KR20210049110A - 히알루론산의 염소화 유도체, 그 제조 방법, 유도체를 포함하는 조성물 및 그 용도 - Google Patents

히알루론산의 염소화 유도체, 그 제조 방법, 유도체를 포함하는 조성물 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미드 기 -NH-CO-의 대부분의 수소 원자가 염소 원자 -NCl-CO-로 치환된 히알루론산의 유도체 - 히알루로난 클로르아미드 - 를 포함하는 다양한 형태의 제조 및 그 용도에 관한 것이다. 히알루로난 클로르아미드를 포함하는 조성물은 광범위한 항미생물 및 항바이러스 활성을 발휘하며, 이의 생체적합성으로 인해 상처용 피복재 분야에서의 용도로 적합하거나 또는 광범위한 이식가능한 의료 기구를 제조하는데 적합하다.

Description

히알루론산의 염소화 유도체, 그 제조 방법, 유도체를 포함하는 조성물 및 그 용도
본 발명은 아미드 기 -NH-CO-에서 수소 원자 대부분이 염소 원자 -NCl-CO-로 치환된 히알루론산의 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 방식으로 변형되면, 폴리머 - 히알루로난 클로르아미드는 산화 반응 및 환원 반응 둘다에 대해 증가된 반응성을 나타낸다.
아울러, 본 발명은, 화학적 변형이 수성 분위기에서 트리클로로이소시아누르산 또는 트리클로로이소시아누르산의 염을 이용함으로써 이루어지는, 히알루로난 클로르아미드의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 최종 조성물의 제조는 히알루로난 클로르아미드를 포함하는 형태의 제공을 포함한다. 본원에서, 용어 "형태"는 박막 (thin film), 동결건조물 (lyophilisate), 스테이블 섬유 층 (layer of staple fibres), 엔드리스 섬유 (endless fibre), 직물 (woven fabric), 편성물 (knitted fabric), 편조물 (braided fabric) 또는 나노섬유 층 (nanofibrous layer)과 같은 다양한 타입의 재료를 지칭한다.
또한, 본 발명은 히알루로난 클로르아미드를 포함하는 최종 조성물 및 아래 특성 또는 아래 특성들의 임의 조합이 요구되는 분야에서의 상기한 조성물의 용도에 관한 것이다:
- 산화 활성 또는 환원 활성 또는 항미생물 활성 또는 항진균 활성 또는 항바이러스 활성
- 생물학적 적합성 및 생물학적 분해성
- 편리한 수준의 안정성을 가진 다양한 형태의 제조 가능성
- 생분해율 조절 가능성
- 산화 반응 및 환원 반응의 속도 조절 가능성
- 치유 과정에 유의미한 기여.
히알루론산
히알루론산 또는 이의 소듐 염은 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민 반복 단위 2개로 구성되는 비-황산화 글리코스아미노 글리칸이다.
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 수소 또는 소듐이다.
천연 히알루론산의 분자량은 5.104 내지 5.106 g.mol-1 범위에 속한다. 이 친수성 다당류는 프로테오글리칸의 조직화, 수화 또는 세포 분화와 같은 다수의 생물학적 과정에 중요한 역할을 수행하며, 피부, 윤활관절액 및 결합 조직의 필수 성분인 것으로 알려져 있다. 전술한 폴리머는 생물 시스템에서 자연적으로 생성되며, 따라서 생분해성 및 생체적합성이 특징적일 수 있다. 그래서, 광범위한 생의학적 용도에서 생물학적 활성 물질의 담체 분야에 적합한 물질을 형성한다.
히알루론산의 화학적 변형 및 형태
히알루론산의 물리적 특성 및 생물학적 특성을 조절하기 위한 목적으로 히알루론산을 화학적으로 변형하는 방법들이 다수 알려져 있다 (Burdick J. A. and Prestwich G. D., Adv . Mater. 23, 41-56, 2011). 특정 용도와 관련하여 용해도에 기본적인 변화가 필요할 경우, 가장 빈번하게 수행되는 공정은 생분해성 에스테르 결합을 이용해 폴리머 구조에 소수성 체인을 공유 결합하는 것이다 (Kettou S. et al., PV 2009-399, Buffa R. et al., WO2010105582). 이러한 방식으로 변형하면, 그 물질은 섬유 (Scudlova J. et. al., EP2925916 A1), 편성물 및 편조물 (Pitucha T. et al., CZ 306354), 자가-지지 필름 (Foglarova M. et al. PV2015-166; Foglarova M. et al., Carbohydrate Polymers, 144, 68-75, 2016) 또는 나노섬유 층 (Ruzickova J. et al. PV2013-913)과 같은 다양한 형태를 제조하는데 활용할 수 있다. 다른 가능한 형태는 본딩 스테이플 미세섬유 (bonded staple microfibre)에 의해 제조되는 부직포로서, 이것은 비-고정식 응고조에서 습식 방사 공정을 통해 제조된다 (Zapotocky V. et al., International Journal of Biological Macromolecules, 95, 903-909, 2017).
트리클로로이소시아누르산 또는 소듐 트리클로로이소시아누레이트를 이용한 산화
트리클로로이소시아누르산 (TCC)은 주로 비-수성 용매 중에서 구조적으로 단순한 아미드를 N-클로르아미드로 N-염소화하는데 종종 이용된다 (Hiegel G. A. et al., Synthetic Communications, 35, 2099-2105, 2005). 아울러, TCC는, 대개 수 존재 하에 일차 하이드록시 기를 선택적으로 산화하기 위해, 피페리디닐옥시-타입 (TEMPO)과 같은 안정한 라디칼과 조합하여, 언급된다. 히알루론산과 관련하여, 수중에서 TCC를 TEMPO와 함께 사용하는 방법이 예를 들어 특허 (Buffa R. et al., WO2011069475A3)에서 개시되어 있으며, 클로르아미드는 형성되지 않고 오직 일차 하이드록시기만 알데하이드 및 카르복시산으로 산화되는 것으로 관찰되었다. 그래서, 2차 및 1차 알코올을 다량 함유한 물질 (다당류)의 경우, 하이드록시 기에서의 반응은 TCC 및 이의 유사체를 이용할 경우에 예상할 수 있다. TCC 모노소듐 염은 소듐 다이클로로이소시아누레이트 (DCC-Na)로도 알려져 있으며, TCC보다 수용성은 높지만 반응성은 낮은 유사체이다. 하지만, 하이드록시 기를 함유하지 않는 아민 및 아미드를 산화하기 위한 DCC-Na의 이용도 알려져 있다 (Sun X. et al., Ind. Eng. Chem. Res., 49, 22, 2010). 제조된 클로르아민을 중합하여, 최종 물질이 라텍스 에멀젼 형태로 항세균, 항진균 및 항바이러스 물질로서 성공적인 것으로 조사되었다 (Cao Z. et al., App. Mat. Inter. 1, 2, 494-504, 2009).
전술한 결과들을 토대로, 수 중에서 선택적인 방식으로 N-염소화 히알루로난 아미드를 제조하는데 있어 TCC 또는 이의 유사체의 이용은, 히알루로난의 하이드록시 기와의 반응이 예상되므로, 기대할 수 없는 것으로, 결론지을 수 있다.
차아염소산 또는 차아염소산염을 이용한 다당류의 산화
차아염소산 및 이의 염은 주로 피페리디닐옥시 라디칼 (TEMPO)과 조합하여 다당류의 하이드록시 기를 산화하는데 종종 이용된다 (Bragd P. et al., WO2002/48197, Buffa R. et al., WO2011/069475A3). 일반적으로, 대부분의 경우, 아미드 기를 함유한 다당류들에서는 각각의 클로르아미드 형성은 관찰되지 않는다고 할 수 있다. 초기 문헌들에는 히알루로난 클로르아미드의 존재가 전혀 언급되어 있지 않다 (Green S. P. et al., J. Rheumatology, 17, 1670-5, 1990, Lindvall S. et al., Chem.-Biol. Interac. 90, 1-12, 1994, Baker M. S. et al. , 461-7Arthritis and Rheumatism, 32, 4, 1989). 이들 간행물은, 마이엘로옥시다제 (MPO)와 과산화수소 및 클로라이드의 반응으로 형성되는 차아염소산 또는 이의 염에 의해 유발되는 히알루로난의 분해 공정을 검토한 것이다. 염증 과정을 시뮬레이션하기 위해, 글리코스아미노글리칸, 주로 세포외 기질에 함유된 글리코스아미노글리칸의 분해를 언급한 추가적인 간행물들도 몇가지 있다. 주 성과는 공정 자체와 예상되는 특정 화학 구조의 생체내 존재 이 둘다에 대한 정보이다. 보다 최신 또는 현재 출처들에서는 히알루로난의 클로르아미드가 이제 언급되고 있다. 예를 들어, 간행물 (Hawkins C. L. et al., Free Radical Biology & Medicine, 24, 9, 1396-1410, 1998)에는 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트 및 아미드 기를 함유한 기타 물질, 예를 들어 저-분자 물질의 분해 기전 실험이 언급되어 있다. 사용된 산화제는 HOCl/ClO-이다. 저자는 히알루로난 클로르아미드를 불안정한 중간산물이 아닌 다른 형태로의 존재는 추정하지 않았다. 하지만, 불안정한 중간산물 역시 직접적인 방식으로 검출된 것은 아니다. 그 이유는, 폴리머의 분해를 유발하는 방식으로 추가로 반응하는 라디칼이, 빠른 균일 분해 (homolytic) 또는 환원성 절단을 통해 형성되기 때문이다. 다른 논문 (Parsons B. J. et al., Biochem. J., 381, 175-184, 2004)에는 MPO (마이엘로퍼옥시다제 효소), 과산화수소 및 클로라이드를 이용해 히알루로난 클로르아미드, 콘드로이틴 설페이트 및 기타 물질을 제조하는 공정이 기술되어 있다. 저자는 각각의 클로르아미드가 일정 수명이 있는 것으로 추정하였으며, 추가 물질을 사용해 클로르아미드를 분해하는 설명을 상세히 언급하였다. 또 다른 매우 흥미로운 논문 (Rees M. D. et al., 125, 13719-13733J. Am. Chem. Soc., 2003)에서는 아미드 기를 함유한 단당류, 올리고당 및 다당류와 NaClO의 반응이 언급되었다. 이 논문에서는 Cu2 + 및 산소와 같은 물질과 기타 시약의 존재 및 부재 하에, 변형율이 각각 35% 및 16%인 히알루로난 클로르아미드뿐 아니라 콘드로이틴 설페이트의 안정성이 충분히 분석되었다. 분해는 특정 금속의 존재에 의해 실질적으로 가속화되는 것으로 밝혀졌다. 50℃에서 히알루로난 클로르아미드 폴리머와 콘드로이틴 설페이트의 빠른 분해는 심지어 금속의 부재 하에서도 관찰되었다. 분해는 낮은 온도에서 현저하게 더 느려졌다. 또한, 직접 관찰한 결과, 과산화수소의 존재 및 생리학적 함량의 클로라이드의 존재 하에 이루어지는 MPO와 글리코스아미드글리칸의 반응에서, 글리코스아미노글리칸 클로르아미드가 소량 만들어졌다. 이에, 저자는 이러한 클로르아미드가 생체내에서 또한 형성되는 것으로, 결론지었다.
이러한 결과들에 기반하여, 공지되어 있긴 하지만, 변형율이 낮은 히알루로난 클로르아미드는 생의학적 용도의 조성물을 제조하는데 적합할 수 있는 충분한 안정성을 기대하기 어려운 것으로 결론 내릴 수 있다.
N-할로겐화 폴리머의 이용
이 섹션은 클로르아민 또는 클로르아미드의 선택된, 더욱 구체적인 용도를 또한 보여주는 결과들을 기술한다.
요약 논문 (Hui F. et al., Biomacromolecules, 14, 585-601, 2013)은 -N-할로겐 결합을 가진 다양한 물질들의 제조, 분석 및 이용을 기술하고 있다. 그러나, 이 요약 논문에는 히알루론산은 언급되어 있지 않으며, 설명도 구조적인 관점에서 가장 비슷한 물질로 간주되는 키토산에 관한 것이다. 가능성 있는 염소화제들 중, 트리클로로이소시아누르산 및 반응성이 낮은 이의 유사체, 소듐 다이클로로이소시아누레이트만 언급되어 있다. 전술한 물질을 이용할 경우 일반적인 이점은 매우 다양한 미생물들에 대한 효과, 장기 안정성, 재생성, 인간 및 자연에서의 안전성뿐 아니라 낮은 단가이다. 언급된 대부분의 활용에서, N-염소 유도체가 사용되었으며, 상대적으로 양호한 안정성은 주로 N-hal 기 옆에 수소 (알파 수소)를 함유한 탄소가 없는 경우에 일반적으로 관찰되었다. 한편, 알파 할로겐이 존재할 경우, 할로겐화 수소의 제거 및 후속적인 복수의 이민 결합 형성 -NHal-CH- -> N=C-이 이루어질 수 있다. 히알루론산 또는 키토산은 이러한 알파 할로겐을 포함하며, 즉 이러한 타입의 물질 (아미노사카라이드)이 안정성 측면에서 문제가 될 수 있는 구조 단편을 포함한다는 것을 의미한다.
논문 (Cao Z. et al., Journal of Biomedical Materials Research, Part A, 85, 99-107, 2008)에는 또한 염소화 키토산의 제조, 분석 및 검사가 언급되어 있다. 필름 형태의 물질이 미생물 스타필로코커스 아우레우스 및 에셰리키아 콜라이 검사에서 성공적이었다. 전술한 물질에 의한 현저한 생물막 형성 억제도 관찰되었다. 25℃ 안정성도 관찰되었으며, 1달 저장 기간 경과 후 활성 염소의 양이 현저하게 줄어든 것으로 검출되었고, 최종 함량은 처음 값의 15% 수준으로 낮았다.
Cl2 용액과의 반응으로 제조되는 필름 형태의 N-염소화 폴리우레탄 (Luo J. et al., J Bioact Compat Polym, 30, 157-166, 2015)은 미생물 스타필로코커스 아우레우스 (그람 양성 박테리아), 에셰리키아 콜라니 (그람 음성 박테리아) 및 칸디다 알비칸스 (진균)에 대한 검사에서 성공적이었다. 이 물질은 박테리아의 증식을 확실하게 억제하였으며, 아울러 바이오막 형성도 현저하게 저해하였다.
매우 광범위한 물질에 대한 N-클로르아민의 제조 및 용도가 특허에서 청구되었다 (Heller A. et al., WO 2008/094664). 이 물질은 또한 염소가 히알루로난 아미드 상에는 존재하지 않고 이의 탈아세틸화된 아민에 존재하는, 다음과 같은: N-염소화 키토산, N-염소화 폴리라이신 및 N-염소화 탈아세틸화된 히알루론산과 같은 바이오폴리머를 포함한다. 사용 형태는 각각의 클로람아민을 함유한 용액 또는 붕대이다. 이 물질을 국소 방식으로 적용하면, 현저한 통증과 소양증 완화를 제공한다. 클로르아민의 제조시, 다수의 시약들, 예를 들어 HOCl, NaClO, HClO2, N-클로로숙신이미드, N-클로로설폰아미드의 염, 염소 분자, 티오닐 클로라이드, 포스겐, PCl3 및 PCl5들이 언급된다.
일반적으로, 변형율이 높은 (50% 이상) 히알루론산 클로르아미드는 아직까지 개시된 바 없다고 할 수 있다. 공지된 유일한 클로르아미드는 변형율이 좀더 낮은 것 (35% 이하)으로, 불만족스러운 안정성과 관련한 이유로 지금까지 어떠한 실제적인 사용은 언급된 바 없다. 실제, 본원에서 논의되는 물질들은 다음과 같은 요건들을 동시에 충족한다는 점에서 독창적이다:
- 생물학적 적합성 및 생물학적 분해성 (예를 들어, 인체의 특정 염증 과정과 관련있음)
- (클로르아미드 및 클로르아민과 유사하게) 매우 다양한 미생물, 진균 및 바이러스에 대한 증식 저해
- (히알루론산의 존재로 인한) 치유 과정에 유익한 효과
- (활성 성분이 공유 결합에 의해 운반 폴리머에 연결된다는 점에서) 매우 다양한 형태로의 제조 가능성
일반적으로, 이러한 조합은 항바이러스, 및 동시에 생체적합한 상처 드레싱, 충전재, 항-유착 장벽, 멤브레인, 포켓 또는 포장지가 필요한 외부 및 내부 용도로 바람직하다.
본 발명은 히알루로난 클로르아미드를 포함하고 치유 효과를 동반하는 항미생물 및 항바이러스 효과를 발휘하는, 안정성, 생체적합성 및 생분해성을 갖춘 조성물의 제조 및 용도를 기술한다. 또한, 표면적, 기계적 또는 유동학적 특성 및 분해 시간이 상당히 가변적인 매우 다양한 형태들을 기술한다.
본 발명의 대상은, 아미드 기 -NH-CO-의 수소가 구조식 -NCl-CO-에 따라 염소 원자로 치환되고, 치환율이 50-100%인, 히알루론산의 염소화 유도체 또는 변형된 히알루론산의 염소화 유도체이며, 이는 또한 히알루로난 클로르아미드로도 지칭된다. 즉, 변형된 히알루론산은, 일부 -OH 기가 -OCOR2 기로 및/또는 일부 -CH2-OH 기가 -CH=O 기로, 및/또는 일부 CO-OH 기가 -CO-OR2 기로 치환되고, R2가 C1 - C17 원자를 포함하는 선형 또는 방향족 쇄인, 히알루론산이다. 바람직하게는, 히알루론산의 유도체는 에틸 에스테르, 벤질 에스테르, 포르밀, 라우로일 (C12), 팔미토일 (C16), 카프로일 (C6)을 포함하는 군으로부터 선택되며, 유도체의 분자량은 바람직하게는 5 내지 500 kg.mol-1 범위이고, 변형율은 1 내지 100% 범위이다.
아울러, 본 발명은, 화학적 변형시 질소에 결합된 염소를 함유한 물질을 사용해, 바람직하게는 트리클로로이소시아누르산을 또는 다이클로로이소시아누르산의 염을 사용함으로써 구현되는, 히알루로난 클로르아미드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은, 구체적으로, 분자량 40 내지 2200 kg.mol-1의 초기 히알루론산 또는 이의 변형된 유도체를 농도 0.5 내지 5 중%의 수용액으로 제조하고, pH 값을 예를 들어 히알루로난 이당류에 대해 0.2 내지 7 당량의 함량으로 아세트산을 사용해 2.5 내지 7.5, 바람직하게는 4 내지 6 범위로 조정한 다음, 히알루로난 이당류에 대해 0.3 내지 1.5 당량, 바람직하게는 2 내지 4 당량의 함량으로 염소화제를 첨가하고, 혼합물을 5 내지 40℃ 범위의 온도에서 5 내지 72시간 반응시킨 후, 수득되는 클로르아미드를 석출에 의해 분리함으로써, 구현된다. 처음 기질은 히알루론산 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체일 수 있으며, 이러한 기질의 분자량은 40 내지 2200 kg.mol-1 범위이다.
본 발명의 대상은, 아미드 기의 수소 원자 대부분이 염소 원자로 치환되어 산화 및 환원 반응 모두에서 증가된 반응성을 나타내는, 히알루로난 클로르아미드를 포함하는 조성물이다. 최종 조성물은 또한 카르복시 기 및/또는 하이드록시 기가 화학적으로 변형된, 변형된 히알루론산을 포함한다. 본 발명에 따른 조성물은 항미생물, 항진균 및 항바이러스 활성을 나타낸다. 조성물에 포함된 클로르아미드의 농도는 10 내지 99 중량%이며, 조성물은 물, 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 글리세롤, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 소듐 알기네이트, 옥시-셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스 또는 변형된 히알루론산을 포함하는 군으로부터 선택되는 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 여기서 변형된 히알루론산은, 일부 -OH 기들이 OCOR2 기로 치환되거나 및/또는 일부 -CH2-OH 기들이 CH=O 기로 치환되거나 및/또는 일부 CO-OH 기들이 -CO-OR2 기로 치환되되, R2가 C1 - C17 원자를 포함하는 선형 또는 방향족 쇄인 것이다. 조성물은, 예를 들어, 최종 조성물 내 히알루로난 클로르아미드의 함량이 건조물로 계산하였을 때 10 내지 100% 범위인, 수용액 중의 겔 또는 용액의 형태를 추정할 수 있다. 또한, 조성물은, 최종 조성물 내 히알루로난 클로르아미드의 함량이 건조물로 계산하였을 때 10 내지 100% 범위인, 자기-지지 필름, 동결건조물, 스테이블 섬유 층 (부직포), 엔드리스 섬유, 직물, 편성물, 편조물, 나노섬유 층을 포함하는 군으로부터 선택되는 고체 기재 형태를 추정할 수 있다.
본 발명에 따른 염소화 유도체뿐 아니라 본 발명에 따른 조성물은 이식가능한 의료 기구의 제조 또는 상처 드레싱의 제조에 이용가능하다. 이러한 용도에 대한 비-제한적인 예로는 문합 후 유착 방지용 제품, 또는 열개결손 방지용 제품, 또는 다른 물질과 조합하여, 복벽 결함을 외과적으로 교정하기 위한 제품, 또는 의료 기구용 이식가능한 래퍼 조성물의 일부를 포함한다.
최종 조성물의 제조는 히알루로난 클로르아미드를 포함하는 하기 형태를 추가적으로 제공해준다:
- 고체 형태, 예를 들어 자기-지지 필름, 동결건조물, 스테이블 섬유 층 (부직포), 엔드리스 섬유, 직물, 편성물, 편조물 또는 나노섬유 층, 이들 모두 선택적으로 추가의 첨가제를 함유함,
- 액체 형태, 특히 수성 클로르아미드 용액, 선택적으로 추가적인 첨가제를 함유함.
이러한 첨가제에 대한 비-제한적인 예는 다음과 같다: 폴리에틸렌 옥사이드, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 변형된 히알루론산 에스테르 형태, 알데하이드 알데하이드 형태, 소듐 알기네이트, 옥시-셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 지방산 에스테르, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 또는 칼슘 클로라이드.
아울러, 본 발명은 특히 후술한 특징 또는 후술한 특징들의 임의 조합이 요구되는 분야에서 상기한 조성물의 용도에 관한 것이다:
- 산화 활성 또는 환원 활성 또는 항미생물 활성 또는 항진균 활성 또는 항바이러스 활성
- 생물학적 적합성 및 생물학적 분해성
- 편리한 수준의 안정성을 가진 다양한 형태의 제조 가능성
- 생분해율 조절 가능성
- 산화 반응 및 환원 반응의 속도 조절 가능성
- 치유 과정에 유의미한 기여.
히알루로난 클로르아미드를 기본 성분으로 하는 안정한 액체 조성물은 히알루로난 클로르아미드와 반응하는 어떤 첨가제도 포함하지 않아야 한다. 이는 특히 산소 라디칼 (히알루로난 클로르아미드가 산화에 사용되어 환원제로서 작용할 경우)을 함유한 것과 같이 강력한 산화제 및/또는 산화 (히알루로난 클로르아미드가 환원에 사용되어 산화제로서 사용될 경우)에 민감한 화합물에 해당된다. 안정한 고체 조성물의 경우에는 히알루로난 클로르아미드는 이와 반응성인 첨가제와 조합될 수 있다. 그러나, 이러한 경우에도 히알루로난 클로르아미드의 용액과 첨가제 용액이 제조 공정 동안 접촉되지 않는 경우에만 적용된다.
최종 조성물의 생분해율 조절은 히알루로난 클로르아미드를 소듐 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 화학적으로 변형된 히알루론산과 조합하거나, 및/또는 예를 들어 다가 Ca2 + 양이온을 사용해 히알루로난 클로르아미드를 자체 가교함으로써, 달성할 수 있다.
산화성 구성성분의 방출율 조절은 특히 추가적인 극성이 낮은 첨가제를 첨가함으로써 최종 조성물의 팽윤과 같은 물리적 특성을 변형시켜 달성할 수 있다. 저 극성의 첨가제에 대한 비-제한적인 예로는 일부 -OH 기가 -O-CO-R 2 기로 치환되거나 및/또는 -CO-OH 기가 -CO-OR 2 기로 치환되되, R 2 가 C1 - C17 원자를 포함하는 선형 또는 방향족 쇄인 히알루론산의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다.
최종 조성물은 생의학적 용도로 이용가능하며, 특히 상처 드레싱 제조, 여드름 제제, 항세균성 충전재, 항유착성 장벽, 멤브레인, 포켓 또는 포장지를 제조하는데 활용가능하다.
본 발명은 히알루로난 클로르아미드를 포함하며, 치유 효과를 동반한 항미생물 및 항바이러스 효과를 나타내는, 안정한, 생체적합성 및 생분해성 조성물에 관한 것이다. 이 물질의 안정성은 실시예 16에 기술되어 있다. 또한, 표면적, 기계적 또는 유동학적 특성 및 분해 시간이 매우 가변적인 매우 다양한 형태들도 기술된다.
본 발명에 따른 기술적인 해법의 실제 구현은 기술적인 관점에서 복잡하지 않으며, 임의의 이용가능성이 낮은 화학제, 용매 및 분리 공정을 사용할 필요가 없다.
도 1a, 1b - 실시예 25에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드를 기본으로 하는 동결건조물 형태를 가진 조성물의 항미생물 활성.
도는 실시예 15에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드를 기본으로 하는 가용성 동결건조물 (도 1a)의 존재 하, 미생물 바실러스 섭틸리스, 에셰리키아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 칸디다 알비칸스, 슈도모나 에어루지노사, 스타필로코커스 에피더미스의 증식 저해를, 동결건조된 본래의 히알루론산 (도 1b)과 비교하여 보여준다.
항미생물 활성을 측정하는 방법은 실시예 43에서 기술된다.
도 2 - 실시예 32에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드를 기본으로 하는 필름 형태로 추정되는 조성물의 항미생물 활성.
도는 실시예 32에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드를 기본으로 하며 라우르산에 의해 에스테르화된 히알루로난으로 구성된 첨가제를 함유한 불용성 필름의 존재 하에, 미생물 바실러스 섭틸리스, 에셰리키아 콜라이 및 스타필로코커스 아우레우스에 대한 증식 저해를, 실시예 31에 따라 제조한 대조군 물질과 비교하여 보여준다.
항미생물 활성을 측정하는 방법은 실시예 43에서 기술된다.
본 발명의 바람직한 구현예들에 대한 예들
DS = 치환도 = 100% * (변형된 폴리머 유닛의 몰 함량) / (폴리머 유닛 전체의 총 몰 함량)
달리 언급되지 않은 한, 본원에서 "당량" (eq)이란 표현은 히알루로난 이당류와 같은 해당 다당류의 반복 단위에 대한 것이다.
달리 언급되지 않은 한, %는 중량%이다.
본원에서, 폴리머의 분자량은 SEC-MALLS 방법으로 측정한 평균 중량 값이다.
실시예 1
히알루로난 에틸 에스테르의 제조
NaOH를 히알루로난 수용액 (1 g, 300 kg.mol-1, 물 40 ml)에 pH 9가 될 때까지 첨가하였다. 그런 후, 다이메틸 설폭사이드 20 ml 및 에틸 아이오다이드 0.08 ml을 첨가하고, 수득되는 혼합물을 3일간 45℃ 온도에서 교반하였다. 그후, 수득한 혼합물을 100% 이소프로판올 140 ml에 의해 석출시키고, 여과를 통해 분리한 고형물을 이소프로판올로 헹군 다음 진공 건조하였다. 생산물 (897 mg)을 NMR로 분석하였다.
상기한 에스테르 화합물의 DS 값은 6%이었다 (NMR에 의해 측정시, lit. Kettou S. et al., CZ PV 2009-399).
실시예 2
히알루로난의 벤질 에스테르의 제조
NaOH를 히알루로난 수용액 (1 g, 300 kg.mol-1, 물 40 ml)에 pH 9가 될 때까지 첨가하였다. 그런 후, 다이메틸 설폭사이드 20 ml 및 벤질 브로마이드 0.08 ml을 첨가하고, 수득한 혼합물을 4일간 20℃ 온도에서 교반하였다. 그후, 수득한 혼합물을 100% 이소프로판올 140 ml에 의해 석출시키고, 여과를 통해 분리한 고형물을 이소프로판올로 헹군 다음 진공 건조하였다. 최종 생산물 (920 mg 수득)을 NMR로 분석하였다.
상기한 에스테르 화합물의 DS 값은 3%였다 (NMR에 의해 측정시, lit. Kettou et al., PV 2009-399).
실시예 3
히알루로난 라우로일의 제조
테트라하이드로푸란 70 ml, 트리에틸아민 4 당량 및 4-다이메틸아미노피리딘 0.1 당량을 히알루로난 (5 g, 250 kg.mol-1) /증류수 100 ml 용액에 첨가하였다. 동시에, 라우르산 (4 당량)을 테트라하이드로푸란 30 ml과 트리에틸아민 7 ml의 혼합물에 용해하고, 수득한 용액에 에틸 클로로포르메이트 4.8 ml을 15분간 0-5℃에서 첨가하였다. 그런 후, 수득한 현탁액을 히알루로난 용액으로 여과하고, 반응 혼합물을 20℃에서 5시간 교반하였다. 수득한 용액을 100% 이소프로판올 400 ml을 첨가하여 석출시키고, 80% 이소프로판올로 헹군 다음 100% 이소프로판올로 헹구었다. 그후, 석출물을 40℃에서 2일간 건조시켰다. 치환율은 NMR에 의해 측정한 바 37%로 결정되었다.
실시예 4
히알루로난 포르밀의 제조
NaCl 1%, KBr 1%, N-아세틸아미노-TEMPO (0,01 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)를 함유한 1% HA 수용액 (1 g, 200 kg.mol- 1)에, NaClO 수용액 (0.5 eq.)을 질소 분위기 하에 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 12시간 교반하였으며, 이때 에탄올 0.1 g을 첨가하였다. 그런 후, 최종 혼합물을 다시 1시간 교반하였다. 수득한 용액을 증류수로 0.2% 농도로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO3)로 3 회 5 L (1x 1일)에 대해 투석하고, 다시 증류수 5 L에 대해 7회 (2x 1일) 투석하였다. 마지막 용액을 증발시켜 분석하였다.
DS 9% (NMR에 의해 측정).
실시예 5
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 82% (NMR에 의해 측정).
실시예 6
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 40 kg.mol- 1)을 증류수 100 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 83% (NMR에 의해 측정).
실시예 7
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 1000 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 72% (NMR에 의해 측정).
실시예 8
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 0.14 ml (0.2 eq.)을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 53% (NMR에 의해 측정).
실시예 9
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 180 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 3 ml의 아세트산을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 83% (NMR에 의해 측정).
실시예 10
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 5 ml (7 eq.)을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 95% (NMR에 의해 측정).
실시예 11
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 1.07 g (0.33 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 51% (NMR에 의해 측정).
실시예 12
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 4.8 g (1.5 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 96% (NMR에 의해 측정).
실시예 13
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 트리클로로이소시아누르산 2.91 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 97% (NMR에 의해 측정).
실시예 14
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol-1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 트리클로로이소시아누르산 0.87 g (0.3 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 71% (NMR에 의해 측정).
실시예 15
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol-1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 5시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 52% (NMR에 의해 측정).
실시예 16
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol-1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 48시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 85% (NMR에 의해 측정). NMR 용액 (D2O 0.7 ml 중의 생산물 7 mg)을 20℃에서 5일간 정치시킨 후 측정하였다. DS 값은 84%로 측정되었다. 분말 형태의 고형 분획을 100일간 20℃에서 정치시켰으며, 이후 샘플을 D2O에 용해하였다. DS 값은 84%로 측정되었다.
실시예 17
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol- 1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 5℃ 온도에서 72시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 64% (NMR에 의해 측정).
실시예 18
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 2200 kg.mol-1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 3.2 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 40℃ 온도에서 5시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 75% (NMR에 의해 측정).
실시예 19
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 300 kg.mol-1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 2.56 g (0.8 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 79% (NMR에 의해 측정).
실시예 20
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 300 kg.mol- 1)을 350 ml의 증류수에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 5분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 2.56 g (0.8 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 17℃ 온도에서 22시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 66% (NMR에 의해 측정).
실시예 21
히알루로난 클로르아미드의 제조
히알루로난 5 g (Mw 300 kg.mol-1)을 증류수 250 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 2 ml을 첨가하고, 용액을 5℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 2.56 g (0.8 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 5℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 2.5 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 2 L로 헹구었으며, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 50% (NMR에 의해 측정).
실시예 22
히알루로난 에틸 에스테르의 클로르아미드의 제조
실시예 1에 따라 제조한 히알루로난 에틸 에스테르 0.5 g을 증류수 25 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 0.2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 0.32 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 250 ml을 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 0.2 L로 헹구고, 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 80% (NMR에 의해 측정).
실시예 23
히알루로난 벤질 에스테르의 클로르아미드의 제조
실시예 2에 따라 제조한 히알루로난 벤질 에스테르 0.5 g을 증류수 25 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 0.2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 0.32 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 0.25 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 0.2 L로 헹구고, 이를 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 78% (NMR에 의해 측정).
실시예 24
히알루로난 포르밀의 제조
실시예 4에 따라 제조한 히알루로난 포르밀 0.5 g을 증류수 25 ml에 용해하였다. 그런 후, 아세트산 0.2 ml을 첨가하고, 용액을 20℃ 온도에서 15분간 교반하였다. 그 후, 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염 0.32 g (1 eq.)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 20℃ 온도에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 이소프로판올 0.25 L를 첨가하여 석출시키고, 여과하였다. 고형 분획을 이소프로판올 0.2 L로 헹구고, 20시간 동안 진공 건조하였다. DS 75% (NMR에 의해 측정).
실시예 25
히알루로난 클로르아미드 동결건조물의 제조
증류수 10 ml 중의 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.2 g으로 된 용액을 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. DS 값은 NMR으로 측정시 70%로 결정되었다.
실시예 26
히알루로난 에틸 에스테르의 클로르아미드 동결건조물의 제조
증류수 10 ml 중의 실시예 22에 따라 제조한 히알루로난 에틸 에스테르의 클로르아미드 0.2 g으로 된 용액을 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. DS 값은 68%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 27
히알루로난 벤질 에스테르의 클로르아미드 동결건조물의 제조
증류수 10 ml 중의 실시예 23에 따라 제조한 히알루로난 벤질 에스테르의 클로르아미드 0.2 g으로 된 용액을 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. DS 값은 67%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 28
히알루로난 클로르아미드로 제조된 스테이블 섬유로부터 부직포 제조
2% 용액을 제조하기 위해, NMR에 따른 치환율이 71%인 히알루로난 클로르아미드 (실시예 14)를 사용하였다. 상기한 성분을 칭량하고, 여기에 증류수를 필요한 양으로 첨가하였다. 전체 혼합물을 속도 500 rpm 및 교반 시간 24시간으로 설정하여 믹서에서 실온 하에 교반하였다. 최종 용액은 투명하고, 약간의 점성을 나타내었다. 스테이블 섬유의 제조 방법은 100% 프로판올이 든 이동 응고조의 스트림에서 폴리머 용액을 석출하는 것을 기반으로 한다. 이후, 방사관 (spinning tube) (튜브 1/직경 8 mm)을 통해 공급되는 응고조의 스트림으로 용액을 실온에서 압출 노즐을 통해 투입하였으며, 응고조의 유속은 1.15 m/s로 통제하였다. 석출을 통해 스테이블 섬유를 제조하였다. 제조된 섬유는 조 스트림에 퍼져 있으며, 이를 분리 콤 (separation comb)으로 포착하여, 100% 이소프로판올이 담긴 숙성 조로 옮겼다. 숙성 조로의 유입 즉시, 믹서의 블레이드를 회전시켜 원 섬유를 분쇄하였으며, 섬유의 양/조의 비율은 0.5 g / 350 ml이었다. 최종 섬유 분산물을 다공성 기판을 통해 필터 프레임을 통해 여과하였다. 해당 실험에서, 표면적이 64 cm2인 필터 프레임을 사용하였다. 여과 후, 섬유를 PAD 편성물을 이용해 부직포를 고정하는 건조 장치로 이송하였다. 섬유는, 건조 장치에 배치하기 전, 롤러를 사용해 석출 잔류물로부터 회수하였다. 부직포를 40℃에서 30분간 건조하였다. 형성된 층은 자기-지지 층으로서 기판으로부터 분리하였으며, 분석용 저울을 사용해 무게를 측정하였다. 직물의 면적당 무게 (areal weight)는 50.2 g/m2이었다. 형성된 부직포의 치환도는 64%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 29
히알루로난 클로르아미드로부터 나노섬유 층의 제조
히알루론산을 함유한 나노섬유 층을 제조하기 위해, 다음과 같은 조성의 수용액을 제조하였다. 실시예 5에 따라 제조된 히알루로난 클로르아미드의 농도는 건조물로서 37.5%이었으며, 분자량이 80 kg.mol-1인 본래의 히알루로난의 농도는 37.5%이고, 분자량이 600 kg.mol-1인 폴리에틸렌 옥사이드의 함량은 25%이었다. 건조물의 총 농도는 5%이다. 용액을 시린지로 투입하고, 무침 직선형 노즐 (needleless linear nozzle)을 이용해 플레이트-타입의 콜렉터에서 정전기장 하에 방사하였으며, 에미터와 콜렉터 사이의 전압과 거리는 각각 50 kV 및 16 cm이다. 섬유의 직경은 110 ± 27 nm이다. DS 값은 30%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 30
히알루로난 클로르아미드로부터 자기-지지 필름의 제조
필름의 제조는 필름을 밀폐된 챔버에서 건조하는 특수 건조 장치에서 수행하였다. 장치에는 온도 제어가능한 바닥판과 상부판이 장착되어 있다. 장치에 대한 상세한 설명은 간행물 Foglarova et al., PV2015-166; FoglarovaM. Et al., Carbohydrate Polymers 2016, 144, 68-75에서 제공된다. 실시예 5에 언급된 히알루로난 클로르아미드 200 mg을 칭량하여, 탈염수 20 ml에 용해한 다음 제조된 용액을 2시간 교반하였다. 그 후, 최종 용액을 건조 장치의 패드 (소수성 유리) 위에 놓고, 밀폐된 챔버에서 18시간 건조하였다. 건조기의 바닥판 및 상부판의 온도는 각각 50℃ 및 20℃였다. 건조 후, 필름을 패드에서 분리하여, 향후 사용을 위해 보관하였다. DS 값은 60%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 31
라우로일 히알루로난 및 본래의 히알루로난 (4/1)으로부터 자기-지지 필름의 제조
필름의 제조는 실시예 30에 언급된 장치에서 수행하였다. (실시예 3에 기술된) 소듐 히알루로네이트의 라우로일 유도체 160 mg을 칭량하여, 2-프로판올 (50% w/w) 수용액 10 ml에 용해한 다음 제조된 용액을 18시간 교반하였다. 분자량 330 kg.mol-1의 본래의 히알루로난 40 mg을 칭량하여, 탈염수 4 ml에 용해하였으며, 제조된 용액을 18시간 교반하였다. 그 후, 이들 2종의 용액을 혼합하고, 30분간 교반하였다. 이후, 제조된 혼합 용액을 건조 장치의 패드 (소수성 유리) 위에 놓고, 밀폐된 챔버에서 7시간 건조하였다. 건조기의 바닥판 및 상부판의 온도는 각각 50℃ 및 20℃였다. 건조 후, 필름을 패드에서 분리하여, 향후 사용을 위해 보관하였다.
실시예 32
라우로일 히알루로난 및 히알루로난 클로르아미드 (3/1)로부터 자기-지지 필름의 제조
필름의 제조는 실시예 30에 언급된 장치에서 수행하였다. (실시예 3에 기술된) 소듐 히알루로네이트의 라우로일 유도체 150 mg을 칭량하여, 2-프로판올 (50% w/w) 수용액 15 ml에 용해한 다음 제조된 용액을 18시간 교반하였다. 실시예 5에 언급된 히알루로난 클로르아미드 50 mg을 칭량하여, 탈염수 5 ml에 용해하였으며, 제조된 용액을 2시간 교반하였다. 그 후, 이들 2종의 용액을 혼합하고, 30분간 교반하였다. 이후, 제조된 혼합 용액을 건조 장치의 패드 (소수성 유리) 위에 놓고, 밀폐된 챔버에서 7시간 건조하였다. 건조기의 바닥판 및 상부판의 온도는 각각 50℃ 및 20℃였다. 건조 후, 필름을 패드에서 분리하여, 향후 사용을 위해 보관하였다. 최종 소재에서 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 25%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 33
라우로일 히알루로난 및 히알루로난 클로르아미드 (4/1)로부터 자기-지지 필름의 제조
필름의 제조는 실시예 30에 언급된 장치에서 수행하였다. (실시예 3에 기술된) 소듐 히알루로네이트의 라우로일 유도체 160 mg을 칭량하여, 2-프로판올 (50% w/w) 수용액 16 ml에 용해한 다음 제조된 용액을 18시간 교반하였다. 실시예 5에 언급된 히알루로난 클로르아미드 40 mg을 칭량하여, 탈염수 4 ml에 용해하였으며, 제조된 용액을 2시간 교반하였다. 그 후, 이들 2종의 용액을 혼합하고, 30분간 교반하였다. 이후, 제조된 혼합 용액을 건조 장치의 패드 (소수성 유리) 위에 놓고, 밀폐된 챔버에서 7시간 건조하였다. 건조기의 바닥판 및 상부판의 온도는 각각 50℃ 및 20℃였다. 건조 후, 필름을 패드에서 분리하여, 향후 사용을 위해 보관하였다. 최종 소재에서 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 20%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 34
히알루로난 클로르아미드로 제조된 섬유로 편성물 제작
섬유 형성에 사용한 첫 원료 물질은 실시예 14에 따라 제조된 히알루로난 클로르아미드이다. 이 폴리머를 탈염수에 용해하여 4.7% 농도의 용액을 제조하였다. 용액은 용해 후 시린지로 옮긴 다음 원심분리에 의해 탈기 처리하였다. 락트산과 이소프로판올 1:4로 구성된 응고조로 용액을 200 ㎕/min의 속도로 투입하였다. 섬유는 속도 1.45 m/min으로 감았다. 그런 후, 섬유를 이소프로필 알코올로 헹군 다음 건조하였다. 섬유는 다음과 같은 특징을 가진다: 섬세도 9 tex, 인장 강도 1.0 N 및 신도 11%. 클로르아미드의 DS 값은 34%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다. 편성물을 제조하기 위해, 공급 속도 10 m/min 및 방사 속도 3000 min- 1으로, 고리-타입의 트위스트 프레임 (twisting frame)에서 섬유 3개의 다발화 및 꼬기를 수행하였으며; 최종 트위스트 값은 300 m-1이었다. 이중-베드 랩 편물기를 사용해, 실들로부터 폐-고리 결합을 가진 양면 위편성 직물을 직조하였다. 최종 편물한 스트립은 너비가 10 mm, 평량 (basis weight)이 99 g.m-2, 고리 밀도 (loop density)가 36 cm-2이었다.
실시예 35
라우로일 히알루로난 및 히알루로난 클로르아미드 (4/1)로 제조된 섬유로부터 편성물 제작
섬유 형성에 사용한 첫 원료 물질은 실시예 3에 따라 제조한 라우로일 히알루로난 400 mg과 실시예 14에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 100 mg을 포함하는 조합물이다. 히알루로난 클로르아미드의 칭량한 양을 탈염수 6 ml에 용해한 다음, 이소프로판올 5.1 ml과 칭량의 양의 라우로일 히알루로난 (NMR에 따른 DS: 91%, MW 300-350 kDa)을 첨가하였다. 농도 4.5%인 제조된 용액을 시린지로 옮긴 다음 원심분리에 의해 탈기 처리하였다. 그런 후, 락트산과 이소프로판올 1:4의 혼합물로 구성된 응고조로 용액을 200 ㎕/min의 속도로 투입하였다. 섬유는 속도 1.32 m/min으로 감았다. 그런 후, 섬유를 이소프로필 알코올로 헹구고, 아세톤을 사용해 안정화한 다음 건조하였다. 섬유는 다음과 같은 특징을 가진다: 섬세도 8 tex, 인장 강도 0.7 N 및 신도 16%. 편성물을 제조하기 위해, 공급 속도 10 m/min 및 방사 속도 3000 min- 1으로, 고리-타입의 트위스트 프레임에서 섬유 3개의 다발화 및 꼬기를 수행하였으며; 최종 트위스트 값은 300 m-1이었다. 이중-베드 랩 편물기를 사용해, 실들로부터 폐-고리 결합을 가진 양면 위편성 직물을 직조하였다. 최종 편물한 스트립은 너비가 10 mm, 평량이 91 g.m-2, 고리 밀도가 36 cm-2이었다.
실시예 36
동결건조물의 제조: 옥시셀룰로스 / 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의, 옥시셀룰로스 (Mw 50 kg.mol-1) 0.3 g 및 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.1 g으로 된 용액을, 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 24%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 37
동결건조물의 제조: 알기네이트 / 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의, 알기네이트 (Mw 40 kg.mol-1) 0.3 g 및 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.1 g으로 된 용액을, 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 26%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 38
동결건조물의 제조: 카르복시메틸 셀룰로스 / 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의, 카르복시메틸 셀룰로스 (Mw 30 kg.mol-1) 0.3 g 및 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.03 g으로 된 용액을, 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 3%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 39
동결건조물의 제조: 콘드로이틴 설페이트 / 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의, 콘드로이틴 설페이트 (Mw 45 kg.mol-1) 0.03 g 및 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.3 g으로 된 용액을, 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 75%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 40
동결건조물의 제조: 하이드록시에틸 셀룰로스 / 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의, 하이드록시에틸 셀룰로스 (Mw 45 kg.mol-1) 0.3 g 및 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.1 g으로 된 용액을, 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 25%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 41
동결건조물의 제조: 히알루로난 포르밀 / 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의, 실시예 4에 따라 제조한 포르밀 히알루로난 (Mw 45 kg.mol-1) 0.3 g 및 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 0.1 g으로 된 용액을, 균질화 즉시 -50℃에서 급속 냉동한 후 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 25%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 42
동결건조물의 제조: CaCl 2 와 가교된 히알루로난 클로르아미드
증류수 100 ml 중의 실시예 5에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 (0.1 g)의 용액에 CaCl2.2H2O 0.01 g을 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 1시간 교반하였다. 균질화 후, 최종 점성 용액을 -50℃에서 급속 냉동시켜 동결건조하였다. 히알루로난 클로르아미드의 DS 값은 64%인 것으로 NMR에 의해 측정되었다.
실시예 43
시험관내 항미생물 활성 검사 (도 1 및 2):
검사에 사용한 각각의 미생물에 대해 약 105 CFU/ml 농도의 현탁물을 준비하였다. 현탁물 100 ㎕를 페트리 디쉬에서 트립톤 소이 아가 표면에 접종하였다 (각 디쉬에 사용되는 미생물의 대략적인 카운트는 104 CFU임). 현탁물은 디쉬 전체 표면에 무균 루프를 사용해 균일하게 도말하였다. 현탁물을 아가에 흡수시킨 후, 아가의 표면을 무균성의 사각-형태의 검사용 선택 샘플로 덮었다. 박테리아 검사 균주는 37℃에서 24시간 배양하였다. 검사는 실시예 25에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드 동결건조물과 실시예 32에 따라 제조한 히알루로난 클로르아미드를 함유한 자기-지지 필름 검사를 포함하였으며, 각각의 대조군은 히알루로난 클로르아미드가 함유되지 않은 비슷한 사각형 조각을 사용하였다. 이를 위해, 무게가 8-12 mg이고 대략적인 크기가 15 mm x 15 mm인 사각형 조각을 준비하였다. 효능 검사에는 확산 플레이트 방법 (2D 배치)을 선택하였다. 배양시에는 비-선별 기질 (트립톤 소이 아가)을 선택하였다. 사각-형태의 샘플에서 다음과 같은 미생물을 검사하였다: 바실러스 섭틸러스, 에셰리키아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 칸디다 알비칸스, 슈도모나스 에어루지노사, 스타필로코커스 에피더미스. 도 1 및 2는, 본 발명에 따른 히알루로난 클로르아미드를 함유한 조성물이, 히알루로난 클로르아미드를 함유하지 않는 대조군과 비교해, 현저하게 더 높은 박테리아 증식 저해 효과를 제공한다는 것을, 명확하게 보여준다.
실시예 44
플라그 감소에 기반한 항바이러스 활성 검사
반복 횟수 - 5, 실시예 19에 따라 제조한 물질 검사, 검사 바이러스: CVB3 (Nancy), 농도 3x10E7, 5 PFU/ml, VERO 세포 기질
절차:
바이러스를, 부피 1.5 ml으로 107배 희석한 후, 페트리 디쉬에서 세포 기질에 30분간 흡수시켰다. 음성 대조군은 바이러스 없이 PBS만 포함하였다. 이후, 석션에 의해 바이러스를 회수하고, 세포 위에 검사 물질 (또는 음성 대조군에 함유된 HA 및 PBS)을 적층하여, 37℃에서 5% CO2 하에 5시간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 헹구고, 5% 불활화된 FBS 및 0.75% 아가로스가 첨가된 EMEM 함유 배지 층으로 덮었다. 5% CO2 함유 분위기 하에 37℃에서 4일간 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 회수하고, 세포를 크리스탈 바이올렛 염료로 염색하여, 플라그 개수를 측정하였다. 검사에서 항바이러스 활성은 플라그의 개수 감소와 비례하였다.
실험군에 대한 설명 인큐베이션한 검사 물질 PD에서의 PFU 평균 SD
세포에서 PBS 검사 PBS 0 0 0 0 0 0 0
세포에서 HA 검사 1% HA 클로르아미드 / PBS 0 0 0 0 0 0 0
독성 검사 1% HA 클로르아미드 / PBS 0 0 0 0 0 0 0
바이러스에서 PBS 검사 PBS 13 9 7 14 10 10.6 2.88
바이러스에서 HA 검사 1% HA / PBS 10 6 14 12 10 10.4 2.97
검사 1 0.1% HA 클로르아미드 / PBS 5 7 10 8 9 7.8 1.92
검사 2 0.5% HA 클로르아미드 / PBS 8 5 8 7 8 7.2 1.3
검사 3 1% HA 클로르아미드 / PBS 4 1 2 3 3 2.6 1.14
FBS - 소 태아 혈청, VERO - 세르코피테쿠스 에어티옵스 (Cercopithecus aethiops)의 신장으로부터 유래한 안정화된 세포주, EMEM - 이글스 최소 기본 배지, 3x10E7.5 PFU/ml - 감염성 현탁물의 제조에 사용된 바이러스 농도 - 3x10E7.5 플라그-형성 단위/ ml, 여기서 PFU/ml은 바이러스의 양 단위이고, PFU는 플라그 형성 단위임, PD - 페트리 디쉬, SD - 표준 편차.
수득한 결과들은, 히알루로난 클로르아미드의 존재가 표준 "바이러스에서 HA 검사"와 비교해 바이러스 증식을 저해하고 (검사 1, 2 및 3), 이러한 저해가 히알루로난 클로르아미드의 농도 증가에 따라 더욱 효과적일 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.

Claims (13)

  1. 클로르아미드인, 히알루론산 체 또는 변형된 히알루론산의 염소화 유도체로서,
    아미드 기 -NH-CO-의 수소가 구조식 -NCl-CO-에 따라 염소 원자로 치환되되, 치환율이 50 내지 100%인, 염소화 유도체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 히알루론산이, 일부 -OH 기들이 -O-CO-R2 기로 치환되거나 및/또는 일부 -CH2-OH 기들이 -CH=O 기로 치환되거나 및/또는 일부 -CO-OH 기들이 -CO-OR2 기로 치환되되 R2가 C1 - C17 원자를 포함하는 선형 또는 방향족 쇄를 가진 히알루론산인, 염소화 유도체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 변형된 히알루론산이 에틸 에스테르, 벤질 에스테르, 포르밀, 라우로일 (C12), 팔미토일 (C16), 카프로일 (C6)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 염소화 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    분자량이 5 내지 500 kg.mol-1인, 염소화 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 또는 변형된 히알루론산의 클로르아미드의 제조 방법으로서,
    분자량 40 내지 2200 kg.mol-1인 초기 히알루론산 또는 이의 변형된 유도체의 수용액을 0.5 내지 5 중량%의 농도로 제조하고; pH를 2.5-7.5의 범위로 조정한 다음; 히알루로난 이당류에 대해 0.3-1.5 당량의 염소화제를 첨가하고; 혼합물을 5-40℃에서 5-72시간 동안 반응하도록 두고; 제조되는 클로르아미드를 석출에 의해 분리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    pH를 4-6의 범위로 조정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    히알루로난 이당류에 대해 아세트산 0.2-7 당량을 첨가하여 pH를 조정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염소화제가 트리클로로이소시아누르산이거나 또는 다이클로로이소시아누르산의 소듐 염인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 항미생물, 항진균 및 항바이러스 조성물로서,
    상기 조성물이, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 유도체를 10 내지 99 중량%로 포함하고, 물, 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 글리세롤, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 소듐 알기네이트, 옥시-셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스 또는 변형된 히알루론산을 포함하는 군으로부터 선택되는 첨가제를 포함하며,
    상기 변형된 히알루론산은, 일부 -OH 기들이 -O-CO-R2 기로 치환되거나 및/또는 일부 -CH2-OH 기들이 -CH=O 기로 치환되거나 및/또는 일부 -CO-OH 기들이 -CO-OR2 기로 치환되되 R2가 C1 - C17 원자를 포함하는 선형 또는 방향족 쇄인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물이 용액 또는 수용액 중의 겔 형태이고,
    최종 조성물 내 상기 클로르아미드의 함량이 건조물로 계산하였을 경우 10-100% 범위인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물이 자기-지지 필름, 동결건조물, 스테이블 섬유 층 (부직포), 엔드리스 섬유, 직물, 편성물, 편조물 또는 나노섬유 층을 포함하는 군으로부터 선택되는 고체 기재 형태이고,
    최종 조성물 내 상기 클로르아미드의 함량이 건조물로 계산하였을 경우 10-100% 범위인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 상처용 피복재 (wound cover)를 제조하거나 또는 이식가능한 의료 기구를 제조하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 염소화 유도체의 용도.
  13. 상처용 피복재를 제조하거나 또는 이식가능한 의료 기구를 제조하기 위한 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
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