BR112021001463A2 - derivado clorado de ácido hialurônico ou de um ácido hialurônico modificado, método de preparação da cloramida de ácido hialurônico ou de um ácido hialurônico modificado, composição antimicrobiana, antifúngica e antiviral e uso - Google Patents
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Abstract
A invenção diz respeito à preparação e ao uso de várias formas que compreendem um derivado do ácido hialurônico - uma cloramida hialuronana, na qual a maioria dos átomos de hidrogênio do grupo amídico -NH-CO- são substituídos por átomos de cloro -NCl-CO-. As composições que compõem a cloramida hialuronana apresentam uma ampla gama de atividade antimicrobiana e antiviral e, graças à sua biocompatibilidade, são adequadas para aplicações no campo de coberturas de feridas ou para a preparação de uma ampla gama de dispositivos médicos implantáveis.
Description
[001] A invenção se refere a um derivado do ácido hialurônico, no qual a maioria dos átomos de hidrogênio do grupo amídico -NH-CO- é substituída por átomos de cloro - NCl-CO-. Quando modificado da maneira atual, o polímero - cloramida hialuronana - apresenta uma reatividade aumentada tanto nas reações oxidativas quanto nas reações redutoras.
[002] Além disso, a invenção se refere ao método de preparação da cloramida hialuronana, onde a modificação química ocorre em ambiente aquoso por meio de ácido tricloroisocianúrico ou por meio de sais de ácido tricloroisocianúrico. A preparação da composição final também compreende o fornecimento de formas contendo cloramida hialuronana. Aqui, o termo “forma” se refere a vários tipos de materiais, tais como película fina, liofilizado, camada de fibras descontínuas, fibra sem fim, tecidos planos, tecido de malha, tecido trançado ou camada nanofibrosa.
[003] Além disso, a invenção diz respeito às composições finais contendo cloramida hialuronana e ao uso de tais composições nos campos onde as seguintes propriedades ou quaisquer combinações das seguintes propriedades são necessárias: - atividade oxidativa ou redutora ou antimicrobiana ou antifúngica ou antiviral; - compatibilidade biológica e degradabilidade biológica;
- possibilidade de preparar várias formas com um conveniente grau de estabilidade; - possibilidade de taxa de biodegradação controlada; - possibilidade de velocidade controlada de reações oxidativas e redutoras; - contribuição significativa para o processo de cicatrização.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO O ácido hialurônico
[004] O ácido hialurônico (HA) ou seu sal sódico é um glicosaminoglicano não sulfatado constituído por duas unidades repetidas de ácido D-glucurônico e N-acetil-D- glucosamina. 1 OH
O O HO O HO O n OH NHAc em que: R1 significa hidrogênio ou sódio.
[005] O peso molecular do ácido hialurônico nativo está na faixa de 5.104 a 5.106 g.mol-1. Este polissacarídeo hidrofílico desempenha um papel significativo em numerosos processos biológicos, como a organização de proteoglicanos, hidratação ou diferenciação celular, e é conhecido por ser um constituinte essencial da pele, do líquido sinovial das articulações e dos tecidos conjuntivos. O polímero acima mencionado ocorre naturalmente nos sistemas biológicos e, portanto, pode ser caracterizado como sendo biodegradável e biocompatível. Portanto, ele constitui um substrato adequado no campo dos portadores de substâncias biologicamente ativas para uma ampla gama de aplicações biomédicas.
Modificações químicas e formas do ácido hialurônico
[006] Existem numerosos métodos conhecidos de modificação química do ácido hialurônico com o objetivo de ajustar as suas propriedades físicas e biológicas (Burdick J. A. and Prestwich G. D., Adv. Mater. 23, 41–56, 2011). Caso uma mudança essencial na solubilidade seja necessária em relação a uma determinada aplicação, o procedimento mais frequentemente realizado consiste em ligar covalentemente uma cadeia hidrofóbica à estrutura polimérica por meio de uma ligação éster biodegradável (Kettou S. et al., PV 2009- 399, Buffa R. et al., WO2010105582). Quando modificados da maneira acima, tais materiais podem ser utilizados para a preparação de várias formas, tais como fibras (Scudlova J. et. al., EP2925916 A1), tecidos de malha e trançados (Pitucha T. et al, CZ 306354), películas autoportantes (Foglarova M. et al. PV2015-166; Foglarova M. et al., Carbohydrate Polymers, 144, 68-75, 2016) ou camadas nanofibrosas (Ruzickova J. et al. PV2013-913). Outra possibilidade são os tecidos não tecido formados por microfibras coladas, estas últimas sendo preparadas por meio do processo de fiação úmida em banho de coagulação não estacionário (Zapotocky V. et al., International Journal of Biological Macromolecules, 95, 903-909, 2017).
Oxidação com ácido tricloroisocianúrico ou com tricloroisocianurato de sódio
[007] O ácido tricloroisocianúrico (TCC) é frequentemente utilizado para a realização da cloração N de amidas estruturalmente mais simples para N-cloramidas (Hiegel G. A. et al., Synthetic Communications, 35, 2099- 2105, 2005), principalmente em solventes não aquosos. Além disso, o TCC é frequentemente mencionado em combinação com radicais estáveis, tais como um tipo piperidinoxi (TEMPO), para oxidação seletiva de grupos hidroxila primários na presença de água. Em relação ao ácido hialurônico, o uso do TCC junto com o TEMPO em água foi divulgado, por exemplo, na patente WO2011069475A3 (Buffa R. et al.), onde não foi observada nenhuma formação de cloramidas, mas apenas a oxidação de grupos hidroxil primários a um aldeído e a um ácido carboxílico. Assim, no caso de substratos contendo grandes quantidades de álcoois secundários e primários (polissacarídeos), podem ser esperadas reações sobre grupos hidroxila quando o TCC e seus análogos são utilizados. O sal monossódico TCC, que também é conhecido como dicloroisocianurato de sódio (DCC-Na), é um análogo de TCC menos reativo, mas melhor solúvel em água. O uso do DCC-Na para oxidar aminas e amidas que, entretanto, não contêm grupos hidroxila (Sun X. et al., Ind. Eng. Chem. Res., 49, 22, 2010) foi divulgado. As cloraminas resultantes foram polimerizadas e os substratos finais foram testados com sucesso como substâncias antibacterianas, antifúngicas e antivirais na forma de uma emulsão de látex (Cao Z. et al., App. Mat. Inter. 1, 2, 494-504, 2009).
[008] Com base nos resultados acima, pode-se concluir que o uso de TCC ou seus análogos para preparar amida de hialuronana N-clorada em água de forma seletiva não é previsível devido à reação pressuposta com os grupos hidróxi de hialuronana.
Oxidação de polissacarídeos com ácido hipocloroso ou com um hipoclorito
[009] O ácido hipocloroso e seus sais são frequentemente utilizados para a oxidação de grupos hidroxila de polissacarídeos, principalmente em combinação com radicais piperidiniloxi (TEMPO) (Bragd P. et al., WO2002/48197; Buffa R. et al., WO2011/069475A3). Pode-se dizer que, na grande maioria dos casos, não foi observada nenhuma formação das respectivas cloramidas em relação aos polissacarídeos contendo um grupo amida. As fontes iniciais não mencionam qualquer presença de cloramida hialuronana (Green S. P. et al., J. Rheumatology, 17, 1670-5, 1990, Lindvall S. et al., Chem. Biol. Interac. 90, 1-12, 1994, Baker M. S. et al., 461-7Arthritis and Rheumatism, 32, 4, 1989). As publicações acima mencionadas descrevem o exame do processo de degradação da hialuronana causado pelo ácido hipocloroso ou por seus sais, sendo este último formado em uma reação de mieloperoxidase (MPO) com peróxido de hidrogênio e cloretos. Há várias outras publicações descrevendo a degradação dos glicosaminoglicanos, principalmente aqueles contidos na matriz extracelular, com o objetivo de simular processos inflamatórios. O principal resultado foi a informação relativa tanto ao processo em si como à presença in vivo esperada de certas estruturas químicas. Fontes mais recentes ou atuais já mencionam as cloramidas de hialuronana. Por exemplo, a publicação (Hawkins C. L. et al., Free Radical Biology & Medicine, 24, 9, 1396-1410, 1998) trata do estudo do mecanismo de degradação do ácido hialurônico, sulfato de condroitina e outros substratos, incluindo os de baixa molecularidade,
contendo um grupo amida.
O agente oxidante utilizado foi o HOCl/ClO-. Os autores não assumem a existência de outras formas de cloramida hialuronana que um intermediário instável.
No entanto, esta última nunca foi detectada de maneira direta.
A razão disso reside em sua rápida clivagem homolítica ou redutora, ambos os casos resultando na formação de radicais que reagem ainda mais de uma forma que leva à degradação do polímero.
Outro artigo (Parsons B.
J. et al., Biochem.
J., 381, 175-184, 2004) descreve a formação de cloramidas de hialuronana, sulfato de condroitina e outros substratos por meio de MPO (enzima mieloperoxidase), peróxido de hidrogênio e cloretos.
Os autores assumem que as cloramidas respectivas têm certa vida útil e fornecem uma descrição detalhada da degradação de tais cloramidas por meio de agentes adicionais.
Outro artigo muito interessante (Rees M.
D. et al., 125, 13719-13733J.
Am.
Chem.
Soc., 2003) descreve as reações de mono, oligo e polissacarídeos contendo um grupo amida com NaClO.
O referido artigo contém uma análise completa da estabilidade das cloramidas de hialuronana, bem como do sulfato de condroitina, tendo os graus de modificação de 35% e 16%, respectivamente, tanto na presença como na ausência de outros reagentes e substâncias, tais como Cu2+ e oxigênio.
Descobriu-se que a degradação é substancialmente acelerada pela presença de certos metais.
Uma rápida degradação de cloramidas poliméricas de hialuronana e de sulfato de condroitina à temperatura de 50oC foi observada, mesmo na ausência de metais.
A degradação foi significativamente mais lenta a temperaturas mais baixas.
Os resultados das observações diretas também mostram que a reação da MPO com glicosaminoglicanos, que ocorre na presença de peróxido de hidrogênio e na presença de uma quantidade fisiológica de cloretos, gera uma pequena quantidade de cloramidas glicosaminoglicanos. Assim, os autores chegaram à conclusão de que tais cloramidas também são geradas in vivo.
[010] Com base nos resultados acima, pode-se concluir que, apesar de serem conhecidas, não se pode esperar que as cloramidas de hialuronana com um baixo grau de modificação tenham uma estabilidade suficiente que as torne adequadas para preparar composições para aplicações biomédicas.
Aplicação de polímeros N-halogenados
[011] Esta seção descreve os resultados que também descrevem aplicações mais específicas e selecionadas de cloraminas ou cloramidas.
[012] O artigo de resumo (Hui F. et al., Biomacromolecules, 14, 585-601, 2013) descreve a preparação, análises e aplicações de vários materiais contendo uma ligação -N-halogênio. Entretanto, o resumo acima mencionado não menciona o ácido hialurônico e a descrição se refere ao quitosano que é considerado como a substância relacionada mais próxima do ponto de vista estrutural. Entre os possíveis agentes clorantes, foi mencionado o ácido tricloroisocianúrico e seu análogo menos reativo, o dicloroisocianurato de sódio. Uma vantagem geral da aplicação dos materiais descritos acima consiste na eficácia contra uma grande variedade de microorganismos, estabilidade em longo prazo, regenerabilidade, segurança para os seres humanos e a natureza, assim como seu baixo custo. Na maioria das aplicações descritas, foram utilizados derivados de N-
cloro onde geralmente se observou uma estabilidade relativamente boa, principalmente nos casos em que não há carbono com um hidrogênio (hidrogênio alfa) ao lado do grupo N-hal. Por outro lado, a eliminação dos halogênios de hidrogênio e a subsequente formação de uma ligação imina múltipla NHal-CH- → -N=C- pode ocorrer quando o halogênio alfa está presente. O ácido hialurônico ou quitosano contém tal hidrogênio alfa, o que significa que os substratos deste tipo (aminossacarídeos) incluem um fragmento estrutural que pode ser problemático do ponto de vista da estabilidade.
[013] A preparação, análise e teste do quitosano clorado também foi descrita no artigo (Cao Z. et al., Journal of Biomedical Materials Research, Parte A, 85, 99-107, 2008). Um material com a forma de uma película foi testado com sucesso contra os microorganismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Também foi observada uma supressão significativa da formação do biofilme pelo material acima mencionado. A estabilidade a 25ºC também foi observada, onde foi detectada uma diminuição significativa na quantidade de cloro ativo após um mês de armazenamento, sendo a quantidade final tão baixa quanto 15% do valor inicial.
[014] Um poliuretano N-clorado na forma de película e preparado em reação com uma solução de Cl2 (Luo J. et al., J Bioact Compat Polym, 30, 157-166, 2015) foi testado com sucesso contra os microorganismos Staphylococcus aureus (bactérias gram-positivas), Escherichia coli (bactérias gram-negativas) e Candida albicans (fungos). O material suprimiu notavelmente o crescimento de bactérias e, além disso, inibiu significativamente a formação do biofilme.
[015] A preparação e o uso de N-cloraminas de uma grande variedade de substratos foram reivindicados na patente WO 2008/094664 (Heller A. et al.). Os substratos também incluíam os seguintes biopolímeros: N-quitosano clorado, N-polisina clorada e N-ácido hialurônico desacetilado, onde o cloro não está presente na amida hialurônica, mas em sua amina desacetilada. As formas utilizadas incluíam soluções ou curativos contendo as respectivas cloraminas. Quando aplicados de forma tópica, tais materiais proporcionavam um alívio significativo da dor e da coceira. Na preparação das cloraminas, são mencionados numerosos agentes, tais como HOCl, NaClO, HClO2, N- clorosuccinimida, sais de N-clorosulfonamidas, cloro molecular, cloreto de tionilo, fosgênio, PCl3 e PCl5.
[016] Em geral, pode-se afirmar que as cloramidas de ácido hialurônico com maior grau de modificação (mais de 50%) ainda não foram descritas. As cloramidas conhecidas incluem apenas aquelas com menor grau de modificação (não mais do que 35%) e, pelas razões associadas a uma estabilidade insatisfatória, nenhuma aplicação prática foi descrita até o momento. Mas, de fato, o material aqui discutido seria único no sentido de atender simultaneamente aos seguintes requisitos: - compatibilidade biológica e degradabilidade biológica (ocorrendo, por exemplo, em conexão com um processo inflamatório particular no corpo humano); - inibição do crescimento de uma grande variedade de microorganismos, fungos e vírus (analogamente às cloramidas e cloraminas);
- efeitos favoráveis sobre os processos de cicatrização (devido à presença de ácido hialurônico); - possibilidade de preparar uma ampla gama de formas (devido ao fato de que o constituinte ativo está ligado ao polímero portador por uma ligação covalente).
[017] Em geral, a combinação acima mencionada é desejável em conexão com aplicações externas e internas que requerem curativos antivirais e, simultaneamente, biocompatíveis, recheios, barreiras antiadesivas, membranas, bolsas ou envoltórios.
[018] A presente invenção resolve a preparação e o uso de composições estáveis, biocompatíveis e biodegradáveis contendo cloramida hialuronana e exibindo efeitos antimicrobianos e antivirais acompanhados de efeitos cicatrizantes. Além disso, é descrita uma ampla gama de formas, cujas formas têm áreas de superfície amplamente variáveis, propriedades mecânicas ou reológicas e tempos de degradação.
Resumo da invenção
[019] O objeto da presente invenção é um derivado clorado do ácido hialurônico ou de um ácido hialurônico modificado, também chamado de cloramida hialuronana, no qual o hidrogênio do grupo amídico -NH-CO- é substituído por um átomo de cloro, de acordo com a fórmula estrutural -NCl-CO- , em que o grau de substituição é de 50 a 100%. Assim, o ácido hialurônico modificado é o ácido hialurônico no qual alguns dos grupos -OH são substituídos por um grupo -OCOR2 e/ou alguns dos grupos -CH2-OH são substituídos por um grupo -CH=O e/ou alguns dos grupos CO-OH são substituídos por um grupo -CO-OR2, no qual R2 é uma cadeia linear ou aromática contendo átomos C1-C17. De preferência, o derivado do ácido hialurônico é selecionado a partir do grupo que compreende éster etílico, éster benzílico, formil, lauroil (C12), palmitoil (C16), caproil (C6), o peso molecular do derivado de preferência variando de 5 a 500 kg.mol1 e o grau de modificação variando de 1 a 100%.
[020] Além disso, a invenção diz respeito ao método de preparação da cloramida hialuronana, onde a modificação química é realizada por meio de agentes contendo cloro ligado ao nitrogênio, de preferência por meio de ácido tricloroisocianúrico ou por meio de sais de ácido dicloroisocianúrico. O método de acordo com a invenção consiste particularmente na preparação de uma solução aquosa do ácido hialurônico inicial ou de seu derivado modificado com peso molecular entre 40 e 2200 kg.mol-1, com concentração entre 0,5 e 5% do peso, o valor do pH é ajustado na faixa de 2,5 a 7,5, de preferência 4 a 6, por exemplo, por meio de ácido acético na quantidade de 0,2 a 7 equivalentes com respeito a um dissacarídeo hialurônico, e então um agente clorador na quantidade de 0,3 a 1,5 equivalentes, de preferência 2 a 4 equivalentes, com respeito a um dissacarídeo hialurônico é adicionado, a mistura é deixada para reagir por 5 a 72 horas a uma temperatura que varia de 5 a 40°C, sendo então a cloramida resultante isolada por precipitação. O substrato inicial pode ser ácido hialurônico ou um derivado modificado quimicamente, o peso molecular de tal substrato variando entre 40 e 2200 kg.mol-1.
[021] O objeto da presente invenção também trata de composições contendo cloramida hialuronana, nas quais a maioria dos átomos de hidrogênio do grupo amídico é substituída por átomos de cloro e que, portanto, apresentam uma reatividade aumentada tanto em reações oxidativas quanto redutoras.
As composições finais também podem incluir ácido hialurônico modificado, sendo a modificação química no grupo carboxil e/ou hidroxil.
A composição de acordo com a invenção exibe atividades antimicrobianas, antifúngicas e antivirais.
A concentração de cloramida contida na composição varia de 10 a 99% em peso e a composição contém ainda um aditivo selecionado do grupo que compreende água, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, glicerol, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, alginato de sódio, oxi-celulose, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose ou ácido hialurônico modificado, no qual alguns dos grupos -OH são substituídos por um grupo OCOR2 e/ou alguns dos grupos -CH2- OH são substituídos por um grupo CH=O e/ou alguns dos grupos CO-OH são substituídos por um grupo -CO-OR2, no qual R2 é uma cadeia linear ou aromática contendo átomos C1-C17. A composição pode, por exemplo, assumir a forma de uma solução ou um gel em solução aquosa, onde o conteúdo da cloramida hialurônica na composição final, calculada em termos de matéria seca, está dentro da faixa de 10 a 100%. A composição também pode assumir a forma de um substrato sólido selecionado do grupo que compreende uma película autoportante, liofilizado, uma camada de fibras descontínuas (um tecido não tecido), uma fibra infinita, um tecido plano, tecido de malha, tecido trançado ou uma camada de nanofibras, em que o teor de cloramida hialuronana na composição final, calculado em termos de matéria seca, está dentro da faixa de 10 a 100%.
[022] O derivado clorado de acordo com a invenção, assim como a composição de acordo com a invenção é utilizável para a preparação de curativos de feridas ou para a preparação de dispositivos médicos implantáveis. Exemplos não limitantes de tais aplicações incluem produtos para prevenção de adesão após a realização de anastomoses, ou produtos para prevenção de deiscências, ou, em combinação com outras substâncias, produtos para correção cirúrgica de defeitos da parede abdominal, ou como parte da composição de envoltórios implantáveis para dispositivos médicos.
[023] A preparação das composições finais compreende ainda o fornecimento das seguintes formas contendo cloramida hialuronana: - formas sólidas, tais como filmes autoportantes, liofilizados, camadas de fibras descontínuas (não tecidos), fibras infinitas, tecidos planos, tecidos de malha, tecidos trançados ou camadas de nanofibras, todos eles opcionalmente contendo aditivos adicionais; - formas líquidas, especialmente soluções aquosas de cloramida, opcionalmente contendo mais aditivos.
[024] Exemplos não limitantes de tais aditivos são: óxido de polietileno, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, ácido hialurônico modificado na forma de ésteres, ácido hialurônico modificado na forma de aldeídos, alginato de sódio, oxi-celulose, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, ésteres de ácidos graxos, cloreto de sódio, cloreto de potássio ou cloreto de cálcio.
[025] Além disso, a invenção diz respeito ao uso de tais composições, especificamente nos campos onde as seguintes propriedades ou quaisquer combinações das seguintes propriedades são necessárias: - atividade oxidativa ou redutora ou antimicrobiana ou antifúngica ou antiviral; - compatibilidade biológica e biodegradabilidade; - possibilidade de preparar várias formas com um conveniente grau de estabilidade; - possibilidade de taxa de biodegradação controlada; - possibilidade de velocidade controlada de reações oxidativas e redutoras; - uma contribuição significativa para um processo de cura.
[026] Composições líquidas estáveis à base de cloramida hialuronana não devem conter nenhum aditivo reagindo com a cloramida hialuronana. Isto se aplica especificamente aos compostos sensíveis à oxidação (neste caso, a cloramida hialuronana está sujeita à redução e atua como oxidante), e/ou a agentes oxidantes fortes, como os que contêm radicais de oxigênio (neste caso, a cloramida hialuronana está sujeita à oxidação e atua como um agente redutor). Para composições estáveis e sólidas, a cloramida hialuronana também pode ser combinada com aditivos que reagem com ela. No entanto, somente nos casos em que a solução de cloramida hialuronana e a solução aditiva não podem entrar em contato durante o processo de preparação.
[027] Uma taxa de biodegradação controlada da composição final pode ser obtida combinando a cloramida hialuronana com aditivos que apresentem uma degradabilidade mais lenta, como o alginato de sódio, carboximetilcelulose ou ácido hialurônico modificado quimicamente, e/ou cruzando a própria cloramida hialuronana por meio, por exemplo, de cátions Ca2+ polivalentes.
[028] Uma taxa controlada de liberação de um componente oxidante pode ser obtida modificando as propriedades físicas, tais como inchaço, da composição final, especificamente pela adição de mais aditivos polares, menos polares. Um exemplo não limitante de um aditivo menos polar é representado por um derivado quimicamente modificado de ácido hialurônico, esse derivado tendo alguns grupos -OH substituídos pelo grupo -O-CO-R2 e/ou grupos -CO-OH substituídos pelo grupo -CO-OR2, em que R2 é uma cadeia linear ou aromática contendo átomos C1-C17.
[029] A composição final é utilizável em aplicações biomédicas, especificamente para a preparação de curativos de feridas, preparações contra a acne, preenchimentos antibacterianos, barreiras antiadesivas, membranas, bolsas ou envoltórios.
[030] A presente invenção diz respeito à preparação e utilização de composições estáveis, biocompatíveis e biodegradáveis contendo cloramida hialuronana, exibindo efeitos antimicrobianos e antivirais acompanhados de efeitos cicatrizantes. A estabilidade do material é descrita no Exemplo 16. Além disso, é descrita uma ampla gama de formas, cujas formas têm uma grande variabilidade de áreas de superfície, de propriedades mecânicas ou reológicas e de tempo de degradação.
[031] A implementação prática da solução técnica de acordo com a presente invenção não é complicada do ponto de vista tecnológico e não requer nenhum produto químico,
solventes ou procedimentos de isolamento menos disponíveis para ser utilizado.
[032] Figuras 1A e 1B - Atividade antimicrobiana da composição assumindo a forma de um liofilizado à base de cloramida hialuronana conforme preparado de acordo com o Exemplo 25.
[033] Os números mostram a inibição do crescimento dos microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida Albicans, Pseudomona aeruginosa, Staphylolococus epidermis sob a presença de liofilizados solúveis à base de cloramida hialuronana, conforme preparado de acordo com o Exemplo 25 (Figura 1A) em comparação com o material de controle, ou seja, com o ácido liofilizado nativo hialurônico (Figura 1B).
[034] O procedimento para determinar a atividade antimicrobiana é descrito no Exemplo 43.
[035] Figura 2 - Atividade antimicrobiana da composição assumindo a forma de um filme à base de cloramida hialuronana, conforme preparado de acordo com o Exemplo 32.
[036] Os números mostram a inibição do crescimento dos microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli e Staphylococcus aureus sob a presença de um filme insolúvel à base de cloramida hialuronana contendo um aditivo constituído por hialuronana esterificado por ácido láurico, tendo o filme sido preparado de acordo com o Exemplo 32, em comparação com o material de controle preparado de acordo com o Exemplo 31.
[037] O procedimento para determinar a atividade antimicrobiana é descrito no Exemplo 43.
EXEMPLOS DAS CONFIGURAÇÕES PREFERIDAS DA INVENÇÃO DS = grau de substituição = 100 % * (a quantidade molar de unidades de polímero modificado)/(a quantidade molar total de todas as unidades de polímero)
[038] A menos que especificado de outra forma, a expressão “equivalente” (eq) aqui usada refere-se a uma unidade de repetição do respectivo polissacarídeo, tal como um dissacarídeo hialurônico.
[039] A menos que especificado de outra forma, as porcentagens são porcentagens de peso.
[040] Conforme utilizado neste documento, o peso molecular dos polímeros refere-se a um valor médio de peso determinado por meio do método SEC-MALLS.
Exemplo 1 Preparação de éster etílico de hialuronana
[041] NaOH foi adicionado a uma solução aquosa de hialuronana (1 g, 300 kg.mol-1, em 40 ml de água) até atingir o valor de pH de 9. Posteriormente, 20 ml de dimetil sulfóxido e 0,08 ml de iodeto de etila foram adicionados e a mistura resultante foi agitada à temperatura de 45ºC durante 3 dias. Em seguida, a mistura resultante foi precipitada com 140 ml de 100% de isopropanol e a matéria sólida separada por filtração foi lavada com isopropanol e seca a vácuo. O produto (897 mg) foi analisado por meio de ressonância magnética nuclear (RMN).
[042] O valor de DS do éster foi de 6% (determinado por meio de RMN, lit. Kettou S. et al., CZ PV 2009-399).
Exemplo 2 Preparação de éster benzílico de hialuronana
[043] NaOH foi adicionado a uma solução aquosa de hialuronana (1 g, 300 kg.mol-1, em 40 ml de água) até atingir o valor de pH de 9. Posteriormente, 20 ml de dimetil sulfóxido e 0,08 ml de brometo de benzila foram adicionados e a mistura resultante foi agitada à temperatura de 20ºC durante 4 dias. Em seguida, a mistura resultante foi precipitada com 140 ml de 100% de isopropanol e a matéria sólida separada por filtração foi lavada com isopropanol e seca a vácuo. O produto final (obtido na quantidade de 920 mg) foi analisado por meio de RMN.
[044] O valor de DS do éster foi de 3% (determinado por meio de RMN, lit. Kettou et al., PV 2009-399).
Exemplo 3 Preparação de lauroil de hialuronana
[045] 70 ml de tetraidrofurano, 4 equivalentes de trietilamina e 0,1 equivalentes de 4-dimetilaminopiridina foram adicionados à solução de hialuronana (5 g, 250 kg.mol- 1) em 100 ml de água destilada. Simultaneamente, o ácido láurico (4 equivalentes) foi dissolvido na mistura de 30 ml de tetraidrofurano e 7 ml de trietilamina e a solução obtida foi suplementada com 4,8 ml de cloroformato de etila por 15 minutos a 0 a 5ºC. Posteriormente, a suspensão resultante foi filtrada na solução de hialuronana e a mistura de reação foi agitada a 20ºC durante 5 horas. A solução resultante foi precipitada pela adição de 400 ml de 100% de isopropanol e lavada com 80% de isopropanol e depois com 100% de isopropanol. Em seguida, o precipitado foi seco a 40°C durante 2 dias. O grau de substituição foi determinado como 37% por meio de RMN.
Exemplo 4 Preparação de formil de hialuronana
[046] Uma solução aquosa de 1% de HA (1 g, 200 kg.mol-1) contendo NaCl 1%, KBr 1%, N-acetilamino-TEMPO (0,01 eq.) e NaHCO3 (20 eq.) foi gradualmente suplementada com uma solução aquosa de NaClO (0,5 eq.) sob atmosfera de nitrogênio. A mistura foi agitada a 10ºC durante 12 horas, sendo adicionado 0,1 g de etanol. Posteriormente, a mistura final foi agitada por mais 1 hora. A solução resultante foi diluída com água destilada até a concentração de 0,2% e dialisada contra a mistura (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3 vezes 5 litros (1x por dia) e depois contra água destilada 7 vezes 5 litros (2x por dia). A solução final foi evaporada e analisada. DS 9% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 5 Preparação de cloramida hialuronana
[047] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 82% (determinado pela RMN).
Exemplo 6 Preparação de cloramida hialuronana
[048] 5 g de hialuronana (Mw 40 kg.mol-1) foram dissolvidos em 100 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 83% (determinado a partir do RMN).
Exemplo 7 Preparação de cloramida hialuronana
[049] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 1000 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 72% (determinado a partir do RMN).
Exemplo 8 Preparação de cloramida hialuronana
[050] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, foi adicionado 0,14 ml de ácido acético (0,2 eq.) e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 53% (determinado a partir do RMN).
Exemplo 9 Preparação de cloramida hialuronana
[051] 5 g de hialuronana (Mw 180 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 3 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 83% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 10 Preparação de cloramida hialuronana
[052] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 5 ml de ácido acético (7 eq.) foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 95% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 11 Preparação de cloramida hialuronana
[053] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 1,07 g (0,33 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 51% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 12 Preparação de cloramida hialuronana
[054] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 4,8 g (1,5 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 96% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 13 Preparação de cloramida hialuronana
[055] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado ácido tricloroisocianúrico na quantidade de 2,91 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 97% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 14 Preparação de cloramida hialuronana
[056] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado ácido tricloroisocianúrico na quantidade de 0,87 g (0,3 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 71% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 15 Preparação de cloramida hialuronana
[057] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC durante 5 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 52% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 16 Preparação de cloramida hialuronana
[058] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20°C durante 15 minutos. Em seguida, um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.) foi adicionado. Em seguida, a mistura foi agitada a uma temperatura de 20°C por 48 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 85% (determinado a partir de RMN). A solução de RMN (7 mg do produto em 0,7 ml de D2O) foi medida após mais 5 dias de repouso a 20°C. O valor de DS foi determinado como 84%. A porção sólida na forma de pó foi deixada a 20°C por 100 dias e depois disso a amostra foi dissolvida em D2O. O valor de DS foi determinado como 84%.
Exemplo 17 Preparação de cloramida hialuronana
[059] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada a uma temperatura de 5ºC por 72 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol e secada a vácuo por 20 horas. DS 64% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 18 Preparação de cloramida hialuronana
[060] 5 g de hialuronana (Mw 2200 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 3,2 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada a uma temperatura de 40ºC durante 5 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol e secada a vácuo por 20 horas. DS 75% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 19 Preparação de cloramida hialuronana
[061] 5 g de hialuronana (Mw 300 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 2,56 g (0,8 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol e secada a vácuo por 20 horas. DS 79% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 20 Preparação de cloramida hialuronana
[062] 5 g de hialuronana (Mw 300 kg.mol-1) foram dissolvidos em 350 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 5 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 2,56 g (0,8 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 17ºC durante 22 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol e secada a vácuo por 20 horas. DS 66% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 21 Preparação de cloramida hialuronana
[063] 5 g de hialuronana (Mw 300 kg.mol-1) foram dissolvidos em 250 ml de água destilada. Posteriormente, 2 ml de ácido acético foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura de 5ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 2,56 g (0,8 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 5ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 2,5 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 50% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 22 Preparação de cloramida de éster etílico de hialuronana
[064] 0,5 g de éster etílico de hialuronana preparado de acordo com o Exemplo 1 foi dissolvido em 25 ml de água destilada. Em seguida, foi adicionado 0,2 ml de ácido acético e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 0,32 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 250 ml de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 0,2 litros de isopropanol e seca a vácuo por 20 horas. DS 80% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 23 Preparação de cloramida de éster benzílico de hialuronana
[065] 0,5 g de éster benzílico de hialuronana preparado de acordo com o Exemplo 2 foi dissolvido em 25 ml de água destilada. Em seguida, foi adicionado 0,2 ml de ácido acético e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 0,32 g (1 eq.).
Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 0,25 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 0,2 litros de isopropanol, após o que foi seca a vácuo por 20 horas. DS 78% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 24 Preparação de formil de hialuronana
[066] 0,5 g de formil de hialuronana preparado de acordo com o Exemplo 4 foi dissolvido em 25 ml de água destilada. Em seguida, foi adicionado 0,2 ml de ácido acético e a solução foi agitada à temperatura de 20ºC durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico na quantidade de 0,32 g (1 eq.). Em seguida, a mistura foi agitada à temperatura de 20ºC por 24 horas. Em seguida, a mistura foi precipitada com 0,25 litros de isopropanol e filtrada. A porção sólida foi lavada com 0,2 litros de isopropanol e seca a vácuo por 20 horas. DS 75% (determinado a partir de RMN).
Exemplo 25 Preparação de cloramida liofilizada de hialuronana
[067] Uma solução de 0,2 g de cloramida de hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5 em 10 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor de DS foi determinado como 70% por meio de RMN.
Exemplo 26 Preparação de cloramida liofilizada de um éster etílico de hialuronana
[068] Uma solução de 0,2 g de cloramida de éster etílico de hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 22 em 10 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor de DS foi determinado como 68% por meio de RMN.
Exemplo 27 Preparação de cloramida liofilizada de um éster benzílico de hialuronana
[069] Uma solução de 0,2 g de cloramida de éster benzílico de hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 23 em 10 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor de DS foi determinado como 67% por meio de RMN.
Exemplo 28 Preparação de um tecido não tecido a partir de fibras descontínuas de cloramida hialuronana
[070] Para a preparação de uma solução de 2% de cloramida hialuronana (Exemplo 14) foi utilizada, tendo o grau de substituição de 71% de acordo com RMN. O constituinte acima foi pesado e complementado com a quantidade necessária de água destilada. Toda a mistura foi agitada em um misturador à temperatura ambiente, sendo a velocidade definida de 500 rpm e o tempo de agitação de 24 horas. A solução final foi clara e ligeiramente viscosa. O método de preparo das fibras descontínuas é baseado na precipitação de uma solução de polímero em um fluxo de um banho de coagulação móvel contendo 100% de isopropanol.
Posteriormente, a solução foi dosada à temperatura ambiente por meio de bicos de extrusão em um fluxo de um banho de coagulação alimentado através de tubos de fiação (1 tubo/8 mm de diâmetro), sendo a vazão controlada do banho de 1,15 m/s.
A formação de fibras descontínuas foi obtida por meio de precipitação.
As fibras formadas foram enroladas no fluxo do banho, capturadas por pentes de separação e transferidas para o banho de maturação contendo 100% de isopropanol.
Imediatamente após entrar no banho de maturação, as fibras brutas foram moídas por lâminas rotativas de um misturador, sendo a relação entre a quantidade das fibras e a do banho de 0,5 g/350 ml.
A dispersão fibrosa final foi filtrada por meio de um substrato poroso por uma estrutura filtrante.
Para o experimento em questão, foi utilizada uma estrutura filtrante com área de superfície de 64 cm2. Após terem sido filtradas, as fibras foram transferidas para um dispositivo de secagem por meio de um tecido de malha PAD, com a fixação do tecido não- tecido.
Antes de serem colocadas no dispositivo de secagem, as fibras eram liberadas dos resíduos precipitantes por meio de um rolo.
O tecido não-tecido foi seco à temperatura de 40°C durante 30 minutos.
A camada resultante foi separada do substrato como uma camada autoportante e pesada por balança analítica.
O peso areal do tecido era de 50,2 g/m2. O grau de substituição do tecido não tecido formado foi determinado como 64% por meio de RMN.
Exemplo 29 Preparação de camada nanofibrosa a partir de cloramida hialuronana
[071] Para a preparação de uma camada nanofibrosa contendo ácido hialurônico, foi preparada uma solução aquosa com a seguinte composição. A concentração da cloramida hialuronana, que foi preparada de acordo com o Exemplo 5, na matéria seca era de 37,5%, a concentração de hialuronana nativa com o peso molecular de 80 kg.mol-1 era de 37,5%, e a quantidade de óxido de polietileno com peso molecular de 600 kg.mol-1 era de 25%. A concentração total da matéria seca foi de 5%. A solução foi introduzida em uma seringa e fiada em um campo eletrostático em um coletor tipo placa usando um bocal linear sem agulha, sendo a tensão e o espaçamento entre o emissor e o coletor de 50 kV e 16 cm, respectivamente. A dimensão das fibras era de 110 ± 27 nm. O valor de DS foi determinado como 30 % por meio de RMN.
Exemplo 30 Preparação de película autoportante a partir de cloramida hialuronana
[072] A preparação da película ocorreu em um dispositivo especial de secagem onde a película foi seca em uma câmara fechada. O aparelho era equipado com as placas inferior e superior com temperaturas controláveis. A descrição detalhada do aparelho é fornecida na publicação Foglarova et al., PV2015-166; Foglarova M. et al., Carbohydrate Polymers 2016, 144, 68-75. A quantidade pesada de 200 mg da cloramida hialuronana descrita no Exemplo 5 foi dissolvida em 20 ml de água desmineralizada, sendo que a solução resultante foi agitada por 2 horas. Em seguida, a solução final foi dosada no dispositivo de secagem em uma almofada (vidro hidrofobizado) e seca em uma câmara fechada por 18 horas. As placas inferior e superior do secador tinham as temperaturas de 50°C e 20°C, respectivamente. Depois de seca, a película foi liberada da almofada e mantida para uso futuro. O valor do DS foi determinado como 60 % por RMN.
Exemplo 31 Preparação de película autoportante a partir de lauroil hialuronana e hialuronana nativa (4/1)
[073] A preparação da película ocorreu no dispositivo descrito no Exemplo 30. A quantidade pesada de 160 mg do derivado de lauroil hialuronato de sódio (conforme descrito no Exemplo 3) foi dissolvida em 16 ml de uma solução aquosa de 2-propanol (50% p/p), sendo que a solução resultante foi agitada por 18 horas. A quantidade pesada de 40 mg de hialuronana nativo com o peso molecular de 330 kg.mol-1 foi dissolvida em 4 ml de água desmineralizada, sendo que a solução resultante foi agitada por 18 horas. Posteriormente, ambas as soluções foram misturadas e agitadas por 30 minutos. Em seguida, a solução misturada resultante foi dosada no dispositivo de secagem em uma almofada (vidro hidrofobizado) e seca em uma câmara fechada por 7 horas. As placas inferior e superior do secador tinham as temperaturas de 50°C e 20°C, respectivamente. Depois de seca, a película foi liberada da almofada e mantida para uso futuro.
Exemplo 32 Preparação de película autoportante a partir de lauroil hialuronana e cloramida hialuronana (3/1)
[074] A preparação da película ocorreu no dispositivo descrito no Exemplo 30. A quantidade pesada de 150 mg do derivado de lauroil hialuronato de sódio (conforme descrito no Exemplo 3) foi dissolvida em 15 ml de uma solução aquosa de 2-propanol (50% p/p), sendo que a solução resultante foi agitada por 18 horas. A quantidade pesada de 50 mg de cloramida hialuronana descrita no Exemplo 5 foi dissolvida em 5 ml de água desmineralizada, sendo que a solução resultante foi agitada por 2 horas. Posteriormente, ambas as soluções foram misturadas e agitadas por 30 minutos. Em seguida, a solução misturada resultante foi dosada no dispositivo de secagem em uma almofada (vidro hidrofobizado) e seca em uma câmara fechada por 7 horas. As placas inferior e superior do secador tinham as temperaturas de 50°C e 20°C, respectivamente. Depois de seca, a película foi liberada da almofada e mantida para uso futuro. O valor DS de cloramida hialuronana no material final foi determinado como 25% por meio de RMN.
Exemplo 33 Preparação de película autoportante a partir de lauroil hialuronana e cloramida hialuronana (4/1)
[075] A preparação da película ocorreu no dispositivo descrito no Exemplo 30. A quantidade pesada de 160 mg do derivado de lauroil hialuronato de sódio (conforme descrito no Exemplo 3) foi dissolvida em 16 ml de uma solução aquosa de 2-propanol (50% p/p), sendo que a solução resultante foi agitada por 18 horas. A quantidade pesada de 40 mg da cloramida hialuronana descrita no Exemplo 5 foi dissolvida em 4 ml de água desmineralizada, sendo que a solução resultante foi agitada por 2 horas. Posteriormente, ambas as soluções foram misturadas e agitadas por 30 minutos. Em seguida, a solução misturada resultante foi dosada no dispositivo de secagem em uma almofada (vidro hidrofobizado) e seca em uma câmara fechada por 7 horas. As placas inferior e superior do secador tinham as temperaturas de 50°C e 20°C, respectivamente. Depois de seca, a película foi liberada da almofada e mantida para uso futuro. O valor DS da cloramida hialuronana no material final foi determinado como 20% por meio de RMN.
Exemplo 34 Preparação de tecido de malha a partir de fibras de cloramida hialuronana
[076] A matéria-prima inicial utilizada para a formação das fibras foi cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 14. Ao dissolver o polímero supracitado em água desmineralizada, foi preparada uma solução com a concentração de 4,7%. Após a dissolução, a solução foi transferida para uma seringa e desgaseificada por meio de uma centrífuga. A solução foi dosada na velocidade de 200 µl/min para o banho coagulante composto de uma mistura de ácido láctico e isopropanol, 1:4. A fibra foi enrolada à velocidade de 1,45 m/min. Em seguida, a fibra foi lavada com álcool isopropílico e seca. A fibra tinha as seguintes características: finura de 9 tex, resistência à tração de 1,0 N e alongamento de 11%. O valor de DS da cloramida foi determinado como 34% por meio de RMN. Com o objetivo de obter um tecido de malha, três fibras foram agrupadas e torcidas em um quadro de torção tipo anel, sendo a taxa de alimentação de 10 m/min e a velocidade do fuso de 3000 min-1; o valor da torção final foi de 300 m-1. Utilizando uma máquina de tricotar tecidos double-bed, foi fabricado a partir de fios um tecido de malha de trama de dupla face com ligação de malha fechada. A tira de malha final tinha a largura de 10 mm, o peso da base de 99 g.m-2 e a densidade de malha de 36 cm-2.
Exemplo 35 Preparação de um tecido de malha com fibras de lauroil hialuronana e cloramida hialuronana (4/1)
[077] A matéria-prima inicial utilizada para a formação das fibras foi a combinação compreendendo 400 mg de lauroil hialuronana preparado de acordo com o Exemplo 3 e 100 mg de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 14. A quantidade pesada de cloramida hialuronana foi dissolvida em 6 ml de água desmineralizada, sendo adicionados 5,1 ml de isopropanol e uma quantidade pesada de lauroil hialuronana (DS de acordo com RMN: 91%, MW 300-350 kDa). A solução preparada, que tinha a concentração de 4,5%, foi transferida para uma seringa e desgaseificada por meio de uma centrífuga. Posteriormente, a solução foi dosada à velocidade de 200 µl/min no banho coagulante composto de uma mistura de ácido láctico e isopropanol, 1:4. A fibra foi enrolada à velocidade de 1,32 m/min. Em seguida, a fibra foi lavada com álcool isopropílico, estabilizada com acetona e seca. A fibra tinha as seguintes características: finura de
8 tex, resistência à tração de 0,7 N e alongamento de 16%. Com o objetivo de obter um tecido de malha, três fibras foram agrupadas e torcidas em um quadro de torção do tipo anel, sendo a taxa de alimentação de 10 m/min e a velocidade do fuso de 3000min-1; o valor da torção final foi de 300 min-1. Utilizando uma máquina de tricotar tecidos double-bed, foi fabricado a partir de fios um tecido de malha de trama de dupla face com ligação de malha fechada. A tira de malha final tinha a largura de 10 mm, o peso da base de 91 g.m-2 e a densidade de malha de 36 cm-2.
Exemplo 36 Preparação de um liofilizado: oxicelulose/cloramida hialuronana
[078] Uma solução de 0,3 g de oxicelulose (Mw 50 kg.mol-1) e 0,1 g de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5 em 100 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor DS de cloramida hialuronana foi determinado como 24% por meio de RMN.
Exemplo 37 Preparação de um liofilizado: alginato/cloramida hialuronana
[079] Uma solução de 0,3 g de alginato (Mw 40 kg.mol-1) e 0,1 g de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5 em 100 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor DS de cloramida hialuronana foi determinado como 26% por meio de RMN.
Exemplo 38 Preparação de um liofilizado: carboximetilcelulose/cloramida hialuronana
[080] Uma solução de 0,3 g de carboximetilcelulose (Mw 30 kg.mol-1) e 0,03 g de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5 em 100 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor DS da cloramida hialuronana foi determinado como 3% por meio de RMN.
Exemplo 39 Preparação de um liofilizado: sulfato de condroitina/cloramida hialuronana
[081] Uma solução de 0,03 g de sulfato de condroitina (Mw 45 kg.mol-1) e 0,3 g de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5 em 100 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor DS da cloramida hialuronana foi determinado como 75% por meio de RMN.
Exemplo 40 Preparação de um liofilizado: hidroxietilcelulose/cloramida hialuronana
[082] Uma solução de 0,3 g de hidroxietilcelulose (Mw 45 kg.mol-1) e 0,1 g de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5 em 100 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor DS da cloramida hialuronana foi determinado como 25% por meio de RMN.
Exemplo 41 Preparação de um liofilizado: formil hialuronana/cloramida hialuronana
[083] Uma solução de 0,3 g de formil hialuronana (Mw 45 kg.mol-1) preparada de acordo com o Exemplo 4 e 0,1 g de cloramida hialuronana preparada de acordo com o Exemplo 5, em 100 ml de água destilada foi, imediatamente após a homogeneização, ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor de DS da cloramida hialuronana foi determinado como 25% por meio de RMN.
Exemplo 42 Preparação de um liofilizado: cloramida hialuronana reticulada com CaCl2
[084] Uma solução de cloramida hialuronana (0,1 g) preparada de acordo com o Exemplo 5 em 100 ml de água destilada foi suplementada com 0,01 g de CaCl2.2H2O e a mistura foi agitada em 20°C durante 1 hora. Após a homogeneização, a solução viscosa final foi ultracongelada à temperatura de -50ºC e liofilizada. O valor DS da cloramida hialuronana foi determinado como 64% por meio de RMN.
Exemplo 43 Teste de atividade antimicrobiana in vitro (Figuras 1 e 2):
[085] Para os microorganismos individuais submetidos a testes, foram preparadas suspensões com a concentração de aproximadamente 105 UFC/ml. A suspensão na quantidade de 100 µl foi inoculada na superfície do meio TSA em placas de Petri (uma contagem aproximada de microrganismos aplicados em cada placa foi de 104 UFC). A suspensão foi uniformemente espalhada por toda a superfície da placa por meio de um laço estéril. Após absorver a suspensão no ágar, a superfície do ágar foi coberta por amostras quadradas estéreis selecionadas para testes. As cepas de bactérias de teste estavam sendo cultivadas em 37°C por 24 horas. Os testes envolveram o exame da cloramida hialuronana liofilizada conforme preparado de acordo com o Exemplo 25 e as películas autoportantes contendo cloramida hialuronana conforme preparado de acordo com o Exemplo 32, sendo os respectivos materiais de controle constituídos por peças quadradas análogas sem conteúdo de cloramida hialuronana. Para este fim, foram preparadas peças quadradas com peso variando entre 8 e 12 mg e dimensão aproximada de 15 mm x 15 mm. Para o teste de eficácia, foi selecionado o método de placa difusora (layout 2D). Para o cultivo, foi selecionado um substrato não seletivo (TSA). As amostras em forma de quadrado foram testadas para os seguintes microorganismos: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida Albicans, Pseudomona aeruginosa, Staphylolococus epidermis. As Figuras 1 e 2 mostram claramente que as composições contendo cloramida hialuronana de acordo com a invenção proporcionam uma eficácia significativamente maior de inibição do crescimento bacteriano, em comparação com o material de controle sem conteúdo de cloramida hialuronana.
Exemplo 44 Teste da atividade antiviral com base na redução da placa bacteriana: Número de repetições - 5, substância testada preparada de acordo com o Exemplo 19, vírus sujeito a teste: CVB3 (Nancy) na concentração de 3x10E7, 5 PFU/ml, substrato celular VERO
Procedimento:
[086] Após ter sido submetido a uma diluição de 107 vezes no volume de 1,5 ml, o vírus foi adsorvido no substrato celular em placas de Petri por 30 minutos. O controle negativo continha PBS sem vírus. Posteriormente, o vírus foi removido por sucção e as células foram intercaladas pela substância testada (ou por HA e PBS contidas nos materiais de controle negativo), incubação a 37ºC e na presença de 5% de CO2, durante 5 horas. As células foram lavadas com PBS e cobertas por uma camada de um meio contendo EMEM suplementado com 5% de FBS inativado e 0,75% de agarose. A incubação em um ambiente contendo 5% de CO2 a 37ºC, durante 4 dias. Posteriormente, o meio foi removido, as células foram coradas por um corante violeta cristalino e as contagens de placas foram determinadas. Durante o teste, a atividade antiviral foi proporcional à redução do número de placas.
Incubação com Descrição do a substância PFU em PD Média DP grupo testada Exame das células com PBS 0 0 0 0 0 0 0
PBS Exame das 1% de células com cloramida de 0 0 0 0 0 0 0 HA HA em PBS 1% de Exame de cloramida de 0 0 0 0 0 0 0 toxicidade HA em PBS Exame do vírus com PBS 13 9 7 14 10 10,6 2,88
PBS Exame do 1% HA em PBS 10 6 14 12 10 10,4 2,97 vírus com HA
0,1% HA Teste 1 cloramida em 5 7 10 8 9 7,8 1,92
PBS 0,5% de Teste 2 cloramida HA 8 5 8 7 8 7,2 1,3 em PBS 1% HA de Teste 3 cloramida 4 1 2 3 3 2,6 1,14 em PBS FBS - soro fetal bovino, VERO - linha celular estabilizada derivada de um rim de Cercopithecus aethiops, EMEM - meio mínimo essencial de Eagle, 3x10E7, 5 PFU/ml - a concentração do vírus utilizada para preparar a suspensão infecciosa – 3x10E7, 5 unidades formadoras de placas por ml, onde PFU/ml é a unidade de quantidade do vírus e PFU são unidades formadoras de placas, PD - placa de Petri, DP - desvio padrão.
[087] Os resultados obtidos mostram claramente que a presença de cloramida hialuronana causa uma inibição do crescimento viral (Testes 1, 2 e 3) quando comparada com o “Exame dos vírus com HA” padrão, essa inibição se torna mais eficiente com o aumento da concentração de cloramida hialuronana.
Claims (13)
1. DERIVADO CLORADO DE ÁCIDO HIALURÔNICO OU DE UM ÁCIDO HIALURÔNICO MODIFICADO, a chamada cloramida, caracterizado pelo hidrogênio do grupo amídico -NH-CO- ser substituído por um átomo de cloro, de acordo com a fórmula estrutural -NCl-CO-, em que o grau de substituição é de 50 a 100%.
2. DERIVADO CLORADO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ácido hialurônico modificado ser ácido hialurônico no qual alguns dos grupos -OH são substituídos por um grupo -O-CO-R2 e/ou alguns dos grupos -CH2-OH são substituídos por um grupo -CH=O e/ou alguns dos grupos -CO-OH são substituídos por um grupo -CO- OR2, em que R2 é uma cadeia linear ou aromática contendo átomos C1-C17.
3. DERIVADO CLORADO de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo ácido hialurônico modificado ser selecionado a partir do grupo que compreende éster etílico, éster benzílico, formil, lauroil (C12), palmitoil (C16), caproil (C6).
4. DERIVADO CLORADO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que seu peso molecular é de 5 a 500 kg.mol-1.
5. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA CLORAMIDA DE ÁCIDO HIALURÔNICO OU DE UM ÁCIDO HIALURÔNICO MODIFICADO, definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é preparada uma solução aquosa do ácido hialurônico inicial ou de seu derivado modificado com peso molecular entre 40 a 2200 kg.mol-1, sendo a sua concentração entre 0,5 a 5% p/p, o pH é ajustado na faixa de 2,5 a 7,5 e então é adicionado um agente clorador na quantidade de 0,3 a 1,5 equivalente em relação a um dissacarídeo de hialuronana, a mistura é deixada para reagir por 5 a 72 horas a 5 a 40°C, sendo então a cloramida resultante isolada pela precipitação.
6. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo pH ser ajustado à faixa de 4 a 6.
7. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo pH ser ajustado pela adição de ácido acético na quantidade de 0,2 a 7 equivalentes em relação ao dissacarídeo de hialuronana.
8. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo agente clorador ser o ácido tricloroisocianúrico ou um sal de sódio de ácido dicloroisocianúrico.
9. COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA, ANTIFÚNGICA E ANTIVIRAL, caracterizada por compreender o derivado definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 na concentração de 10 a 99% p/p e um aditivo selecionado a partir do grupo que compreende água, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, glicerol, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, alginato de sódio, oxi-celulose, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose ou um ácido hialurônico modificado, em que alguns dos grupos -OH são substituídos por um grupo -O- CO-R2 e/ou alguns dos grupos -CH2-OH são substituídos por um grupo CH=O e/ou alguns dos grupos -CO-OH são substituídos por um grupo -CO-OR2, em que R2 é uma cadeia linear ou aromática contendo átomos C1-C17.
10. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por se apresentar na forma de solução ou gel em solução aquosa, em que o conteúdo da cloramida na composição final, calculada em termos de matéria seca, está dentro da faixa de 10 a 100%.
11. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por se apresentar na forma de um substrato sólido selecionado a partir do grupo que compreende uma película autoportante, liofilizado, uma camada de fibras descontínuas (um tecido não tecido), uma fibra infinita, um tecido, malha, tecido trançado ou uma camada de nanofibras, em que o conteúdo da cloramida na composição final, calculado em termos de matéria seca, está na faixa de 10 a 100%.
12. USO DO DERIVADO CLORADO definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por ser na preparação de coberturas de feridas ou na preparação de dispositivos médicos implantáveis.
13. USO DA COMPOSIÇÃO definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11 caracterizado por ser na preparação de coberturas de feridas ou na preparação de dispositivos médicos implantáveis.
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