KR20210018682A - 티로시나아제를 억제하는 항-티로시나아제 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 티로시나아제를 억제하는 항-티로시나아제 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-티로시나아제 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-티로시나아제 항체는 티로시나아제 활성을 억제하여 피부 미백 개선 또는 피부 색소침착 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

티로시나아제를 억제하는 항-티로시나아제 항체 및 이의 용도{Anti-tyrosinase antibodies inhibiting tyrosinase and use thereof}
본 발명은 티로시나아제(tyrosinase)를 억제하는 항-티로시나아제 항체 및 이의 용도에 대한 것이다.
사람의 피부색은 여러 가지 요인들 특히, 계절, 인종, 및 성별에 따라 다르며, 주로 멜라닌(melanin), 카로틴, 및 헤모글로빈의 양에 의해서 결정되는데, 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소로 작용한다. 멜라닌은 피부기저층에 존재하는 멜라닌 세포(melanocyte)에서 합성되며 주변 각질 세포로 전이되어 사람의 피부색을 나타낸다. 멜라닌이 비정상적으로 적게 되면 백반증과 같은 피부 병변이 유발되며, 반대로 과잉으로 생산될 경우에는 기미, 잡티를 형성하는 것으로 알려져 있다. 멜라닌은 아미노산 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나아제(tyrosinase)가 작용함으로써 생성되는데 티로시나아제는 자외선에 의해 더욱 활성화되기 때문에 햇빛을 많이 받게 되면 피부가 검게 변하게 된다. 따라서 색소 침착을 예방하는 미백화장품의 개발을 위한 약제의 기본 메커니즘은 티로시나아제의 활성 억제, 티로시나아제의 생성 억제, 멜라닌을 생성을 촉진하는 중간 인자(mediator)의 억제, 생성된 멜라닌의 환원 및 광산화 억제, 멜라닌의 배설 촉진 및 자외선 차단 등이 있을 수 있다. 이 중 가장 간단하면서 효과적인 피부 미백효과를 얻을 수 있는 방법 중 하나가 티로시나아제의 활성 억제를 통한 방법이라고 할 수 있다.
상기 티로시나아제의 활성 억제를 통한 피부 미백에 대한 연구가 활발하게 진행 중이지만, 티로시나아제를 억제하는 항체에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다.
한국공개특허 제10-2019-0052100호(2019.05.15 공개)
본 발명의 목적은 티로시나아제를 억제하는 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 티로시나아제 항원 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 피부 색소침착 질환 진단용 조성물 또는 피부 색소침착 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 티로시나아제 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 피부 색소침착 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 시료로부터 항원-항체 반응을 통하여 티로시나아제 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 피부 색소침착 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 티로시나아제를 억제하는 항-티로시나아제 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-티로시나아제 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-티로시나아제 항체는 티로시나아제 활성을 억제하여 피부 미백 개선 또는 피부 색소침착 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 α-티로시나아제(α-Tyrosinase) scFv 항체 선별을 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 ELISA 분석법의 재현성 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 세포투과성 α-티로시나아제 scFv 단백질의 정제 후 SDS-PAGE를 통해 크기 및 단백질 순도 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 세포투과성 α-티로시나아제 scFv 단백질의 티로시나아제 효소 활성 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 세포투과성 α-티로시나아제 scFv 단백질의 돼지피부 투과능을 DAB 염색법으로 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
한편, 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 표 1에 기재하였다.
또한, 본 발명에 사용된 TAT 펩타이드의 아미노산 서열은 "YGRKKRRQRRR" (서열번호 7)이고, TAT 펩타이드의 염기서열은 "TAT GGC CGC AAA AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC" (서열번호 8)이다.
본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 티로시나아제에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 티로시나아제 항원 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 유효성분 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 또는 피부염에서 발생하는 과색소 침착일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 진단용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 또는 피부염에서 발생하는 과색소 침착일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 피부 색소침착 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 시료로부터 항원-항체 반응을 통하여 티로시나아제 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 피부 색소침착 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 또는 피부염에서 발생하는 과색소 침착일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 항원-항체 반응을 통하여 티로시나아제 단백질을 검출하는 방법은 항원과 항체의 결합을 측정하여 티로시나아제 단백질을 검출할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 면역형광분석법, 면역블롯, 오우크레로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법, 보체 고정 분석법, 면역크로마토그래피 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 항원-항체 반응의 면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제, 및 안정화제 등을 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 및 반응 정지제 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> α- 티로시나아제 (α- Tyrosinase ) scFv 항체 선별
1. bio-panning 시행
7.6 × 109의 다양성을 가지는 OPAL library를 이용하여 bio-panning을 수행하였다. Epoxy magnetic bead에 5 μg의 티로시나아제 항원을 고정시키고 input phage를 반응시켰다. 항원과 반응한 phage를 용출(elution)하여 output titer를 측정하였다. 매 횟수마다 input과 output titer를 측정하여 bio-panning의 정보를 획득하고 정상적으로 시행되고 있는지를 확인하였다. 매 횟수마다 input phage는 2 × 1012 cfu/ml ≥의 phage를 사용하였다. output은 1차 - 1.7 × 106, 2차 - 3.65 × 106, 3차 - 4.68 × 108 cfu/ml으로 bio-panning이 진행될수록 증폭되는 것을 알 수 있었다. 따라서 bio-panning이 정상적으로 진행되었다는 것을 확인할 수 있었다.
2. ELISA 분석
고민감도, 고특이성 항체의 선별을 위해 ELISA 분석법을 수행하였다. 획득한 phage를 대장균에 감염시켜 항생제가 첨가된 LB plate에 도말하였다. 16 시간 동안 30℃ 인큐베이터에서 배양한 후 생성된 콜로니(colony)를 랜덤하게 채집하였다. 각 콜로니(colony)를 LB 배지에 넣어 배양한 후 IPTG를 처리하여 scFv를 발현시키고 대장균을 용해(lysis)하여 수용성 분획(soluble fraction)을 취하여 ELISA를 수행하였다. 먼저, 30 ng의 티로시나아제 항원을 96 well ELISA plate에 고정시키고, 3% BSA가 함유된 PBS로 차단하였다. 1 시간 후, 위에서 얻은 세포 용해물(cell lysate)을 처리하여 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 3회 씻어준 후 차단 용액(blocking solution)에 HRP conjugated anti-HA 항체를 1:1000으로 희석하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 5회 씻어준 후 TMB substrate로 발색시켜 ELISA leader로 항원에 결합된 scFv 항체를 측정하였다. 96개의 항체를 분석하였고 OD 0.4를 양성 가이드라인(positive guideline), 0.1을 음성 가이드라인(negative guideline)으로 임의로 정하여 11종을 선별하였다(도 1).
< 실시예 2> α- 티로시나아제 scFv 항체 서열 분석
ELISA 분석을 통하여 선별된 티로시나아제 scFv 11종의 양성 클론(positive clone)에 대하여 서열분석(sequencing)을 통해 개별적 클론(clone)을 선별하였다. 앞서 선별한 양성 클론(positive clone) 중에 중복되는 클론(clone)이 존재할 가능성이 있기 때문에 서열분석이 필요하였다. 서열 분석 결과, 11종의 양성 클론(positive clone) 중에 2종이 개별적인 클론(clone)임을 확인하였다.
< 실시예 3> 선별된 α- 티로시나아제 항체 정제 및 민감도 분석
1. α- 티로시나아제 scFv 항체 정제
앞서 선별된 1종의 α-티로시나아제 scFv 항체를 정제하였다(표 1). 1종의 클론(clone)이 형질전환(transformation) 되어 있는 ER2738 E. coli cell을 500 ml의 SB media에 배양시킨 후 1X TES buffer를 이용하여 세포를 용해(lysis) 시켰다. 세포 용해물(cell lysate)을 0.5 ml Ni bead에 반응시키고 이미다졸(imidazole)을 이용하여 용출(elution) 하였다.
Target Clone Light chain CDR sequence Heavy chain CDR sequence
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
Tyrosinase D9 TGSSSNIGNNDVT NDNQ GTWDSSLSG SYDMS GISHGGSST RDIIHCNPLWCSYADGMDV
2. 정제된 α- 티로시나아제 scFv 항체의 민감도 분석
정제된 α-티로시나아제 scFv 항체를 이용하여 민감도 분석을 시행하였다. 민감도 분석은 ELISA 분석법을 이용하였다. 우선 여러 농도의 티로시나아제 항원을 ELISA plate에 고정시킨 후 10 μg/ml의 α-티로시나아제 scFv 항체를 처리하였다. 분석은 1:1000으로 희석한 HRP conjugated anti-HA 항체를 이용하여 분석하였다. EC50 - 1368 ng/ml, LOD - 12.5 ng/ml로 분석 되었다(도 2).
< 실시예 4> 세포투과성 α- 티로시나아제 scFv 제작
1. TAT-α- 티로시나아제 scFv construct 제작
앞서 선별된 scFv를 primer를 이용하여 제한효소 사이트(restriction enzyme site)와 TAT을 삽입한 PCR 산물을 생산하였다. 각 PCR 산물 30 μl에 완충액(buffer) 3.1 4 μl, EcoRI 1 μl, XhoI 1 μl, 증류수 4 μl를 처리하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 DNA를 분리하여 vector에 삽입할 insert를 확보하였다. pET28a(+) vector는 DH5α competent cell에 형질전환(transformation) 한 후 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB plate에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하고 다음 날 콜로니(colony)를 취하여 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB media에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 다음날 mini-prep kit를 이용하여 vector를 분리한 후 vector 30 μl 에 완충액(buffer) 3.1 4 μl, EcoRI 1 μl, XhoI 1 μl, CIP 1 μl, 증류수 3 μl를 처리하여 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 정제하였다. 정제된 vector와 insert의 농도를 nanodrop으로 측정하고 vector와 insert의 비율별로 T4 ligase를 이용하여 상온에서 16 시간 동안 ligation을 진행하였다. Ligation이 끝난 후 DH5α에 형질전환(transformation) 한 후 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB plate에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하고 다음 날 콜로니(colony)를 취하여 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB media에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 다음날 insert가 삽입되었는지 확인하기 위해 플라스미드(plasmid)를 분리하여 EcoRI과 XhoI으로 절단(restriction)하였다. 1% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
2. TAT-α- 티로시나아제 scFv 항체 정제
클로닝 된 TAT-α-티로시나아제 scFv 항체 클론을 BL21(DE3) 대장균 숙주에 형질전환(transformation) 하고, 형질전환체를 0.5 mM의 IPTG 유도(induction) 하였다. scFv 항체를 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, p H 7.5, 150 mM NaCl)에 현탁하고 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후, 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질의 정제는 Ni-NTA에 친화력을 갖는 레진을 사용해서 단백질 정제하였다. SDS-PAGE 분석을 통하여 발현이 잘 되는 것을 확인할 수 있었다. 단백질 크기는 약 30kDa 으로 확인하였다(도 3).
< 실시예 5> 세포투과성 항-티로시나아제 scFv의 세포독성 시험
TAT-α-티로시나아제 scFv 항체에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 생쥐 유래 악성흑생종 세포인 B16F10 세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 TAT-α-티로시나아제 scFv 항체를 농도별 (0.1, 1, 5, 10, 50, 100 ppm)로 처리한 후 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 MTT{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide} 용액을 넣고 배양하고, 그 후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣고 적당히 흔들어 준 뒤 570 nm에서 ELISA Reader system으로 흡광도를 측정하였으며, 그 값은 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, TAT-α-티로시나아제 scFv을 0.1, 1, 5, 10, 50, 100 ppm 농도로 처리했을 때, 100 ppm 농도까지 악성흑색종 세포의 세포모양 변형 및 세포생존률의 변화가 거의 없음을 확인하였다. 따라서, TAT-α-티로시나아제 scFv이 100 ppm 농도까지는 세포 독성이 없는 물질임을 알 수 있었다.
양성대조구 실시예5
Arbutin TAT-α-티로시나아제 D9
농도 (ppm) 평균 오차 평균 오차
0 100.0 3.1 100.0 9.6
0.1 97.6 5.8 101.0 3.3
1 97.0 5.6 108.9 7.0
5 83.5 3.3 104.9 10.8
10 89.3 2.3 94.2 3.8
50 82.4 8.1 98.1 5.7
100 57.7 2.1 102.2 3.0
< 실시예 6> 세포투과성 항-티로시나아제 scFv의 티로시나아제 활성 억제 효과 실험
TAT-α-티로시나아제 scFv에 대하여, 멜라닌 색소 생성에 관여하는 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 알아보았다. TAT-α-티로시나아제 scFv 5 ug에 0.1 M 인산염완충액 (pH 6.8)을 100 ul 넣고, 300 unit/ml 머쉬룸 티로시나아제를 10 ul 넣은 후, 1.5 mM L-티로신 용액 20 ul를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 490 nm에서 ELISA Reader system으로 흡광도를 측정하였으며, 그 값은 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, TAT-α-티로시나아제 scFv는 티로시나아제 활성 억제하였으며, 동일 농도의 알부틴과 유사한 효과를 나타냄을 확인하였다.
< 실시예 7> 세포투과성 항-티로시나아제 scFv의 멜라닌 생성량 억제 효과 실험
TAT-α-티로시나아제 scFv 항체의 세포 내에서 멜라닌 생성에 미치는 저해효과를 확인하기 위해, B16F10 세포주에 TAT-α-티로시나아제 scFv 항체를 처리 후 세포내 생성된 멜라닌 함량을 측정하였다. 악성흑색종 세포인 B16F10 세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, TAT-α-티로시나아제 scFv 항체 10 ppm과 양성대조구로서 아데노신(adenosine) 100 ppm을 처리한 후 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양한 후 각 well를 PBS로 세척한 다음 1 N NaOH 용액 130 ul를 첨가하고 60℃에서 1 시간 동안 용해시킨 후 준 뒤 475 nm에서 ELISA Reader system으로 흡광도를 측정하였으며, 그 값은 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타낸 바와 같이, TAT-α-티로시나아제 scFv는 멜라닌 생성을 억제하였으며, 알부틴과 유사한 효과를 나타냄을 확인하였다.
　 시료 멜라닌생합성양
(% of control)
평균 오차
음성대조구 Control 100.0 1.1
양성대조구 Arbutin 66.1 0.3
실시예7 TAT-α-티로시나아제 D9 65.8 0.2
< 실시예 8> 세포투과성 항-티로시나아제 scFv의 활성 산소 억제 효과 실험
TAT-α-티로시나아제 scFv 항체의 세포 내에서 활성산소 저해효과를 확인하기 위해, B16F10 세포주에 TAT-α-티로시나아제 scFv 항체를 처리 후 세포내 활성산소 함량을 형광염색법을 이용하여 측정하였다. 악성흑색종 세포인 B16F10 세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, TAT-α-티로시나아제 scFv 항체 100 ppm과 양성대조구로서 아데노신(adenosine) 100 ppm을 처리한 후 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양한 후 각 well에 0.2 mM 과산화수소를 첨가한 다음 2시간 동안 추가 배양하였다. carboxy-H2DCF-DA 첨가하고 37℃, 30분간 반응시켰다. PBS로 세척한 다음 PBS를 재첨가하여 475/535 nm에서 ELISA Reader system으로 형광을 측정하였으며, 그 값은 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, TAT-α-티로시나아제 scFv는 ROS 생성을 억제하였으며, 동일 농도의 알부틴보다 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
　 시료 ROS (fold of control)
non treat control 0.2 mM H2O2
평균 오차 평균 오차
음성대조구 Control 1.00 0.02 1.42 0.03
양성대조구 Arbutin 0.82 0.02 1.29 0.05
실시예8 TAT-α-티로시나아제 D9 0.83 0.04 1.16 0.03
< 실시예 9> 세포투과성 항-티로시나아제 scFv의 피부 투과 분석
TAT-α-티로시나아제 scFv의 피부 투과를 확인하기 위하여, 돼지 피부를 사용하여 조직염색으로 확인하였다. 돼지 피부에 TAT-α-티로시나아제 scFv 항체 10 ug을 처리하고 37℃, CO2 인큐베이터에서 16시간 배양하였다. 돼지 피부를 4% 포름알데하이드로 고정시킨 뒤 파라핀 블록을 제조하였으며, 마이크로톰을 이용하여 5 μm로 조직을 절제하였다. 그 후, 슬라이드 위에 조직을 마운팅한 다음 파라핀을 제거하고, 수화과정을 거친 후 조직 절편을 30분간 블락킹하였다. 블락킹이 끝난 조직에 anti-His HRP antibody를 상온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 씻어준 다음 DAB-chromogen 용액 5분간 반응후 H&E 염색기법으로 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 도 5는 α-티로시나아제 scFv과 TAT-α-티로시나아제 scFv의 피부 투과력을 비교한 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, α-티로시나아제 scFv는 돼지 피부 조직 내로 전혀 전달되지 않음에 반해, TAT-α-티로시나아제 scFv는 효율적인 피부 전달 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> HAUUL BIO <120> Anti-tyrosinase antibodies inhibiting tyrosinase and use thereof <130> ADP-2019-0170 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <400> 1 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <400> 2 Asn Asp Asn Gln 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 <400> 3 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <400> 4 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <400> 5 Gly Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Thr 1 5 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <400> 6 Arg Asp Ile Ile His Cys Asn Pro Leu Trp Cys Ser Tyr Ala Asp Gly 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 8 tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgc 33

Claims (13)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가적으로 서열번호 7로 표시되는 TAT 펩타이드가 결합된 융합 항-티로시나아제 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  6. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 티로시나아제 항원 검출용 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 색소침착 질환 진단용 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 피부 색소침착 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 접촉시키는 단계; 및
    상기 시료로부터 항원-항체 반응을 통하여 티로시나아제 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 피부 색소침착 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는 피부 색소침착 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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