaco de teste AS11259-ADC-001 (2,5 mg/kg), AS11259-ADC-0012 (6 mg/kg), AS11259-ADC-011 (5 mg/kg) e AS11259-ADC-010 (2,5 mg/kg) de grupos de tratamento inibiram signi- ficativamente o crescimento de tumor depois da administração. No 17° dia após a administração (PG-D17), o volume médio de tumor foi de 17 mm3, 6 mm3, 11 mm3 e 9 mm3, respectivamente. A inibição de cresci- mento de tumor (TGI) foi 99,3%, 99,8%, 99,6%, e 99 6 %, com diferença estatisticamente significativa comparada ao grupo de controle com veí- culo (todos os valores p são 0,001). Modelo WSU-DLCL2
[000221] Células WSU-DLCL2 foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo soro de bezerro fetal a 10% a 37ºC, 5% de CO2. Células em fase de crescimento logarítmico foram coletadas e inoculadas subcuta- neamente por injeção nos flancos direitos de camundongos NOD/SCID (fêmeas, 8-9 semanas de idade da Bejing Ankai Yibo Biotechnology Co., Ltd. Número de certificado animal: 11402400012441; ambiente de ali- mentação: nível de SPF). O volume de células inoculados por camun- dongo foi 0,1 ml, e a quantidade de células inoculadas foi de 1 x 107. Quando o tamanho médio de tumor alcançou cerca de 200 mm3, tomou- se o peso corporal, os camundongos foram agrupados aleatoriamente e a administração foi iniciada. A administração foi realizada por veia da cauda, e a frequência de administração foi de apenas uma vez. Padrão de Avaliação de Resultado
[000222] No grupo de controle de veículo da primeira batelada, o vo- lume médio de tumor atingiu 2,146 mm3 no 32º dia após a administração (PG-D32). A eutanásia foi realizada no grupo de controle e a TGI dos grupos de tratamento de fármaco foi calculada no 32° dia. No 43° dia após a administração, o experimento foi terminado e todos os camun- dongos em repouso foram submetidos a eutanásia, enquanto foi regis- trado o número de camundongos nos quais os tumores foram regredi- dos completamente em cada grupo.
[000223] Para o grupo de controle de veículo da segunda batelada, o volume médio de tumor atingiu 2,360 mm3 no 35° dia após a adminis- tração (PG-D35). A eutanásia foi realizada no grupo de controle e a TGI dos grupos de tratamento com fármaco foi calculada no 35° dia. No 42° dia após a administração, o experimento foi terminado e todos os ca- mundongos em repouso foram submetidos a eutanásia, enquanto foi re- gistrado o número de camundongos nos quais os tumores foram regre- didos completamente em cada grupo. Resultado Experimental
[000224] Os resultados experimentais são mostrados nas Tabelas 13, 14 e Figuras 6 e 7 abaixo. Tabela 13: Efeito terapêutico de A11259-ADC-001, 004 em xenoenxer- tos subcutâneos de camundongos nus com linfoma humano WSU- DLCl2 Dosagem PG-D32 TGI PG-D43 Grupo Animais Indivíduos de teste P Peso corporal (g) (mg/kg) (mm3) (%) Total resolvido 1 6 Veículo(PBS) -- 2.146±293 -- -- 23,2±0,7 0 2 6 AS11259-ADC-001 3,5 845±86 60,4 0,004 22,9±0,3 0 3 6 AS11259-ADC-001 7,0 273±74 87,6 0,001 22,2±0,4 1 4 6 AS11259-ADC-001 14 132±18 93,7 0,001 21,8±0,1 0 5 6 AS11259-ADC-004 3,5 1.526±73 28,3 0,080 22,3±0,4 0 6 6 AS11259-ADC-004 7,0 1.632±51 24,0 0,123 22,4±0,5 0 7 6 AS11259-ADC-004 14 1.521±91 28,6 0,080 22,8±0,4 0 Tabela 14: efeito Terapêutico De A11259-ADC -001, 0012, 011 e 010 em xenoenxertos subcutâneos de camundongos nus com linfoma hu- mano WSU-DLCl2 Dosagem PG-D35 TGI PG-D42 Grupo Animais Indivíduos de teste P Peso corporal (g) (mg/kg) (mm3) (%) Total resolvido 1 6 Veículo(PBS) -- 2360±164 -- -- 23,7±0,6 0 2 6 AS11259-ADC-001 3,5 919±127 61,0 < 0,001 22,1±0,5 0 3 6 AS11259-ADC-0012 8,4 840±125 64,4 < 0,001 22,7±0,3 0 4 6 AS11259-ADC-011 7,0 700±61 71,4 < 0,001 21,1±0,3 0 5 6 AS11259-ADC-010 3,5 913±248 62,0 0,001 22,1±0,3 0
[000225] No primeiro modelo de xenoenxerto em batelada, o grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC-001 produziu efeitos antitumor significativos em três dosagens (3,5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg) em comparação com o grupo de controle com veículo, e apre- sentou uma relação dose-resposta significativa. No grupo de baixa do- sagem (3,5 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 845 mm3 no primeiro dia após a administração (PG-D32), e a inibição de crescimento de tu- mor (TGI) foi de 60,4 %, com diferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle com veículo (p = 0,004). No grupo de dosagem média (7 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 273 mm3 no primeiro dia após a administração (PG-D32), e a inibição de cresci- mento de tumor (TGI) foi de 87,6%, com diferença estatisticamente sig- nificativa em comparação com o grupo de controle de veículo (p = 0,001) . No grupo de dosagem alta (14 mg/kg), o volume médio de tumor foi de 132 mm3 no primeiro dia após a administração (PG-D32), e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 93,7%, com diferença estatistica- mente extremamente significativa em comparação com o grupo de con- trole com veículo (p = 0,001).
[000226] O grupo de tratamento com fármaco de teste AS11259-ADC- 004 produziu um ligeiro efeito antitumor em três grupos de dosagem (3,5 mg/kg, 7 mg/kg, 14 mg/kg) em comparação com o grupo de controle com veículo, mas sem diferenças estatísticas significativas. Nos três grupos de dosagem, o volume médio de tumor no 32º dia após a admi- nistração (PG-D32) foi de 1.526 mm3, 1.632 mm3 e 1.521 mm3, respec- tivamente, e a inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 28,3%, 24,0% e 28,6, respectivamente. Os valores p foram de 0,080; 0,123 e 0,080, respectivamente.
[000227] No segundo modelo de xenoenxerto em batelada, o fármaco de teste AS11259-ADC-001 (3,5 mg/kg), AS11259-ADC-0012 (8,4 mg/kg), AS11259-ADC-011 (7 mg/kg) e AS11259-ADC-010 (3,5 mg/kg) do grupo de tratamento inibiram todos significativamente o crescimento de tumor depois da administração. No 35° dia após a administração (PG-D35), os volumes médios de tumor foram de 912 mm3, 840 mm3, 700 mm3 e 913 mm3, respectivamente. A inibição de crescimento de tumor (TGI) foi de 61,0%, 64,4%, 71,4% e 62 0 %, com valores p < 0,001, < 0,001, < 0,001, e 0,001 respectivamente. O fármaco de teste foi bem tolerado pelos camundongos de todos os grupos de dosagem.
[000228] Todos os documentos mencionados no presente pedido são aqui incorporados na íntegra como referência, como se qualquer docu- mento individual fosse referenciado em sua totalidade. Além disso, deve ser entendido que várias modificações e mudanças podem ser feitas por aqueles versados no estado da técnica, as quais devem todas se en- quadrar no escopo das reivindicações anexas.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, em que esse anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de liga- ção com antígeno é caracterizado pelo fato de que compreende: HCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1; HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3; LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4; LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5; LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6.
2. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da HCDR1 do anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno é apresentada na SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácidos de HCDR2 é apresentada na SEQ ID NO: 2, a sequência de aminoácidos de HCDR3 é apresentada na SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos de LCDR1 é apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência de aminoácidos de LCDR2 é apresen- tada em SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos de LCDR3 é apre- sentada em SEQ ID NO: 6
3. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD79b é um anticorpo monoclonal, e/ou o anti- corpo anti-CD79b é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico
4. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CD79b é apresentada em SEQ ID NO: 7 ou 11, e/ou a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anti- corpo anti-CD79b é apresentada em SEQ ID NO: 8 ou 12; ou a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pe- sada do anticorpo anti-CD79b é selecionada a partir da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-17, e/ou a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CD79b é selecionada a partir da sequência de aminoáci- dos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-22.
5. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo anti- CD79b é selecionada de sequências de aminoácidos que têm pelo me- nos 90% de identidade de sequência com qualquer uma do grupo que consiste das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31 e 33; e a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-CD79b é selecionada a partir de sequências de aminoácidos que têm pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma do grupo que consiste das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32 e 34.
6. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD79b é selecionado do grupo que consiste em: (1) um anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada em SEQ ID NO: 25, e a sequência de aminoáci- dos da cadeia leve é apresentada em SEQ ID NO: 26; (2) um anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada em SEQ ID NO: 27, e a sequência de aminoáci- dos da cadeia leve é apresentada em SEQ ID NO: 28;
(3) um anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 29, e a sequência de aminoáci- dos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 30; (4) um anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 31, e a sequência de aminoáci- dos da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 32; (5) um anticorpo cuja sequência de aminoácidos da cadeia pesada é apresentada em SEQ ID NO: 33, e a sequência de aminoáci- dos da cadeia leve é apresentada em SEQ ID NO: 34.
7. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que é um conjugado do anticorpo, ou fragmento seu de ligação com antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, com um agente citotóxico.
8. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindi- cação 7, caracterizado pelo fato de que sua estrutura é como segue: A-(V-L-D)n em que: A é um anticorpo; V-L é um ligante, V pode ou não estar presente e é um ele- mento ligante do tipo de bismaleimida ou tetramalemida; L pode ou não estar presente, e pode ser um ligante clivável ou um ligante não clivável; pelo menos um de V e L está presente; D é um agente citotóxico de interesse; e n é um número inteiro de 1 a 4.
9. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindi- cação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é um fármaco quimioterápico, um inibidor de crescimento, uma toxina ou um radioisótopo.
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, ou um conjugado do mesmo com um fármaco, e um portador farmaceuticamente aceitável.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica com- preende o conjugado anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
12. Sequência de polinucleotídeo, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma sequência de polinucleotídeo que codifica a sequên- cia de aminoácidos de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-8, 11-22 e 25-34; (2) uma sequência de polinucleotídeo que codifica o anti- corpo ou fragmento seu de ligação com antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; (3) a sequência complementar da sequência de polinucleotí- deo de (1) ou (2).
13. Sequência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindi- cação 12, caracterizada pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em: (a) a sequência de polinucleotídeo apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-39; e (b) a sequência complementar da sequência de polinucleotí- deo de (a).
14. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou um fragmento seu de ligação com antígeno, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, ou sua sequência complementar, em que o vetor é um vetor de clonagem ou um vetor de expressão.
15. Anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um conjugado do anticorpo, ou um fragmento seu de ligação com antígeno, com um fármaco, caracterizado pelo fato de que é para uso na prepara- ção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma do- ença mediada por CD79b; preferivelmente, o conjugado é como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença é um câncer do sistema hematopoiético, pre- ferivelmente um distúrbio proliferativo de células B; preferivelmente, a doença é linfoma ou leucemia; mais preferivelmente, a doença é seleci- onada a partir de linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recorrente, NHL recorrente indolor, NHL refratário, NHL refra- tário indolor, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL) ou leucemia linfocítica aguda (ALL)
17. Uso de um anticorpo anti-CD79b ou seu fragmento de ligação com antígeno, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que se destina à preparação de um agente de diagnóstico para um distúrbio proliferativo celular associ- ado ao aumento de expressão de CD79b.
18. Artigo que compreende um primeiro recipiente, caracte- rizado pelo fato de que o primeiro recipiente compreende uma compo- sição que contém o anticorpo anti-CD79b ou fragmento seu de ligação com antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou o conjugado do anticorpo anti-CD79b, ou fragmento seu de ligação com antígeno, com um fármaco, ou uma composição farmacêutica do anticorpo anti-CD79b, ou fragmento seu de ligação com antígeno, ou do conjugado.
19. Artigo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente um segundo recipiente que com- preende um tampão farmaceuticamente aceitável; ou a composição compreende o anticorpo anti-CD79b ou frag- mento seu de ligação com antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o artigo compreende adicionalmente um recipiente que contém um diluente, tampão ou anticorpo de controle para detec- ção.
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