KR20210012394A - 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 - Google Patents
브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 면역력 증강용 식품 조성물 또는 약학 조성물의 개발에 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 조성물은 브로콜리 재배시 버려지는 부산물인 잎을 활용한 점에서 농가의 생산력 향상 및 부가가치 증대에도 기여할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 면역 증강용 브로콜리 잎의 제조방법에 관한 것이다.
면역반응은 초기 면역반응인 선천성 면역반응과 후기 면역반응인 후천성 면역반응으로 구분될 수 있다. 초기 면역반응에서는 대식세포와 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포)의 활성에 의해 병원체를 억제하여 숙주를 보호하는데, 이때 대식세포는 병원체를 탐식하면서 활성표지인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)를 많이 생산해 분비하고 NK 세포는 활성표지인 퍼포린(perforin)을 많이 생산하여 분비함으로써 병원체 감염세포를 살해한다. 이어서 후천성 면역에 관여하는 세포독성(cytotoxic) T 림프구, 헬퍼(helper) T 림프구 그리고 B 림프구가 활성화 해 감염세포를 살해하거나 항체를 만들어 숙주를 보호한다. 세포독성 T 림프구는 NK 세포처럼 퍼포린을 많이 생산분비해 병원체 감염세포를 죽이고 B 림프구는 헬퍼 T 림프구의 의존 또는 비의존적으로 항체를 만들어 숙주를 보호한다. COX-2(cyclooxygenase-2), IL-6(interleukin-6) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 대표되는 염증성 사이토카인은 면역반응을 매개하는 물질로 특히 초기면역반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, NO(nitric oxide)는 라디칼로서 NOS(nitric oxide synthases) 효소군에 의하여 L-아르기닌으로부터 생성되며, 세포의 중요한 2차 전달체로 작용한다. 유도성 NOS(inducible NOS; iNOS)는 염증이 있을 때 다량의 NO를 생성하며 과산화질산염(peroxynitrite) 등의 반응성 라디칼을 생성하여 항암, 항균 및 항기생충 효과를 나타낸다. 활성화된 대식세포에 의해 생성된 NO는 종양세포의 파괴에 관여하고 있는 주요한 유효분자로 확인되고 있으며 더욱이, 비특이적으로 숙주를 방어하거나, 대식세포-매개성 사멸, 생체외 및 생체내에서 미생물 및 종양세포의 증식억제에 NO가 관여하고 있음이 보고 된 바 있다. 따라서 세균성 또는 환경적 병원균에 대한 방어작용에 있어서 대식세포를 활성화시킬 수 있는 효과적인 면역조절인자를 개발하는 것이 매우 중요하다. 지금까지 많은 연구에서 플라보노이드(flavonoid) 및 다당류(polysaccharides)를 포함하는 천연 화합물 또는 추출물의 면역증강활성이 보고되어 왔다.
본 발명자들은 면역 증강에 효과가 좋은 소재에 대하여 연구하던 중에 브로콜리의 식용 부위를 취하고 남은 부산물인 브로콜리 잎에 고전압 펄스 전기장 처리를 하는 경우, 면역 증강 효과가 나타남을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 상기 브로콜리 잎은 경제적인 이용가치가 낮아 가격이 저렴하므로 본 발명의 원료 물질로서 적당하다.
본 발명은 고전압 펄스 전기장 처리를 하여 면역 증강용 브로콜리 잎의 제조방법, 그로부터 제조된 브로콜리 잎을 포함하는 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 브로콜리 잎은 원물, 건조물, 분쇄물, 및 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 고전압 펄스 전기장 처리는 브로콜리 잎이 담긴 액상 매질에 전기장 0.1 내지 30 kV/cm, 주파수 1 내지 200 Hz, 에너지 1 내지 20 kJ 및 에너지 1 내지 20 kJ로 0.1초 내지 150 초 동안 1 내지 100회 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 고전압 펄스 전기장 처리는 1.5 내지 2.5 kV/cm 및 에너지 3 내지 10 kJ로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 액상 매질은 물, 주정 또는 이들의 혼합액일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 브로콜리 잎이 담긴 액상 매질에 전기장 0.1 내지 30 kV/cm, 주파수 1 내지 200 Hz, 에너지 1 내지 20 kJ 및 에너지 1 내지 20 kJ로 0.1초 내지 150 초 동안 1 내지 100회 수행하는 단계;를 포함하는, 면역 증강용 브로콜리 잎의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 조성물은 면역력 증강용 식품 조성물 또는 약학 조성물의 개발에 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 조성물은 브로콜리의 재배시 버려지는 부산물인 잎을 활용한 점에서 농가의 생산력 향상 및 부가가치 증대에도 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물(이하, 'BLE'라 함)의 농도 증가에 따른 라디칼 소거 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 RAW 264.7 세포(도 2a), HepG2 세포(도 2b) 및 3T3-L1 세포(도 2c)를 다양한 농도의 BLE로 24 시간 동안 처리한 후, BLE가 세포 생존 능력에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 NO 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 TNF-α 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 IL-6 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 IL-1β 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 구체적으로, 도 7a는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS와 COX-2 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 분석한 결과를 나타내는 것이고, 도 7b는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 발현량을 상대적으로 비교하여 나타내는 그래프이며, 도 7c는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 COX-2 발현량을 상대적으로 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 8은 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 아가로스 겔 전기영동을 통한 이동성 패턴 및 전기영동도(electropherogram)를 통한 RNA 피크 패턴 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 BLE 시료(1250 ㎍/㎖)를 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 RIN 값을 분석한 결과이다.
도 10은 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포를 이용한 유전자 온톨로지 분석 결과이다.
도 11은 LPS 및 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 이용한 유전자 온톨로지 분석 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 세포(도 2a), HepG2 세포(도 2b) 및 3T3-L1 세포(도 2c)를 다양한 농도의 BLE로 24 시간 동안 처리한 후, BLE가 세포 생존 능력에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 NO 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 TNF-α 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 IL-6 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 IL-1β 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 구체적으로, 도 7a는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS와 COX-2 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 분석한 결과를 나타내는 것이고, 도 7b는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 발현량을 상대적으로 비교하여 나타내는 그래프이며, 도 7c는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 COX-2 발현량을 상대적으로 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 8은 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 아가로스 겔 전기영동을 통한 이동성 패턴 및 전기영동도(electropherogram)를 통한 RNA 피크 패턴 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 BLE 시료(1250 ㎍/㎖)를 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 RIN 값을 분석한 결과이다.
도 10은 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포를 이용한 유전자 온톨로지 분석 결과이다.
도 11은 LPS 및 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 이용한 유전자 온톨로지 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
브로콜리는 꽃봉오리 부위만 식용으로 활용되고 있으며, 그 외 브로콜리 전체에서 70%를 차지하고 있는 브로콜리 잎 및 줄기는 버려지고 있다. 상기 브로콜리 잎 및 줄기는 꽃봉오리 부위에 비해 식감이 좋지 않을 뿐만 아니라 유용 성분의 함량 및 효능 등이 낮아 활용도가 매우 낮다.
이에, 본 발명자들은 브로콜리 부산물의 활용도를 높이기 위하여 연구하던 중, 브로콜리 잎에 고전압 펄스 전기장 처리를 하는 경우 브로콜리 꽃과 유사한 정도의 면역 증강 효과가 나타나는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 상기 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎은 브로콜리 잎이 담긴 액상 매질에 전기장 0.1 내지 30 kV/cm, 주파수 1 내지 200 Hz, 에너지 1 내지 20 kJ 및 에너지 1 내지 20 kJ로 0.1초 내지 150 초 동안 1 내지 100회 수행하여 제조된 것일 수 있다.
상기 고전압 펄스 전기장 처리는 1.5 내지 2.5 kV/cm 및 에너지 3 내지 10 kJ로 수행하는 것이 바람직하다.
상기 고전압 펄스 전기장 처리 전의 상기 액상 매질에 담긴 브로콜리 잎은 분쇄 또는 마쇄과정을 거치지 않은 원물이거나 그 절단물일 수 있다.
상기 액상 매질은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합액인 것이 바람직하다. 상기 액상 매질에는 아세트산, 구연산, 젖산 등의 유기산이나 소금 등의 무기염류가 더 첨가될 수 있다.
그리고, 상기 고전압 펄스 전기장 처리를 한 후의 브로콜리 잎은 원물, 건조물, 분쇄물, 및 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 즉, 고전압 펄스 전기장 처리를 한 브로콜리 잎 원물 그 자체이거나, 고전압 펄스 전기장 처리를 한 후 건조 공정, 분쇄 공정, 건조 후 분쇄 공정, 분쇄 후 건조 공정 또는 추출 공정을 거친 것일 수 있다. 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올의 용매를 이용하여 추출한 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 60 내지 80 %(v/v) 메탄올을 용매로 이용하여 환류 냉각 추출한 추출물, 또는 물을 용매로 이용하여 90 내지 100 ℃에서 1 내지 3 시간 동안 가열하여 추출한 열수 추출물일 수 있다. 또한, 상기 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.
상기 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎 또는 이를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물은 면역 증강 효과가 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있고, 예를 들면 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명에 의하면 상기 건강기능식품 조성물에서 상기 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎의 함량은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 100 중량%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 80 중량%, 더 바람직하게는 0.3 내지 60 중량%로 함유될 수 있다. 상기 브로콜리 잎의 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 상기 브로콜리 잎에 의한 효과를 기대하기 어려운 문제가 있다.
본 발명의 조성물을 건강음료로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 텍스트린, 사이클로텐스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물은 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 상기 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 면역 증강용 약학 조성물은 약학조성물 총 중량에 대하여 상기 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하여 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 텍스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조 혼합물을 들 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위탭솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우진지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 브로콜리 잎을 액상 매질이 담긴 회분식 또는 연속식 처리 용기에 넣는 단계; 및 상기 액상 매질에 전기장 0.1 내지 30 kV/cm, 주파수 1 내지 200 Hz, 에너지 1 내지 20 kJ 및 에너지 1 내지 20 kJ로 0.1초 내지 150 초 동안 1 내지 100회 수행하는 단계;를 포함하는, 면역 증강용 브로콜리 잎의 제조방법을 제공한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예
브로콜리 잎은 (재)제주테크노파크에서 재배한 것을 구매하여 사용하였다. 고전압 펄스 전기장 처리장치는 German Institute of Food Technology사(독일)의 모델명 ELCRACK HVP5를 사용하였다.
실시예(BLE)
100 g의 신선한 브로콜리 잎의 원물 그 자체를 고전압 펄스 전기장 처리장치의 물이 담긴 회분식 처리용기에 넣고 전기장 2.1 kV/cm, 주파수 200 Hz, 에너지 7 kJ 및 처리시간 3초의 처리조건에서 1회 펄스 전기장(PEF) 처리하였다.
그리고, 상기 고전압 펄스 전기장 처리한 브로콜리 잎을 파쇄하고, 2 L의 정제수를 투입한 후, 95 ℃에서 2 시간 동안 가온 추출하였다. 이 추출물을 여과, 농축 및 건조하여 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎 추출물을 제조하였다.
비교예 1(브로콜리 줄기)
실시예와 동일하게 실시하되, 브로콜리 잎 대신 브로콜리 줄기를 이용하여 브로콜리 줄기 추출물을 제조하였다.
비교예 2(브로콜리 꽃)
실시예와 동일하게 실시하되, 브로콜리 잎 대신 브로콜리 꽃을 이용하여 브로콜리 꽃 추출물을 제조하였다.
비교예 3(브로콜리 잎 + PEF 미처리)
실시예와 동일하게 실시하되, 고전압 펄스 전기장 처리를 하지 않고 브로콜리 잎 추출물을 제조하였다.
비교예 4(브로콜리 줄기 + PEF 미처리)
비교예 1과 동일하게 실시하되, 고전압 펄스 전기장 처리를 하지 않고 브로콜리 줄기 추출물을 제조하였다.
비교예 5(브로콜리 꽃 + PEF 미처리)
비교예 2와 동일하게 실시하되, 고전압 펄스 전기장 처리를 하지 않고 브로콜리 꽃 추출물을 제조하였다.
실험예
실험예 1: 글루코라판 및 설포라판 함량 분석
고전압 펄스 전기장(PEF) 처리 전 또는 후의 브로콜리의 잎 및 줄기에 포함된 설포라판 함량을 다음과 같이 분석하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 이때, 고전압 펄스 전기장 처리를 하는 실험군(브로콜리의 잎, 줄기 및 꽃)은 원료를 제외하고는 실시예와 동일한 방법으로 처리하여 시료를 제조하였으며, 고전압 펄스 전기장 처리를 하지 않는 실험군(브로콜리의 잎, 줄기 및 꽃)은 원료 및 고전압 펄스 전기장 처리를 하지 않는 것을 제외하고는 실시예와 동일한 방법으로 처리하여 시료를 제조하였다.
글루코라판 표준품 및 설포라판 표준품(90%, Sigma)으로 표준용액을 제조하여 UPLC-MS/MS(제조사 Waters)로 분석하여 표준정량선을 작성하고, 상기 시료들의 농축분말 1g을 메탄올 1 ml에 녹인 시료를 UPLC-MS/MS로 글루코라판 함량 및 설포라판 함량을 분석하여 하기 표 1에 나타내었다. UPLC system은 Acquity UPLC system (Waters corporation, milford, MA), Binary solvent manager, Sample manager로 된 시스템이며, MS system은 Waters Quattro Premier XE Tandem MS (Micromass UK limited), Software 는 Masslynx V4.1을 이용하였다.
| 함량 (mg/100g) |
브로콜리 잎 | 브로콜리 줄기 | ||
| PEF 전 (비교예 3) |
PEF 후 (실시예) |
PEF 전 (비교예 4) |
PEF 후 (비교예 1) |
|
| 글루코라판 | 247.1 | 129.1 | 581.2 | 389.3 |
| 설포라판 | 16.8 | 39.9 | 3.57 | 18.8 |
상기 표 1을 살펴보면, 고전압 펄스 전기장 처리를 한 브로콜리 잎 추출물(실시예)의 설포라판 함량이 현저히 증가하였다.
실험예 2: 항산화 효능 평가(
in vitro
)
본 발명의 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물의 항산화 효과는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.
먼저, 실시예의 시료(BLE; 브로콜리 잎 추출물)를 DMSO에 녹여 농도별(0, 500, 1,000, 2,000, 2,500 ㎍/mL)로 희석하였다.
그리고, 에탄올(ethanol)에 용해한 0.1 mM DPPH용액 950 μL에 상기 시료 50 μL 가하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 흡수분광광도계를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고, 상기 측정한 흡광도를 이용하여 하기 식에 따라 DPPH 라디칼 소거활성을 구하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
항산화활성 (%) = { 1 - (시료 첨가군의 흡광도 / 시료 무첨가군의 흡광도) } x 100
도 1을 살펴보면, 본 발명의 시료는 각각 1,000 ㎍/mL, 2,000 ㎍/mL 및 2,500 ㎍/mL의 농도에서 라디칼 소거활성이 20%, 40% 및 43% 증가하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 BLE가 DPPH 라디칼 소거 활성을 농도 의존적으로 증가시키며, 우수한 항산화 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3: MTT assay에 의한 세포독성 측정
RAW 264.7 세포, HepG2 세포 그리고 3T3-L1 세포에 대한 BLE의 농도별 세포 독성을 MTT assay로 확인하고자 하였다.
이를 위하여 먼저, RAW 264.7 세포, HepG2 세포 그리고 3T3-L1 세포를 96 well plate에 5×105 cells/well로 동일하게 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 뒤 배양액을 제거하였다.
BLE를 농도별(0, 1, 10, 100, 1500, 2500, 5000 ㎍/mL)로 희석하여 상기 배지에 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator(CLM-170B-85, ESCO Co., Korea)에서 24시간 배양하였다. EZ-Cytox(DoGen Bio Co., Ltd., Korea)를 각 well당 배지의 10%씩 가하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 3시간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 도 2에 나타내었다.
도 2는 RAW 264.7 세포(도 2a), HepG2 세포(도 2b) 및 3T3-L1 세포(도 2c)를 다양한 농도의 BLE로 24 시간 동안 처리한 후, BLE가 세포 생존 능력에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 2를 살펴보면, BLE에 대하여 RAW 264.7 세포에서는 1~1,500 ㎍/mL의 농도, HepG2 세포에서는 1~1,250 ㎍/mL의 농도, 그리고 3T3-L1 세포에서는 1~2,500 ㎍/mL의 농도에서 세포독성의 변화를 나타내지 않았다.
실험예 4: 산화질소(NO) 생성 저해 활성
BLE의 NO 생성 저해 활성을 확인하고자 하였다.
이를 위하여 먼저, RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×106 cells/well로 동일하게 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤 배양액을 제거하였다. 상기 배지에 BLE를 농도별(0, 0(+LPS), 100, 500, 1000, 1250 ㎍/mL)로 희석하여 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 배양시켰고, LPS(lipopolysacchride, 1 ㎍/mL)를 대조군(control)을 제외한 모든 well에 첨가하여 자극시켰다. 24시간 후, griess reagent로 10분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이로부터 NO 생성량을 추산하여 도 3에 나타내었다.
도 3은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 NO 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3을 살펴보면, LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포는 NO의 생성량이 현저히 증가한 반면, BLE를 처리한 실험군의 경우 1000 ㎍/mL 농도에서 NO의 생성량이 대조군에 비하여 약 77%까지 유의하게 감소하였다. 참고로, 1250 ㎍/mL 농도에서는 50% NO 생성 저해 효과를 나타내었다. 양성대조군으로 사용된 GRN과 SFN은, LPS 자극 RAW 264.7 세포에 5 μM의 농도로 처리한 경우 32% 및 79%의 NO 생성량 감소 효과를 나타내었다.
즉, 염증이 유도되었을 때 BLE가 농도의존적으로 NO 생성량을 감소시키는 것을 구체적으로 확인하였다.
또한, 이와 동일한 방법으로 실시예(BLE) 및 비교예 1 내지 5의 추출물을 각각 1,250 ㎍/mL 농도로 처리한 경우의 NO 생성량을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.
| 구분 | 실시예 | 비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 | 비교예 4 | 비교예 5 |
| NO 생성량 (% of control) |
23.3 | 22.6 | 21.8 | 80.1 | 76.4 | 62.7 |
상기 표 2를 살펴보면, 본 발명의 BLE(실시예)를 섭취한 실험군의 NO 생성량이 브로콜리 꽃과 유사한 정도까지 감소하는 것을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터 본 발명의 BLE는 NO 생성량을 감소시켜 면역력을 증대시키는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실험예 5: TNF-α, IL-6 및 IL-1β 사이토카인 생성 억제 활성
BLE의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 사이토카인 생성 억제 활성을 확인하고자 하였다.
이를 위하여 먼저, RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×106 cells/well로 동일하게 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 뒤 배양액을 제거하였다. 상기 배지에 BLE을 농도별(0, 0(+LPS), 100, 500, 1000, 1250 ㎍/mL)로 희석하여 첨가한 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 배양시켰고, LPS (lipopolysacchride, 1 ㎍/mL)를 대조군을 제외한 모든 well에 첨가하여 자극시켰다. 24시간 후, 세포 배양액 내의 사이토카인의 분비량을 ELISA kits(Koma biotech., Korea)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다.
도 4는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 TNF-α 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고, 도 5는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 IL-6 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이며, 도 6은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, BLE가 IL-1β 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4 내지 도 6을 살펴보면, LPS로 염증이 유도된 Raw 264.7 세포는 대조군에 비하여 TNF-α, IL-6 and IL-1β의 함량이 현저히 증가한 반면, BLE를 처리한 실험군의 경우 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 and IL-1β의 생성량이 농도 의존적으로 감소하였다.
구체적으로, BLE를 처리한 실험군의 경우 100 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 1,000 ㎍/mL 및 1,250 ㎍/mL 농도에서 대조군에 비해 TNF-α 생성은 각각 14%, 25%, 31%, 68% 억제되었고, IL-6 생성은 각각 24%, 35%, 44%, 65% 억제되었으며, IL-1β 생성은 각각 19%, 28%, 34%, 39% 억제되었다.
즉, BLE가 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 and IL-1β)의 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 구체적으로 확인하였다.
또한, 이와 동일한 방법으로 실시예(BLE) 및 비교예 1 내지 5의 추출물을 각각 1,000 ㎍/mL 농도로 처리한 경우의 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 and IL-1β) 생성량을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
| 구분 | 실시예 | 비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 | 비교예 4 | 비교예 5 |
| TNF-α 생성량 (% of control) |
32.4 | 36.3 | 30.6 | 94.2 | 91.2 | 89.4 |
| IL-6 생성량 (% of control) |
36.2 | 41.6 | 34.4 | 96.8 | 93.1 | 92.3 |
| IL-1β 생성량 (% of control) |
61.7 | 66.4 | 60.5 | 92.7 | 88.5 | 85.6 |
상기 표 3을 살펴보면, 본 발명의 BLE(실시예)를 섭취한 실험군의 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 and IL-1β) 생성량이 브로콜리 꽃과 유사한 정도까지 감소하는 것을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터 본 발명의 BLE의 식이는 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 and IL-1β) 생성량을 감소시켜 면역력을 증대시키는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실험예 6: COX-2 및 INOS 단백질 발현 억제 활성
BLE와 COX-2 및 iNOS 단백질 발현의 관련성을 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 먼저 RAW 264.7 세포를 PBS로 세척하고 RIPA buffer로 용해시킨 후 4 ℃ 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 상기 원심분리하여 얻은 상층액을 Bradford assay로 정량하고 SDS-PAGE(Tris-Glycine-PAG, non-SDS Precast Gel(10%))에서 전기 연동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane으로 transfer하였고 membrane은 blocking buffer(5% skim milk in TBST (Tris-buffered saline with Tween 20))로 blocking하여 항체의 비특이적 결합을 억제시키고 TBST로 세척하였다.
이후, 1차 항체(COX-2, iNOS)를 희석하여 4 ℃에서 overnight 반응시킨 다음 다시 TBST를 이용하여 10분 간격으로 3회 세척하고 membrane을 HRP가 중합된 각각의 2차 항체를 희석하여 45분 동안 반응시켰다. Chemi-luminescence Bioimaging Instrument(NeoScience Co., Ltd., Korea)를 사용하여 COX-2, iNOS 밴드 및 정량을 측정하였다.
도 7은 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 다시 LPS로 처리하여 염증을 유도한 경우, COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 구체적으로, 도 7a는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS와 COX-2 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 분석한 결과를 나타내는 것이고, 도 7b는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 발현량을 상대적으로 비교하여 나타내는 그래프이며, 도 7c는 다양한 농도의 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 COX-2 발현량을 상대적으로 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 7을 살펴보면, LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포는 COX-2, iNOS 단백질 발현량이 현저히 증가한 반면, BLE를 처리한 실험군의 경우 COX-2, iNOS 단백질 발현이 농도의존적으로 감소하였다.
즉, 염증이 유도되었을 때 BLE가 농도의존적으로 COX-2 및 iNOS 단백질의 발현량을 감소시키는 것을 구체적으로 확인하였다.
또한, 이와 동일한 방법으로 실시예(BLE) 및 비교예 1 내지 5의 추출물을 각각 1000 ㎍/mL 농도로 처리한 경우의 COX-2 및 iNOS 단백질의 발현량을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.
| 구분 | 실시예 | 비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 | 비교예 4 | 비교예 5 |
| COX-2 발현량 | 0.41 | 0.46 | 0.37 | 1.73 | 1.81 | 1.54 |
| iNOS 발현량 | 0.37 | 0.51 | 0.31 | 1.24 | 1.26 | 1.21 |
상기 표 4를 살펴보면, 본 발명의 BLE(실시예)를 섭취한 실험군의 COX-2 및 iNOS 단백질의 발현량이 브로콜리 꽃과 유사한 정도까지 감소하는 것을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터 본 발명의 BLE는 COX-2 및 iNOS 단백질의 발현량을 감소시켜 면역력을 증대시키는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실험예 7: BLE에 의한 유전자 발현의 증감 분석
7-1. mouse macrophage RAW 264.7 cell의 total RNA 분리
먼저, RAW 264.7 세포를 1×106 cells/well로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다.
상기 세포가 약 80%정도 부착되었을 때(약 1일 후), 1×PBS로 세척하고, 상기 well에 BLE과 LPS를 주입하였다(실험군: BLE(0 ㎍/mL), BLE(0 ㎍/mL)+LPS, BLE(100 ㎍/mL)+LPS, BLE(1,250 ㎍/mL)+LPS).
1일 후, 각 well의 세포들을 Trizol 500 μL에 녹여서 총 RNA를 분리한 후, 분석 시까지 -80 ℃에서 보관하였다.
7-2. 총 RNA QC(Quality check)
상기 분리한 총 RNA의 QC(quality check; OD260/280 & OD260/230)를 분석하여 하기 표 5에 나타내었다.
| No. | 시료 | Nano-drop(ND 2000) | Bioanalyzer(nano) | 결과 | ||||
| 함량(ng/㎕) | Total(㎍) | OD260/280 | OD260/230 | Ratio(28s/18s) | RIN | |||
| 1 | (-)control | 7327.1 | 146.5 | 2.10 | 2.22 | 1.9 | 10.0 | PASS |
| 2 | (+)control | 5027.2 | 100.5 | 1.95 | 2.00 | 1.7 | 9.8 | PASS |
| 3 | 100 ㎍/㎖ BLE |
4530.9 | 90.6 | 2.00 | 2.09 | 1.8 | 9.9 | PASS |
| 4 | 1250 ㎍/㎖ BLE |
4762.5 | 95.3 | 1.99 | 2.08 | 1.7 | 10.0 | PASS |
< QC 기준 >
·PASS : 하기 기준을 모두 통과한 시료임.
- 함량 > 100 ng/μL (Total 500 ng 이상)
- OD260/280 > 1.8 , OD260/230 > 1.6
- 진핵생물의 경우, Ratio(28s/18s) > 1.0, RIN value > 7.0
·Check : 실험에 사용될 수는 있으나, 고객과 협의 후 다음 단계를 진행함.
- 함량 : 100 ng/μL ~ 0.5 ng/μL (Total 5 ng 이상)
- OD260/280 1.2 ~ 1.8, OD260/230 > 0.5 ~ 1.5
·Fail : 실험에 사용할 수 없는 시료임.
7-3. 아가로스 겔 전기영동을 통한 RNA 이동성 분석(Migration pattern)
RAW 264.7 세포에 BLE 및 LPS를 처리한 군(실험군: BLE(0 ㎍/mL), BLE(0 ㎍/mL)+LPS, BLE(100 ㎍/mL)+LPS, BLE(1,250 ㎍/mL)+LPS)으로부터 분리한 총 RNA를 0.8% 아가로스 겔에 넣고(loading), 100 V에서 전기영동을 실시하였으며, 그 분석 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 아가로스 겔 전기영동을 통한 이동성 패턴 및 전기영동도(electropherogram)를 통한 RNA 피크 패턴 분석 결과를 나타내는 것이다.
본 실험을 통하여 분리된 RNA의 경우 분석실험에 적용할 수 있는 적정 quality를 확보하였고, 이를 통한 분석결과에 신뢰성을 확보하였다.
7-4. Rin(RNA Integrity Number)
본 발명의 BLE 시료(1250 ㎍/㎖)를 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 quality를 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 본 발명의 BLE 시료(1250 ㎍/㎖)를 처리한 RAW 264.7 세포로부터 분리한 총 RNA의 RIN 값을 분석한 결과이다.
도 9를 살펴보면, 본 발명의 BLE 시료에 대한 RIN 값은 10.0이므로 High quality 시료인 것을 알 수 있다.
참고로, 상기 Agilent 2100 Bioanalyzer에서 제시하는 RIN 값은 migration 및 peak pattern, 28s/18s ribosomal RNA의 비율을 근거로 한 통계적인 수치로서 1 ~ 10의 범위를 가지며, 진핵생물 total RNA samples의 quality 지표로 사용되고 있다. High quality 시료를 요하는 DNA microarray analysis를 위한 권장 값은 7.0 이상이다.
7-5. RNA Sequencing
분석방법
마우스에 BLE 및 LPS를 투여한 실험군(BLE(0 ㎍/mL), BLE(0 ㎍/mL)+LPS, BLE(100 ㎍/mL)+LPS, BLE(1,250 ㎍/mL)+LPS)으로부터 RNA를 분리하고, 상기 RNA로부터 각 군의 유전자 발현 차이를 비교하고자 하였다. 본 발명의 RNA sequencing 분석 방법을 표 6에 나타내었다.
| 구분 | 세부내용 |
| RNA 샘플 | Agilent's 2100 Bioanalyzer System을 이용하여 total RNA의 quality를 측정함 |
| Library construction | Lexogen의 Quant-Seq library Prep kit으로 제작함 |
| Sequencing Platform | Illumina NextSeq500 |
| Library layout | Illumina SE75 |
| Organism | Mouse |
| Build | mm10(UCSC) |
| Alignment | Transcriptome |
| Transcript Model | UCSC mm10 |
| Qualtiry Trimming | >average Q20 |
| Normalization Method | Quantile normalization between samples |
분석결과
(1) Gene Ontology
LPS 자극과 BLE 처리에 의해 조절되는 염증(Inflammation) 및 면역 반응(immune response) 관련 유전자들을 유전자 온톨로지(gene ontology, GO)를 통해 확인하고자 하였다.
도 10 및 표 7은 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포를 이용한 유전자 온톨로지 분석 결과이다.
| 구분 | Total |
| Gene Number | 23282 |
| % of Total | 100 |
| Up significant | 2314 |
| % UP significant | 9.9 |
| Down significant | 2579 |
| % of Down significant | 11.1 |
| Total Significant | 4893 |
| % of Total Significant | 21.0 |
또한, 도 11 및 표 8은 LPS 및 BLE로 처리한 RAW 264.7 세포를 이용한 유전자 온톨로지 분석 결과이다.
| 구분 | Total |
| Gene Number | 23282 |
| % of Total | 100 |
| Up significant | 2539 |
| % UP significant | 10.9 |
| Down significant | 2482 |
| % of Down significant | 10.6 |
| Total Significant | 5021 |
| % of Total Significant | 21.5 |
(2) cDNA microarray
LPS 자극에 의해 2배 이상으로 up-regulation 되었다가 BLE 처리에 의해 대조군 수준까지 회복된 25개의 유전자를 하기 표 9에 나타내었다.
| 유전자 | LPS/Negative control | BLE+LPS/Negative control | 설명 |
| Fasl | 3.180 | 1.014 | Fas ligand(TNF superfamily, member 6) |
| Prdm1 | 3.227 | 1.026 | PR domain containing 1, with ZNF domain |
| Nlrp1b | 2.118 | 1.268 | NLR family, pyrin domain containing 1B |
| Mpo | 2.119 | 1.014 | myeloperoxidase |
| Hist1h2ba | 2.100 | 1.007 | histone cluster 1, H2ba |
| Peli2 | 2.119 | 1.014 | pellino 2 |
| Mx1 | 3.296 | 1.049 | MX dynamin-like GTPase 1 |
| Cd6 | 2.097 | 1.253 | CD6 antigen |
| Nmi | 2.868 | 1.314 | N-myc (and STAT) interactor |
| Mecom | 2.119 | 1.014 | MDS1 and EVI1 complex locus |
| Il12a | 2.100 | 1.007 | Inteleukin 12 a |
| Cdh17 | 2.100 | 1.007 | Cadherin 17 |
| Prkcz | 3.180 | 1.014 | Protein kinase C |
| Oas1e | 2.100 | 1.007 | 2'-5' oligoadenylate synthetase 1E |
| Crcp | 2.044 | 1.637 | calcitonin gene-related peptide-receptor |
| Gstk1 | 2.119 | 1.014 | glutathione S-transferase kappa 1 |
| March8 | 2.310 | 1.355 | membrane-associated ring finger |
| Bcl3 | 4.225 | 1.541 | B cell leukemia/lymphoma 3 |
| Chid1 | 2.129 | 1.377 | chitinase domain containing 1 |
| Cx3d1 | 2.136 | 1.020 | chemokine(C-X3-C motif) ligand 1 |
| Cd3d | 2.100 | 1.007 | CD3 antigen |
| Gcnt3 | 2.100 | 1.007 | glucosaminyl(N-acetyl) transferase 3 |
| Tdgf1 | 2.100 | 1.007 | teratocarcinoma-derived growth factor 1 |
| Cybb | 2.349 | 1.064 | cytochrome b-245, beta polypeptide |
또한, LPS 자극에 의해 0.5배 이하로 down-regulation 되었다가 BLE 처리에 의해 대조군 수준까지 회복된 27개의 유전자를 하기 표 10에 나타내었다.
| 유전자 | LPS/Negative control | BLE+LPS/Negative control | 설명 |
| Cd28 | 0.460 | 0.956 | CD28 antigen |
| Inpp5d | 0.495 | 0.885 | inositol polyphosphate-5-phosphatase D |
| Sesn1 | 0.330 | 0.738 | sestrin 1 |
| Haver2 | 0.283 | 1.148 | hepatitis A virus cellular receptor 2 |
| Pnma1 | 0.460 | 0.956 | paraneoplastic antigen MA1 |
| Naip6 | 0.469 | 0.863 | NLR family, apoptosis inhibitory protein 6 |
| Ang | 0.457 | 0.784 | angiogenin |
| Trim13 | 0.455 | 0.934 | tripartite motif-containing 32 |
| Klhl6 | 0.410 | 0.971 | kelch-like 6 |
| Rab12 | 0.458 | 1.013 | RAB12, member RAS oncogene family |
| Gsn | 0.177 | 0.912 | gelsolin |
| Ptgs1 | 0.389 | 0.861 | prostaglandin-endoperoxide synthase 1 |
| F2 | 0.237 | 0.974 | coagulation factor II |
| Mcoln2 | 0.460 | 0.956 | mucolipin 2 |
| Trim32 | 0.475 | 1.041 | tripartite motif-containing 32 |
| Tlr4 | 0.188 | 0.999 | toll-like receptor 4 |
| Epha2 | 0.470 | 1.220 | Eph receptor A2 |
| Tec | 0.456 | 1.255 | tec protein tyrosine kinase |
| Clec5a | 0.495 | 0.913 | C-type lectin domain family 5, member a |
| Cyp26b1 | 0.323 | 1.001 | cytochrome P450, family 26, subfamily b |
| Trim30b | 0.355 | 0.738 | tripartite motif-containing 30B |
| Tnfsf13b | 0.378 | 0.738 | tumor necrosis factor (ligand) sf13b |
| Hmgb2 | 0.408 | 0.795 | high mobility group box 2 |
| Cxcr5 | 0.180 | 0.781 | chemokine (C-X-C motif) receptor 5 |
| Smad6 | 0.201 | 0.828 | SMAD family member 6 |
| Cxcr3 | 0.228 | 1.172 | chemokine (C-X-C motif) receptor 3 |
상기에서, LPS 자극 RAW 264.7 세포 유전자들의 발현을 분석한 결과, LPS를 처리한 실험군에서 대조군보다 총 25개의 유전자(Mpo, cd6, Il12a, Il3ra2, Cd3d 등)가 2배 이상 up-regulation되었고, 총 27개의 유전자(Cd28, Tlr4, Cxcr5, Cxcr3 등)가 0.5배 이하로 down-regulation되었으며, 이들의 발현수준은 BLE 처리에 의해 대조군 수준으로 회복됨을 확인하였다.
상기와 같은 실험결과로부터, 본 발명의 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎은 브로콜리 재배시 버려지는 부산물인 잎을 활용하므로 매우 경제적이면서도 브로콜리 꽃만큼의 면역 증강 효과를 달성할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
제제예
제제예 1: 정제의 제조
실시예의 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎 추출물 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 2: 캅셀제의 제조
실시예의 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎 추출물 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 3: 분말 건강기능식품의 제조
실시예의 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎 추출물 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 4: 음료의 제조
실시예의 고전압 펄스 전기장 처리된 브로콜리 잎 추출물 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (8)
- 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 브로콜리 잎은 원물, 건조물, 분쇄물, 및 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 고전압 펄스 전기장 처리는
브로콜리 잎이 담긴 액상 매질에 전기장 0.1 내지 30 kV/cm, 주파수 1 내지 200 Hz, 에너지 1 내지 20 kJ 및 에너지 1 내지 20 kJ로 0.1초 내지 150 초 동안 1 내지 100회 수행하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 고전압 펄스 전기장 처리는 1.5 내지 2.5 kV/cm 및 에너지 3 내지 10 kJ로 수행되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 액상 매질은 물, 주정 또는 이들의 혼합액인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 고전압 펄스 전기장(PEF) 처리된 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 약학 조성물.
- 브로콜리 잎을 액상 매질이 담긴 회분식 또는 연속식 처리 용기에 넣는 단계; 및 상기 액상 매질에 전기장 0.1 내지 30 kV/cm, 주파수 1 내지 200 Hz, 에너지 1 내지 20 kJ 및 에너지 1 내지 20 kJ로 0.1초 내지 150 초 동안 1 내지 100회 수행하는 단계;를 포함하는, 면역 증강용 브로콜리 잎의 제조방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020190090055A KR102402445B1 (ko) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | 브로콜리 잎을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230059207A (ko) | 2021-10-26 | 2023-05-03 | 이호규 | 브로콜리 잎 분획물을 이용한 이너뷰티 조성물 및 그 제조방법 |
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| KR20150118531A (ko) * | 2014-04-14 | 2015-10-22 | 주식회사 비케이바이오 | 설포라판 함량이 증가된 브로콜리의 제조방법 및 그로부터 제조된 브로콜리의 이용 |
-
2019
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| KR101729913B1 (ko) | 2014-04-14 | 2017-04-25 | 주식회사 비케이바이오 | 설포라판 함량이 증가된 브로콜리의 제조방법 및 그로부터 제조된 브로콜리의 이용 |
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| KR20230059207A (ko) | 2021-10-26 | 2023-05-03 | 이호규 | 브로콜리 잎 분획물을 이용한 이너뷰티 조성물 및 그 제조방법 |
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| KR102402445B1 (ko) | 2022-05-26 |
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