CN108659142A - 一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光标记的多糖，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：多糖分子与荧光染料分子之间形成稳定的共价键结合，在血清等检测环境中的稳定性高，生物相容性高，适于细胞内外的糖类分子检测。上述荧光标记的多糖，由于荧光染料分子的斯托克斯位移大，同时具有荧光稳定性好、荧光量子产率高，以及成像结果信噪比高的优点。本发明公开了上述荧光标记的多糖的制备方法，反应条件温和，操作简单，反应的选择性高，能够制得高产率的荧光标记的多糖。

Description

一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途。
背景技术
荧光标记技术是指将能发射荧光的物质通过共价结合或物理吸附等方式标记于所研究分子的某个基团上，用它的荧光特性来反映研究对象的信息。利用荧光标记试剂与被研究对象(多糖、核酸、蛋白、多肽等)吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映出有关研究对象性能的信息。随着现代医学、生物学技术的不断发展，新型荧光标记染料的发现以及各种先进荧光检测技术和仪器，如流式细胞仪(FCM)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等的应用，作为一种非放射性的标记技术，荧光标记具有操作简便、稳定性高、灵敏度高和选择性好等特点，可广泛应用于细胞内外物质检测、组织及活体动物标记成像、药物分析、病理模型研究及疾病早期诊断等，在生物医学研究领域里发挥着重要的作用。
多糖是由多个单糖分子脱水聚合，以糖苷键连接而成的糖链。多糖是一种重要的生物高分子，在生物中有储存能量和组成结构的作用。近年来，随着糖化学和糖生物学的不断发展，植物、海洋生物及菌类等各类中药来源的多糖已作为有生物活性的天然产物的一个重要类型出现。大量研究发现中药多糖参与及介导细胞内各种生命活动的调节，具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节，降血糖、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗凝血、抗缺氧、抗衰老等生物活性，且对机体的毒副作用小。因此，多糖的检测对于糖类为基础的药物研究和开发具有重要意义。荧光检测法因其具有灵敏度高、选择性好，动态响应范围宽，能在活体内检测等优点在多糖检测中得以广泛应用。由于多糖本身缺少发光基团和荧光基团，在多糖的荧光检测中，需要将发射荧光的物质连接到多糖的还原性末端，通过检测荧光物质来实现对多糖的定性和定量研究。
目前已经商业化的荧光染料有很多，光谱范围分布很广，从蓝色到红色均有覆盖，且能从市场上直接获得。但是，现有的荧光染料也存在很多问题，例如荧光染料的斯托克斯位移一般不超过30nm，荧光染料易淬灭、信号不稳定，且不利于实现不同荧光信号之间的区分，限制了对糖分子的荧光检测。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中荧光标记的多糖存在斯托克位移小、荧光信号不稳定、无法有效区分不同的荧光信号的缺陷。
为此，本发明提供了一种荧光标记的单糖，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：
其中，X为卤素；R1选自氢、烷基、环烷基、芳基和杂环基的一种。
可选地，上述的荧光标记的多糖，所述多糖经溴化氰活化，在所述多糖的羟基位置上连接氰基，所述氰基连接所述荧光染料的氨基。
可选地，上述的荧光标记的多糖，所述X为Br。
可选地，上述的荧光标记的多糖，所述荧光染料具有式A～式G所示的结构：
可选地，上述的荧光标记的多糖，所述多糖选自葡聚糖、壳聚糖、果胶多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、香菇多糖和藻多糖中的至少一种。
本发明提供了一种制备上述荧光标记的多糖的方法，包括如下步骤：
(1)将多糖溶解于水中后，加入饱和溴化氰溶液反应，反应3-20分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化处理；
(2)将步骤(2)中得到的纯化的溶液浓缩至干，用0.1-0.3M的硼砂溶液溶解，加入式I所示的荧光染料，避光反应后得到荧光标记的多糖。
可选地，上述的制备方法，所述步骤(1)中，所述反应在pH>10的条件下进行；和/或，反应时间控制5-10分钟。
可选地，上述的制备方法，所述步骤(2)中，所述硼砂溶液的浓度为约 0.2M，所述硼砂溶液的用量与所述多糖的用量(mL:mg)为(0.1～1)：1。
可选地，上述的制备方法，所述式I所示的荧光染料通过如下步骤制备：
(1)中间体I’-1制备
将苯肼加入冰乙酸中，搅拌，缓慢滴加3-甲基-2-丁酮，滴加完毕后加热至60-65℃，反应3-4小时，萃取，浓缩，精制，得到中间体I’-1；
其中，苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：(1.0-1.2)；
(2)中间体I’-2制备
将中间体I’-1和1,2-二溴乙烯加入甲苯中，氮气保护，加热回流反应 16-18小时，冷却，析出固体，即中间体I’-2；
其中，中间体I’-1和1,2-二溴乙烯的摩尔比为1：(1.5-2.0)；
(3)中间体I’-4制备
将干燥的N，N-二甲基甲酰胺加到干燥的二氯甲烷中，冰浴下加入三氯氧磷的二氯甲烷溶液，搅拌，加入环己酮，撤去冰浴，加热回流反应2-3 小时，将反应液倒入碎冰中，静置过夜，析出固体，即中间体I’-4；
其中，环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：(1.0-1.1)： (1.0-1.05)；
(6)中间体I’-5制备
将中间体I’-2和中间体I’-4加至正丁醇和甲苯的混合液中，加热回流 2-3小时，析出固体，过滤得到中间体I’-5；
(7)化合物I制备
将中间体I’-5与Br-R1-NH2发生氨基取代反应，反应过程中加入NaOH，生产化合物I；
合成路线如下所示：
本发明提供了上述的荧光标记的多糖在制备荧光探针中的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种荧光标记的单糖，由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构。荧光标记的多糖在血清等检测环境中的稳定性高，同时荧光标记的多糖生物相容性高、毒性低，可广泛应用于细胞内外、组织及活体动物的多糖检测，在多糖吸收、代谢排泄检测及药理研究等领域具有重要意义。
由于式I所示的荧光染料具有大的斯托克斯位移，荧光染料分子的发射波长与激发波长进一步分开，使荧光标记的多糖在用于荧光检测时具有荧光稳定性好、荧光量子产率高，以及成像结果信噪比高的优点。另外，长的斯托克斯位有利于增加不同荧光染料分子之间的区分度，适于多重荧光检测，因此，有利于实现不同荧光标记的多类多糖分子的检测。另外，本发明提供的荧光标记的多糖，适于作为液相芯片探针用于生物体内外糖类分子的检测，增加了液相芯片的检测对象和荧光标记的探针种类。
2.本发明提供的荧光标记的多糖的制备方法，合成所需的原料易得，反应条件温和，操作简单，反应的选择性高，反应制备的荧光标记的多糖兼具高的荧光产率、荧光稳定性和生物活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中的化合物B的1H核磁谱图；
图2是本发明实验例2中制备的荧光标记的葡聚糖在不同浓度下对 HEK-293T细胞的细胞生存率影响检测柱状图；
图3是本发明实验例3中制备的荧光标记的壳聚糖在不同浓度下对 HEK-293T细胞的细胞生存率影响检测柱状图；
图4是本发明实验例2中制备的荧光标记的葡聚糖在PBS或血清中孵育不同时间的化学纯度图；
图5是本发明实验例3中制备的荧光标记的壳聚糖在PBS或血清中孵育不同时间的化学纯度图；
图6是荧光标记的多糖在HEK-293T细胞中的荧光强度检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明实施例所用的试剂等基础化工原料，均可在国内化工产品市场买到，或在有关中间体制备厂定做。
核磁共振仪(Bruker DRX-500)、高效液相色谱仪(Waters 2445)、γ计数仪(Perkin-Elmer 1470)、元素分析仪(Perkin-Elmer 240C)、酶联免疫检测(美国Bio-Rad)、高速离心机(美国贝克曼库尔特J2-HS)。下述实施例中所有涉及的细胞均购自上海生命科学研究院细胞所。
实施例1
本实施例提供一种荧光染料，具有下述式B所示的结构：
式B所示荧光合成路线如下所示：
(1)中间体I’-1制备
将苯肼加入冰乙酸中，搅拌，缓慢滴加3-甲基-2-丁酮，滴加完毕后加热至62.5℃，反应3-4小时，萃取，浓缩，精制，得到中间体I’-1；
其中，苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：1.1；
(2)中间体I’-2制备
将中间体I’-1和1,2-二溴乙烯加入甲苯中，氮气保护，加热回流反应 17小时，冷却，析出固体，即中间体I’-2；
其中，中间体Ⅰ-1和1,2-二溴乙烯的摩尔比为1：1.75；
(3)中间体I’-4制备
将干燥的N，N-二甲基甲酰胺加到干燥的二氯甲烷中，冰浴下加入三氯氧磷的二氯甲烷溶液，搅拌，加入环己酮，撤去冰浴，加热回流反应2.5 小时，将反应液倒入碎冰中，静置过夜，析出固体，即中间体I’-4；
其中，环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：1.05： 1.025；
(4)中间体I’-5制备
将中间体I’-2和中间体I’-4加至正丁醇和甲苯的混合液中，加热回流 2.5小时，析出固体，过滤得到中间体I’-5。
(5)化合物B制备
中间体I’-5为原料进行常规的氨基取代反应。取中间体I’-5加入 Br-CH3-NH2反应，并加入NaOH，制得所需化合物B。化合物B的核磁谱图如图1所示。
元素分析计算值:C35H39Br3N4
质谱(MS+)：752.07(M+)
m/z:754.07(100.0％),756.07(97.7％),755.07(39.3％),757.07(38.7％),752.07(34.2％),758.07(32.0％),753.08(13.1％),759.07(12.2％),756.08 (7.1％),758.08(7.0％),754.08(2.4％),760.07(2.4％)。
元素分析:C,55.65；H,5.20；Br,31.73；N,7.42。
实施例2
本实施例提供一种荧光标记的多糖，其中，多糖为葡聚糖(购于sigma，货号00268)，荧光染料的分子结构如下所示：
荧光标记的多糖的制备方法包括如下步骤：
1、配制饱和溴化氰溶液及0.2M的NaOH溶液；
2、称取20mg葡聚糖，将葡聚糖溶于1ml蒸馏水中，充分搅拌溶解；加入4ml溴化氰溶液，每次加入25μI NaOH溶液，不断地加入(保证ρΗ>10)，持续7min，并观察溶液变化，若出现沉淀，则实验失败，重做；
3、将上步中得到的反应液对蒸馏水透析，透析1-2天，每2-3h更换透析外液；将袋内溶液浓缩至干，加入pH＝8的0.2M Na2B4O7·12H2O(硼砂) 5～10ml，将浓缩物溶解后，加入少量的式A所示的荧光染料(约1.5mg)，避光反应过夜。将上步中得到的溶液转移至40℃水浴中继续避光反应24h。反应停止后，离心，取上清液对蒸馏水避光透析两天，离心后冻干，得到荧光标记的葡聚糖；荧光染料标记多糖的方法示意如下所示：
实施例3
本实施例提供一种荧光标记的多糖，其中，多糖为壳聚糖(购于sigma，货号448869)，荧光染料的分子结构如下所示：
荧光标记的多糖的制备方法包括如下步骤：
1、配制饱和溴化氰溶液及0.2M的NaOH溶液；
2、称取10mg壳聚糖，将壳聚糖溶于1ml蒸馏水中，充分搅拌溶解；加入4ml溴化氰溶液，每次加入25μI NaOH溶液，不断地加入(保证ρΗ>10)，持续9min，并观察溶液变化，若出现沉淀，则实验失败，重做；
3、将上步中得到的反应液对蒸馏水透析，透析1-2天，每2-3h更换透析外液；将袋内溶液浓缩至干，加入pH＝8的0.2M Na2B4O7·12H2O(硼砂) 1～10ml，将浓缩物溶解后，加入少量的式A所示的荧光染料(约1.5mg)，避光反应过夜。将上步中得到的溶液转移至40℃水浴中继续避光反应24h。反应停止后，离心，取上清液对蒸馏水避光透析两天，离心后冻干，得到荧光标记的壳聚糖。
实验例1荧光染料的荧光性质检测
1、准确称取待测定化合物B，用体积分数为50％的乙醇溶液配制成浓度为1.0×10-5mol/L的溶液，测定其荧光光谱，得到化合物近红外光谱中的最大吸收波长λabs。
2、利用测定的近红外光谱中的最大吸收波长，作为荧光光谱的激发波长，测定荧光光谱。称量待测化合物，配制浓度为1.0×10-6mol/L的乙醇：水(50:50，v/v)溶液，测定其发射光谱，计算斯托克位移，如表1所示。
3、测定荧光染料的摩尔消光系数
利用紫外可见吸收光谱测定化合物的摩尔消光系数。计算式如式(1) 所示：
A＝εcl 式(1)
其中，I代表吸收强度，ε为摩尔吸光系数，c是化合物的浓度，l为检测用的石英池的厚度。
4、测定荧光染料的荧光量子产率
在20℃下测定荧光染料的荧光量子产率，以硫酸奎宁(溶剂为0.1M的 H2SO4，量子产率为0.56)作为参比物，通过测量荧光染料和参比物质的稀溶液在相同激发条件下得到的荧光积分强度和该激发波长下的紫外吸收值，来计算荧光量子产率。产物溶解于无水乙醇中。
计算公式如式(2)所示：
其中，其中Φ为待测物的量子产率，下标R代表参比物。I为荧光积分强度，I为紫外吸收值。η为溶剂折射率。一般要求吸光度I、IR均小于0.1。
表1实施例1所述荧光染料的光谱学性质
如表1所示，式B所示的荧光染料的荧光量子产率＞85％，斯托克位移大，适于标记多糖等生物分子制备荧光探针，实现荧光性能稳定、荧光量子率高且成像信噪比高的核酸分子检测。
实验例2荧光标记的多糖的毒性检测
1.细胞毒性实验
通过MTT实验测定实施例2制备的荧光标记的葡聚糖和实施例3制备的荧光标记的壳聚糖在HEK-293T(人源胚胎肾细胞)中的细胞毒性，包括如下步骤：
(1)以每孔5×103个细胞/100μL的密度将HEK-293T细胞接种于96 孔板中，培养基为DMEM，在37℃下含5％的CO2的恒温培养箱中培养过夜；
(2)将实施例2制备的荧光标记的葡聚糖，以及实施例3制备的荧光标记的壳聚糖用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为0.1mol/L的母液，用DMEM培养基稀释成浓度分别为80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、 10μmol/L和5μmol/L的溶液，备用；另取DMEM培养基加入等体积的去离子水稀释，其中荧光标记多糖的浓度为0μmol/L；
(3)将步骤(1)中的96孔板中原有培养基更换为上述步骤(2)中配制的药浓度分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L 和80μmol/L的DMEM培养基，每孔200μL，每个药物浓度设置6个复孔。随后将96孔板放入37℃下含5％的CO2恒温培养箱中分别孵育3h、6h、12h 和24h。孵育结束后，向每孔中加入20μL的MTT(5mg/mL)继续培养4h。培养结束后，吸去培养基，向每孔中加入150μL的DMSO，并在摇床上震荡10min，直至结晶完全溶解。用酶标记测定490nm下每孔的吸光度值，实验结果为至少三次独立实验的平均值。
不同药物浓度与孵育时间下，荧光标记的葡聚糖对HEK-293T细胞生存率影响的柱状图如图2所示，荧光标记的壳聚糖对HEK-293T细胞生存率影响的柱状图如图3所示。随着药物作用时间延长与化合物浓度的增大，细胞生存率变化并不明显，且在24h内，细胞生存率均大于90％，所以可以判定标记前体荧光标记的多糖对HEK-293T细胞是安全低毒的，具有良好的生物兼容性。
实验例3荧光标记的多糖的稳定性实验
(1)取4份800μL的PBS(pH＝7.4)缓冲液和200μL的实施例2制备的荧光标记的葡聚糖溶液分别混合，在37℃下加热0.5h、1h、2h、3h、4h。取上述少量溶液稀释，通过放射性高效液相检测标记产物的稳定性，高效液相条件：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN (含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱： 0min→3min，流动相II-1：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相II-1：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相 II-1：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。再取4份800μL老鼠血清(购自碧云天)和200μL的实施例1制备的式II-1所示的化合物溶液分别混合，在37℃下加热0.5h、1h、 2h、3h、4h，然后取100μL上述溶液，加入100μL乙腈，用高速离心机在 10000g下离心5min，取上层清液，通过高效液相色谱检测标记产物的稳定性，高效液相条件：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相II-1，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20； 3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为 1mL/min，控制柱温25℃。图4为荧光标记的葡聚糖在PBS或血清中孵育不同时间的液相色谱检测的化学纯度图。
(2)采用步骤(1)中的检测方法，测定荧光标记的壳聚糖在PBS或血清中孵育不同时间后的化学纯度，结果如图5所示。
由图4和图5可知，随着孵育时间的增加，荧光标记的壳聚糖和荧光标记的葡聚糖在PBS与血清中放射性化学纯度略有下降，在4h的时候，PBS 与血清中的化学纯度仍大于95％。这表明荧光标记的氨基酸在体外具有良好的稳定性，有利于进一步的体内实验研究。
实验例4荧光标记的多糖的荧光强度检测图
(1)将HEK-293T细胞在5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养至对数期；
(2)以1×105个/孔接种于已含有玻片(玻片用75％乙醇浸泡5min以消毒，玻片购自Assitent公司)的12孔板中，培养过夜；
(3)吸去细胞上清，分别加入用培养基稀释的终浓度为1mg/ml的实施例2制备的荧光标记的葡聚糖和实施例3制备的荧光标记的壳聚糖，细胞培养箱中继续培养24h；
(4)终止培养，将孔板中的玻片移至新的12孔板中，加入PBST(含 0.1％的Tween-20)漂洗3-4次；加入4％多聚甲醛室温固定15min，PBST 漂洗3-4次；加入终浓度为1μg/ml的DAPI(购自美国Cell signaling公司) 溶液37℃孵育15min，PBS漂洗3-4次；封片，激光共聚焦显微镜(购自日本奥林巴斯公司)下观察。
图6显示荧光标记的多糖在HEK-293T细胞中的荧光强度检测结果，图中自左向右依次代表荧光标记的葡聚糖在HEK-293T细胞中的荧光检测结果，荧光标记的壳聚糖在HEK-293T细胞中的荧光检测结果，和HEK-293T 细胞的DAPI染色结果。由图6可知，荧光标记的葡聚糖和荧光标记的壳聚糖孵育后的细胞中，均能检测到明显的荧光强度，说明HEK-293T细胞能够摄入上述荧光标记的多糖，且多糖在标记有荧光染料后具有较高的荧光发光强度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种荧光标记的单糖，其特征在于，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：
其中，X为卤素；R1选自氢、烷基、环烷基、芳基和杂环基的一种。
2.根据权利要求1所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述多糖经溴化氰活化，在所述多糖的羟基位置上连接氰基，所述氰基连接所述荧光染料的氨基。
3.根据权利要求1或2所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述X为Br。
4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述荧光染料具有式A～式G所示的结构：
5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述多糖选自葡聚糖、壳聚糖、果胶多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、香菇多糖和藻多糖中的至少一种。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的荧光标记的多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将多糖溶解于水中后，加入饱和溴化氰溶液反应，反应3-20分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化处理；
(2)将步骤(2)中得到的纯化的溶液浓缩至干，用0.1-0.3M的硼砂溶液溶解，加入式I所示的荧光染料，避光反应后得到荧光标记的多糖。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应在pH>10的条件下进行；和/或，反应时间控制5-10分钟。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述硼砂溶液的浓度为约0.2M，所述硼砂溶液的用量与所述多糖的用量(mL:mg)为(0.1～1)：1。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述式I所示的荧光染料通过如下步骤制备：
(1)中间体I’-1制备
将苯肼加入冰乙酸中，搅拌，缓慢滴加3-甲基-2-丁酮，滴加完毕后加热至60-65℃，反应3-4小时，萃取，浓缩，精制，得到中间体I’-1；
其中，苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：(1.0-1.2)；
(2)中间体I’-2制备
将中间体I’-1和1,2-二溴乙烯加入甲苯中，氮气保护，加热回流反应16-18小时，冷却，析出固体，即中间体I’-2；
其中，中间体I’-1和1,2-二溴乙烯的摩尔比为1：(1.5-2.0)；
(3)中间体I’-4制备
将干燥的N，N-二甲基甲酰胺加到干燥的二氯甲烷中，冰浴下加入三氯氧磷的二氯甲烷溶液，搅拌，加入环己酮，撤去冰浴，加热回流反应2-3小时，将反应液倒入碎冰中，静置过夜，析出固体，即中间体I’-4；
其中，环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：(1.0-1.1)：(1.0-1.05)；
(4)中间体I’-5制备
将中间体I’-2和中间体I’-4加至正丁醇和甲苯的混合液中，加热回流2-3小时，析出固体，过滤得到中间体I’-5；
(5)化合物I制备
将中间体I’-5与Br-R1-NH2发生氨基取代反应，反应过程中加入NaOH，生产化合物I；
合成路线如下所示：
10.权利要求1-5任一项所述的荧光标记的多糖在制备荧光探针中的用途。
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