JP5385368B2 - 多糖類誘導体のハイドロゲル - Google Patents

Description

本発明は、多糖類誘導体からなる注入可能な神経機能障害修復剤に関する。

事故あるいは肉体の酷使などにより神経は損傷および／または変性を受け、その機能は低下する。特に、末梢神経に関する神経機能障害を伴う疾患としては、神経損傷、手根管症候群、肘部管症候群などが挙げられる。このように機能が低下した神経が再びその機能を回復するには長い期間を要し、患者の負担は大きい。
現在、手根管症候群や肘部管症候群などの絞扼性神経障害に対して神経剥離術などの減圧術が施行され、有効であると報告されているが、術後の神経周囲組織の瘢痕形成や神経線維束内の線維化などの問題が危惧されている。例えば、手根管開放術においては３％の失敗率があるが、これは術後の神経内外の癒着や線維化が症状再発の主な原因とされており、術後の癒着が少なければ神経機能障害修復の効果はより高まると考えられる。
一方、このような問題に対して生体吸収性の癒着防止材が提唱され、アドコン（グリアテック社）として米国において承認され、臨床的に使用されていた。しかし、この癒着防止材は、手術部位の治癒遅延による副作用が懸念されていた。すなわち、術後の癒着を防止できても、治癒遅延などにより減圧術後の神経機能障害の修復を妨げてしまう虞がある。
これまで、低下した神経機能を回復させるため、生体適合性材料である多糖類を使用した種々の提案がなされている。例えば、脂質を結合させたグリコサミノグリカンまたはその塩を有効成分とする神経疾患治療材が開示されている（特開平９−３０９７９号公報）。しかし、この神経疾患治療材は任意の剤形に製剤化することが可能ではあるが、体内での滞留性に関わる適度な粘度を持つゲルについては記載されておらず、また、術後の癒着については記載も示唆もされていない。
また、カルボキシル基を有する多糖類および／またはその塩をアミン系化合物からなる架橋性試薬で共有結合架橋してなる架橋性多糖類からなる神経再生用材料が開示されている（特開２０００−１９８７３８号公報）。しかし、残存する架橋性試薬による炎症反応など、その安全性については懸念が残る。また、化学架橋ゲルは不均一性による特性変化を起こすことがあり、その安定性には改善の余地がある。加えて、術後の癒着については記載も示唆もされていない。
さらに、ウサギ坐骨神経癒着モデルを用いて、ヒアルロン酸が手術後の末梢神経癒着を抑制するとともに、末梢神経の潜時遅延を抑制したとの報告がある（Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ ５６，ｐｐ３４２−３４７，２００３）。しかし、このヒアルロン酸は手術の開始時から塗布しなければ効果がなく、実際に使用する際には手術の妨げとなり、その取扱い性には改善の余地がある。
一方、多糖類としてセルロースを用いたゲル材について、国際公開ＷＯ２００７／０１５５７９号明細書には、水に溶解させるとゲルを形成する、カルボキシメチルセルロースをホスファチジルエタノールアミンで修飾した誘導体が開示されている。しかし、神経機能障害修復効果については記載も示唆もされていない。
末梢神経における術後の癒着防止材として、欧州において既に臨床的に使用されている自己架橋ヒアルロン酸であるＨＹＡＬＯＧＬＩＤＥ（登録商標）（フィディア社）は、手の末梢神経手術後の痛みやチネルサインの改善にも効果があることを報告している（Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ２７（１），ｐｐ２−７，２００７）。
上記したように、神経機能を回復させるために多糖類を用いた種々の提案がなされているが、リン脂質で修飾した多糖類誘導体を用いた、神経機能障害修復効果があり、適度な粘度を有し、かつ術後の癒着も少なく、取扱いやすいハイドロゲルについては何ら検討されていない。特に、神経伝達速度改善効果を示す多糖類誘導体は、従来知られていない。

本発明の目的は、損傷や変性を受けた神経の機能を回復させるための神経機能障害修復剤を提供することにある。特に、注射器を通して注入可能なハイドロゲルとすることができ、優れた体内での滞留性を有する神経機能障害修復剤を提供することにある。
本発明者らは、損傷や変性を受けた神経の機能を回復させるための神経機能障害修復剤について鋭意研究した。その結果、０．５重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が１〜１０００Ｎ／ｍ^２であり、かつ損失係数が０．０１〜２．０である特徴を有する多糖類誘導体のハイドロゲルが存在することを見出した。そして、かかるハイドロゲルが損傷を受けた神経の機能回復に有用で、術後の癒着も少ないことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、０．５重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が１〜１０００Ｎ／ｍ^２であり、かつ損失係数が０．０１〜２．０である多糖類誘導体のハイドロゲルを含む神経機能障害修復剤である。
本発明で用いられる多糖類誘導体を水に溶解させると、注射可能な一定の弾性率および粘性を有するハイドロゲルとなる。かかるハイドロゲルを医療用インジェクタブルゲルとして使用すると、神経機能障害修復剤としての効果、例えば神経伝達速度改善効果を発現する。
また、本発明の神経機能障害修復剤は適度な粘弾性および／または優れた体内での滞留性を有するため、取扱い性に優れ、内視鏡を用いた手術の際など、複雑な形状の部位にも適用できる。

図１は、術後２０日での、本発明の神経機能障害修復剤が有する神経伝達速度改善効果を示す図である。
図２は、本発明の神経機能障害修復剤が有する生理的な塩濃度下での複素弾性率増加を示す図である。
図３は、術後１週での、本発明の多糖類誘導体のハイドロゲルによる神経周膜再生を示す図である。矢印は神経周膜を示す。
図４は、術後１週での、本発明の多糖類誘導体のハイドロゲルを用いなかった場合の神経周膜再生を示す図である。矢印は神経周膜を示す。
図５は、術後６週での、本発明の多糖類誘導体のハイドロゲルによる髄鞘再生を示す図である。矢印は髄鞘を示す。
図６は、術後６週での、本発明の多糖類誘導体のハイドロゲルを用いなかった場合の髄鞘再生を示す図である。矢印は髄鞘を示す。

本発明は、０．５重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が１〜１０００Ｎ／ｍ^２であり、かつ損失係数が０．０１〜２．０である多糖類誘導体のハイドロゲルを含む神経機能障害修復剤である。
好ましい複素粘弾率範囲としては、１〜２００Ｎ／ｍ^２であり、より好ましくは１〜１００Ｎ／ｍ^２である。また、好ましい損失係数としては、０．０１〜１．５である。
本発明で用いる多糖類誘導体としては、好ましくはセルロース誘導体であり、より好ましくは、下記式で表される繰り返し単位からなるセルロース誘導体が挙げられる。
式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立に下記式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）からなる群より選ばれるものであり、
−Ｈ （ａ）
−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ （ｂ）
−ＣＨ_２−ＣＯＯＸ （ｃ）
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｄ）中、Ｒ^４およびＲ^５はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
（ｄ）の置換度が０．００１〜０．０５、より好ましくは０．００５〜０．０１５である。
上記式中、Ｒ^４およびＲ^５はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基を表す。なかでも、Ｒ^４およびＲ^５が炭素数９〜１９のアルケニル基であるものが好ましく、その中でもＲ^４ＣＯ−および／またはＲ^５ＣＯ−がオレオイル基であるもの、特にＲ^４ＣＯ−およびＲ^５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
本発明の神経機能障害修復剤としては、水１００重量部に対し、本発明で用いる多糖類誘導体を０．１〜１．５重量部含む、注入可能なハイドロゲルである神経機能障害修復剤であることが好ましい。さらに好ましくは、０．５〜１．０重量部のものである。
そのなかでも、０．５重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が１〜２００Ｎ／ｍ^２であるものが好ましい。さらに好ましくは、１〜１００Ｎ／ｍ^２のものである。また、このときの損失係数が０．０１〜１．５であるものが好ましい。
また、本発明の神経機能障害修復剤は多糖類誘導体ハイドロゲルからなり、生理的な塩濃度下において、１．０重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が１〜１０００Ｎ／ｍ^２増加することが好ましい。より好ましい粘弾性の増加範囲としては、５０〜７００Ｎ／ｍ^２増加するものであり、さらに好ましくは１００〜５００Ｎ／ｍ^２増加するものである。
ここで、生理的な塩濃度とは、細胞の生存を維持させるように調整される生理的塩類溶液の塩濃度のことをいい、具体的な塩濃度をあげると、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）、リンガー液、リン酸緩衝液などを例示することができる。
本発明は神経機能障害修復剤である。例えば、事故あるいは肉体の酷使などで損傷および／または変性した神経の機能回復などに好ましく用いられる。
本発明の神経機能障害修復剤調製のための多糖類誘導体としてセルロース誘導体を用いる場合、例えば次のようにして製造することができる。
＜セルロース誘導体の製造方法＞
上記した本発明で用いられるセルロース誘導体は、下記式で表される繰り返し単位からなり、分子量が５×１０^３〜５×１０^６のカルボキシメチルセルロースと、
下記式で表されるホスファチジルエタノールアミンとを、
カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基（すなわち（ｂ）＋（ｃ）の置換基の合計）１００当量に対し、ホスファチジルエタノールアミン０．１〜１００当量の割合にて、水および水と相溶する有機溶媒とからなり、水が２０〜７０容量％含まれる混合溶媒に溶解し、縮合剤の存在下で反応させる工程を含む方法により製造することができる。
ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立に、下記式（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から選ばれるものであり、
−Ｈ （ａ）
−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ （ｂ）
−ＣＨ_２−ＣＯＯＸ （ｃ）
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
Ｒ^４およびＲ^５はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である。
かかる原料としてのカルボキシメチルセルロースは、分子量が５×１０^３〜５×１０^６であるものが好ましく、より好ましくは５×１０^４〜５×１０^６、さらに好ましくは５×１０^４〜１×１０^６である。
かかる原料としてのカルボキシメチルセルロースは、例えばパルプを水酸化ナトリウム溶液で溶解し、モノクロロ酢酸またはそのナトリウム塩でエーテル化し、精製することにより製造することができる。
上記式（ｃ）におけるＸのアルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどが好ましく、アルカリ土類金属としては、マグネシウム、カルシウムなどが好ましい。
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計は、０．３〜２．０、好ましくは０．５〜１．８、より好ましくは０．６〜１．５である。（ｂ）と（ｃ）の割合は特に限定されないが、水に対する溶解性の点から、（ｃ）が（ｂ）よりも多く存在するほうが好ましい。
原料として好ましいカルボキシメチルセルロースの具体的な構造式は下記式で示す通りである。セルロース骨格におけるカルボキシメチル基の置換位置は、Ｃ−６位にあることが好ましい。
上記セルロース誘導体の製造方法で用いられる上記式で表されるホスファチジルエタノールアミンにおいて、Ｒ^４およびＲ^５はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である。Ｒ^４およびＲ^５としては、いずれも炭素数９〜２７のアルケニル基であることが好ましく、なかでもＲ^４ＣＯ−および／またはＲ^５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましく、特にＲ^４ＣＯ−およびＲ^５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
かかる原料としてのホスファチジルエタノールアミンは、動物組織から抽出したもの、または合成して製造したものどちらでも使用できる。具体例としてジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルホスファチジルエタノールアミン、ラウロオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。その中でも、合成する際に使用する有機溶媒への溶解性の面からジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが好ましい。ホスファチジルエタノールアミンは生体由来の安全な物質である。
本発明で用いられるセルロース誘導体においては、セルロース誘導体分子間の疎水性相互作用を高める結果、本発明で用いられるセルロース誘導体はハイドロゲルを形成するものと考えられる。
本発明で用いられるセルロース誘導体の原料たるカルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンは、カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基１００当量に対し、ホスファチジルエタノールアミンを０．１〜５０当量、好ましくは１〜４０当量、より好ましくは３〜３０当量の割合で反応させる。０．１当量よりも少ないと生成されるセルロース誘導体がハイドロゲルを形成しない。また、４０当量より多いと生理的塩濃度の状態での粘弾性上昇が観察されなくなる。
カルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンとの縮合反応は、縮合に用いる縮合剤の反応性や反応条件によっては反応効率が悪くなることがあるため、ホスファチジルエタノールアミンは、目的とする置換度の計算値よりも過剰に用いることが好ましい。
カルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンとは、水および水と相溶する有機溶媒（Ａ）とからなり、水が２０〜７０容量％である混合溶媒に溶解させる。水の含有量が２０容量％よりも少ないとカルボキシルメチルセルロースが溶解しにくくなり、また７０容量％よりも多いとホスファチジルエタノールアミンが溶解しにくくなるため反応が進まない。水の含有量は、好ましくは３０〜６０容量％である。
水と相溶する有機溶媒（Ａ）としては、具体的にはテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、モルホリンなどの環状エーテル結合を有する有機溶媒、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド結合を有する有機溶媒、ピリジン、ピペリジン、ピペラジンなどのアミン類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類を挙げることができる。これらの中でも環状エーテル類あるいはスルホキシド類が好ましく、なかでもテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシドがより好ましい。
かかる反応に用いる試薬としては、カルボキシル活性化剤や縮合剤が好ましい。カルボキシル活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２，４，５−トリクロロフェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。縮合剤としては４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドやその塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドやＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどが挙げられる。これらの中でも、カルボキシル活性化剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、縮合剤として４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドや１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を用いるのが好ましい。
反応温度は、好ましくは０〜６０℃である。副生成物の産生を抑制するためには、反応を０〜１０℃で行うことがより好ましい。反応環境は弱酸性下が好ましい。さらに好ましくはｐＨ６〜７である。
＜セルロース誘導体の精製方法＞
本発明で用いられるセルロース誘導体の製造方法においては、得られたセルロース誘導体を、実質的にカルボキシメチルセルロースを溶解しないが水と相溶する有機溶媒（Ｂ）を用いてセルロース誘導体を精製する工程を加えてもよい。
ここで、実質的にカルボキシメチルセルロースを溶解しない有機溶媒とは、粉末状あるいは凍結乾燥状態で入手可能なカルボキシメチルセルロースナトリウム塩あるいはカルボキシメチルセルロース（ＣＯＯＨ型）に関して、水が存在しない条件下でカルボキシメチルセルロースの有機溶媒に対する溶解性を調べたとき、溶解度が３％以下の有機溶媒をいう。具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコールなどのアルコール類、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類、アセトンなどのケトン類、フェノールなどの芳香族アルコール類を挙げることができる。これらの中でも沸点１００℃未満のものが好ましく、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが好ましい。生体内で使用することを考慮するとエタノールが特に好ましい。
これらの群からなる有機溶媒（Ｂ）を用いて精製する場合、セルロース誘導体が水や有機溶媒（Ａ）の混合液中に存在する状態で有機溶媒（Ｂ）を加えて沈殿を形成し、セルロース誘導体を取り出す方法を用いてもよい。また、上記により得られた沈殿、あるいは乾燥状態にある粉末、あるいは凍結乾燥により得られたスポンジなどの成型体に、有機溶媒（Ｂ）を添加し、洗浄する方法を用いてもよい。これらの精製方法により、反応に用いた縮合剤やカルボキシル活性化剤などの触媒類、反応せずに系中に残った未反応のリン脂質などを取り除くことができる。有機溶媒（Ｂ）中に懸濁している目的物を得るには、遠心分離、ろ過などの方法が利用される。また、ソックスレー抽出も、有機溶媒（Ｂ）による洗浄を行うために利用することができる。
＜セルロース誘導体のハイドロゲル＞
本発明の神経機能障害修復剤は、上述のセルロース誘導体を含有するハイドロゲルであり、水１００重量部に対し、かかるセルロース誘導体を０．１〜１．５重量部、好ましくは０．５〜１．０重量部含むハイドロゲルである。
これらのハイドロゲルは、スパテルなどの金属へらで触ると容易に変形することが可能で、患部に塗布することが容易な状態であり、また注射器など細管を有する器具で注入することが可能である。
かかるゲルの好ましい複素弾性率としては、水中におけるポリマー濃度が０．５重量％、温度３７℃の条件で、動的粘弾性測定装置を用い、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定したときに１〜２００Ｎ／ｍ^２であるものが好ましく、１〜１００Ｎ／ｍ^２であるものがさらに好ましい。また、このときの損失係数が０．０１〜１．５であるものが好ましい。この範囲が損傷や変性を受けた神経の機能回復に最も効果があるからである。
また本発明のハイドロゲルは無色透明であり、製造の過程でごみなどの異物が混入した場合、これを検知することが可能であり、工業生産する上でのメリットを有する。
またハイドロゲル中に含まれる水以外の他の成分としては、触媒として用いた縮合剤類、縮合剤が所定の化学反応を経由することで生成するウレアなどの副産物類、カルボキシル活性化剤、未反応のホスファチジルエタノールアミン類、反応の各段階で混入する可能性のある異物、ｐＨの調整に用いたイオン類などが考えられるが、これらの成分は、上記の有機溶媒（Ｂ）を用いた精製あるいは洗浄によって取り除かれており、いずれの化合物も、生体内に入れたときに異物反応として認識されない程度の低いレベルに抑えてあることが好ましい。
また本発明の神経機能障害修復剤の保存方法は限定されないが、例えば冷暗所に保管し、使用時に室温に戻して使用することができる。また本発明の神経機能障害修復剤の滅菌方法についても特に限定されないが、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、ガンマ線滅菌、電子線滅菌など一般的に医療機器、医療材料の滅菌に使用されている方法を用いることができる。
さらに、本発明の神経機能障害修復剤を手術後に用いる場合、手術をした部位とその周辺部に、例えば０．１〜５．０ｍＬ程度を注射器で塗布し、術部全体を覆うことで損傷や変性を受けた神経の機能回復が期待できる。

（１）実施例に使用した材料は以下の通りである。
（ｉ）ＣＭＣＮａ：カルボキシメチルセルロースナトリウム（第一工業製薬（株）製、置換度０．７３、または日本製紙ケミカル（株）製、置換度０．６９）、
（ｉｉ）テトラヒドロフラン（和光純薬工業（株）製）、
（ｉｉｉ）０．１Ｍ ＨＣｌ（和光純薬工業（株）製）、
（ｉｖ）０．１Ｍ ＮａＯＨ（和光純薬工業（株）製）、
（ｖ）４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（国産化学（株）製）、
（ｖｉ）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＥ−８１８１、日本油脂（株）製）、
（ｖｉｉ）エタノール（和光純薬工業（株）製）、
（ｖｉｉｉ）注射用蒸留水（大塚製薬（株）製）、
（ｉｘ）消毒用エタノール（和光純薬工業（株）製）、
（ｘ）ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール注射液、大日本住友製薬製）、
（ｘｉ）ＮａＣｌ（和光純薬工業（株）製）。
（２）セルロース誘導体中のリン脂質含量の測定
セルロース誘導体中のリン脂質の割合は、バナドモリブデン酸吸光光度法による全リン含量の分析により求めた。
（３）ハイドロゲルの複素弾性率および損失係数の測定
ハイドロゲルの複素弾性率および損失係数は、動的粘弾性測定装置であるＲｈｅｏｍｅｔｅｒ ＲＦＩＩＩ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用し、３７℃、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定した。
複素弾性率とは、弾性体の応力とひずみの比を表す定数をいう。損失係数とは、貯蔵剪断弾性率と損失剪断弾性率の比を表す定数をいう。
［実施例１］
（セルロース誘導体）
ＣＭＣＮａ（第一工業製薬（株）製、置換度０．７３）３０００ｍｇを水６００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン６００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１４０５ｍｇ（１．８８９ｍｏｌ）（ＣＭＣＮａのカルボキシル基１００当量に対し２０当量）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド５７５ｍｇ（２．０８ｍｏｌ）を添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、テトラヒドロフランを除去し、水をある程度蒸発させたところで、エタノール中に加え、沈殿させた。ろ過によりエタノールを除き、再度、エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでセルロース誘導体を得て、そのリン脂質含量を測定した。反応前のカルボキシメチルセルロースナトリウムの置換度は０．７３であり、すべてのカルボキシメチル基はナトリウム化されていると仮定し、リン脂質含量を用いて計算により、式（ｄ）の置換度を求めた。式（ｄ）の置換度は０．７８ｍｏｌ％／糖であった。
（ハイドロゲル）
真空乾燥したセルロース誘導体からなる組成物を滅菌後、注射用蒸留水に溶解し、濃度０．５重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率および損失係数を測定した結果、それぞれ１８．３Ｎ／ｍ^２および０．６３であった。
［実施例２］
（ラット坐骨神経の機能障害作製）
日本チャールス・リバー（株）のＬｅｗｉｓラット（３肢）を使用し、Ｏｈｓｕｍｉらの方法に従って坐骨神経の機能障害を作製した［Ｈｉｄｅｈｉｋｏ Ｏｈｓｕｍｉ，Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｈｉｒａｔａ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｎａｇａｋｕｒａ，Ｍａｓａｙａ Ｔｓｕｊｉｉ，Ｔｏｓｈｉｋｏ Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｋｅｉｉｃｈｉ Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｈｏｒｉｕｃｈｉ：Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ １１６（３）：８２３−３０，２００５］。すなわち、ラットをペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与麻酔下で側臥位に固定し、臀部を剃毛した後、消毒用エタノールで消毒した。腹部から背部に向け、臀部を４〜５ｃｍ切開して坐骨神経を露出させた。坐骨神経の上周膜を１．５ｃｍ剥離し、さらに周囲の筋組織を灼焼した。その後、上周膜を剥離した坐骨神経周囲に実施例１のハイドロゲル（０．５ｍＬ）を塗布し、切開部の筋層および皮膚を縫合した。創傷部をイソジン消毒液で消毒した後、ケージに戻した。術後２０日に動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下で再度、坐骨神経を露出させ、ＮｅｕｒｏＰａｃｋ（日本光電工業（株））を用いて神経伝達速度を測定した。有意差については、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで検定した。その結果、神経伝達速度は、術後２０日でそれぞれ１８．８±３．３ｍ／ｓ（平均値±標準偏差）であった。
［比較例１］
コントロールとして、ハイドロゲルを塗布せずに、実施例２と同様の操作を行い、神経伝達速度を測定した。その結果、神経伝達速度は１１．８±３．６ｍ／ｓ（平均値±標準偏差）であった。
実施例２および比較例１の、術後２０日における神経伝達速度測定結果を図１に示す。
以上より、術後２０日の神経伝達速度は、比較例１より実施例２において、統計学的に有意に大きくなった。よって、実施例１で得られたハイドロゲルには、生体内において損傷や変性を受けた神経機能を修復する効果が高いことが確認された。
［実施例３］
（塩添加による複素弾性率増加）
ＣＭＣＮａ（日本製紙ケミカル（株）製、置換度０．６９）３５００ｍｇを水１００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン１００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４１３．７ｍｇ（０．００００７９５ｍｏｌ）（ＣＭＣＮａのカルボキシル基１００当量に対し５当量）、縮合剤として４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド１６９．４ｍｇ（０．００００８７４ｍｏｌ）を添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、エタノール中に加え、沈殿させた。以下、実施例１と同様の操作を行い、セルロース誘導体を得た。置換度は１．０ｍｏｌ％／糖であった。セルロース誘導体からなる組成物２０ｍｇを注射用蒸留水１８００ｍｇに溶解後、最終濃度が０．９％となるように９％ＮａＣｌを２００ｍｇ添加し、最終濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１３４．５±１．４Ｎ／ｍ^２（平均値±標準偏差）であった。
［比較例２］
９％のＮａＣｌの代わりに注射用蒸留水２００ｍｇを添加すること以外、実施例３と同様の操作を行い、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、８．０±０．５Ｎ／ｍ^２（平均値±標準偏差）であった。
実施例３および比較例２の複素弾性率結果を図２に示す。
以上より、比較例２より実施例３において複素弾性率が著しく増加し、複素弾性率５〜２００Ｎ／ｍ^２と低いハイドロゲルは生体内と同程度の０．９重量％となるようＮａＣｌを添加することで複素弾性率は著しく増加することが確認された。
［実施例４］
（セルロース誘導体）
ＣＭＣＮａ（第一工業製薬（株）製、置換度０．７３）３０００ｍｇを水６００ｍＬに溶解し、さらにテトラヒドロフラン６００ｍＬを加えた。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１４０５ｍｇ（１．８８９ｍｏｌ）（ＣＭＣＮａのカルボキシル基１００当量に対し２０当量）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド５７５ｍｇ（２．０８ｍｏｌ）を添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、テトラヒドロフランを除去し、水をある程度蒸発させたところで、エタノール中に加え、沈殿させた。ろ過により、エタノールを除き、再度、エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでセルロース誘導体を得て、そのリン脂質含量を測定した。反応前のカルボキシメチルセルロースナトリウムの置換度は０．７３であり、すべてのカルボキシメチル基はナトリウム化されていると仮定し、リン脂質含量を用いて計算により、式（ｄ）の置換度を求めた。式（ｄ）の置換度は０．７８ｍｏｌ％／糖であった。
（ハイドロゲル）
真空乾燥したセルロース誘導体からなる組成物を滅菌後、注射用蒸留水に溶解し、濃度０．５重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率および損失係数を測定した結果、それぞれ１８．３Ｎ／ｍ^２および０．６３であった。
［実施例５］
（ラット坐骨神経変性作製）
日本チャールス・リバー（株）のＬｅｗｉｓラット（３肢）を使用し、Ｏｈｓｕｍｉらの方法に従って坐骨神経を変性させた［Ｈｉｄｅｈｉｋｏ Ｏｈｓｕｍｉ，Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｈｉｒａｔａ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｎａｇａｋｕｒａ，Ｍａｓａｙａ Ｔｓｕｊｉｉ，Ｔｏｓｈｉｋｏ Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｋｅｉｉｃｈｉ Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｈｏｒｉｕｃｈｉ：Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ １１６（３）：８２３−３０，２００５］。すなわち、ラットをペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与麻酔下で側臥位に固定し、臀部を剃毛した後、消毒用エタノールで消毒した。腹部から背部に向け、臀部を４〜５ｃｍ切開して坐骨神経を露出させた。坐骨神経の上周膜を１．５ｃｍ剥離し、さらに周囲の筋組織を灼焼した。その後、上周膜を剥離した坐骨神経周囲に実施例４のハイドロゲル（０．５ｍＬ）を塗布し、切開部の筋層および皮膚を縫合した。創傷部をイソジン消毒液で消毒した後、ケージに戻した。術後１週に動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下で坐骨神経を採取し、マッソン・トリクローム染色を行い、坐骨神経の組織学的観察を行った。その結果、術後１週で神経周膜の再生が認められた。
［比較例３］
コントロールとして、ハイドロゲルを塗布せずに、実施例５と同様の操作を行い、坐骨神経の組織学的観察を行った。その結果、術後１週での神経周膜の再生は不十分であった。
実施例５および比較例３の、術後１週におけるマッソン・トリクローム染色の結果をそれぞれ図３および図４に示す。以上より、術後１週での組織学的観察から、比較例３より実施例５において神経周膜の良好な再生が認められた。よって、実施例４で得られたハイドロゲルには、生体内において損傷や変性を受けた神経を修復する効果が高いことが確認された。
［実施例６］
（ラット坐骨神経変性作製）
日本チャールス・リバー（株）のＬｅｗｉｓラット（３肢）を使用し、Ｏｈｓｕｍｉらの方法に従って坐骨神経を変性させた［Ｈｉｄｅｈｉｋｏ Ｏｈｓｕｍｉ，Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｈｉｒａｔａ Ｔａｋｅｓｈｉ Ｎａｇａｋｕｒａ，Ｍａｓａｙａ Ｔｓｕｊｉｉ，Ｔｏｓｈｉｋｏ Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｋｅｉｉｃｈｉ Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｈｏｒｉｕｃｈｉ：Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ １１６（３）：８２３−３０，２００５］。すなわち、ラットをペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与麻酔下で側臥位に固定し、臀部を剃毛した後、消毒用エタノールで消毒した。腹部から背部に向け、臀部を４〜５ｃｍ切開して坐骨神経を露出させた。坐骨神経の上周膜を１．５ｃｍ剥離し、さらに周囲の筋組織を灼焼した。その後、上周膜を剥離した坐骨神経周囲に実施例４のハイドロゲル（０．５ｍＬ）を塗布し、切開部の筋層および皮膚を縫合した。創傷部をイソジン消毒液で消毒した後、ケージに戻した。術後６週に動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下で坐骨神経を採取し、トルイジンブルー染色を行い、坐骨神経の組織学的観察を行った。その結果、術後６週で髄鞘の再生が認められた。
［比較例４］
コントロールとして、ハイドロゲルを塗布せずに、実施例６と同様の操作を行い、坐骨神経の組織学的観察を行った。その結果、術後６週での髄鞘の再生は不十分であった。
実施例６および比較例４の、術後６週におけるトルイジンブルー染色の結果をそれぞれ図５および図６に示す。以上より、術後６週での組織学的観察から、比較例４より実施例６において髄鞘の良好な再生が認められた。よって、実施例４で得られたハイドロゲルには、生体内において損傷や変性を受けた神経を修復する効果が高いことが確認された。

本発明の神経機能障害修復剤は、注射器を通して注入可能かつ優れた体内滞留性を有する薬剤であり、例えばヒトの外科手術時に用いられる。

Claims (9)

1. 下記式で表される繰り返し単位からなるセルロース誘導体のハイドロゲルを含む神経機能障害修復剤。
   式中、Ｒ ^１ 、Ｒ ^２ 、およびＲ ^３ はそれぞれ独立に下記式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）からなる群より選ばれるものであり、
   −Ｈ （ａ）
   −ＣＨ _２ −ＣＯＯＨ （ｂ）
   −ＣＨ _２ −ＣＯＯＸ （ｃ）
   （ｄ）
   式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
   式（ｄ）中、Ｒ ^４ およびＲ ^５ はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、
   （ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
   （ｄ）の置換度が０．００１〜０．０５である。
2. Ｒ^４およびＲ^５が炭素数９〜１９のアルケニル基である、請求項１に記載の神経機能障害修復剤。
3. Ｒ^４ＣＯ−および／またはＲ^５ＣＯ−がオレオイル基である、請求項１に記載の神経機能障害修復剤。
4. 水１００重量部に対し、セルロース誘導体を０．１〜１．５重量部含む、請求項１から３のいずれかに記載の神経機能障害修復剤。
5. 末梢神経機能障害修復剤である、請求項１から４のいずれかに記載の神経機能障害修復剤。
6. 末梢神経機能障害が絞扼性神経障害である、請求項５に記載の神経機能障害修復剤。
7. 中枢神経機能障害修復剤である、請求項１から４のいずれかに記載の神経機能障害修復剤。
8. 坐骨神経機能障害修復剤である、請求項１から４のいずれかに記載の神経機能障害修復剤。
9. 神経伝達速度改善効果を有する、請求項１から４のいずれかに記載の神経機能障害修復剤。