KR20210076956A

KR20210076956A - α-시누클레인병증, 타우병증 및 기타 장애를 억제 및 치료하기 위한 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온

Info

Publication number: KR20210076956A
Application number: KR1020217014520A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 더블유. 힌만; 찰스 알. 홀스트; 안젤라 미넬라; 폴 몰라드; 션 핀쵸브스키; 제프리 케이. 트리머; 에릭 토레이
Original assignee: 피티씨 테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2018-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-06-24
Also published as: IL282375A; FI3866772T3; BR112021007153A2; MX2021004329A; PL3866772T3; EP4257190A3; EP4257190A2; US20210276937A1; US20220106248A1; WO2020081879A3; CA3116866A1; TN2021000075A1; EP3866772A2; JP2022505257A; EP3866772B1; PE20211600A1; CO2021006356A2; ECSP21034596A; SG11202103887VA; WO2020081879A2

Abstract

본원에 개시된 것은 치료 유효량의 화학식 1 (

)의 화합물 또는 이의 하이드로퀴논(hydroquinone) 형태; 또는 이의 용매화물 또는 수화물을 α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료 또는 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 억제하는 방법이다.

Description

α-시누클레인병증, 타우병증 및 기타 장애를 억제 및 치료하기 위한 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온

본 출원은 2018년 10월 17일자로 출원된 알츠하이머 질환을 억제 및 치료하기 위한 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온(2,3,5-TRIMETHYL-6-NONYLCYCLOHEXA-2,5-DIENE-1,4-DIONE FOR SUPPRESSING AND TREATING ALZHEIMER'S DISEASE AND OTHER DISORDERS)이란 명칭의 미국 특허 출원 제62/747,080호 및 2018년 11월 26일자로 출원된 알츠하이머 질환을 억제 및 치료하기 위한 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온(2,3,5-TRIMETHYL-6-NONYLCYCLOHEXA-2,5-DIENE-1,4-DIONE FOR SUPPRESSING AND TREATING ALZHEIMER'S DISEASE AND OTHER DISORDERS)이란 명칭의 미국 특허 출원 제62/771,570호에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.

미국특허공개공보 제2007/0072943호는 특정 퀴논(quinone) 화합물 및 특정 미토콘드리아 장애(mitochondrial disorders) 치료 방법을 개시하고 있다. 미국특허공개공보 제2010/0063161호는 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온(2,3,5-trimethyl-6-nonylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione) 화합물 및 전반적 발달 장애(pervasive development disorders) 및 주의력 결핍 과다 행동 장애(Attention Deficit Hyperactivity Disorder: ADHD)를 치료하기 위한 방법을 개시하고 있다.

α-시누클레인병증(α-synucleinopathies), 타우병증(taupathies), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 및 허혈성 재관류 관련 손상(ischemic-reperfusion related injuries)을 포함하는 질환을 치료 또는 억제하기 위한 방법을 개선시키는 것이 필요하다. 또한, 뇌 침투가 우수하고/하거나 신체의 다른 부위(예: 혈장)에 비해 뇌로 우선적으로 분할되는 화합물이 요구된다.

또한, 약학 조성물; 약학 조성물의 제조; 및 α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측상경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상을 포함하는 질환을 치료 또는 억제하기 위한 방법에 사용될 수 있는 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 및 그 입자의 안정한 다형체(polymorph)가 필요하다.

본 발명의 하나의 양태는 치료 유효량의 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 하이드로퀴논 형태; 또는 이의 용매화물 또는 수화물을 α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료 또는 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 억제하는 방법이다.

일부 구현예에서, 상기 화합물은 용매화물 또는 수화물이 아니다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 퀴논 형태이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 하이드로퀴논 형태이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 α-시누클레인병증을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, α-시누클레인병증은 파킨슨병, 파킨슨병 치매(Parkinson's Disease with dementia: PDD), 다계통 위축증(multisystem atrophy: MSA), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia), 루이소체 치매(Dementia with Lewy Bodies: DLB), 고셔병(Gaucher's disease: GD), 뇌 철분 축적 신경 퇴행증(Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation: NBIA) 및 신경축삭퇴행위축(neuroaxonal dystrophies)(PLA2G6-관련 신경변성(PLA2G6-associated neurodegeneration))로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 파킨슨병은 유전성이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 파킨슨병은 특발성(idiopathic)이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 환자가 다음의 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는다: MAPT(Microtubule-associated protein tau: 미세소관 관련 타우 단백), PRKN(parkin: 파킨), PINKK1(PINK1: 핑크1), LRRK2(Leucine-rich repeat kinase: 류신 리치 리피트 키나제), GBA(glucocerebrosidase: 글루코세레브로시다제),SNCA(알파 시누클린), PARK7(DJ-1) 및/또는 UCHL1(ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1: 유비퀴틴 카르복시 말단 에스테라제 L1). 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 타우병증을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 타우병증은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 권투선수 치매(dementia pugilistica), 괌 근위축성 측삭경화증-파킨슨병-치매(Guam Amyotrophic lateral sclerosis-Parkinsonism-Dementia: Guam ALS/PD), 픽병(Pick Disease), 은친화입자병(Argyrophilic grain dementia), 니만-피크병 타입 C(Niemann-Pick type C), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis: SSPE), 진핵성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy: PSP), 다계통 위축증(multisystem atrophy: MSA), 피질기저핵변성(Corticobasoganlionic degeneration), 파킨슨 증후군-17에 의한 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia with parkinsonism-17: FTDP-17), 뇌염후 파킨슨병(Postencephalitic Parkinsonism: PEP) 및 상염색체 열성 유전 파킨슨 증후군(Autosomal recessive Parkinsonism). 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 알츠하이머 질환을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 파킨슨병을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 외상성 뇌손상을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 허혈성 재관류 관련 손상을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 뇌졸중을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 근위축성 측삭경화증(ALS)을 치료하거나 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 치료하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 억제하기 위한 것이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 경구로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 정맥으로 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 치료 유효량의 화학식 1 (

)의 화합물 또는 이의 하이드로퀴논 형태; 또는 이의 용매화물 또는 수화물을 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료 또는 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 억제하는 방법이다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 화학식 1 (

) 또는 이의 하이드로퀴논 형태이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 퀴논 형태이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 하이드로퀴논 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 알츠하이머 질환을 억제 또는 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 파킨슨병을 억제 또는 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 특발성 파킨슨병을 치료 또는 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 가족성(즉, 유전성) 파킨슨병(familial parkinson's disease)을 치료 또는 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 환자가 다음 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는다: MAPT, PRKN, PINKK1, LRRK2, GBA, SNCA, PARK7(DJ-1) 및/또는 UCHL1. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외상성 뇌손상을 억제 또는 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 허혈성 재관류 관련 손상을 억제 또는 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 허혈성 재관류 관련 손상은 뇌졸중이다. 일부 구현예에서, 허혈성 재관류 관련 손상은 허혈성 재관류 망막 손상이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 경구로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 주사로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 정맥으로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 억제하는 방법이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 치료하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태는 분말 X선 회절 패턴이 적어도 4.10, 12.12 및 16.14의 각도 위치에서의 특성 피크(characteristic peak)를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있는 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 무수물 다형체이다. 일부 구현예에서, 구리(Cu) Kα1 소스를 통해 1.540598Å의 파장 및 23~25℃의 온도의 데이터를 얻는다. 일부 구현예에서, 상기 다형체는 적어도 4.10, 11.77, 12.12 및 16.14의 각도 위치에서 특성 피크를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 다형체는 적어도 4.10, 11.77, 12.12, 16.14 및 22.41의 각도 위치에서 특성 피크를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있다. 일부 또는 임의의 구현예에서, 상기 다형체의 분말 X선 회절 패턴은 4.10, 11.77, 12.12, 16.14 및 22.41의 각도 위치 중 적어도 하나에서 특성 피크를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있다. 일부 또는 임의의 구현예에서, 상기 다형체의 분말 X선 회절 패턴은 4.10, 11.77, 12.12, 16.14 및 22.41의 각도 위치 중 적어도 두 개에서 특성 피크를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있다. 일부 또는 임의의 구현예에서, 상기 다형체의 분말 X선 회절 패턴은 4.10, 11.77, 12.12 및 16.14의 각도 위치 중 적어도 두 개에서 특성 피크를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있다. 일부 또는 임의의 구현예에서, 상기 다형체의 분말 X선 회절 패턴은 4.10, 12.12 및 16.14의 각도 위치 중 적어도 두 개에서 특성 피크를 포함하며, 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 각도 위치는 ±0.1로 변할 수 있다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 각도 위치는 ±0.05로 변할 수 있다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 다형체는 실질적으로 도 5, 11, 14 및 16 중 어느 하나에 도시된 것과 같은 분말 X선 회절 패턴을 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 다형체는 실질적으로 도 7에 도시된 것과 같은 시차 주사 열량계(Differential scanning calorimetry: DSC) 열상(thermogram)을 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, DSC 열상은 약 47℃ 내지 약 53℃에서 단일 흡열 피크(single endothermic peak)를 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, DSC 열상은 약 49℃ 내지 약 53℃에서 단일 흡열 피크를 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, DSC 열상은 약 50℃ 내지 약 52℃에서 단일 흡열 피크를 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, DSC 열상은 약 50.5℃에서 단일 흡열 피크를 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 다형체는 실질적으로 도 8에 도시된 것과 같은 열중량 분석(thermogravimetric analysis: TGA) 열상을 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 다형체는 실질적으로 도 6에 도시된 것과 같은 ¹H NMR 스펙트럼을 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 임의의 용매, 담체(carriers) 또는 부형제(excipients)를 제외하고는, 약 95%/몰 이상의 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 다형체다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고, 약 99%/몰 이상의 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 다형체다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, HPCL로 측정할 때, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고는, 상기 조성물의 적어도 약 95% a/a가 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, HPCL로 측정할 때, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고는, 상기 조성물의 적어도 약 99% a/a가 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 역가(potency)가 적어도 약 95% 이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 역가(potency)가 적어도 약 99% 이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 다형체는 복수의 입자로 존재하며 상기 입자의 D90:D10의 비가 약 11:1 미만이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 다형체는 복수의 입자로 존재하며 상기 입자의 D90:D10의 비가 약 7:1 미만이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 다형체는 약 75~85%의 IPA/물을 포함하는 용매에 의해 재결정화되었다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 다형체는 약 80~85%의 IPA/물을 포함하는 용매에 의해 재결정화되었다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 다형체는 약 85%의 IPA/물을 포함하는 용매에 의해 재결정화되었다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 다형체 또는 본원에 기재된 조성물, 및 약학적으로 혀옹가능한 용매, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물, 또는 본원에 기재된 다형체 또는 본원에 기재된 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 용매, 담체 또는 부형제로 제조된 약학 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 다형체 또는 본원에 기재된 조성물의 치료 유효량을 α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 외상성 뇌손상 또는 허혈성 재관류 관련 손상의 치료 또는 억제를 필요로하는 개체(individual)에게 투여하는 것을 포함하는, α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 또는 허혈성 재관류 관련 손상을 치료 또는 억제하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 조성물로부터 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온을 재결정화하는 방법이다: (a) 조성물을 약 40~45℃의 온도에서 IPA(isopropanol) 및 물과 접촉시켜 IPA 대 물의 생성되는 비율이 약 75~87% (IPA) / 25~13% 물(v:v)로 되도록 하는 단계; (b) 혼합물을 약 32℃로 냉각시키는 단계; 및 (c) 상기 혼합물로부터 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온을 여과하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 단계 (a)는 하기 단계를 포함한다: (a1) 조성물과 IPA를 접촉시키는 단계; (a2) 혼합물을 약 40~45℃로 가온시키는 단계; 및 (a3) 상기 혼합물에 물을 첨가하여 IPA 대 물의 비율이 약 75~85% IPA : 25~15% 물(v:v)로 되도록 하는 단계. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (a)는 교반하여 조성물을 용해시키는 단계를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, IPA 대 물의 비율은 약 80~85% IPA : 20~15% 물(v:v)이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, IPA 대 물의 비율은 약 85% IPA : 15% 물(v:v)이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 단계 (a3)는 혼합물의 온도를 약 40~45℃의 온도로 되돌리는 것을 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 이후에 혼합물을 연마 여과하는 것(polish filtering)을 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2~10시간동안 약 32℃로 냉각시키는 단계를 포함한다. 단계 (b)는 약 6시간동안 약 32℃로 냉각시키는 단계를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (b) 이후에 단계 (b1)으로서, 혼합물을 약 32℃에서 약 2~24시간에 걸쳐 고정(holding)하는 단계를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (b) 이후에 단계 (b1)으로서, 혼합물을 약 32℃에서 약 6시간에 걸쳐 고정하는 단계를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (b) 또는 단계 (b1)이 존재하는 경우 단계 (b) 또는 단계 (b1) 이후에 단계 (b2)으로서, 혼합물을 약 0℃로 냉각시키는 단계를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (b2)는 약 3~24시간에 걸쳐 혼합물을 약 0℃로 냉각시키는 단계를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 단계 (b2)는 약 0℃에서 약 1시간에 걸쳐 혼합물을 고정하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법에 따라 제조된 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온을 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 이전 단락 중 어느 하나에 기재된 다형체 또는 이전 단락 중 어느 하나에 기재된 조성물을 액체 또는 에멀젼 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조방법이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 경구 용액, 액체로 충전된 캡슐 또는 주사용 용액으로 제공된다. 이러한 방법에 따라 제조된 약학 조성물들이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태는 실질적으로 도 31에 나타난 X-선회절분석 (x-ray powder diffraction: XRPD) 플롯(plot)을 갖는 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 준안정성 용융 비정질 형태(metastable melted amorphous form)이다.

본 발명의 하나의 양태는 치료 유효량의 화학식 1 (

)의 화합물 또는 이의 하이드로퀴논 형태이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 퀴논 형태이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 하이드로퀴논 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 알츠하이머 질환을 억제 또는 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 파킨슨병을 억제 또는 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 특발성 파킨슨병을 치료 또는 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 가족성(즉, 유전성) 파킨슨병을 치료 또는 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 파킨슨병을 억제 또는 치료하는 방법은 환자가 다음 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것이다: MAPT, PRKN, PINKK1, LRRK2, GBA, SNCA, PARK7 및/또는 UCHL1. 일부 구현예에서, 방법은 외상성 뇌손상을 억제 또는 치료하는 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 허혈성 재관류 관련 손상을 억제 또는 치료하는 것이다. 일부 구현예에서, 허혈성 재관류 관련 손상은 뇌졸중이다. 일부 구현예에서, 허혈성 재관류 관련 손상은 허혈성 재관류 망막 손상이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 경구로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 주사로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 화합물은 정맥으로 투여된다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 억제하는 방법이다. 전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 질환을 치료하는 방법이다.

전술한 모든 화합물을 포함하여 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 내용(internal use)으로 제형화된다. 전술한 모든 화합물을 포함하여 본원에 기대된 임의의 하나 이상의 화합물은 단위 용량 제제로 제형화될 수 있다.

본원에 기재된 모든 화합물, 조성물, 제제 및 방법에 대해, 필요한 경우 퀴논 형태의 임의의 화합물을 또한 환원된 형태(하이드로퀴논)로 사용할 수 있다. 즉, 사이클로헥사디엔디온(cyclohexadienedione) 화합물(산화된 퀴논) 형태로 본원에 언급된 화합물은 필요한 경우 벤젠다이올(benzenediol)(환원된 하이드로퀴논)형태로도 사용할 수 있다.

본원에 기재된 모든 화합물, 조성물 및 제제 및 본원에 기재된 화합물 또는 조성물 또는 제제를 사용하는 모든 방법에 대해, 상기 화합물 또는 조성물은 나열된 성분 또는 단계를 포함할 수 있거나, 나열된 성분 또는 단계로 "필수적으로 이루어지는(consist essentially of)" 것 일 수 있거나, 나열된 성분 또는 단계로 "구성되는(consist of)" 것 일 수 있다. 즉, 전환 문구(transitional phrase) "포함하는" 또는 "포함하다"는 전환 문구 "필수적으로 이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지다"로 대체될 수 있다. 바꾸어 말해, 일부 구현예에서, "포함하는" 또는 "포함하다"는 "구성된" 또는 "구성되다"로 대체될 수 있다. 조성물이 나열된 성분으로 "필수적으로 이루어지는" 것으로 기술될 때, 조성물은 나열된 성분을 포함하고, 치료 상태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 성분을 포함할 수 있지만, 명시적으로 나열된 성분 이외의 치료 상태에 실질적으로 영향을 미치는 다른 성분을 포함할 수 없다. 또는 조성물이 나열된 것 이외에 치료 상태에 실질적으로 영향을 미치는 추가 성분을 포함하는 경우, 조성물은 치료 상태에 실질적으로 영향을 미치기에 충분한 농도 또는 양의 추가 성분을 함유하지 않는다. 방법이 나열된 단계로 "필수적으로 이루어지는" 것으로 기술될 때, 방법은 나열된 단계를 포함하고 치료 상태에 실질적으로 미치지 않는 다른 단계를 포함할 수 있지만, 명시적으로 나열된 단계 이외의 치료에 실질적으로 영향을 미치는 단계를 포함하지 않는다. 비제한적인 특정 예로서, 조성물이 성분으로 '필수적으로 이루어지는' 것으로 기술될 때, 조성물은 임의의 양의 약학적으로 허용되는 담체, 비히클, 부형제 또는 희석제 및 실질적으로 치료 상태에 영향을 미치지 않는 기타 성분을 포함할 수 있다.

본 발명은 α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측상경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상을 치료 또는 억제하기 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. α-시누클레인병증은 신경세포(neurons), 신경 섬유(nerve fibers) 또는 교세포(glial cells)에 α-시누클린 단백질(alpha-synuclein protein)의 응집체(aggregates)가 비정상적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)이다. 타우병증은 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease)과 같이 인간의 뇌에서 신경섬유(neurofibrillary) 또는 신경교원섬유 매듭(gliofibrillary tangles)에 있는 타우 단백질(tau protein)의 병리학적 응집과 관련된 신경퇴행성 질환에 속한다. (예를 들어, 세포 및 분자 신경생물학(Cellular and Molecular Neurobiology) (2018) 38:965-980 참조). 실시예에서 볼 수 있듯이, 청구된 화합물은 α-시누클린 단백질의 응집 감소와 타우 단백질의 응집 감소에 효과가 있음이 증명되었다. 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 청구된 질환의 경우 약물이 뇌에 침투하는 것이 유리할 수 있으며, 또한 약물이 다른 조직에 비해 뇌로 우선적으로 분할되도록 하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방식으로 비표적 효과(off-target) 및 부작용을 줄일 수 있다. 발명자들은 놀랍게도 청구된 화합물이 뇌 침투력이 뛰어나고 혈장과 비교하여 뇌로의 분할이 우수하다는 것을 발견하였다.

본 발명은 더 나아가 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 화합물의 고체 형태, 보다 바람직한 입자 형태(particle morphology)와 입자 크기 분포와 같은 바람직한 특성을 갖는 더 높은 순도의 상기 고체 형태를 포함하는 조성물, 및 상기 고체 형태와 상기 조성물의 제조 방법을 제공한다. 발명의 설명, 실시예 및 도면에서 볼 수 있듯이, 상기 조성물은 가령 순도 향상(예를 들면, 낮은 은 함유량), 취급 특성 개선(예를 들면, 유동성(flowability)) 및 향상된 약학 제조 능력(예를 들면, 제분 능력 향상)과 같은 유익한 특성을 갖는다. 상기 입자들은 이전의 공정에 비해 양호한 흐름과 형태학적 특성을 갖는다. 상기 입자의 사용은 예를 들면, 캡슐 주입과 같은 의약품 제조를 촉진시킨다. 또한, 상기 입자를 사용하면 의약품 제조에 필요한 부형제(excipient)의 양을 줄일 수 있어 비용, 시간, 공정 효율성 측면에서 이점을 제공할 수 있다. 실제로, 약물이 끈적거리거나 잘 흐르지 않는 경우 해당 약물의 취급을 개선하기 위해 더 많은 부형제가 필요할 수 있다. 또한 약물 물질 밀링(milling)이 필요한 경우, 끈적한 소재는 밀링장비의 표면 손실로 인한 생산 손실을 일으키며, 또한 밀링된 제품이 부서지기 어렵도록 더 혹은 단단하게 응집하게 된다. 이러한 특성은 의약품 제조 공정에서 바람직하지 않으며, 기술된 공정에 의해 개선된다.

본원에 사용된 약어는 달리 명시하지 않은 한 화학 및 생물학적 기술 내에서 일반적인 의미를 갖는다.

본원에서 수치 또는 파라미터(parameter)에 대한 "약"에 대한 언급은 그 수치 또는 파라미터 자체에 대한 변형을 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"을 지칭하는 설명에는 "X"에 대한 설명이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "약" 및 "대략"이라는 용어가 조성물 또는 제형(dosage form)의 성분의 온도, 투여량, 양 또는 무게 백분율과 같은 다양한 용어와 관련하여 사용될 때, "약" 및 "대략"이라는 용어는 예를 들어, 특정 온도 투여량(temperature dose), 양 또는 무게 백분율에서 얻은 것과 동등한 효과를 제공하기 위해 통상의 기술자에 의해 인식되는 온도, 투여량, 양 또는 무게 백분율을 의미한다. 구체적으로, "약" 및 "대략"이라는 용어가 본원에 사용될 경우, "약" 및 "대략"이라는 용어는 온도, 투여량, 양 또는 무게 백분율 등을 15% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 혹은 0.5% 이내의 특정 온도, 투여량, 양 또는 무게 백분율 등을 고려한다.

본원에 사용된 용어 단수형("a" 또는 "an")은 문맥상 달리 명백히 지시하지 않는 한 하나 이상을 의미한다.

"대상", "개체" 또는 "환자"는 개별 유기체, 바람직하게는 포유 동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.

본원에 논의된 화합물 및 방법으로 질환을 "치료하는 것"은 질환 또는 하나 이상의 질환 증상을 감소 또는 제거하기 위해, 질환 또는 하나 이상의 질환 증상의 진행을 지연시키기 위해 또는 질환의 중증도 또는 하나 이상의 질환 증상을 감소시키기 위해 추가 치료제와 함께 또는 추가 치료제 없이 본원에서 논의된 하나 이상의 화합물을 투여하는 것으로 정의한다. 본원에 논의된 화합물 및 방법을 사용한 질환의 "억제"는 질환의 임상적 발현을 억제하기 위해 또는 질환의 불리한 증상 발현을 억제하기 위해 추가 치료제와 함께 또는 추가 치료제 없이 본원에 논의된 하나 이상의 화합물을 투여하는 것으로 정의한다. 치료와 억제의 차이는 치료는 질환의 부작용이 피실험자에게 나타난 후에 이루어지는 반면, 억제는 질환의 부작용이 피실험자에게 나타나기 전에 일어나는 것이다. 억제는 부분적으로, 실질적으로 전체 또는 전체일 수 있다. 일부 구현에서는 유전적 스크리닝을 사용하여 질환의 위험이 있는 환자를 식별할 수 있다. 본원에 개시된 화합물 및 방법은 이상 증상의 출현을 억제하기 위해 질환의 임상 증상에 걸릴 위험이 있는 무증상 환자에게 투여할 수 있다.

본원에 논의된 화합물의 "치료적 사용"은 본원에 정의된 바와 같이 질환을 치료하거나 억제하기 위해 본원에 논의된 화합물 중 하나 이상을 사용하는 것으로 정의한다. 화합물의 "치료 유효량"은 피실험자에게 투여될 때 질환 또는 하나 이상의 질환 증상을 감소 또는 제거시키거나, 질환 또는 하나 이상의 질환 증상의 진행을 지연시키거나, 질환 또는 하나 이상의 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환의 임상적 징후를 억제하거나 또는 질환의 부작용 징후를 억제하기에 충분한 화합물의 양이다. 치료 유효량은 1회 이상의 투여로 제공될 수 있다.

본원에서 "2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온"과 "C9"은 상호 교환적으로 사용된다.

본원에서 "2,3,5-트리메틸-6-옥틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온(2,3,5-trimethyl-6-octylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione)"과 "C8"은 상호 교환적으로 사용된다.

본원에서 "2,3,5-트리메틸-6-헵틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온(2,3,5-trimethyl-6-heptylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione)"과 "C7"은 상호 교환적으로 사용된다.

"하이드로퀴논(hydroquinone) 형태"는 2개의 옥소 그룹(oxo group)의 순수 전환(net conversion)을 두개의 하이드록시 그룹(hydroxy group)으로 제공하면서 퀴논 고리의 2개 전자가 환원될 때의 화합물의 형태를 말한다. 예를 들면, 퀴논 화합물 (

)의 하이드로퀴논의 형태는

이다.

본원에서 "알파-시누클린" 과 "α-시누클린"은 상호 교환적으로 사용된다.

본원에 포함된 화합물에 대한 설명은 또한 일부 구현에서 모든 동위원소 단백질을 포함하며 일부 구현 예에서 본원의 모든 화합물의 부분 중소화 유도체(deuterated analogs) 또는 과중수소화 유도체(perdeuterated analog)를 포함한다.

허혈성 재관류 관련 손상에는 뇌졸중(stroke) 및 허혈성 재관류 망막 손상(ischemic reperfusion-related retinal injury)이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

"뇌졸중"은 허혈성 뇌졸중(비 제한적인 예는 혈전성 뇌졸중(thrombotic stroke) 및 출혈성 뇌졸중(embolic stroke)을 포함한다.), 출혈성 뇌졸중(비 제한적인 예는 뇌내 출혈(intracerebral hemorrhage) 및 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage)을 포함한다.) 및 일시적인 허혈 발작(transient ischemic attack)을 포함한다. 일부 구현 예에서, 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중이다. 일부 구현 예에서, 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중이다. 일부 구현 예에서, 뇌졸중은 일시적인 허혈 발작이다.

일부 구현 예에서, 본원의 청구 범위에 기재된 모든 특성화 데이터(예. XRPD피크, DSC TGA, 입자 크기 분포 등)를 위해 데이터는 본원에 기재된 바와 같이 실질적으로 수행되는 방법(예를 들어, XRPD, DSC 및 TGA, 특정 방법론은 실시예 7 참조)에 의해 획득한다. "실질적으로 본원에 기재된 바와 같음"은 통상의 기술자가 특정 방법으로부터 수득한 것과 실질적으로 동등한 결과를 제공하기 위해 통상의 기술자에 의해 인식되는 방법을 사용하는 것을 나타낸다.

약학 제제

청구된 결정 형태의 경우, 잔류 용매는 허용 한계 내에 있으므로 제약 조성물로의 제형화에 매우 적합하다. 고체 형태 또한 결정화 기술을 통해 쉽게 정제할 수 있다. 청구된 결정 형태는 흡습성(hygroscopic)이 없고 수화물/용매화물이 아니므로 습도 노출과 관련하여 특별한 취급이 필요하지 않다. 또한, 재결정화 공정에 의한 개선된 형태로 인해 제조 시 취급이 용이하다(자세한 내용은 본원에서 설명). 본원에 기재된 화합물은 약학적으로 허용되는 부형제, 약학적으로 허용되는 담체(carriers) 및 약학적으로 허용되는 비히클과 같은 첨가제와 함께 제약성분으로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용되는 적합한 부형제, 담체 및 비히클은 일부 구현 예에서의 인산 칼슘(calcium phosphate), 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 탈크(talc), 단당류(monosaccharides), 이당류(disaccharides), 전분(starch), 젤라틴(gelatin), 셀룰로오스(cellulose), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 데스트로스(dextrose), 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(hydroxypropyl-β-cycoldextrin), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 저융점 왁스(low melting waxes), 이온 교환 수지(ion exchange resins) 등과 같은 약물 전달 조정제(modifiers), 인핸서(enhancers) 및 가공제뿐만 아니라 이들 임의의 둘 이상의 조합을 포함한다. 다른 약학적으로 허용되는 적합한 부형제에 대해서는 본원에 참조로 포함된 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey(1991), "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Lippincott Williams & wilkins, Philadelphia, 20th edition(2003) 및 21st edition(2005)에 기술되어 있다.

약학 조성물은 단위 용량 제형을 포함할 수 있으며, 여기서 단위 용량은 치료효과를 갖기에 충분한 양이다.

본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 일부 구현예에서 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하여 의도된 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 액체 담체는 일반적으로 용액, 현탁액 및 에멀젼을 준비하는데 사용된다. 본 발명의 실시에 사용되는 액체 담체는 일부 구현예에서 물, 식염수, 약학적으로 허용되는 유기용매, 약학적으로 허용되는 오일 또는 지방 및 이들 둘 이상의 혼합물을 포함한다. 액체 담체는 용해제(solubilizers), 유화제(emulsifiers), 영양소(nutrients), 완충제(buffers), 보존제(preservatives), 부유제(suspending agent), 두께 조절제(thickening agents), 점도 조절제(viscosity regulators), 안정제(stabilizers) 등과 같은 다른 적절한 약제 첨가물을 포함할 수 있다. 적절한 유기 용매는 일부 구현예에서 에탄올과 같은 1가 알코올(monohydric alcohols) 및 글라이콜(glycol)과 같은 다가 알코올(polyhydric alcohols)을 포함한다. 적절한 오일은 일부 구현예에서 참기름(sesame oil), 대두유(soybean oil), 코코넛 오일(coconut oil), 올리브 오일(olive oil), 홍화유(safflower oil), 면실유(cottonseed oil) 등을 포함한다. 비경구 투여(parenteral administration)의 경우, 담체는 또한 올레인산에틸(ethyl oleate) 및 이소프로필미리스테이트(isopropyl myristate) 등과 같은 유성 에스터(oily ester)일 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 마이크로입자, 마이크로캡슐, 리포솜 캡슐화제(liposomal encapsulates) 등의 형태일 수 있을 뿐만 아니라 이들의 임의의 2개 이상의 조합일 수 있다.

예를 들어 Lee, "Diffusion-Controlled Matrix Systems", (pp. 155~198) 및 Ron and Langer, "Erodible Systems", (pp. 199-224), "Treatise on Controlled Drug Delivery", A. Kydonieus Ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1992)에 설명된 바와 같이 확산 제어 매트릭스 시스템(diffusion controlled matrix system) 또는 침식성 시스템(erodible system)과 같은 시간 방출 또는 제어 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다. 상기 매트릭스는 일부 구현예에서, 현지 내(in situ) 및 생체 내(in vivo)에서 예를 들면 프로테아제(protease)에 의한 가수분해 또는 효소 절단에 따라 자발적으로 분해될 수 있는 생분해성 물질일 수 있다. 상기 전달 시스템은 일부 구현예에서 자연 발생 또는 합성고분자화합물(synthetic polymer) 또는 공중합체(copolymer)일 수 있으며, 일부 구현예에서 하이드로겔(hydrogel) 형태일 수 있다. 절단 가능한 결합을 갖는 예시적인 중합체는 폴리 에스터, 폴리오르토에스터(polyorthoesters), 폴리 무수물(polyanhydrides), 다당류, 폴리(포스포에스터)(poly(phosphoesters)), 폴리아미드(polyamides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리(이미도카르보네이트)(poly(imidocarbonates)) 및 폴리(포스파젠)(poly(phosphazenes))을 포함한다.

본 발명의 화합물은 원하는 바에 따라 통상적으로 약학적으로 허용되는 비독성 담체, 보조제 및 비히클을 함유하는 투여 단위 제형으로 흡입(예를 들어, 미스트 또는 스프레이)에 의해, 직장으로 또는 국소적으로 장내, 경구, 비경구 또는 설하 투여 할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 투여 방식은 경구, 피하, 경피, 경 점막, 이온 삼투, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 복강 내, 비강 내(예: 코 점막을 통해), 경막 하, 직장, 위장 등을 포함하여 특정 또는 영향을 받을 기관 또는 조직에 직접적으로 투여하는 것을 포함한다. 국소 투여용 제형은 로션, 팅쳐(tincture), 크림, 에멀젼, 연고, 스프레이, 젤 등을 포함할 수 있으며, 추가로 선스크린(sunscreen), 보습로션, 보습크림, 얼굴 젤 및 얼굴 크림 등과 같은 다른 적합한 제형으로 제형화할 수 있다. 이러한 조성물에서, 활성 생성물은 예를 들어 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부탄-1,3-다이올, 이소프로필미리스테이트, 이소프로필팔미테이트, 미네랄 오일 및 이들의 혼합을 포함하는 하나 이상의 불활성 부형제와 혼합한다. 국소 투여는 또한 경피 패치 또는 이온 삼투 장치와 같은 경피 투여의 사용을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어인 비경구는 피하, 정맥 내, 근육 내 및 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 화합물은 원하는 투여 경로에 적합한 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클과 혼합한다. 경구 투여가 바람직한 투여 경로이고, 경구 투여에 적합한 제형이 바람직한 제형이다. 국소 투여는 또 다른 바람직한 투여 경로이며, 국소 투여에 적합한 제형이 바람직한 제형이다. 사용하기 위해 본원에 기재된 화합물은 고체 형태, 액체 형태, 에어로졸 형태 또는 정제, 환약 분말 혼합물, 캡슐, 과립, 주사제, 크림, 용약, 좌약, 관장, 결장 관개, 에멀젼, 분산액, 식품 프리믹스(food premixes) 및 기타 적합한 형태로 투여될 수 있다. 화합물은 또한 리포솜 제형으로 투여될 수 있다. 추가 투여 방법은 당 업계에 알려져있다.

국소 투여용 조성물은 에멀젼 또는 멸균 용액일 수 있다. 용매 또는 비히클로서 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 식물성 오일, 특히 올리브 오일 또는 주사용 유기 에스터(injectable organic ester), 특정 구현예에서 에틸 올레이트(ethyl oleate)가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 보조제, 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 포함할 수 있다. 살균은 여러 가지 방식으로 수행될 수 있으며, 특정 구현예에서 방사선 또는 가열에 의해 수행될 수 있다. 또한 멸균수(sterile water) 또는 기타 주사 가능한 멸균 매체에 사용할 때 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 제조 할 수 있다.

일부 구현예에서 멸균 수계 제형(sterile injectable aqueous) 또는 유성 현탁액(oleaginous suspensions)인 주사용 제제(injectable preparations)는, 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화 할 수 있다. 주사용 멸균 제제는 또한 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매에 있는 현탁액 또는 멸균 주사용액일 수 있고, 일부 구현예에서 용매는 프로필렌 글리콜 용액일 수 있다. 사용할 수 있는 비히클 및 용매에는 물, 링거용액(Ringer's solution) 및 생리식염액(isotonic sodium chloride solution)이 있다. 또한 일반적으로 용매 또는 현탁 매체로 무균 고정 오일을 사용한다. 이러한 목적을 위해 합성 모노글리세라이드(monoglyceride) 또는 디글리세라이드(diglycerides)를 포함하여 완하성 지방유(bland fixed oil)를 사용할 수 있다. 또한 올레산(oleic acid)과 같은 지방산은 주사제 제조에 사용된다.

경구 투여를 위한 고체 제형은 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립을 포함할 수 있다. 이러한 고체 제형에서 활성화합물은 수크로스, 락토오스 또는 전분과 같은 하나 이상의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 제형은 또한 불활성 희석제 이외의 추가 물질, 예를 들어 스테아르산 마그네슘 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 알약은 추가로 장용성 코팅(enteric coatings)이 될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 제형은 약학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 물과 같이 당업게에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 엘릭시르제(elixirs)를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 현탁제, 사이클로 덱스트린(cyclodextrin) 감미제, 향미제 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 리포솜 형태로 투여될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 리포솜은 일반적으로 인지질 또는 기타 지질 물질에서 파생된다. 리포솜은 수성 매질에 분산된 단일층상수화액정(monolamellar hydrated liquid crystal) 또는 다중층상수화액정(multilamellar hydrated liquid crystal)에 의해 형성된다. 리포솜을 형성할 수 있는 무독성, 생리학적으로 허용되고 대사가 가능한 지질을 사용할 수 있다. 리포솜 형태의 본 조성물은 본 발명의 화합물에 더하여 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 지질은 천연 및 합성의 인지질과 포스파티딜콜린(레시틴)(phosphatidylcholines(lecithins))이 선호된다. 리포솜을 형성 하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academin Press, New York, N.W., p.33 et(1976)에서 확인할 수 있다.

본 발명의 제제는 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 화합물 또는 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 중 임의의 하나 이상을 포함하는 제조 물품 및 키트(kits)를 제공한다.

단일 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 활성 성분이 투여되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라진다. 그러나 특정 개인에 대한 특정 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 신체 면적, 체질량 지수(body mass index: BMI), 일반 건강, 성별 및 환자의 식단을 포함한 다양한 요인, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 또는 약물의 조합 및 특정 질환 또는 상태의 유형, 진행 및 중증도에 따라 달라진다는 것을 알 수 있다. 선택된 약제학적 단위 투여량은 신체의 표적 부위에 정의 된 최종 약물 농도를 제공하기 위해 제작 및 투여될 수 있다. 상황에 대한 치료적으로 유효한 양은 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있으며 일반 임상의(clinician)의 기술 판단 범위 내에 있다.

사용될 수 있는 단일 또는 다중 투여량은 약 0.1 mg/kg에서 약 600 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 500 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 400 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 300 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 200 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 100 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 50 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 30 mg/kg 중량, 약 1.0 mg/kg에서 약 10 mg/kg 중량, 약 10 mg/kg에서 약 600 mg/kg 중량, 약 10 mg/kg에서 약 500 mg/kg 중량, 약 10 mg/kg에서 약 400 mg/kg 중량, 약 10 mg/kg에서 약 300 mg/kg 중량, 약 10 mg/kg에서 약 200 mg/kg 중량, 약 10 mg/kg에서 약 100 mg/kg 중량, 약 50 mg/kg에서 약 150 mg/kg 중량, 약 100 mg/kg에서 약 200 mg/kg 중량, 약 150 mg/kg에서 약 250 mg/kg 중량, 약 200 mg/kg에서 약 300 mg/kg 중량, 약 250 mg/kg에서 약 350 mg/kg 중량, 약 200 mg/kg에서 약 400 mg/kg 중량, 약 300 mg/kg에서 약 400 mg/kg 중량, 약 250 mg/kg에서 약 300 mg/kg 중량 또는 300 mg/kg 중량으로부터 독립적으로 선택된 양을 포함한다. 본 발명의 화합물은 1일 1회 투여량으로 투여될 수 있거나, 총 1일 투여량은 1일 2회, 3회 또는 4회로 분할 투여될 수 있다.

단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 또는 1일 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 매시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간 또는 24시간마다 투여된다.

본 발명의 화합물은 유일한 활성 약제(pharmaceutical agent)로서 투여될 수 있지만, 본원에 기재된 질환 치료 또는 억제에 사용되는 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 치료 유효량으로 존재하는 유일한 활성 약제로서 투여된다.

본 발명의 복합체와 함께 추가 활성제를 사용할 경우, 추가 활성제는 일반적으로 미국 의사 처방집(Physician's Desk Reference: PDR) 53판(1999)에 표시된 치료량으로 사용하거나 통상의 기술자에게 알려진 치료학적으로 유용한 양으로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 기타 치료 활성제 또는 예방 유효 제제는 권장되는 최대 임상 투여량 또는 더 낮은 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물에서 활성 화합물의 투여 수준은 투여 경로, 질환의 중증도 및 개인의 반응에 따라 원하는 반응을 얻기 위해 다양하게 할 수 있다. 다른 치료제 또는 예방제와 조합하여 투여되는 경우, 치료제 또는 예방제는 동시에 또는 상이한 시간에 제공되는 별도의 조성물로 제형화 될 수 있거나, 치료제 또는 예방제는 단일 조성물로 제공될 수 있다.

도 1a는 화합물 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온("C9"), 2,3,5-트리메틸-6-옥틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온("C8"), 2,3,5-트리메틸-6-헵틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온("C7") 또는 비히클만 존재하는 경우 아화학량론적 비(sub-stoichiometric ratio)에서 재조합 인간 알파시누클린(αsynuclein: αSyn) 응집의 역학을 나타낸 것이다.
도 1b는 t=24 시간인 섬유화에서 C9, C8 또는 C7의 부재 (비히클) 또는 존재하에서 αSyn의 섬유질 함량을 나타낸 것이다. 섬유질 함량은 상대적인 ThT 형광 강도를 기반으로 평가되었다(100%는 비히클이 처리된 αSyn 샘플의 평균 t = 45.5 시간에서 종말점(endpoint) 값으로 설정되었다).
도 2는 94시간의 인큐베이션 후 Tau가 미리 형성된 원섬유(fibril) 함량에 대한 비히클, C9, C8 또는 C7을 처리한 효과를 나타낸 것이다.
도 3a는 C9, C8 또는 C7 공동-치료의 부재 또는 존재하에 RSL3으로 처리된 N27 쥐의 도파민성 세포에서의 핵 및 응집된 α시누클린을 나타낸 것이다.
도 3b는 N27세포에서 RSL3 유도 α시누클린 응집에 대한 C9, C8 또는 C7 처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 C57BL/6 마우스의 개방 필드 운동 분석에서 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine: MPTP)-억제된 수직 활성(각각의 전체 수직 카운트 및 수직 시간)에 대한 C9 투여의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 롱 스캔(long scan) 방법에 의해 분석한 수신 물질 (ID 1-1)의 XRPD 회절(패턴 A)를 나타낸 것이다.
도 6은 MeOD 중 생성된 물질(as-received material) (ID 1-1)의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 생성된 물질 (ID 1-1)의 독립형 DSC 열상(Standalone DSC thermogram)을 나타낸 것이다.
도 8은 생성된 물질 (ID 1-1)의 TGA 및 DCS 열상을 나타낸 것이다.
도 9a (오른쪽 하단에 100μm 비율이 표시됨) 및 도 9b (오른쪽 하단에 20μm 비율이 표시됨)는 각각 100X 및 400X 배율에서 생성된 물질 (ID 1-1)의 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 생성된 물질 (ID 1-1)에 대한 DVS 등온선 플롯(DVS isotherm plot)을 나타낸 것이다.
도 11은 생성된 고체 (ID 1-1)(패턴 A (아래))를 DVS 기기에서 가습 순환 후의 고체(위)와 비교한 XRPD 회절도를 나타낸 것이다.
도 12는 생성된 물질 (ID 1-1)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 13은 ID 1-1의 열처리 후 ID-10-1의 DSC 열상을 나타낸 것이다..
도 14는 생성된 물질 (ID-1-1)(패턴 A (아래))을 열처리로부터 회수된 고체 (ID 10-1) (위)와 비교한 XRPD 회절도를 나타낸 것이다.
도 15는 안정성 샘플 ID-4-1의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 16은 75% RH 및 40℃에서 1주일 처리한 고체 형태 안정성 샘플 ID-4-1 (위)과 비교하여 얻은 ID-1-1 (아래)의 XRPD 회절도를 나타낸 것이다.
도 17a (오른쪽 하단에 100μm 비율이 표시됨) 및 도 17b (오른쪽 하단에 20μm 비율이 표시됨)는 각각 100X 및 400X 배율에서 ID-4-1의 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 18은 25X 배율에서 ID-38-1의 현미경 이미지를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 500μm 비율이 표시된다.
도 19는 100X 배율에서 ID-38-1의 현미경 이미지를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 100μm 비율이 표시된다.
도 20은 400X 배율에서 ID-38-1의 현미경 이미지를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 20μm 비율이 표시된다.
도 21은 25X 배율에서 ID-38-2의 현미경 이미지를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 500μm 비율이 표시된다.
도 22는 100X 배율에서 ID-38-2의 현미경 이미지를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 100μm 비율이 표시된다.
도 23a 및 도 23b는 400X 배율에서 ID-38-2의 현미경 이미지를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 20μm 비율이 표시된다.
도 24는 25X 배율에서 ID-38-1 (위)및 ID-38-2 (아래)를 모두 비교한 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 500μm 비율이 표시된다.
도 25는 100X 배율에서 ID-38-1 (위) 및 ID-38-2 (아래)를 모두 비교한 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 100μm 비율이 표시된다.
도 26은 400X 배율에서 ID-38-1 (위) 및 ID-38-2 (아래)를 모두 비교한 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이며, 오른쪽 하단 모서리에 20μm 비율이 표시된다.
도 27 및 도 28은 각각 실시예 3A, 프렙 1 및 프렙 2 물질에 대한 대표적인 실험에 대한 입자 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 29 및 도 30은 각각 실시예 3B, 프렙 1 및 프렙 2 물질에 대한 대표적인 실험에 대한 입자 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 31은 5분 동안 실온으로 냉각된 액체 C9의 XRPD 회절도이다.
도 32는 스트레스가 적은 조건에서 온도 사이클링 실험으로부터 얻은 DSC 열상이다.

본 발명의 화합물의 제조

본 발명의 화합물은 본원에 제공된 개시 내용을 고려하여 통상의 기술자에게 명백한 일반적인 방법 및 절차를 사용하여 쉽게 입수가 가능한 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 전형적이거나 바람직한 공정 조건(즉, 반응 온도, 시간, 반응물의 몰비, 용매, 압력 등)이 주어진 경우, 달리 언급되지 않는 한 다른 공정 조건도 사용될 수 있다. 최적의 반응 조건은 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 달라질 수 있지만, 이러한 조건은 일상적인 최적화 절차에 따라 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. C9 용액은 빛에 민감하므로, 실내 조명은 450nm 미만의 파장을 제거하기 위해 이상적으로 여과해야 한다(황색 광 필터(amber light filters)). 황색 조명을 사용할 수 없는 경우, 적절한 제어를 사용하여, 예를 들면 알루미늄 호일 포장, 호박색 유리 제품을 이용하여, 용액에 대한 빛 노출을 최소화해야 한다.

본원에 기재된 모든 화합물 및 방법에 대해, 퀴논 형태는 필요한 경우 환원된 형태(하이드로퀴논)로 사용할 수 있다. 마찬가지로 하이드로퀴논 형태는 필요한 경우 산화된 형태(퀴논)로도 사용할 수 있다. 환원된 형태(하이드로퀴논) 당업계에 알려진 방법을 사용하여 산화된 형태(퀴논)로 쉽게 전환할 수 있다. 예를 들어, air silica Miller et al. 국제특허출원 제2006130775호 2006년 12월 7일 참조. 산화된 형태(퀴논)는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 환원된 하이드로퀴논 형태로 쉽게 전환할 수 있다. 예를 들어, Zn, AcOH Fuchs et al. EJOC 6 (2009) 833-40 참조.

본 발명을 하기 비제한적인 실시예 및 구현예에 의해 추가로 설명한다.

재결정(Recrystalization). 실시예 1A 및 3A에서와 같이, C9을 제조하는 합성 방법으로 생성된 생성물은 높은 은 함량(high silver content), 생성물의 끈적임 및 바라지 않는 입자 크기 및 분포 같은 하나 이상의 바라지 않은(undesired) 특성을 가졌다. 일반적으로 약학 용도의 경우 입자 크기가 좁은 고체 생성물을 사용하는 것이 바람직하다. 실시예 3A의 생성물의 끈적거림은 밀링(milling)을 어렵게 하고 체(sieve)로 거르는 것을 불가능하게 하는 등 생성물 취급을 어렵게 하였다.

재결정화로 인해 특성을 향상할 수 있는데, 예를 들어, 고체 생성물에서 분술물을 제거하고 더 균일한 크기 및 분포의 물질을 생성하여 후속 제제의 제품 성능을 향상시킬 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 재결정화 과정은 고체 생성물의 품질을 향상시키는 결과, 예를 들어, 순도 향상, 더 높은 융점, 더 낮은 은함량, 더 좋은 유동성, 더 균일한 입자 크기 및 분포를 포함하는 결과를 가져왔다. 또한, 재결정 방법은 종자 결정(seed crystal)을 필요로 하지 않았거나 C9의 기름칠(oiling out)에 대한 문제가 없었다.

재결정화 과정은 일반적으로 용매에 C9을 용해시키고, C9을 용해시키기 위해 혼합물을 약 40~45℃로 가열하고, 결정화가 일어난 혼합물을 약 32℃로 냉각시키고 생성물을 여과하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 재결정화 용매는 약 75~85% 이소프로필알코올(isopropyl alcohol: IPA)/물이다. 일부 구현예에서, 재결정화 용매는 약 80~85% IPA/물이다. 일부 구현예에서, 재결정화 용매는 약 80~87% IPA/물이다. 일부 구현예에서, 재결정화 용매는 약 83~87% IPA/물이다. 일부 구현예에서, 재결정화 용매는 약 85% IPA/물이다. 일부 구현예에서 비율은 (v:v)로 측정한다. 일부 구현예에서 비율은 (wgt:wgt)로 측정한다. 일부 구현예에서, 재결정화 용매는 메탄올과 물의 조합이다. 일부 구현예에서, 재결정화 용매는 메탄올과 헵테인(heptane)의 조합이다.

재결정화 용매가 IPA/물인 경우, 일부 구현예에서 방법은 IPA에 C9을 용해시킨 다음(예를 들어, 혼합물을 약 40~45℃로 가열함으로써) 물을 첨가하는 단계를 포함한다. 물을 첨가한 후, 혼합물의 온도가 약 40~45℃로 돌아갈 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 IPA/물 혼합물에 C9을 용해시키는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 용해된 C9을 함유하는 혼합물을 연마 여과(polish filter)한다. 연마 여과는 약 40~45℃ 또는 용액에서 C9을 유지하는 데 필요한 온도에서 수행할 수 있다.

일부 구현예에서, 혼합물을 수 시간에 걸쳐, 예를 들어 약 2~10시간, 약 4~8시간 또는 약 6시간에 걸쳐 약 32℃로 냉각한다. 일부 구현예에서, 혼합물을 C9이 결정화되도록 하기 위해 약 32℃에서 수시간에 걸쳐, 예를 들어 약 2~24시간, 약 4~8시간 또는 약 6시간에 걸쳐 유지한다.

일부 구현예에서, 혼합물을 추가로 냉각한다. 일부 구현예에서, 온도를 약 -5℃, 약 5℃ 또는 약 0℃로 냉각할 수 있다. 냉각은 단일 단계로 또는 여러 단계로 발생할 수 있다(예를 들어, 약 24℃로 냉각하고 약 16℃로 냉각한 다음 약 0℃로 냉각). 일부 구현예에서, 혼합물을 약 3~24시간에 걸쳐 냉각한다. 일부 구현예에서, 혼합물을 약 0℃에서, 예를 들어 적어도 1시간에 걸쳐 또는 약 1시간에 걸쳐 유지한다.

재결정 과정으로 인해 C9 생성물의 순도가 향상되었다. 다양한 구현예에서, 생성물은 임의의 용매, 담체, 부형제를 제외한 C9을 HPLC로 측정했을 때, 적어도 약 95% a/a, 적어도 96% a/a, 적어도 97% a/a, 적어도 98% a/a, 적어도 99% a/a 또는 적어도 99.5% a/a를 포함한다.

과정은 또한 청구된 다형체의 높은 순도를 초래할 수 있다. 다양한 구현예에서, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고는 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온은 1 몰당 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99.5%인 다형체다.

이 과정은 또한 C9의 높은 역가(potency)를 초래할 수 있다. 역가 = (100% - HPLC에 의한 총 불순물) × (100% - 수분 함량% - 총 잔류 용매% - 강열잔분(residue on ingnition: ROI)%). 역가는 (HPLC/100에 따른 % 면적 순도)* (100 - %wt/wt 수분 함량(KF) - %wt/wt 잔류 용매 - %wt/wt = 강열잔분)와 같이 계산할 수 있다. 다양한 구현예에서, 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 역가는 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99.5%이다.

과정은 또한 입자 크기의 더 좁은 분포를 초래할 수 있다. D10은 10% 누적(0에서 100%까지) 소형 입자 크기 분포에 해당하는 입자 직경을 나타낸다(즉, D10보다 작은 입자의 백분율은 10%이다.). D90은 90% 누적(0에서 100%까지) 소형 입자 크기 분포에 해당하는 입자 직경을 나타낸다(즉, D90보다 작은 입자의 백분율은 90%이다). 일부 구현예에서, 입자는 약 11:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 10:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 9:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 8:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 7:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 6:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 5:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 4:1 미만의 D90:D10의 비를 갖는다.

[실시예]

실시예 1A. 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (3)의 합성

온도계 및 교반기가 있는 50 L 반응기에 23℃에서 2,3,5-트리메틸-벤젠-1,4-다이올(2,3,5-trimethyl-benzene-1,4-diol (1) (1.39 kg, 9.1 mol) 및 에테르(ether) (15 L)를 첨가했다. 30분 동안 교반하여 투명한 용액을 만들었다. 물 (20 L)에 녹인 염화 철(ferric chloride) (5.6 kg, 34.5 mol) 용액을 3시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 2시간에 걸쳐 교반하였다. 유기상(organic phase)이 분리되었다. 배수된 물층을 에테르(3 x5 L)로 추출하였다. 합친 유기상을 황산 나트륨(sodium sulfate)에서 건조 및 농축했다. 잔류물을 다이클로로메탄(dichloromethane: DCM) (1 L)으로 희석하고 실리카겔 크로마토그래피(silica gel chromatography) (1 칼럼)로 정제하여 원하는 생성물 2 (1.27 kg, 95%)을 얻었다. TLC (벤진(petroleum ether: PE)/아세트산에틸(ethyl acetate: EA) = 30/1). R_f(화합물 1) = 0.2. R_f(화합물 2) = 0.6

온도계 및 교반기가 있는 50 L 반응기에 2,3,5-트리메틸-[1,4]벤조퀴논(2,3,5-trimethyl-[1,4]benzoquinone) (2) (780 g, 5.2 mol, 1.0 eq), 데칸산(decanoic acid) (895g, 5.2 mol, 1.0 eq) 및 아세토니트릴(acetonitrile) (15 L)를 첨가했다. 실온에서 30분간 교반하여 투명한 용액을 만들었다. 질산은 (882 g, 5.2 mol, 1.0 eq)을 한 부분에 첨가했다. 반응 혼합물을 75℃까지 가열했다. 물 (30 L)에 녹인 과황산 칼륨(potassium persulfate) (1.54 kg, 5.7 mol, 1.1 eq)을 2시간에 걸쳐 적가하였다. 첨가 후, 75℃에서 추가로 3시간에 걸쳐 교반하여 반응시켰다. 용액을 실온으로 냉각하였다. 15 L의 물에 수층을 배출하고, 에틸 아세테이트 (3 x 5 L)로 추출했다. 조합된 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 여과액을 농축하여 노란색 잔류물을 얻고 뜨거운 메탄올 (800 mL)로 결정화 하였다. 고체를 여과하고 소량의 메탄올과 에테르로 세척한 뒤 진공에서 건조하여 노란색 결정 덩어리인 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (3) (447 g)을 얻었다. 여과액을 농축하고 플래시 칼럼 크로마토그래피(flash column chromatography: FCC) (벤진:아세트산에틸, 100:1)로 정제하여 추가 155 g의 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (3)을 얻었다 (총량: 602 g, 42%). TLC (벤진/아세트산에틸 = 30/1). R_f(화합물 2) = 0.5. R_f(생성물 3) = 0.6. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 2.46 (s, 2H), 2.02~2.01(m, 9H), 1.35~1.26 (m, 22H), 0.88~0.86 (m, 5H). Ag = 45 ppm. 녹는점 49.9.

생성물은 높은 은 함량을 가지고 있었으며, 두가지 분리의 조합으로 인해, 하나는 MeOH에서의 분쇄(trituration)로부터 다른 하나는 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)로부터, 생성물은 미세한 입자와 큰 화합물 덩어리로 구성된 비균질 혼합물이었다.

실시예 1B. 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C9)의 재결정

요약. 생성물은 NaCl 전처리(pre-treatment) 후 2-프로판올 (IPA)/물 (H₂O)으로부터 재결정화 한 다음 침지, 수득하고, 공기 및 진공을 통한 건조에 의해 제조하였다. 출발 물질 (실시예 1A에서 제조된 C9, 99.9 g)은 높은 은 함량 (45 ppm)을 지니므로 건조 및 재결정 전에 C9화합물의 메틸 터트-부틸 에터(methyl tert-butyl ether: MTBE) 용액에서 염수 세척 및 두 번의 물 세척을 수행했다. C9의 MTBE 용액을 2.7μm 필터를 통해 여과하여 염화나트륨(NaCl) 세척 후 존재하는 모든 미립자를 제거하였다. MTBE에서 재결정 용매 IPA로 용매를 교환하는 동안 용액에 갈색 고체가 형성되어 이를 제거하기 위해 고온 여과가 필요했다. 황갈색(tan) 고체는 퀴논 용액의 빛 노출로 인한 것으로 추정되며 더 이상 분석하지 않았다. 그 다음 여과된 밝은 노란색 용액을 빛으로부터 보호하고, 농축하여 40℃에서 85% IPA/H₂O (486 g/98 g)에 용해시켰다. 열을 제거하고 35℃에서 결정이 형성되었다. 슬러리(slurry)를 16℃에서 48시간에 걸쳐 교반하고 0℃로 냉각시킨 뒤 고체를 수득 및 세척하고 공기 및 진공 (~125 mmHg) 에서 일정한 중량으로 건조하여 82.1 g(82.1%)의 미세한 노란색 니들형 물질(yellow needle)을 얻었다. 물질은 NMR, UPLC, LCMS, IR 및 MP로 분석하였다.

NaCl 세척에 의한 은 제거. 혼합 분말 및 결정의 황색 응집체인 미정제(crude) C9 (99.9 g, 실시예 1A에서 제조된 바와 같음)를 500 mL MTBE에 용해시키고 작은 (1~2 mm) 흑색 반점을 갖는 탁한 황색 액체를 염수 (100 mL, 20 wt% NaCl 수용액)로 세척하였다. 탁한 황색 유기 상층을 유지하고 레그 레이어(rag layer)와 투명한 무색 수성상층은 제거하였다. 유기상을 물 (2 x 100 mL)로 세척하고 무수 황산 나트륨(anhydrous sodium sulfate: Na₂SO_4,35 g)으로 건조했다. 투명한 노란색 용액을 55 mm 와트만 GF/D(Whatman GF/D) 필터 (2.7μm) 위에 쌓은 55 mm 와트만 타입 3 필터(Whatman Type 3 filter) (6μm)를 통해 여과하고 용기를 MTBE (2 x 20 mL)로 헹구었다. 밝은 노란색 슬러리 (180 g)를 얻기 위해, IPA (100 mL)를 첨가하고, 로토밥(rotovap) (125~90 mmHg, 40~25℃ 배스(bath))을 통해 농축하였다. IPA (348 g)를 첨가하고 슬러리를 투명하게 하기 위해 20분 동안 가열(35℃, 120 mmHg)하고, 그 다음 압력을 60 mmHg로 낮추고 결정이 형성되기 시작할 때까지 부피를 줄였다(~45분). 생성된 슬러리에는 MTBE 냄새가 없었다. 슬러리를 35℃에서 182 g 중량으로 농축하고, IPA (404 g)를 첨가하고 용해될 때까지 40℃로 가열하고 황색 고체 (35 mmHg)로 농축하였다. IPA (500 mL)를 첨가하고 밤새 교반시켰다.

황갈색 고체를 제거하기 위한 여과. 갈색 반점은 IPA 용액에서 발견되었으며 적층된 55 mg 와트만 타입 3 (8μm) 및 와트만 GF/D (2.7μm) 필터를 통해 고온 여과 (~40℃)로 제거하였다. 끈적한 황갈색 잔류물이 필터에 남았고 맑고 밝은 노란색 용액을 로토밥(rotovap)을 통해 노란색 고체로 농축했다.

재결정. 황색 고체에 IPA (486 g)를 첨가하고, 용기를 40℃로 가열하고 물 (98 g)을 투명한 황색 용액에 첨가하였다. 열을 2시간에 걸쳐 21℃로 낮추어 밝은 노란색의 니들형 슬러리를 얻었다. 슬러리를 16℃에서 48시간에 걸쳐 교반하고, 0℃로 냉각시킨 뒤 진한 노란색 슬러리를 여과하였다(와트만 #54, 150 mm, 부흐너(Buchner)). 미세한 노란색 니들형 물질을 얼음처럼 차가운 85% IPA/H₂O (2 x 250 mL, 0℃) 및 IPA (100mL, 0℃)로 헹구었다. 고체를 1시간에 걸쳐 흡인 상태로 두고, 니트릴 댐(nitrile dam)을 부흐너 깔때기에 설치하고 하우스 진공(house vac) (~100 mmHg)으로 밤새 유지했다. 노란색 결정 (88.9 g)은 여전히 IPA 냄새가 나서 새로운 부흐너 필터 (깔때기가 C9 잔류물로 막혔음)로 옮긴 뒤 진공 (100 mmHg, 6시간)에서 일정한 무게 (82.1 g, 82.1%)로 유지했다. 보관을 위해 실온에서 500 mL 엠버 타입 1 쇼트 듀란(Amber Type Ⅰ Schott-Duran) 병으로 옮겼다. 결정 (82.1 g)의 부피 ~280 mL.

적격(qualified) 방법에 의한 시험성적서(Certificate of Analysis: CoA) 분석: 수분 함량 (KF) = 0.05%; 용매 함량 = 0.23%; HPLC 순도 = 100% AUC; DSC에 의한 녹는점 = 53.0℃; 은 함량 <2.00 ppm; 강열잔분 = 0.02%; 역가 (계산된) = 99.71%, 패턴 A와 일치하는 결정 형태.

역가는 다음과 같이 계산 한다(HPLC/100에 의한 % 영역 순도)*(100 - %wt/wt 수분함량 (KF) - %wt/wt 잔류 용매 - %wt/wt = 강열잔분).

실시예 2. 재결정 스크리닝

실시예 1A 및 3A와 같이, C9을 제조하는 합성 방법은 높은 은 함량, 생성물의 끈적임 및 원하지 않는 입자크기 및 분포와 같은 하나 이상의 원하지 않는 특성이 있었다. 앞서 논의한 바와 같이, 재결정화는 생성물의 특성을 향상시킬 수 있다. 따라서 C9 재결정에 적합한 다양한 용매를 선별하였다.

C9 100 mg을 시험관에 넣고 용매를 첨가하고 변화를 기록했다. 그런 다음 샘플을 열풍기(heat gun)로 잠시 가열(약 45~50℃로 가열)하고 용해도를 기록하였으며, 실온으로 냉각하고 용해도를 기록, 0℃로 냉각하고 용해도를 기록하였다. 결과는 아래 표 1 과 같다.

재결정화를 위한 용매 스크리닝

용매	대략적인 농도(mg/mL)	실온 결과	가열 결과	가열 후 실온으로의 결과	실온 후 냉각 결과
MeOH	100	약간 용해	용해	약간 용해	불용성 - 긴니들형 물질
EtOH	100	부분적으로 용해	용해	약간 용해	부분적으로 용해 - 작은 니들형 물질
IPA	100	용해	용해	용해	부분적으로 용해 - 작은 니들형 물질
70% IPA/H₂O	100	약간 용해	대부분 용해- 녹음	약간 용해 (용해되기 전 흐려지고 고체가 녹음)	약간 용해 - 반투명 니들형 물질
MeCN	100	용해	용해	용해	대부분 용해 - 작은 니들형 물질
THF	100	용해	용해	용해	용해
95% EtOH	100	부분적으로 용해	용해	부분적으로 용해	대부분 용해
물	10	불용성	불용성	불용성	불용성
80% EtOH	100	부분적으로 용해	완전히 용해되기 전에 녹음	부분적으로 용해	약간 용해
80% EtOH	50	부분적	용해되기 전에 녹음	부분적	약간

다음 용매는 C9가 저온에서 너무 용해되기 때문에 부적합한 것으로 폐기하였다: MeCN, THF.

다음 용매는 C9가 고온에서 충분히 용해되지 않았기 때문에 부적합한 것으로 폐기하였다: 물.

다음 용매는 C9 물질이 용해되기 전에 녹았기 때문에 부적합한 것으로 폐기하였다: 80% EtOH. EtOH는 용액에 현탁된 오일을 형성하기 때문에 바람직하지 않다. 냉각 시 결정화 될 수 있지만 일반적으로 결정은 균질하지 않거나 순도가 증가하지 않는다.

95% EtOH는 MeOH와 아세톤을 포함하고 있어 의약품에 문제가 될 수 있기 때문에 부적합한 것으로 폐기하였다.

메탄올 및 에탄올은 끓는점이 낮기 때문에 덜 선호되었다. 나아가, MeOH의 긴 니들형 물질은 더 작은 입자보다 전달 및 여과가 더 어렵기 때문에 덜 선호되었다.

에탄올은 뜨거울 때 거의 완전히 용해되는 물질을 생성하고, 차가울 때 부분적으로 용해되는 물질을 생성한다는 점에 주목했다. IPA도 유사한 성질을 보였지만 100 mg/mL일 때 고온에서 용해되고 실온/저온에서는 부분적으로 용해되었다. 에탄올/물 혼합물은 초기에 용해도 특성을 조사했지만 >40℃에서 기름칠 된 C9 화합물로 인해 제외하였다. IPA는 완전히 용해되기 전에 고온에서 기름칠 되지 않고 약간 더 나은 용해도를 보였고, IPA는 좋은 반용매(anti-solvent)(H₂O)와 혼합될 수 있었기 때문에, 에탄올이 부적합한 것으로 판명된 후 조사하였다. 70% IPA/H₂O는 용융 문제와 오일링(oiling)을 야기한 반면, 100% IPA는 저온에서 이상적으로 불용성이 아니었다. 따라서, 70~100% 사이의 IPA농도를 테스트하였다.

1 g 규모의 테스트 용액은 75~85% IPA/H₂O가 우수한 용해도 (~10:1 vol:wt), 여과 가능한 미세결정 및 가열 및 냉각되어 예측 가능한 용융/결정화를 생성할 수 있는 용액을 제공한다고 확인하였다. 씨딩(seeding)은 필요 없어 보였다. 용액이 1시간을 초과하여 실내 조명에 노출되었을 때 결정화 과정에서 갈색 물질이 형성되었으므로 고온 여과(hot filtration)가 필요하였다. 이것은 용액이 빛에 노출되었을 때만 관찰되었다. 회수율은 미세 니들형 물질의 92.7%, 상청액(supernatant)의 UHPLC 분석은 고체에 대해 91% a/a 대 99%였으며 이는 상청액이 불순물을 제거하고 있음을 나타낸다. 미세한 노란색 니들형 물질은 쉽게 여과되고 좋은 회수율로 세척되었다. UHPLC는 UHPLC 면적%가 개선되었으며 결정은 모두 크기가 유사했고 건조되면 쉽게 흘렀다.

실시예 3A. 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 합성

다이클로로메탄 (20 L) 중 교반된 화합물 1 (2.0 Kg, 13.15 mol, 1.0 eq)의 용액을 23℃에서 30분 동안 교반하였다. 물 (19.04 L)에 녹인 염화철 (5.33 kg, 32.88 mol, 2.5 eq) 용액을 22시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 이 온도에서 2시간에 걸쳐 교반하였다. HPLC는 화합물 1이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 유기상을 분리했다. 배수된 수층을 다이클로로메탄 (2 x 10 L)으로 추출하였다. 합한 유기상을 물 (2 x 20 L), 염수 (2 x 10 L)로 세척하고 황산 나트륨 (약 5 kg)으로 건조하고 농축하여 미정제 화합물 2 (1.95 kg, 미정제)를 얻었으며, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용했다.

아세토니트릴 (25 L) 중 화합물 2 (1.25 kg, 8.33 mol, 1.0 eq)와 데칸산 (1.44 kg, 8.33 mol, 1.0eq)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 실온에서 교반하였다. 질산 은(siver nitrate) (353.9 g, 2.08 mol, 0.25 eq)을 한 부분에 첨가했다. 반응 혼합물을 75℃까지 가열하였다. 물 (100 L)에 녹인 황산 칼륨 (2.48 kg, 9.17 mol, 1.1 eq) 용액을 적가하였다. 첨가 후, 반응을 75℃에서 추가로 3.5시간에 걸쳐 교반하였다. HPLC는 화합물 2가 완전히 소모되었음을 보여주었다. 용액을 실온으로 냉각시켰다. 수층을 물 50 L로 배출하고, 에틸 아세테이트 (3 x 10 L)로 추출하였다. 합한 유기상을 수성 염화 나트륨으로 (5 L) 세척하고 황산 나트륨 (약 5 kg)으로 건조 및 여과하였다. 여과액을 농축했다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (PE, PE/EA, 50/1)로 정제하여 미정제 생성물을 얻었다. 생성물은 플래시 칼럼 크로마토그래피 후 오일로 수득하였다(방치 후 고형화 됨). 고형화되기 전에 3구 플라스크에 빠르게 충전했다. 오일을 교반하면서 고체를 형성했다. 고체를 메탄올 (2 부피, 컬럼 정제 후 미정제 생성물의 양으로 적가)으로 밤새 (~15시간) 실온 (20~30℃)에서 분쇄하고 여과하였다. 수득된 케이크(cake)를 메탄올 (500 mL)로 세척하고 진공에서 건조하였다: 고체를 수조(<30℃)에서 진공 펌프 (0.5 mmHg)가 있는 20 L 회전 증발기에 7일 동안 8시간/일 충전하여 잔류 용매를 제거했다: 아세토니트릴, 메탄올, 다이클로로메탄 및 에틸아세테이트) 황색 결정으로 C9 (1.28 kg, 56%)를 제공하기 위해. 생성물을 스테인레스 용기에 펴고 비슷한 크기를 얻기 위해 막자사발로 박살냈다. 밀링 공정을 여러번 반복했다. 고체를 체로 거르려 하였다. 그러나 생성물이 체 (100 메쉬(mesh))에 달라 붙어 고체를 체로 거를 수가 없었다. 이 물질의 밀링이 어렵기 때문에 파생된 입자가 크고 공식화하기 어렵다.

TLC (PE/EA = 30/1). R_f (Compound 2) = 0.5. R_f(C9) = 0.8. LC-MS: n/a.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 2.45~2.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.99~1.94 (m, 9H), 1.24 (m, 16H)

Assay = HPLC 92.2% w/w 대 참조 표준(reference standard).

실시예 3B. 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 재결정화

요약. 이 실시예는 10 g 엔지니어링 배치(engineering batch)에서 C9의 재결정화 및 2.4 kg의 C9 (두 샘플 모두 실시예 3A에서 제공됨)의 후속 재결정화를 요약한다. 40℃에서 2-프로판올 속 물질의 용해 후 물을 첨가하여 40℃에서 재킷필터(jacketed filter)를 통해 연마 여과된 흐릿한 용액을 얻었다. 생성된 투명한 용액을 32℃로 서서히 냉각시켰고, 생성물은 자발적으로 미세한 황색 니들형 물질로 결정화 되었다. 추가로 16℃로 냉각한 다음 0℃로 냉각하여 여과를 통해 슬러리(slurry)를 수득하고 물에서 85% 2-프로판올로 헹구었다. 생성된 고체를 진공하에 25℃에서 일정한 중량으로 건조하여 82%의 회수율로 생성물 (1.975 kg)을 얻었다. 분리된 고체를 DSC, IR 및 ¹H NMR을 통해 테스트하였다.

논의.

본원에 설명된 공정의 장점은 다음과 같다: 오일링 없이 진정한 결정질 고체의 제어된 형성(controlled formation)을 허용한다; 종결정(seed crystal)이 필요하지 않다; 분석/순도의 증가; 우수한 유동성으로 끈적임이 없음; 촘촘한 입자크기분포; 분리하고 건조하기 쉬운 규칙적인 모양의 입자. 필요한 경우, 이 물질의 밀링은 간단할 것으로 예상된다.

공급된 C9 (실시예 3A에 따라 제조, 92.2% 순도)의 LCMS 분석은 UV254 또는 증기광산란검출기(evaporative light scattering detector : ELSD)에서 보이지 않는 총 이온수(total ion count: TIC)에 의한 주요 불순물을 보여주었다. 모수(mother liquor)의 불순물 회수율이 높고 재결정된 생성물에서 불순물은 효율적으로 제거되었다.

냉각 프로토콜은 오일 제거 또는 종결정의 사용을 필요로 하지 않고 결정을 생성했으며, 결정화는 32℃에서 발생했다.

최종 생성물 분리는 니트릴 댐(nitrile dam)을 사용하지 않고 25℃에서 건조 오븐으로 옮겨진 습식 케이크를 제공했다.

재결정화 (2.4 kg)

오버헤드 메카닉컬 교반기(overhead mechanical stirrer), 아르곤 주입구(argon inlet) 및 테플론 코팅된 온도 탐침(Teflon-coated temperature probe)가 장착된 50 L 재킷 반응기(jacketed reactor)에 C9 (2400 g) 및 2-프로판올 (15.6 L, Fisher A416)을 첨가했다. 혼합물을 아르곤 하에서 75 rpm으로 교반하고 반응기를 알루미늄 호일로 덮었다. 재킷 반응기를 41℃ (내부 온도 40℃)로 가온하고 60분 동안 교반하여 투명한 용액을 만들었다.

반응물에 탈 이온수 (2.5 L, Ricca 9150-5)를 첨가하고 용액을 90분 동안 교반하였다. 용액을 파지티브 아르곤 압력(positive argon pressure) (8 psi)을 사용하여 40℃에서 P4 (10~16um) 소결 유리 재킷 깔때기(sintered glass jacketed funnel)를 통해 연마 여과하고 20 L 유리 카보이(carboy)에 수득했다.

50 L 반응기를 2-프로판올 (2 L, Fisher A416)로 헹구고 유기 폐기물로 배수하였다.

투명한 상청액 (36℃)을 오버헤드 메카닉컬 교반기, 아르곤 주입구 및 테플톤 코팅된 온도 탐침이 장착된 50 L 재킷 반응기로 되돌리고 다시 40℃에서 가열하였다. 용액을 75 rpm에서 교반하고 6시간에 걸쳐 32℃로 냉각한 다음 추가 6시간에 걸쳐 32℃에서 유지했다. 결정이 형성되었다. 슬러리를 1시간에 걸쳐 24℃로 냉각하고 추가로 1시간에 걸쳐 16℃로 냉각하고, 추가로 0℃에서 1시간에 걸쳐 냉각하였다.

고체는 파지티브 아르곤 압력 (8 psi)을 사용하여 P4 (10~16um) 소결 유리 깔때기에서 수득하였다. 필터 케이크를 2-프로판올/물 (85/15 v/v, 2x6L)로 헹구고 아르곤 스트림(stream)하에서 2시간에 걸쳐 건조하여 3450g의 노란색 고체를 얻었다. 고체를 진공 오븐으로 옮기고 진공하에 25℃에서 240시간에 걸쳐 건조시켰다. 최종 생성물 C9 (1975 g, 82.8% 수율)을 자유 유동성 황색 결정 고체(free-flowing yellow crystaline solid)로서 수득하기 위해 일정한 중량이 달성될 때까지 ~24시간 간격으로 중량을 확인하였다. 고체의 DSC 분석은 48.66℃에서 용융 시작 및 50.13℃의 녹는점을 나타냈다. HPLC에 의한 분석은 99.4% a/a 순도를 나타냈다.

모수를 감압하에 농축하여 400 g의 적색 오일을 얻었다. 오일 분석 결과 몇몇 생성물은 254 nm에서 상당한 흡광도를 갖지 않는 TIC에 의한 주요 불순물 피크가 있었다. 불순물의 분자량은 373 (M+H = 374 amu)으로 나타났다.

적격 방법에 의한 CoA 분석: 수분 함량 (KF) = 0.06%; 용매 함량 = 0.24%; HPLC 순도 = 100% AUC; DSC에 의한 녹는점 = 53.0℃; 은 함량 <2.00 ppm; 강열잔분 =< 0.01%; 역가 (계산된) = 99.69%, A 형태와 일치하는 결정 형태.

실시예 4. 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 다형체

요약

얻은 패턴 A와 그 용융에 대한 요약은 다음과 같다.

* BDL: 검출한계 밖(Below Detection limit).

특성화

생성된 고체 (ID 1-1, 실시예 1A 및 1B에 따라 생성)는 약간 끈적한 황색 분말이었다. 용기(container)를 5℃에서 냉장고에 보관했다. 물질이 빛에 민감하기 때문에 용기와 모든 샘플 바이알(vial)은 황색 또는 호일로 덮은 바이알을 통해 빛 노출에서 보호했다. 물질 (ID 1-1)의 XRPD 분석은 물질이 결정질이고 4, 12 및 16°2θ에서 고강도 피크뿐만 아니라 몇 가지 다른 낮은 강도 피크를 갖는 것을 보여주었다; 이 패턴을 패턴 A로 지정하였다 (도 5). d-스페이싱 및 강도(d-spacing and intensity)가 있는 피크 목록은 표 2에 있다.

물질 (ID 1-1)의 XRPD 피크 리스트. 상대 강도(relative intensity)가 >5인 피크가 기록됨.

2θ (도)	d-스페이싱 (Å)	상대 강도 (카운트(counts))
4.10	21.52	100
11.77	7.51	8
12.12	7.30	40
16.14	5.49	31
22.41	3.96	7

* 표 2의 회절 패턴은 Cu Kα 소스, 파장 1.540598 Å 및 온도 23~25℃를 사용하는 Rigaku MiniFlex 600을 사용하여 얻었다.

물질 (ID 1-1)을 MeOD에 용해시키고 ¹H NMR을 분석하였다 (도 6). NMR 스펙트럼은 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 구조와 일치하였다. 그것은 또한 용매화물이 아닌 무수물과 일치한다.

물질 (ID 1-1)의 DSC는 48.70℃에서 용해가 시작되었다 (도 7). 동시 열분석기(simultaneous TGA/DSC)는 용해 시작과 관련하여 DSC와 일치하였으며, 0.26%의 중량 감소를 위한 관련 단계를 보여주었다 (도 8). 세부 방법을 포함한 DSC 데이터 요약은 표 3에 있다.

물질 (ID 1-1)의 DSC 서모그램에 대한 피크 목록

시작(Onset) (℃)	피크 (℃)	표준화된 엔탈피(normalized enthalpy)
48.70	50.45	-144.12

* DSC 서모그램은 핀홀과 뚜껑이 있는 밀폐형 알루미늄 팬에서 25~250℃ 온도까지 10℃/분, 60 mL/분 N2 방법과 메틀러 토레도 DSC3+(Mettler Toledo DSC3+)를 사용하여 얻었다.

생성된 물질 (ID 1-1)의 현미경 이미지는 100X (도 9a) 및 400X (도 9b) 배율로 캡쳐하였다. 물질은 직사각형 판과 같은 형태를 보였다.

수분 함량에 대한 칼 피셔(Karl Fischer: KF) 적정은 생성된 물질 (ID 1-1)의 두 샘플로 수행하였고, 첫번째는 24 mg으로 두번째는 43 mg으로 하였다; 그러나 어느 샘플도 적정기(titrator)에 의한 측정을 제공하지 않았다. 이는 물질의 수분 함량이 기기의 검출한계 (> 1 ppm) 미만임을 의미한다. 이 결과는 무수물인 물질과 일치한다.

생성된 물질 (ID 1-1)은 동적 증기 수착(dynamic vapor sorption: DVS) 장비에 의해 가습 순환에 적용되었다. 물질은 15~75% 상대 습도 범위에서 0.01%의 질량 변화가 일어났고, 2~95% 상대 습도 전체 범위에서 0.08%의 질량 변화가 일어났다. 등온선 플롯은 도 10에 나와있다. 가습 순환 후, 고체를 XRPD로 분석하였다. 관찰 된 패턴은 생성된 고체 (ID 1-1), 패턴 A에서 변경되지 않았다; XRPD 데이터는 도 11에 나와있다. 이러한 결과는 물질에 흡습성이 없음을 보여준다.

생성된 고체의 샘플을 0.5 mg/mL 농도로 용해시키고 순도 분석을 위해 HPLC로 주입하였다. 불순물은 관찰되지 않았다. 크로마토그램은 도 12에 나와있다.

열처리

생성된 물질 (ID 1-1) 15 mg을 DSC 팬에 칭량(weighting)하고 독립형 DSC 기기에서 10℃/분으로 60℃까지 가열한 후 2℃/분에서 10℃까지 냉각하는 방법으로 열처리 하였다. 결과물을 팬에서 회수하여 XRPD 분석을 위해 도금하였다 (ID-10-1). 물질은 48.74℃에서 녹기 시작하였고, 22.58℃에서 발열을 시작으로 재결정되었다. 회수된 물질은 XRPD을 통해 패턴 A를 보였다. DSC 처리에 의한 서모그램은 도 13에 나와있다. XRPD 데이터는 도 14에 나와있다.

핫 스테이지 현미경 검사(Hot Stage Microscopy)

링캠(Linkam) 핫 스테이지 시스템을 사용하여 용융 중에 생성된 고체 (ID-1-1)의 이미지를 캡쳐하였다. 핫 스테이지 내부의 현미경 슬라이드에 소량의 물질을 배치하고 온도 램프 방법(temperature ramp method)을 사용하여 1℃/분의 속도로 30℃에서 55℃까지 올렸다. 램프하는 동안 200X 배율로 일련의 이미지를 캡쳐하였다. 녹을 때까지 형태 변화가 관찰되지 않았다(데이터 표시되지 않음). 용융 후, 핫 스테이지는 자연적으로 실온으로 다시 냉각되었고 재결정을 위해 물질을 200X 배율로 모니터링 하였지만, 고체는 관찰되지 않았다; 샘플은 유리처럼 보였다. 이 물질을 결정 핵(crystal nucleation) 생성을 위해 21-게이지(gauge) 니들형 물질로 조작하였다. 그 다음 슬라이드를 핫 스테이지에서 제거하고 이미지를 200X 배율로 캡쳐하였다; 결과 물질은 변형되지 않은 것처럼 보였다(데이터 표시되지 않음). 이것은 화합물이 실온에서 녹은 액체 형태 (비정질)로 존재할 수 있음을 나타낸다.

고체 형태 안정성

물질의 고체 형태 안정성을 1주에 걸쳐 평가하였다. ID-1-1 49.0 mg을 킴와이프(KimWipe)와 호일로 덮은 4 mL 바이알에 넣었다. 이 바이알을 포화 수성 염화나트륨을 함유하는 20 mL 바이알에 넣었다. 바이알을 40℃의 핫 플레이트에 7일 동안 두어 시스템에 상대 습도 75%의 대기를 조성했다. 7일 후, 고체를 HPLC (ID-4-1)를 위해 샘플링 했다.

크로마토그램 결과 안정성 샘플에서 어떠한 불순물도 나타나지 않았다. 크로마토그램은 도 15에 나와있다. 응력 물질(stressed material)의 샘플을 도금하고 XRPD로 분석했다; 패턴 A가 관찰되었다. XRPD 데이터는 도 16에 나와있다. ID-4-1의 현미경 이미지는 100X 및 400X 배율로 캡쳐하였다. 이미지는 도 17a (100X) 및 도 17b (400X)에 나와있다.

고체 형태의 샘플을 녹을 때까지 55℃에서 가열한 다음 5분 동안 실온으로 냉각하였고, XRPD 회절도는 샘플이 무정형임을 보여주었다 (도 31). 온도 순환 DSC 실험에서 볼 수 있듯이, 20℃에서 용융물은 결국 패턴 A로 응고되었다 (도 32). 이것은 무정형 액체 형태가 준안정성적(metastable)이며 패턴 A로 변환됨을 나타낸다.

모의 유체(Simulated Fluids) 및 물에서의 용해도

패턴 A 및 용융된 고체의 용해도는 공복 상태 모의 위액(Fasted-State Simulated Gastric Fluid: FaSSGF), 식이 상태 모의 장액(Fed-State Simulated Intestinal Fluid: FeSSIF) 및 금식 상태 모의 장액(Fasted-State Simulated Intestinal Fluid: FaSSIF), 물 및 0.5% 메틸셀룰로오스 + 2% Tween80 수용액에서 평가하였다. 호일로 덮은 5개의 4 mL 바이알, 11~13 mg의 생성 물질 (ID-1-1) 및 10 mm 교반 막대를 준비하였다. 11~13 mg의 C9을 함유하는 호일로 덮은 5개의 4 mL 바이알을 70℃에서 10분 동안 핫 플레이트에서 용융시키고 5분 동안 실온으로 냉각 시켰으며, 10 mm 교반막대가 포함되었다.

생성된 물질 ID-1-1 (패턴 A) 및 용융된 C9을 사용하여 슬러리를 각각 2.5 mL의 모의 유체(0.5% 메틸셀룰로오스 + 2% Tween80 수용액을 포함하여) 또는 물에 준비하였다. 녹은 활성 제약 성분(active pharmaceutical ingredient: API)를 포함하는 샘플은 물질 덩어리를 포함하는 것으로 보여 짧게 초음파 처리 하였다. pH와 용해도 모두 30분 및 24시간에서 평가하였다. 용해도 분석을 위해 각 샘플 1mL를 주사기 필터에 파이펫팅(pipetting)하고, 첫 0.5 mL를 소스 바이알(source vial)로 다시 여과한 뒤 나머지 0.5 mL를 저용량 삽입물이 있는 HPLC 바이알로 여과하였다.

보정점으로 계산한 응답 계수(response factor)를 모의 유체 및 물에서 API 농도를 결정하는 데 사용하였다. ACN에서 얻은 물질 (ID-1-1)로 보정 샘플을 준비했다. 각 보정점에 대한 농도 및 피크 영역을 그리고 용해도 평가를 위해 응답 계수를 계산했다.

실험 설계 및 결과 데이터를 표 5에 나타냈다. 나머지 각 슬러리를 여과하고 XRPD 분석을 위해 도금했다. 관찰된 모든 패턴은 패턴 A였다(데이터 표시되지 않음).

모의 유체 및 물의 용해도에서 얻은 실험 설계 및 결과 데이터

패턴	액체	30분에서 농도 (mg/mL)	24시간에서 농도 (mg/mL)	순수한 용액의 pH	30분에서 pH	24시간에서 pH	XRPD
A	FaSSGF	BDL	BDL	1.63	1.51	1.60	A
	FeSSIF	0.29	0.20	4.95	4.90	4.82	A
	FaSSIF	0.01	BDL	6.55	6.48	6.44	A
	0.5% MC + 2% Tween80 (aq.)	0.53	0.31#	3.38	3.52	3.62	A
	물	BDL	BDL	~7.00	6.65	6.82	A
A (녹음)	FaSSGF	BDL	BDL	1.63	1.48	1.62	A
	FeSSIF	0.25	0.20	4.95	4.87	4.83	A
	FaSSIF	0.02	0.04	6.55	6.54	6.44	A
	0.5% MC + 2% Tween80 (aq.)	0.22	0.28#	3.38	3.61	3.65	A
	물	BDL	BDL#	~7.00	7.18	7.29	A

* BDL: 검출한계 밖(below detection limit)

#페노메넥스 루나 페닐 헥실 HPLC(Phenomenex Luna Phenyl Hexyl HPLC) 칼럼 및 수정된 방법 사용.

UPLC 컬럼에서 관찰된 고압으로 인해, 24시간에 걸쳐 0.5% 메틸 셀룰로오스 + 2% Tween80 수용액 및 물에서 24시간 데이터 포인트에 대해 다른 컬럼 및 수정된 방법이 사용되었다 (ID-30-4, ID-30-9 및 ID-30-10). ID-30-4 및 ID-30-9 HPLC 샘플 (메틸 셀룰로오스/Tween80 혼합물을 포함하는 것)을 ACN으로 10배 희석하였다. 이러한 샘플과 보정점의 새로운 주입 세트를 분석하고, 새로운 응답 계수를 결정 및 나머지 샘플의 용해도를 계산하였다 (응답 계수: 8084.7908; R2: 0.9989).

실시예 5. 실시예 3A 및 3B로부터의 C9 결정 형태

요약

실시예 3A 및 3B에 기재된 바와 같이 로트(lots)에서의 물질은 시각적으로 황색 결정성 고체였다.

편향을 피하기 위해 이미지를 캡쳐할 때 3가지 다른 배율 (25X, 10X, 400X)에서 각 로트에 대해 다중 현미경 이미지를 촬영했다. 첫번째 로트인 ID-38-1 (실시예 3B)에서 대략 100μm에서 600μm 이상까지 다양한 범위에 있는, 대부분 큰 입자가 현미경을 통해 관찰되었다. 입자는 전반적으로 규칙적인 모양이었고 직사각형이며 다소 평평하며 우수한 복굴절성(birefringence)을 보여주었다.

두번째 로트인 ID-38-2 (실시예 3A)는 첫번째 로트와 비교했을 때 전체적으로 훨씬 더 작은 입자를 보였다. 약 50~350μm 범위의 입자가 관찰되었으며 이러한 입자는 더 과립상(granular)이거나 모양이 불규칙한 경향이 있었다. 개별 입자가 일관되게 관찰된 첫번째 로트와 달리 더 큰 입자에 붙은 눈에 띄는 작은 입자의 응집이 있었다.

결과

ID-38-1 (실시예 3B)에 대해 현미경 검사를 3가지 다른 배율에서 수행하였다: 25X, 100X 및 400X. 이 특정 C9의 로트는 현미경으로 광범위한 입자 크기를 보여주었다.

도 18에서, 25X배 확대를 통해 입자 크기와 모양의 다양성을 볼 수 있었다. 주로 직사각형 플레이트가 관찰되었다; 그러나 일부 들쭉날쭉한 2차원 모양도 있었다. 100X 배율 (도 19)에서 길이 변화는 약 100μm~600μm이다; 복굴절이 관찰되었다. 400X 배율에서는 입자가 너무 커 프레임에 맞지 않았지만 부드러운 직사각형 복굴절 모양이 잘 관찰되었다 (도 20).

ID-38-2 (실시예 3A)에 대해 현미경 검사를 3가지 다른 배율에서 수행하였다: 25X, 100X 및 400X. 이 특정 C9의 로트는 ID-38-1 (실시예 3B)와 비교할 때 전체적으로 더 작은 입자, 더 적은 복굴절 및 더 큰 입자의 일부에 '고착(stuck)'된 더 작은 응집 입자가 관찰되었다.

도 21에서, 작은 응집 입자가 25X 배율에서 관찰되었다. 100X 배율에서, 도 22, 약 50μm~350μm 범위의 과립상의 입자 모양이 더 잘 보였다. 여러 개의 작은 응집 입자도 관찰되었다. 400X 배율에서, 도 23a 및 도 23b, 입자는 ID-38-1 (실시예 3B)와 달리 프레임 내에서 관찰되었다. 반투명 입자가 구형으로 관찰되었으며, 많은 입자에서 복굴절 또한 관찰되었다. 관찰된 입자 크기의 큰 범위를 증명하고 더 큰 고체 중 일부에 응집된 더 작은 입자를 보기 위해 이러한 배율에서 여러 이미지를 캡쳐하였다.

로트의 비교

ID-38-1 (실시예 3B) 및 ID-38-2 (실시예 3A)를 아래에 직접 비교하였다. 25X 배율에서 두 로트간에 형태와 크기의 차이가 빠르게 관찰되었다 (도 24). 도 25에서, 100X 배율에서 작은 입자가 큰 입자에 응집된 것으로 관찰된 ID-38-02와 비교할 때, ID-38-1에 더 많은 개별 입자가 관찰되었다. 400X 배율에서, 도 26, 입자가 너무 커서 ID-38-1 (실시예 3B)를 위한 프레임에 맞지 않았지만 매끄러운 판과 같은 형태가 명확하게 관찰된 반면, ID-38-2 (실시예 3A)에서 더 큰 고체에 응집한 작은 입자가 다시 한번 관찰되었다.

현미경 검사

광학 현미경 검사는 2.5X, 10X, 20X 및 40X 대물렌즈와 편광기가 장착된 자이스 엑시오스코프 A1(Zeiss AxioScope A1) 디지털 이미징 현미경을 사용하여 수행하였다. 이미지는 내장된 엑시오캠(Axiocam) 105 디지털 카메라를 통해 캡쳐하고 Zeiss에서 제공하는 젠 2(ZEN 2) 블루 에디션(blue edition) 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.

실시예 6. 실시예 3A 및 3B로부터의 C9 입자 크기 분포

요약. 말번 3000 마스터사이저(Malvern 3000 Mastersizer)를 사용하여 실시예 3A(미정제) 및 3B(재결정화)의 C9에 대한 입자 크기 분포를 결정했다.

실시예 3A, 프렙 1. 24.4 mg의 C9 샘플을 바이알에 칭량했다. 약 20 mL의 물을 첨가하였다. 물 용액에 있는 5% 옥틸페톡시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL) 20방울을 바이알에 첨가했다. 용액의 뚜껑을 닫고 부드럽게 혼합했다.

실시예 3A, 프렙 2. 25.2 mg의 C9 샘플을 바이알에 칭량했다. 약 20 mL의 물을 첨가하였다. 물 용액에 있는 5% IGEPAL 20방울을 바이알에 첨가했다. 용액의 뚜껑을 닫고 부드럽게 혼합했다.

실시예 3B, 프렙 1. 24.7 mg의 C9 샘플을 바이알에 칭량했다. 약 20 mL의 물을 첨가하였다. 물 용액에 있는 5% IGEPAL 20방울을 바이알에 첨가했다. 용액의 뚜껑을 닫고 부드럽게 혼합했다.

실시예 3B, 프렙 2. 25.2 mg의 C9 샘플을 바이알에 칭량했다. 약 20 mL의 물을 첨가하였다. 물 용액에 있는 5% IGEPAL 20방울을 바이알에 첨가했다. 용액의 뚜껑을 닫고 부드럽게 혼합했다.

PSD 샘플들의 시각적 관찰

실시예 3A 샘플들은 매우 불균일한 고체인 것으로 관찰되었다. 샘플들에서 큰 입자가 많이 관찰되었다. 두 프렙 모두 유사한 불균일성을 포함했다.

실시예 3B 샘플들에서 매우 큰 결정이 관찰되었다. 육안으로 관찰한 결과 두 샘플 프렙 모두 매우 작은 결정에서 더 큰 결정이 있음을 알 수 있었다. 샘플 2 프렙은 샘플1 프렙보다 시각적으로 더 작고/미세한 입자를 포함했다.

입자 크기 분포

Malvern 3000 Mastersizer를 사용하여 레이저 회절에 따른 입자 크기 분포를 결정했다. 설정은 표 6에 나와있다. 다른 샘플에도 동일한 설정이 사용되었다. 결과는 표 7에 나타내었다.

실시예 3A, 프렙 1에 대한 Malvern 기기 설정

입자 유형
비 구형 입자 모드	예
프라운호퍼 타입(Fraunhofer type)인가	아니오
물질 특성
굴절률	1.480
흡수 지수	0.001
입자 밀도	1.00 g/㎤
청색광의 다양한 광학 특성	예
굴절률 (블루 라이트)	1.480
흡수 지수 (파란색)	0.001
분산제 특성
분산제 이름	물
굴절률	1.330
레벨 센서 임계 값	100.000
측정 시간
배경 측정 시간 (빨간색)	15.00 초
샘플 측정 시간 (빨간색)	15.00 초
청색광 측정을 수행 하였나?	예
배경 측정 시간 (파란색)	15.00 초
샘플 측정 시간 (파란색)	15.00 초
밝은 배경 안정성 평가	아니오
측정 순서
알리쿼트(Aliquots)	1
자동 측정 횟수	없음
사전 정렬 지연	0.00 초
측정 횟수	3
측정 사이의 지연	0.00 초
사전 측정 지연	0.00 초
측정 후 측정 창 닫기	아니오
측정 감광(obscuration) 설정
자동 시작 측정	아니오
감광 하한	1.00%
감광 상한	10.00%
감광 여과 활성화	아니오
측정 경보
배경 체크 사용	아니오
배경 체크 제한	[1,200],[20,60]

C9 샘플의 입자 크기 분포

실시예 3A
종합 결과 (2번의 프렙, 각 프렙에 대해 N=3)	d(v ,0.1)(μm)(D10)	d(v ,0.5)(μm)(D50)	d(v ,0.9)(μm)(D90)
평균	59.78	278.83	926.00
RSD (%)	5.68	10.27	13.51

실시예 3B
종합 결과 (2번의 프렙, 각 프렙에 대해 N=3)	d(v ,0.1)(μm)(D10)	d(v ,0.5)(μm)(D50)	d(v ,0.9)(μm)(D90)
평균	133.22	433.33	877.67
RSD (%)	43.71	13.54	5.71

표 7에 나타난 바와 같이, 두 실시예 모두 상당히 큰 입자로 구성되어 있지만, 3B는 평균적으로 상당히 크다: 평균. d(v, 0.5um) = 278 μm (3A) 및 433 μm (3B). 그러나 3A(d(v, 0.1 ~ 0.9) = ~60 μm 에서 925 μm까지)는 아마도 부분 밀링 때문에 3B(d(v, 0.1 ~ 0.9) = ~ 133 μm 에서 878 μm까지)와 비교했을 때 더 넓은 크기 분포를 갖는다. 각 분석의 대표적인 예는 도 27 및 도 28 (실시예 3A 프렙 1 및 2) 그리고 도 29 및 도 30 (실시예 3B 프렙 1 및 2)에 나와있다. 도 27 및 도 29에서 볼 수 있듯이, 실시예 3A 샘플은 실시예 3B (재결정화된) 샘플에 비해 더 넓은 입자 크기 분포 및 다봉분포(bimodal)의 특성을 갖는다. 실시예 3A 샘플 (비율 15.5:1)과 비교하여 실시예 3B 샘플 (비율 6.6:1)에서 D90과 D10사이에 더 좁은 분포범위가 있다. D10은 소형 입자 크기 분포의 누적 10% (0 ~ 100%)에 해당하는 입자 직경을 나타낸다(즉, D10보다 작은 입자의 백분율은 10%). D90은 소형 입자 크기 분포의 누적 90% (0 ~ 100%)에 해당하는 입자 직경을 나타낸다(즉, D90보다 작은 입자의 백분율은 90%). 각 프렙의 대표적인 실시예는 도 27 내지 도 30에 나와있다 (각 실시예 3A 프렙 1, 실시예 3A 프렙 2, 실시예 3B 프렙 1, 실시예 3B 프렙 2). 도 27 내지 도 30에서 볼 수 있듯이, 실시예 3A 샘플은 실시예 3B (재결정화된) 샘플보다 더 넓은 입자 크기 분포를 갖는다.

실시예 7. 파킨슨병(PD) 및 알츠하이머 질환 (AD) 환자의 인간 피부 섬유 아세포(Human Dermal Fibroblasts)에서 화합물 스크리닝

PD 및 AD의 개선을 위한 화합물의 효과를 확인하기 위해 초기 스크리닝을 수행하였다. 테스트 샘플 및 대조군 용매는 Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24):3055 (2002), Jauslin et al., FASEB J. 17:1972-4 (2003) 및 국제 특허 출원 WO 2004/003565에 설명된 것과 유사한 방식으로 L-부티오닌-(S,R)-설폭시민(L-buthionine-(S,R)-sulfoximine: BSO, GSH 합성 효소의 특정 억제제)과 철(특히 구연산 철(iron citrate))의 첨가에 의해 스트레스 받은 PD 및 AD 섬유아세포를 치료하는 능력에 대해 테스트하였다. 이러한 특정 BSO-매개 세포 사멸은 본원에 기재된 화합물의 투여에 의해 예방 또는 개선되었다.

AD 실험은 다음과 같이 수행하였다. PD 실험은 유사한 방식으로 수행하였다; 특정 조건은 아래 표 1A에 나와있다.

멤(MEM)(아미노산과 비타민이 풍부한 배지) 및 얼레의 균형 염류(Earle’s Balanced Salts: EBS)가 포함된 페놀 레드가 없는 배지 199(M199)를 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였다. 송아지 태아 혈청(Fetal Calf Serum)은 코닝(Coining)에서 구입하였다. 기본 섬유 아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor: bFGF) 및 표피 생장 인자(epidermal growth factor: EGF)는 페프로텍(PeproTech)에서 구입하였다. 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 믹스(Penicillin-streptomycin-glutamine mix), L-부티오닌-(S,R)-설폭시민, 구연산 철 및 소 췌장의 인슐린은 시그마(Sigma)에서 구입하였다. 칼세인 AM(Calcein AM)은 아나스펙(Anaspec)에서 구입하였다. 세포 배양 배지는 MEM 450 mL, 송아지 태아 혈청 50 mL, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 마이크로그램/mL을 혼합하여 준비하였다. 분석 배지는 M199 125 mL, 송아지 태아 혈청 50 mL, 페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 마이크로그램/mL, 글루타민 2 mM, 인슐린 10 마이크로그램/mL, EGF 10 ng/ mL 및 bFGF 10 ng/mL를 혼합하여 준비하였다; MEM을 첨가하여 부피를 최대 500 mL로 만들었다. BSO 10 mM 및 구연산 철 용액 10 mM을 물에서 제조하고 후속 필터-멸균하고 -20℃에서 보관하였다.

테스트 샘플을 1.5 mL 유리 바이알 또는 폴리 프로필렌 바이알에 주입하였다. 화합물을 DMSO로 희석하여 1 mM 스톡(stock) 용액을 얻었다. 용해 되면, -20℃에서 보관하였다.

테스트 샘플을 다음 프로토콜에 따라 스크리닝 하였다:

AD 또는 PD 환자 유래 섬유 아세포의 배양은 약 500,000 개의 세포가 액체 질소에 저장된 바이알에서 시작하였다. 세포를 1:3의 비율로 트립신 처리에 의해 3일마다 계대 배양하면서 세포 배양 배지에서 증식시켰다. 일단 융합되면, 섬유 아세포를 트립신화하여 수확하고, 분석 배지에 재현탁 하고, 표준 96-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 2,500 세포/0.1 mL의 최종 세포 밀도로 배양하였다. 플레이트를 95% 습도 및 5% CO₂대기 조건하에 37℃에서 5시간에 걸쳐 배양하여 세포가 배양 플레이트에 부착되도록 한 다음, 구연산 철 용액(물)을 원하는 최종 농도로 첨가하였다.

테스트 샘플 (DMSO 중 1 mM)을 10% DMSO:물 용액에서 최종 농도 5 μM로 희석한 다음 10% DMSO에서 원하는 농도로 연속하여 희석하였다. 이어서 세포를 다양한 화합물 희석액으로 처리하여 최종 DMSO 농도가 1%가 되도록 한 다음 37℃에서 습도 95% 및 5% CO₂ 대기 조건에서 18시간에 걸쳐 배양하였다.

다음날, BSO 용액을 웰에 첨가하여 원하는 최종 농도를 얻었다. 48시간 후, 배지를 버리고 종이 타월에 판을 뒤집어 부드럽게 두드려 남은 액체를 제거하였다. 플레이트를 웰당 100 마이크로 리터의 칼슘 및 마그네슘(+Ca +Mg)을 함유하는 PBS로 1회 세척하였다.

이어서 PBS +Ca +Mg에 녹인 100 마이크로 리터의 칼세인 AM(1 microM)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후 스펙트라맥스(Spectramax) 형광 판독기에서 형광 (각 485 nm 및 525 nm의 흡수(excitation)/방출(emission) 파장)을 판독하였다. 데이터는 각 화합물에 대한 EC₅₀농도를 결정하기 위해 표준 4-파라미터 곡선 맞춤 알고리즘 (XLFit 또는 Prism)을 사용하여 분석하였다.

용매 (DMSO, 물)는 비-BSO 처리된 세포의 생존력에 해로운 영향을 미치지 않았으며 테스트된 최고 농도 (1%)에서도 BSO 및 철 처리된 섬유 아세포에 유익한 영향을 미치지 않았다.

본원에 기술된 테스트 샘플이 BSO 및 철-유도 산화 스트레스로부터 파킨슨병 및 알츠하이머 질환 환자로부터의 섬유 아세포를 치료하는 것을 확인하였다.

BSO (125μM) + 철 (125 μM)-유도 산화 스트레스로부터 PD 환자 섬유 아세포의 구조

	PD (ND29542)
화합물 (#C)	EC _{50 (nM)}	SEM	최대 완화(max rescue) (@ 500 nM)
C6	>500	20	39
C8	>500	97	73
C9	84	4	103

EC₅₀= 세포 생존력의 50% 최대 완화가 관찰된 농도

SEM = 표준오차(standard error of the mean)

C9에 의한 BSO-플러스 철-유도 산화 스트레스로부터 AD 환자 섬유 아세포의 완화

셀 라인(cell line)	EC ₅₀ (nM)
셀 라인(cell line)	구연산 철 (50μM) + BSO (50 μM)	구연산 철 (100μM) + BSO (25 μM)	구연산 철 (100μM) + BSO (100 μM)	구연산 철 (200μM) + BSO (100 μM)
ND34730	15	24	-	-
ND41001	13	17	-	-
AG04402	-	-	5	12
AG11414	-	-	11	23

- = 테스트 되지 않음

표 8에서 언급한 바와 같이, C9 화합물 (2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온)은 BSO-플러스 철-유도 산화 스트레스에 의한 PD 섬유 아세포를 치료하는 데 C6 및 C8 유사체보다 더 큰 역가를 가졌다.

C9 화합물은 또한 산화 스트레스로부터 AD 환자 섬유 아세포를 치료하는 데 활성을 나타냈다 (표 9).

실시예 8. α-시누클린의 응집 억제를 위한 화합물 스크리닝

요약: 단백질 응집 동역학에서 지연 단계(lag phase)의 존재 및 정도를 특정함에 따라 화합물 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 ("C9") 및 그 유사체 C8 (2,3,5-트리메틸-6-옥틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온) 및 C7 (2,3,5-트리메틸-6-헵틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온)의 α-시누클린의 응집 억제제로서의 기능을 테스트 하였다. 응집체 결합 발형광단(aggregate-binding fluorophore), 티오플라빈 T(Thioflavin T),에 의한 형광 강도의 변화를 추적하여 단백질 응집을 시간 함수로 기록하였다.

실험 방법: α-시누클린 프리 세포 응집 분석(Cell-free αSynuclein aggregation assays)은 비히클로서 화합물(DMSO의 10mM 스톡 솔루션에서) 100μM 또는 1% (v/v) DMSO의 존재하에 재조합 인간 알파시누클린(Proteos, Inc) 200 μM으로 설정되었다. 모든 용액은 0.03% (v/v) NaN₃ 및 5 μM 티오블라빈 T (ThT)가 포함된 둘베코 인산 완충 생리 식염수(Dulbecco’s phosphate-buffered saline: DPBS) 완충액 (pH 7.4)에서 준비하였고, 단백질 또는 화합물을 첨가하기 전에 마스터 믹스(master mix)로 준비하였다. 단백질 마스터 믹스를 준비하고 4개의 튜브로 분리하였다 (조건 당 1개). 동시에, 용액에 단백질이 추가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 배경 측정을 위해 마스터 믹스를 만들었다. 화합물 또는 DMSO를 각 샘플에 로드(loading)하고 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하고 3초 동안 원심분리 하였다.

단백질 용액 +/- 화합물 및 배경 샘플을 검정색 벽을 가진 광학적으로 투명한 96-웰 플레이트(코닝 코스터(Corning Costar))에 로드하고, LightCycler® 480 씰(seal)(로슈 라이프 사이언스(Roche Life Science))로 밀봉하고, 37℃에서 15분 동안 평형을 이룬 후 데이터 수집을 시작하였다. 테칸(Tecan) M1000 분광기를 사용하여 30분마다 ThT 형광 (흡수/방출 450/490 nm)에 대한 데이타값을 수집하였다. 플레이트를 형광 판독 중간에 흔들어 교반하였다.

데이터 분석 및 결과: 형광 강도 데이터를 시간이 지남에 따라 모든 샘플에서 수집하였다. 비히클 처리 알파시누클린 샘플의 평균 종말점 형광 강도 단위(fluorescence intensity unit: FIU) 값은 100%로 설정하였고 다른 모든 FIU 값은 이에 대해 상대적으로 표준화하였다 (도 1a 참조). 최종 결과로 시간에 대한 표준화된 ThT 형광(%) 도면을 그렸다.

t = 24 시간에서 표준화된 ThT 형광 값 (% FIU)을 사용하여 샘플을 비교하였다 (도 1b 참조). 조건 당 최소 2개의 기술 복제(technical replicates)를 수행하였다. 샘플의 통계 분석은 일반적인 일원 분산 분석(one-way ANOVA analysis)을 통해 수행하였다. 터키 다중비교 테스트(Tukey's multiple comparisons test)를 모든 단백질 함유 샘플에 대해 수행하였으며, 비히클과 C9 처리된 샘플(p = 0.0041), C9 처리된 샘플과 C7 처리된 샘플(p = 0.0085) 및 C9 처리된 샘플과 C8 처리된 샘플(p = 0.0437) 간에 통계적 유의성을 보였다. 다른 모든 비교는 p>0.05로 통계적으로 유의하지 않았다(즉, ns).

도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, C9 화합물은 알파 시누클린 응집에 대해 상당한 억제 효과를 가지며, C7 또는 C8 유사체보다 더 큰 억제를 나타낸다.

실시예 9. 타우(Tau) K18 야생형(wild type: WT) 프리폼드피브릴(pre-formed fibril) 분해에서 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C9) 및 이의 유사체의 역가

요약: 시간이 지남에 따라 응집체 결합 발형광단 Thioflavin T의 형광 강도 감소를 측정하여 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C9), 2,3,5-트리메틸-6-옥틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C8) 및 2,3,5-트리메틸-6-헵틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C7) 화합물의 인간 야생형 Tau K18 프리폼드피브릴(PFFs)을 분해하는 능력을 테스트하였다.

실험 방법: 인간 재조합 Tau K18 WT 단편의 PFF는 DPBS 버퍼(buffer) (pH 7.4)의 환원제로서의 트리스(2 클로로 에틸)인산염(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP) 과량 (50x) 존재하에 Tau K18 단량체(바이오테크네(Bio-Techne®))를 나트륨 헤파린(sodium heparin)과 함께 1:1 비율로 배양하여 생성하였다. 혼합물을 교반 없이 37℃에서 4일 동안 배양하여 최종 농도 100 μM의 PFF를 생성하였다.

타우 프리 세포 분해 분석(Cell-free Tau disaggregation assays)은 비히클로서 화합물 (DMSO의 10 mM 스톡) 30 μM 또는 0.3% (v/v) DMSO의 존재하에 10 μM의 Tau PFF로 설정하였다. 모든 용액은 0.03% (v/v) NaN₃ 및 5 μM ThT와 함께 DPBS 버퍼 (pH 7.4)에서 준비하였고, 단백질 또는 화합물을 첨가하기 전에 마스터 믹스로 준비하였다. 단백질 마스터 믹스를 분석 전날 먼저 준비하여 Tau PFF를 주변 온도 및 대기 조건하에 10 μM에서 사전 평형화(pre-equilibrate)하였다. 다음날, 미리 혼합된 단백질 용액을 4개의 튜브(조건 당 1개)로 분리하였다. 화합물 또는 DMSO를 각 샘플에 로드하고 10초 동안 볼텍싱 및 3초 동안 원심분리 한 다음 주위 온도에서 15분 동안 배양했다. 동시에, 단백질이 추가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 배경 측정을 하기 위해 마스터 믹스를 생성하였다.

Tau PFF 용액 +/- 화합물 및 배경 샘플을 검정색 벽을 가진 광학적으로 투명한 96-웰 플레이트에 로드하고, LightCycler® 480 씰(seal)(Roche Life Science)로 밀봉하고, 37℃에서 15분 동안 평형을 이룬 후 데이터 수집을 시작하였다. Tecan M1000 분광기를 사용하여 교반 없이 30분마다 ThT 형광 (흡수/방출 450/490 nm)에 대한 데이타값을 수집하였다.

데이터 분석 및 결과: 비히클 처리된 Tau 샘플의 최대 형광 강도 단위 (FIU) 값은 100%로 설정되었으며, 다른 모든 FIU 값은 상대적으로 표준화되었다. 조건 당 최소 2개의 기술 복제를 수행하였다. 분석 시작 94시간 후 모든 샘플의 원 섬유 함량(fibril content)의 종점 값을 기록하였다 (도 2).

샘플의 통계적 분석은 일반적인 one-way ANOVA 분석을 통해 수행하였다. 듀넷 다중 비교 테스트(Dunnett's multiple comparisons test)를 비히클 처리된 샘플과 복합 처리된 Tau PFF 샘플간에 수행하였고, 비히클 처리된 샘플과 C9 처리된 샘플간에 통계적 유의성을 보여주었다 (p = 0.0478).

도 2에 나타난 바와 같이, C9 처리된 샘플은 94시간에 Tau 원 섬유 함량이 현저하게 감소하였다. 대조적으로 C7 및 C8 처리된 샘플은 94시간에 섬유질 함량이 크게 감소하지 않았다.

실시예 10. RSL3-유도 α-시누클린 응집의 억제

N27 쥐의 도파민성 세포(EMD Millipore에서 구입, SCC048)를 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP)과 융합된 절단된 α-시누클린을 안정적으로 과발현 하도록 오리젠(Origene)에서 얻은 플라스미드 작제물(plasmid construct, RG221446)으로 형질전환하였다. 세포들을 10% (v/v) 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Millipore, ES-009-B), 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140-122), 1% (v/v) L-글루타민(Gibco, 25030-081) 및 500μg/mL G418(Gibco, 10131-027)이 보충된 RPMI 1640 배지로 구성된 선택 배지에서 유지하였다.

상기 기재된 바와 같이 절단된 (122개 아미노산) 인간 α-시누클린-GFP 융합 단백질을 과발현하는 N27 쥐 도파민성 세포를 상기 기재된 바와 같이 정상 배양 조건에서 유지하였다. 실험 전날, 세포를 3000 세포/웰의 검은 벽판인 96 웰 옵티칼 바틈(96 well optical bottom)에 플레이팅 하고 24시간에 걸쳐 37℃에서 유지하였다. 실험은 D300e 복합 프린터 (Tecan)를 사용하여 세포에 (1S,3R)-메틸 2-(2-클로로아세틸)-1-(4-(메톡시카보닐)페닐)-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-3-카복실레이트((1S,3R)-methyl 2-(2-chloroacetyl)-1-(4-(methoxycarbonyl)phenyl)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylate) (1S,3R-RSL3, Yang et al., Cell 156:317-331 (2014)에 설명) 과 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C9), 2,3,5-트리메틸-6-옥틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C8) 또는 2,3,5-트리메틸-6-헵틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온 (C7)을 함께 공동 처리하는 것으로 시작하였고, 37℃에서 24시간에 걸쳐 인큐베이터에 다시 두었다. 응집된 α-시누클린의 선택적 표지를 위해 세포들을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고 DPBS 완충액으로 3회 세척한 다음 1% 트리톤-X 100 용액(Triton-X 100 solution)(DPBS 내)으로 실온에서 48시간에 걸쳐 배양하였다. 그런 다음 세포를 세척하고 표준 면역 세포화학(standard immunocytochemistry: ICC) 방법을 사용하여 총 α-시누클린 (항-α시누클린 마우스, 1:250, BD Biosciences)를 표지하였다. 세포를 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양한 다음, 다음날 DPBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 형광 접합된 2차 항체(염소 항-마우스 Alexa 647, Invitrogen)와 함께 실온에서 2시간에 걸쳐 인큐베이션 하였다. 핵 표지를 위해 10 nM 헥스트(Hoechst)를 추가하였고, 세포를 고함량 이미징 플랫폼(high-content imaging platform)(ThermoFisher, HSC Cellomics Arrayscan)에서 이미지화하여 총 응집된 α-시누클린을 정량하였다 (도 3a 참조).

도 3b는 화합물 C7, C8 및 C9에 의한 RSL3-유도 α-시누클린 응집의 억제를 보여준다. 샘플의 통계 분석은 듀넷 다중 비교 테스트와 함께 일반적인 one-way ANOVA 분석을 통해 RSL3 단독 처리 세포 와 RSL3 및 화합물을 처리한 세포를 비교하였다. C7은 어떠한 α-시누클린 응집의 억제도 나타내지 않았다(p>0.05). C8 및 C9는 유의미한 α-시누클린 응집 억제를 나타냈다(각 0.01 및 0.0003의 p-벨류, C9는 C8에 비해 약 5.45배 더 높은 수준의 응집 억제 효과를 보여주었다.

실시예 11. 파킨슨병 마우스 MPTP 모델에서 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 효과

요약

1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine: MPTP) (60 mg/kg)으로 동물을 처리하면 문헌 보고서 및 내부 검증 연구에 따라 선조체(striatum)에서 도파민이 상당히 고갈(~74%)되었다.

C9 (300 mg/kg)의 투여는 수직 활성에 대한 상당한 치료효과를 야기했다 (도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같은 수직 카운트 및 시간).

서론

MPTP는 인간, 비인간 영장류 및 마우스에서 파킨슨병 (PD)의 많은 신경 병리학적 특징을 생성하는 강력하고 선택적 흑질 선상체(nigrostriatal) 도파민성 신경 독소이다. 마우스에서 MPTP는 흑질 선상체 도파민성 변성을 일으킨다. 도파민 기능을 증가시키거나 MPTP의 신경 독성을 차단하는 약리학적 제제는 MPTP 관련 운동 기능 질환을 약화시키고 파킨슨병 치료를 위한 진료에 유용하였다. 더욱이, MPTP 매개 독성은 질환에서 도파민성 손실과 관련된 메커니즘과 관련이 있을 수 있으며, 이는 이 모델이 흑질 선상체 도파민성 손실을 늦추거나 감소시키는 제제를 식별하는 데 잠재적으로 유용할 수 있음을 의미한다.

본 연구에서, C9를 PD의 MPTP 유도 모델에서 테스트하였다. 연구의 종점은 오픈 필드 테스트에서 운동 활동 매개 변수(locomotor activity parameter)였다.

실험 과정

동물 . 종: 마우스. 균주: C57BI/6. 동물의 기원: Charles River. 나이: 6~7주. 성별: 수컷. 무작위화(randomization): 동물을 치료 그룹에 무작위로 할당하였다. 연구 블라인딩(Blinding of Study): 실험자들은 실험의 치료에 대해 블라인드 하였다.

하우징(Housing) 및 피딩(Feeding). 적응/컨디셔닝: 3일 이상. 하우징: 마우스를 12시간 명/암 주기 (오전 6:00에 점등)로 수용하였다. 케이지 당 마우스 4마리 이하. 환기식 케이지 랙 시스템(rack system). 식이요법: 표준 설치류 사료 및 물 무제한.

매개 변수 설계(Design Parameters). 투여 경로: PO. 투여량: PO: 5 mL/kg. 제형(들): BioElectron의 지시에 따라 Melior에 의해 제형화 되었다. 비히클-참기름(sesame oil) (Spectrum Chemical, NF 카탈로그 #SE130, CAS #8008-74-0). 용량 수준: 300 mg/kg. 투여빈도: 하루에 한 번(quaque die: QD) -2일 (MPTP = 0일)부터 7일 까지. 연구기간: 11일. 전처리 시간(최대 2시간): 0일 동안 (MPTP 일): 30분, 오픈필드 분석/운동활동 분석(OFA/LMA)을 위한 전처리시간: 1시간. 그룹 수: 3. 그룹 당 동물 수: 10. 총 동물 수: 30(연구 중), 총 42 마리(최소한 10 마리의 동물/그룹에 대한 적절한 전력 분석을 보장하기 위해, MPTP를 받는 모든 그룹에 대해 4마리의 동물을 추가하여 MPTP로 인한 사망한 동물이 있을 경우 연구에 미치는 영향을 완화하였다.)

M PTP 치료. MPTP는 인산 완충 생리 식염수로 제형화하고 2시간 간격으로 20 mg/kg 용량(20 mg/kg으로 1 mg/mL 전달)으로 마우스에 3회 투여하였다(MPTP의 최종 용량 = 60 mg/kg).

운동 활동. 1일 전 (기준선) 및 MPTP 투여 후 7일 (-1일 및 7일), 마우스를 완전 자동화된 개방형 장치(Med-Associates, Inc)를 사용하여 운동 기능의 다양한 측면에 대해 모니터링 하였다. 이 장치는 10.75" x 10.75" 아레나(arena)로 구성되어 있으며, 소음 감쇠 상자 안에 팬과 실내 조명이 장착되어 있다. 아레나에는 위치 추적을 위한 X축 및 Y축과 사육 감지를 위한 Z축에 위치한 3개의 16 빔 IR 어레이가 장착되어 있다.

투여 일정에 따라 오픈 필드 분석 1시간 전에 모든 마우스에 C9 또는 비히클-참기름 최종 용량을 투여하였다. 도파민성 결핍과 관련된 주요 운동 매개 변수에는 양육 행동 (후방 수/15분 세션) 및 총 이동 거리가 (15분 당) 포함되었다.

데이터 분석. 데이터는 평균을 내고 평균 ± SEM으로 표시하였다. 데이터는 일원 분산 분석에 이어 사후 테스트로 분석하였다. 0.05 미만의 p-벨류는 대조군에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

오픈 필드 운동 분석에 대한 치료의 효과(수직 카운트). 오픈 필드 기기에서 식염수 + 비히클, MPTP + 비히클 또는 MPTP + C9으로 처리된 동물의 활동을 측정하였다. 동물은 위에 표시된 대로 치료를 받았다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 수직 카운트는 식염수 + 비히클 처리된 동물과 비교하여 MPTP + 비히클 처리된 동물에서 감소하였다 (p = 0.06). MPTP-challenged 동물의 C9 처리는 대조군인 식염수 + 비히클 처리된 동물에서 관찰된 수직 카운트로 복원하였다(MPTP + 비히클 vs MPTP + C9, p<0.01; 식염수 + 매개채 vs MPTP + C9, p = 0.312). 데이터를 각 그룹에서 평균 + SEM, n = 12~14로 표시하였다. 통계 분석: 다중비교를 위한 사후 터키 테스트를 사용한 one-way ANOVA 분석; **p<0.01; ns, 통계적으로 유의하지 않음 (p>0.05).

오픈 필드 운동 분석에 대한 치료의 효과 (수직시간). 식염수 + 비히클, MPTP + 비히클 또는 MPTP + C9으로 처리된 동물의 오픈 필드 장치에서의 활동 (수직시간)을 측정했다. 동물은 위에 표시된 대로 치료를 받았다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 수직 시간은 식염수 + 비히클 처리된 동물과 비교하여 MPTP + 비히클 처리된 동물에서 감소하였다 (p<0.05). MPTP-challenged 동물의 C9 처리는 대조군인 식염수 + 비히클 처리된 동물에서 관찰된 수직 시간으로 복원하였다(MPTP + 비히클 vs MPTP + C9, p<0.001; 식염수 + 매개채 vs MPTP + C9, p = 0.315). 데이터를 각 그룹에서 평균 + SEM, n = 12~14로 표시하였다. 통계 분석: 다중비교를 위한 사후 터키 테스트를 사용한 one-way ANOVA 분석; *,p<0.05; ***,p<0.001; ns, 통계적으로 유의하지 않음 (p>0.05).

PD의 MPTP 마우스 모델에서 C9 투여는 수직 카운트 및 수직 시간에 의해 측정된 운동 활성의 현저한 개선을 입증하였으며, 선조체의 도파민 기능을 반영하는 두 가지 행동 지표를 나타냈다(Meredith and Rademacher, J Parkinsons Dis. 1(1):19-33 (2012) 및 그 안의 참고문헌).

실시예 12. 수컷 C57 마우스에 급성 경구 투여한 후의 PK 프로파일

300 mg/kg 용량의 C9을 4마리의 C57BL/6 마우스에게 경구 위관 영양법(oral gavage)을 통해 참기름 용약으로 투여하였다. 화합물 투여 8시간 후 혈장 및 뇌 노출을 측정하였다 (표 10).

경구 투여 후 마우스에서 C9의 뇌 및 혈장 노출

투여량 (mg/kg)	경로	시간 (h)	C9 [혈장] (ng/mL)	C9 [뇌] (ng/g)	뇌 : 혈장 비율
300	PO	8	3830	27925	7

본 발명의 비제한적인 실시예는 다음을 포함한다:

구현예 1. 치료 유효량의 화학식 1 (

)의 화합물 또는 이의 하이드로퀴논 형태; 또는 이의 용매화물 또는 수화물을 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 와상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 와상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 억제하는 방법.

구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 용매화물 또는 수화물이 아닌 방법.

구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 화합물은 퀴논 형태인 방법.

구현예 4. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 화합물은 하이드로퀴논 형태인 방법.

구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 알츠하이머 질환을 치료 또는 억제하기 위한 것인 방법.

구현예 6. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 파킨슨병을 치료 또는 억제하기 위한 것인 방법.

구현예 7. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 외상성 뇌손상을 치료 또는 억제하기 위한 것인 방법.

구현예 8. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 허혈성 재관류 관련 손상을 치료 또는 억제하기 위한 것인 방법.

구현예 9. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 뇌졸중을 치료 또는 억제하기 위한 것인 방법.

구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 질환을 치료하기 위한 것인 방법.

구현예 11. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 질환을 억제하기 위한 것인 방법.

구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물을 경구 투여하는 방법.

구현예 13. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물을 정맥 투여하는 방법.

식별 인용에 의해 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원 및 공개된 특허출원의 개시 내용은 그 전체가 본원의 참조로 포함된다.

명료한 이해를 위해 전술한 발명이 예시 및 예로서 일부 상세하게 설명되었지만, 특정 사소한 변경 및 수정이 수행될 것이라는 것은 통상의 기술자에게 자명하다. 따라서, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims

치료 유효량의 하기 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 하이드로퀴논(hydroquinone) 형태; 또는 이의 용매화물 또는 수화물을 α-시누클레인병증(α-synucleinopathy), 타우병증(tauopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 및 허혈성 재관류 관련 손상(ischemic-reperfusion related injury)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료 또는 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 허혈성 재관류 관련 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 억제하는 방법:
[화학식 1]

.
제1항에 있어서,
화합물은 용매화물 또는 수화물이 아닌, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
화합물은 퀴논(quinone) 형태인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
화합물은 하이드로퀴논 형태인, 방법.
제1항에 있어서,
방법은 α-시누클레인병증을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제5항에 있어서,
α-시누클레인병증은 파킨슨병(Parkinson's disease), 파킨슨병 치매(Parkinson's Disease with dementia: PDD), 다계통 위축증(multisystem atrophy: MSA), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia), 루이소체 치매(Dementia with Lewy Bodies: DLB), 고셔병(Gaucher's disease: GD), 뇌 철분 축적 신경 퇴행증(Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation: NBIA) 및 신경축삭퇴행위축(neuroaxonal dystrophies)(PLA2G6-관련 신경변성(PLA2G6-associated neurodegeneration))으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제6항에 있어서,
파킨슨병은 유전성인, 방법.
제6항에 있어서,
파킨슨병은 특발성인(idiopathic), 방법.
제1항에 있어서,
방법은 타우병증을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제9항에 있어서,
타우병증은 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 권투선수 치매(dementia pugilistica), 괌 근위축성 측삭경화증-파킨슨병-치매(Guam Amyotrophic lateral sclerosis-Parkinsonism-Dementia: Guam ALS/PD), 픽병(Pick Disease), 은친화입자병(Argyrophilic grain dementia), 니만-피크병 타입 C(Niemann-Pick type C), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis: SSPE), 진핵성 핵상 마비마비(Progressive supranuclear palsy: PSP), 다계통 위축증(multisystem atrophy: MSA), 피질기저핵변성(Corticobasoganlionic degeneration), 파킨슨 증후군-17에 의한 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with parkinsonism-17: FTDP-17), 뇌염후 파킨슨병(Postencephalitic Parkinsonism: PEP) 및 상염색체 열성 유전 파킨슨 증후군(Autosomal recessive Parkinsonism)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 알츠하이머 질환을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 파킨슨병을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 외상성 뇌손상을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 허혈성 재관류 관련 손상을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 뇌졸중(stroke)을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 근위축성 측삭경화증을 치료 또는 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 장애(disorder)를 치료하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 장애를 억제하기 위한 것인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
화합물이 경구 투여되는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
화합물이 정맥내 투여되는, 방법.
분말 X선 회절 패턴이 적어도 4.10, 12.12 및 16.14의 각도 위치에서의 특성 피크(characteristic peak)를 포함하며 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있는, 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온(2,3,5-trimethyl-6-nonylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione)의 무수물의 다형체(polymorph).
제21항에 있어서,
다형체는 적어도 4.10, 11.77, 12.12 및 16.14의 각도 위치에서 특성 피크를 포함하며 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있는, 다형체.
제21항에 있어서,
다형체는 적어도 4.10, 11.77, 12.12, 16.14 및 22.41의 각도 위치에서 특성 피크를 포함하며 상기 각도 위치는 ±0.2로 변할 수 있는, 다형체.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
각도 위치가 ±0.1로 변할 수 있는, 다형체.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
각도 위치가 ±0.05로 변할 수 있는, 다형체.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
다형체는 실질적으로 도 5, 11, 14 및 16 중 어느 하나에 나타난 분말 X선 회절 패턴을 갖는 것인, 다형체.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
실질적으로 도 7에 나타난 시차 주사 열량계(Differential scanning calorimetry: DSC) 열상(thermogram)을 갖는, 다형체.
제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
시차 주사 열량계 열상이 약 47℃에서 약 53℃까지 단일 흡열 피크(single endothermic peak)를 갖는, 다형체.
제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
실질적으로 도 8에 나타난 열중량 분석(thermogravimetric analysis: TGA) 열상을 갖는, 다형체.
제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
실질적으로 도 6에 나타난 ¹H NMR 스펙트럼을 갖는, 다형체.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물로서, 임의의 용매, 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 제외하고는, 약 95몰% 이상의 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온이 다형체인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물로서, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고는, 약 99몰% 이상의 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온이 다형체인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 조성물을 포함하는 조성물로서, HPCL로 측정할 때, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고는, 조성물의 적어도 약 95% a/a가 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 조성물을 포함하는 조성물로서, HPCL로 측정할 때, 임의의 용매, 담체 또는 부형제를 제외하고는, 조성물의 적어도 약 99% a/a가 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물로서, 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 역가(potency)가 적어도 약 95%인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물로서, 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 역가가 적어도 약 99%인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물로서, 다형체는 복수의 입자로 존재하며 입자의 D90:D10의 비가 약 11:1 미만인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물로서, 다형체는 복수의 입자로 존재하며 입자의 D90:D10의 비가 약 7:1 미만인, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조성물로서, 다형체는 약 75~85%의 IPA/물을 포함하는 용매에 의해 재결정화된, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물로서, 다형체는 약 80~85%의 IPA/물을 포함하는 용매에 의해 재결정화된, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물로서, 다형체는 약 85%의 IPA/물을 포함하는 용매에 의해 재결정화된, 조성물.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체 또는 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 용매, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물, 또는 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체 또는 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 용매, 담체 또는 부형제로 제조된 약학 조성물.
[청구항 53]
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체 또는 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 α-시누클레인병증(α-synucleinopathy), 타우병증(tauopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 또는 허혈성 재관류 관련 손상(ischemic-reperfusion related injury)의 치료 또는 억제를 필요로 하는 개체(individual)에게 투여하는 것을 포함하는, α-시누클레인병증, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 외상성 뇌손상 또는 허혈성 재관류 관련 손상을 치료 또는 억제하는 방법.
[청구항 54]
하기 단계를 포함하는, 조성물로부터 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온을 재결정화하는 방법:
(a) 조성물을 약 40~45℃의 온도에서 IPA 및 물과 접촉시켜 IPA 대 물의 생성되는 비율이 약 75~87% 이소프로판올(IPA)/25~13% 물(v:v)로 되도록 하는 단계;
(b) 혼합물을 약 32℃로 냉각시키는 단계; 및
(c) 혼합물로부터 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온을 여과하는 단계.
[청구항 55]
제54항에 있어서,
단계 (a)는 하기 단계를 포함하는 방법:
(a1) 조성물과 IPA를 접촉시키는 단계;
(a2) 혼합물을 약 40~45℃로 가온시키는 단계; 및
(a3) 혼합물에 물을 첨가하여 IPA 대 물의 비율이 약 75~85% IPA : 25~15% 물(v:v)로 되도록 하는 단계.
[청구항 56]
제54항에 있어서,
단계 (a)는 조성물을 용해시키기 위하여 교반하는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 57]
제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
IPA : 물이 비율이 약 80~85% IPA : 20~15% 물(v:v)인, 방법.
[청구항 58]
제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
IPA : 물의 비율이 약 85% IPA : 15% 물(v:v)인, 방법.
[청구항 59]
제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a3)는 혼합물의 온도를 약 40~45℃로 되돌리는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 60]
제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a) 이후에 혼합물을 연마 여과(polish filtering)하는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 61]
제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b)는 약 2~10시간에 걸쳐 약 32℃로 냉각시키는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 62]
제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b)는 약 6시간에 걸쳐 약 32℃로 냉각시키는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 63]
제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b) 이후에 단계 (b1)로서, 혼합물을 약 32℃에서 약 2~24시간에 걸쳐 고정(holding)하는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 64]
제 54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b) 이후에 단계 (b1)으로서, 혼합물을 약 32℃에서 약 6시간에 걸쳐 고정하는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 65]
제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b) 또는 단계 (b1)이 존재하는 경우 단계 (b) 또는 (b1) 단계 이후에 단계 (b2)로서, 혼합물을 약 0℃ 로 냉각시키는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 66]
제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b2)는 혼합물을 약 3~24시간에 걸쳐 약 0℃로 냉각시키는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 67]
제64항 또는 제65항에 있어서,
단계 (b2)는 약 0℃에서 약 1시간에 걸쳐 혼합물을 고정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[청구항 68]
제54항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따라 제조된 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온을 포함하는 조성물.
[청구항 69]
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다형체, 또는 제31항 내지 제42항 또는 제68항 중 어느 한 항의 조성물을 액체 또는 에멀젼(emulsion) 형태로 전환시키는 단계를 포함하는, 약학 조성물의 제조 방법.
[청구항 70]
제69항에 있어서,
액체 또는 에멀젼 형태는 경구 용액, 액체로 충전된 캡슐 또는 주사용 용액으로 제공되는, 방법.
[청구항 71]
제69항 또는 제70항에 따라 제조된 약학 조성물.
[청구항 72]
실질적으로 도 31에 나타낸 XRPD 플롯(plot)을 갖는 2,3,5-트리메틸-6-노닐사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 준안정성성 용융 비정질 형태(metastable melted amorphous form).