KR20200138244A - 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 정제 방법 - Google Patents

트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

특정한 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜 및 특정한 디트리틸화 불순물을 포함하는 혼합물로부터, 공정 (A), (B), (C)를 실시함으로써, 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 정제하는 방법.
공정 (A):트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 수산기를 특정한 방법으로 에스테르화하는 공정
공정 (B):상기 에스테르화된 화합물을 특정한 방법으로 추출하는 공정
공정 (C):상기 에스테르화된 화합물을 가수분해하여, 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 공정

Description

트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 정제 방법
본 발명은, 의약 용도에 사용되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 효율적으로 고순도로 제조하기 위한 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, 단분산 PEG 합성 특유의, PEG 사슬 길이 연장 반응에 의해 생성되는 디트리틸화 불순물의 제거 방법에 관한 것이다.
약제에 수식함으로써, 혈중 체류성을 향상시키는 PEG는 드러그 딜리버리 시스템(DDS)·의약 분야에서 널리 사용되어 왔다. 이와 같은 PEG는, 최근에는, 약제에 수식했을 때의 성능이나 안전성의 관점에서 보다 고순도인 것이 요구되고 있다.
한편, PEG는 에틸렌 옥시드의 개환 중합에 의해 합성된, 다수의 분자량을 갖는 불균일한 혼합물이다. 이에 대해, 저분자량의 에틸렌글리콜 등의 원료로부터 축차 합성을 실시하는 단분산 PEG는 단일 분자량을 갖는 단일 화합물이고, 고순도를 특징으로 하는 새로운 DDS 소재이다. 이들 단분산 PEG는 축차 합성을 실시하므로, 개환 중합에 의해 합성하는 지금까지의 PEG 에 대해 사슬 길이의 연장에 드는 수고가 번잡하고, 에틸렌글리콜 사슬 길이수 48 이하의 저분자량체가 범용된다.
최근, 링커를 개재하여 약제와 항체를 결합시켜, 항원 제시 세포에 약물을 능동적으로 운반하는 것이 가능한 항체 결합 의약(Antibody-Drug Conjugate:ADC)가 실용화되어 높은 주목을 끌고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2).
이 ADC의 링커 재료로서 이용이 진행되고 있는 것의 하나가, 헤테로형 단분산 PEG이다. 헤테로형 단분산 PEG는, 양 말단에 서로 상이한 관능기를 갖는 단분산 PEG이므로, 그 각 말단에 항체와 약제를 결합시킬 수 있다. 그러나, 헤테로형 단분산 PEG 중에, 양 말단에 동일한 관능기를 갖는 단분산 PEG가 존재하면, 항체가 2개 결합한 불순물 또는 약제가 2개 결합한 불순물이 생성된다. 이들 불순물이 존재함으로써, 목적물인 ADC의 수율이 저하되므로, 본 분야에 있어서, 고순도의 헤테로형 단분산 PEG가 필요하게 된다.
또, ADC를 제조할 때는, 통상, 약물의 결합 개수를 질량 분석계나 HPLC(고속 액체 크로마토그래피)를 사용하여 확인하기 때문에, 링커 재료 중에 에틸렌글리콜 사슬 길이가 상이한 단분산 PEG가 불순물로서 존재하면, 그 확인이 곤란해진다는 제조상의 문제가 생긴다. 또, 에틸렌글리콜 사슬 길이가 상이한 불순물의 존재에 의해, 상기 ADC 제조시에 첨가하는 항체나 약제의 당량이 불명확해지기 때문에 고가의 항체나 약제를 과잉으로 사용할 필요가 생긴다는 문제나, 의약품 신청시에 복수의 분자량의 화합물이 발생하여, 화합물의 동정이나 각종 시험의 실시가 필요하게 된다는 문제가 있다. 따라서, 상기 헤테로형 단분산 PEG로는, 에틸렌글리콜 사슬 길이가 동일한 단분산 PEG를 1종만 고순도로 함유하는 것이 중요하다고 할 수 있다.
이와 같이, ADC의 링커 재료로서 사용하는 헤테로형 단분산 PEG로는, 주성분으로서, 양 말단에 서로 상이한 관능기를 갖는 헤테로형 단분산 PEG로서, 에틸렌글리콜 사슬 길이가 균일한 단분산 PEG를, 특히 고순도로 함유하는 것이 요망되고 있었다.
일반적으로, 단분산 PEG의 사슬 길이 연장 공정은, 부피가 큰 소수기인 트리틸기 등의 수산기의 보호기를 갖는 에틸렌글리콜 유도체를 원료로서 사용하는 것이 공지되어 있다. 또, 그 단분산 PEG의 사슬 길이의 연장에 관련된 각 공정에서는, 사슬 길이수나 관능기가 상이한 불순물이 생성된다. 그러나 저분자량의 단분산 PEG는 고분자량의 PEG와 달리 관능기의 영향을 크게 받고, 또 그 대부분이 액체이므로, 폴리머 특유의 간편한 정석 정제를 실시할 수 없는 경우가 많다. 따라서 이들 불순물이 목적물에 많이 잔존하게 된다. 또 사슬 길이 연장 공정에 있어서는 목적물과 불순물 사이에 명확한 극성차가 없어, 공업 이용 가능한 정제법에서는 분리하는 것이 어렵다.
단분산 PEG의 제법에 관한 보고는 복수 있지만, 특허문헌 1에서는 이하와 같은 제법으로 단분산 PEG의 사슬 길이 연장을 실시하고 있다.
Figure pct00001
상기와 같이, 이 사슬 길이 연장의 공정에서는, 목적물의 12량체의 단분산 PEG인 화합물 8에, 디트리틸화 불순물 3, 6, 9가 포함된다. 이들 불순물은 목적물과 유사한 물성을 가지고 있기 때문에, 제거가 어렵고, 스케일 업에 적합하지 않은 칼럼 크로마토그래피 등의 정제 방법에 한정된다. 또, 특허문헌 1에는 이들 디트리틸화 불순물을 화합물 8로부터 제거하기 위한 정제 방법에 관한 기재는 없다.
특허문헌 1에서는 화합물 8의 수산기를 부피가 큰 소수기인 토실기로 변환한 후, 탈트리틸 반응을 실시하여 디올체가 된 불순물 3, 6, 9를 분액 추출에 의해 제거하고 있다.
일본 공개특허공보 2017-14371호
Toxins, 2011년, 3, p.848-883 J. Med. Chem., 2011년, 54, p.3606-3623
발명의 요약
발명이 해결하려는 과제
상기로부터, 공업적으로 실시 가능한 기존의 정제 방법에서는, 디트리틸화 불순물을 제거하기 위해서는, 토실기 등의 부피가 큰 소수기로 한 번 변환하는 것이 필요해진다. 그러나, 본래의 관능기 변환 공정에서 이 부피가 큰 소수기를 필요로 하지 않는 화합물을 얻는 것을 목적으로 했을 경우, 디트리틸화 불순물 제거를 위한 일련의 공정을 추가함으로써, 합성 공정을 번잡화시켜, 합성 효율을 저하시키는 것이 과제이다.
한편, 화합물 8의 수산기를 메틸기 등의 소수성이 낮은 소수기로 변환한 후에, 특허문헌 1의 상기 탈트리틸 반응 및 디올체가 된 불순물 3, 6, 9의 제거를 시도한 결과, 디올체 불순물과 목적물을 분액 추출로 분리할 수는 없었다. 이와 같이, 특허문헌 1의 방법에서는, 부가하는 관능기에 의해 디트리틸화 불순물의 제거를 할 수 없는 것이 분명해졌다.
또, 디트리틸화 불순물을 함유하는 단분산 PEG를 사용하여 반응을 실시하는 경우, 원료 단분산 PEG의 순도를 정확하게 산출하기 위한 적절한 방법이 없기 때문에, 반응에 사용하는 적정한 시약 첨가량을 결정할 수 없다. 또, 불순물의 양이 흐트러지면, 항상 동등한 반응이 실시할 수 없어, 과잉된 시약에 의한 부반응의 발생이나 시약 부족에 의한 반응 미달 등의 위험성이 있다. 또, 얻어지는 생성물의 순도도 불명확해진다. 또한, 단분산 PEG의 정제 조작으로서 범용되는 분액 추출에 의한 정제 조작에도 악영향을 미친다. 사슬 길이가 상이한 디트리틸화 불순물이 각각 서로 상이한 친수성/소수성을 나타내고, 분층성을 저하시키므로 추출 효율의 저하를 초래하는 경우가 있다.
이상으로부터, 단분산 PEG 중에 포함되는 사슬 길이 연장 공정 유래의 특정한 분자량을 갖는 디트리틸화 불순물을 효율적으로 제거하는 방법이 요망되고 있다.
본 발명은, 상기 단분산 PEG의 사슬 길이 연장 공정에서 부생하는 특정한 사슬 길이가 상이한 디트리틸화 불순물의 정제에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 과제는, 공업 이용 가능한 수법으로, 의약 용도에 적합한 고순도의 단분산 PEG를 효율적으로 얻을 수 있는 정제법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 단분산 PEG의 사슬 길이 연장 공정 후에 얻어지는 혼합물에 대해, 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 수산기를 에스테르화에 의해 카르복실산을 도입하여 친수성을 끌어올린 후, 특정 조성의 추출 조작을 반복하여, 디트리틸화 불순물을 유기층에 추출·제거할 수 있는 것을 알아내었다. 또한 계속해서, 수층의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG 유도체의 에스테르기를 가수분해시킴으로써, 신속하게 고순도의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG가 얻어지는 것을 알아내었다.
이 발명의 특징은, 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG에 효율적으로 카르복실산을 도입할 수 있는 것, 추출 정제시에, 특정한 pH, 특정한 탄화수소계 용제와 방향족계 용제의 혼합 비율, 추출 온도를 제어함으로써, 디트리틸화 불순물을 유기층에 제거할 수 있는 것, 그리고 계속되는 가수분해 공정을 포함하는 3공정을, 연속해서 일련의 프로세스로 실시 가능한 점이고, 공업 이용 가능하여 효율적인 정제 방법이다.
즉 본 발명은 이하의 것이다.
(1) 하기 식 (1)로 표시되는 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜 및 하기 식 (2)로 표시되는 디트리틸화 불순물을 포함하는 혼합물로부터, 상기 디트리틸화 불순물을 분리하여 제거함으로써, 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 정제 방법으로서,
하기 공정 (A), 공정 (B) 및 공정 (C)를 이 순서로 실시하는 것을 포함하는, 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 정제 방법.
Figure pct00002
(식 (1)에 있어서, n은 에틸렌 옥시드 단위의 반복 단위수이며, 3 이상, 48 이하이다)
Figure pct00003
(식 (2)에 있어서, m은, 에틸렌 옥시드 단위의 반복 단위수이며, 3 이상, 92 이하이다)
공정 (A): 하기 유기 용제 II 중에서, 식 (1)로 표시되는 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 수산기를 이염기산 무수물과 반응시킴으로써, 에스테르 구조 및 카르복실기를 갖는 에스테르 화합물을 포함하는 반응 용액을 얻는 에스테르화 반응 공정
공정 (B): 상기 공정 (A)에서 얻어진 상기 반응 용액과, 하기 유기 용제 I, 유기 용제 II 및 유기 용제 III으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유기 용제와, pH3∼7의 수용액을 사용하여 분액 추출 정제를 실시함으로써 수층과 유기층을 분리하고, 식 (2)로 표시되는 상기 디트리틸화 불순물을 상기 유기층에 분배하고, 상기 에스테르 화합물을 상기 수층에 분배하는 추출 공정
공정 (C): 상기 수층에 염기를 첨가함으로써 상기 에스테르 화합물의 가수분해를 실시하여, 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 공정
유기 용제 I: 탄소수 3 이하의 알코올 용제
유기 용제 II: 합계 탄소수 8 이하의 방향족 탄화수소 용제
유기 용제 III: 합계 탄소수 10 이하의 포화 지방족 탄화수소 용제
(2) 상기 공정 (A)에 있어서, 상기 이염기산 무수물이, 숙신산 무수물 및 글루타르산 무수물로 이루어지는 군에서 선택되는, (1) 의 방법.
(3) 상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기 용제 I이, 메탄올, 에탄올 및 프로판올에서 선택되는 1 종 이상의 용제이고, 상기 유기 용제 II가, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 용제이고, 상기 유기 용제 III이, 펜탄, 헥산 및 헵탄으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 용제인, (1) 또는 (2)의 방법.
(4) 상기 공정 (B)에 있어서의 상기 유기 용제의 혼합 비율은, 상기 유기 용제 I의 질량 비율이 15∼55질량％이고, 상기 유기 용제 II의 질량 비율이 15∼75질량％이고, 상기 유기 용제 III의 질량 비율이 0∼50질량％인, (1)∼(3) 중 어느 하나의 방법.
(5) 상기 공정 (B)의 상기 추출 공정 중의 온도가 0℃ 이상, 60℃ 이하인, (1)∼(4) 중 어느 하나의 방법.
(6) 상기 공정 (B)의 상기 추출 공정을 반복하는, (1)∼(5) 중 어느 하나의 방법.
(7) 상기 공정 (C)에 있어서의 상기 염기가, 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 염기인, (1)∼(6) 중 어느 하나의 방법.
본 발명은, 의약 용도에 적합한 고순도의 단분산 PEG가 얻어지는 신규한 정제법이다. 이 정제 방법에서는, 종래의 기술에서는 효율적인 분리가 곤란한 사슬 길이 연장 공정에서 생성되는 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(식 (1))와 사슬 길이가 상이한 특정 분자량의 디트리틸화 불순물(식 2)을, 말단 수산기의 유도 및 추출 정제에 의해 효율적으로 분리할 수 있다. 또, 유도된 관능기 부분도 정제 후 수용액인 채로 신속하게 탈리시켜 유도 전의 원래의 구조로 되돌리는 것이 가능하다. 즉, 공업적으로 용이하게 실시 가능한 연속된 공정에서, 디트리틸화 불순물을 크게 저감시킨 고순도의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG를 양호한 수율로 얻는 것이 가능하다.
또, 본 발명에 의해, 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG를 정제하고, 단리할 수 있으므로, 지금까지는 디트리틸화 불순물을 포함한 상태에서 실시하고 있던 다음 공정의 관능기 변환 공정에 있어서, 양호한 재현으로, 고순도, 고수율로 단분산 PEG 유도체를 제조하는 것이 가능하다.
도 1은, 실시예 1에 있어서의 화합물 2의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 2는, 실시예 1에 있어서의 화합물 2'의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 3은, 실시예 3에 있어서의 화합물 5의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 4는, 실시예 3에 있어서의 화합물 5'의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 5는, 실시예 5에 있어서의 화합물 8의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 6은, 실시예 5에 있어서의 화합물 8'의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 7은, 실시예 6에 있어서의 화합물 5의 정제 후의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 8은, 실시예 6에 있어서의 화합물 5의 정제 전후의 TLC도를 나타내고, 왼쪽이 정제 전, 오른쪽이 정제 후를 나타낸다.
도 9는, 실시예 7에 있어서의 화합물 10의 분액 세정 전(공정 A 종료 후)의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 10은, 실시예 7에 있어서의 화합물 10의 분액 세정 후(공정 B 종료 후)의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 11은, 실시예 7에 있어서의 화합물 8의 정제 후(공정 C 종료 후)의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 12는, 실시예 7에 있어서의 화합물 8 정제 전후의 TLC도를 나타내고, 왼쪽이 정제 전, 오른쪽이 정제 후를 나타낸다.
도 13은, 실시예 11에 있어서의 화합물 14의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 14는, 실시예 11에 있어서의 화합물 14'의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 15는, 실시예 13에 있어서의 화합물 17의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 16은, 실시예 13에 있어서의 화합물 17'의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 17은, 실시예 15에 있어서의 화합물 20의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 18은, 실시예 15에 있어서의 화합물 20'의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 19는, 실시예 16에 있어서의 화합물 20의 정제 후의 NMR 측정 결과를 나타낸다.
도 20은, 실시예 16에 있어서의 화합물 20의 정제 전후의 TLC도를 나타내고, 왼쪽이 정제 전, 오른쪽이 정제 후를 나타낸다.
본 발명에 있어서의 PEG 화합물이란, 에틸렌글리콜 사슬의 반복 구조를 갖는 화합물의 총칭이다. 또, PEG란, 에틸렌 옥시드의 개환 중합에 의해 얻어지는, 복수의 분자량을 갖는 다수의 PEG 화합물의 혼합물을 나타낸다. 이것과는 달리, 단분산 PEG란, 목적으로 하는 PEG 화합물이, 에틸렌글리콜을 원료로 한 축차 합성에 의해 얻어진 단일 분자량을 갖는 PEG 화합물이고, 바꾸어 말하면, 에틸렌글리콜 사슬 길이수(에틸렌 옥시드 단위의 반복 단위수)가 단일한 PEG 화합물이다.
단분산 PEG의 사슬 길이 연장 공정은, 트리틸기를 수산기의 보호기로서 사용하는 일반적인 사슬 길이 연장 반응을 실시하는 것이다. 사슬 길이 연장시에, 목적으로 하는 트리틸기를 1개 갖고, 다른 편말단이 수산기인 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG와 양 말단이 트리틸기이고, 특정 사슬 길이수를 갖는 단분산 PEG인 디트리틸화 불순물과의 혼합물이 얻어진다. 본 발명은, 이 혼합물 중에서, 식 (2)의 디트리틸화 불순물을 분리하여, 식 (1)의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG를 얻는다.
이하에 본 발명을 실시함에 있어서, 바람직한 조건에 관해 기재한다. 그러나, 이들 양태는, 본 발명의 설명을 목적으로 하여, 클레임에 의해 정의된 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 에틸렌글리콜 사슬 길이수 n은 3 이상, 48 이하이고, 바람직하게는 4 이상, 24 이하이고, 보다 바람직하게는 4이상, 20 이하이고, 특히 바람직하게는 8 이상, 12 이하이다. 대응하는 디트리틸화 불순물 사슬 길이수 m 은 3 이상, 92 이하이고, 바람직하게는 4 이상, 44 이하이고, 보다 바람직하게는 4 이상, 36 이하이고, 특히 바람직하게는 4 이상, 20 이하이다.
본 발명의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG는 분기 구조를 갖지 않는 직사슬형의 단분산 PEG이다.
본 발명의 분액 추출시에 사용하는 각 유기 용제는, 친수성이 강한 용제로부터 약한 용제를 향하여 차례로, 이하의 유기 용제 I∼III의 각 군으로 분류한다.
유기 용제 I:
메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올을 예로 하는 합계 탄소수 3 이하의 수용성 또한 친수성 알코올 용제이고, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 및 프로판올이고, 보다 바람직하게는 메탄올이다.
유기 용제 II:
벤젠, 톨루엔, 자일렌을 예로 하는 합계 탄소수 8 이하의 방향족 탄화수소 용제이고, 바람직하게는 톨루엔 또는 자일렌이고, 보다 바람직하게는 톨루엔이다.
유기 용제 III:
펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸을 예로 하는 합계 탄소수 10 이하의 포화 지방족 탄화수소 용제이고, 바람직하게는 펜탄, 헥산 또는 헵탄이고, 보다 바람직하게는 헥산이다.
(공정 (A))
이염기산 무수물을 사용하여, 사슬 길이 연장 공정에서 얻어진 단분산 PEG 혼합물 중의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 수산기를 이염기산 에스테르로 변환하는 에스테르화 반응 공정이다. 얻어진 에스테르 화합물은, 에스테르 구조 및 카르복실기를 갖는다.
상기 에스테르화 반응은 이염기산 무수물과 염기 촉매를 사용하여 실시한다.
사용하는 이염기산 무수물은, 숙신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물, 메틸숙신산 무수물, 메틸글루타르산 무수물, 말레산 무수물, 프탈산 무수물, 타르타르산 무수물을 예로 하는 이염기산 무수물이고, 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 친수성을 향상시키기 위해, 개환시의 메틸렌 사슬 탄소수 3 이하이고 분기 사슬을 갖지 않는 숙신산 무수물 및 글루타르산 무수물이 바람직하고, 보다 바람직하게는 숙신산 무수물이다. 이염기산 무수물은 용제 및 원료에 포함되는 물에 의해 개환되어, 이염기산이 되기 때문에, 소과잉(small excess) 첨가하는 것이 좋다. 통상 몰비로 1.0∼3.0배이고, 보다 바람직하게는 1.0∼2.0배이다. 과잉량이 많은 경우, 이후의 추출 공정에서 수용액의 산성도가 높아져, 트리틸기의 탈리의 위험성이 있다.
염기 촉매는 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG에 대해 몰비로 0.01∼1.0배량 첨가하는 것이 바람직하고, 바람직하게는 0.5∼1.0배량이다. 염기 촉매는 이염기산 무수물이 물에 의해 개환되어 생성되는 이염기산의 중화에 소비되기 때문에, 촉매의 첨가량이 적은 경우에는 반응이 느려지는 경향이 있다. 또 염기 촉매가 부족하여, 용액 중의 이염기산이 증가했을 경우 트리틸기의 탈리의 위험성이 있다.
상기 에스테르화 반응은 용제 중에서 실시할 수 있고, 유기 용제 II 에서 선택되는 용제를 사용한다. 상기 용제의 사용량은 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG에 대해 1.0∼2.0질량배가 바람직하다.
상기 에스테르화 반응은, 통상은 0℃∼120℃ 사이에서 실시하고, 바람직하게는 30℃∼110℃, 보다 바람직하게는 50℃∼80℃ 이다. 온도가 낮으면 반응 속도가 느려지는 경향이 있고, 높으면 트리틸기가 탈리되는 경향이 있다. 반응 시간은 상기 반응 조건에 따라 상이하지만 통상 1∼48시간 정도가 바람직하다.
반응 후에는, 용액 중에 잔존하는 이염기산 무수물 유래의 이염기산 및 염기 촉매를 제거해도 된다. 그 경우는 유기 용제 II를 사용하여 반응액을 희석 후, 염 농도를 조정한 식염수에 의해 추출을 실시하여, 수층에 이염기산 및 염기 촉매를 제거한다.
상기 수용액의 염 농도는 단분산 PEG의 수층에 대한 분배가 없으면 특별히 한정되지 않지만, 통상은 첨가 수용액에 대하여 5∼25질량％, 바람직하게는 15∼25질량％의 농도이다. 또 추출 온도는 각 용액의 분층성의 개선을 실시하기 위해, 통상은 10℃∼80℃, 바람직하게는 30℃∼60℃의 범위에서 실시한다. 추출 온도가 낮으면 단분산 PEG 에스테르 화합물의 수층에 대한 분배가 향상되어, 유화되는 경향이 있고, 추출 온도가 높으면 트리틸기의 탈리가 일어나는 경향이 있다.
공정 (A)에서는, 이와 같은 에스테르화 반응에 의해 카르복실산 말단을 함유하는 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 이염기산 에스테르가 얻어진다. 이염기산 무수물로서 숙신산 무수물 혹은 글루타르산 무수물을 사용한 경우에는, 식 (3)에 나타내는 구조의 단분산 PEG 에스테르 화합물(카르복실산 유도체)과 디트리틸화 불순물의 혼합물이 얻어진다. 이 에스테르 화합물은, 에스테르 구조 및 카르복실기를 갖는다.
Figure pct00004
(n은 에틸렌 옥시드 단위의 반복 단위수이며, 3 이상, 48 이하의 정수이다. x는, 사용한 이염기산 무수물에 의해 바뀌는 정수이고, 2 혹은 3 이다.)
상기 공정 (A)에서의 트리틸기의 탈리는, 에스테르화 반응시에 디트리틸화 불순물의 말단에 대해 발생한 경우에는, 에틸렌글리콜 사슬 길이가 상이한 단분산 PEG 에스테르 화합물이 부생하게 되어, 본 발명에 의해 분리 불가능한 신규 불순물이 되기 때문에 주의를 필요로 한다.
(공정 (B))
상기 공정 (A)에서 얻어진 혼합물 용액에 대해, 유기 용제 I, II, III으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유기 용제 및 수용액을 첨가하고, 교반이나 진탕 등에 의해 혼합하며, 일정 시간 이것을 정치시킴으로써, 수층에 상기 단분산 PEG 에스테르 화합물을, 유기층에 디트리틸화 불순물을 분리시켜, 추출 정제를 실시하는 공정이다.
단분산 PEG 에스테르 화합물은 소수성인 트리틸기 및 친수성인 카르복실산을 함유하고, 양 친매성 화합물 특유의 용해성을 나타낸다. 이 때문에, 에틸렌글리콜 사슬 길이수에 따라 다르기도 하지만, 단분산 PEG 에스테르 화합물은 친수성 유기 용제 이외의 물/유기 용제에 대해서는 균일 용액이 되기 어렵다. 한편, 분리하는 대상인 디트리틸화 불순물은 소수성 관능기만을 갖지만, 에틸렌글리콜 사슬 유래의 친수성을 나타내기 때문에, 친수성 용제에도 가용이다. 각각의 용해성은 이하와 같이 된다.
단분산 PEG 에스테르 화합물의 용해성.
유기 용제 I > 유기 용제 II ≒ 물 >>> 유기 용제 III
디트리틸화 불순물의 용해성.
유기 용제 I > 유기 용제 II > 유기 용제 III > 물
상기 단분산 PEG 에스테르 화합물을 수층에 추출하기 위해는 카르복실산을 이온화시켜, 수용성을 향상시킬 필요가 있다. 그러나, 이온화했을 경우에도 전술한 바와 같이 수층에 균일하게 잘 용해되지 않아 유화 상태로 되어 있으며, 유화의 억제에는, 유기 용제 I의 첨가, 혹은 가온, 혹은 유기 용제 I의 첨가 및 가온을 필요로 한다.
한편, 단분산 PEG 에스테르 화합물의 이염기산 에스테르 부분은 염기성 조건하에서 용이하게 가수분해를 받는다. 이로써 원료의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG로 분해되고, 계속되는 추출 조작에 의해 유기층으로 분배되어 손실된다.
이상으로부터, 단분산 PEG 에스테르 화합물의 분액 추출 정제에 사용하는 수용액의 pH는, pH3∼7, 바람직하게는 pH5∼7의 약산성-중성 조건이다. 단분산 PEG 에스테르 화합물이 용해된 수층은, pH3∼7, 바람직하게는 pH5∼7의 약산성-중성 조건이다.
단분산 PEG 에스테르 화합물을 이온화시키기 위해서는, pH를 조정한 수용액을 수층으로서 첨가한다. pH를 조정하기 위해서 사용하는 염은, 카르복실산을 이온화 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 통상은 인산염, 아세트산염, 탄산염, 중탄산염, 붕산염, 시트르산염, 프탈산염, 타르타르산염 또는 락트산염 등의 유기염 및 무기염이 포함된다. 또, 이들 복수의 유기염이나 무기염을 조합하여 사용해도 된다.
상기 염의 농도는, 단분산 PEG 에스테르 화합물의 분액 추출 정제에 사용하는 수용액의 pH가 3∼7이면 특별히 한정되지는 않지만, 염 농도가 지나치게 높으면 유기 용제와의 추출 세정시에 수층에 단분산 PEG 에스테르 화합물을 유지할 수 없고, 또 후술하는 유기 용제 I과의 혼합시에 염이 석출되기 때문에, 물에 대해 10질량％ 이하, 바람직하게는 5질량％ 이하이다.
상기 이온화한 단분산 PEG 에스테르 화합물의 용해성은, 유기 용제 I > 수용액 > 유기 용제 II >>> 유기 용제 III이 된다. 한편, 디트리틸화 불순물의 용해성은, 유기 용제 I > 유기 용제 II > 유기 용제 III > 수용액이다. 이로써 각 화합물의 수층 및 유기층에 대한 분배의 차가 명확해져, 분액 추출에 의한 정제가 가능해진다.
디트리틸화 불순물의 분리에는, 상기 수층으로부터 유기 용제 II를 사용하여 디트리틸화 불순물의 추출을 실시할 필요가 있다. 그러나, 유기 용제 II에는 단분산 PEG 에스테르 화합물도 가용이고, 유기 용제 II만을 유기층으로서 사용한 경우에는 단분산 PEG 에스테르 화합물의 손실이 생긴다. 그래서, 단분산 PEG 에스테르 화합물이 불용의 유기 용제 III을 첨가하여, 단분산 PEG 에스테르 화합물의 손실을 저감시킴으로써 디트리틸화 불순물의 선택성을 향상시켜, 효율적으로 디트리틸화 불순물을 유기층에 추출·분리하는 것이 가능해진다.
바람직한 각 유기 용제의 혼합 비율은, 정제하는 단분산 PEG의 에틸렌글리콜 사슬 길이수에 의존한다. 단분산 PEG 에스테르 화합물은 에틸렌글리콜 사슬 길이가 짧을수록 소수성인 트리틸기의 영향을 강하게 받아, 수층으로 유지하는 것이 어려워진다. 따라서, 사슬 길이가 짧을수록, 유기층 I 및 유기층 III의 혼합 비율을 끌어올릴 필요가 있다.
한편, 디트리틸화 불순물은 에틸렌글리콜 사슬 길이가 길수록 친수성인 에틸렌글리콜 사슬의 영향을 강하게 받아, 소수성이 저하되고, 수층과의 친화성이 상승한다. 따라서, 사슬 길이가 길수록 유기 용매 II의 혼합 비율을 끌어올려, 디트리틸화 불순물의 유기층측으로의 추출 효율을 끌어올릴 필요가 있다.
추출시의 수용액의 양은 원료의 단분산 PEG 화합물에 대해 통상은 0.5∼10질량배이고, 바람직하게는 1∼5질량배이다. 수층의 유화를 억제하기 위해서 유기 용제 I를 첨가하는 경우에 필요로 하는 용제량은, 통상은 수층의 0.3∼4질량배이고, 보다 바람직하게는 수층의 0.8∼2.4질량배이다. 유기 용제 II 및 III, 혹은 유기 용제 II로 이루어지는 용액의 합계 질량은, 수용액 혹은 수용액과 유기 용제 I로 이루어지는 용액의 합계 질량에 대해 통상은 0.3∼2배이고, 보다 바람직하게는 0.7∼1.2배이다.
유기 용제의 혼합 비율은, 유기 용제 I:0∼55％, 유기 용제 II:15∼75％, 유기 용제 III:0∼50％(모두 질량％)가 바람직하고, 보다 바람직한 혼합 비율은 유기 용제 I:15∼55％, 유기 용제 II:15∼75％, 유기 용제 III:0∼50％(모두 질량％)이다.
사슬 길이마다의 바람직한 혼합 비율은, 에틸렌글리콜 사슬 길이 3∼7에서는, 유기 용제 I:25∼55％, 유기 용제 II:15∼45％, 유기 용제 III:20∼50％(모두 질량％)이고, 보다 바람직하게는 유기 용제 I:35∼45％, 유기 용제 II:25∼35％, 유기 용제 III:30∼40％(모두 질량％)이다.
에틸렌글리콜 사슬 길이 8∼24에서는, 유기 용제 I:20％∼50％, 유기 용제 II:30％∼70％, 유기 용제 III:0％∼45％(모두 질량％)가 바람직하고, 보다 바람직하게는 유기 용제 I:25∼45％, 유기 용제 II:40∼60％, 유기 용제 III:5∼25％이고, 더욱 바람직하게는 유기 용제 I:27.5∼32.5％, 유기 용제 II:47.5∼52.5％, 유기 용제 III:17.5∼22.5％(모두 질량％)이다.
에틸렌글리콜 사슬 길이 25∼48에서는, 유기 용제 I:0∼45％, 유기 용제 II:45∼75％, 유기 용제 III:0∼35％(모두 질량％)가 바람직하고, 보다 바람직하게는 유기 용제 I:25∼35％, 유기 용제 II:55∼65％, 유기 용제 III:15∼25％(모두 질량％)이다.
상기 추출 정제시의 온도는, 낮으면 수층의 유화를 해제할 수 없고, 지나치게 높으면 유기 용제가 휘발되므로, 통상은 0-60℃이고, 바람직하게는 30-60℃이고, 보다 바람직하게는 45-55℃이다.
(공정 (C))
추출 후의 수층에 염기를 첨가하여, 이염기산 에스테르의 가수분해 반응을 실시하여, 단분산 PEG 에스테르 화합물을 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG로 되돌린 후에 단분산 PEG를 유기층에 추출하여 회수하는 공정이다.
단분산 PEG 에스테르 화합물을 포함한 수용액에 염기를 첨가하여, 가수분해를 실시한다. 수용액에 염기 화합물을 첨가하고, 수층의 pH를 9 이상으로 유지하고, 염기성 하의 가수분해 반응을 실시하여, 에스테르를 분해시키는 것이 바람직하다.
가수분해 반응에서 사용하는 염기는 pH9 이상으로 조정 가능한 염기이면 제한은 없지만, 바람직하게는 구핵성을 갖는 강염기이다. 구체적으로는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이고, 더욱 바람직하게는 수산화나트륨이다.
가수분해 반응 후의 수용액에 유기 용제를 첨가하고, 목적물을 유기층에 추출하여 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG를 회수한다. 농축·결정화·건조 중 어느 것을 포함하는 공정에 의해 편말단 트리틸 함유 단분산 PEG를 얻는다.
편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG 회수시에 사용하는 유기 용제는 톨루엔, 자일렌, 클로로포름, 디클로로메탄, 디클로로에탄에서 선택되는 유기 용제이고, 바람직하게는 톨루엔, 클로로포름, 디클로로메탄이고, 보다 바람직하게는 톨루엔이다.
실시예
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 원료에 사용되는 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG는, 특허문헌 1을 참고로 하여 실시예 1-5 및 10-15에 있어서 합성했다. 얻어진 8량체, 12량체 및 24량체의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG에는 복수의 디트리틸화 불순물이 포함되고, 함유량의 정확한 정량은 곤란하지만, 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 수산기를, 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하여 라벨화하여, 얻어진 화합물의 1H-NMR 측정 결과로부터, 각 단계에서 포함되는 디트리틸화 불순물의 함량을 개산했다. 실시예 6-9 및 16에서는, 상기 실시예에서 얻어진 8량체, 12량체 및 24량체의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 정제를 실시하여, 디트리틸화 불순물의 제거를 확인했다.
또한 각 실시예의 반응에 있어서는, 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 정확한 몰수가 분명하지 않기 때문에, 전체량이 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG라고 가정하여, 시약 당량을 산출했다.
본 발명에서 얻어지는 단분산 PEG의 측정에 대해서는, 1H-NMR 분석에서는 JEOL Datum Co., Ltd. 제조 JNM-ECP400 또는 JNM-ECA600을 사용했다. 측정에는 φ5㎜ 튜브를 사용하고, 중수소화 용매로서 CDCl3을 사용하고, 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 사용했다.
TLC 분석에서는, 머크 밀리포어사 제조 TLC 유리 플레이트 실리카 겔 60 F254를 사용하고, 특별히 기재가 없는 경우에는 전개 용매로서 클로로포름:메탄올=85:15(체적 비율) 혹은 클로로포름:메탄올=9:1(체적 비율)을 사용했다. 표품에 사용한 화합물과의 요오드 정색(iodine coloration)에 있어서의 스폿의 비교를 실시하여, 평가했다. 실시예 6-9 및 16에 있어서의 공정 (A)의 에스테르화 반응 및 공정 (B)의 분액 추출에 의한 디트리틸화 불순물의 제거의 확인에는 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG를 표품으로서 사용했다. 또, 공정 (C)의 에스테르의 가수분해 반응의 확인에는, 단분산 PEG 에스테르 화합물을 사용했다.
(실시예 1 화합물 2의 합성)
Figure pct00005
4구 플라스크에 테트라에틸렌글리콜 1(2,000㎖, 11.5㏖)을 넣고, 톨루엔(500㎖×2회)을 사용하여 공비 탈수를 2회 실시했다. 가지형 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 피리딘(180㎖, 2.2㏖) 및 트리틸클로라이드(TrtCl, 400g, 1.4㏖)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 교반했다. 3시간 후, 박층 크로마토그래피(TLC, 헥산:아세트산에틸=1:1(체적비))를 사용하여 TrtCl의 소실을 확인하고, 이온 교환수 2,000㎖를 첨가했다. 얻어진 혼합액에 톨루엔 1,000㎖를 첨가한 후에 분액하고, 유기층을 이온 교환수/포화 식염수의 혼합 용액 1,000㎖(이온 교환수:포화 식염수=4:1(체적비))로 1회, 1M 염산 수용액 500㎖로 1회, 포화 식염수 500㎖로 4회 세정했다. 얻어진 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과하며, 여과액에 톨루엔(500㎖×3회)을 첨가하고 공비 탈수를 3회 실시하여, 담황색 투명 액체의 화합물 2를 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정 결과(도 1)에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3도 포함되어 있는 것을 확인했다.
화합물 2
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.4 (1H, t, -C-(OCH2CH2)4-OH),
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (14H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )3-OH, 화합물 3 유래를 포함한다),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3 유래를 포함한다)
수량: 633g
Figure pct00006
얻어진 화합물 2를 함유하는 반응 생성물에 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하고, 수산기를 라벨화한 화합물 2'의 1H-NMR 측정 결과(도 2)로부터, 화합물 3은 약 7㏖％포함되어 있는 것을 확인했다.
δ3.23 피크를 기준으로 했을 경우의 화합물 3 함유량 산출식:
(((2-[δ 4.38])/4H)/([δ 4.38]/2H)) x 100 (mol%)
화합물 2'
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (12H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )2-OCH 2 CH2-OCO-, 화합물 3 유래를 포함한다)
4.38 (2H, t, - OCH2CH 2 -OCO-NH-COCCl3),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3 유래를 포함한다)
(실시예 2 화합물 4의 합성)
Figure pct00007
가지형 플라스크에 상기 화합물 2를 함유하는 반응 생성물(화합물 2:628g, 0.14㏖ 미만) 및 테트라하이드로푸란(THF) 2,000㎖를 넣고, 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 수용액(200g, 5.0㏖/600㎖)을 첨가하고, 0℃에서 20분간 교반했다. 반응 혼합액에 토실클로라이드(TsCl)/THF 용액(300g, 1.6㏖/600㎖)을 30분에 걸쳐 적하하고, 혼합물을 0℃에서 4시간 교반했다. 4시간 후, TLC(헥산:아세트산에틸=1:1(체적비))를 사용하여 화합물 2의 소실을 확인한 후, 미반응의 TsCl을 소실시키기 위해, 실온에서 15시간 교반했다. 15시간 후, TLC로 TsCl의 소실을 확인하고, 이온 교환수 300㎖와 디에틸에테르 500㎖를 첨가했다. 혼합액을 포화 중탄산나트륨 수용액 500㎖로 1회, 포화 식염수 500㎖로 3회 세정했다. 유기층에 활성탄 5.0g과 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 4를 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3도 포함되어 있는 것을 확인했다.
수량:818g
(실시예 3 사슬 길이 8의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 5)의 합성)
Figure pct00008
2 구 가지형 플라스크에 수소화나트륨(81g)을 넣고, 내부를 질소 치환했다. 탈수 헥산(500㎖×2회)으로 2회 세정하고, THF 1,800㎖를 첨가하고 0℃로 냉각시켰다. 여기에 톨루엔 500㎖로 3회 공비 탈수한 테트라에틸렌글리콜 1(2,000㎖, 11.5㏖)을 적하 깔때기에 넣고, 30분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 톨루엔 500㎖로 3회 공비 탈수한 상기 실시예 2에서 얻어진 화합물 4를 함유하는 반응 생성물(화합물 4:813g, 1.4㏖ 미만)에 THF 1,000㎖를 혼합하고, 동일한 적하 깔때기에 넣고, 15분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 반응 혼합액을 40℃로 승온시키고, 19시간 교반했다. 19시간 후, TLC(아세트산에틸)를 사용하여 화합물 4가 소실된 것을 확인하고, 혼합물을 실온으로 방랭했다. 반응 혼합액에 이온 교환수 2,000㎖ 및 포화 식염수 2,000㎖를 첨가하고, 층을 분액했다. 수층에 디에틸에테르 500㎖를 첨가하고 추출했다. 분액한 유기층을 혼합하고, 이온 교환수/포화 식염수의 혼합 용액 500㎖(이온 교환수:포화 식염수=1:1(체적비))로 1회, 포화 식염수 500㎖로 5회 세정했다. 유기층에 활성탄 5.0g과 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 5를 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정 결과(도 3)에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3 및 6도 포함되어 있는 것을 확인했다.
화합물 5
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.58 (1H, t, -C-(OCH2CH2)8-OH),
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (30H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )3-OH, 화합물 3,6 유래를 포함한다)
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3,6을 포함한다)
수량: 788g
Figure pct00009
얻어진 화합물 5를 함유하는 반응 생성물에 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하고, 수산기를 라벨화한 화합물 5'의 1H-NMR 측정 결과(도 4)로부터, 화합물 3 및 6 은 약 12㏖％(화합물 3:7㏖％, 화합물 6:5㏖％, 개산) 포함되어 있는 것을 확인했다.
δ3.23 피크를 기준으로 했을 경우의 화합물 3, 6 함유량 산출식:
(((2-[δ4.42])/4H)/([δ4.42]/2H))×100(㏖％)
화합물 3의 함유량은 실시예 1의 수치를 적용
화합물 5'
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (28H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )6-OCH 2 CH2-OCO-, 화합물 3, 6 유래를 포함한다)
4.42 (2H, t, - OCH2CH 2 -OCO-NH-COCCl3),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2-, 화합물 3, 6 유래를 포함한다)
(실시예 4 화합물 7의 합성)
Figure pct00010
가지형 플라스크에 실시예 3에서 합성한 화합물 5를 함유하는 반응 생성물(화합물 5:598g, 0.83㏖ 미만) 및 톨루엔(2,450㎖)을 넣고, 가지형 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 트리에틸아민(139㎖, 1.00㏖)을 첨가했다. 0℃에서 염화메탄술포닐(71㎖, 0.92㏖)을 적하하고, 실온에서 2시간 교반했다. 2시간 후, TLC 측정에 의해 화합물 5의 소실을 확인하고, 1M HClaq. 700㎖를 첨가하고, 층을 분액했다. 유기층을 1M HCl aq. 700㎖로 1회, 포화 중탄산나트륨 수용액 700㎖로 2회, 포화 식염수 700㎖로 1회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 7을 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3 및 6도 포함되어 있는 것을 확인했다.
수량:561g
(실시예 5 사슬 길이 12의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 8)의 합성)
Figure pct00011
2구 가지형 플라스크에 수소화나트륨(46g)을 넣고, 내부를 질소 치환했다. 탈수 헥산(350㎖×2회)으로 2회 세정하고, MeCN 1,400㎖를 첨가하고 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔 2,450㎖로 3회 공비 탈수한 테트라에틸렌글리콜 1(1,120㎖, 6.5㏖)에 MeCN 350㎖를 혼합하고, 적하 깔때기에 넣고 30분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 톨루엔 350㎖로 3회 공비 탈수한 상기 실시예 4에서 얻어진 화합물 7을 함유하는 반응 생성물(화합물 7:561g, 0.81㏖ 미만)에 MeCN 350㎖를 혼합하고, 동일한 적하 깔때기에 넣고 15분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 반응 혼합액을 80℃로 승온시키고, 3시간 교반했다. 3시간 후, 1H-NMR(CDCl3)에 의해 화합물 7이 소실된 것을 확인하고, 혼합물을 실온으로 방랭했다. 반응 혼합액을 감압 농축하고, 잔류물에 톨루엔 1400㎖를 첨가했다. 이 톨루엔 용액을 포화 염화암모늄 수용액 700㎖로 2회, 포화 식염수 700㎖로 3회 세정했다. 유기층에 황산 나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체의 화합물 8을 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정 결과(도 5)에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6 및 9 도 포함되어 있는 것을 확인했다.
화합물 8
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.57 (1H, b, -C-(OCH2CH2)12-OH,
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (46H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )11-OH, 화합물 3,6, 9 유래를 포함한다)
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9를 포함한다)
수량: 598g
Figure pct00012
얻어진 화합물 8을 함유하는 반응 생성물에 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하고, 수산기를 라벨화한 화합물 8'의 1H-NMR 측정 결과(도 6)로부터, 화합물 3, 6 및 9 는 약 15㏖％(화합물 3:7㏖％, 화합물 6:5㏖％, 화합물 9:3㏖％, 개산) 포함되어 있는 것을 확인했다.
δ3.23 피크를 기준으로 했을 경우의 화합물 3, 6, 9 함유량 산출식:
(((2-[δ4.42])/4H)/([δ4.42]/2H))×100(㏖％)
화합물 3, 6의 함유량은 실시예 1, 3의 수치를 적용
화합물 8'
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (44H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )11-OCH 2 CH2-OCO-, 화합물 3, 6, 9 유래를 포함한다)
4.42 (2H, t, - OCH2CH 2 -OCO-NH-COCCl3),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9 유래를 포함한다)
(실시예 6 사슬 길이 8의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 5)의 정제)
Figure pct00013
(공정 (A))
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 화합물 5를 주성분으로 하는 혼합물(38g, 62m㏖, 실시예 3으로부터 화합물 3, 6 합계 약 12㏖％, 약 17질량％함유), 아세트산나트륨(3g, 37m㏖), 톨루엔(38g)을 첨가했다. 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 무수 숙신산(7g, 68m㏖)을 첨가했다. 혼합물을 70℃에서 1시간 교반했다. 1시간 후에 TLC 측정에 의해, 화합물 5의 소실을 확인하고, 전체를 40℃ 이하로 냉각시켰다. 톨루엔(61g)을 첨가 후, 23.4wt％ 식염수(228g)를 첨가하고, 55℃에서 합계 3회 분액 세정했다.
(공정 (B))
유기층에 헥산(38g), 메탄올(61g), pH5.5 시트르산인산(0.2M) 버퍼(60.8g)를 주입하고, 분층시켰다. 백탁된 수층의 pH가 6-7인 것을 확인하고, 45∼50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층이 투명한 것을 확인하고, 유기층을 폐기했다. 톨루엔(99g), 헥산(38g)을 수층에 첨가하고, 45-50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층으로 분층 후, 유기층을 폐기했다. 또한 2회, 톨루엔(99g), 헥산(38g)을 첨가하여 분액 세정을 실시 후, TLC 측정으로부터 디트리틸화 불순물(3, 6, 9) 유래의 스폿이 소실된 것을 확인했다.
분액 세정시 용제 질량비:
유기 용제 I:유기 용제 II:유기 용제 III=30.8％:50.0％:19.2％
(공정 (C))
세정 후 수층(pH6.3)에 400g/L의 수산화나트륨 수용액(11g)을 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 2시간 교반했다. 2시간 후의 수층(pH12.8)의 TLC 측정으로부터, 화합물 11이 소실되어 있는 것을 확인했다.
수층에 톨루엔(331g)을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 15분 교반했다. 정치시키고, 분층을 확인 후, TLC 측정으로부터 화합물 5가 수층에 잔존하고 있지 않은 것을 확인하고, 수층을 폐기했다. 유기층에 20wt％ 식염수(228g)를 첨가하고, 30℃에서 분액 세정했다. 회수한 유기층을 황산나트륨(38g)으로 탈수하고, 톨루엔을 사용하여 여과 후 농축하여, 화합물 5(21g)를 얻었다. NMR 측정 결과(도 7)의 적분값이 이론값과 일치하고, 정제 전후의 화합물 5의 TLC 결과 비교(도 8)로부터 디트리틸화 불순물이 포함되지 않은 것을 확인했다.
디트리틸화 불순물 3, 6 N.D.(TLC 측정, 도 8 참조), 수량 21g, 수율 67％
화합물 5 (정제 후)
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.52 (1H, s, -C-(OCH2CH2)8-OH)
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 -),
3.45-3.85 (30H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )7-OH),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-O-CH2-)
(실시예 7 사슬 길이 12의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 8)의 정제)
Figure pct00014
(공정 (A))
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 화합물 8을 주성분으로 하는 혼합물(145g, 화합물 8: 184m㏖, 실시예 5로부터 디트리틸화 불순물 3, 6, 9 합계 약 15㏖％, 약 18질량％ 함유), 아세트산나트륨(9g, 110m㏖), 톨루엔(145g)을 첨가했다. 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 무수 숙신산(20g, 202m㏖)을 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 1시간 교반했다. 1시간 후에 TLC 측정에 의해, 화합물 8의 소실을 확인하고, 40℃ 이하로 냉각시켰다. 톨루엔(232g)을 첨가 후, 23.4wt％ 식염수(870g)를 첨가하고, 55℃에서 합계 3회 분액 세정했다.
(공정 (B))
유기층에 헥산(145g), 메탄올(232g), pH5.5 시트르산인산(0.2M) 버퍼(232g)를 주입하고, 분층시켰다. 백탁한 수층의 pH가 5-6인 것을 확인하고, 45∼50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층이 투명한 것을 확인하고, 유기층을 폐기했다. 톨루엔(378g), 헥산(145g)을 수층에 첨가하고, 혼합물을 45-50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층으로 분층 후, 유기층을 폐기했다. 또한 2회, 톨루엔(378g), 헥산(145g)을 첨가하여 분액 세정을 실시 후, TLC 측정으로부터 디트리틸화 불순물(3, 6, 9) 유래의 스폿이 소실된 것, 분액 세정 후의 NMR 측정 결과가 이론값과 일치한 (세정 전:도 9, 세정 후:도 10) 것을 확인했다.
화합물 10 (정제 후)
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.62 (4H, m, -OCO-CH 2 CH 2 -COOH)
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 -),
3.45-3.85 (44H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )10-OCH 2 CH2-O-CO-),
4.25 (2H, t, -OCH2CH 2 -OCO-CH2CH2-),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-O-CH2-)
분액 세정시 용제 질량비:
유기 용제 I:유기 용제 II:유기 용제 III=30.7％:50.1％:19.2％
(공정 (C))
세정 후 수층(pH6.0)에 400g/L의 수산화나트륨 수용액(32g)을 첨가하고, 25℃에서 2시간 교반했다. 2시간 후의 수층(pH13)의 TLC 측정으로부터, 화합물 10이 소실되어 있는 것을 확인했다.
수층에 톨루엔(1260g)을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 15분 교반했다. 혼합물을 정치시키고, 분층을 확인 후, TLC 측정으로부터 화합물 8이 수층에 잔존하고 있지 않은 것을 확인하고, 수층을 폐기했다. 유기층에 20wt％ 식염수(870g)를 첨가하고, 30℃에서 분액 세정했다. 회수한 유기층을 황산나트륨(145g)으로 탈수하고, 톨루엔을 사용하여 여과 후 농축하고, 화합물 8(98g)을 얻었다. NMR 측정 결과(도 11)의 적분값과 이론값이 일치하고, 정제 전후의 화합물 8의 TLC 결과 비교(도 12)로부터 디트리틸화 불순물이 포함되지 않은 것을 확인했다.
디트리틸화 불순물 3, 6, 9 N.D.(TLC 측정, 도 12 참조), 수량 98g, 수율 82％
화합물 8 (정제 후)
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.57 (1H, s, -OCH2CH2-(OCH2CH2)11-OH)
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-),
3.45-3.85 (46H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )11-OH),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-O-CH2CH2-)
(실시예 8 사슬 길이 12의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG의 정제, 글루타르산 무수물 사용)
Figure pct00015
(공정 (A))
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 화합물 8을 주성분으로 하는 혼합물(30g, 38m㏖, 실시예 5로부터 디트리틸화 불순물 3, 6, 9 합계 약 15㏖％, 약 18질량％ 함유), 아세트산나트륨(1.9g, 23m㏖), 톨루엔(30g) 을 첨가했다. 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 무수 글루타르산(4.8g, 42m㏖)을 첨가했다. 70℃에서 1시간 교반했다. 1시간 후에 TLC 측정에 의해, 화합물 8의 소실을 확인하고, 전체를 40℃ 이하로 냉각시켰다. 톨루엔(48g)을 첨가 후, 23.4wt％ 식염수(180g)를 첨가하고, 55℃에서 합계 3회 분액 세정했다.
(공정 (B))
유기층에 헥산(30g), 메탄올(48g), pH5.5 시트르산인산(0.2M) 버퍼(48g)를 주입하고, 분층시켰다. 백탁한 수층의 pH가 5-6인 것을 확인하고, 45∼50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층이 투명한 것을 확인하고, 유기층을 폐기했다. 톨루엔(78g), 헥산(30g)을 수층에 첨가하고, 45-50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층으로 분층 후, 유기층을 폐기했다. 추가로 3회, 분액 세정을 실시 후, TLC 측정으로부터 디트리틸화 불순물(3, 6, 9) 유래의 스폿이 소실된 것을 확인했다.
분액 세정시 용제 질량비:
유기 용제 I:유기 용제 II:유기 용제 III=30.8％:50.0％:19.2％
(공정 (C))
세정 후, 수층(pH6.12)에 400g/L의 수산화나트륨 수용액(6.6g)을 첨가하고, 25℃에서 4시간 교반했다. 4시간 후의 수층(pH13.5)의 TLC 측정으로부터, 화합물 12가 소실되어 있는 것을 확인했다.
수층에 톨루엔(261g)을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 15분 교반했다. 혼합물을 정치시키고, 분층을 확인 후, TLC 측정으로부터 화합물 8이 수층에 잔존하고 있지 않은 것을 확인하고, 수층을 폐기했다. 유기층에 20wt％ 식염수(870g)를 첨가하고, 30℃에서 분액 세정했다. 회수한 유기층을 황산나트륨(30g)으로 탈수하고, 톨루엔을 사용하여 여과 후 농축하여, 화합물 8(15g)을 얻었다. NMR 측정 결과의 적분값이 이론값과 일치하고, 정제 전후의 화합물 8의 TLC 결과 비교로부터 디트리틸화 불순물이 포함되지 않은 것을 확인했다.
디트리틸화 불순물 N. D., 수량 15g, 수율 62％
(실시예 9 실시예 7의 유기 용제 III 비율이 높은 예)
실시예 7의 공정 (A)와 동일한 조작을 실시하여, 공정 (B)에 있어서의 용제의 비율이 메탄올(231g), pH5.5 시트르산인산(0.2M) 버퍼(222g), 톨루엔(378g), 헥산(290g)이 되도록 용제를 첨가했다. 이 용제 비율로 분액 세정을 실시하고, 그 후 톨루엔(378g), 헥산(290g)을 첨가하고 분액 세정 조작을 9회 반복했다. TLC 측정으로부터 디트리틸화 불순물(3, 6, 9) 유래의 스폿이 소실된 것을 확인했다.
분액 세정시 용제 질량비:
유기 용제 I:유기 용제 II:유기 용제 III=25.7％:42.0％:32.3％
공정 (C)는 실시예 7과 동일한 조작을 실시하여, 화합물 8(76g)을 얻었다.
NMR 측정 결과의 적분값과 이론값이 일치하고, 정제 전후의 화합물 8의 TLC 결과 비교로부터 디트리틸화 불순물이 포함되지 않은 것을 확인했다.
디트리틸화 불순물 N. D., 수량 76g, 수율 64％
(실시예 10 화합물 13의 합성)
Figure pct00016
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 실시예 3에 기재된 방법으로 합성한 화합물 8을 함유하는 반응 생성물(화합물 8:90g, 0.11㏖ 미만) 및 톨루엔(451㎖)을 넣고, 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 트리에틸아민(29㎖, 0.21㏖)을 첨가했다. 0℃에서 염화메탄술포닐(14㎖, 0.18㏖)을 적하하고, 혼합물을 실온에서 2시간 교반했다. 2시간 후, TLC 측정에 의해 화합물 8의 소실을 확인하고, 5％ 인산이수소나트륨 수용액 450㎖를 첨가하고 분액했다. 유기층을 5％ 인산이수소나트륨 수용액 450㎖로 1회, 포화 중탄산나트륨 수용액 450㎖로 2회, 포화 식염수 450㎖로 1회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 13을 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6 및 9도 포함되어 있는 것을 확인했다.
수량:96g
(실시예 11 사슬 길이 16의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 14)의 합성)
Figure pct00017
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 수소화나트륨(6.3g)을 넣고, 내부를 질소 치환 후, MeCN 192㎖를 첨가하고 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔 53㎖로 공비 탈수한 테트라에틸렌글리콜 1(108g, 0.56㏖)에 MeCN 96㎖를 혼합하고, 적하 깔때기에 넣고 30분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 상기 실시예 10에서 얻어진 화합물 13을 함유하는 반응 생성물(화합물 13:96g, 0.11㏖ 미만)에 MeCN 96㎖를 혼합하고, 생성물을 동일한 적하 깔때기에 넣고 15분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 반응 혼합액을 75℃로 승온시키고, 3시간 교반했다. 3시간 후, 1H-NMR(CDCl3)에 의해 화합물 13이 소실된 것을 확인하고, 혼합물을 40℃ 이하가 될 때까지 방랭했다. 반응 혼합액에 포화 염화암모늄 수용액 170㎖, 헥산 146㎖를 첨가하고, 분액했다. 헥산층(상층)을 제거한 하층을 감압 농축하고, 잔류물에 톨루엔 481㎖를 첨가했다. 이 톨루엔 용액을 포화 염화암모늄 수용액 260㎖로 1회, 포화 식염수 480㎖로 3회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 14를 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정 결과(도 13)에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6, 9 및 15도 포함되어 있는 것을 확인했다.
화합물 14
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.78 (1H, b, -C-(OCH2CH2)16-OH,
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (62H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )11-OH, 화합물 3, 6, 9, 15 유래를 포함한다)
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15을 포함한다)
수량: 103 g
Figure pct00018
얻어진 화합물 14를 함유하는 반응 생성물에 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하고, 수산기를 라벨화한 화합물 14'의 1H-NMR 측정 결과(도 14)로부터, 화합물 3, 6, 9 및 15는 약 19㏖％(화합물 3:7㏖％, 화합물 6:5㏖％, 화합물 9:3㏖％, 화합물 15:4㏖％, 개산) 포함되어 있는 것을 확인했다.
δ3.23 피크를 기준으로 했을 경우의 화합물 3, 6, 9, 15 함유량 산출식:
(((2-[δ4.43])/4H)/([δ4.43]/2H))×100(㏖％)
화합물 3, 6, 9 의 함유량은 실시예 1, 3, 5의 수치를 적용
화합물 14'
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (60H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )14-OCH 2 CH2-OCO-, 화합물 3, 6, 9, 15 유래를 포함한다)
4.43 (2H, t, - OCH2CH 2 -OCO-NH-COCCl3),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2-, 화합물 3, 6, 9, 15 유래를 포함한다)
(실시예 12 화합물 16의 합성)
Figure pct00019
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 실시예 11에서 합성한 화합물 14를 함유하는 반응 생성물(화합물 14:100g, 0.10㏖ 미만) 및 톨루엔(500㎖)을 넣고, 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 트리에틸아민(20㎖, 0.14㏖)을 첨가했다. 0℃에서 염화메탄술포닐(9.6㎖, 0.12㏖)을 적하하고, 실온에서 2시간 교반했다. 2시간 후, TLC 측정에 의해 화합물 14의 소실을 확인하고, 5％ 인산이수소나트륨 수용액 500㎖를 첨가하고, 층을 분액했다. 유기층을 5％ 인산이수소나트륨 수용액 500㎖로 1회, 포화 중탄산나트륨 수용액 500㎖로 2회, 포화 식염수 500㎖로 1회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 16을 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6, 9 및 15도 포함되어 있는 것을 확인했다.
수량:106g
(실시예 13 사슬 길이 20의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 17)의 합성)
Figure pct00020
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 수소화나트륨(5.7g)을 넣고, 내부를 질소 치환 후, MeCN 208㎖를 첨가하고 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔 48㎖로 공비 탈수한 테트라에틸렌글리콜 1(97g, 0.50㏖)에 MeCN 105㎖를 혼합하고, 생성물을 적하 깔때기에 넣고 30분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 상기 실시예 12에서 얻어진 화합물 16을 함유하는 반응 생성물(화합물 16:109g, 0.10㏖ 미만)에 MeCN 105㎖를 혼합하고, 동일한 적하 깔때기에 넣고 15분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 반응 혼합액을 75℃로 승온시키고, 3시간 교반했다. 3시간 후, 1H-NMR(CDCl3)에 의해 화합물 16이 소실된 것을 확인하고, 40℃ 이하가 될 때까지 방랭했다. 반응 혼합액에 포화 염화암모늄 수용액 190㎖, 헥산 159㎖를 첨가하고, 층을 분액했다. 헥산층(상층)을 제거한 하층을 감압 농축하고, 잔류물에 톨루엔 524㎖를 첨가했다. 이 톨루엔 용액을 포화 염화암모늄 수용액 285㎖로 1회, 포화 식염수 520㎖로 3회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 17을 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정 결과(도 15)에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6, 9, 15 및 18도 포함되어 있는 것을 확인했다.
화합물 17
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.64 (1H, b, -C-(OCH2CH2)20-OH,
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (78H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )19-OH, 화합물 3, 6, 9, 15, 18 유래를 포함한다)
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18을 포함한다)
수량: 109 g
Figure pct00021
얻어진 화합물 17을 함유하는 반응 생성물에 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하고, 수산기를 라벨화한 화합물 17'의 1H-NMR 측정 결과(도 16)로부터, 화합물 3, 6, 9, 15 및 18은 약 23㏖％(화합물 3:7㏖％, 화합물 6:5㏖％, 화합물 9:3㏖％, 화합물 15:4㏖％, 화합물 18:4㏖％, 개산) 포함되어 있는 것을 확인했다.
δ3.23 피크를 기준으로 했을 경우의 화합물 3, 6, 9, 15, 18 함유량 산출식:
(((2-[δ4.43])/4H)/([δ4.43]/2H))×100(㏖％)
화합물 3, 6, 9, 15의 함유량은 실시예 1, 3, 5, 11의 수치를 적용
화합물 17'
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (76H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )18-OCH 2 CH2-OCO-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18 유래를 포함한다)
4.43 (2H, t, - OCH2CH 2 -OCO-NH-COCCl3),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18을 포함한다)
(실시예 14 화합물 19의 합성)
Figure pct00022
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 실시예 13에서 합성한 화합물 17을 함유하는 반응 생성물(화합물 17:107g, 0.094㏖ 미만) 및 톨루엔(535㎖)을 넣고, 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 트리에틸아민(18㎖, 0.13㏖)을 첨가했다. 0℃에서 염화메탄술포닐(8.7㎖, 0.11㏖)을 적하하고, 실온에서 2시간 교반했다. 2시간 후, TLC 측정에 의해 화합물 17의 소실을 확인하고, 5％ 인산이수소나트륨 수용액 535㎖를 첨가하고, 층을 분액했다. 유기층을 5％ 인산이수소나트륨 수용액 535㎖로 1회, 포화 중탄산나트륨 수용액 535㎖로 2회, 포화 식염수 535㎖로 1회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 담황색 투명 액체의 화합물 19를 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6, 9, 15 및 18도 포함되어 있는 것을 확인했다.
수량:112g
(실시예 15 사슬 길이 24의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 20)의 합성)
Figure pct00023
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 수소화나트륨(5.2g)을 넣고, 내부를 질소 치환 후, MeCN 221㎖를 첨가하고 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔 44㎖로 공비 탈수한 테트라에틸렌글리콜 1(88g, 0.46㏖)에 MeCN 111㎖를 혼합하고, 생성물을 적하 깔때기에 넣고, 30분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 상기 실시예 14에서 얻어진 화합물 19를 함유하는 반응 생성물(화합물 19:113g, 0.092㏖ 미만)에 MeCN 111㎖를 혼합하고, 생성물을 동일한 적하 깔때기에 넣고 15분에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 반응 혼합액을 75℃로 승온시키고, 3시간 교반했다. 3시간 후, 1H-NMR(CDCl3)에 의해 화합물 19가 소실된 것을 확인하고, 혼합물을 40℃ 이하가 될 때까지 방랭했다. 반응 혼합액에 포화 염화암모늄 수용액 200㎖, 헥산 168㎖를 첨가하고, 층을 분액했다. 헥산층(상층)을 제거한 하층을 감압 농축하고, 잔류물에 톨루엔 556㎖를 첨가했다. 이 톨루엔 용액을 포화 염화암모늄 수용액 300㎖로 1회, 포화 식염수 555㎖로 3회 세정했다. 유기층에 황산나트륨을 첨가하고, 건조·여과했다. 여과액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체의 화합물 20을 함유하는 반응 생성물을 얻었다. 또, TLC 측정 및 NMR 측정 결과(도 17)에 의해, 얻어진 반응 생성물 중에는 상기 화합물 3, 6, 9, 15, 18 및 21도 포함되어 있는 것을 확인했다.
화합물 20
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.66 (1H, b, -C-(OCH2CH2)24-OH,
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21 유래를 포함한다),
3.45-3.85 (94H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )23-OH, 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21 유래를 포함한다)
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21을 포함한다)
수량: 115 g
Figure pct00024
얻어진 화합물 20을 함유하는 반응 생성물에 트리클로로아세틸이소시아네이트를 사용하고, 수산기를 라벨화한 화합물 20'의 1H-NMR 측정 결과(도 18)로부터, 화합물 3, 6, 9, 15, 18 및 21은 약 27㏖％(화합물 3:7㏖％, 화합물 6:5㏖％, 화합물 9:3㏖％, 화합물 15:4㏖％, 화합물 18:4㏖％, 화합물 21:4㏖％, 개산) 포함되어 있는 것을 확인했다.
δ3.23 피크를 기준으로 했을 경우의 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21 함유량 산출식:
(((2-[δ4.43])/4H)/([δ4.43]/2H))×100(㏖％)
화합물 3, 6, 9, 15, 18의 함유량은 실시예 1, 3, 5, 11, 13의 수치를 적용
화합물 20'
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21 유래를 포함한다 ),
3.45-3.85 (92H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )22-OCH 2 CH2-OCO-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21 유래를 포함한다)
4.43 (2H, t, - OCH2CH 2 -OCO-NH-COCCl3),
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-, 화합물 3, 6, 9, 15, 18, 21 유래를 포함한다)
(실시예 16 사슬 길이 24의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG(화합물 20)의 정제)
Figure pct00025
(공정 (A))
냉각관, 온도계, 질소 도입관을 장착한 4구 플라스크에 화합물 20을 주성분으로 하는 혼합물(97g, 74m㏖, 실시예 15로부터 디트리틸화 불순물 3, 6, 9, 15, 18, 21 합계 약 27㏖％, 약 30질량％함유), 아세트산나트륨(6.0g, 74m㏖), 톨루엔(97g)을 첨가했다. 플라스크 내를 질소 퍼지하고, 무수 숙신산(11g, 110m㏖)을 첨가했다. 70℃에서 4시간 교반했다. 4시간 후에 TLC 측정에 의해, 화합물 20의 소실을 확인하고, 40℃ 이하로 냉각시켰다. 톨루엔(155g)을 첨가 후, 23.4wt％ 식염수(582g)를 첨가하고, 55℃에서 1회 분액 세정했다.
(공정 (B))
유기층에 헥산(33g), 메탄올(226g), pH6.8 인산(0.3M) 버퍼(222g)를 주입하고, 분층시켰다. 백탁한 수층의 pH가 5-7인 것을 확인하고, 45∼50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층이 투명한 것을 확인하고, 유기층을 폐기했다. 톨루엔(252g)을 수층에 첨가하고, 45-50℃에서 15분 교반 후, 정치시켰다. 상하층으로 분층 후, 유기층을 폐기했다. 또한 2회, 분액 세정을 실시 후, TLC 측정으로부터 디트리틸화 불순물(3, 6, 9, 15, 18, 21) 유래의 스폿이 소실된 것을 확인했다.
분액 세정시 용제 질량비:
유기 용제 I:유기 용제 II:유기 용제 III=44.2％:49.3％;6.5％
(공정 (C))
세정 후, 수층(pH6.68)에 400g/L의 수산화나트륨 수용액(19g)을 첨가하고, 35℃에서 4시간 교반했다. 4시간 후의 수층(pH11.3)의 TLC 측정으로부터, 화합물 22가 소실되어 있는 것을 확인했다.
수층에 디클로로메탄(643g)을 첨가하고, 30℃에서 15분 교반했다. 정치시키고, 분층을 확인 후, TLC 측정으로부터 화합물 20이 수층에 잔존하고 있지 않은 것을 확인하고, 수층을 폐기했다. 유기층에 20wt％ 식염수(582g)를 첨가하고, 30℃에서 분액 세정했다. 회수한 유기층을 황산나트륨(97g)으로 탈수하고, 디클로로메탄을 사용하여 여과 후 농축하여, 화합물 20(68g)을 얻었다. NMR 측정 결과(도 19)의 적분값이 이론값과 일치하고, 정제 전후의 화합물 20의 TLC 결과 비교(도 20)로부터 디트리틸화 불순물이 포함되지 않은 것을 확인했다.
디트리틸화 불순물 N. D. (TLC 측정, 도 20 참조), 수량 68g, 수율:70％
화합물 20 (정제 후)
1H-NMR (CDCl3, 내부 표준 TMS); δ (ppm):
2.69 (1H, s, -OCH2CH2-(OCH2CH2)23-OH),
3.23 (2H, t, (C6H5)3C-OCH 2 CH2-),
3.45-3.85 (94H, m, -OCH2CH 2 -(OCH 2 CH 2 )23-OH)
7.21-7.47 (15H, m, (C6 H 5 )3C-OCH2CH2-)
상기 실시예 6-9 및 16으로부터, 사슬 길이 연장 공정 직후의 편말단 트리틸기 함유 단분산 PEG로부터 디트리틸화 불순물을 제거할 수 있는 것이 설명되었다.
또 실시예 9에서는, 디트리틸화 불순물의 제거가 가능하기는 하지만, 디트리틸화 불순물의 제거에 필요로 하는 분액 세정 횟수가 증가하여, 실시예 7에 비하면 수율이 저하되는 것이 설명되었다.
(비교예 1 수용액의 pH가 지나치게 높은 예)
실시예 7의 공정 (A)와 동일한 조작을 실시하고, 공정 (B)에 있어서의 용제의 비율이 중탄산나트륨(4wt％, pH8) 수용액(232g), 메탄올(232g), 톨루엔(378g), 헥산(145g)이 되도록 분액 추출을 실시했다. 수용액의 pH는 8이고, 본 발명의 범위 외로 되어 있다.
분액 추출 4회 실시 후에 TLC 측정으로부터 디트리틸화 불순물(3, 6, 9) 유래의 스폿이 소실된 것을 확인했지만, 분액 추출 중에 화합물 10이 가수분해되어, 화합물 8이 되고, 유기층에 추출되어 손실되었다.
공정 (C)는 실시예 1과 동일한 조작을 실시하여, 화합물 8(53g)을 얻었다. NMR 측정 결과의 적분값이 이론값과 일치하고, 정제 전후의 화합물 8의 TLC 결과 비교로부터 디트리틸화 불순물이 포함되지 않은 것을 확인했다.
디트리틸화 불순물 N.D., 수량 53g, 수율 45％
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 의약 용도에 적합한 고순도의 단분산 PEG가 얻어지는 신규한 정제법이 제공된다.
본 발명을 상세하게 또 특정한 실시양태를 참조하여 설명했지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나는 일 없이 여러 가지 변경이나 수정을 가할 수 있는 것은 당업자에게 있어서 분명하다.
본 출원은 2018년 3월 29일 출원의 일본 특허출원 2018-63421호에 기초하는 것이고, 그 내용은 여기에 참조로서 받아들여진다.

Claims (7)

  1. 하기 식 (1)로 표시되는 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜 및 하기 식 (2)로 표시되는 디트리틸화 불순물을 포함하는 혼합물로부터, 상기 디트리틸화 불순물을 분리하여 제거함으로써, 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 정제 방법으로서,
    하기 공정 (A), 공정 (B) 및 공정 (C)를 이 순서로 실시하는 것을 포함하는, 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 정제 방법.
    Figure pct00026

    (식 (1)에 있어서, n은 에틸렌 옥시드 단위의 반복 단위수이며, 3 이상, 48 이하이다)
    Figure pct00027

    (식 (2)에 있어서, m은 에틸렌 옥시드 단위의 반복 단위수이며, 3 이상, 92 이하이다)
    공정 (A) : 하기 유기 용제 II 중에서, 식 (1)로 표시되는 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 수산기를 이염기산 무수물과 반응시킴으로써, 에스테르 구조 및 카르복실기를 갖는 에스테르 화합물을 포함하는 반응 용액을 얻는 에스테르화 반응 공정
    공정 (B) : 상기 공정 (A)에서 얻어진 상기 반응 용액과, 하기 유기 용제 I, 유기 용제 II 및 유기 용제 III으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유기 용제와, pH3∼7의 수용액을 사용하여 분액 추출 정제를 실시함으로써 수층과 유기층을 분리하고, 식 (2)로 표시되는 상기 디트리틸화 불순물을 상기 유기층에 분배하고, 상기 에스테르 화합물을 상기 수층에 분배하는 추출 공정
    공정 (C) : 상기 수층에 염기를 첨가함으로써 상기 에스테르 화합물의 가수분해를 실시하여, 상기 트리틸기 함유 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 공정
    유기 용제 I : 탄소수 3 이하의 알코올 용제
    유기 용제 II : 합계 탄소수 8 이하의 방향족 탄화수소 용제
    유기 용제 III : 합계 탄소수 10 이하의 포화 지방족 탄화수소 용제
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 공정 (A)에 있어서, 상기 이염기산 무수물이, 숙신산 무수물 및 글루타르산 무수물로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기 용제 I이, 메탄올, 에탄올 및 프로판올에서 선택되는 1 종 이상의 용제이고, 상기 유기 용제 II가, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 용제이고, 상기 유기 용제 III이, 펜탄, 헥산 및 헵탄으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 용제인 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 (B)에 있어서의 상기 유기 용제의 혼합 비율은, 상기 유기 용제 I의 질량 비율이 15∼55질량％이고, 상기 유기 용제 II의 질량 비율이 15∼75질량％이고, 상기 유기 용제 III의 질량 비율이 0∼50질량％인 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 (B)의 상기 추출 공정 중의 온도가 0℃ 이상, 60℃ 이하인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 (B)의 상기 추출 공정을 반복하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 (C)에 있어서의 상기 염기가, 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 염기인 방법.
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