KR20210013559A - 형광 표지 다당, 그 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다당 공유결합 커플링 형광 염료로 형성되고, 식 I로 나타낸 구조를 가지며,
,
다당 분자와 형광 염료 분자 사이에 안정한 공유 결합을 형성하고, 혈청 등 검측 환경에서의 안정성이 높으며, 생물 상용성이 높고, 세포 내외의 당류 분자 검측에 적합한 형광 표지 다당을 제공한다. 상술한 형광 표지 다당에 있어서 형광 염료 분자의 스토크스 이동이 큰 동시에 형광 안정성이 우수하고, 형광 양자 산율이 높으며, 이미징 결과 신호 대 잡음비가 높은 장점을 가진다. 본 발명은 상술한 형광 표지 다당의 제조 방법을 제공하는데 반응 조건이 온화하고 조작이 간단하며 반응의 선택성이 높아 산율이 높은 형광 표지 다당을 제조할 수 있다.
다당 분자와 형광 염료 분자 사이에 안정한 공유 결합을 형성하고, 혈청 등 검측 환경에서의 안정성이 높으며, 생물 상용성이 높고, 세포 내외의 당류 분자 검측에 적합한 형광 표지 다당을 제공한다. 상술한 형광 표지 다당에 있어서 형광 염료 분자의 스토크스 이동이 큰 동시에 형광 안정성이 우수하고, 형광 양자 산율이 높으며, 이미징 결과 신호 대 잡음비가 높은 장점을 가진다. 본 발명은 상술한 형광 표지 다당의 제조 방법을 제공하는데 반응 조건이 온화하고 조작이 간단하며 반응의 선택성이 높아 산율이 높은 형광 표지 다당을 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 의학 생물 검측에 관한 것이고, 구체적으로 형광 표지 다당, 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
형광 표지 기술은 형광 방출이 가능한 물질을 공유 결합 또는 물리 흡착 등 방식으로 피연구대상 분자의 하나의 원자단에 표지하여, 그 형광 특성을 이용하여 연구 대상의 정보를 반영하는 기술을 말한다. 형광 표지 시약과 피연구대상（다당, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 등）의 흡착 또는 공유 결합 후 그 형광 특성이 변화하는 것을 이용하여 관련 연구 대상 성능의 정보를 반영한다. 현대 의학, 생물학 기술의 끊임없는 발전에 따라, 신규 형광 표지 염료의 발견 및 각종 선진 형광 검측 기술 및 기기, 예를 들어 유세포 분석기(FCM), 레이저 스캔 공초점 레이저 주사 현미경(LSCM) 등의 응용은 비방사성 표지 기술로서, 형광 표지는 조작이 간편하고, 안정성이 높으며, 감도가 높고 선택성이 좋은 등 특징을 가져, 세포 내외 물질 검측, 조직 및 생체 동물 표지 이미징, 약물 분석, 병리학 모델 연구 및 질병 조기 진단 등에 광범위하게 응용되고, 생물 의학 연구 분야에서 중요한 역할을 발휘하고 있다.
다당은 복수의 단당 분자가 탈수 중합하여, 글리코시드 결합으로 연결되어 이루어진 당사슬이다. 다당은 일종의 중요한 생물 고분자이고, 생물에서 에너지 저장 및 조성 구조의 역할을 한다. 최근, 당화학과 당생물학의 끊임없는 발전에 따라 식물, 해양 생물 및 균류 등 각종 한약 유래의 다당은 이미 생물 활성의 천연 산물의 중요한 유형의 한가지로 출현되고 있다. 대량 연구를 거쳐 한약 다당은 세포 내의 각종 생명 활동을 조절하는데 참여하거나 매개하고, 항암, 항균, 면역 조절, 강혈당, 항바이러스, 항산화, 강혈지, 항응혈, 항산소결핍, 노화방지 등 생물 활성을 가지며, 유기체에 대한 독성 및 부작용이 작다. 따라서, 다당의 검측은 당류를 기초로 하는 약물 연구 및 개발에 중요한 의미를 가진다. 형광 검측법은 감도가 높고, 선택성이 우수하며, 동적 응답 범위가 넓기에, 생체 내 검측이 가능한 등 다당 검측에서 광범위하게 응용된다. 다당 자체에 발광 원자단 및 형광 원자단이 부족하기에, 다당의 형광 검측에서, 형광을 방출하는 물질을 다당의 환원성 말단에 연결하여야 하고, 형광 검측 물질을 통해 다당의 정성(定性) 및 정량 연구를 실현한다.
현재 이미 상업화된 형광 염료는 아주 많고, 스펙트럼 범위 분포가 아주 넓어, 청색에서 적색까지 모두 분포되어 있으며, 또한 시판으로 직접 얻을 수 있다. 그러나 기존의 형광 염료에 여러가지 문제가 존재하는 바 예를 들어 형광 염료의 스토크스 이동이 일반적으로 30nm를 초과하지 못하고, 형광 염료는 소광이 쉽고, 신호가 안정적이지 못하며, 서로 다른 신호 사이의 구분을 실현하기에 불리하여 당분자의 형광 검측을 제한하고 있다.
따라서, 본 발명의 기술 과제는 기존 기술에서 형광 표지 다당이 스토크스 이동이 작고 형광 신호가 불안정하며, 서로 다른 신호를 구별할 수 없는 흠결을 해결하고자 하는데 있다.
이를 위해, 본 발명은 다당 공유결합 커플링 형광 염료로 형성되고, 식 I로 나타낸 구조를 가지며,
여기서, X는 할로겐이고; R1은 수소, 알킬기, 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로시클릴기에서 선택된 일종인 형광 표지 다당을 제공한다.
바람직하게, 상술한 형광 표지 다당에 있어서, 상기 다당은 브롬화시안 활성화를 거쳐, 상기 다당의 수산기 위치에 시안기가 결합되고, 상기 시안기는 상기 형광 염료의 아미노기에 결합된다.
바람직하게, 상술한 형광 표지 다당에 있어서, 상기 X는 Br이다.
바람직하게, 상술한 형광 표지 다당에 있어서, 상기 형광 염료는 식 A~식 G로 나타낸 구조를 가진다.
바람직하게, 상술한 형광 표지 다당에 있어서, 상기 다당은 글루칸, 키토산, 펙틴 다당, 잎새 버섯 다당（grifolan）, 영지 다당（ganoderan）, 표고버섯 다당（lentinan） 및 조류 다당에서 선택된 적어도 일종이다.
본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 상술한 형광 표지 다당의 제조 방법을 제공한다.
（1） 다당을 물에 용해시킨 후, 포화 브롬화시안 용액을 추가하여 3-20분간 반응시키고 반응 종료 후 얻은 용액을 정제 처리한다.
（2） 단계（1）에서 얻은 정제된 용액을 농축하여 건조시키고, 0.1-0.3M의 붕사 용액으로 용해시키며, 식 I로 나타낸 형광 염료를 추가하여, 차광 반응 후 형광 표지 다당을 얻는다.
바람직하게, 상술한 제조 방법에 있어서, 상기 단계（1）에서, 상기 반응은 pH>10의 조건하에서 진행되거나 및/또는, 반응 시간은 5-10분간으로 제어된다.
바람직하게, 상술한 제조 방법에 있어서, 상기 단계(2)에서, 상기 붕사 용액의 농도는 약 0.2M이고, 상기 붕사 용액의 용량과 상기 다당의 용량（mL:mg）은 （0.1~1）: 1이다.
바람직하게, 상술한 제조 방법에 있어서, 상기 식 I로 나타낸 형광 염료는 다음과 같은 단계를 통해 제조된다.
（1） 중간체 I’-1의 제조
페닐히드라진을 빙초산에 추가하여 교반하고, 3-메틸 뷰탄-2-온을 천천히 적가하며, 적가 완료 후 60-65℃까지 가열하여, 3-4시간동안 반응시키고, 추출, 농축 정제를 거쳐, 중간체 I’-1을 얻되,
여기서, 페닐히드라진과 3-메틸 뷰탄-2-온의 몰비는 1: （1.0-1.2）이다.
（2） 중간체 I’-2의 제조
중간체 I’-1과 1,2-디브로모에틸렌을 메틸벤젠에 추가하고, 질소 가스 보호하에서, 가열하여 16-18시간동안 환류 반응을 진행하며, 냉각을 거쳐 고체를 석출하여, 중간체 I’-2를 얻되,
여기서, 중간체 I’-1과 1,2-디브로모에틸렌의 몰비는 1: （1.5-2.0）이다.
（3） 중간체 I’-4의 제조
건조한 N, N-디메틸포름아미드를 건조한 디클로로메탄에 추가하고, 빙조에서 염화 포스포릴의 디클로로메탄 용액을 추가하며, 교반하고, 사이클로헥사논을 추가한 후, 빙조를 철거하며, 가열하여 2-3시간동안 환류 반응을 진행하고, 반응이 종료된 후 반응액을 얼음에 부어, 정치하여 밤을 지내 고체를 석출하여, 중간체 I’-4를 얻되,
여기서, 사이클로헥사논, N, N-디메틸포름아미드 및 염화 포스포릴의 몰비는 1: （1.0-1.1）: （1.0-1.05）이다.
（4） 중간체 I’-5의 제조
중간체 I’-2 및 중간체 I’-4를 n-부탄올 및 메틸벤젠의 혼합액에 추가하고, 가열하여 2-3시간동안 환류 반응을 진행하며, 고체를 석출하고, 여과를 거쳐 중간체 I’-5를 얻는다.
（5） 화합물I의 제조
중간체 I’-5와 Br-R1-NH2가 아미노기 치환 반응을 진행하고, 반응 과정에 NaOH를 추가하여, 화합물 I를 생산하되,
합성 경로는 다음과 같다.
본 발명은 상술한 형광 표지 다당이 형광 탐침 제조에서의 용도를 제공한다.
본 발명의 기술방안은 다음과 같은 장점을 가진다.
1. 본 발명에서 제공한 형광 표지 다당에 있어서, 다당 공유결합 커플링 형광 염료로 형성되고, 상기 형광 염료는 식 I로 나타낸 구조를 가진다. 형광 표지 다당은 혈청 등 검측 환경에서의 안정성이 높은 동시에 형광 표지 다당은 생물 상용성이 높으며, 독성이 낮아, 세포 내외, 조직 및 생체 동물의 다당 검측에 광범위하게 응용될 수 있고, 다당의 흡수, 대사 배출 검측 및 약리 연구 등 분야에서 중요한 의미를 가진다.
식 I로 나타낸 형광 염료는 큰 스토크스 이동을 가지기에, 형광 염료 분자의 방출 파장과 여기 파장을 진일보 분리시켜, 형광 표지 다당이 형광 검측에 이용될 경우 형광 안정성이 우수하고, 형광 양자 산율이 높으며, 이미징 결과 신호 대 잡음비가 높은 장점을 가진다. 또한, 긴 스토크스 이동은 서로 다른 형광 염료 분자 사이의 구분도를 증가하는데 유리하고, 다중 형광 검측에 적합하기에, 서로 다른 형광 표지의 여러 종류 다당 분자의 검측을 실현하는데 유리하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 형광 표지 다당은 액상 칩 탐침으로서 생물체 내 당류 분자의 검측에 적합하고, 액상 칩의 검측 대상과 형광 표지 탐침 종류를 증가하였다.
2. 본 발명에서 제공하는 형광 표지 다당의 제조 방법은 합성에 필요한 원료가 얻기 쉽고, 반응 조건이 온화하며, 조작이 간단하고, 반응의 선택성이 높으며, 반응하여 제조된 형광 표지 다당은 높은 형광 산율, 형광 안정성 및 생물 활성을 겸비한다.
본 발명의 구체적인 실시 형태 또는 종래 기술에서의 기술 방안을 더욱 명백하기 하기 위해, 이하 구체적인 실시형태 또는 종래 기술의 서술에 필요한 첨부 도면에 대해 간단히 설명하도록 하고, 이하 서술에서 첨부 도면은 본 발명의 일부 실시형태이며, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 창조적인 노동을 들이지 않는 전제하에 이러한 첨부 도면에 기초하여 다른 도면을 더 얻을 수 있는 것은 자명한 것이다.
도 1은 실시예 1의 화합물 B의 1H 핵자기 공명 스펙트럼(ChemNMR)이다.
도 2는 본 발명의 실험예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸이 서로 다른 농도에서 HEK-293T세포의 세포 활성에 미치는 영향을 검측한 막대형 차트이다.
도 3은 본 발명의 실험예 3에서 제조한 형광 표지 키토산이 서로 다른 농도에서 HEK-293T세포의 세포 활성에 미치는 영향을 검측한 막대형 차트이다.
도 4는 본 발명의 실험예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸이 PBS 또는 혈청에서 서로 다른 부화 시간에 따른 화학 순도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 실험예 3에서 제조한 형광 표지 키토산이 PBS 또는 혈청에서 서로 다른 부화 시간에 따른 화학 순도를 보여준다.
도 6은 형광 표지 다당이 HEK-293T세포에서의 형광 강도 검측 결과이다.
도 1은 실시예 1의 화합물 B의 1H 핵자기 공명 스펙트럼(ChemNMR)이다.
도 2는 본 발명의 실험예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸이 서로 다른 농도에서 HEK-293T세포의 세포 활성에 미치는 영향을 검측한 막대형 차트이다.
도 3은 본 발명의 실험예 3에서 제조한 형광 표지 키토산이 서로 다른 농도에서 HEK-293T세포의 세포 활성에 미치는 영향을 검측한 막대형 차트이다.
도 4는 본 발명의 실험예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸이 PBS 또는 혈청에서 서로 다른 부화 시간에 따른 화학 순도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 실험예 3에서 제조한 형광 표지 키토산이 PBS 또는 혈청에서 서로 다른 부화 시간에 따른 화학 순도를 보여준다.
도 6은 형광 표지 다당이 HEK-293T세포에서의 형광 강도 검측 결과이다.
이하 첨부 도면에 결부하여 본 발명의 기술방안을 명백하고 완전하게 설명하도록 하고 이하 설명하는 실시예는 본 발명의 일부 실시예에 불과하며 전체 실시예가 아닌 것은 말할 나위도 없다. 본 발명에 따른 실시예에 기초하여 본 분야의 통상의 기술자가 창조적인 노동을 들이지 않는 전제하에 얻는 모든 기타 실시예는 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속한다. 그 외, 이하 설명하게 되는 본 발명의 기타 실시예는 서로 모순되지 않는 한 서로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 실시예에 사용되는 시약 등 기초 화학 원료는 국내 화학 제품 시장에서 시판되거나 또는 관련 중간체는 제조업체에서 주문 제작 가능하다.
자기공명 영상촬영기（Bruker DRX-500）, 고속액체크로마토그래프(Waters 2445), 감마계수기（Perkin-Elmer 1470）, 원소 분석기（Perkin-Elmer 240C）, 효소 면역 검측（미국Bio-Rad）, 고속도 원심 분리기（미국 베크만 쿨터J2-HS）. 후술하는 실시예에 있어서 모든 세포는 모두 상해 생명 과학연구원 세포소에서 구입하였다.
실시예 1
본 실시예는 후술하는 식 B로 나타낸 구조를 가지는 형광 염료를 제공한다.
식 B에 나타낸 형광 합성 경로는 다음과 같다.
（1） 중간체 I'-1의 제조
페닐히드라진을 빙초산에 추가하여 교반하고, 3-메틸 뷰탄-2-온을 천천히 적가하며, 적가 완료 후 62.5℃까지 가열하여, 3-4시간동안 반응시키고, 추출, 농축 정제를 거쳐, 중간체 I'-1을 얻되,
여기서, 페닐히드라진과 3-메틸 뷰탄-2-온의 몰비는 1: 1.1이다.
（2） 중간체 I'-2의 제조
중간체 I'-1과 1,2-디브로모에틸렌을 메틸벤젠에 추가하고, 질소 가스 보호하에서, 가열하여 17시간동안 환류 반응을 진행하며, 냉각을 거쳐 고체를 석출하여 중간체 I'-2를 얻되,
여기서, 중간체 I'-1과 1,2-디브로모에틸렌의 몰비는 1: 1.75이다.
（3） 중간체 I'-4의 제조
건조한 N, N-디메틸포름아미드를 건조한 디클로로메탄에 추가하고, 빙조에서 염화 포스포릴의 디클로로메탄 용액을 추가하며, 교반하고, 사이클로헥사논을 추가한 후, 빙조를 철거하며, 가열하여 2.5시간동안 환류 반응을 진행하고, 반응이 종료된 후 반응액을 얼음에 부어, 정치하여 밤을 지내 고체를 석출하여 중간체 I'-4를 얻되,
여기서, 사이클로헥사논, N, N-디메틸포름아미드, 염화 포스포릴의 몰비는 1: 1.05: 1.025이다.
（4） 중간체 I'-5의 제조
중간체 I'-2와 중간체 I'-4를 n-부탄올 및 메틸벤젠의 혼합액에 추가하고, 가열하여 2.5시간동안 환류 반응을 진행하며, 고체를 석출하고, 여과를 거쳐 중간체 I'-5를 얻는다.
（5）화합물 B의 제조
중간체 I'-5를 원료로 하여 통상적인 아미노기 치환 반응을 진행한다. 중간체 I'-5를 취해 Br-CH3-NH2 반응을 진행하고, NaOH를 추가하여, 필요한 화합물 B를 제조한다. 화합물 B의 핵자기 공명 스펙트럼은 도 1에 나타낸 바와 같다.
원소 분석 계산치: C35H39Br3N4
질량 스펙트럼（MS+）: 752.07（M+）
m/z: 754.07(100.0%), 756.07(97.7%), 755.07(39.3%), 757.07(38.7%), 752.07(34.2%), 758.07(32.0%), 753.08(13.1%), 759.07(12.2%), 756.08(7.1%), 758.08(7.0%), 754.08(2.4%), 760.07(2.4%).
원소 분석: C, 55.65; H, 5.20; Br, 31.73; N, 7.42.
실시예 2
본 실시예에서 일종의 형광 표지 다당을 제공하되, 여기서, 다당은 글루칸(sigma에서 구입, 물품 번호: 00268), 형광 염료의 분자 구조는 다음과 같다.
형광 표지 다당의 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1. 포화 브롬화시안 용액 및 0.2M의 NaOH 용액을 배합한다.
2. 20mg의 글루칸을 취해, 글루칸을 1ml의 증류수에 용해시켜, 충분히 교반하여 용해시키고; 4ml의 브롬화시안 용액을 추가하며, 매번 25μI의 NaOH용액을 추가하되, 끊임없이 추가하며(pH>10 확보), 7min 지속하고, 용액의 변화를 관찰하는 바 침전이 나타나면 실험이 실패한 것이기에 다시 진행한다.
3. 앞 단계에서 얻은 반응액으로 증류수를 투석하되 1-2일간 투석하고, 2-3시간마다 투석외액을 교체하여 주머니속 용액이 건조하도록 농축하며, pH=8인 0.2M의 Na2B4O7·12H2O（붕사）5~10ml를 추가하여, 농축물을 용해시킨 후, 소량의 식A에 나타낸 형광 염료（약 1.5mg）를 추가하여, 차광 반응을 진행하며 밤을 지낸다. 앞 단계에서 얻은 용액을 40°C의 수욕으로 옮겨 계속 24시간동안 차광 반응을 진행한다. 반응 정지 후, 원심 분리하여, 상청액을 취해 증류수에 대해 2일간 차광 투석을 진행하고, 원심 분리 후, 동결 건조하여 형광 표지 글루칸을 얻되, 형광 염료 표지 다당의 방법은 도시한 바와 같다.
실시예 3
본 실시예에서 일종의 형광 표지 다당을 제공하되, 여기서, 다당은 키토산(sigma에서 구입, 물품 번호: 448869), 형광 염료의 분자 구조는 다음과 같다.
형광 표지 다당의 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1. 포화 브롬화시안 용액 및 0.2M의 NaOH 용액을 배합한다.
2. 10mg의 키토산을 취해, 키토산을 1ml의 증류수에 용해시켜, 충분히 교반하여 용해시키고; 4ml의 브롬화시안 용액을 추가하며, 매번 25μI의 NaOH용액을 추가하되, 끊임없이 추가하며(ρH>10 확보), 9min 지속하고, 용액의 변화를 관찰하는 바 침전이 나타나면 실험이 실패한 것이기에 다시 진행한다.
3. 앞 단계에서 얻은 반응액으로 증류수를 투석하되 1-2일간 투석하고, 2-3시간마다 투석외액을 교체하여 주머니속 용액이 건조하도록 농축하며, pH=8인 0.2M의 Na2B4O7·12H2O（붕사）1~10ml를 추가하여, 농축물을 용해시킨 후, 소량의 식A에 나타낸 형광 염료（약 1.5mg）를 추가하여, 차광 반응을 진행하며 밤을 지낸다. 앞 단계에서 얻은 용액을 40℃의 수욕으로 옮겨 계속 24시간동안 차광 반응을 진행한다. 반응 정지 후, 원심 분리하여, 상청액을 취해 증류수에 대해 2일간 차광 투석을 진행하고, 원심 분리 후, 동결 건조하여 형광 표지 키토산을 얻는다.
실험예 1 형광 염료의 형광 성질 검측
1. 피측정 화합물 B를 정확하게 취해, 체적분수가 50%인 에탄올 용액으로 농도가 1.0×10-5 mol/L인 용액을 배합하여, 그 형광 스펙트럼을 측정하고, 화합물의 근적외 스펙트럼 중의 최대 흡수 파장(λabs)을 얻는다.
2. 측정된 근적외 스펙트럼 중의 최대 흡수 파장을 형광 스펙트럼의 여기 파장으로 하여, 형광 스펙트럼을 측정한다. 측정하고자 하는 화합물을 취해, 농도가 1.0×10-6 mol/L인 에탄올: 물（50:50, v/v）용액을 배합하여 그 방출 스펙트럼의 방출 파장(λem)을 측정하고, 표 1과 같이 스토크스 이동을 계산한다.
3. 형광 염료의 몰 흡수 계수의 측정
자외 가시 흡수 스펙트럼을 이용하여 화합물의 몰 흡수 계수를 측정한다. 계산식은 식（1）에 나타낸 바와 같다.
계산식은 식（2）에 나타낸 바와 같다.
여기서, A는 자외 흡수치이고, ε는 몰 흡수 계수이고, c는 화합물의 농도, l는 검출용 석영 탱크의 두께이다.
4. 형광 염료의 형광 양자 산율 측정
20℃에서 형광 염료의 형광 양자 산율을 측정하고, 황산퀴닌(용매는 0.1M의 H2SO4이고, 양자 산율은 0.56)를 참조물로 하여, 형광 염료와 참조 물질의 희박 용액이 동일한 여기 조건하에서 얻는 형광 적분 강도와 해당 여기 파장하에서의 자외 흡수치를 측정하는 것을 통해 형광 양자 산율을 계산한다. 산물은 무수 에탄올에 용해된다.
계산식은 식（2）에 나타낸 바와 같다.
여기서, Φ 는 피측정물의 양자 산율이고, 아래첨자 R은 참조물을 표시하며, I는 형광 적분 강도이고, A는 자외 흡수치이다. η는 용매 굴절율이다. 통상적으로 자외 흡수치(A, AR)는 모두 0.1보다 작아야 한다.
표 1. 실시예 1의 형광 염료의 스펙트럼학 성질
| λabs （mIx/nm） |
λem （mIx/nm） |
εХ104 （M-1 cm-1） |
Φ（%） | 스토크스이동 （nm） |
|
| 식 B에 나타낸 화합물 | 786 | 821 | 8.6 | 85.06 | 40 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 식 B에 나타낸 형광 염료의 형광 양자 산율은 85%보다 크고, 스토크스 이동이 크며 표지 다당 등 생물 분자가 형광 탐침을 제조하는데 적합하고, 형광 성능이 안정적이고, 형광 양자 산율이 높으며 이미징 신호 대 잡음비가 높은 핵산 분자 검측을 실현한다.
실험예 2 형광 표지 다당의 독성 검측
1. 세포 독성 실험
MTT 실험을 통해 실시예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸 및 실시예 3에서 제조한 형광 표지 키토산이 HEK-293T（인간배아신장세포）에서의 세포 독성을 측정하되 다음과 같은 단계를 포함한다.
（1） 각 홀 5Х103개 세포/100μL의 밀도로 HEK-293T세포를 96홀판에 접종하되, 배지는 DMEM이고, 37℃에서 5%의 CO2을 함유한 항온 인큐베이터에서 배양하여 밤을 지낸다.
（2） 실시예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸 및 실시예 3에서 제조한 형광 표지 키토산을 디메틸술폭시드（DMSO）로 용해하여, 농도가 0.1mol/L인 모액으로 배합하며, DMEM로 배지를 농도가 각각 80μmol/L, 40μmol/L, 20μmol/L, 10μmol/L 및 5μmol/L인 용액으로 희석하여 비축하고, 따로 DMEM배지를 취해 동일 체적의 탈이온수로 희석하되, 여기서 형광 표지 다당의 농도는 0μmol/L이다.
（3） 단계（1）중의 96홀판 중의 원 배지를 상술한 단계（2）에서 배합한 약 농도가 각각 0μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 20μmol/L, 40μmol/L 및 80μmol/L인 DMEM배지로 교체하고, 각 홀은 200μL이고, 각 약물 농도는 6개의 복수홀을 설정하며, 그 후 96 홀판을 37℃에서 5%의 CO2를 함유하는 항온 인큐베이터에서 각각 3h, 6h, 12h 및 24h 부화한다. 부화 완료 후, 각 홀에 20μL의 MTT（5 mg/mL）를 추가하여 계속 4h 배양한다. 배양 완료 후, 배지 흡수 제거하여, 각 홀에 150μL의 DMSO을 추가하고, 진동기에서 결정이 완전히 용해될 때까지 10분간 진동한다. 효소 표지로 490nm하에서 각 홀의 흡광도 수치를 측정하고, 실험 결과는 적어도 3차례 독릭적 실험의 평균치를 취한다.
서로 다른 약물 농도와 부화 시간에 따라 형광 표지 글루칸이 HEK-293T세포 생존율에 미치는 영향의 막대형 차트는 도 2에 나타낸 바와 같고, 형광 표지 키토산이 HEK-293T세포 생존율에 미치는 막대형 차트는 도 3에 나타낸 바와 같다. 약물 작용 시간의 연장과 화합물 농도의 증가에 따라 세포 생존율에 현저한 변화를 일으키지 않고, 24시간 내에 세포 생존율은 모두 90%보다 크기에 형광 표지 다당이 HEK-293T세포에 대해 안전하고 독성이 적으며 양호한 생물 상용성을 가지는 것으로 판정할 수 있다.
실험예 3 형광 표지 다당의 안정성 실험
（1） 4몫의 800μL의 PBS（pH = 7.4） 완충액 및 200μL의 실시예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸 용액을 취해 각각 혼합하고, 37℃에서 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h 가열한다. 상술한 소량의 용액을 취해 희석하고, 방사성 고효율 액상으로 표지 산물의 안정성을 검측하고, 고효율 액상 조건은 물（체적 농도가 0.1%인 TFA를 함유）을 유동상 A로 하고, CH3CN（체적 농도가 0.1%인 TFA를 함유）를 유동상 B로 하며, 다음과 같은 과정으로 기울기 용리를 진행한다: 0min→3min, 유동상A: 유동상 B의 체적비 80:20→80:20; 3min→25min, 유동상A: 유동상 B의 체적비 80:20→10: 90; 25min→30min, 유동상A: 유동상 B의 체적비 10:90→80:20, 유동상의 유동 속도: 1mL/min, 칼럼 온도를 25℃로 제어한다. 또 4몫의 800μL 쥐 혈청（그랜드 스카이에서 구입） 및 200μL의 실시예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸 용액을 취해 각각 혼합하고, 37℃에서 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h 가열한 후 100μL의 상술한 용액을 취해 100μL의 아세토니트릴을 추가하여, 고속도 원심 분리기로 10000g에서 5분간 원심 분리를 진행하고, 상층 맑은 액을 취해 고효율 액상 스펙트럼으로 표지 산물의 안정성을 검측하며, 고효율 액상 조건은 다음과 같다: 물（체적 농도가 0.1%인 TFA를 함유）을 유동상A로 하고, CH3CN（체적 농도가 0.1%인 TFA를 함유）을 유동상 B로 하며, 다음과 같은 과정으로 기울기 용리를 진행한다: 0min→3min, 유동상 A: 유동상 B의 체적비 80:20→80:20; 3min→25min, 유동상 A: 유동상 B의 체적비 80:20→10:90; 25min→30min, 유동상 A: 유동상 B의 체적비 10:90→80:20, 유동상의 유동 속도: 1mL/min, 칼럼 온도를 25℃로 제어한다. 도 4는 형광 표지 글루칸이 PBS 또는 혈청에서 서로 다른 부화 시간에 따른 액상 스팩트럼으로 검측한 화학 순도도이다.
（2） 단계（1） 중의 검측 방법을 사용하여, 형광 표지 키토산이 PBS 또는 혈청에서 서로 다른 부화 시간 후의 화학 순도를 측정하고 결과는 도 5에 나타낸 바와 같다.
도 4 및 도 5에서 알 수 있다시피, 부화 시간의 증가에 따라 형광 표지 키토산 및 형광 표지 글루칸이 PBS 및 혈청에서의 방사성 화학 순도가 다소 감소되고, 4h일 경우, PBS 및 혈청에서의 화학 순도는 여전히 95%보다 크다. 이는 형광 표지 아미노산이 체외에서 양호한 안정성을 가지고 추가적인 체내 실험 연구에 유리하다는 것을 보여준다.
실험예 4 형광 표지 다당의 형광 강도 검측도
（1） HEK-293T세포를 5% CO2, 온도가 37℃인 인큐베이터에서 로그기까지 배양한다.
（2） 1×105개/홀로 슬라이드(슬라이드를 75％ 에탄올로 5분간 담그어 소독 후 사용, 슬라이드는 Assitent사에서 구입)를 포함하는 12홀판에 접종하여 배양하여 밤을 지낸다.
（3） 세포 상청액을 흡수하여 제거하고 각각 배지로 희석한 최종 농도가 1mg/ml인 실시예 2에서 제조한 형광 표지 글루칸 및 실시예 3에서 제조한 형광 표지 키토산을 추가하여, 세포 인큐베이터에서 24시간 계속 배양한다.
（4） 배양을 종료하고 홀판 중의 슬라이드를 새로운 12홀판으로 옮겨, PBST(0.1％의 Tween-20을 함유)를 추가하여 3-4차례 표백하고, 4％의 파라포름 알데히드를 추가하여 실온에서 15분간 고정하며, PBST로 3-4차례 표백하고 최종 농도가 1μg/ml인DAPI(미국 Cell signaling사에서 구입)용액을 추가하여 37℃에서 15분간 부화하며, PBS로 3-4차례 표백하며 슬라이드를 덮고, 공초점레이저주사현미경(일본 올림푸스사에서 구입)에서 관찰한다.
도 6은 형광 표지 다당이 HEK-293T세포에서의 형광 강도 검측 결과를 보여주고, 도면에서 좌측에서 우측으로 차례로 형광 표지 글루칸이 HEK-293T세포 중의 형광 검측 결과, 형광 표지 키토산이 HEK-293T세포 중의 형광 검측 결과, 및 HEK-293T세포의 DAPI염색 결과를 보여준다. 도 6으로부터 알 수 있다시피, 형광 표지 글루칸 및 형광 표지 키토산 부화 후 세포에서, 모두 현저한 형광 감도를 검측할 수 있는데 HEK-293T세포가 상술한 형광 표지 다당을 섭취할 수 있고, 또한 다당은 형광 염료가 표지된 후 비교적 높은 형광 발광 감도를 가지는 것을 보여준다.
상술한 실시예는 명백하게 설명하기 위한 예시에 불과하며, 실시 형태에 대해 한정하고자 하는 것이 아니다. 본 분야의 통상의 기술자에게 있어서, 상술한 설명의 기초상에 다른 형태의 변화 또는 변동을 진행할 수 있으며, 여기에서 모든 실시형태에 대해 열거할 필요가 없다. 이로 인해 확대된 자명한 변화 또는 변동은 여전히 본 발명의 보호범위에 속한다.
Claims (10)
- 다당 공유결합 커플링 형광 염료로 형성되고, 식 I로 나타낸 구조를 가지며,
,
여기서, X는 할로겐이고; R1은 수소, 알킬기, 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로시클릴기에서 선택된 일종인 것을 특징으로 하는 형광 표지 다당.
- 제1항에 있어서,
상기 다당은 브롬화시안 활성화를 거쳐, 상기 다당의 수산기 위치에 시안기가 결합되고, 상기 시안기는 상기 형광 염료의 아미노기에 결합되는 것을 특징으로 하는 형광 표지 다당.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 X는 Br인 것을 특징으로 하는 형광 표지 다당.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 염료는 식 A~식 G로 나타낸 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 형광 표지 다당.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다당은 글루칸, 키토산, 펙틴 다당, 잎새 버섯 다당, 영지 다당, 표고버섯 다당 및 조류 다당에서 선택된 적어도 일종인 것을 특징으로 하는 형광 표지 다당.
- （1） 다당을 물에 용해시킨 후, 포화 브롬화시안 용액을 추가하여 반응시키고, 3-20분간 반응시켜 반응 종료 후 얻은 용액을 정제 처리하는 단계;
（2） 단계（1）에서 얻은 정제된 용액을 농축하여 건조시키고, 0.1-0.3M의 붕사 용액으로 용해시키며, 식 I로 나타낸 형광 염료를 추가하고, 차광 반응 후 형광 표지 다당을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 형광 표지 다당의 제조 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 단계（1）에서, 상기 반응은 pH>10의 조건하에서 진행되거나/또는, 반응 시간은 5-10분간으로 공제되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 단계(2)에서, 상기 붕사 용액의 농도는 약 0.2M이고, 상기 붕사 용액의 용량 및 상기 다당의 용량（mL:mg）은 （0.1~1）: 1인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식 I로 나타낸 형광 염료는
（1） 페닐히드라진을 빙초산에 추가하여 교반하고, 3-메틸 뷰탄-2-온을 천천히 적가하며, 적가 완료 후 60-65℃까지 가열하여, 3-4시간동안 반응시키고, 추출, 농축 정제를 거쳐, 중간체 I'-1를 얻되
여기서, 페닐히드라진 및 3-메틸 뷰탄-2-온의 몰비는 1: （1.0-1.2）인 중간체 I'-1의 제조 단계;
（2） 중간체 I'-1 및 1,2-디브로모에틸렌을 메틸벤젠에 추가하고, 질소 가스 보호하에서, 가열하여 16-18시간동안 환류 반응을 진행하며, 냉각을 거쳐 고체를 석출하여, 중간체 I'-2를 얻되,
여기서, 중간체 I'-1 및 1,2-디브로모에틸렌의 몰비는 1: （1.5-2.0）인 중간체 I'-2의 제조 단계;
（3） 건조한 N, N-디메틸포름아미드를 건조한 디클로로메탄에 추가하고, 빙조에서 염화 포스포릴의 디클로로메탄 용액을 추가하며, 교반하고, 사이클로헥사논을 추가한 후, 빙조를 철거하며, 가열하여 2-3시간동안 환류 반응을 진행하고, 반응이 종료된 후 반응액을 얼음에 부어, 정치하여 밤을 지내 고체를 석출하여, 중간체 I'-4를 얻되
여기서, 사이클로헥사논, N, N-디메틸포름아미드, 염화 포스포릴의 몰비는 1: （1.0-1.1）: （1.0-1.05）인 중간체 I'-4의 제조 단계;
(4) 중간체 I'-2 및 중간체 I'-4를 n-부탄올 및 메틸벤젠의 혼합액에 추가하고, 가열하여 2-3시간동안 환류 반응을 진행하며, 고체를 석출하고, 여과를 거쳐 중간체 I'-5를 얻는 중간체 I'-5의 제조 단계; 및
(5) 중간체 I'-5를 Br-R1-NH2와 아미노기 치환 반응을 진행하고, 반응 과정에 NaOH를 추가하여, 화합물I을 생산하되;
합성 경로는 다음과 같은 화합물 I의 제조 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 형광 표지 다당이 형광 탐침 제조에서의 용도.
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