KR20200132849A - CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절 - Google Patents

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Abstract

CRISPR/Cas 시너지 활성화 매개자 시스템 구성요소를 포함하는 비인간 동물 세포 및 비인간 동물 및 이러한 비인간 동물 세포 및 비인간 동물을 제조 및 사용하는 방법이 제공된다. 생체내에서 표적 유전자의 발현을 증가시키고 생체내에서 표적 유전자의 발현을 증가시키는 능력에 대해 CRISPR/Cas 시너지 활성화 매개자 시스템을 평가하기 위하여 이러한 비인간 동물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 19일에 출원된 미국 출원 번호 62/644,961의 이익을 주장하며, 상기 출원은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 언급
파일 527578SEQLIST.txt로 쓰여진 서열 목록은 137 킬로바이트이고, 2019년 3월 19일에 생성되었으며, 본원에 참조로 포함된다.
유전자 발현은 많은 생물학적 과정, 예컨대 발달 및 질환에서 엄격하게 제어된다. 전사 인자는 표적 유전자의 인핸서 및 프로모터 영역에서 특정 DNA 서열에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하고, 그것의 이펙터 도메인을 통해 전사를 조절한다. 동일한 원리를 토대로, 인공 전사 인자 (ATF)가 다양한 기능성 도메인을 관심의 유전자에 결합하도록 조작된 DNA 결합 도메인에 융합시킴으로써 생성되었고, 그로써 그것의 전사가 조절되었다. 그러나, 이들 ATF의 결합 특이성은 보통 축퇴성이어서, 예측하기가 어려울 수 있고, 복잡하고 시간 소모적인 설계 및 생성은 그것의 적용을 제한한다.
CRISPR/Cas 기술은 유망한 새로운 치료 양식이고 표적화된 게놈 변형을 만들기 위해서뿐만 아니라 표적 유전자의 전사를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 도입된 CRISPR/Cas 제제의 효율을 생체내에서 평가하는 더 나은 수단이 필요하다. 시스템을 생체내에서 테스트할 때 한 가지 한계는 살아있는 유기체로 모든 구성요소를 동시에 도입할 필요가 있다는 것이다. 이들 구성요소를 도입시키는 전형적인 방법은 적절한 RNA 및 단백질을 생성할 세포 안으로 DNA 구성물을 일시적으로 트랜스펙션시키는 것이다. 이 접근법은 효과적이긴 하지만, 세포가 먼저 전사가 진행된 후 번역이 진행된 후에 Cas 단백질이 sgRNA 구성요소와 상호작용하기 위해 이용될 수 있는 플라스미드 DNA 구성물에 의존해야만 하기 때문에 고유한 단점을 갖는다. 도입된 CRISPR/Cas 제제의 활성을 보다 효과적으로 평가하고 생체내에서 특정 조직 또는 세포 유형을 표적화하기 위한 상이한 전달 방법 및 파라미터를 평가하기 위한 더 나은 방법 및 도구가 필요하다.
이에 더불어, CRISPR/Cas 제제와 같은 생물학적 활성제의 대상체로의 전달은 자주 표적 세포 또는 조직에 도달하는 구성요소의 어려움에 의해 방해를 받는다. 이들 제한은, 예를 들어, 결과를 달성하기 위해 바람직한 것보다 훨씬 더 높은 농도의 제제를 사용할 필요를 초래하고, 그것은 독성 효과 및 부작용의 위험을 증가시킨다. 개선된 전달 방법 및 그러한 전달 방법을 생체내에서 평가하는 방법이 필요하다.
개요
CRISPR/Cas 시너지 활성화 매개자 (synergistic activating mediator, SAM) 시스템을 포함하는 비인간 동물이 제공되며, 뿐만 아니라 생체내에서 표적 유전자의 전사를 활성화시키는 CRISPR/Cas SAM 제제의 능력을 평가하기 위하여 또는 생체내에서 표적 유전자의 전사를 활성화시키거나 발현을 증가시키는 효과를 평가하기 위하여 그러한 비인간 동물 (예컨대, SAM-준비된 비인간 동물)을 사용하는 방법이 제공된다. CRISPR/Cas 시너지 활성화 매개자 (SAM) 시스템을 포함하는 비인간 동물 게놈 또는 세포가 또한 제공된다.
한 측면으로, 하나 이상의 게놈상으로 통합된 시너지 활성화 매개자 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물이 제공된다. 그러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은, 예를 들어, 제1 게놈상으로 통합된 발현 카세트를 포함하며, 제1 발현 카세트는: (a) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 포함하는 키메라 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 관련 (Cas) 단백질을 암호화하는 핵산; 및 (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 어댑터를 포함하는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다.
그러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있고, 각각의 가이드 RNA는 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하며, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 그것을 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 발현 카세트는 아데노-관련 바이러스 (AAV), 예컨대 AAV8에 있다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 발현 카세트는 AAV에 있고, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 상이한 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함한다.
그러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 각각이 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 제2 게놈상으로 통합된 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있고, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 Cas 단백질과 복합체를 형성하여 그것을 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내할 수 있다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 표적 서열은 표적 유전자 내의 조절 서열을 포함한다. 선택적으로, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 표적 서열은 표적 유전자의 전사 시작 부위의 200 염기쌍 내에 있다. 선택적으로, 표적 서열은 전사 시작 부위의 상류로 200 염기쌍 및 전사 시작 부위의 하류로 1 염기쌍의 영역 내에 있다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각을 암호화하는 서열은 U6 프로모터와 같은 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 순환 TTR 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 어댑터-결합 요소를 포함한다. 선택적으로, 제1 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제1 루프 내에 있고, 제2 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제2 루프 내에 있다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 교차활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 부분에 융합된 CRISPR RNA (crRNA) 부분을 포함하는 단일 가이드 RNA이고, 여기서 제1 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 13-16에 상응하는 테트라루프이며, 제2 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 53-56에 상응하는 스템 루프 2이다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 어댑터-결합 요소는 SEQ ID NO: 16에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 SEQ ID NO: 40 또는 63에 제시된 서열을 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 질환 관련 유전자를 표적으로 한다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Ttr 유전자를 표적으로 하며, 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34-36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 37-39 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Pcsk9 유전자를 표적으로 하며, 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89-91 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 92-94 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Ldlr 유전자를 표적으로 하며, 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75-77 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 78-80 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 둘 이상의 표적 유전자를 표적으로 한다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함한다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 적어도 3개의 가이드 RNA를 포함한다. 선택적으로, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ttr 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 37에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 35를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 36을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 39에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Pcsk9 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 92에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 90을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 91을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ldlr 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 78에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 76을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 79에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 80에 제시된 서열을 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 선택적으로, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질이다. 선택적으로, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질과 최적으로 정렬될 때 D10A 및 N863A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질을 암호화하는 서열은 비인간 동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 키메라 Cas 단백질에서의 하나 이상의 전사 활성자 도메인은: VP16, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 선택적으로, 키메라 Cas 단백질에서의 하나 이상의 전사 활성자 도메인은 VP64를 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 키메라 Cas 단백질은 N-말단에서 C-말단 쪽으로: 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질; 및 VP64 전사 활성자 도메인을 포함한다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 키메라 Cas 단백질은 N-말단에서 C-말단 쪽으로: 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질; 핵 국지화 신호; 및 VP64 전사 활성자 도메인을 포함한다. 선택적으로, 키메라 Cas 단백질은 SEQ ID NO: 1에 제시된 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 SEQ ID NO: 25에 제시된 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 제1 발현 카세트는 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 분절의 상류로 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 추가로 포함하며, 여기서 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 재조합효소 인식 부위에 의해 플랭킹되고, 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 조직-특이적 방식으로 절제(excise)되었다. 선택적으로, 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 간에서 절제되었다. 선택적으로, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 선택적으로, 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합 효소 코딩 서열을 포함하는 게놈상으로 통합된 재조합효소 발현 카세트를 추가로 포함한다. 선택적으로, 재조합효소 유전자는 표 2에 제시된 프로모터 중 하나에 작동 가능하게 연결된다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 어댑터는 키메라 어댑터 단백질의 N-말단부에 있고, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 키메라 어댑터 단백질의 C-말단부에 있다. 선택적으로, 어댑터는 MS2 코트 단백질 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함한다. 선택적으로, 키메라 어댑터 단백질의 하나 이상의 전사 활성화 도메인은: VP16, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 선택적으로, 키메라 어댑터 단백질의 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 p65 및 HSF1을 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 키메라 어댑터 단백질은 N-말단에서 C-말단 쪽으로: MS2 코트 단백질; 핵 국지화 신호; p65 전사 활성화 도메인; 및 HSF1 전사 활성화 도메인을 포함한다. 선택적으로, 키메라 어댑터 단백질은 SEQ ID NO: 6에 제시된 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 SEQ ID NO: 27에 제시된 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 제1 발현 카세트는 다중시스트론성(다중시스트론성)이다. 선택적으로, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절로부터 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)에 의해 분리된다. 선택적으로, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절로부터 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산에 의해 분리된다. 선택적으로, 2A 펩타이드는 T2A 펩타이드이다.
일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 제1 발현 카세트가 안전한 은닉 유전자좌(harbor locus)에 통합된다. 일부 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물에서, 제1 발현 카세트 및/또는 제2 발현 카세트가 안전한 은닉 유전자좌에 통합된다. 선택적으로, 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 제1 발현 카세트에 대해 이형접합성이며 제2 발현 카세트에 대해 이형접합성이고, 제1 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌의 제1 대립유전자 내에 게놈상으로 통합되며, 제2 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌의 제2 대립유전자 내에 게놈상으로 통합된다. 선택적으로, 안전한 은닉 유전자좌는 Rosa26 유전자좌이다. 선택적으로, 제1 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 이러한 비인간 동물은 포유류이다. 선택적으로, 포유류는 설치류이다. 선택적으로, 설치류는 래트 또는 마우스이다. 선택적으로, 설치류는 마우스이다.
다른 측면으로, 상기 개시된 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물 중 어느 것을 제조하기 위한 표적화 벡터가 제공된다. 그러한 표적화 벡터는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열을 표적화하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적화 서열을 표적화하는 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 삽입 핵산을 포함할 수 있고, 발현 카세트는 (a) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 뉴클레아제-비활성 Cad 단백질을 포함하는 키메라 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 관련 (Cas) 단백질을 암호화하는 핵산; 및 (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 어댑터를 포함하는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다.
또 다른 측면으로, 상기 개시된 비인간 동물 중 어느 것을 제조하기 위한 방법에 제공된다. 일부 그러한 방법은: (a) 비인간 동물 배아 줄기 (ES) 세포에: (i) 표적 게놈 유전자좌의 표적 서열을 표적으로 하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 표적 게놈 유전자좌의 5' 표적 서열에 상응하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌의 3' 표적 서열에 상응하는 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 도입하는 단계, 여기서 표적화 벡터는 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 생성하기 위하여 표적 게놈 유전자좌와 재조합되는 것인 단계; (b) 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 비인간 동물 숙주 배아를 대리 모체(surrogate mother)에서 임신시키는 단계, 여기서 대리 모체는 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 F0 자손 유전자 변형된 비인간 동물을 생산하는 것인 단계를 포함한다. 선택적으로, 표적화 벡터는 길이가 적어도 10 kb인 또는 5' 및 3' 상동성 팔의 총 합의 길이가 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터이다.
일부 이러한 방법은: (a) 비인간 동물 1세포기 배아에: (i) 표적 게놈 유전자좌의 표적 서열을 표적으로 하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 표적 게놈 유전자좌의 5' 표적 서열에 상응하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌의 3' 표적 서열에 상응하는 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 도입하는 단계, 여기서 표적화 벡터는 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 생성하기 위하여 표적 게놈 유전자좌와 재조합되는 것인 단계; (b) 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 유전자 변형된 F0 세대 비인간 동물을 생산하기 위하여 유전자 변형된 비인간 동물 1세포기 배아를 대리 모체에서 임신시키는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 선택적으로, 이러한 방법은 표적 게놈 유전자좌 내에서 제2 표적 서열을 표적으로 하는 제2 가이드 RNA를 도입시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 이러한 방법에서, 비인간 동물은 마우스 또는 래트이다. 선택적으로, 비인간 동물은 마우스이다.
또 다른 측면으로, 비인간 동물 중 어느 것에서든 생체내에서 표적 유전자의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 각각이 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 비인간 동물에 도입하는 단계, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA는 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질과 복합체를 형성하여 그것을 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내함으로써, 표적 유전자의 발현을 증가시키는 것인 단계를 포함한다. 선택적으로, 표적 유전자는 간에서 발현되는 유전자이다.
일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달을 통해 도입된다. 선택적으로, AAV는 AAV8이다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 지질-나노입자-매개 전달 또는 유체역학적 전달을 통해 도입된다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 비인간 동물로의 투여 경로는 정맥내 주사, 비경구 주사, 복강내 주사, 비강 주사, 또는 유리체내 주사이다.
일부 이러한 방법에서, 표적 서열은 표적 유전자 내의 조절 서열을 포함한다. 선택적으로, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 표적 서열은 표적 유전자의 전사 시작 부위의 200 염기쌍 내에 있다. 선택적으로, 표적 서열은 전사 시작 부위의 상류로 200 염기쌍 및 전사 시작 부위의 하류로 1 염기쌍의 영역 내에 있다.
일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA의 형태로 도입된다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 DNA의 형태로 도입된다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 U6 프로모터와 같은 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 어댑터-결합 요소를 포함한다. 선택적으로, 제1 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제1 루프 내에 있고, 제2 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제2 루프 내에 있다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 교차활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 부분에 융합된 CRISPR RNA (crRNA) 부분을 포함하는 단일 가이드 RNA이며, 여기서 제1 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 13-16에 상응하는 테트라루프이고 제2 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 53-56에 상응하는 테트라루프이다.
일부 이러한 방법에서, 어댑터-결합 요소는 SEQ ID NO: 16에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 SEQ ID NO: 40 또는 63에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 질환-관련 유전자를 표적으로 한다. 선택적으로, 질환-관련 유전자는 Ttr 유전자이고, 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO : 34-36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 37-39 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Pcsk9 유전자를 표적으로 하고, 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89-91 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 92-94 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Ldlr 유전자를 표적으로 하며, 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75-77 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 78-80 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 둘 이상의 표적 유전자를 표적으로 한다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 적어도 3개의 3개의 가이드 RNA를 포함한다. 선택적으로, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ttr 유전자좌를 표적으로 하고, 여기서 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 37에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 35를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 36을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 39에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Pcsk9 유전자좌를 표적으로 하며, 여기서 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 92에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 90을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 91을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ldlr 유전자좌를 표적으로 하며, 여기서 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 78에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 76을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 79에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 80에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 표적 유전자의 발현의 증가는 대조군 비인간 동물에 비해 적어도 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 20배 더 높다.
일부 이러한 방법에서, 제1 발현 카세트는 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 분절의 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 추가로 포함하며, 여기서 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식되는 재조합효소 인식 부위가 옆에 있고, 방법은 재조합효소를 비인간 동물에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 선택적으로, 재조합효소는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달을 통해 도입된다. 선택적으로, AAV는 AAV8이다. 선택적으로, 재조합효소는 지질-나노입자-매개 전달 또는 유체역학적 전달을 통해 도입된다. 선택적으로, 재조합효소는 조직-특이적 방식으로 도입되거나 발현된다. 선택적으로, 재조합효소는 단백질의 형태로 도입된다. 선택적으로, 재조합효소는 DNA 또는 RNA의 형태로 도입된다. 선택적으로, 재조합효소는 표 2에 제시된 프로모터 중 하나에 작동 가능하게 연결된 DNA의 형태로 도입된다. 선택적으로, 재조합 효소의 비인간 동물에의 투여 경로는 정맥내 주사, 뇌실질내 주사, 복강내 주사, 비강 주사, 또는 유리체내 주사이다.
일부 이러한 방법에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달을 통해 도입되고, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 상이한 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함한다.
또 다른 측면으로, 상기 기술된 비인간 동물 중 어느 것에서 고콜레스테롤혈증을 모델링하는 방법이 제공된다. 그러한 방법은 Pcsk9를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA를 비인간 동물에 도입하는 단계를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하고, 하나 이상의 가이드 RNA는 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질고 복합체를 형성하여 그것을 Pcsk9 내에 있는 표적 서열로 안내함으로써, Pcsk9의 발현을 증가시키고 고콜레스테롤혈증을 유발시킨다.
도 1A (실제 치수 아님)는 5'에서 3' 쪽으로: 3' 스플라이싱 서열; 제1 loxP 부위; 네오마이신 내성 유전자; 폴리아데닐화 신호; 제2 loxP 부위; dCas9-NLS-VP64 코딩 서열; T2A 펩타이드 코딩 서열; MCP-NLS-p65-HSF1 코딩 서열; 및 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 lox-중단-lox (LSL) dCas9 시너지 활성화 매개자 (SAM) 대립유전자를 도시한다.
도 1B (실제 치수 아님)는 플록스된(floxed) 네오마이신 내성 유전자 및 폴리아데닐화 신호가 제거된 도 1A로부터의 대립유전자를 도시한다.
도 2는 도 1A로부터의 dCas9 SAM 대립유전자를 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론으로 표적화하기 위한 일반적인 개략도를 도시한다.
도 3A는 F1H4 야생형 (WT) 마우스 배아 줄기 세포 (mESC), Cas9 WT mESC, lox-중단-lox (LSL) dCas9 SAM mESC (도 1A에서와 같이 플록스된 폴리아데닐화 신호의 하류의 dCas9 SAM 대립유전자가 있는 mESC), 및 dCas9 SAM mESC (플록스된 폴리아데닐화 신호가 도 1B에서와 같이 Cre 재조합효소에 의해 삭제되어 있는 dCas9 SAM 대립유전자를 가진 mESC)에서의 Cas9 mRNA 발현 수준을 도시한다.
도 3B는 F1H4 야생형 (WT) 마우스 배아 줄기 세포 (mESC), Cas9 WT mESC, LSL dCas9 SAM mESC (도 1A 참조), 및 dCas9 SAM mESC (도 1B 참조)에서의 p65 mRNA 발현 수준을 도시한다.
도 4는 F1H4 야생형 (WT) 마우스 배아 줄기 세포 (mESC), Cas9 WT mESC, LSL dCas9 SAM mESC (도 1A 참조), 및 dCas9 SAM mESC (도 1B 참조)에서의 Cas9 단백질 발현 수준을 도시한다.
도 5 (실제 치수 아님)는 가이드 RNA 어레이 대립유전자를 dCas9 SAM 마우스 배아 줄기 세포에 도입시키기 위한 개략도를 도시한다. 가이드 RNA 어레이 대립유전자는 5'에서 3' 쪽으로: 3' 스플라이싱 서열; 제1 rox 부위; 퓨로마이신 내성 유전자; 폴리아데닐화 신호; 제2 rox 부위; 제1 U6 프로모터; 제1 가이드 RNA 코딩 서열; 제2 U6 프로모터; 제2 가이드 RNA 코딩 서열; 제3 U6 프로모터; 및 제3 가이드 RNA 코딩 서열을 포함한다.
도 6 (실제 치수 아님)은 Ttr의 전사 시작 부위의 상류를 표적으로 하는 3개의 가이드 RNA를 설계하기 위한 개략도를 도시한다.
도 7은 전사 활성화 도메인에 융합된 키메라 MS2 코트 단백질 (MCP)의 충원을 용이하게 하기 위해 테트라루프 및 스템 루프 2가 MS2-결합 압타머로 대체되어 있는 일반적인 단일 가이드 RNA (SEQ ID NO: 63)의 개략도를 도시한다.
도 8A 내지 8C는 Ttr 가이드 RNA 어레이로 표적화된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 클론에서의 Ttr, Dsg2, 및 B4galt6 각각의 mRNA 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-qPCR에 의해 측정되었다. y-축은 사이클 한계 (ct) 값을 나타낸다. F1H4 야생형 mESC, LSL dCas9 SAM (도 1A 참조), 및 dCas9 SAM (도 1B 참조) mESC 클론이 대조군으로서 사용되었다.
도 9A-9L은 야생형 마우스, 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이에 대해 또한 이형접합성인 이형접합성 dCas9 SAM 마우스로부터 분리된 다양한 조직에서의 TTR 단백질 발현을 도시한다.
도 10A 및 10B는 야생형 마우스, 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이에 대해 또한 이형접합성인 이형접합성 dCas9 SAM 마우스로부터 분리된 폐 및 비장 각각에서의 Ttr mRNA 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-qPCR에 의해 측정되었다. y-축은 사이클 한계 (ct) 값을 나타낸다.
도10C 및 10D는 야생형 마우스, 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이에 대해 또한 이형접합성인 이형접합성 dCas9 SAM 마우스로부터 분리된 폐 및 비장 각각에서의 Dsg2 mRNA 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-qPCR에 의해 측정되었다. y-축은 사이클 한계 (ct) 값을 나타낸다.
도 10E 및 10F는 야생형 마우스, 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이에 대해 또한 이형접합성인 이형접합성 dCas9 SAM 마우스로부터 분리된 폐 및 비장 각각에서의 Bgalt6 mRNA 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-qPCR에 의해 측정되었다. y-축은 사이클 한계 (ct) 값을 나타낸다.
도 11은 ELISA에 의해 검정된 바, 야생형 마우스, 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이에 대해 또한 이형접합성인 이형접합성 dCas9 SAM 마우스에서의 TTR의 혈청 수준을 도시한다.
도 12는 ELISA에 의해 검정된 바, 미처리 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, AAV8-GFP로 처리된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이를 포함하는 AAV8로 처리된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스에서의 TTR의 혈청 수준을 도시한다. 주사 후 5일, 19일, 및 60일째로부터의 결과가 도시된다.
도 13은 ELISA에 의해 검정된 바, 야생형 마우스, 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이에 대해 또한 이형접합성인 이형접합성 dCas9 SAM 마우스에서의 TTR의 순환 혈청 수준을 도시한다. 주사 후 3 내지 13개월로부터의 결과가 도시된다.
도 14는 ELISA에 의해 검정된 바, 미처리 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, AAV8-GFP로 처리된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이를 포함하는 AAV8로 처리된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스에서의 TTR의 순환 혈청 수준을 도시한다. 주사 후 5일, 19일, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 및 8개월로부터의 결과가 도시된다.
도 15는 ELISA에 의해 검정된 바, 미처리 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, AAV8-GFP로 처리된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ttr 가이드 RNA 어레이 또는 개별적인 가이드 RNA 1, 2, 또는 3을 포함하는 AAV8로 처리된 이형접합성 dCas9 SAM 마우스에서의 TTR의 순환 혈청 수준을 도시한다. 주사 후 1주, 2주, 및 3주째로부터의 결과가 도시된다.
도 16A 및 16B는 미처리 동형접합성 dCas9 SAM 마우스 (Pre PCSK9, Pre LDLR, Pre-WT, 2wk WT, or 5wk WT), Pcsk9 가이드 RNA 어레이를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스, or Ldlr 가이드 RNA 어레이를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스 각각에서의 콜레스테롤 및 LDL 수준을 도시한다.
도 17A 및 17B는 미처리 동형접합성 dCas9 SAM 마우스, Pcsk9 가이드 RNA 어레이를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스, 및 Ldlr 가이드 RNA 어레이를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스로부터 분리된 간에서의 상대적인 Ldlr 및 Pcsk9 mRNA 발현 수준을 도시한다.
도 18A 및 18B는 미처리 동형접합성 dCas9 SAM 마우스 (UNT) or Ldlr 가이드 RNA 어레이 (LDLR (HFD))를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스에서, 각각, 콜레스테롤 및 LDL 수준을 도시한다.
도 19는 미처리 마우스, 표적 유전자 1 가이드 RNA #1을 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스, 표적 유전자 1 가이드 RNA #2를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스, 또는 표적 유전자 1 가이드 RNA #1&2를 포함하는 AAV8로 처리된 동형접합성 dCas9 SAM 마우스로부터 분리된 간에서의 표적 유전자 1의 상대적인 mRNA 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-qPCR에 의해 측정되었다. y-축은 미처리 샘플과 관련된 발현을 보여준다. *는 미처리 샘플과 비교하여 p<0.0001을 나타낸다. **는 가이드 RNA #1 or 가이드 RNA #2와 비교하여 p< 0.001을 나타낸다.
정의
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는 암호화된 및 암호화되지 않은 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함한, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 용어는 또한 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩타이드 골격을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "도메인"은 특정 기능 또는 구조를 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 나타낸다.
단백질은 "N-말단" 및 "C-말단"을 가진다고 말한다. 용어 "N-말단"은 유리 아민 기 (-NH2)를 가진 아미노산에 의해 종결되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작에 관련된다. 용어 "C-말단"은 유리 카르복실기 (-COOH)에 의해 종결되는 아미노산 사슬 (단백질 또는 폴리펩타이드)의 단부에 관련된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 그것의 유사체 또는 변형된 버전을 포함한, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함한다. 이것은 단일-, 이중-, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 자연적인, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비자연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
핵산은 모노뉴클레오타이드가 한 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포다이에스테르 결합을 통해 한 방향으로 그것의 이웃한 3' 산소에 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 만들기 위해 반응하기 때문에 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 가진다고 말한다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 만약 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않는다면 "3' 단부"로서 언급된다. 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오타이드의 내부에 있더라도, 또한 5' 및 3' 단부를 가진다고 말할 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소들이 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'에 있다고 언급된다.
용어 "게놈상으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 통합되도록 세포에 도입된 핵산을 나타낸다. 세포의 게놈에 핵산의 안정적인 통합을 위해 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구성물" 또는 "발현 카세트"는 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 원하는 코딩 서열을 함유하는 재조합 핵산을 나타낸다. 원핵세포에서 발현에 필요한 핵산 서열은 보통 프로모터, 오퍼레이터 (선택적임), 및 리보솜 결합 부위뿐만 아니라, 다른 서열을 포함한다. 진핵세포는 일반적으로 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 활용하는 것으로 알려져 있지만, 필요한 발현을 희생시키지 않으면서 일부 요소가 삭제될 수 있고 다른 요소가 첨가될 수도 있다.
용어 "표적화 벡터"는 상동성 재조합, 비상동성-단부 연결-매개 결찰, 또는 세포의 게놈에서 표적 위치에 대한 임의의 다른 재조합 수단에 의해 도입될 수 있는 재조합 핵산을 나타낸다.
용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 한 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자에 포장을 위한 또는 포장을 허용하기에 충분한 요소를 포함하는 재조합 핵산을 나타낸다. 벡터 및/또는 입자는 DNA, RNA, 또는 다른 핵산을 세포에 생체외로 또는 생체내로 전달할 목적으로 이용될 수 있다. 많은 형태의 바이러스 벡터가 알려져 있다.
단백질, 핵산, 및 세포와 관련하여 용어 "분리된"은 단백질, 핵산, 또는 세포의 실질적으로 순수한 제제까지 및 그것들을 포함한, 제자리에 정상적으로 존재할 수 있는 다른 세포의 또는 유기체 구성요소와 관려하여 상대적으로 정제된 단백질, 핵산, 및 세포를 포함한다. 용어 "분리된"은 또한 자연적으로 발생하는 대응물 또는 화학적으로 합성된 단백질 또는 핵산을 갖지 않고 그로써 다른 단백질 또는 핵산에 의해 실질적으로 오염되지 않은 단백질 및 핵산을 포함한다. 용어 "분리된"은 또한 자연적으로 수반되는 대부분의 다른 세포의 구성요소 또는 유기체 구성요소 (예컨대, 다른 세포의 단백질, 핵산, 또는 세포의 또는 세포외의 구성요소)로부터 분리된 또는 정제된 단백질, 핵산, 또는 세포를 포함한다.
용어 "야생형"은 정상 (돌연변이, 질병, 변경, 등과 대조적임) 상태 또는 맥락에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 가지는 실체를 나타낸다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 자주 다수의 상이한 형태 (예컨대, 대립유전자)로 존재한다.
용어 "내인성 서열"은 세포 또는 비인간 동물 내에서 자연적으로 발생하는 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 비인간 동물의 내인성 Rosa26 서열은 비인간 동물에서 Rosa26 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 천연 Rosa26 서열을 나타낸다.
"외인성" 분자 또는 서열은 그 형태로는 세포에서 정상적으로 존재하지 않는 분자 또는 서열을 포함한다. 정상적 존재는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련한 존재를 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은, 예를 들어, 세포 내에서 상응하는 내인성 서열의 돌연변이된 버전, 예컨대 내인성 서열의 인간화된 버전을 포함하거나, 또는 세포내에서 내인성 서열에 상응하지만 상이한 형태로 있는 (즉, 염색체 내에 있지 않은) 서열을 포함할 수 있다. 대조적으로, 내인성 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에서 특정 세포에 그 형태로 정상적으로 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때 그 핵산 또는 단백질이 동일한 분자에서 함께 자연적으로 발생하지 않는 적어도 2개의 분절을 포함하는 것을 가리킨다. 예를 들어, 용어 "이종성"은, 핵산의 분절 또는 단백질의 분절과 관련하여 사용될 때, 그 핵산 또는 단백질이 자연적으로는 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 (예컨대, 함께 연결된) 둘 이상의 하위서열을 포함하는 것을 가리킨다. 한 예로서, 핵산 벡터의 "이종성" 영역은 자연적으로는 다른 분자와 회합하는 것으로 발견되지 않은 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 또는 그것에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 벡터의 이종성 영역은 자연적으로는 코딩 서열과 회합하는 것으로 발견되지 않는 서열이 옆에 있는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 단백질의 "이종성" 영역은 자연적으로는 다른 펩타이드 분자와 회합되는 것으로 발견되지 않는 또 다른 펩타이드 분자 내에 있거나 또는 그것에 부착된 아미노산의 분절이다 (예컨대, 융합 단백질, 또는 태그를 가진 단백질). 유사하게, 핵산 또는 단백질은 이종성 표지 또는 이종성 분비 또는 국지화 서열을 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는 아미노산을 특정하는 3-염기쌍 코돈 조합의 다중성에 의해 나타나는 바와 같이 코돈의 축퇴성을 장점을 가지며, 일반적으로 천연 서열의 적어도 한 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체시키는 한편 천연 아미노산 서열을 유지시킴으로써 특정 숙주 세포에서 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산은 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함한 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서, 자연적으로 발생하는 핵산 서열과 비교하여 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 쉽게 이용 가능하다. 이들 표는 많은 방법으로 조정될 수 있다. Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화를 위한 컴퓨터 알고리즘 또한 이용 가능하다 (예컨대, Gene Forge 참조).
용어 "유전자좌"는 유전자 (또는 중요한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-암호화 서열의 특정 장소, 또는 유기체의 게놈의 염색체 상에서의 위치를 나타낸다. 예를 들어, "Ttr 유전자좌"는 Ttr 유전자, Ttr DNA 서열, TTR-암호화 서열의 특정 장소, 또는 그러한 서열이 체류하는 것으로 확인된 유기체의 게놈의 염색체 상에서의 Ttr 위치를 나타낼 수 있다. "Ttr 유전자좌"는 예를 들어 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 미번역 영역 (UTR), 또는 이것들의 조합을 포함하여, Ttr 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 생성물 (예컨대, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 암호화하는 염색체의 DNA 서열을 나타내며 유전자가 전장 mRNA (5' 및 3' 미번역 서열을 포함함)에 상응하도록 비코딩 인트론으로 차단된 코딩 영역 및 5' 및 3' 단부 둘 다에서 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함한다. 용어 "유전자"는 또한 조절 서열 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 유입 부위, 사일런서(silencer), 절연(insulating) 서열, 및 매트릭스 부착 영역을 포함한 다른 비코딩 서열을 포함한다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 가깝거나 (예컨대, 10 kb 이내) 또는 먼 부위에 있을 수 있고, 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 준다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이 형태를 나타낸다. 일부 유전자는 다양한 상이한 형태를 가지며, 그것들은 염색체 상의 동일한 장소, 또는 유전자 유전자좌에 위치한다. 이배체 유기체는 각각의 유전자 유전자좌에 2개의 대립유전자를 가진다. 각 쌍의 대립유전자는 특정 유전자 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 있다면 동형접합성인 것으로 및 2개의 대립유전자가 상이하다면 이형접합성인 것으로 기술된다.
"프로모터"는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 중합효소 II가 RNA 합성을 개시하도록 지시할 수 있는 TATA 박스를 일반적으로 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 주는 다른 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에 개시딘 세포 유형 (예컨대, 진핵 세포, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능 세포, 1세포기 배아, 분화된 세포, 또는 이것들의 조합) 중 하나 이상에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성인 프로모터, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 발달상 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는, 예를 들어, WO 2013/176772 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
구성성 프로모터는 모든 발달 단계에서 모든 조직 또는 특정 조직에서 활성인 프로모터이다. 구성성 프로모터의 예로는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 (hCMV), 마우스 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 (mCMV), 인간 신장 인자 1 알파 (hEF1α), 마우스 신장 인자 1 알파 (mEF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 닭 베타 액틴 하이브리드 (CAG 또는 CBh), SV40 초기, 및 베타 2 튜불린 프로모터를 들 수 있다.
유도성 프로모터의 예로는, 예를 들어, 화학적으로 조절된 프로모터 및 물리적으로 조절된 프로모터를 들 수 있다. 화학적으로 조절된 프로모터로는, 예를 들어, 알코올-조절 프로모터 (예컨대, 알코올 데하이드로게나제 (alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절 프로모터 (예컨대, 테트라사이클린-반응성 프로모터, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO), tet-온 프로모터, 또는 tet-오프 프로모터), 스테로이드 조절된 프로모터 (예컨대, 래트 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체의 프로모터, 또는 엑디손 수용체의 프로모터), 또는 금속-조절 프로모터 (예컨대, 메탈로단백질 프로모터)를 들 수 있다. 물리적으로 조절된 프로모터로는, 예를 들어, 온도-조절 프로모터 (예컨대, 열 충격 프로모터) 및 광-조절 프로모터 (예컨대, 광-유도성 프로모터 또는 광-억제성 프로모터)를 들 수 있다.
조직-특이적 프로모터는, 예를 들어, 뉴런-특이적 프로모터, 신경교-특이적 프로모터, 근육 세포-특이적 프로모터, 심장 세포-특이적 프로모터, 신장 세포-특이적 프로모터, 뼈 세포-특이적 프로모터, 내피 세포-특이적 프로모터, 또는 면역세포-특이적 프로모터 (예컨대, B 세포 프로모터 또는 T 세포 프로모터)일 수 있다.
발달상으로 조절된 프로모터는 예를 들어, 발달의 배아 단계 중에, 또는 오로지 성인 세포에서만 활성인 프로모터를 들 수 있다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 두 구성요소가 정상적으로 기능하고 적어도 한 구성요소가 다른 구성요소 중 적어도 하나에 대해 발휘하는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 하는 둘 이상의 구성요소 (예컨대, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병렬위치를 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 만약 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 연속적인 또는 트랜스로 작용하는 그러한 서열을 포함할 수 있다 (예컨대, 조절 서열이 코딩 서열의 전사를 제어하기 위해 원거리에서 작용할 수 있음).
핵산의 "상보성"은 핵산의 한 가닥의 뉴클레오타이드 서열이 그것의 핵염기 기의 방향으로 인해, 반대쪽 핵산 가닥 상의 또 다른 서열과 수소 결합을 형성하는 것을 의미한다. DNA에서 상보하는 염기는 전형적으로 A와 T 및 C와 G이다. RNA에서, 그것은 전형적으로 C와 G 및 U와 A이다. 상보성은 완벽하거나 또는 실질적인/충분한 것일 수 있다. 두 핵산 사이의 완벽한 상보성은 두 핵산이 듀플렉스의 모든 염기가 왓슨-크릭 쌍형성에 의해 상보하는 염기에 결합되는 듀플렉스를 형성할 수 있는 것을 의미한다. "실질적인" 또는 "충분한" 상보하는은 한 가닥의 서열이 반대쪽 가닥 상의 서열에 완전히 및/또는 완벽하게 상보하지는 않지만, 혼성화 조건의 환경 (예컨대, 염 농도 및 온도)에서 안정적인 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 두 가닥 상의 염기 사이에서 충분한 결합이 일어나는 것을 의미한다. 이러한 조건은 혼성화된 가닥의 Tm (용융 온도)을 예측하기 위하여 서열 및 표준 수학적 계산을 사용함으로써, 또는 기본적인 방법을 사용하여 Tm의 실험적 측정에 의해 예측될 수 있다. Tm은 두 핵산 가닥 사이에서 형성된 혼성화 복합체의 집단이 50% 변성되는 (즉, 이중 가닥 핵산 분자의 집단의 절반이 단일 가닥으로 분리되는) 온도를 포함한다. Tm 아래의 온도에서, 혼성화 복합체의 형성이 선호되는 반면, Tm보다 높은 온도에서 혼성화 복합체의 가닥의 용융 또는 분리가 선호된다. Tm은 예컨대 Tm=81.5+0.41(% G+C)를 사용함으로써 1 M NaCl 수용액에서의 공지된 G+C 함량을 가지는 핵산에 대해 산정될 수 있지만, 다른 공지된 Tm 계산은 핵산의 구조적 특징을 고려한다.
"혼성화 조건"은 한 핵산 가닥이 상보하는 가닥 상호작용 및 수소 결합에 의해 제2 핵산 가닥에 결합하여 혼성화 복합체를 생성하는 누적 환경을 포함한다. 이러한 조건은 화학적 구성요소 및 핵산을 함유하는 수성 또는 유기 용액의 그것들의 농축물 (예컨대, 염, 킬레이트화제, 포름아미드), 및 혼합물의 온도를 포함한다. 다른 인자, 예컨대 인큐베이션 시간의 길이 또는 반응 챔버 치수가 환경에 기여할 수 있다. 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.sup.nd ed., pp. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 1 1.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
혼성화는 두 핵산이 상보하는 서열을 함유하지만, 염기 사이의 미스매치가 가능한 것을 필요로 한다. 두 핵산 사이의 혼성화에 적절한 조건은 잘 알려져 있는 변수들인 핵산의 길이 및 상보하는 정도에 좌우된다. 두 뉴클레오타이드 서열 사이의 상보 정도가 클수록, 그 서열들을 가지는 핵산의 하이브리드에 대한 용융 온도 (Tm)의 값은 더 커진다. 짧은 구간의 상보성 (예컨대 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 22개 이하, 20개 이하, 또는 18개 이하의 뉴클레오타이드에 걸친 상보성)을 가진 핵산 사이의 혼성화의 경우 미스매치의 위치가 중요해진다 (Sambrook et al., supra, 11.7-11.8 참조). 전형적으로, 혼성화 가능한 핵산에 대한 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오타이드이다. 혼성화 가능한 핵산에 대한 예시적인 최소 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드, 적어도 약 22개 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개 뉴클레오타이드, 및 적어도 약 30개 뉴클레오타이드를 포함한다. 나아가, 온도 및 세척 용액 염 농도는 상보 영역의 길이 및 상보 정도와 같은 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 혼성화할 수 있는 그것의 표적 핵산의 서열에 대해 100% 상보할 필요는 없다. 더욱이, 폴리뉴클레오타이드는 개재하는 또는 인접한 분절이 혼성화 사건에 포함되지 않도록 (예컨대, 루프 구조 또는 헤어핀 구조) 하나 이상의 분절에 걸쳐 혼성화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, gRNA)는 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 20개의 뉴클레오타이드 중 18개가 표적 영역에 상보하고, 따라서 특이적으로 혼성화할 수 있는 gRNA는 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이 실례에서, 나머지 상보하는 뉴클레오타이드는 클러스터를 형성하거나 상보하는 뉴클레오타이드가 산재될 수 있고 서로에 대해 또는 상보하는 뉴클레오타이드에 대해 연속적일 필요가 없다.
핵산 내 핵산 서열의 특정 구간 사이의 퍼센트 상보성은 기본적으로 BLAST 프로그램 (기본 로컬 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656)을 사용하여 또는 Smith와 Waterman의 알고리즘 (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 사용하는 디폴트 세팅을 사용하여 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용함으로써 측정될 수 있다.
본원에 제공된 방법 및 조성물은 다양한 상이한 구성요소를 사용한다. 설명 전체에서 일부 구성요소는 활성 변이체 및 단편을 가질 수 있다. 이러한 구성요소로는, 예를 들어, Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 가이드 RNA를 들 수 있다. 이들 구성요소의 각각에 대한 생물학적 활성은 본원의 다른 곳에서 기술된다. 용어 "기능성"은 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 단백질 또는 핵산 (또는 이것들의 단편 또는 변이체)의 고유한 능력을 나타낸다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능은, 예를 들어, Cas 단백질의 가이드 RNA 및 표적 DNA 서열에 결합하는 능력을 포함할 수 있다. 기능성 단편 또는 변이체의 생물학적 기능은 동일하거나 또는 원래와 비교하여 실제로 (예컨대, 그것들의 특이성 또는 선택성 또는 효능과 관련하여) 변경될 수 있지만, 기본적인 생물학적 기능은 보유된다.
용어 "변이체"는 집단에서 가장 일반적인 서열과 (예컨대, 한개의 뉴클레오타이드만큼) 상이한 뉴클레오타이드 서열 또는 집단에서 가장 일반적인 서열과 (예컨대, 한개의 아미노산만큼) 상이한 단백질 서열을 나타낸다.
용어 "단편"은 단백질을 언급할 때 전장 단백질보다 짧거나 더 적은 수의 아미노산을 가지는 단백질을 의미한다. 용어 "단편"은 핵산을 언급할 때 전장 핵산보다 짧거나 더 적은 수의 뉴클레오타이드를 가지는 핵산을 의미한다. 단편은, 예를 들어, N-말단 단편 (즉, 단백질의 C-말단부 부분의 제거), C-말단 단편 (즉, 단백질의 N-말단부 부분의 제거), 또는 내부 단편일 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 창에서 최대 상응성에 대해 정렬될 때 동일한 두 서열에서의 잔기에 관련된다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 자주 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하며, 이때 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예컨대, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기에 대해 치환되고 따라서 분자의 기능성 특성을 변경되지 않는다. 서열이 보존성 치환에서 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존성 성질을 교정하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존성 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 가진다고 말한다. 이런 조정을 만들기 위한 수단은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이것은 전체 미스매치보다는 부분적인 것으로서 보존성 치환을 채점하고, 그로써 백분율 서열 동일성을 증가시키는 것을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고 비보존성 치환에 0의 점수가 제공되면, 보존성 치환은 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존성 치환의 채점은 예컨대, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 실행되는 것과 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열 (완벽하게 매치된 잔기의 가장 큰 수)을 비교함으로써 측정된 값을 포함하며, 여기서 비교 창의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (첨가 또는 삭제를 포함하지 않은 서열)과 비교하여 첨가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다. 백분율은 매치된 위치의 수를 산출하기 위하여 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 측정하고, 매치된 위치의 수를 비교 창의 위치의 총 수로 나눈 후, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 백분율을 구함으로써 계산된다. 다르게 명시되지 않는 한 (예컨대, 더 짧은 서열이 연결된 이종성 서열을 포함함), 비교 창은 비교되는 두 서열의 더 짧은 쪽의 전장이다.
다르게 진술되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 다음의 파라미터를 사용하는 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 포함한다: 50의 GAP 중량 및 3의 길이 중량, 및 nwsgapdna.cmp 채점 매트릭스를 사용하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 8의 GAP 중량 및 2의 길이 중량, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 이것들의 임의의 동등한 프로그램. "동등한 프로그램"은 문제의 임의의 두 서열에 대해, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치 및 GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬에 비교할 때 동일한 퍼센트 서열 동일성을 가지는 배열을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존성 아미노산 치환"은 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산으로 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 치환하는 것을 나타낸다. 보존성 치환의 예로는 아이소류신, 발린, 또는 류신과 같은 무극성(소수성) 잔기의 다른 무극성 잔기에 대한 치환을 포함한다. 마찬가지로, 보존성 치환의 예로는 한 극성 (친수성) 잔기의 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이와 같이 다른 것에 대한 치환을 포함한다. 추가적으로, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 다른 것에 대한 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 한 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기에 대한 치환이 보존성 치환의 추가적인 예이다. 비보존성 치환의 예로는 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌과 같은 무극성 (소수성) 아미노산 잔기의 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신과 같은 극성 (친수성) 잔기에 대한 치환 및/또는 극성 잔기의 무극성 잔기에 대한 치환을 들 수 있다. 전형적인 아미노산 분류는 하기 표 1에서 요약된다.
아미노산 분류.
알라닌 Ala A 무극성 중성 1.8
아르기닌 Arg R 극성 양성 -4.5
아스파라긴 Asn N 극성 중성 -3.5
아스파르트산 Asp D 극성 음성 -3.5
시스테인 Cys C 무극성 중성 2.5
글루탐산 Glu E 극성 음성 -3.5
글루타민 Gln Q 극성 중성 -3.5
글리신 Gly G 무극성 중성 -0.4
히스티딘 His H 극성 양성 -3.2
아이소류신 Ile I 무극성 중성 4.5
류신 Leu L 무극성 중성 3.8
리신 Lys K 극성 양성 -3.9
메티오닌 Met M 무극성 중성 1.9
페닐알라닌 Phe F 무극성 중성 2.8
프롤린 Pro P 무극성 중성 -1.6
세린 Ser S 극성 중성 -0.8
트레오닌 Thr T 극성 중성 -0.7
트립토판 Trp W 무극성 중성 -0.9
티로신 Tyr Y 극성 중성 -1.3
발린 Val V 무극성 중성 4.2
"상동성" 서열 (예컨대, 핵산 서열)은 공지된 참조 서열과 동일한 또는 실질적으로 유사하여서, 예를 들어, 공지된 참조 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하게 되는 서열을 포함한다. 상동성 서열은, 예를 들어, 병렬상동성(orthologous) 서열 및 직렬상동성(paralogous) 서열을 포함할 수 있다. 상동성 유전자는, 예를 들어, 전형적으로 공통 조상 DNA 서열로부터, 종분화 사건을 통해 (병렬상동성 유전자) 또는 유전자 중복 사건을 통해 (직렬상동성 유전자) 내려온다. "병렬상동성" 유전자는 종분화에 의해 공통 조상 유전자로부터 진화된 상이한 종의 유전자를 포함한다. 병렬상동은 전형적으로 진화 과정에서 동일한 기능을 보유한다. "직렬상동성" 유전자는 게놈 내에서 중복에 의해 관련된 유전자를 포함한다. 직렬상동은 진화 과정에서 새로운 기능으로 진화할 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공적인 환경 및 인공적인 환경 (예컨대, 시험관) 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체내"는 자연적인 환경 (예컨대, 세포 또는 유기체 또는 신체) 및 자연적인 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체외"는 개체의 신체로부터 제거된 세포 및 그러한 세포 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다.
용어 "리포터 유전자"는 내인성 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서 요소에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자 서열을 포함하는 구성물이 그 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 활성화에 필요한 인자를 함유하고 있는 (또는 함유하도록 만들어질 수 있는) 세포에 도입될 때 쉽게 그리고 정량화가 가능하게 검정되는 유전자 생성물 (전형적으로 효소)을 암호화하는 서열을 가지는 핵산을 나타낸다. 리포터 유전자의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 베타-갈락토시다제 (lacZ)를 암호화하는 유전자, 박테리아 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (cat) 유전자, 반딧불이 루시페라제 유전자, 베타-글루쿠로니다제 (GUS)를 암호화하는 유전자, 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 들 수 있다. "리포터 단백질"은 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "형광 리포터 단백질"은 형광이 직접적으로 리포터 단백질로부터, 발색단 기질 상의 리포터 단백질의 활성으로부터, 또는 형광 태그 화합물에 대한 결합에 대해 친화성을 가진 단백질로부터 유래될 수 있는 형광을 토대로 검출 가능한 리포터 단백질을 의미한다. 형광 단백질의 예로는 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, GFP-2, 태그GFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린, 모노머 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, 및 ZsGreenl), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, eYFP, 시트린, 비너스, YPet, PhiYFP, 및 ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예컨대, BFP, eBFP, eBFP2, 남동석, mKalamal, GFPuv, 사파이어, 및 T-사파이어), 청록색 형광 단백질 (예컨대, CFP, eCFP, 세룰린, CyPet, AmCyanl, 및 미도리시-시안(Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질 (예컨대, RFP, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 모노머, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-모노머, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, 및 Jred), 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 모노머 쿠사비라-오렌지, mTangerine, 및 tdTomato), 및 세포에서 그것의 존재가 유동 세포분석 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 들 수 있다.
이중 가닥 절단 (DSR)에서의 수복은 원칙적으로 2개의 보존된 DNA 수복 경로를 통해 일어난다: 상동성 재조합 (HR) 및 비상동성 단부 연결 (NHEJ). Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 마찬가지로, 외인성 도너 핵산에 의해 매개된 표적 핵산의 수복은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보의 임의의 교환 과정을 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보의 임의의 교환 과정을 포함하며 임의의 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 재조합은 상동성 지정 수복 (HDR) 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 일어날 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 할 수 있고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 겪은 분자)의 수복을 위한 주형으로서 "도너" 분자를 사용하며, 도너로부터 표적으로 유전자 정보의 전달로 이어지는 핵산 수복 형태를 포함한다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 것을 바라지는 않지만, 이러한 전달은 절단된 표적과 도너 사이에서 형성되는 이종듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 도너가 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하기 위해 사용되는 합성-의존성 가닥 어닐링, 및/또는 관련된 과정들을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 도너 폴리뉴클레오타이드, 도너 폴리뉴클레오타이드의 부분, 도너 폴리뉴클레오타이드의 복사물, 또는 도너 폴리뉴클레오타이드의 복사물의 일부분이 표적 DNA에 통합된다. Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
NHEJ는 상동성 주형에 대한 필요성 없이 서로에 대한 또는 외인성 서열에 대한 절단 단부의 직접적인 결찰에 의해 핵산에서 이중 가닥 절단을 수복하는 것을 포함한다. NHEJ에 의한 비연속 서열의 결찰은 자주 이중 가닥 절단 부위 가까이에서 삭제, 삽입, 또는 전위(translocation)를 초래할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 또한 절단된 단부의 외인성 도너 핵산의 단부와의 직접적인 결찰 (즉, NHEJ-기반 포획)을 통해 외인성 도너 핵산의 표적화된 통합을 초래할 수 있다. 이러한 NHFJ-매개 표적화된 통합은 상동성 지정 수복 (HDR) 경로가 쉽게 사용 가능하지 않을 때 (예컨대, 비분할 세포, 일차 세포, 및 상동성-기반 DNA 수복이 빈약하게 수행되는 세포에서) 외인성 도너 핵산의 삽입에 바람직할 수 있다. 이에 더불어, 상동성-지정 수복과는 대조적으로, 절단 부위의 측면에 있는 서열 동일성의 큰 영역에 관련한 정보가 필요하지 않으며, 이것은 게놈 서열에 대한 지식이 제한되어 있는 게놈을 가진 유기체에 표적화된 삽입을 시도할 때 유리할 수 있다. 통합은 외인성 도너 핵산과 절단된 게놈 서열 사이의 블런트 단부의 결찰을 통해, 또는 절단된 게놈 서열에서 뉴클레아제 작용제에 의해 생성된 것들과 부합하는 돌출 단부가 측면에 있는 외인성 도너 핵산을 사용하는 점착 단부 (sticky 단부)(즉, 5' 또는 3' 돌출 단부를 가짐)의 결찰을 통해 진행될 수 있다. 예컨대, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, 및 Maresca et al. (2013) Genome Res. 23(3):539-546 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 만약 블런트 단부가 결찰되면, 단편 연결에 필요한 마이크로상동성 영역을 생성하기 위해 표적 및/또는 도너 절제가 필요할 수 있고, 그것은 표적 서열에서 원치 않는 변경을 생성할 수 있다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 함께 함유할 수 있다. 전환 문구 "~으로 본질적으로 이루어지는"은 청구범위의 범주가 청구범위에서 인용된 명시된 요소 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 유해한 영향을 주지 않는 요소를 포함하는 것으로 해석되어야 하는 것을 의미한다. 그러므로, 용어 "~으로 본질적으로 이루어지는"은 본 발명의 청구범위에서 사용될 때 "포함하는"과 동등하게 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있는 것과 설명이 사건 또는 상황이 일어난 상황 및 일어나지 않은 상황을 포함하는 것을 의미한다.
값의 범위의 지정은 그 범위 내의 또는 그 범위를 규정하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수에 의해 규정된 모든 하위범위를 포함한다.
맥락으로부터 다르게 드러나지 않는 한, 용어 "약"은 표시된 값의 표준 측정 오차 범위 (예컨대, SEM) 내의 값을 포함한다.
용어 "및/또는"은 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안으로 ("또는") 해석될 때 조합이 없는 것을 나타내며 포함한다.
용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 한 구성원을 나타내며 또한 그 목록의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.
물품의 단일 형태는 맥락이 분명하게 다른 것을 표시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "단백질" 또는 "적어도 한 단백질"은 혼합물을 포함한, 복수의 단백질을 포함할 수 있다.
통계학적으로 유의한은 p≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개관
군집화된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/CRISPR-회합 (Cas) (CRISPR/Cas) 시스템은 게놈 조작을 위한, 그리고 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 강력한 도구이다. 생체내에서 이 시스템의 한가지 한계는 살아있는 유기체로 모든 구성요소를 동시에 도입해야 하는 것이다. 전형적으로, 이들 구성요소는 DNA 구성물을 적절한 RNA 및 단백질을 생성할 세포에 트랜스펙션함으로써 일시적으로 도입된다. 이 접근법은 효과적이긴 하지만, Cas 단백질이 sgRNA 구성요소와 상호작용하기 위해 이용가능하게 되기 전에 먼저 전사가 진행된 후 번역되는 플라스미드 DNA 구성물에 세포가 의존해야 하기 때문에 고유한 단점을 가진다. CRISPR/Cas 작용제의 활성을 보다 효과적으로 평가하고 생체내에서 특정 조직 또는 세포 유형을 표적화하기 위한 상이한 전달 방법 및 파라미터를 평가하기 위한 더 나은 방법 및 도구가 필요하다.
예시의 CRISPR/Cas 시너지 활성화 매개자 (SAM) 시스템에서, 여러 활성화 ㄷ도메인이 임의의 한 인자 단독에 의해 유도될 수 있는 것보다 큰 전사 활성화를 유발하기 위하여 상호작용한다. SAM 시스템을 사용하기 위하여, 전형적으로 3개의 바이러스가 도입될 필요가 있다. 제1 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스 단백질 16의 4개의 탠덤 복사물로 구성된 전사 활성자인 VP64 도메인에 직접 융합된 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질을 함유한다. VP64가 전사 시작 부위 가까이에서 결합하는 단백질에 융합될 때, 그것은 강력한 전사 활성자로서 작용한다. 제2 바이러스는 2개의 추가적인 활성화 전사 인자: 열 충격 인자 1 (HSF1); 및 전사 인자 65 (p65)에 융합된 MS2 코트 단백질 (MCP)을 가져온다. MCP는 자연적으로 MS2 스템 루프에 결합한다. 예시의 SAM 시스템에서, MCP는 CRISPR-회합된 sgRNA에 엔지니어링된 MS2 스템 루프와 상호작용함으로써 결합된 전사 인자를 적절한 게놈 장소로 왕복한다. 제3 바이러스는 MS2-루프-함유 sgRNA를 도입한다.
생체내에서 및 생체외에서 표적 유전자의 전사를 활성화하기 위한, 그리고 생체내에서 및 생체외에서 CRISPR/Cas-매개 전사 활성화 활성을 평가하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 방법 및 조성물은 구성요소들이 구성적으로 이용 가능하거나 또는, 예를 들어, 조직-특이적 또는 시간-특이적 방식으로 이용 가능하도록 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 또는 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트 (예컨대, 키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 서열)를 포함하는 세포 및 비인간 동물을 사용한다. 카세트는 게놈상으로 통합될 수 있다. 이러한 세포 및 비인간 동물은 또한 본원의 다른 곳에서 개시된 가이드 RNA 발현 카세트 및/또는 재조합효소 발현 카세트를 포함할 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 구성요소 (예컨대, 가이드 RNA 및/또는 재조합효소)가 표적 유전자의 전사 활성화를 유도하기 위한 다른 수단에 의해 세포 및 비인간 동물에 도입될 수 있다.
SAM 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물은, 가이드 RNA만이 표적 유전자의 전사를 활성화하기 위해 비인간 동물에 도입될 필요가 있기 때문에, 생체내에서 CRISPR/Cas 구성요소의 전달 및 활성을 테스트하기 위한 과정을 단순화한다. 만약 비인간 동물이 또한 가이드 RNA 발현 카세트를 포함하면, 표적 유전자 활성화의 효과는 임의의 추가의 구성요소를 도입시키지 않으면서 연구될 수 있다. 이에 더불어, SAM 발현 카세트 또는 가이드 RNA 발현 카세트는 선택적으로 특정 조직 또는 발달 단계에서 선택적으로 발현될 수 있는, 예를 들어, Cas-매개 독성의 위험을 생체내에서 감소시킬 수 있는 조건부 발현 카세트일 수 있다. 대안으로, 이러한 발현 카세트는 임의의 및 모든 유형의 세포, 조직, 및 장기에서 활성을 테스트하는 것을 가능하게 하기 위해 구성적으로 발현될 수 있다.
생체내에서 표적 유전자의 전사를 활성화하는 Cas-기반 SAM 시스템의 능력을 테스트하고 측정하기 위하여, 그리고 생체내에서 표적 유전자의 전사를 증가시키는 효과를 평가하기 위하여 이들 비인간 동물을 제조하고 사용하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다.
II. 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물
본원에 개시된 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물은 생체내에서 또는 생체외에서 표적 유전자의 전사를 활성화시키는 방법에 사용하기 위한, 그리고 생체내에서 또는 생체외에서 표적 게놈 유전자좌의 전사를 활성화시키는 SAM 시스템 또는 그러한 시스템의 구성요소 (예컨대, 비인간 동물 또는 세포에 도입된 가이드 RNA)의 능력을 평가하기 위하여 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/CRISPR-회합된 (Cas)-기반 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트를 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 생체내에서 또는 생체외에서 표적 유전자의 전사를 활성화시키는 방법에 사용하기 위하여, 그리고 생체내에서 또는 생체외에서 표적 게놈 유전자좌의 전사를 활성화하는 SAM 시스템 또는 그러한 시스템의 구성요소 (예컨대, 비인간 동물 또는 세포에 도입된 가이드 RNA)의 능력을 평가하기 위하여 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/CRISPR-회합된 (Cas)-기반 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물 또는 세포를 활용한다. 본원에서 기술된 SAM 시스템은 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질을 포함하며 표적 유전자의 전사를 활성화하기 위하여 본원의 다른 곳에서 기술된 가이드 RNA와 함께 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 게놈상으로 통합된 발현 카세트에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 그것들은 AAV에 의해 또는 임의의 다른 적합한 수단에 의해 제공될 수 있다. 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질 (예컨대, 가이드 RNA 내의 어댑터-결합 요소에 특이적으로 결합하는 어댑터; 및 하나 이상의 이종성 전사 활성화 도메인을 포함함)은 본원의 다른 곳에서 한층 더 상세하게 기술된다.
CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현에 관여하는, 또는 Cas 유전자의 활성을 지시할 수 있는 전사물 및 다른 요소들을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III 시스템, 또는 유형 V 시스템 (예컨대, 하위유형 V-A 또는 하위유형 V-B)일 수 있다. 본원에서 개시된 조성물 및 방법에 사용된 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로 발생하지 않는 것일 수 있다. "자연적으로 발생하지 않는" 시스템은 인공적인 것의 포함을 가리키는 어떤 것, 예컨대 자연적으로 발생하는 상태로부터 변경되거나 돌연변이된, 본질적으로 자연적으로 관련된 적어도 하나의 다른 구성요소가 적어도 실질적으로 없는, 또는 자연적으로 관련되지 않은 적어도 하나의 다른 구성요소와 관련된 시스템의 하나 이상의 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 일부 CRISPR/Cas 시스템은 gRNA 및 자연적으로 함께 발생하지 않는 Cas 단백질을 포함하는 자연적으로 발생하지 않는 CRISPR 복합체를 사용하거나, 자연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질을 사용하거나, 또는 자연적으로 발생하지 않는 gRNA를 사용한다.
본원에서 개시된 방법 및 조성물은 생체내에서 표적 게놈 유전자좌의 전사적 활성화를 유도하는 CRISPR 복합체 (키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질과 복합체를 형성한 가이드 RNA (gRNA)를 포함함)의 능력을 사용하거나 테스트함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
본원에 개시된 게놈, 세포, 및 비인간 동물은 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 및/또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 게놈, 세포, 및 비인간 동물은 키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 코딩 서열을 포함하는 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트를 포함할 수 있다.
SAM 발현 카세트를 포함하는 이러한 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 표적 게놈 유전자좌의 전사적 활성화를 유도하기 위하여 가이드 RNA만의 전달을 필요로 하는 장점을 가진다. 일부 이러한 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 또한 표적 유전자의 전사적 활성화에 필요한 모든 구성요소가 이미 존재하도록 가이드 RNA 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 세포에서 임의의 원하는 방식으로 표적 유전자의 증가된 발현을 제공하기 위하여 SAM 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표적 유전자의 발현은 구성적 방식으로 또는 조절된 방식으로 (예컨대, 유도성, 조직-특이적, 일시적으로 조절된, 등의 방식) 증가될 수 있다.
A. 키메라 Cas 단백질
표적 유전자의 전사를 활성화하기 위하여 본원의 다른 곳에서 개시된 가이드 RNA에 결합할 수 있는 키메라 Cas 단백질이 제공된다. 이러한 키메라 Cas 단백질은: (a) 가이드 RNA와 복합체를 형성할 수 있고 표적 서열에 결합할 수 있는 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)-회합된 (Cas) 단백질 또는 그것의 기능성 단편 단편 또는 변이체인 DNA-결합 도메인; 및 (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 전사 활성화 도메인 (예컨대, 2개 이상의 이종성 전사 활성화 도메인 또는 3개 이상의 이종성 전사 활성화 도메인)을 포함할 수 있다. 한 예에서, 키메라 Cas 단백질은 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질 (예컨대, dCas9) 및 VP64 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키메라 Cas 단백질은 SEQ ID NO: 1에 제시된 dCas9-VP64 키메라 Cas 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 그러나, 전사 활성화 도메인이 다른 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하거나 및/또는 Cas 단백질이 다른 Cas 단백질 (예컨대, 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질)을 포함하는 키메라 Cas 단백질이 또한 제공된다. 다른 적합한 전사 활성화 도메인의 예는 본원의 다른 곳에서 제공된다.
전사 활성화 도메인(들)은 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내의 어느 곳에든지 위치할 수 있다. 예를 들어, 전사 활성화 도메인(들)은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질의 Rec1 도메인, Rec2 도메인, HNH 도메인, 또는 PI 도메인 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질과 최적으로 정렬될 때 병렬상동성 Cas9 단백질 또는 상동성 또는 병렬상동성 Cas 단백질의 임의의 상응하는 영역에 부착될 수 있다. 예를 들어, 전사 활성화 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질의 위치 553에 있는 Rec1 도메인, 위치 575에 있는 Rec1 도메인, 위치 175 내지 306 내의 또는 위치 157 내지 306 내의 대체 부분 또는 전체 영역 내의 임의의 위치에 있는 Rec2 도메인, 위치 715 내지 901 내의 또는 위치 715 내지 901 내의 대체 부분 또는 전체 영역 내의 임의의 위치에 있는 NHN 도메인, 또는 위치 1153에 있는 PI 도메인에 부착될 수 있다. 예컨대, WO 2016/049258 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 전사 활성화 도메인은 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 한쪽 또는 양쪽에서 하나 이상의 링커가 측면에 있을 수 있다.
키메라 Cas 단백질은 또한 추가적인 이종성 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되거나 융합될 수 있다. 융합된 또는 연결된 이종성 폴리펩타이드는 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내의 어느 곳에든지 위치할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Cas 단백질은 추가로 핵 국지화 신호를 포함할 수 있다. 적합한 핵 국지화 신호 및 Cas 단백질에 대한 다른 변형은 본원의 다른 곳에서 한층 더 상세하게 기술된다.
(1) Cas 단백질
Cas 단백질은 일반적으로 가이드 RNA와 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. Cas 단백질의 기능성 단편 또는 기능성 변이체는 가이드 RNA와 복합체를 형성하고 표적 유전자의 표적 서열에 결합하는 (그리고, 예를 들어, 표적 유전자의 전사를 활성화시키는) 능력을 보유하는 것이다.
본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이, 전사 활성화 도메인 외에, Cas 단백질 또한 뉴클레아제 도메인 (예컨대, DNase 도메인 또는 RNase 도메인), DNA-결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 다이머화 도메인, 및 다른 도메인을 포함할 수 있다. 일부 이러한 도메인 (예컨대, DNase 도메인)은 천연 Cas 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 이러한 도메인은 변형된 Cas 단백질을 만들기 위해 첨가될 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 핵산 분자의 공유 결합의 절단을 포함하는, 핵산 절단을 위한 촉매적 활성을 가진다. 절단은 블런트 단부 또는 점착 단부를 생성할 수 있고, 그것은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 전형적으로 블런트 절단 생성물을 생성할 것이다. 대안으로, 야생형 Cpf1 단백질 (예컨대, FnCpf1)은 5-뉴클레오타이드 5' 돌출 단부를 가지는 절단 생성물을 초래할 수 있고, 이때 절단은 비표적화 가닥 상의 PAM 서열로부터 18번째 염기쌍 뒤에서 및 표적화된 가닥 상에서 23번째 염기 뒤에서 일어난다. Cas 단백질은 표적 게놈 유전자좌에서 이중 가닥 절단 (예컨대, 블런트 단부를 가지는 이중 가닥 절단)을 생성하는 전체 절단 활성을 가지거나, 또는 그것은 표적 게놈 유전자좌에서 단일 가닥 절단을 생성하는 닉카아제일 수 있다. 한 예에서, 본원에서 개시된 키메라 Cas의 Cas 단백질 부분은 감소된 뉴클레아제 활성을 가지도록 (예컨대, 뉴클레아제 활성은 야생형 Cas 단백질과 비교하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 감소됨) 또는 실질적으로 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 (즉, 뉴클레아제 활성은 야생형 Cas 단백질과 비교하여 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 감소하거나, 야생형 Cas 단백질의 뉴클레아제 활성의 약 0%, 1%, 2%, 3%, 5%, 또는 10% 이하의 활성을 가짐) 변형되었다. 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질은 그것의 촉매적 (즉, 뉴클레아제) 도메인에 비활성화 돌연변이 (예컨대, Cpf1 단백질의 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인의 비활성화 돌연변이, 또는 Cas9에서 HNH 엔도뉴클레아제 도메인 및 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인 둘 다의 비활성화 돌연변이)인 것으로 알려져 있는 돌연변이를 가지는 Cas 단백질이거나, 또는 야생형 Cas 단백질과 비교하여 뉴클레아제 활성이 적어도 약 97%, 98%, 99%, 또는 100% 감소된 Cas 단백질이다. 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 또는 실질적으로 제거하는 상이한 Cas 단백질 돌연변이의 예가 하기에서 개시된다.
Cas 단백질의 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 또는 Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이것들의 상동체 또는 변형된 버전을 들 수 있다.
예시의 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질로부터 유래된 단백질이다. Cas9 단백질은 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래하고 전형적으로 보존된 구조와 4개의 핵심 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2, 및 4는 RuvC-유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. 예시의 Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토미세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도미코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 마이크로실라 마리나(Microscilla marina), 부르콜데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 왓소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테스 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀루로시룹터 벡시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실루스 페록시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비아 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 또는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터 유래한다. Cas9 패밀리 구성원의 추가적인 예는 WO 2014/131833 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (SpCas9) (배정된 SwissProt 수탁 번호 Q99ZW2)가 예시의 Cas9 단백질이다. 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9 (SaCas9) (배정된 UniProt 수탁 번호 J7RUA5)가 또 다른 예시의 Cas9 단백질이다. 캄필로박터 제주니로부터의 Cas9 (CjCas9) (배정된 UniProt 수탁 번호 Q0P897)가 또 다른 예시의 Cas9 단백질이다. 예컨대, Kim et al. (2017) Nat. Comm. 8:14500 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. SaCas9는 SpCas9보다 작고, CjCas9는 SaCas9 및 SpCas9 둘보다 작다.
Cas 단백질의 또 다른 예는 Cpf1 (프레보텔란(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 1로부터의 CRISPR) 단백질이다. Cpf1은 Cas9의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대한 대응물과 함께 Cas9의 상응하는 도메인에 상동하는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 큰 단백질 (약 1300개 아미노산)이다. 그러나, Cpf1은 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 없고, RuvC-유사 도메인은 NHN 도메인을 포함한 긴 삽입물을 함유하는 Cas9와는 대조적으로 Cpf1 서열에서 연속적이다. 예컨대, Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 예시의 Cpf1 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 1, 프란시셀라 툴라렌시스 하위종 노비시다(Francisella tularensis subsp. novicida), 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페르그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종(Smithella sp.) SCADC, 아시다미노코쿠스 종(Acid아미노coccus sp.) BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라즈마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 및 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae)로부터 유래한다. 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) U112로부터 유래된 Cpf1 (FnCpf1; 배정된 UniProt 수탁 번호 A0Q7Q2)이 예시의 Cpf1 단백질이다.
Cas 단백질은 야생형 단백질 (즉, 자연에서 발생하는 단백질), 변형된 Cas 단백질 (즉, Cas 단백질 변이체), 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 촉매적 활성과 관련하여 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 촉매적 활성과 관련하여 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 그것들의 일부분에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하고 따라서 닉-유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성을 보유한다. 닉-유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고 일반적으로 절단 부위를 함유하는 DNA 기질에 대한 Cas 단백질의 전체적인 활성 및 특이성을 측정한다.
변형된 Cas 단백질의 한 예는 비특이적 DNA 접촉을 감소시키기 위해 설계된 변경 (N497A/R661A/Q695A/Q926A)을 은닉한 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 고신뢰도 변이체인 변형된 SpCas9-HF1 단백질이다. 예컨대, Kleinstiver et al. (2016) Nature 529(7587):490-495 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 변형된 Cas 단백질의 또 다른 예는 표적 외 효과를 감소시키기 위해 설계된 변형된 eSpCas9 변이체 (K848A/K1003A/R1060A)이다. 예컨대, Slaymaker et al. (2016) Science 351(6268):84-88 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 다른 SpCas9 변이체로는 K855A 및 K810A/K1003A/R1060A를 들 수 있다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화성, 핵산 결합 특이성, 및 효소적 활성 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성, 예컨대 안정성을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형되거나, 삭제되거나, 또는 비활성화될 수 있거나, 또는 Cas 단백질은 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 또는 Cas 단백질의 활성 또는 특성을 최적화 (예컨대, 증강 또는 감소)시키기 위해 절단될 수 있다.
Cas 단백질은 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cpf1 단백질은 일반적으로, 다이머 구성일 가능성이 있는 표적 DNA의 두 가닥을 절단하는 RuvC-유사 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 일반적으로 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 및 HNH 도메인은 각각 DNA에서 이중 가닥 절단을 만들기 위하여 이중 가닥 DNA의 상이한 가다을 절단할 수 있다. 예컨대, Jinek et al. (2012) Science 337:816-821 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
하나 이상의 또는 모든 뉴클레아제 도메인은 그것이 더 이상 뉴클레아제 활성이 없거나 감소된 뉴클레아제 활성을 갖도록 삭제되거나 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 만약 뉴클레아제 도메인 중 하나가 Cas9 단백질에서 삭제되거나 돌연변이된다면, 결과적으로 생성된 Cas9 단백질은 닉카제로서 언급될 수 있고 이중 가닥 표적 DNA 내에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있지만 이중 가닥 절단은 아니다 (즉, 그것은 상보하는 가닥 또는 비상보 가닥을 절단하지만, 둘 다는 절단하지 않음). 만약 뉴클레아제 도메인이 둘 다 삭제되거나 돌연변이되면, 결과적으로 생성된 Cas9 단백질 (예컨대, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 두 가닥을 전부 절단하는 능력이 감소될 것이다 (예컨대, 뉴클레아제-눌(null) 또는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질, 또는 촉매적으로 죽은 Cas 단백질 (dCas)). Cas9를 닉카제로 전환시키는 돌연변이의 예는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC 도메인의 D10A (Cas9의 위치 10에서 아스파테이트의 알라닌으로) 돌연변이이다. 마찬가지로, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 NHN 도메인에서 H939A (아미노산 위치 839에서 히스티딘의 알라닌으로의 돌연변이), H840A (아미노산 위치 840에서 히스티딘의 알라닌으로의 돌연변이), 또는 N863A (아미노산 위치 N863에서 아스파라긴의 알라닌으로의 돌연변이)가 Cas9를 닉카제로 전환시킬 수 있다. Cas9를 닉카제로 전환시키는 돌연변이의 다른 예는 S. 써모필루스로부터의 Cas9에 대한 상응하는 돌연변이를 포함한다. 예컨대, Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Research 39:9275-9282 및 WO 2013/141680 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 이러한 돌연변이는 부위-특정 돌연변이생성, PCR-매개 돌연변이생성, 또는 전체 유전자 합성과 같은 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 닉카제를 생성하는 다른 돌연변이의 예는, 예를 들어, WO 2013/176772 및 WO 2013/142578 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다. 만약 모든 뉴클레아제 도메인이 Cas 단백질에서 삭제되거나 돌연변이되면 (예컨대, 두 뉴클레아제 도메인이 모두 Cas9 단백질에서 삭제되거나 돌연변이됨), 그 결과의 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 두 가닥을 모두 절단하는 능력이 감소될 것이다 (예컨대, 뉴클레아제-눌 또는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질). 한 특정 예는 D10A/H840A 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 또 다른 종으로부터의 Cas9에서의 상응하는 이중 돌연변이이다. 또 다른 특정 예는 D10A/N863A 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 또 다른 종으로부터의 Cas9에서의 상응하는 이중 돌연변이이다. 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질 (dCas9)의 한 예는 SEQ ID NO: 2에 제시된 dCas9 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다.
스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 단백질의 촉매성 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 효소 (SaCas9)는 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 생성하기 위하여 위치 N580에서의 치환 (예컨대, N580A 치환) 및 위치 D10에서의 치환 (예컨대, D10A 치환)을 포함할 수 있다. 예컨대, WO 2016/106236 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
Cpf1 단백질의 촉매적 도메인에서의 비활성화 도메인의 예가 또한 알려져 있다. 프란시셀라 노비시다 U112로부터의 Cpf1 단백질 (FnCpf1), 아시다미노코쿠스 종 BV3L6으로부터의 Cpf1 단백질 (AsCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006으로부터의 Cpf1 단백질 (LbCpf1), 및 모락셀라 보보쿨리 237로부터의 Cpf1 단백질 (MbCpf1 Cpf1)을 참조하면, 이러한 돌연변이는 AsCpf1의 위치 908, 993, 또는 1263 또는 Cpf1 병렬상동체에서의 상응하는 위치, 또는 LbCpf1의 위치 832, 925, 947, 또는 1180 또는 Cpf1 병렬상동체의 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어 AsCpf1의 돌연변이 D908A, E993A, 및 D1263A 또는 Cpf1 병렬상동체에서의 상응하는 돌연변이, 또는 LbCpf1의 D832A, E925A, D947A, 및 D1180A 또는 Cpf1 병렬상동체에서의 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, US 2016/0208243 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질로서 이종성 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 전사 활성화 도메인에 더불어, Cas 단백질은 절단 도메인 또는 후생유전 변형 도메인에 융합될 수 있다. WO 2014/089290 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. Cas 단백질은 또한 증가된 또는 감소된 안정성을 제공하는 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종성 폴리펩타이드는 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내에 내부적으로 위치할 수 있다.
한 예로서, Cas 단백질은 세포내 국지화를 제공하는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 이러한 이종성 폴리펩타이드로, 예를 들어, 핵을 표적화하기 위한 모노파타이트(monopartite) SV40 NLS 및/또는 바이파타이트(bipartite) 알파-임포틴 NLS와 같은 하나 이상의 핵 국지화 신호 (NLS), 미토콘드리아를 표적화하기 위한 미토콘드리아 국지화 신호, ER 정체(retention) 신호, 등을 들 수 있다. 예컨대, Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이러한 세포내 국지화 신호는 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내 어느 곳에서든지 위치할 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 구간을 포함할 수 있고, 모노파타이트 서열 또는 바이파타이트 서열일 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질은 N-말단에 있는 NLS (예컨대, 알파-임포틴 NLS 또는 모노파타이트 NLS) 및 C-말단에 있는 NLS (예컨대, SV40 NLS 또는 바이파타이드 NLS)를 포함한, 둘 이상의 NLS를 포함할 수 있다. Cas 단백질은 또한 N-말단에 둘 이상의 NLS 및/또는 C-말단에 둘 이상의 NLS를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 세포-침투 도메인 또는 단백질 변환 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래될 수 있고, TLM 세포-침투 모티프는 인간 B형 간염 바이러스, MPG, Pep-1, VP22로부터 유래되며, 세포 침투 펩타이드는 단순 헤르페스 바이러스, 또는 폴리아르기닌 펩타이드 서열로부터 유래될 수 있다. 예컨대, WO 2014/089290 및 WO 2013/176772 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 세포-침투 도메인은 N-말단에, C-말단에, 또는 Cas 단백질 내 어느 곳에서든지 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위하여 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 예로는 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, GFP-2, 태그GFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린, 모노머 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, eYFP, 시트린, 비너스, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예컨대, eBFP, eBFP2, 남동석, mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어), 청록색 형광 단백질 (예컨대, eCFP, 세룰린, CyPet, AmCyanl, 미도리시-시안), 적색 형광 단백질 (예컨대, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 모노머, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-모노머, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지, 모노머 쿠사비라-오렌지, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 들 수 있다. 태그의 예로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌 (HA), nus, Sof태그 1, Sof태그 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘 (His), 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모둘린을 들 수 있다.
Cas 단백질은 또한 표지된 핵산에 묶여질 수 있다. 이러한 테더링 (즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 이루어질 수 있고, 테더링은 직접적이거나 (예컨대, 직접 융합 또는 화학적 컨쥬게이션을 통하고, 이것은 단백질 상의 시스테인 또는 리신 잔기의 변형 또는 인테인 변형에 의해 이루어질 수 있음), 또는 스트렙트아비딘 또는 압타머와 같은 하나 이상의 개재하는 링커 또는 어댑터 분자를 통해 이루어질 수 있다. 예컨대, Pierce et al. (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55; Duckworth et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822; Schaeffer and Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332; Goodman et al. (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557; 및 Khatwani et al. (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 단백질-핵산 컨쥬게이트를 합성하기 위한 비공유 전략은 비오틴-스트렙트아비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 포함한다. 공유 단백질-핵산 컨쥬게이트는 적절하게 기능화된 핵산과 단백질을 광범위한 다양한 화학물질을 사용하여 연결시킴으로써 합성될 수 있다. 이들 화학물질의 일부는 올리고뉴클레오타이드의 단백질 표면 상의 아미노산 잔기 (예컨대, 리신 아민 또는 시스테인 티올)에의 직접적인 부착을 포함하는 한편, 다른 보다 복잡한 도식은 단백질의 번역 후 변형 또는 촉매적 또는 반응성 단백질 도메인의 포함을 필요로 한다. 단백질의 핵산에의 공유 부착을 위한 방법은, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 단백질 리신 또는 시스테인 잔기에의 화학적 가교 결합, 발현된 단백질 결찰, 화학효소 방법, 및 포토압타머의 사용을 포함할 수 있다. 표지된 핵산은 C-말단에, N-말단에, 또는 Cas 단백질 내 내부 영역에 테더링될 수 있다. 한 예에서, 표지된 핵산은 Cas 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 테더링된다. 마찬가지로, Cas 단백질은 5' 단부에, 3' 단부에, 또는 표지된 핵산 내 내부 영역에 테더링될 수 있다. 즉, 표지된 핵산은 임의의 방향 및 극성으로 테더링될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 표지된 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부에 테더링될 수 있다.
(2) 전사 활성화 도메인
본원에서 개시된 키메라 Cas 단백질은 하나 이상의 전사 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 전사 활성화 도메인은 DNA-결합 도메인 (예컨대, 가이드 RNA와 복합체를 형성한 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질)과 함께, 프로모터로부터의 전사를 전사 기계와 직접 접촉하거나 보조활성자와 같은 다른 단백질을 통해 접촉함으로써 활성화할 수 있는 자연적으로 발생하는 전사 인자의 영역을 포함한다. 전사 활성화 도메인은 또한 전사 인자 및 천연, 자연적으로 발생하는 전사 활성화 도메인으로부터 유래된 또는 표적 유전자의 전사를 활성화하기 위하여 인공적으로 생성되거나 합성된 엔지니어링된 전사 활성화 도메인의 그러한 영역의 기능성 단편 또는 변이체를 포함한다. 기능성 단편은 적합한 DNA-결합 도메인과 작동 가능하게 연결될 때 표적 유전자의 전사를 활성화할 수 있는 단편이다. 기능성 변이체는 적합한 DNA-결합 도메인과 작동 가능하게 연결될 때 표적 유전자의 전사를 활성화할 수 있는 변이체이다.
본원에서 개시된 키메라 Cas 단백질에 사용하기 위한 특정 전사 활성화 도메인은 VP64 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함한다. VP64는 단순 헤르페스 VP16 활성화 도메인으로부터의 최소 활성화 도메인의 테트라머 반복부이다. 예를 들어, 전사 활성화 도메인은 SEQ ID NO: 3에 제시된 VP64 전사 활성화 도메인 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
전사 활성화 도메인의 다른 예로는 단순 헤르페스 바이러스 VP16 교차활성화 도메인, VP64 (단순 헤르페스 바이러스 VP16의 사중 탠덤 반복부), NF-κB p65 (NF-κB 교차 활성화 하위유닛 p65) 활성화 도메인, MyoD1 교차활성화 도메인, HSF1 교차활성화 도메인 (인간 열충격 인자 1로부터의 교차활성화 도메인), RTA (엡스타인 바 바이러스 R 교차활성자 활성화 도메인), SET7/9 교차활성화 도메인, p53 활성화 도메인 1, p53 활성화 도메인 2, CREB (cAMP 반응 요소 결합 단백질) 활성화 도메인, E2A 활성화 도메인, NFAT (활성화된 T-세포의 핵 인자) 활성화 도메인, 및 이것들의 기능성 단편 및 변이체를 들 수 있다. 예컨대, US 2016/0298125, US 2016/0281072, 및 WO 2016/049258 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 전사 활성화 도메인의 다른 예로는 Gcn4, MLL, Rtg3, Gln3, Oaf1, Pip2, Pdr1, Pdr3, Pho4, Leu3, 및 이것들의 기능성 단편 및 변이체를 들 수 있다. 예컨대, US 2016/0298125 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 전사 활성화 도메인의 또 다른 예로는 Spl, Vax, GATA4, 및 이것들의 기능성 단편 및 변이체를 들 수 있다. 예컨대, WO 2016/149484 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 다른 예는 Oct1, Oct-2A, AP-2, CTF1, P300, CBP, PCAF, SRC1, PvALF, ERF-2, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, ARF-6, ARF-7, ARF-8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1PC4로부터의 활성화 도메인, 및 이것들의 기능성 단편 및 변이체를 포함한다. 예컨대, US 2016/0237456, EP3045537, 및 WO 2011/146121 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 추가적인 적합한 전사 활성화 도메인이 또한 알려져 있다. 예컨대, WO 2011/146121 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
B. 키메라 어댑터 단백질
본원의 다른 곳에서 개시된 가이드 RNA에 결합할 수 있는 키메라 어댑터 단백질이 또한 제공된다. 본원에서 개시된 키메라 어댑터 단백질은 표적 유전자의 전사를 활성화하기 위하여 표적 유전자 내의 표적 서열에 대해 지시되는 전사 활성화 도메인의 수 및 다양성을 증가시키기 위한 dCas-시너지 활성화 매개자 (SAM)-유사 시스템에 유용하다. 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산은 본원의 다른 곳에서 개시된 세포 또는 비인간 동물 (예컨대, 게놈상으로 통합된 키메라 Cas 단백질 발현 카세트를 포함하는 세포 또는 비인간 동물)에 게놈상으로 통합될 수 있거나, 또는 핵산은 본원의 다른 곳에서 개시된 방법 (예컨대, LNP-매개 전달 또는 AAV-매개 전달)을 사용하여 그러한 세포 및 비인간 동물에 도입될 수 있다.
이러한 키메라 어댑터 단백질은: (a) 가이드 RNA 내에서 어댑터-결합 요소에 특이적으로 결합하는 어댑터 (즉, 어댑터 도메인 또는 어댑터 단백질); 및 (b) 하나 이상의 이종성 전사 활성화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 이러한 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 전사 활성화 도메인 (예컨대, 2개 이상의 이종성 전사 활성화 도메인 또는 3개 이상의 이종성 전사 활성화 도메인)을 포함할 수 있다. 한 예에서, 이러한 키메라 어댑터 단백질은: (a) 가이드 RNA의 어댑터-결합 요소에 특이적으로 결합하는 어댑터 (즉, 어댑터 도메인 또는 어댑터 단백질); 및 (b) 2개 이상의 전사 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 어댑터 단백질은: (a) 가이드 RNA의 하나 이상의 MS2 압타머 (예컨대, 가이드 RNA의 별도의 위치에 있는 2개의 MS2 압타머)에 특이적으로 결합하는 MS2 코트 단백질 어댑터; 및 (b) 하나 이상의 (예컨대, 2개 이상의) 전사 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2개의 전사 활성화 도메인은 p65 및 HSF1 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체일 수 있다. 그러나, 전사 활성화 도메인이 다른 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는 키메라 어댑터 단백질 또한 제공된다.
하나 이상의 전사 활성화 도메인은 어댑터에 직접 융합될 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 링커 또는 링커들의 조합을 통해 또는 하나 이상의 추가적인 도메인을 통해 어댑터에 연결될 수 있다. 마찬가지로, 만약 2개 이상의 전사 활성화 도메인이 존재하면, 그것들은 서로에게 직접 융합되거나 또는 서로에게 링커 또는 링커들의 조합을 통해 또는 하나 이상의 추가적인 도메인을 통해 연결될 수 있다. 이들 융합 단백질에 사용될 수 있는 링커로는 융합 단백질의 기능을 간섭하지 않는 임의의 서열을 들 수 있다. 예시의 링커는 짧고 (예컨대, 2 내지 20개 아미노산) 전형적으로 유연성이 있다 (예컨대, 글리신, 알라닌, 및 세린과 같은 고도의 자유도를 가진 아미노산을 포함함). 링커의 일부 특정 예는 GGGS (SEQ ID NO: 4) 또는 GGGGS (SEQ ID NO: 5)으로 이루어지는 하나 이상의 유닛을, 예컨대 2, 3, 4개 또는 그 이상의 반복되는 GGGS (SEQ ID NO: 4) 또는 GGGGS (SEQ ID NO: 5)을 임의의 조합으로 포함한다. 다른 링커 서열 또한 사용될 수 있다.
하나 이상의 전사 활성화 도메인 및 어댑터는 키메라 어댑터 단백질 내에 임의의 순서로 있을 수 있다. 한 선택권으로서, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 어댑터에 대해 C-말단이고 어댑터는 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 대해 N-말단일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 키메라 어댑터 단백질의 C-말단에 있을 수 있고, 어댑터는 키메라 어댑터 단백질의 N-말단에 있을 수 있다. 그러나, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 키메라 어댑터 단백질의 C-말단에 있지 않으면서 어댑터에 대해 C-말단일 수 있다 (예컨대, 핵 국지화 신호가 키메라 어댑터 단백질의 C-말단에 있는 경우). 마찬가지로, 어댑터는 키메라 어댑터 단백질의 N-말단에 있지 않으면서 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 대해 N-말단일 수 있다 (예컨대, 핵 국지화 신호가 키메라 어댑터 단백질의 N-말단에 있는 경우). 다른 선택권으로서, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 어댑터에 대해 N-말단일 수 있고 어댑터는 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 키메라 어댑터 단백질의 N-말단에 있을 수 있고, 어댑터는 키메라 어댑터 단백질의 C-말단에 있을 수 있다. 또 다른 선택권으로서, 만약 키메라 어댑터 단백질이 2개 이상의 전사 활성화 도메인을 포함한다면, 2개 이상의 전사 활성화 도메인은 어댑터 측면에 있을 수 있다.
키메라 어댑터 단백질은 또한 추가적인 이종성 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되거나 융합될 수 있다. 융합된 또는 연결된 이종성 폴리펩타이드는 N-말단에, C-말단에, 또는 키메라 어댑터 단백질 내 내부의 어느 곳에든지 위치할 수 있다. 예를 들어, 키메라 어댑터 단백질은 추가로 핵 국지화 신호를 포함할 수 있다. 이러한 단백질의 특정 예는 MS2 코트 단백질 (MCP)에 대해 C-말단인 p65 전사 활성화 도메인에 (직접 또는 NLS를 통해) 연결된 MS2 코트 단백질 (어댑터), 및 p65 전사 활성화 도메인에 대해 C-말단인 HSF1 전사 활성화 도메인 C-말단을 포함한다. 이러한 단백질은 N-말단에서 C-말단 쪽으로: MCP; 핵 국지화 신호; p65 전사 활성화 도메인; 및 HSF1 전사 활성화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 키메라 어댑터 단백질은 SEQ ID NO: 6에 제시된 MCP-p65-HSF1 키메라 어댑터 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
키메라 어댑터 단백질은 또한 세포내 국지화를 제공하는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합되거나 또는 연결될 수 있다. 이러한 이종성 폴리펩타이드는, 예를 들어, 핵을 표적화하기 위한 하나 이상의 핵 국지화 신호 (NLS), 예컨대 SV40 NLS 및/또는 알파-임포틴 NLS, 미토콘드리아를 표적화하기 위한 미토콘드리아 국지화 신호, ER 정체 신호, 등을 포함할 수 있다. 예컨대, Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. NLS는, 예를 들어, 염기성 아미노산의 구간을 포함할 수 있고, 모노파타이트 서열 또는 바이파타이트 서열일 수 있다. 선택적으로, 키메라 어댑터 단백질은 N-말단에 있는 NLS (예컨대, 알파-임포틴 NLS) 및/또는 C-말단에 있는 NLS (예컨대, SV40 NLS)를 포함한, 2개 이상의 NLS를 포함한다.
키메라 어댑터 단백질은 또한 세포-침투 도메인 또는 단백질 변환 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래될 수 있고, TLM 세포-침투 모티프는 인간 B형 간염 바이러스, MPG, Pep-1, VP22로부터 유래되며, 세포 침투 펩타이드는 단순 헤르페스 바이러스, 또는 폴리아르기닌 펩타이드 서열로부터 유래될 수 있다. 예컨대, WO 2014/089290 및 WO 2013/176772 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또 다른 실례로서, 키메라 어댑터 단백질은 증가된 또는 감소된 안정성을 제공하는 이종성 폴리펩타이드에 융합되거나 연결될 수 있다.
키메라 어댑터 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위하여 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 예로는 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, GFP-2, 태그GFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린, 모노머 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, Zsgreenl), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, eYFP, 시트린, 비너스, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예컨대, eBFP, eBFP2, 남동석, mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어), 청록색 형광 단백질 (예컨대, eCFP, 세룰린, CyPet, AmCyanl, 미도리시-시안), 적색 형광 단백질 (예컨대, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-모노머, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지, 모노머 쿠사비라-오렌지, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 들 수 있다. 태그의 예로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1 , AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌 (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1 , T7, V5, VSV-G, 히스티딘 (His), 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모듈린을 들 수 있다.
키메라 어댑터 단백질은 또한 표지된 핵산에 묶여질 수 있다. 이러한 테더링 (즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 이루어질 수 있고, 테더링은 직접적이거나 (예컨대, 직접 융합 또는 화학적 컨쥬게이션을 통하고, 이것은 단백질 상의 시스테인 또는 리신 잔기의 변형 또는 인테인 변형에 의해 이루어질 수 있음), 또는 스트렙트아비딘 또는 압타머와 같은 하나 이상의 개재하는 링커 또는 어댑터 분자를 통해 이루어질 수 있다. 예컨대, Pierce et al. (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55; Duckworth et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822; Schaeffer and Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332; Goodman et al. (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557; 및 Khatwani et al. (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 단백질-핵산 컨쥬게이트를 합성하기 위한 비공유 전략으로는 비오틴-스트렙트아비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 들 수 있다. 공유 단백질-핵산 컨쥬게이트는 적절하게 기능화된 핵산과 단백질을 광범위한 다양한 화학물질을 사용하여 연결시킴으로써 합성될 수 있다. 이들 화학물질의 일부는 올리고뉴클레오타이드의 단백질 표면 상의 아미노산 잔기 (예컨대, 리신 아민 또는 시스테인 티올)에의 직접적인 부착을 포함하는 한편, 다른 보다 복잡한 도식은 단백질의 번역 후 변형 또는 촉매적 또는 반응성 단백질 도메인의 포함을 필요로 한다. 단백질의 핵산에의 공유 부착을 위한 방법은, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 단백질 리신 또는 시스테인 잔기에의 화학적 가교 결합, 발현된 단백질 결찰, 화학효소 방법, 및 포토압타머의 사용을 포함할 수 있다. 표지된 핵산은 C-말단에, N-말단에, 또는 키메라 어댑터 단백질 내 내부 영역에 테더링될 수 있다. 한 예에서, 표지된 핵산은 Cas 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 테더링된다. 마찬가지로, 키메라 어댑터 단백질은 5' 단부에, 3' 단부에, 또는 표지된 핵산 내 내부 영역에 테더링될 수 있다. 즉, 표지된 핵산은 임의의 방향 및 극성으로 테더링될 수 있다.
(1) 어댑터
어댑터 (즉, 어댑터 도메인 또는 어댑터 단백질)는 구별되는 서열을 특이적으로 인식하고 그것에 결합하는 (예컨대, 서열-특이적인 방식으로 압타머와 같은 구별되는 DNA 및/또는 RNA 서열에 결합하는) 핵산-결합 도메인 (예컨대, DNA-결합 도메인 및/또는 RNA-결합 도메인)이다. 압타머는 특이적인 삼차원 형태를 채택하는 능력을 통해 표적 분자에 높은 친화도 및 특이성으로 결합할 수 있는 핵산을 포함한다. 이러한 어댑터는, 예를 들어, 특정 RNA 서열 및 이차 구조에 결합할 수 있다. 이들 서열 (즉, 어댑터-결합 요소)은 가이드 RNA에 조작될 수 있다. 예를 들어, MS2 압타머는 MS2 코트 단백질 (MCP)에 특이적으로 결합하기 위하여 가이드 RNA에 조작될 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 SEQ ID NO: 7에 제시된 MCP 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
어댑터 및 표적의 일부 특정 예로는 다양한 박테리오파지 코트 단백질 내에 존재하는 RNA-결합 단백질/압타머 조합을 들 수 있다. 예를 들어, 다음의 어댑터 단백질 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체가 사용될 수 있다: MS2 코트 단백질 (MCP), PP7, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M1l, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, Φ Cb8r, Φ Cb12r, ΦCb23r, 7s, 및 PRR1. 예컨대, WO 2016/049258 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 어댑터 단백질의 기능성 단편 또는 기능성 변이체는 특정 어댑터-결합 요소에 결합하는 능력 (예컨대, 서열-특이적 방식으로 특정어댑터-결합 서열에 결합하는 능력)을 보유하는 것이다. 예를 들어, 아미노산 68-69가 SG로 돌연변이되어 있고 아미노산 70-75가 야생형 단백질로부터 삭제되어 있는 PP7 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리오파지 코트 단백질 변이체가 사용될 수 있다. 예컨대, Wu et al. (2012) Biophys J 102(12):2936-2944 및 Chao et al. (2007) Nature Structural & Molecular Biology 15(1):103-105 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 마찬가지로, MCP 변이체, 예컨대 N55K 돌연변이가 사용될 수 있다. 예컨대, Spingola and Peabody (1994) J Biol Chem 269(12):9006-9010 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
사용될 수 있는 어댑터 단백질의 다른 예로는 엔도리보뉴클레아제 Csy4 또는 람다 N 단백질의 전부 또는 일부 (예컨대, 이것들로부터의 DNA-결합)를 들 수 있다. 예컨대, US 2016/0312198 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
(2) 전사 활성화 도메인
본원에서 개시된 키메라 어댑터 단백질은 하나 이상의 전사 활성화 도메인을 포함한다. 이러한 전사 활성화 도메인은 자연적으로 발생하는 전사 활성화 도메인일 수 있거나, 자연적으로 발생하는 전사 활성화 도메인의 기능성 단편 또는 기능성 변이체일 수 있거나, 또는 조작된 또는 합성된 전사 활성화 도메인일 수 있다. 사용될 수 있는 전사 활성화 도메인은 본원의 다른 곳에서 키메라 Cas 단백질에 사용하기 위해 기술된 것들을 포함한다.
본원에서 개시된 키메라 어댑터 단백질에 사용하기 위한 특정 전사 활성화 도메인은 p65 및/또는 HSF1 전사 활성화 도메인 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함한다. HSF1 전사 활성화 도메인은 인간 열 충격 인자 1 (HSF1)의 전사 활성화 도메인일 수 있다. p65 전사 활성화 도메인은 RELA 유전자에 의해 암호화된 핵 인자 NF-카파-B p65 하위유닛으로도 알려져 있는 전사 인자 p65의 전사 활성화 도메인일 수 있다. 한 예로서, 전사 활성화 도메인은 SEQ ID NO: 8에 제시된 p65 전사 활성화 도메인 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 다른 예로서, 전사 활성화 도메인은 SEQ ID NO: 9에 제시된 HSF1 전사 활성화 도메인 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
C. 가이드 RNA 및 가이드 RNA 어레이
표적 유전자의 전사를 활성화하기 위하여 본원의 다른 곳에서 개시된 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질에 결합할 수 있는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이가 또한 제공된다. 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 세포 또는 비인간 동물 (예컨대, SAM-준비된 세포 또는 비인간 동물)에 게놈상으로 통합되거나, 또는 가이드 RNA 또는 핵산은 본원의 다른 곳에서 개시된 방법 (예컨대, LNP-매개 전달 또는 AAV-매개 전달)을 사용하여 이러한 세포 및 비인간 동물에 도입될 수 있다. 전달 방법은 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 재조합효소의 조직-특이적 전달을 제공하기 위해 선택될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화할 수 있다 (또는 만약 가이드 RNA가 세포 또는 비인간 동물에 도이된다면, 하나 이상의 가이드 RNA가 도입될 수 있다). 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 가이드 RNA가 암호화되거나 도입될 수 있다. 각각의 가이드 RNA 코딩 서열은 동일한 프로모터 (예컨대, U6 프로모터) 또는 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다 (예컨대, 각각의 가이드 RNA 코딩 서열은 그 자체의 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결된다). 2개 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자에서 상이한 표적 서열을 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 가이드 RNA가 각각 단일 표적 유전자에서 상이한 표적 서열을 표적으로 할 수 있다. 유사하게, 가이드 RNA는 다중 표적 유전자 (예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 표적 유전자)를 표적으로 할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다.
(1) 가이드 RNA
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질)에 결합하고 표적 DNA 내의 특정 위치로 Cas 단백질을 표적화한다. 가이드 RNA는 2개의 분절을 포함할 수 있다: "DNA-표적화 분절" 및 "단백질-결합 분절". "분절"은 분자의 섹션 또는 영역, 예컨대 RNA의 뉴클레오타이드의 연속 구간을 포함한다. 일부 gRNA, 예컨대 Cas9에 대한 gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자: "활성자-RNA" (예컨대, tracrRNA) 및 "타게터(표적er)-RNA" (예컨대, CRISPR RNA 또는 crRNA)를 포함할 수 있다. 다른 gRNA는 단일 RNA 분자 (단일 RNA 폴리뉴클레오타이드)이고, 이것은 또한 "단일-분자 gRNA", "단일-가이드 RNA", 또는 "sgRNA"로도 언급될 수 있다. 예컨대, WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578, 및 WO 2014/131833 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. Cas9의 경우, 예를 들어, 단일-가이드 RNA가 tracrRNA에 (예컨대, 링커를 통해) 융합된 crRNA를 포함할 수 있다. Cpf1의 경우, 예를 들어, 표적 서열에 대한 결합을 이루기 위해서는 단지 ctRNA만이 필요하다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중 분자 (즉, 모듈식) gRNA 및 단일 분자 gRNA를 둘 다 포함한다.
예시의 2-분자 gRNA는 crRNA-유사 ("CRISPR RNA" 또는 "타게터-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사 ("트랜스-작용 CRISPR RNA" 또는 "활성자-RNA" 또는 "tracrRNA") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 분절 (단일-가닥) 및 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 절반을 형성하는 뉴클레오타이드 구간 둘 다를 포함한다. DNA-표적화 분절의 하류 (3')에 위치한 crRNA 꼬리의 예는 GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 10)를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다. 본원에서 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 crRNA를 형성하기 위하여 SEQ ID NO: 10의 5' 단부에 연결될 수 있다.
상응하는 tracrRNA (활성자-RNA)는 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 다른 절반을 형성하는 뉴클레오타이드 구간을 포함한다. crRNA의 뉴클레오타이드의 구간은 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위하여 tracrRNA의 뉴클레오타이드 구간에 상보하고 그것과 혼성화한다. 그로써, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 가진다고 말할 수 있다. tracrRNA 서열의 예는 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 11)를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다.
crRNA 및 tracrRNA 둘 다가 필요한 시스템에서, crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 gRNA를 형성하기 위하여 혼성화한다. crRNA만이 필요한 시스템에서, crRNA는 gRNA일 수 있다. crRNA는 추가적으로 표적 DNA의 상보하는 가닥에 혼성화하는 단일 가닥 DNA-표적화 분절을 제공한다. 만약 세포 내에서 변형을 위해 사용된다면, RNA 분자가 사용될 종에 대해 특이적이 되도록 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열이 설계될 수 있다. 예컨대, Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:227-229; Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:233-239; 및 Cong et al. (2013) Science 339:819-823 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
주어진 gRNA의 DNA-표적화 분절 (crRNA)은 하기에서 보다 상세하게 기술되는 것과 같이, 표적 DNA의 상보하는 가닥 상의 서열에 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 분절은 혼성화 (즉, 염기 쌍형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 그로써, DNA-표적화 분절의 뉴클레오타이드 서열은 달라질 수 있고 gRNA 및 표적 DNA가 상호작용할 표적 DNA 내의 장소를 결정한다. 대상 gRNA의 DNA-표적화 분절은 표적 DNA 내에서 임의의 원하는 서열에 혼성화하도록 변형될 수 있다. 자연적으로 발생하는 crRNA는 CRISPR/Cas 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만 자주, 21 내지 46개 뉴클레오타이드의 길이의 2개의 직접 반복부 (DR)가 측면에 있는, 21 내지 72개 뉴클레오타이드 길이의 표적화 분절을 함유한다 (예컨대, WO 2014/131833 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 스트렙토코쿠스 피오게네스의 경우에, DR은 36개 뉴클레오타이드 길이이고 표적화 분절은 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 3' 위치한 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보하며 그것과 혼성화하고, 그것은 결국 Cas 단백질에 결합한다.
DNA-표적화 분절은, 예를 들어, 적어도 약 12, 15, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 이러한 DNA-표적화 분절은, 예를 들어, 약 12 내지 약 100개, 약 12 내지 약 80개, 약 12 내지 약 50개, 약 12 내지 약 40개, 약 12 내지 약 30개, 약 12 내지 약 25개, 또는 약 12 내지 약 20개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, DNA 표적화 분절은 약 15 내지 약 25개 뉴클레오타이드 (예컨대, 약 17 내지 약 20개 뉴클레오타이드, 또는 약 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드)일 수 있다. 예컨대, US 2016/0024523 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 16 내지 20개 뉴클레오타이드 길이이거나 또는 17 내지 20개 뉴클레오타이드 길이이다. S. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 21 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이다. Cpf1의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 적어도 16개 뉴클레오타이드 길이이거나 또는 적어도 18개 뉴클레오타이드 길이이다.
TracrRNA는 임의의 형태 (예컨대, 전장 tracrRNAs 또는 활성 부분 tracrRNA), 및 달라지는 길이로 있을 수 있다. 이것은 일차 전사물 또는 가공된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA는 (단일 가이드 RNA의 일부로서 또는 2-분자 gRNA의 일부로서 별개의 분자로서) 야생형 tracrRNA 서열의 전부 또는 일부 (예컨대, 야생형 tracrRNA 서열의 약 또는 약 20개 이상, 약 또는 약 26개 이상, 약 또는 약 32개 이상, 약 또는 약 45개 이상, 약 또는 약 48개 이상, 약 또는 약 54개 이상, 약 또는 약 63개 이상, 약 또는 약 67개 이상, 약 또는 약 85개 이상, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다. 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 야생형 tracrRNA 서열의 예로는 171개-뉴클레오타이드, 89개-뉴클레오타이드, 75개-뉴클레오타이드, 및 65개-뉴클레오타이드 버전을 들 수 있다. 예컨대, Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-607; WO 2014/093661 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 단일-가이드 RNA (sgRNA) 내의 tracrRNA의 예로는 sgRNA의 +48, +54, +67, 및 +85 버전 내에서 발견되는 tracrRNA 분절을 포함하고, 여기서 "+n"은 야생형 tracrRNA의 +n개의 뉴클레오타이드가 sgRNA에 포함되는 것을 가리킨다. US 8,697,359 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 적어도 60% (예컨대, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다. DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 약 20개의 연속 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 60%일 수 있다. 예로서, DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보하는 가닥의 5' 단부에 있는 14개의 연속 뉴클레오타이드에 걸쳐 100%일 수 있고 나머지에 대해서는 0%로 낮을 수 있다. 이러한 경우에, DNA-표적화 분절은 길이가 14개 뉴클레오타이드인 것으로 여겨질 수 있다. 다른 예로서, DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보하는 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보하는 가닥의 5' 단부에서 7개의 연속 뉴클레오타이드에 걸쳐 100%일 수 있고 나머지에 대해서는 0%로 낮을 수 있다. 이러한 경우에, DNA-표적화 분절은 길이가 7개 뉴클레오타이드인 것으로 여겨질 수 있다. 일부 가이드 RNA에서, DNA-표적화 분절 내의 적어도 17개 뉴클레오타이드는 표적 DNA의 상보하는 가닥에 상보한다. 예를 들어, DNA-표적화 분절은 20개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고 표적 DNA의 상보하는 가닥과 1, 2 또는 3개의 미스매치를 포함할 수 있다. 한 예에서, 미스매치는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 상응하는 상보 가닥의 영역 (즉, PAM 서열의 역 보체)에 인접하지 않는다 (예컨대, 미스매치는 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절의 5' 단부에 있거나, 또는 미스매치는 PAM 서열에 상응하는 상보 가닥의 영역으로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개 염기쌍 떨어져 있다).
gRNA의 단백질-결합 분절은 서로 상보하는 뉴클레오타이드의 두 구간을 포함할 수 있다. 단백질-결합 분절의 상보하는 뉴클레오타이드는 이중 가닥의 RNA 듀플렉스 (dsRNA)를 형성하기 위하여 혼성화한다. 대상 gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 결합된 Cas 단백질을 DNA-표적화 분절을 통해 표적 DNA 내의 특정 뉴클레오타이드 서열로 지시한다.
단일-가이드 RNA는 DNA-표적화 분절 및 스캐폴드 서열 (즉, 가이드 RNA의 단백질-결합 또는 Cas-결합 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 가이드 RNA는 3' 스캐폴드 서열에 연결된 5' DNA-표적화 분절을 가질 수 있다. 예시의 스캐폴드 서열은:
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (버전 1; SEQ ID NO: 12);
GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 2; SEQ ID NO: 13);
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 3; SEQ ID NO: 14); 및
GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 4; SEQ ID NO: 15)를 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진다. 본원에서 개시된 임의의 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 가이드 RNA는, 예를 들어, 가이드 RNA의 3' 단부 상의 임의의 예시의 가이드 RNA 스캐폴드 서열에 융합된 가이드 RNA의 5' 단부 상의 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 단일 가이드 RNA (키메라 가이드 RNA)를 형성하기 위하여 상기 스캐폴드 서열 중 임의의 하나의 5' 단부에 연결될 수 있다.
가이드 RNA는 추가적인 원하는 특징 (예컨대, 변형된 또는 조절된 안정성; 세포내 표적화; 형광 표지로의 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위; 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예로는, 예를 들어, 5' 캡(cap) (예컨대, 7-메틸구아닐레이트 캡 (m7G)); 3' 폴리아데닐화된 꼬리 (즉, 3' 폴리(A) 꼬리); 리보스위치(riboswitch) 서열 (예컨대, 조절된 안정성 및/또는 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 접근성을 허용하기 위한 것임); 안정성 제어 서열; dsRNA 듀플렉스를 형성하는 서열 (즉, 헤어핀); 세포내 장소 (예컨대, 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 등)로 RNA를 표적화하는 변형 또는 서열; 추적을 제공하는 변형 또는 서열 (예컨대, 형광 분자에 대한 직접 컨쥬게이션, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 대한 컨쥬게이션, 형광 검출을 허용하는 서열, 등); 단백질에 대한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열 (예컨대, DNA에 작용하는 단백질, 예컨대 전사 활성자); 및 이것들의 조합을 들 수 있다. 변형의 다른 예로는 조작된 스템 루프 듀플렉스 구조, 조작된 벌지 영역, 스템 루프 듀플렉스 구조의 조작된 헤어핀 3', 또는 이것들의 임의의 조합을 들 수 있다. 예컨대, US 2015/0376586 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 벌지는 crRNA-유사 영역 및 최소 tracrRNA-유사 영역으로 구성된 듀플렉스 내의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 영역일 수 있다. 벌지는, 듀플렉스의 한 쪽에서, 쌍을 이루지 않은 5'-XXXY-3' (여기서 X는 임의의 퓨린이고 Y는 반대쪽 가닥에 있는 뉴클레오타이드와 동요 쌍 (wobble pair)을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드일 수 있음)를 포함하고, 듀플렉스의 다른 쪽에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 영역을 포함할 수 있다.
미변형 핵산은 분해되기 쉬울 수 있다. 외인성 핵산은 또한 선천성 면역 반응을 유도할 수 있다. 변형은 안정성을 도입시키고 면역원성을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 가이드 RNA는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함한, 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: (1) 비연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 포스포다이에스테르 골격 결합에서 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경 또는 대체; (2) 리보스 당에 있는 2' 하이드록실의 변경 또는 대체와 같은 리보스 당의 구성요소의 변경 또는 대체; (3) 포스페이트 모이어티의 디포스포 링커(dephospho linkers)로의 대체; (4) 자연적으로 발생하는 핵염기의 변형 또는 대체; (5) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형; (6) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형 (예컨대, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티의 컨쥬게이션); 및 (7) 당의 변형. 다른 가능한 가이드 RNA 변형으로는 우라실 또는 폴리-우라실 트랙의 변형 또는 대체를 들 수 있다. 예컨대, WO 2015/048577 및 US 2016/0237455 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 유사한 변형이 Cas-암호화 핵산, 예컨대 Cas mRNA에 대해 만들어질 수 있다. 예를 들어, Cas mRNA는 동의어 코돈을 사용하는 우리딘 고갈에 의해 변형될 수 있다.
한 예로서, 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 있는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다 (예컨대, 염기는 포스포로티오에이트 기인 변형된 포스페이트 기를 가질 수 있다). 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 있는 2, 3, 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부에 있는 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부에 있는 2, 3, 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다 (예컨대, 5' 단부). 예컨대, WO 2017/173054 A1 및 Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
일부 가이드 RNA (예컨대, 단일 가이드 RNA)에서, 가이드 RNA의 적어도 1개의 루프 (예컨대, 2개의 루프)는 하나 이상의 어댑터 (즉, 어댑터 단백질 또는 도메인)에 결합하는 별개의 RNA 서열의 삽입에 의해 변형된다. 이러한 어댑터 단백질은 추가로 하나 이상의 이종성 기능성 도메인, 예컨대 전사 활성화 도메인을 충원하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 어댑터 단백질 (즉, 키메라 어댑터 단백질)을 포함하는 융합 단백질의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 예를 들어, MS2-결합 루프 ggccAACAUGAGGAUCACCCAUGUCUGCAGggcc (SEQ ID NO: 16)는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14에 제시된 sgRNA 스캐폴드 (골격) 또는 WO 2016/049258 및 Konermann et al. (2015) Nature 517(7536):583-588 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 스트렙토코쿠스 피오게네스 CRISPR/Cas9 시스템에 대한 sgRNA 골격의 뉴클레오타이드 +13 내지 +16 및 뉴클레오타이드 +53 내지 +56을 대체할 수 있다. 예컨대, 도 7을 참조한다. 본원에서 사용된 가이드 RNA 넘버링은 가이드 RNA 스캐폴드 서열 (즉, 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절의 하류의 서열)의 뉴클레오타이드 넘버링을 나타낸다. 예를 들어, 가이드 RNA 스캐폴드의 제1 뉴클레오타이드는 +1이고, 스캐폴드의 제2 뉴클레오타이드는 +2이며, 이런 식이다. SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 +13 내지 +16과 상응하는 잔기는, 본원에서 테트라루프로서 언급되는 영역인, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 +9 내지 +21에 걸쳐 있는 영역의 루프 서열이다. SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 +53 내지 +56과 상응하는 잔기는, 본원에서 스템 루프 2로서 언급되는 영역인, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 +48 내지 +61에 걸쳐 있는 영역의 루프 서열이다. SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 다른 스템 루프 서열은 스템 루프 1 (뉴클레오타이드 +33 내지 + 41) 및 스템 루프 3 (뉴클레오타이드 +63 내지 + 75)을 포함한다.그 결과의 구조는 테트라루프 및 스템 루프 2 서열의 각각이 MS2 결합 루프에 의해 대체되어 있는 sgRNA 스캐폴드이다. 테트라루프 및 스템 루프 2는 MS2-결합 루프를 첨가하는 것이 어떠한 Cas9 잔기도 간섭하지 않을 방식으로 Cas9 단백질로부터 돌출된다. 추가적으로, 테트라루프 및 스템 루프 2 부위의 DNA에의 근접성은 이들 위치에 대한 국지화가 DNA와 임의의 충원된 단백질, 예컨대 전사 활성자 사이의 고도의 상호작용을 초래할 수 있음을 가리킨다. 그러므로, 일부 sgRNA에서, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14에 제시된 가이드 RNA 스캐폴드의 +13 내지 +16에 상응하는 뉴클레오타이드 및/또는 +53 내지 +56에 상응하는 뉴클레오타이드 또는 이들 스캐폴드/골격 중 임의의 것과 최적으로 정렬될 때 상응하는 잔기는 하나 이상의 어댑터 단백질 또는 도메인에 결합할 수 있는 별개의 RNA 서열에 의해 대체된다. 대안으로 또는 추가적으로, 어댑터-결합 서열은 가이드 RNA의 5' 단부 또는 3' 단부에 첨가될 수 있다. 테트라루프 및 스템 루프 2 영역에 MS2-결합 루프를 포함하는 예시의 가이드 RNA 스캐폴드는 SEQ ID NO: 40에 제시된 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 테트라루프 및 스템 루프 2 영역에 MS2-결합 루프를 포함하는 예시의 일반적인 단일 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 63에 제시된 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 RNA의 형태로, 2개의 분자로서 (별도의 crRNA 및 tracrRNA) 또는 1개의 분자로서 (sgRNA) 제공될 수 있고, 선택적으로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 gRNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자 (sgRNA) 또는 별도의 RNA 분자 (예컨대, 별도의 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다. 후자의 경우에, gRNA를 암호화하는 DNA는 1개 분자로서 또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 암호화하는 별도의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
gRNA가 DNA의 형태로 제공될 때, gRNA는 세포에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있고 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 구성물의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 암호화하는 DNA는 이종성 핵산을 포함하는 벡터에 있을 수 있다. 이러한 발현 구성물에서 사용될 수 있는 프로모터로는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 성인 줄기 세포, 발달상으로 제한된 선구 세포, 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포, 또는 1세포기 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 들 수 있다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 또한, 예를 들어 양방향성 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터의 특정 예로는 RNA 중합효소 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터, 래트 U6 중합효소 III 프로모터, 또는 마우스 U6 중합효소 III 프로모터를 들 수 있다.
대안으로, gRNA는 다양한 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 예를 들어, T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, WO 2014/089290 및 WO 2014/065596 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 가이드 RNA는 또한 화학적 합성에 의해 제조된 합성적으로 제조된 분자일 수 있다.
가이드 RNA (또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)는 하나 이상의 가이드 RNA (예컨대, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 가이드 RNA) 및 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는 (예컨대, 주어진 보관 조건 (예컨대, -20℃, 4℃, 또는 주변 온도) 하에서 분해 생성물이 한계값 아래로, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 아래로 남아있게 하는 기간을 연장시키는; 또는 생체내에서 안정성을 증가시키는) 담체를 포함하는 조성물로 있을 수 있다. 이러한 담체의 비제한적인 예로 폴리(락트산) (PLA) 미소구, 폴리(D,L-락틱-코글리콜-산) (PLGA) 미소구, 리포솜, 미셸, 역 미셸, 지질 코킬레이트(lipid cochleates), 및 지질 미세소관을 들 수 있다. 이러한 조성물은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질, 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
(2) 가이드 RNA 표적 서열
가이드 RNA에 대한 표적 DNA는, 충분한 결합 조건이 존재한다면, gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합하게 될 DNA에 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 적합한 DNA/RNA 결합 조건으로는 세포에 정상적으로 존재하는 생리적 조건을 들 수 있다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건 (예컨대, 세포-유리 시스템에서의 조건)은 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001) (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). gRNA에 상보하고 그것과 혼성화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보하는 가닥"으로 불릴 수 있고, "상보하는 가닥"에 상보하는 (따라서 Cas 단백질 또는 gRNA에는 상보하지 않는) 표적 DNA의 가닥은 "비상보 가닥" 또는 "주형 가닥"으로 불릴 수 있다.
표적 DNA는 가이드 RNA가 혼성화하는 상보하는 가닥 상의 서열 및 비-상보 가닥 상의 (예컨대, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한) 상응하는 서열을 모두 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "가이드 RNA 표적 서열"은 가이드 RNA가 상보하는 가닥에서 혼성화하는 서열에 상응하는 (즉, 그것의 역 보체) 비-상보 가닥 상의 서열을 구체적으로 나타낸다. 즉, 가이드 RNA 표적 서열은 PAM에 인접한 비-상보 가닥 상의 서열을 구체적으로 나타낸다 (예컨대, Cas9의 경우에 PAM의 상류 또는 5'). 가이드 RNA 표적 서열은 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 동등하지만, 우라실 대신 티민을 포함한다. 한 예로서, SpCas9 효소에 대한 가이드 RNA 표적 서열은 비-상보 가닥 상의 5'-NGG-3' PAM의 상류 서열을 나타낼 수 있다. 가이드 RNA는 표적 DNA의 상보하는 가닥에 상보하도록 설계되고, 이때 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보하는 가닥 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요하지는 않다. 만약 본원에서 가이드 RNA가 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 것으로서 언급된다면, 그것이 의미하는 것은 가이드 RNA가 비-상보 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 역 보체인 표적 DNA의 상보하는 가닥 서열에 혼성화한다는 것이다.
표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 세포의 핵 또는 세포질에 또는 세포의 소기관 내에, 예컨대 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 위치할 수 있다. 표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 세포에 내인성이거나 외인성인 임의의 핵산 서열일 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열은 유전자 생성물 (예컨대, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비코딩 서열 (예컨대, 조절 서열)일 수 있거나 둘 다를 포함할 수 있다.
표적 서열은 유전자의 전사 시작 부위에 인접한 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 전사 시작 부위에서 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 1 염기쌍 내에, 전사 시작 부위의 상류로 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 1 염기쌍 내에, 또는 전사 시작 부위의 하류로 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 1 염기쌍 내에 있을 수 있다. 선택적으로, 표적 서열은 전사 시작 부위의 상류로 200 염기쌍 및 전사 시작 부위의 하류로 1 염기쌍의 영역 (-200 to +1) 내에 있다.
표적 서열은 전사 활성화를 위해 표적화되는 것이 바람직한 임의의 유전자 내에 있을 수 있다. 일부 경우에, 표적 유전자는 비발현 유전자 또는 약하게 발현하는 (예컨대, 바탕값 이상으로 최소한으로, 예컨대 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 또는 2배로만 발현되는) 유전자인 것일 수 있다. 표적 유전자는 또한 대조군 유전자와 비교하여 저수준으로 발현되는 것일 수 있다. 표적 유전자는 또한 후생적으로 침묵하는 것일 수 있다. 용어 "후생적으로 침묵하는"은 돌연변이와 같은 유전자 변화 이외의 메커니즘으로 인해, 전사되지 않는 또는 대조군 샘플 (예컨대, 상응하는 대조군 세포, 예컨대 정상 세포)에서 유전자의 전사 수준과 관련하여 감소된 수준으로 전사되는 유전자를 나타낸다. 유전자 침묵의 후생적 메커니즘은 잘 알려져 있고, 예를 들어, 유전자의 5' 조절 영역의 CpG 섬(CpG island)에서의 CpG 다이뉴클레오타이드의 과메틸화 및, 예를 들어, 히스톤 아세틸화로 인한, 유전자 전사가 감소되거나 억제되도록 하는 크로마틴의 구조적 변화를 포함한다.
표적 유전자는 특정 장기 또는 조직, 예컨대 간에서 발현된 유전자를 포함할 수 있다. 표적 유전자는 질환-관련 유전자를 포함할 수 있다. 질환-관련 유전자는 비정상적인 수준으로 전사 또는 번역 생성물을 생산하는 또는 비-질환 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여 질환-환부 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상적인 형태로 있는 임의의 유전자를 나타낸다. 그것은 비정상적으로 고수준으로 발현되는 유전자일 수 있는데, 그 경우 변경된 발현은 질환의 발생 및/또는 진행과 상관이 있다. 질환-관련 유전자는 또한 질환의 발병에 기여하는 돌연변이 또는 유전자 변이를 가진 유전자를 나타낸다. 전사된 또는 번역된 생성물은 알려진 것이거나 미지의 것일 수 있고, 정상 또는 비정상 수준으로 있을 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 단백질 응집 질환 및 장애, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 프리온병, 및 트랜스티레틴 아밀로이드증 (예컨대, Ttr)과 관련된 유전자일 수 있다. 표적 유전자는 또한 질환 또는 질병, 예컨대 고콜레스테롤혈증 또는 죽상 동맥경화증과 관련된 경로에 관여하는 유전자, 또는 과다발현이 이러한 질환 또는 질병을 모델로 할 수 있을 때의 유전자일 수 있다. 표적 유전자는 또한 하나 이상의 암 유형에서 발현된 또는 과다발현된 유전자일 수 있다. 예컨대, Santarius et al. (2010) Nat. Rev. Cancer 10(1):59-64 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
이러한 표적 유전자의 한 가지 특정한 예는 Ttr 유전자이다. 선택적으로, Ttr 유전자는 병원성 돌연변이 (예컨대, 아밀로이드증을 유발하는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는, 예컨대, WO 2018/007871 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제공된다. 예시의 인간 TTR 단백질 및 예시의 인간 TTR 유전자는 각각 UniProt ID P02766 및 Entrez Gene ID 7276으로 식별된다. 예시의 마우스 TTR 단백질 및 예시의 마우스 Ttr 유전자는 각각 UniProt ID P07309 및 Entrez Gene ID 22139에 의해 식별된다. 트랜스티레틴 (TTR)은 혈청 및 갑상선 호르몬 및 레티놀-결합 단백질을 레티놀로 운반하는 뇌척수액에서 발견되는 단백질이다. 간은 TTR을 혈액으로 분비하는 한편, 맥락막 신경총은 그것을 뇌척수액으로 분비한다. TTR은 또한 망막 색소 상피에서 생성되고 유리체로 분비된다. 잘못 접혀지고 응집된 TTR은 아밀로이드 질환 노인성 전신성 아밀로이드증 (SSA), 가족성 아밀로이드 다발신경병증 (FAP), 및 가족성 아밀로이드 심근병증 (FAC)에서 다수 조직 및 장기에서 축적된다. 트랜스티레틴 (TTR)은 간에 의해 주로 합성되지만 맥락막 신경총에 의해서도 생성되는, 127-개 아미노산, 55 kDa의, 혈청 및 뇌척수액 수송 단백질이다. 이것은 또한 프리알부민, 티록신 결합 프리알부민, ATTR, TBPA, CTS, CTS1, HEL111, HsT2651, 및 PALB로도 언급되었다. 이것의 천연 상태에서, TTR은 테트라머로서 존재한다. 동형접합체에서, 단일-테트라머는 동일한 127개-아미노산 베타 시트-풍부 하위단위를 포함한다. 이형접합체에서, TTR 테트라머는 전형적으로 통계학적 양식으로 조합된 변이체 및/또는 야생형 하위단위로 구성될 수 있다. TTR은 혈청 및 뇌척수액에서 티록신 (T4) 및 레티놀-결합 RBP (레티놀-결합 단백질)을 운반하는 데 기여한다. 마우스 Ttr 유전자에서 (PAM을 포함하지 않는) 가이드 RNA 표적 서열의 예는 각각 SEQ ID NO: 34, 35, 및 36에서 제시된다. SEQ ID NO: 34는 Ttr 전사 시작 부위의 -63에 위치하고 (게놈 좌표: build mm10, chr18, + 가닥, 20665187 - 20665209), SEQ ID NO: 35는 Ttr 전사 시작 부위의 -134에 위치하며 (게놈 좌표: build mm10, chr18, + 가닥, 20665116 - 20665138), SEQ ID NO: 36은 Ttr 전사 시작 부위의 -112에 위치한다 (게놈 좌표: build mm10, chr18, + 가닥, 20665138 - 20665160). 각각 SEQ ID NO: 34, 35, 및 36에 제시된 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 가이드 RNA DNA-표적화 분절은 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 및 43에 제시된다. 이들 DNA-표적화 분절을 포함하는 단일 가이드 RNA의 예는 각각 SEQ ID NO: 37, 38, 및 39에 제시된다.
표적 유전자의 다른 예는 프로단백질 전환효소 서브틸리신/헥신 유형 9 (PCSK9) 및 저밀도 리포단백질 (LDL) 수용체 (LDLR)이다. 예시의 인간 PCSK9 단백질 및 예시의 인간 PCSK9 유전자는 각각 UniProt ID Q8NBP7 및 Entrez Gene ID 255738에 의해 식별된다. 예시의 마우스 PCSK9 단백질 및 예시의 마우스 Pcsk9 유전자는 각각 UniProt ID Q80W65 및 Entrez Gene ID 100102에 의해 식별된다. 예시의 인간 LDLR 단백질 및 예시의 인간 LDLR 유전자는 각각 UniProt ID P01130 및 Entrez Gene ID 3949에 의해 식별된다. 예시의 마우스 LDLR 단백질 및 예시의 마우스 Ldlr 유전자는 각각 UniProt ID P35951 및 Entrez Gene ID 16835에 의해 식별된다.
LDLR은 콜레스테롤-풍부 LDL의 세포내이입을 매개하고 그로써 LDL의 혈장 수준을 유지한다. 이것은 모든 핵화된 세포에서 발생하지만, 주로 간에서 일어나며, 간은 약 70%의 LDL을 순환으로부터 제거한다. LDL 수용체는 LDL 입자에 결합하여 세포외 유체로부터 세포 안으로 LDL 입자의 흡수를 개시하고, 그로써 LDL 입자 농도를 감소시킨다. LDL이 LDLR에 결합할 때, 그것은 엔도솜 내에서 LDLR-LDL 복합체의 내부화를 유도한다. 엔도솜 환경의 산성은 LDLR이 헤어핀 형태를 채택하도록 유도한다. 형태의 변화는 LDLR이 그것의 LDL 리간드를 방출하는 것을 유발하고, 수용체는 형질막으로 재순환된다. 인간에서, LDL은 혈액의 LDL-콜레스테롤의 축적으로 인한, 대부분의 심혈관 질환의 원인이 되는 과정인 죽상 동맥경화증의 발생에 직접적으로 관여한다.
PCSK9가 LDLR에 결합할 때, PCSK9는 수용체-리간드 복합체의 형태 변화를 방지한다. 이런 억제는 LDLR이 대신 리소솜으로 가도록 재지시한다. PCSK9는 주로 형질 막 상의 LDLR 수준을 감소시킴으로써, 콜레스테롤 항상성에서 주요 조절 역할을 한다. 감소된 LDLR 수준은 고콜레스테롤혈증으로 이어질 수 있는 LDL 입자의 대사 감소를 초래한다. 만약 PCSK9가 차단되면, 더 많은 LDLR이 재순환되고 세포외 유체로부터 LDL 입자를 제거하기 위하여 세포 표면에 존재한다. 그러므로, PCSK9를 차단하는 것은 혈중 LDL 입자 농도를 저하시킬 수 있는 반면, PCSK9의 발현을 증가시키는 것은 혈중 LDL 입자 농도를 증가시킬 수 있다. 그러므로, 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 의 발현을 활성화시키는 것은 죽상 동맥경화증 (동맥의 경화)으로 이어질 수 있는 고콜레스테롤혈증 (혈액에 고수준의 콜레스테롤이 존재함)을 모델링하기 위해 사용될 수 있다.
마우스 Ldlr 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열 (PAM을 포함하지 않음)의 예는 각각 SEQ ID NO: 75, 76, 및 77에 제시된다. 각각 SEQ ID NO: 75, 76, 및 77에 제시된 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 가이드 RNA DNA-표적화 분절은 각각 SEQ ID NO: 81, 82, 및 83에 제시된다. 이들 DNA-표적화 분절을 포함하는 단일 가이드 RNA의 예는 각각 SEQ ID NO: 78, 79, 및 80에 제시된다.
마우스 Pcsk9 유전자에서 가이드 RNA 표적 서열 (PAM을 포함하지 않음)의 예는 각각 SEQ ID NO: 89, 90, 및 91에 제시된다. 각각 SEQ ID NO: 89, 90, 및 91에 제시된 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 가이드 RNA DNA-표적화 분절은 각각 SEQ ID NO: 95, 96, 및 97에 제시된다. 이들 DNA-표적화 분절을 포함하는 단일 가이드 RNA의 예는 각각 SEQ ID NO: 92, 93, 및 94에 제시된다.
Cas 단백질에 의한 부위-특이적 결합 및 표적 DNA의 절단은 (i) 가이드 RNA와 표적 DNA의 상보하는 가닥 사이의 염기쌍 상보성 및 (ii) 표적 DNA의 비-상보 가닥에 있는, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)로 불리는 짧은 모티프 둘 다에 의해 결정된 장소에서 일어날 수 있다. PAM은 가이드 RNA 표적 서열 측면에 있을 수 있다. 선택적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 3' 단부에서 PAM이 측면에 있을 수 있다 (예컨대, Cas9의 경우). 대안으로, 가이드 RNA 표적 서열은 5' 단부에서 PAM이 측면에 있을 수 있다 (예컨대, Cpf1의 경우). 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열의 상류 또는 하류로 약 1 내지 약 10 또는 약 2 내지 약 5 염기쌍 (예컨대, 3 염기쌍)에 (예컨대, 가이드 RNA 표적 서열 내에) 있을 수 있다. SpCas9의 경우에, PAM 서열 (즉,비-상보 가닥 상의)은 5'-N1GG-3'일 수 있고, 여기서 N1은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이며, PAM은 표적 DNA의 비-상보 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 바로 3'에 있다. 그로써, 상보하는 가닥 상의 PAM에 상보하는 서열 (즉, 역 보체)은 5'-CCN2-3'일 것이고, 여기서 N2는 임의의 DNA 뉴클레오타이드이며, 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절이 표적 DNA의 상보하는 가닥에서 혼성화하는 서열의 바로 5'에 있다. 일부 이러한 경우에, N1 및 N2는 상보하는 것일 수 있고 N1- N2 염기쌍은 임의의 염기쌍일 수 있다 (예컨대, N1=C 및 N2=G; N1=G 및 N2=C; N1=A 및 N2=T; 또는 N1=T, 및 N2=A). S. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우에, PAM은 NNGRRT 또는 NNGRR일 수 있고, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있으며, R은 G 또는 A일 수 있다. C. 제주니로부터의 Cas9의 경우에, PAM은, 예를 들어, NNNNACAC 또는 NNNNRYAC일 수 있고, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있으며, R은 G 또는 A일 수 있다. 일부 경우에 (예컨대, FnCpf1의 경우), PAM 서열은 5' 단부의 상류일 수 있고 서열 5'-TTN-3'를 가진다.
가이드 RNA 표적 서열의 예는 SpCas9 단백질에 의해 인식된 NGG 모티프 직전의 20개-뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM의 두 예는 GN19NGG (SEQ ID NO: 17) 또는 N20NGG (SEQ ID NO: 18)이다. 예컨대, WO 2014/165825 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 5' 단부에 있는 구아닌은 세포에서 RNA 중합효소에 의한 전사를 용이하게 할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM의 다른 예는 시험관내에서 T7 중합효소에 의한 효율적인 전사를 용이하게 하기 위해 5' 단부에 2개의 구아닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다 (예컨대, GGN20NGG; SEQ ID NO: 19). 예컨대, WO 2014/065596 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 다른 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM은 5' G 또는 GG 및 3' GG 또는 NGG를 포함하는, SEQ ID NO: 17-19의 길이가 4 내지 22개인 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 또 다른 가이드 RNA 표적 서열 플러스 PAM은 SEQ ID NO: 17-19의 길이가 4 내지 20개인 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
표적 DNA에 혼성화된 CRISPR 복합체의 형성은 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 영역 내에서 또는 근처에서 표적 DNA의 하나 또는 양 가닥의 절단을 초래할 수 있다 (즉, 표적 DNA의 비-상보 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 및 가이드 RNA가 혼성화하는 상보하는 가닥 상의 역 보체). 예를 들어, 절단 부위는 가이드 RNA 표적 서열 내에 (예컨대, PAM 서열과 관련하여 규정된 장소에) 있을 수 있다. "절단 부위"는 Cas 단백질이 단일-가닥 파괴 또는 이중-가닥 파괴를 유발하는 표적 DNA의 위치를 포함한다. 절단 부위는 이중-가닥 DNA의 단지 한 가닥에만 (예컨대, 닉카아제가 사용될 때) 또는 양 가닥에 있을 수 있다. 절단 부위는 양 가닥 상의 동일한 위치에 있거나 (블런트 단부를 생성함; 예컨대 Cas9) 또는 각 가닥 상의 상이한 부위에 있을 수 있다 (엇갈린 단부 (즉, 돌출 단부)를 생성함; 예컨대, Cpf1). 엇갈린 단부는, 예를 들어, 2개의 Cas 단백질을 사용함으로써 생성될 수 있는데, 이것들은 각각 상이한 가닥 상의 상이한 절단 부위에서 단일-가닥 파괴를 유발함으로써, 이중-가닥 파괴를 유발한다. 예를 들어, 돌출 단부가 생성되도록 제1 닉카아제는 이중-가닥 DNA (dsDNA)의 제1 가닥에서 단일-가닥 파괴를 생성하고, dsDNA의 제2 가닥에서 단일-가닥 파괴를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 제1 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 또는 닉카아제의 절단 부위는 제2 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 또는 닉카아제의 절단 부위로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 또는 1,000 염기쌍 만큼 분리된다.
D. 재조합효소 및 재조합효소 삭제자(Deleter) 비인간 동물
카세트가 본원에서 개시된 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식된 재조합효소 인식 부위가 측면에 있는 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자의 하류에 있는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, SAM 발현 카세트, 가이드 RNA 발현 카세트, 또는 재조합효소 발현 카세트를 포함하는 세포 또는 비인간 동물은 부위-특이적 재조합효소의 발현을 구동시키는 재조합효소 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 재조합효소를 암호화하는 핵산은 게놈상으로 통합되거나, 또는 재조합효소 또는 핵산은 본원의 다른 곳에서 개시된 방법 (예컨대, LNP-매개 전달 또는 AAV-매개 전달)을 사용하여 그러한 세포 및 비인간 동물에 도입될 수 있다. 전달 방법은 본원의 다른 곳에서 개시된 재조합효소의 조직-특이적 전달을 제공하기 위하여 선택될 수 있다.
부위-특이적 재조합효소는 2개의 재조합 부위가 단일 핵산 내에서 또는 별도의 핵산 상에서 물리적으로 분리되어 있는, 재조합효소 인식 부위 사이의 재조합을 용이하게 하는 효소를 포함한다. 재조합효소의 예로는 Cre, Flp, 및 Dre 재조합효소를 들 수 있다. Cre 재조합효소 유전자의 한 예는 Crei로, Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손이 원핵 세포에서 그것의 발현을 방지하기 위해 인트론에 의해 분리되어 있다. 이러한 재조합효소는 핵으로의 국지화를 용이하게 하기 위하여 핵 국지화 신호를 추가로 포함할 수 있다 (예컨대, NLS-Crei). 재조합효소 인식 부위는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 재조합 사건에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 재조합효소 인식 부위의 예로 FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox, 및 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, 및 lox5171과 같은 lox 부위를 들 수 있다.
재조합효소 발현 카세트는 본원에서 개시된 다른 발현 카세트로부터의 상이한 표적 게놈 유전자좌에서 통합되거나, 또는 그것은 동일한 표적 유전자좌에서 게놈상으로 통합될 수 있다 (예컨대, Rosa26 유전자좌, 예컨대 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론에 통합됨). 예를 들어, 세포 또는 비인간 동물은 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트) 및 재조합효소 발현 카세트의 각각에 대해 이형접합성일 수 있고, 이때 표적 게놈 유전자좌의 한 대립유전자는 SAM 발현 카세트를 포함하며, 표적 게놈 유전자좌의 제2 대립유전자는 재조합효소 발현 카세트 발현 카세트를 포함한다. 마찬가지로, 세포 또는 비인간 동물은 가이드 RNA 발현 카세트 (예컨대, 가이드 RNA 어레이 발현 카세트) 및 재조합효소 발현 카세트의 각각에 대해 이형접합성일 수 있고, 이때 표적 게놈 유전자좌의 한 대립유전자는 RNA 발현 카세트를 포함하며, 표적 게놈 유전자좌의 제2 대립유전자는 재조합효소 발현 카세트 발현 카세트를 포함한다.
재조합효소 발현 카세트의 재조합효소 유전자는 임의의 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 예를 들어, 프로모터는 조직-특이적 프로모터 또는 발달 단계-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 이것들이 원하는 조직에서 또는 단지 원하는 발달 단계에서만 표적 유전자의 전사를 선택적으로 활성화할 수 있기 때문에 유리하다. 예를 들어, Cas 단백질의 경우에, 이것은 생체내에서 Cas-매개 독성의 가능성을 감소시킬 수 있다. 마우스 재조합효소 삭제 스트레인의 예시의 프로모터의 비제한적인 목록이 표 2에 제공된다.
마우스 재조합효소 삭제자 스트레인에서 사용된 예시의 프로모터.
프로모터 (종) 발현 부위
ACTA1　(인간) 원체절 및 심장의 성인 횡문근 섬유 및 배아 횡문근 세포
Adipoq,　아디포넥틴, C1Q 및 콜라겐 도메인 함유 (마우스) 백색 지방 조직 (WAT) 및 갈색 지방 조직 (BAT)
Agrp　(마우스) 시상하부의 ArGP 뉴런
Alb, 알부민 (래트) 간
Alb1, 알부민 (마우스) 간
Amh　(마우스) 고환 세르톨리 세포
Aqp2　(마우스) 신장 세포 (집합 관, 좌측) 및 고환 (정자, 우측).
Calb2, 칼빈딘 2 뇌 및 피질의 칼레티닌 인터뉴런
Camk2a, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II 알파 (마우스) 전뇌, 구체적으로 해마의 CA1 피라미드형 세포 층
Cck,　콜레시스토키닌 (마우스) 피질의 및 성인 척수 및 배아일 15.5의 척수 및 심장에서의 콜레시스토키닌 양성 뉴런 (인터뉴런)
CD2, CD2 분자 (인간) T 세포 및 B 세포 (모두 전용 B 세포 및 T 세포 선조세포))
Cd19 B 세포
Cdh5, 캐드헤린 5 발달 중인 및 정지한 혈관, 및 조혈 세포의 하위세트의 내피
Chd16　(마우스) 신장 세관, 특히 집합 관, 헨레(Henle) 및 원위 세관의 루프
Chat, 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (마우스) 콜린성 뉴런
Ckmm　(마우스) 골격 및 심장 근육
Cort,　코르티스타틴 Cort-발현 세포 (CST 양성 뉴런)
Crh, 코르티코트로핀 방출 호르몬 CRH-양성 뉴런
Cspg4 (마우스) 중추신경계의 NG2-발현 신경교 (다중수지상세포, 희소돌기아교세포 선조 세포) 및 다른 장기의 NG2-발현 세포; 뇌량; CNS 및 고환 및 혈관과 같은 다른 조직
Cyp39a1, 시토크롬 P450, 패밀리 39, 하위패밀리 a, 폴리펩타이드 1 (마우스) 대뇌 피질, 해마, 선조체, 후각 벌브, 소뇌
dlx6a, 원위성 없는 호메오박스 유전자 6a GABA성 전뇌 뉴런
Ella, 아데노바이러스 (아데노바이러스) 자손에게 유전자 변경을 전파하는 생식 세포를 포함한, 광범위한 조직
Emx1, 빈 숨구멍 상동체 1 (초파리) 신피질 및 해마, 및 뇌 외피의 교질 세포의 뉴런
En1,　인그레일드(engrailed) 1 척수 V1 인터뉴런, 배아 중간뇌 및 E9에 의한 롬보미어 1, 뿐만 아니라 사지의 복부 외배엽, 체세포의 하위세트, 및 일부 중배엽-유래 조직에서
Fabp4,　지방산 결합 단백질 4 갈색 및 백색 지방 조직
Foxd1　(마우스) 신장의 간질 세포가 될 운명의 세포에서의 뒤콩팥 중배엽의 신장 발달, 및 신체 전체의 다중 장기
Foxp3　(마우스) 림프절, 비장 및 흉선으로부터의 Cd4+Cd25<high>Cd127<low>T 세포; 난소
Gad2, 글루탐산 탈카르복실화제 2 Gad2-양성 뉴런
GFAP, 신경교 섬유질 산성 단백질 (인간) 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 및 일부 뉴런을 포함한 중추신경계; 또한 간의 문맥주위 세포
Gfap　(마우스) 뇌 및 척수의 성상세포, 뿐만 아니라 출생후 및 성인 GFAP-발현 신경 줄기 세포 및 이것의 뇌에서의 자손; e15.5에서의 연)골 원기(primordium); 흉선, 심근, 눈의 수정체, 성인의 방광 및 장 근육에 삽입된 말초 신경
Gfap　(마우스) 건강한 뇌 및 척수 전체의 대부분의 성상세포 및 중추신경계 (CNS) 손상 후 본질적으로 모든 성상세포까지; 뇌실하 영역의 성인 줄기의 아집단
Grik4, 글루타메이트 수용체, 이오노트로픽, 카이네이트 4 (마우스) 해마의 CA3 영역에서 14일 후, 및 8주째, 재조합은 CA3의 거의 100%의 피라미드형 세포에서 관찰됨; 다른 뇌 영역
Hspa2, 열 충격 단백질 2 (마우스) 세사기(Leptotene)/접합기(접합체ne) 정모세포
Ins2,　인슐린 2 (래트) 췌장의 베타 세포, 또한 시상하부
Itgax, 인테그린 알파 X (마우스) CD8-, CD8+수지상 세포, 림프절, 폐 및 표피로부터의 조직 유래 수지상 세포, 및 형질세포양 수지상 세포
Kap　(마우스) 수컷 마우스의 신장 피질의 근위 세관 세포; 자궁 및 간
KRT14,케라틴 14 (인간) 피부, 11.75 d.p.c.에서의 치아 라미나를 포함한 구강 외배엽, 및 14.5 ㅇ.a.c.에 의한 치아 상피
Lck, 림프구 단백질 티로신 키나제 (마우스) 흉선세포
Lck　(마우스) 흉선
Lepr　(마우스) 시상하부 (아치형, 배내측, 측면, 복내측 핵), 변연 및 피질 뇌 영역 (기저 편도 핵, 조롱박 피질, 및 측면 내후각 피질), 및 후뇌량팽대 피질
Lyve1　(마우스) 림프 내피
Lyz2, 리소자임 2 (마우스) 단핵세포, 성숙한 애식세포 및 과립구를 포함한 골수성 세포
MMTV 유선, 침샘, 정낭, 피부, 적혈구, B 세포 및 T 세포; 하부 폐, 신장, 간 및 뇌 조직
Mnx1, 운동 뉴런 및 췌장 호메오박스 1 (마우스) 운동 뉴런
Myf5, 근원성 인자 5 골격근 및 진피, 및 여러 이소성 위치
Myh6　(마우스) 심장 조직
Nes,네스틴 (래트) 중추 및 말초 신경계; 소수의 분리된 신장 및 심장 세포
Neurog3, 뉴로게닌 3, (래트) 성인 췌장샘, 소장 장내분비 세포, 위의 내분비 부분, 모든 췌장 내분비 세포, 및 일부 비-내분비 장 세포
Nkx2-1 Cre 재조합효소 활성은 뇌 연합뉴런 전구체, 발달하는 폐, 갑상선, 및 뇌하수체에 대해 Nkx2.1 프로모터/인핸서 영역에 의해 지시된다
NPHS2　(인간) 사구체 발달의 후기 모세관 루프 단계 동안의 족세포 및 성숙한 사구체의 족세포
Nr5a1, 핵 수용체 하위패밀리 5군 A 구성원 1 (마우스) 복내측 해마, 피질, 부신, 뇌하수체 및 생식샘
Omp, 후각 마커 단백질 (마우스) 성숙한 후각 감각 뉴런
Pax3,　쌍을 이룬 박스 유전자 3 E9 내지 11.5 배아의 등 신경관 및 체절 및 심장 신경 능선 세포 및 E11.5 배아의 콜로니 상피 세포
Pf4,　혈소판 인자 4 (마우스) 거핵세포
Pomc1　(마우스) 시상하부의 아치형 핵 및 해마의 치아 이랑에서 분산된 POMC 뉴런
Prdm1　(마우스) 원시 생식 세포
Prm　(마우스) 수컷 생식선
Pvalb, 파브알부민 파브알부민을 발현하는 뉴런, 예컨대 뇌의 연합뉴런 및 배근 신경절의 촉각 구심성 감각 뉴런
Scnn1a　(마우스) 피질, 시상, 중뇌, 및 소뇌
Shh,　소닉 헤지호그 내인성 Shh 발현 패턴
Sim1, 싱글 마인디드(single-minded) 상동체 1 (초파리)(마우스) 뇌실곁 시상하부 및 뇌의 다른 부분
Slc6a3,　용질 담체 패밀리 6 (신경전달물질 수송자, 도파민), 구성원 3 도파민성 세포 그룹 (흑질 (SN) 및 복측 피개 영역 (VTA),뿐만 아니라 적색핵 후 영역에서)
Slc17a6　(마우스) 흥분성 글루타메이트성 뉴런 세포체
Sst, 소마토스타틴 소마토스타틴 양성 뉴런 (말티노티 세포 및 오리엔스-라쿠노섬-몰레큘라(문지기) 세포와 같은 수지상 억제성 연합뉴런을 포함함)
Stra8　(마우스) 출생 후,감수분열 전, 수컷 생식 세포
Syn1　(래트) E12.5와 같은 조기의 뇌, 척수 및 DRG를 포함한 뉴런 세포 뿐만 아니라 성인 뉴런에서
태그ln, 트랜스겔린 (마우스) 평활근
태그ln　(마우스) 성인 평활근 세포 (예컨대 동맥, 정맥, 및 내장 장기) 및 심장 근세포
Tek　(마우스) 배발생 중의 및 성인기의 내피 세포
Thy1　(마우스) 피질 및 해마의 뉴런
Twist2,　트위스트 베이직 나선-루프-나선 전사 인자 2 배아일 9.5 정도로 초기의 중배엽, 아가미궁 및 체절과 같은 중배엽 조직에서, 및 압축된 중간엽-유래 연골세포 및 골모세포에서
Vav1　(마우스) 다양한 종류의 생식선 (고환 및 난소), 및 심장 및 장
Vil1, 빌린 1 (마우스) 소장 및 대장의 융모 및 크립트
Vip, 혈관작용성 장 폴리펩타이드 일부 GABA성 연합뉴런
Wnt1, 윙리스(wingless)-관련 MMTV 통합 부위 1 (마우스) 배아 뉴런관, 중뇌, 중뇌 및 꼬리 간뇌의 등 및 복측 중앙선, 중-후뇌 결합 및 등 척수
Wnt1　(마우스) 발달 중인 신경 능선 및 중뇌
Krt17,　케라틴 17 (마우스) 내인성 케라틴 17 발현 패턴
Osr2, 홀수-건너뜀 관련 2 (초파리), 마우스, 실험실 발달 중인 혈소판 및 비뇨생식관
Trp63,　형질전환 관련 단백질 63 (마우스) 내인성　Trp63 발현 패턴
Prrx1, 쌍을 이룬 관련 호메오박스 1 (래트) 초기 사지 싹 중간엽 및 두개안면 간엽의 하위세트에서, 한정된 암컷 생식선 발현과 함께
Tbx22,　T-박스 전사 인자 22 (마우스) 내인성　Tbx22 발현 패턴
Tgfb3, 형질전환 성장 인자, 베타 3 (마우스)　 배아 및 태아 발달 중의 심장, 아가미궁, 눈 소포, 중뇌, 사지 싹, 중추 구개 상피, 및 수염 모낭
Wnt1, 윙리스-관련 MMTV 통합 부위 1 (마우스) 배아 뉴런관, 중뇌, 꼬리 간뇌, 중후뇌 결합, 등 척수, 및 신경 능선 세포
ACTB, 액틴, 베타 (닭) 대부분의 조직 유형
Col2a1,　콜라겐, 유형 II, 알파 1 (마우스) 배아발생 중 및 출생 후에 연골발생 계통 (연골) 세포
Dlx5,　원위성 없는 호메오박스 5 피질
KRT14,케라틴 14 (인간) 케라틴 생성세포
Lgr5, 류신 풍부 반복부 함유 G 단백질 결합 수용체 5 소장 (소장의 줄기 세포) 및 결장의 크립트 베이스 원주 세포
Myh6, 미오신, 중쇄 폴리펩타이드 6,(마우스) 발달중인 및 성인 심장
Plp1, 단백지질 단백질 (미엘린) 1 (마우스) 희소돌기아교세포 및 슈반 세포
UBC, 유비퀴틴 C (인간) 모든 조직 유형
Wfs1,　볼프람 증후군 1 상동체 (인간) 피질, 해마, 선조체, 시상 및 소뇌
Gt(ROSA)26Sor　 (마우스) 발달 중인 생식선을 포함한, 착상전 대부분의 조직 유형
닭 베타-액틴 프로모터 및 hCMV 즉시 초기 인핸서 어디에나 있음
E. 키메라 Cas 단백질, 키메라 어댑터 단백질, 가이드 RNA, 시너지 활성화 매개자, 또는 재조합효소를 암호화하는 핵산
또한 키메라 Cas 단백질, 키메라 어댑터 단백질, 가이드 RNA, 재조합효소, 또는 이것들의 임의의 조합을 암호화하는 핵산이 제공된다. 키메라 Cas 단백질, 키메라 어댑터 단백질, 가이드 RNA, 및 재조합효소는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기술된다. 예를 들어, 핵산은 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질 둘 다를 암호화하는 핵산을 포함하는 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이 발현 카세트, 재조합효소 발현 카세트, 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있다. 이러한 핵산은 RNA (예컨대, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA일 수 있고, 단일-가닥이거나 이중-가닥일 수 있으며, 선형 또는 원형일 수 있다. DNA는 벡터, 예컨대 발현 벡터 또는 표적화 벡터의 일부분일 수 있다. 벡터는 또한 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 및 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 본원에서 개시된 핵산 중 어느 것이 세포에 도입될 때, 암호화된 키메라 DNA-표적화 단백질, 키메라 어댑터 단백질, 또는 가이드 RNA는 세포에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
선택적으로, 핵산은 특정 세포 또는 유기체로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 관심 있는 임의의 다른 숙주 세포에서, 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위하여 변형될 수 있다.
핵산 또는 발현 카세트는 세포 또는 비인간 동물의 게놈에 (즉, 염색체에) 안정적으로 통합되거나, 또는 그것은 염색체 외부에 위치할 수 있다 (예컨대, 염색체 외에서 복제하는 DNA). 안정적으로 통합된 발현 카세트 또는 핵산은 비인간 동물의 게놈에 무작위로 통합되거나 (즉, 유전자 변형), 또는 그것들은 비인간 동물의 게놈의 예정된 영역에 통합될 수 있다 (즉, 녹인(knock in)). 한 예에서, 핵산 또는 발현 카세트는 본원의 다른 곳에서 기술되는 안전한 은닉 유전자좌에 안정적으로 통합된다. 핵산 또는 발현 카세트가 안정적으로 통합되는 표적 게놈 유전자좌는 그 핵산 또는 발현 카세트에 대해 이형접합성이거나 또는 그 핵산 또는 발현 카세트에 대해 동형접합성일 수 있다. 예를 들어, 표적 게놈 유전자좌 또는 세포 또는 비인간 동물은 SAM 발현 카세트에 대해 이형접합성이고 가이드 RNA 발현 카세트에 대해 이형접합성일 수 있으며, 이때 선택적으로 각각은 상이한 대립유전자 상의 동일한 표적 게놈 유전자좌에 있을 수 있다.
본원에서 기술된 핵산 또는 발현 카세트는 비인간 동물 내에서 생체내에서의 발현 또는 세포 내에서 생체외에서의 발현에 적합한 임의의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 비인간 동물은 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같은 임의의 적합한 비인간 동물일 수 있다. 한 예로서, 핵산 또는 발현 카세트 (예컨대, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 또는 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질 둘 다를 암호화하는 핵산을 포함하는 SAM 카세트)는 표적 게놈 유전자좌에 있는 내인성 프로모터, 예컨대 Rosa26 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 카세트 핵산 또는 발현 카세트는 외인성 프로모터, 예컨대 구성적으로 활성인 프로모터 (예컨대, CAG 프로모터 또는 U6 프로모터), 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 발달상으로 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 프로모터는 잘 알려져 있고 본원의 다른 곳에서 논의된다. 발현 구성물에서 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 또는 접합체 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다.
예를 들어, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 U6 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터 또는 마우스 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 (예컨대, 가이드 RNA를 발현하기 위한)의 특정 예로는 RNA 중합효소 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터, 래트 U6 중합효소 III 프로모터, 또는 마우스 U6 중합효소 III 프로모터를 들 수 있다.
선택적으로, 프로모터는 한 유전자 (예컨대, 키메라 DNA-표적화 단백질을 암호화하는 유전자) 및 제2 유전자 (예컨대, 가이드 RNA 또는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 유전자)의 발현을 다른 방향으로 구동시키는 양방향성 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소: 원위 서열 요소 (DSE), 근위 서열 요소 (PSE), 및 TATA 박스를 함유하는 완전한, 종래의, 단일방향성 Pol III 프로모터; 및 (2) 역방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 PSE 및 TATA 박스를 포함하는 제2 기본 Pol III 프로모터로 이루어질 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 역방향의 전사가 U6 프로모터로부터 유래된 PSE 및 TATA 박스를 첨부함으로써 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성이 될 수 있다. 예컨대, US 2016/0074535 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 두 유전자를 동시에 발현시키기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 전달을 용이하게 하기 위해 압축 발현 카세트의 생성을 허용한다.
하나 이상의 핵산은 다중시스트론성 발현 구성물에 함께 있을 수 있다. 예를 들어, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산은 이중시스트론성 발현 구성물에 함께 있을 수 있다. 예컨대, 도 1A 및 1B를 참조한다. 다중시스트론성 발현 벡터는 동일한 mRNA (즉, 동일한 프로모터로부터 생성된 전사물)로부터 둘 이상의 별도의 단백질을 동시에 발현한다. 단백질의 다중시스트론성 발현에 적합한 전략은, 예를 들어, 2A 펩타이드의 사용 및 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 이러한 구성물은: (1) 하나 이상의 키메라 Cas 단백질 및 하나 이상의 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산; (2) 둘 이상의 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산; (3) 둘 이상의 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 핵산; (4) 둘 이상의 가이드 RNA 또는 둘 이상의 가이드 RNA 어레이를 암호화하는 핵산; (5) 하나 이상의 키메라 Cas 단백질 및 하나 이상의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이를 암호화하는 핵산; (6) 하나 이상의 키메라 어댑터 단백질 및 하나 이상의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이를 암호화하는 핵산; 또는 (7) 하나 이상의 키메라 Cas 단백질, 하나 이상의 키메라 어댑터 단백질, 및 하나 이상의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 한 예로서, 이러한 다중시스트론성 벡터는 mRNA의 내부 영역으로부터 번역 개시를 허용하기 위하여 하나 이상의 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 사용할 수 있다. 다른 예로서, 이러한 다중시스트론성 벡터는 하나 이상의 2A 펩타이드를 사용할 수 있다. 이들 펩타이드는 일반적으로 18 내지 22개 아미노산 길이를 가지는 작은 "자기 절단" 펩타이드이고, 동일한 mRNA로부터 등몰 수준의 다중 유전자를 생성한다. 리보솜은 2A 펩타이드의 C-말단에서 글리시딜-프로필 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰어서, 2A 펩타이드와 그것의 즉시 하류 펩타이드 사이의 "절단"으로 이어진다. 예컨대, Kim et al. (2011) PLoS One 6(4): e18556 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. "절단"은 C-말단 상에서 볼 수 있는 글리신과 프롤린 잔기 사이에서 일어나며, 이것은 상류의 시스트론이 단부에 첨가된 추가적인 소수의 잔기를 가지는 한편, 하류의 시스트론은 프롤린으로 시작할 것임을 의미한다. 그 결과로서, "절단된" 하류 펩타이드는 그것의 N-말단에 프롤린을 가진다. 2A-매개 절단은 모든 진핵 세포에서 보편적인 현상이다. 2A 펩타이드는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스 및 유형 C 로타바이러스로부터 확인되었다. 예컨대, Szymczak et al. (2005) Expert Opin Biol Ther 5:627-638 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 사용될 수 있는 2A 펩타이드의 예로는 토세아아시그나(Thoseaasigna) 바이러스 2A (T2A); 돼지 테스코바이러스-1 2A (P2A); 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 2A (E2A); 및 FMDV 2A (F2A)를 들 수 있다. 예시의 T2A, P2A, E2A, 및 F2A 서열은 다음을 들 수 있다: T2A (EGRGSLLTCGDVEENPGP; SEQ ID NO: 20); P2A (ATNFSLLKQAGDVEENPGP; SEQ ID NO: 21); E2A (QCTNYALLKLAGDVESNPGP; SEQ ID NO: 22); 및 F2A (VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP; SEQ ID NO: 23). GSG 잔기는 절단 효율을 개선하기 위하여 이들 펩타이드 중 어느 것의 5' 단부에 첨가될 수 있다.
핵산 또는 발현 카세트 중 어느 것이든지 또한 코딩 서열 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, SAM 발현 카세트, 가이드 RNA 발현 카세트, 또는 재조합효소 발현 카세트는 발현 카세트에서 코딩 서열(들) 상류의 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식된 재조합효소 인식 부위가 측면에 있을 수 있다. 선택적으로, 재조합효소 인식 부위는 또한, 예를 들어, 약물 내성 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 선택 카세트 측면에 있을 수 있다. 선택적으로 재조합효소 인식 부위는 선택 카세트의 측면에 있지 않는다. 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질 또는 RNA (예컨대, 키메라 Cas 단백질, 키메라 어댑터 단백질, 가이드 RNA, 또는 재조합효소)의 전사 및 발현을 방지한다. 그러나, 부위-특이적 재조합효소에 노출될 때, 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 삭제될 것이고, 단백질 또는 RNA가 발현될 수 있다.
발현 카세트 (예컨대, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 SAM 발현 카세트)에 대한 이러한 구성은, 만약 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자가 조직-특이적 또는 발달 단계-특이적 방식으로 삭제된다면 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물에서 조직-특이적 발현 또는 발달 단계-특이적 발현을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Cas 단백질의 경우에, 이것은 세포 또는 비인간 동물에서 키메라 Cas 단백질의 연장된 발현 또는 비인간 동물 내에서 원하지 않은 발달 단계에 있는 또는 원하지 않는 세포 또는 조직 유형에서 키메라 Cas 단백질의 발현으로 인한 독성을 감소시킬 수 있다. 예컨대, Parikh et al. (2015) PLoS One 10(1):e0116484 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 조직-특이적 또는 발달 단계-특이적 방식으로 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자의 절제는 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물이 조직-특이적 또는 발달 단계-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 부위-특이적 재조합효소에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다면 이루어질 수 있다. 그러면 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 그런 조직에서만 또는 그런 발달 단계에서만 절제되어 조직-특이적 발현 또는 발달 단계-특이적 발현이 가능해질 것이다. 한 예에서, 키메라 Cas 단백질, 키메라 어댑터 단백질, 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질, 또는 가이드 RNA는 간-특이적 방식으로 발현될 수 있다. 비인간 동물의 이러한 "재조합효소 삭제자" 스트레인을 개발하기 위해 사용된 그러한 프로모터의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다.
임의의 전사 종결자 또는 폴리아데닐화 신호가 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 "전사 종결자"는 전사의 종결을 유발하는 DNA 서열을 나타낸다. 진핵세포에서, 전사 종결자는 단백질 인자에 의해 인식되고, 종결 후에는, 폴리(A) 꼬리가 폴리(A) 중합효소의 존재 하에 mRNA 전사물에 첨가되는 과정인 폴리아데닐화가 이어진다. 포유류 폴리(A) 신호는 전형적으로 절단 및 폴리아데닐화 효율을 향상시키기 위하여 작용하는 다양한 보조 서열이 측면에 있을 수 있는 약 45 뉴클레오타이드 길이의 코어 서열로 이루어진다. 코어 서열은 절단 및 폴리아데닐화-특이성 인자 (CPSF)에 의해 인식된, 폴리 A 인식 모티프 또는 폴리 A 인식 서열로 언급된, mRNA의 고도로 보존된 상류 요소 (AATAAA 또는 AAUAAA), 및 절단 자극 인자 (CstF)에 의해 결합된, 빈약하게 규정된 하류 영역 (U 또는 G 및 U가 풍부함)으로 이루어진다. 사용될 수 있는 전사 종결자의 예로, 예를 들어, 인간 성장 호르몬 (HGH) 폴리아데닐화 신호, 유인원 바이러스 40 (SV40) 후기 폴리아데닐화 신호, 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 폴리아데닐화 신호, AOX1 전사 종결 서열, CYC1 전사 종결 서열, 또는 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절하기에 적합한 것으로 알려져 있는 임의의 전사 종결 서열을 들 수 있다.
부위-특이적 재조합효소는 재조합효소 인식 부위 사이의 재조합을 용이하게 할 수 있는 효소를 포함하고, 이때 두 재조합 부위는 단일 핵산 내에서 또는 별도의 핵산 상에 물리적으로 분리된다. 재조합효소의 예로는 Cre, Flp, 및 Dre 재조합효소를 들 수 있다. Cre 재조합효소 유전자의 한 예는 Crei이고, 여기서 Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손은 원핵 세포에서 그것의 발현을 방지하기 위하여 인트론에 의해 분리된다. 이러한 재조합효소는 핵으로의 국지화를 용이하게 하기 위한 핵 국지화 신호를 추가로 포함할 수 있다 (예컨대, NLS-Crei). 재조합효소 인식 부위는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식되고 재조합 사건에 대한 기질로서 작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 재조합효소 인식 부위의 예로는 FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox, 및 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, 및 lox5171과 같은 lox 부위를 들 수 있다.
본원에서 개시된 발현 카세트는 다른 구성요소 또한 포함할 수 있다. 이러한 발현 카세트 (예컨대, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, SAM 발현 카세트, 가이드 RNA 발현 카세트, 또는 재조합효소 발현 카세트)는 발현 카세트의 5' 단부에 3' 스플라이싱 서열 및/또는 코딩 서열 (예컨대, 키메라 Cas 단백질, 메라 어댑터 단백질, 가이드 RNA, 또는 재조합효소를 암호화하는 서열) 뒤에 제2 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 용어 3' 스플라이싱 서열은 스플라이싱 기계에 의해 인식되고 결합될 수 있는 3' 인트론/엑손 경계에 있는 핵산 서열을 나타낸다. 발현 카세트는, 예를 들어, 약물 내성 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 선택 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 선택 마커의 예로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neor), 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제 (puror), 블라스티시딘 S 탈아민효소 (bsrr), 잔틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (gpt), 및 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-k)를 들 수 있다. 선택적으로, 선택 카세트는 부위-특이적 재조합효소에 대한 재조합효소 인식 부위가 측면에 있을 수 있다. 만약 발현 카세트가 상기에서 기술된 것과 같이 코딩 서열의 상류에서 폴리아데닐화 신호 측면에 있는 재조합효소 인식 부위를 또한 포함한다면, 선택 카세트의 측면에는 동일한 재조합효소 인식 부위가 있거나 또는 상이한 재조합효소에 의해 인식된 상이한 세트의 재조합효소 인식 부위가 있을 수 있다.
발현 카세트는 또한 하나 이상의 리포터 단백질, 예컨대 형광 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질)을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 리포터 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명의 다른 곳에서 정의된 형광 리포터 단백질이 사용되거나, 또는 비-형광 리포터 단백질이 사용될 수 있다. 형광 리포터 단백질의 예는 본원의 다른 곳에서 제공된다. 비-형광 리포터 단백질로는, 예를 들어, 조직화학 또는 생물발광 검정에서 사용될 수 있는 리포터 단백질, 예컨대 베타-갈락토시다제, 루시페라제 (예컨대, 레닐라 루시페라제, 반딧불이 루시페라제, 및 NanoLuc 루시페라제), 및 베타-글루쿠로니다제를 들 수 있다. 발현 카세트는 유동 세포분석 검정으로 검출될 수 있는 리포터 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질과 같은 형광 리포터 단백질) 및/또는 조직화학 검정으로 검출될 수 있는 리포터 단백질 (예컨대, 베타-갈락토시다제 단백질)을 포함할 수 있다. 이러한 조직화학 검정의 한 예는 파란색 침전물을 생산하는 X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-D-갈락토피라노시드)의 가수분해를 통해, 또는 베타-메틸움벨리페릴 갈락토시드 (MUG) 및 플루오레세인 다이갈락토시드 (FDG)와 같은 형광발생 기질을 사용하여 조직화학적으로 제자리 베타-갈락토시다제 발현을 시각화하는 것이다.
본원에서 기술된 발현 카세트는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 벡터 또는 플라스미드, 예컨대 바이러스 벡터일 수 있다. 발현 카세트는 단백질 또는 RNA의 발현을 지시할 수 있는 발현 구성물에서 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다 (예컨대, 상류 폴리아데닐화 신호의 제거 시에). 대안으로, 발현 카세트는 표적화 벡터에 있을 수 있다. 예를 들어, 표적화 벡터는 발현 카세트 측면의 상동성 팔을 포함할 수 있고, 상동성 팔은 내인성 서열의 게놈 통합 및/또는 대체를 용이하게 하기 위해 원하는 표적 게놈 유전자좌와의 재조합을 지시하기에 적합하다.
본원에서 기술된 발현 카세트는 시험관내에 있을 수 있거나, 그것은 생체외에서 세포 (예컨대, 배아 줄기 세포) 내에 있을 수 있거나 (예컨대, 게놈상으로 통합되거나 또는 앰색체 외재성), 또는 그것은 생체내에서 유기체 (예컨대, 비인간 동물)에 있을 수 있다 (예컨대, 게놈상으로 통합되거나 또는 염색체외재성). 만약 생체외라면, 발현 카세트(들)는 임의의 유기체로부터의 임의의 유형의 세포에, 예컨대 배아 줄기 세포 (예컨대, 마우스 또는 래트 배아 줄기 세포) 또는 유도된 만능 줄기 세포 (예컨대, 인간 유도된 만능 줄기 세포)와 같은 전능 세포에 있을 수 있다. 만약 생체내라면, 발현 카세트(들)는 임의의 유형의 유기체 (예컨대, 본원의 다른 곳에서 추가로 기술되는 비인간 동물)에 있을 수 있다.
촉매적으로 비활성인 Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 특정 예는 SEQ ID NO: 2에 제시된 dCas9 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 핵산은 SEQ ID NO: 24에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다 (선택적으로 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 dCas9 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단백질을 암호화한다).
키메라 Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 특정 예는 SEQ ID NO: 1에 제시된 키메라 Cas 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 핵산은 SEQ ID NO: 25에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다 (선택적으로 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 키메라 Cas 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단백질을 암호화한다).
어댑터를 암호화하는 핵산의 특정 예는 SEQ ID NO: 7에 제시된 MCP 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 핵산은 SEQ ID NO: 26에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다 (선택적으로 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 MCP 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단백질을 암호화한다).
키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO: 6에 제시된 키메라 어댑터 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 핵산은 SEQ ID NO: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다 (선택적으로 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 키메라 어댑터 단백질 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단백질을 암호화한다).
전사 활성화 도메인을 암호화하는 핵산의 특정 예는 SEQ ID NO: 3, 8, 또는 9에 각각 제시된 VP64, p65, 또는 HSF1 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 핵산은 SEQ ID NO: 28, 29, 또는 30에 각각 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다 (선택적으로 서열은 SEQ ID NO: 3, 8, 또는 9에 제시된 VP64, p65, 또는 HSF1 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단백질을 암호화한다).
한 예시의 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트는 5'에서 3' 쪽으로: (a) 3' 스플라이싱 서열; (b) 제1 재조합효소 인식 부위 (예컨대, loxP 부위); (c) 약물 내성 유전자에 대한 코딩 서열 (예컨대, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neor) 코딩 서열); (d) 폴리아데닐화 신호; (e) 제2 재조합효소 인식 부위 (예컨대, loxP 부위); (f) 키메라 Cas 단백질 코딩 서열 (예컨대, dCas9-NLS-VP64 융합 단백질); (g) 2A 단백질 코딩 서열 (예컨대, T2A 코딩 서열); 및 (e) 키메라 어댑터 단백질 코딩 서열 (예컨대, MCP-NLS-p65-HSF1)을 포함한다. 예컨대, 도 1A 및 SEQ ID NO: 31 (SEQ ID NO: 64에 제시된 코딩 서열 및 SEQ ID NO: 44에 제시된 암호화 단백질)을 참조한다.
한 예시의 일반적인 가이드 RNA 어레이 발현 카세트는 5'에서 3' 쪽으로: (a) 3' 스플라이싱 서열; (b) 제1 재조합효소 인식 부위 (예컨대, rox 부위); (c) 약물 내성 유전자에 대한 코딩 서열 (예컨대, 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제 (puror) 코딩 서열); (d) 폴리아데닐화 신호; (e) 제2 재조합효소 인식 부위 (예컨대, rox 부위); (f) 하나 이상의 가이드 RNA 유전자를 포함하는 가이드 RNA (예컨대, 제1 U6 프로모터와 이어서 제1 가이드 RNA 코딩 서열, 제2 U6 프로모터와 이어서 제2 가이드 RNA 코딩 서열, 및 제3 U6 프로모터와 이어서 제3 가이드 RNA 코딩 서열)를 포함한다. 예컨대, 도 5 및 SEQ ID NO: 32를 참조한다. 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 32의 영역은 SEQ ID NO: 65에 제시된다. 가이드 RNA 어레이 발현 카세트의 재조합효소 인식 부위는 SAM 발현 카세트의 재조합효소 인식 부위와 동일하거나 상이할 수 있다 (예컨대, 동일한 재조합효소 또는 상이한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다). 가이드 RNA 표적화 마우스 Ttr을 암호화하는 이러한 예시의 가이드 RNA 어레이 발현 카세트는 SEQ ID NO: 33에 제시된다. 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 33의 영역은 SEQ ID NO: 66에 제시된다.
또 다른 예시의 일반적인 가이드 RNA 어레이 발현 카세트는 하나 이상의 가이드 RNA 유전자를 포함한다 (예컨대, 제1 U6 프로모터에 이어 제1 가이드 RNA 코딩 서열, 제2 U6 프로모터에 이어 제2 가이드 RNA 코딩 서열, 및 제3 U6 프로모터에 이어 제3 가이드 RNA 코딩 서열). 이러한 예시의 일반적인 가이드 RNA 어레이 발현 카세트는 SEQ ID NO: 66에 제시된다. 특정 유전자에 대한 이러한 가이드 RNA 어레이 발현 카세트의 예는, 예컨대, SEQ ID NO: 33, 66, 67, 71, 84, 85, 및 98에 제시된다.
F. 통합을 위한 게놈 유전자좌
본원에서 기술된 핵산 및 발현 카세트는 세포 또는 비인간 동물의 표적 게놈 유전자좌에서 게놈상으로 통합될 수 있다. 유전자를 발현할 수 있는 임의의 표적 게놈 유전자좌가 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 핵산 또는 카세트가 안정적으로 통합될 수 있는 표적 게놈 유전자좌의 예는 비인간 동물의 게놈의 안전한 은닉 유전자좌이다. 통합된 외인성 DNA와 숙주 게놈 사이의 상호작용은 통합의 신뢰성 및 안전성을 제한할 수 있고 표적화된 유전자 변형으로 인한 것이 아니라 대신 주변의 내인성 유전자 상의 의도하지 않았던 통합 효과로 인한 명백한 표현형 효과로 이어질 수 있다. 예를 들어, 무작위로 삽입된 전이유전자(transgene)는 위치 효과 및 침묵이 수행될 수 있어서, 그것의 발현을 신뢰할 수 없고 예측할 수 없게 만든다. 마찬가지로, 외인성 DNA를 염색체 유전자좌로 통합시키는 것은 주변의 내인성 유전자 및 크로마틴에 영향을 줄 수 있음으로써, 세포 거동 및 표현형을 변경시킨다. 안전한 은닉 유전자좌로는 전이유전자 또는 다른 외인성 핵산 삽입물이 세포 거동이나 표현형을 명백하게 변경시키지 않으면서 (즉, 숙주 세포에 어떠한 유해 효과 없이) 관심 있는 모든 조직에서 안정적으로, 그리고 신뢰할 수 있게 발현될 수 있는 염색체 유전자좌를 들 수 있다. 예컨대, Sadelain et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:51-58 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 예를 들어, 안전한 은닉 유전자좌는 삽입된 유전자 서열의 발현이 인접한 유전자로부터의 어떠한 번역 초과(read-through) 발현에 의해 방해되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 안전한 은닉 유전자좌는 내인성 유전자 구조 또는 발현에 불리하게 영향을 주지 않으면서 예측할 수 있는 방식으로 외인성 DNA가 통합할 수 있고 기능할 수 있는 염색체 유전자좌를 포함할 수 있다. 안전한 은닉 유전자좌는 유전자 외 영역 또는, 예를 들어, 필수적이지 않거나, 불필요하거나, 또는 명백한 표현형 결과 없이 방해받을 수 있는 유전자 내의 유전자좌 같은 유전자내 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 인간에서 Rosa26 유전자좌 및 그것의 동등물은 모든 조직에서 개방된 크로마틴 구성을 제공하고 배아 발생 중에 및 성인에서 어디에서나 발현된다. 예컨대, Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3789-3794 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이에 더불어, Rosa26 유전자좌는 고효율로 표적화될 수 있고, Rosa26 유전자의 파괴는 명백한 표현형을 유발하지 않는다. 안전한 은닉 유전자좌의 다른 예는 CCR5, HPRT, AAVS1, 및 알부민을 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제 7,888,121호; 7,972,854호; 7,914,796호; 7,951,925호; 8,110,379호; 8,409,861호; 8,586,526호; 및 미국 특허 공개 번호 2003/0232410호; 2005/0208489호; 2005/0026157호; 2006/0063231호; 2008/0159996호; 2010/00218264호; 2012/0017290호; 2011/0265198호; 2013/0137104호; 2013/0122591호; 2013/0177983호; 2013/0177960호; 및 2013/0122591호 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. Rosa26 유전자좌와 같은 안전한 은닉 유전자좌의 이중대립유전자 표적화는 부정적 결과를 나타내지 않으며, 따라서 상이한 유전자 또는 리포터가 2개의 Rosa26 대립유전자에 대해 표적화될 수 있다. 한 예에서, 발현 카세트는 Rosa26 유전자좌의 인트론에, 예컨대 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론에 통합된다. 예컨대, 도 2를 참조한다.
표적 게놈 유전자좌에 통합된 발현 카세트는 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나 또는 표적 게놈 유전자좌에 대해 이종성인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 한 예에서, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 또는 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트는 표적 게놈 유전자좌 (예컨대, Rosa26 유전자좌)에 통합되고 표적 게놈 유전자좌에 있는 내인성 프로모터 (예컨대, Rosa26 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 예에서, 가이드 RNA 발현 카세트는 표적 게놈 유전자좌 (예컨대, Rosa26 유전자좌)에 통합되고 하나 이상의 이종성 프로모터 (예컨대, U6 프로모터(들), 예컨대 각각의 가이드 RNA 코딩 서열의 상류의 상이한 U6 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다.
G. 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물
본원에서 기술된 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물이 또한 제공된다. 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 핵산 또는 발현 카세트는 세포 또는 비인간 동물의 게놈에 (즉, 염색체에) 안정적으로 통합되거나 또는 그것은 염색체 외부에 위치할 수 있다 (예컨대, 염색체 외에서 복제하는 DNA). 핵산 또는 발현 카세트는 비인간 동물의 게놈에 무작위로 통합될 수 있거나 (즉, 유전자 변형), 또는 그것은 비인간 동물의 게놈의 예정된 영역 (예컨대, 안전한 은닉 유전자좌)에 통합될 수 있다 (즉, 녹인). 핵산 또는 발현 카세트가 안정적으로 통합되는 표적 게놈 유전자좌는 그 핵산 또는 발현 카세트에 대해 이형접합성이거나, 그 핵산 또는 발현 카세트에 대해 동형접합성일 수 있다. 이배체 유기체는 각각의 유전자 유전자좌에서 2개의 대립유전자를 가진다. 각 대립유전자 쌍은 특정 유전자 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 만약 2개의 동일한 대립유전자가 특정 유전자좌에 있다면 동형접합성으로서, 그리고 만약 2개의 대립유전자가 상이하다면 이형접합성으로서 기술된다. 본원에 기술된 안정적으로 통합된 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물은 그것의 생식선에 그 핵산 또는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
예를 들어, 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 본원에서 개시된 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 또는 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트 (키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 서열 둘 다를 포함함)를 포함할 수 있다. 한 예에서, 게놈, 세포 또는 비인간 동물은 키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 코딩 서열 둘 다를 포함하는 SAM 발현 카세트를 포함한다. 한 예에서, SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)는 게놈에 안정적으로 통합된다. 안정적으로 통합된 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)는 비인간 동물의 게놈에 무작위로 통합되거나 (즉, 유전자 변형), 또는 그것은 비인간 동물의 게놈의 예정된 영역에 통합될 수 있다 (즉, 녹인). 한 예에서, SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)는 게놈의 에정된 영역, 예컨대 안전한 은닉 유전자좌 (예컨대, Rosa26)에 안정적으로 통합된다. SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)가 안정적으로 통합된 표적 게놈 유전자좌는 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다.
선택적으로, 상기 기술된 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 가이드 RNA 발현 카세트 (예컨대, 가이드 RNA 어레이 발현 카세트)를 추가로 포함할 수 있다. 가이드 RNA 발현 카세트는 세포 또는 비인간 동물의 게놈에 (즉, 염색체에) 안정적으로 통합될 수 있거나 또는 그것은 염색체 외부에 위치할 수 있다 (예컨대, 염색체 외에서 복제하는 DNA 또는 AAV, LNP, 또는 본원에서 개시된 임의의 다른 수단을 통해 세포 또는 비인간 동물에 도입된다). 가이드 RNA 발현 카세트는 비인간 동물의 게놈에 무작위로 통합될 수 있거나 (즉, 유전자 변형), 또는 그것은 비인간 동물의 게놈의 예정된 영역 (예컨대, 안전한 은닉 유전자좌)에 통합될 수 있다 (즉, 녹인). 가이드 RNA 발현 카세트가 안정적으로 통합되는 표적 게놈 유전자좌는 가이드 RNA 발현 카세트에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 한 예에서, 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트) 및 가이드 RNA 발현 카세트를 둘 다 포함한다. 한 예에서, EN 카세트는 모두 게놈상으로 통합된다. 가이드 RNA 발현 카세트는 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)와 상이한 표적 게놈 유전자좌에서 통합될 수 있거나, 또는 그것은 동일한 표적 유전자좌에서 게놈상으로 통합될 수 있다 (예컨대, Rosa26 유전자좌, 예컨대 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론에 통합됨). 예를 들어, 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트) 및 가이드 RNA 발현 카세트의 각각에 대해 이형접합성일 수 있고, 이때 표적 게놈 유전자좌 (예컨대, Rosa26)의 한 대립유전자는 SAM 발현 카세트 (또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트)를 포함하며, 표적 게놈 유전자좌의 제2 대립유전자는 가이드 RNA 발현 카세트 발현 카세트를 포함한다.
선택적으로, 상기에서 기술된 게놈, 세포, 또는 비인간 동물의 어느 것이든지 재조합효소 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 재조합효소 발현 카세트는 세포 또는 비인간 동물의 게놈에 (즉, 염색체에) 안정적으로 통합될 수 있거나, 또는 그것은 염색체 외부에 위치할 수 있다 (예컨대, 염색체 외에서 복제하는 DNA 또는 AAV, LNP, 또는 본원에서 개시된 임의의 다른 수단을 통해 세포 또는 비인간 동물에 도입된다). 재조합효소 발현 카세트는 비인간 동물의 게놈에 무작위로 통합될 수 있거나 (즉, 유전자 변형), 또는 그것은 비인간 동물의 게놈의 예정된 영역 (예컨대, 안전한 은닉 유전자좌)에 통합될 수 있다 (즉, 녹인). 재조합효소 발현 카세트가 안정적으로 통합되는 표적 게놈 유전자좌는 재조합효소 발현 카세트에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 재조합효소 발현 카세트는 본원에서 개시된 임의의 다른 발현 카세트와 상이한 표적 게놈 유전자좌에서 통합될 수 있거나, 또는 그것은 동일한 표적 유전자좌에서 게놈상으로 통합될 수 있다 (예컨대, Rosa26 유전자좌, 예컨대 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론에 통합됨).
본원에서 제공된 게놈 또는 세포는, 예를 들어, 진핵 게놈 또는 세포일 수 있고, 예를 들어, 진균 세포 (예컨대, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 및 인간 세포를 들 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류 게놈 또는 세포는, 예를 들어, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 햄스터 세포일 수 있다. 다른 비인간 포유류로는, 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 토끼, 말, 황소, 사슴, 들소, 가축 (예컨대, 암소, 숫소, 등과 같은 소 종; 양, 염소, 등과 같은 양 종; 및 돼지 및 멧돼지와 같은 돼지 종)을 들 수 잇다. 조류로는, 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위, 오리, 등을 들 수 있다. 가축화된 동물 및 농작용 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간"은 인간을 배제한다.
세포는 또한 미분화 또는 분화 상태의 임의의 유형의 것일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능 세포, 만능 세포 (예컨대, 인간 만능 세포 또는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 또는 래트 ES 세포와 같은 비인간 만능 세포), 또는 비-만능 세포일 수 있다. 전능 세포는 임의의 세포 유형으로 발생할 수 있는 미분화 세포를 포함하고, 만능 세포는 하나 이상의 분화된 세포 유형으로 발달할 능력을 가진 미분화 세포를 포함한다. 이러한 만능 및/또는 전능 세포는, 예를 들어, ES 세포 또는 ES-유사 세포, 예컨대 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아로 도입될 때 발달하는 배아의 임의의 조직으로 기여할 수 있는 배아-유도 전능 또는 만능 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내부 세포 집단으로부터 유래될 수 있고 3개의 척추동물 배엽 (내배엽, 외배엽, 및 중배엽) 중 임의의 것의 세포로 분화할 수 있다.
인간 만능 세포의 예로는 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발달상으로 제한된 인간 선조 세포, 및 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 예컨대 프라이밍된 인간 iPS 세포 및 나이브 인간 iPS 세포를 들 수 있다. 유도 만능 줄기 세포는 분화된 성인 세포로부터 직접 유래될 수 있는 만능 줄기 세포를 포함한다. 인간 iPS 세포는 특정 세트의 재프로그래밍 인자, 예를 들어, Oct3/4, Sox 패밀리 전사 인자 (예컨대, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15), Myc 패밀리 전사 인자 (예컨대, c-Myc, l-Myc, n-Myc), Kruppel-유사 패밀리 (KLF) 전사 인자 (예컨대, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5), 및/또는 관련된 전사 인자, 예컨대 NANOG, LIN28, 및/또는 Glis1를 세포에 도입함으로써 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 또한, 예를 들어, 전사 인자, 또는 계통 지정자(lineage specifier)의 작용을 모방하는 작은 분자인 miRNA의 사용에 의해 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 3개의 척추동물 배엽, 예컨대, 내배엽, 외배엽, 또는 중배엽 중 임의의 세포로 분화하는 그것의 능력을 특징으로 한다. 인간 iPS 세포는 또한 적합한 시험관내 배양 조건 하에서 그것의 무한하게 증식하는 능력을 특징으로 한다. 예컨대, Takahashi and Yamanaka (2006) Cell 126:663-676 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 프라이밍된 인간 ES 세포 및 프라이밍된 인간 iPS 세포는 이식후 배반엽상층(epiblast) 세포의 특징과 유사한 특징을 발현하며 계통 지정 및 분화를 위해 전용되는 세포를 포함한다. 나이브 인간 ES 세포 및 나이브 인간 iPS 세포는 이식 전 배아의 내부 세포 집단의 ES 세포의 특징과 유사한 특징을 발현하며 계통 지정에 전용되지 않는 세포를 포함한다. 예컨대, Nichols and Smith (2009) Cell Stem Cell 4:487-492 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본원에서 제공된 세포는 또한 생식 세포 (예컨대, 정자 또는 난모세포)일 수 있다. 세포는 유사분열적으로 경합하는 세포 또는 유사분열적으로 비활성인 세포, 감수분열적으로 경합하는 세포 또는 감수분열적으로 비활성인 세포일 수 있다. 유사하게, 세포는 또한 일차 체세포성 세포 또는 일차 체세포성 세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포성 세포로는 배우자, 생식 세포, 생식모세포, 또는 미분화 줄기 세포가 아닌 임의의 세포를 들 수 있다. 예를 들어, 세포는 간 세포, 신장 세포, 조혈 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 중간엽 세포, 케라틴 생성세포, 혈액 세포, 멜라닌 세포, 단핵세포, 단핵성 세포, 단핵세포 전구체, B 세포, 적혈구-거핵 세포, 호산성 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타 세포, 외분비 세포, 췌장 전구체, 내분비 전구체, 지방세포, 지방전구 세포, 뉴런, 신경교 세포, 신경 줄기 세포, 뉴런, 간모세포, 간세포, 심근세포, 골격 근모세포, 평활근 세포, 관 세포(ductal cell), 선포 세포(acinar cell), 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 담관 세포(cholangiocyte), 백색 또는 갈색 지방 세포, 또는 눈 세포 (예컨대, 섬유 주 세포(trabecular meshwork cell), 망막 색소 상피 세포, 망막 미세 혈관 내피 세포, 망막 혈관주위 세포(retinal pericyte cell), 결막 상피 세포, 결막 섬유모세포, 홍채 색소 상피 세포, 각막 세포, 수정체 상피 세포, 비-색소 섬모 상피 세포, 눈의 맥락막 섬유모세포, 광수용체 세포, 신경절 세포, 양극성 세포, 수평 세포, 또는 무축삭 세포)일 수 있다.
본원에 제공된 적합한 세포는 또한 일차 세포를 포함한다. 일차 세포는 유기체, 장기, 또는 조직으로부터 직접 분리된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 일차 세포는 형질전환되었거나 불멸화된 세포를 포함하지 않는다. 이것들은 이전에 조직 배양을 통과하지 않았거나 이전에 조직 배양을 통과하였지만 조직 배양에서 무한하게 통과할 수 없는, 유기체, 장기, 또는 조직으로부터 얻어진 임의의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 종래 기법에 의해 분리될 수 있고, 예를 들어, 체세포성 세포, 조혈 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 중간엽 세포, 케라틴 생성세포, 멜라닌 세포, 단핵세포, 단핵성 세포, 지방세포, 지방세포 전구체, 뉴런, 신경교 세포, 간세포, 골격 근모세포, 및 평활근 세포를 포함한다. 예를 들어, 일차 세포는 결합 조직, 근육 조직, 신경계 조직, 또는 상피 조직으로부터 유래될 수 있다.
본원에 제공된 다른 적합한 세포는 불멸화된 세포를 들 수 있다. 불멸화된 세포는 정상적으로는 무한하게 증식하지 않겠지만, 돌연변이 또는 변경으로 인해, 정상적인 세포 노화를 피하였고 대신 계속해서 분할할 수 있는 다중세포 유기체로부터의 세포를 포함한다. 이러한 돌연변이 또는 변경은 자연적으로 또는 의도적으로 유도될 수 있다. 불멸화된 세포의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 세포 (예컨대, HEK 293 세포 또는 293T 세포), 및 마우스 배아 섬유모세포 (예컨대, 3T3 세포)를 들 수 있다. 많은 유형의 불멸화된 세포가 잘 알려져 있다. 불멸화된 또는 일차 세포는 전형적으로 재조합 유전자 또는 단백질을 배양 또는 발현시키기 위해 사용된 세포를 포함한다.
본원에 제공된 세포는 또한 1세포기 배아 (즉, 수정된 난모세포 또는 접합체)를 포함한다. 이러한 1세포기 배아는 임의의 유전자 배경으로부터 유래될 수 있고 (예컨대, 마우스의 경우 BALB/c, C57BL/6, 129, 또는 이것들의 조합), 신선한 것이거나 냉동될 수 있으며, 자연적인 번식 또는 시험관내 수정으로부터 유래될 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적인, 건강한 세포이거나, 또는 병든 또는 돌연변이-포함 세포일 수 있다.
본원에서 기술된 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물은 본원의 다른 곳에서 기술된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류는, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 말, 황소, 사슴, 들소, 양, 토끼, 설치류 (예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니아 피그), 및 가축 (예컨대, 암소 및 숫소와 같은 소 종; 양 및 염소와 같은 양 종; 및 돼지 및 멧돼지와 같은 돼지 종)을 들 수 잇다. 조류로는, 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위, 및 오리를 들 수 있다. 가축화된 동물 및 농작용 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간 동물"은 인간을 배제한다. 바람직한 비인간 동물은, 예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 들 수 있다.
비인간 동물은 임의의 유전자 배경으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 마우스는 129 스트레인, C57BL/6 스트레인, 129 및 C57BL/6의 혼합, BALB/c 스트레인, 또는 Swiss Webster 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 129 스트레인의 예로는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예컨대, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 들 수 있다. 예컨대, Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. C57BL 스트레인의 예로는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 들 수 있다. 적합한 마우스는 또한 상기 언급한 129 스트레인과 상기 언급한 C57BL/6 스트레인의 혼합느로부터 유래될 수 있다 (예컨대, 50% 129 및 50% C57BL/6). 마찬가지로, 적합한 마우스는 상기 언급한 129 스트레인들의 혼합 또는 상기 언급한 BL/6 스트레인들의 혼합으로부터 유래될 수 있다 (예컨대, 129S6 (129/SvEvTac) 스트레인).
유사하게, 래트는, 예를 들어, ACI 래트 스트레인, 다크 아구티(Dark Agouti, DA) 래트 스트레인, 위스타(Wistar) 래트 스트레인, LEA 래트 스트레인, 스프라그 다울리(Sprague Dawley, SD) 래트 스트레인, 또는 피셔(Fisher) F344 또는 피셔 F6과 같은 피셔 래트 스트레인을 포함한, 임의의 래트 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 래트는 또한 상기 열거된 둘 이상의 스트레인의 혼합으로부터 유래된 스트레인으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 적합한 래트는 DA 스트레인 또는 ACI 스트레인으로부터 유래될 수 있다. ACI 래트 스트레인은 백색 배 및 발과 RT1 av1 할로타입을 가지는 블랙 아구티를 가지는 것으로 특성화된다. 이러한 스트레인은 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급처로부터 입수 가능하다. 다크 아구티 (DA) 래트 스트레인은 아구티 외피와 RT1 av1 할로타입을 가진 것으로 특성화된다. 이러한 래트는 Charles River and Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급처로부터 입수 가능하다. 일부 경우에, 적합한 래트는 교배된 래트 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, US 2014/0235933 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
III. 표적 유전자의 전사/발현을 증가시키는 방법 및 생체내에서 CRISPR/Cas 활성을 검정하기 위한 방법
생체내에서 하나 이상의 표적 유전자의 전사를 활성화시키거나 살아 있는 동물의 조직 및 장기로 CRISPR/Cas 전달을 평가하거나 그곳에서의 CRISPR/Cas 활성을 평가하기 위하여 본원에 기술된 시너지 활성화 매개자 시스템 및 세포 및 비인간 동물을 사용하는 다양한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 본원의 다른 곳에서 기술된 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물을 사용한다.
A. 생체내에서 또는 생체외에서 표적 유전자의 발현을 증가시키는 방법 또는 표적 유전자의 전사를 활성화시키는 CRISPR/Cas의 능력을 테스트하는 방법
본원에 기술된 비인간 동물을 사용하여 생체내에서 표적 유전자의 발현/전사를 증가/활성화시키기 위한 또는 표적 유전자의 발현/전사를 증가/활성화시키는, 본원에 기술된 CRISPR/Cas 시너지 활성화 매개자 (SAM) 시스템의 능력을 평가하기 위한 다양한 방법이 제공된다. 이러한 비인간 동물은, 예를 들어, SAM 발현 카세트 (키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 코딩 서열을 포함함)를 포함하거나 또는 키메라 Cas 단백질 발현 카세트 또는 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 각각이 본원에서 개시된 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 비인간 동물에 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 가이드 RNA는 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 그것을 하나 이상의 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내함으로써, 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 증가시킨다. 이러한 방법은 하나 이상의 표적 유전자의 발현 또는 전사를 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로, 각각이 표적 유전자 내에서 상이한 가이드 RNA 표적 서열을 된 둘 이상의 가이드 RNA가 도입될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 가이드 RNA가 단일 표적 유전자를 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 각각이 둘 이상의 상이한 표적 유전자의 상이한 가이드 RNA 표적 서열을 표적으로 하도록 (즉, 복합체화) 설계된, 둘 이상의 가이드 RNA가 도입될 수 있다.
선택적으로, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 또는 시너지 활성화 매개자 발현 카세트 (키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 코딩 서열을 포함함)가 코딩 서열(들)의 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 포함하고, 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자 측면에 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식된 재조합효소 인식 부위가 있는 방법에서, 방법은 재조합효소를 비인간 동물에 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 재조합효소는 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 절제함으로써, 하류의 코딩 서열(들)의 발현을 허용할 수 있다.
비인간 동물이 이미 본원의 다른 곳에서 기술된 가이드 RNA 발현 카세트를 포함하고 있는 일부 방법에서, 방법은 단순히 재조합효소를 비인간 동물에 도입시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 재조합효소는 상류의 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 절제함으로써, 키메라 Cas 단백질 및/또는 키메라 어댑터 단백질의 발현을 허용하고, 그로 인해 표적 유전자의 발현/전사가 증가/활성화된다.
선택적으로, 비인간 동물이 키메라 Cas 단백질 발현 카세트를 포함하지만 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트를 포함하지 않는 방법에서, 키메라 어댑터 단백질은 비인간 동물에 도입될 수 있다. 마찬가지로, 비인간 동물이 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트를 포함하지만 키메라 Cas 단백질 발현 카세트를 포함하지 않는 방법에서, 키메라 Cas 단백질 발현 카세트는 비인간 동물에 도입될 수 있다.
생체내에서 CRISPR/Cas 활성을 평가하기 위한 상기에서 제공된 다양한 방법은 또한 본원의 다른 곳에서 기술된 Cas 발현 카세트를 포함하는 세포를 사용하여 생체외에서 CRISPR/Cas 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
가이드 RNA 및, 선택적으로, 재조합효소는 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 전달 방법 (예컨대, AAV, LNP, 또는 HDD) 및 임의의 투여 경로를 통해 임의의 형태 (가이드 RNA의 경우 DNA 또는 RNA; 재조합효소의 경우 DNA, RNA, 또는 단백질)로 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다. 가이드 RNA 또는 재조합효소는 일부 방법에서 조직-특이적 방식으로 도입될 수 있다. 특정 방법에서, 전달은 AAV-매개 전달을 통한 것이다. 예를 들어, AAV8은 만약 간이 표적화된다면 사용될 수 있다. 유사하게, 만약 비인간 동물 또는 세포가 키메라 Cas 단백질 발현 카세트를 포함하지만 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트를 포함하지 않는다면, 키메라 어댑터 단백질은 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 전달 방법 (예컨대, AAV, LNP, 또는 HDD) 및 임의의 투여 경로를 통해 임의의 형태 (DNA, RNA, 또는 단백질)로 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다. 대안으로, 만약 비인간 동물 또는 세포가 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트를 포함하지만 키메라 Cas 단백질 발현 카세트를 포함하지 않는 경우에, 키메라 Cas 단백질은 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 전달 방법 (예컨대, AAV, LNP, 또는 HDD) 및 임의의 투여 경로를 통해 임의의 형태 (DNA, RNA, 또는 단백질)로 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다.
표적 게놈 유전자좌의 증가된 전사 또는 발현을 평가하기 위한 방법은 본원의 다른 곳에 제공되고 잘 알려져 있다. 평가는 본원의 다른 곳에서 개시된 임의의 세포 유형, 임의의 조직 유형, 또는 임의의 장기 유형에서 이루어질 수 있다. 일부 방법에서, 간 세포에서 표적 유전자의 발현이, 예컨대 간 세포에서 표적 게놈 유전자좌에 의해 발현된 분비된 단백질의 혈청 수준을 평가함으로써 평가된다. 만약 표적 유전자가 특정 효소 활성을 가진 단백질을 암호화한다면, 평가는 표적 유전자의 발현 및/또는 그 표적 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 평가는 비인간 동물로부터 분리된 하나 이상의 세포에서의 발현을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 평가는 비인간 동물로부터 표적 장기 또는 조직을 분리하는 단계 및 표적 장기 또는 조직에서 표적 유전자의 발현을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 평가는 또한 표적 장기 또는 조직 내에서 둘 이상의 상이한 세포 유형에서 표적 유전자의 발현을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 유사하게, 평가는 비-표적 장기 또는 조직 (예컨대, 둘 이상의 비-표적 장기 또는 조직)을 비인간 동물로부터 분리하는 단계 및 그 비-표적 장기 또는 조직에서 표적 유전자의 발현을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 방법에서, 표적 유전자는 본원의 다른 곳에서 기술된 질환-관련 유전자일 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 단백질 응집 질환 또는 장애와 관련된 유전자일 수 있다. 특정 예로서, 표적 유전자는 단백질 응집 질환 또는 장애와 관련된 유전자 (예컨대, Ttr)일 수 있고, 방법은 단백질 응집 질환 또는 장애를 모델링하기 위해 그 표적 유전자의 발현을 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 특정 방법에서, 표적 유전자는 Ttr일 수 있다. 선택적으로, Ttr 유전자는 병원성 돌연변이 (예컨대, 아밀로이드증을 유발하는 돌연변이) 또는 병원성 돌연변이들의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는, 예컨대, WO 2018/007871 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제공된다.
다른 방법에서, 표적 유전자는 질환 또는 상태, 예컨대 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증에 관련된 경로에 관여된 것일 수 있다. 일부 특정 방법에서, 표적 유전자는 Pcsk9 또는 Ldlr일 수 있다. 다른 방법에서, 표적 유전자는 과다발현되었을 때 이러한 질환 또는 상태를 모델링할 수 있는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 Pcsk9일 수 있고, 방법은 고콜레스테롤혈증을 모델링하기 위해 Pcsk9의 발현을 증가시키는 단계를 포함할 수 있다.
B. 생체내에서 또는 생체외에서 표적 유전자의 발현을 증가시키는 CRISPR/Cas의 능력을 최적화하는 방법
세포 또는 비인간 동물로의 CRISPR/Cas의 전달을 최적화하기 위한 방법 또는 생체내에서 CRISPR/Cas 전사 활성화 활성을 최적화하기 위한 다양한 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어: (a) 상기에서 기술된 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 CRISPR/Cas의 능력을 먼저 제1 비인간 동물 또는 제1 세포에서 테스트하는 방법을 수행하는 단계; (b) 변수를 변경하고 그 방법을 두 번째로 제2 비인간 동물 (즉, 동일 종의) 또는 제2 세포에서 변경된 변수로 수행하는 단계; 및 (c) 단계 (a)의 표적 유전자의 발현/전사를 단계 (b)에서의 표적 유전자의 발현/전사와 비교하고, 표적 유전자의 최고 발현/전사를 초래하는 방법을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
대안으로 또는 추가적으로, 최고 효능, 최고 일관성, 또는 최고 특이성을 초래하는 방법이 선택될 수 있다. 더 높은 효능은 표적 유전자의 더 높은 수준의 발현/전사를 나타낸다 (예컨대, 세포의 더 높은 백분율이 특정 표적 세포 유형 내에서, 특정 표적 조직 내에서, 또는 특정 표적 장기 내에서 표적화된다). 더 높은 일관성은 만약 한 유형 이상의 세포, 조직, 또는 장기가 표적화된다면 상이한 유형의 표적화된 세포, 조직, 또는 장기 중에서 표적 유전자의 발현/전사의 보다 일관된 증가를 나타낸다 (예컨대, 표적 장기 내에서 더 큰 수의 세포 유형의 증가된 발현/전사). 특정 장기가 표적화된다면, 더 높은 일관성은 또한 장기 내 모든 위치를 통해서 발현/전사의 더 일관된 증가를 나타낼 수 있다. 더 높은 특이성은 표적 유전자 또는 표적화되는 유전자와 관련하여 더 높은 특이성, 표적화된 세포 유형과 관련하여 더 높은 특이성, 표적화된 조직 유형과 관련하여 더 높은 특이성, 또는 표적화된 장기와 관련하여 더 높은 특이성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 표적 특이성은 다른 유전자에 대한 더 적은 표적 외 효과를 나타낸다 (예컨대, 표적 게놈 유전자좌의 변형 대신 또는 그것에 더불어 의도하지 않은 표적 외 게놈 유전자좌 (예컨대, 인접한 게놈 유전자좌)에서 전사가 증가된 표적화된 세포의 더 낮은 백분율). 마찬가지로, 증가된 세포 유형, 조직, 또는 장기 유형 특이성은 만약 특정 세포 유형, 조직 유형, 또는 장기 유형이 표적화된다면 표적 외 세포 유형, 조직 유형, 또는 장기 유형에서의 더 적은 효과를 타나낸다 (예컨대, 특정 장기 (예컨대, 간)가 표적화되고, 의도되지 않은 표적이 아닌 세포 또는 장기 또는 조직에서 더 적은 효과 (즉, 증가된 발현/전사)가 있다).
변경되는 변수는 임의의 파라미터일 수 있다. 한 예로서, 변경된 변수는 가이드 RNA (또는 선택적으로 재조합효소 또는 다른 구성요소)가 세포 또는 비인간 동물로 도입되는 포장 또는 전달 방법일 수 있다. 전달 방법의 예, 예컨대 LNP, HDD, 및 AAV는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 예를 들어, 변경된 변수는 AAV 혈청형일 수 있다. 다른 예로서, 변경된 변수는 가이드 RNA (또는 선택적으로 재조합효소 또는 다른 구성요소)의 세포 또는 비인간 동물에의 도입을 위한 투여 경로일 수 있다. 투여 경로의 예, 예컨대 정맥내, 유리체내, 실질내 투여, 및 비강 점적 주입은 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 예로서, 변경된 변수는 가이드 RNA (또는 선택적으로 재조합효소 또는 다른 구성요소)의 농도 또는 양일 수 있다. 또 다른 예로서, 변경된 변수는 가이드 RNA (또는 선택적으로 재조합효소 또는 다른 구성요소)가 도입되는 횟수 또는 빈도일 수 있다. 또 다른 예로서, 변경된 변수는 가이드 RNA (또는 선택적으로 재조합효소 또는 다른 구성요소)가 도입되는 형태일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 DNA의 형태로 또는 RNA의 형태로 도입될 수 있다. 유사하게, 가이드 RNA (또는 선택적으로 재조합효소 또는 다른 구성요소)는 안정성을 위해, 표적 외 효과를 감소시키기 위해, 전달을 용이하게 하기 위해, 등등의 이유로 다양한 조합의 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 변경된 변수는 도입되는 가이드 RNA의 서열일 수 있다 (예컨대, 상이한 서열을 가진 상이한 가이드 RNA의 도입).
C. 가이드 RNA 및 다른 구성요소의 세포 및 비인간 동물에의 도입
본원에서 개시된 방법은 세포 또는 비인간 동물에 하나 이상의 가이드 RNA, 가이드 RNA 어레이, 재조합효소, 또는 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같은 다른 구성요소를 도입하는 것을 포함한다. "도입하는 것"은 세포 또는 비인간 동물에 핵산 또는 단백질을, 핵산 또는 단백질이 세포 내부에 또는 비인간 동물 내에서 세포 내부에 접근하게 되는 방식으로 제공하는 것을 포함한다. 도입하는 것은 임의의 수단에 의해서든 이루어질 수 있고, 구성요소 중 둘 (예컨대, 구성요소 중 둘, 또는 모든 구성요소)은 세포 또는 비인간 동물에 동시에 또는 임의의 조합으로 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 제1 가이드 RNA는 세포 또는 비인간 동물에 제2 가이드 RNA의 도입 전에 도입될 수 있다. 이에 더불어, 둘 이상의 구성요소는 세포 또는 비인간 동물에 동일한 전달 방법 또는 상이한 전달 방법에 의해 도입될 수 있다. 유사하게, 둘 이상의 구성요소는 비인간 동물에 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 도입될 수 있다.
가이드 RNA는 세포에 RNA의 형태로 (예컨대, 시험관내 전사된 RNA) 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 도입될 수 있다. 마찬가지로, 재조합효소와 같은 단백질 구성요소는 DNA, RNA, 또는 단백질의 형태로 세포에 도입될 수 있다. DNA의 형태로 도입될 때, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가증하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 AAV를 통해 전달될 수 있고 U6 프로모터 하에서 생체내에서 발현될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 구성물에 있을 수 있다. 예를 들어, 이러한 발현 구성물은 단일 핵산 분자의 구성요소일 수 있다. 대안으로, 이것은 둘 이상의 핵산 분자 중 임의의 조합으로 분리될 수 있다 (즉, 하나 이상의 CRISPR RNA를 암호화하는 DNA 및 하나 이상의 tracrRNA를 암호화하는 DNA가 별도의 핵산 분자의 구성요소일 수 있다).
가이드 RNA 또는 재조합효소 (또는 다른 구성요소)를 암호화하는 핵산은 발현 구성물에서 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 구성물은 유전자 또는 관심 있는 다른 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산을 포함하며 표적 세포에 관심 있는 그러한 핵산 서열을 전달할 수 있다. 발현 구성물에서 사용될 수 있는 적합한 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 성인 줄기 세포, 발달상 제한된 선조 세포, 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 또는 1세포기 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 한 방향으로 가이드 RNA 및 다른 방향으로 다른 구성요소 둘 다를 구동시키는 양방향성 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소: 원위 서열 요소 (DSE), 근위 서열 요소 (PSE), 및 TATA 박스를 함유하는 완전한, 종래의 단일방향성 Pol III 프로모터; 및 (2) 역 방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 PSE 및 TATA 박스를 포함하는 제2 기본 Pol III 프로모터로 이루어질 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA박스에 인접하고, 프로모터는 역방향으로의 전사가 U6 프로모터로부터 유래된 PSE 및 TATA 박스를 첨부함으로써 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성이 될 수 있다. 예컨대, US 2016/0074535 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 가이드 RNA 및 다른 구성요소를 암호화하는 유전자를 동시에 발현하기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 전달을 용이하게 하기 위한 압축 발현 카세트의 생성을 허용한다.
가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 (또는 다른 구성요소)은 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는 (예컨대, 주어진 보관 조건 (예컨대, -20℃, 4℃, 또는 주변 온도) 하에서 분해 생성물이 한계값 아래로 남아 있는, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 아래로 남아 있는 기간을 연장시키는; 또는 생체내에서 안정성을 증가시키는) 담체를 포함하는 조성물로 제공될 수 있다. 이러한 담체의 비제한적인 예로는 폴리(락트산) (PLA) 미소구, 폴리(D,L-락틱-코들리콜-산) (PLGA) 미소구, 리포솜, 미셸, 역 미셸, 지질 코킬레이트, 및 지질 미세소관을 들 수 있다.
핵산 또는 단백질의 세포 또는 비인간 동물에의 도입을 허용하기 위한 다양한 방법 및 조성물이 제공된다. 핵산을 다양한 세포 유형에 도입하기 위한 방법은 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, 안정적인 트랜스펙션 방법, 일시적인 트랜스펙션 방법, 및 바이러스-매개 방법을 들 수 있다.
핵산 서열을 세포에 도입하기 위한 프로토콜뿐만 아니라 트랜스펙션 프로토콜은 다를 수 있다. 비제한적인 트랜스펙션 방법으로는 리포솜; 나노입자; 칼슘 포스페이트 (Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4, 및 Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 폴리머를 사용하는 화학적-기반 트랜스펙션 방법을 들 수 있다. 비화학적 방법으로는 전기천공, 초음파천공, 및 광학적 트랜스펙션을 들 수 있다. 입자-기반 트랜스펙션으로는 유전자 총, 또는 자석-보조 트랜스펙션 (Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28)을 들 수 있다. 바이러스 방법이 또한 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다.
핵산 또는 단백질의 세포에의 도입은 또한 전자천공에 의해, 실질내 주사에 의해, 바이러스 감염에 의해, 아데노바이러스에 의해, 아데노-관련 바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 레트로바이러스에 의해, 트랜스펙션에 의해, 지질-매개 트랜스펙션에 의해, 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 핵산 기질이 세포질에 전달될 뿐만 아니라 핵 막을 통해 핵으로도 전달되는 것을 가능하게 하는 개선된 전자천공 기술이다. 더불어, 본원에서 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 정규 전자천공보다 훨씬 더 적은 세포를 필요로 한다 (예컨대, 정규 전자천공에 의한 7백만개의 세포와 비교하여 단지 약 2백만개). 한 예에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTORTM 시스템을 사용하여 수행된다.
핵산 또는 단백질의 세포 (예컨대, 접합체)에의 도입은 또한 미세주입에 의해 이루어질 수 있다. 접합체 (즉, 1세포기 배아)에서, 미세주입은 모계 및/또는 부계 전핵에 또는 세포질에서 있을 수 있다. 미세주입이 한 전핵으로만 있는 경우, 부계 전핵이 그것의 더 큰 크기로 인해 바람직하다. 대안으로, 미세주입은 핵/전핵 및 세포질 둘 다로의 주사에 의해 수행될 수 있다: 바늘이 먼저 핵/전핵으로 도입되고 제1 양이 주사될 수 있으며, 바늘이 1세포기 배아로부터 제거되면서 제2 양이 세포질에 주입될 수 있다. 미세주입을 수행하는 방법은 잘 알려져 있다. 예컨대, Nagy et al. (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) 참조; 또한 Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026 및 Meyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359 참조.
핵산 또는 단백질을 세포 또는 비인간 동물에 도입하기 위한 다른 방법으로는, 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개 전달, 엑소좀-매개 전달, 지질-나노입자-매개 전달, 세포-침투-펩타이드-매개 전달, 또는 이식 가능한 장치-매개 전달을 들 수 있다. 특정 예로서, 핵산 또는 단백질은 폴리(락트산) (PLA) 미소구, 폴리(D,L-락틱-코글리콜-산) (PLGA) 미소구, 리포솜, 미셸, 역 미셸, 지질 코킬레이트, 또는 지질 미세관과 같은 담체로 세포 또는 비인간 동물에 도입될 수 있다. 비인간 동물로의 전달의 일부 특정 예는 유체역학적 전달, 바이러스-매개 전달 (예컨대, 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달), 및 지질-나노입자-매개 전달을 들 수 있다.
핵산 및 단백질의 세포 또는 비인간 동물에의 도입은 유체역학적 전달 (HDD)에 의해 달성될 수 있다. 유체역학적 전달은 생체내에서 세포내 DNA 전달을 위한 방법으로서 부각되었다. 실질 세포에의 유전자 전달의 경우, 필수적인 DNA 서열만이 선택된 혈관을 통해 주입될 필요가 있어서, 현재의 바이러스 및 합성 벡터와 결부된 안전성 문제가 제거된다. 혈류로 주입될 때, DNA는 혈관에 접근 가능한 상이한 조직에서 세포에 도달할 수 있다. 유체역학적 전달은 크고 막-침투 불가능한 화합물이 실질 세포로 들어가는 것을 방지하는 내피 및 세포막의 물리적 장벽을 극복하기 위해 순환의 비압축성 혈액으로 다량의 용액의 신속한 주입에 의해 생성된 힘을 사용한다. DNA의 전달에 더불어, 이 방법은 RNA, 단백질, 및 다른 작은 화합물의 생체내에서의 효율적인 세포내 전달에 유용하다. 예컨대, Bonamassa et al. (2011) Pharm. Res. 28(4):694-701 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
핵산의 도입은 또한 바이러스-매개 전달, 예컨대 AAV-매개 전달 또는 렌티바이러스-매개 전달에 의해 달성될 수 있다. 다른 예시의 바이러스/바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 천연두 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스를 들 수 있다. 바이러스는 분할 세포, 비-분할 세포, 또는 분할 및 비-분할 세포 둘 다를 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈에 통합될 수 있거나 또는 대안으로 숙주 게놈에 통합되지 않는다. 이러한 바이러스는 또한 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-경합성이거나 또는 복제-결핍성 (예컨대, 비리온 복제 및/또는 포장의 추가적인 회기에 필요한 하나 이상의 유전자의 결핍)일 수 있다. 바이러스는 일시적인 발현, 장기간 지속 발현 (예컨대, 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 또는 3개월), 또는 영구적인 발현 (예컨대, Cas9 및/또는 gRNA의 발현)을 유발할 수 있다. 예시의 바이러스 역가 (예컨대, AAV 역가)는 1012, 1013, 1014, 1015, 및 1016 벡터 게놈/mL을 포함한다.
ssDNA AAV 게놈은 상보하는 DNA 가닥의 합성을 허용하는 2개의 도치된 말단 반복부가 양옆에 있는 2개의 오픈 리딩 프레임, Rep 및 Cap으로 이루어진다. AAV 전달 플라스미드를 구성할 때, 도입유전자는 2개의 ITR 사이에 배치되고, Rep 및 Cap이 트랜스로 공급될 수 있다. Rep 및 Cap에 더불어, AAV는 아데노바이러스로부터의 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드를 필요로 할 수 있다. 이들 유전자 (E4, E2a, 및 VA)는 AAV 복제를 매개하였다. 예를 들어, 트랜스퍼 플라스미드, Rep/Cap, 및 헬퍼 플라스미드는 감염성 AAV 입자를 생성하기 위하여 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유하는 HEK293 세포에 트랜스펙션될 수 있다. 대안으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드로 조합될 수 있다. 유사한 포장 세포 및 방법이 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 대해 사용될 수 있다.
AAV의 다중 혈청형이 확인되어 있다. 이들 혈청형은 특정 세포 유형의 우선적인 변환을 허용하는, 그것이 감염시키는 세포의 유형 (즉, 그것의 향성)이 다르다. CNS 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 심장 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 신장 조직에 대한 혈청형은 AAV2를 포함한다. 폐 조직에 대한 혈청형은 AAV4, AAV5, AAV6, 및 AAV9를 포함한다. 췌장 조직에 대한 혈청형은 AAV8을 포함한다. 광수용체 세포에 대한 혈청형은 AAV2, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 망막 색소 상피 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 골격근 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 간 조직에 대한 혈청형은 AAV7, AAV8, 및 AAV9, 및 특히 AAV8을 포함한다.
향성은 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 캡시드 및 게놈의 혼합인 위형분류(pseudotyping)를 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어 AAV2/5는 혈청형 5로부터의 캡시드에 포장된 혈청형 2의 게놈을 함유한 바이러스를 나타낸다. 위형분류된 바이러스의 사용은 변환 효율을 개선시킬 수 있을뿐만 아니라, 향성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드는 또한 바이러스 향성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개의 혈청형으로부터의 하이브리드 캡시드를 함유하고 생체내에서 광범위한 세포 유형을 가로질러 높은 감염성을 나타낸다. AAV-DJ8은 향상된 뇌 흡수를 가진 AAV-DJ의 특성을 나타내는 또 다른 예이다. AAV 혈청형은 또한 돌연변이를 통해 변형될 수 있다. AAV2의 돌연변이성 변형의 예는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이성 변형의 예는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이성 변형의 예는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 위형분류된/변형된 AAV 변이체는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 포함한다.
도입유전자 발현을 가속화하기 위하여, 자기-상보하는 AAV (scAAV) 변이체가 사용될 수 있다. AAV는 AAV의 단일 가닥 DNA 게놈의 상보하는 가닥을 합성하기 위하여 세포의 DNA 복제 기계에 의존적이기 때문에, 도입유전자 발현은 지연될 수 있다. 이런 지연을 해결하기 위하여, 감염시 자발적으로 어닐링할 수 있는 상보하는 서열을 함유하는 scAAV가 사용될 수 있어서, 숙주 세포 DNA 합성에 대한 필요성이 제거된다.
포장 능력을 증가시키기 위하여, 더 긴 도입유전자가 2개의 AAV 트랜스퍼 플라스미드 사이에 스플릿될 수 있는데, 제1 플라스미드는 3' 스플라이스 도너이고 제2 플라스미드는 5' 스플라이스 억셉터이다. 세포의 동시 감염시, 이들 바이러스는 연쇄 동일서열(concatemer)을 형성하고, 함께 스플라이스되며, 전장 도입유전자가 발현될 수 있다. 비록 이것이 더 긴 도입유전자 발현을 허용하긴 하지만, 발현은 덜 효율적이다. 능력을 증가시키기 위한 유사한 방법은 상동성 재조합을 이용한다. 예를 들어, 도입유전자는 2개의 트랜스퍼 플라스미드 사이에서 나누어질 수 있지만 동시 발현이 전장 도입유전자의 상동성 재조합 및 발현을 유도하도록 실질적인 서열이 중복될 수 있다.
핵산 및 단백질의 도입은 또한 지질 나노입자 (LNP)-매개 전달에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, LNP-매개 전달은 가이드 RNA를 RNA의 형태로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법을 통한 전달은 가이드 RNA의 일시적인 존재를 초래하고, 생분해성 지질은 클리어런스를 개선시키며, 내약성을 개선시키고, 면역원성을 감소시킨다. 지질 제제는 생물학적 분자가 분해되는 것을 보호할 수 있는 한편 그것의 세포로의 흡수를 개선시킬 수 있다. 지질 나노입자는 분자간 힘에 의해 서로와 물리적으로 회합되어 있는 다수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이것들로는 미소구 (단일층 및 다층 소포를 포함함, 예컨대 리포솜), 에멀션에서의 분산상, 미셸, 또는 현탁액에서의 내부상을 들 수 있다. 이러한 지질 나노입자는 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 전달을 위해 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유하는 제제는 핵산과 같은 다중음이온을 전달하는데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질로는 중성 지질 (즉, 대전되지 않았거나 양쪽성이온성 지질), 음이온성 지질, 트랜스펙션을 향상시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스(stealth) 지질이 있다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는 WO 2016/010840 A1 및 WO 2017/173054 A1 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 예시의 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 하나 이상의 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 한 예에서, 다른 구성요소는 콜레스테롤과 같은 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 다른 구성요소는 콜레스테롤과 같은 헬퍼 지질 및 DSPC와 같은 중성 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 구성요소는 콜레스테롤과 같은 헬퍼 지질, DSPC와 같은 선택적ㅇ딘 중성 지질, 및 S010, S024, S027, S031, 또는 S033과 같은 스텔스 지질을 포함할 수 있다.
LNP는 다음 중 하나 이상 또는 전부를 함유할 수 있다: (i) 캡슐화 및 엔도좀 탈출을 위한 지질; (ii) 안정화를 위한 중성 지질; (iii) 안정화를 위한 중성 지질; 및 (iv) 스텔스 지질. 예컨대, Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 및 WO 2017/173054 A1 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 특정 LNP에서, 적재물(cargo)은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정 LNP에서, 적재물은 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 암호화하는 mRNA, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호호하는 핵산을 포함할 수 있다.
캡슐화 및 엔도좀 탈출을 위한 지질은 양이온성 지질일 수 있다. 지질은 또한 생분해성 지질, 예컨대 생분해성 이온화 가능한 지질일 수 있다. 적합한 지질의 한 예는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트인 지질 A 또는 LP01이다. 예컨대, Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 및 WO 2017/173054 A1 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 적합한 지질의 다른 예는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)로도 불리는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)인 지질 B이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 2-((4-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-다이에노에이트)인 지질 C이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트라이데실 3-옥틸운데카노에이트인 지질 D이다.
본원에서 기술된 LNP에 사용하기에 적합한 일부 이러한 지질은 생체내에서 생분해성이다. 예를 들어, 이러한 지질을 포함하는 LNP는 8, 10, 12, 24, 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10일 내에 적어도 75%의 지질이 혈장으로부터 제거되는 것을 포함한다. 다른 예로서, 적어도 50%의 LNP가 8, 10, 12, 24, 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10일 내에 혈장으로부터 제거된다.
이러한 지질은 그것이 존재하는 매질의 pH에 따라 이온화될 수 있다. 예를 들어, 약산성 매질에서, 지질은 양자화될 수 있고 그로써 양성 전하를 가진다. 역으로, 약염기성 매질에서, 예컨대, 예를 들어, pH가 약 7.35인 혈액에서, 지질은 양자화되지 않을 수 있고, 그로써 전하를 갖지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 지질은 적어도 약 9, 9.5, 또는 10의 pH에서 양자화될 수 있다. 이러한 지질이 전하를 갖는 능력은 그것의 고유한 pKa와 관련이 있다. 예를 들어, 지질은, 독립적으로, 약 5.8 내지 약 6.2의 범위의 pKa를 가질 수 있다.
중성 지질은 LNP를 안정화시키고 LNP의 가공을 개선시키는 기능을 한다. 적합한 중성 지질의 예는 다양한 중성, 대전되지 않은 또는 양쪽성 이온성 지질을 포함한다. 본 개시에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 5-헵타데실벤젠-1,3-다이올 (레조르시놀), 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 포스포콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 포스파티딜콜린 (PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DAPC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 난 포스파티딜콜린 (EPC), 다이라우릴로일포스파티딜콜린 (DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린 (PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 (SPPC), 1,2-다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린 (POPC), 리소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민 (POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, 및 이것들의 조합을 들 수 있다. 예를 들어, 중성 인지질이 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 및 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민 (DMPE)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
헬퍼 지질은 트랜스펙션을 향상시키는 지질을 포함한다. 헬퍼 지질이 트랜스펙션을 향상시키는 메커니즘은 입자 안정성을 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 헬퍼 지질은 막 융합능력(membrane fusogenicity)을 향상시킬 수 있다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 적합한 헬퍼 지질의 예는 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함한다. 한 예에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
스텔스 지질은 나노입자가 생체외에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경시키는 지질을 포함한다. 스텔스 지질은, 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써, 제제화 과정을 보조할 수 있다. 스텔스 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 결합된 친유성 헤드 기를 가지는 지질을 포함한다.
스텔스 지질의 친유성 헤드 기는, 예를 들어, PEG (때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)로도 언급됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드를 토대로 폴리머로부터 선택된 폴리머 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 PEG는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 폴리머를 의미한다. 특정 LNP 제제에서, PEG는 또한 PEG 2000으로도 명명되는 PEG-2K이며, 이것은 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 예컨대, WO 2017/173054 A1 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
스텔스 지질의 지질 모이어티는, 예를 들어, 독립적으로 약 C4 내지 약 C40의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 가지는 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카미드 기를 포함하는 것을 포함한, 다이아실글리세롤 또는 다이아실글리카미드로부터 유래될 수 있고, 여기서 사슬은 예를 들어, 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 기능성 기를 포함할 수 있다. 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬 기를 또한 포함할 수 있다.
한 예로서, 스텔스 지질은 PEG-다이라우로일글리세롤, PEG-다이미리스토일글리세롤 (PEG-DMG), PEG-다이팔미토일글리세롤, PEG-다이스테아로일글리세롤 (PEG- DSPE), PEG-다이라우릴글리카미드, PEG- 다이미리스틸글리카미드, PEG-다이팔미토일글리카미드, 및 PEG-다이스테아로일글리카미드, PEG- 콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르박스아미도-3',6'-다이옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB (3,4-다이테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k- DMG), 1,2- 다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리 에틸렌 글리콜 (PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-다이메타크릴레이트 (PEG2k-DMA), 및 1,2- 다이스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSA)로부터 선택될 수 있다. 한 특정 예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다.
LNP는 제제에서 상이한 각각의 몰 비율의 구성요소 지질을 포함할 수 있다. CCD 지질의 mol-%는, 예를 들어, 약 30 mol-% 내지 약 60 mol-%, 약 35 mol-% 내지 약 55 mol-%, 약 40 mol-% 내지 약 50 mol-%, 약 42 mol-% 내지 약 47 mol-%, 또는 약 45%일 수 있다. 헬퍼 지질의 mol-%는, 예를 들어, 약 30 mol-% 내지 약 60 mol-%, 약 35 mol-% 내지 약 55 mol-%, 약 40 mol-% 내지 약 50 mol-%, 약 41 mol-% 내지 약 46 mol-%, 또는 약 44 mol-%일 수 있다. 중성 지질의 mol-%는, 예를 들어, 약 1 mol-% 내지 약 20 mol-%, 약 5 mol-% 내지 약 15 mol-%, 약 7 mol-% 내지 약 12 mol-%, 또는 약 9 mol-%일 수 있다. 스텔스 지질의 mol-%는, 예를 들어, 약 1 mol-% 내지 약 10 mol-%, 약 1 mol-% 내지 약 5 mol-%, 약 1 mol-% 내지 약 3 mol-%, 약 2 mol-%, 또는 약 1 mol-%일 수 있다.
LNP는 캡슐화될 생분해성 지질 (N)의 양으로 대전된 아민 기와 핵산의 음으로 대전된 포스페이트 기 (P) 사이에 상이한 비율을 가질 수 있다. 이것은 방정식 n/p에 의해 수학적으로 표현될 수 있다. 예를 들어, N/P 비율은 약 0.5 내지 약 100, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 7, 약 3 내지 약 5, 약 4 내지 약 5, 약 4, 약 4.5, 또는 약 5일 수 있다.
일부 LNP에서, 적재물은 Cas mRNA 및 gRNA를 포함할 수 있다. Cas mRNA 및 gRNA는 상이한 비율로 있을 수 있다. 예를 들어, LNP 제제는 약 25:1 내지 약 1:25의 범위, 약 10:1 내지 약 1:10의 범위, 약 5:1 내지 약 1:5의 범위, 또는 약 1:1의 비율의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산을 포함할 수 있다. 대안으로, LNP 제제는 약 1:1 내지 약 1:5, 또는 약 10:1의 비율의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산을 포함할 수 있다. 대안으로, LNP 제제는 약 1:10, 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25의 비율의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산을 포함할 수 있다.
적합한 LNP의 특정 예는 4.5의 질소-대-포스페이트 (N/P) 비율을 가지며 생분해성 양이온성 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 45:44:9:2 몰 비율로 함유한다. 생분해성 양이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트일 수 있다. 예컨대, Finn et al. (2018) Cell Reports 22:1-9 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 적합한 지질의 다른 ㅇ예예는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)로도 불리는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)인 지질 B이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 2-((4-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-다이에노에이트)인 지질 C이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트라이데실 3-옥틸운데카노에이트인 지질 D이다. 다른 적합한 지질로는 헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(다이메틸아미노)부타노에이트 (Dlin-MC3-DMA (MC3)으로도 알려져 있음)를 들 수 있다.
적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 6의 질소-대-포스페이트 (N/P) 비율을 가지며 생분해성 양이온성 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 50:38:9:3 몰 비율로 함유한다. 생분해성 양이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트일 수 있다.
전달 양식은 면역원성을 감소시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 상이한 구성요소는 상이한 양식에 의해 전달될 수 있다 (예컨대, 이중 양식 전달). 이들 상이한 양식은 대상인 전달된 분자에 상이한 약력학적 또는 약동학적 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 상이한 양식은 상이한 조직 분포, 상이한 반감기, 또는 상이한 일히적 분포를 초래할 수 있다. 일부 전달 양식 (예컨대, 자율 복제 또는 게놈 통합에 의해 세포에서 지속적인 핵산 벡터의 전달)은 분자의 보다 지속저긴 발현 및 존재를 초래하는 반면, 다른 전달 양식은 일시적이고 덜 지속적이다 (예컨대, RNA 또는 단백질의 전달). 예를 들어, RNA와 같이, 보다 일시적인 방식의 구성요소의 전달은, Cas/gRNA 복합체가 짧은 시간 동안만 존재하고 면역원성을 감소시킬 수 있는 것을 보장할 수 있다. 이러한 일시적 전달은 또한 표적 외 변형의 가능성도 감소시킬 수 있다.
생체내 투여는, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척수강내, 복강내, 국소적, 비강내, 또는 근육내를 포함한, 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다. 전신적 투여 양식은, 예를 들어, 경구 및 비경구 경로를 포함한다. 비경구 경로의 예는 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 피내, 피하, 비강내, 및 복강내 경로를 포함한다. 특정 예는 정맥내 주입이다. 국소적 투여 양식으로는, 예를 들어, 척수강내, 뇌실내, 실질내 (예컨대, 선조체 (예컨대, 미상핵으로의 또는 조가비핵으로의), 대뇌 피질, 전두 이랑, 해마 (예컨대, 치아 이랑 또는 CA3 영역으로), 측두 피질, 편도, 전두 피질, 시상, 소뇌, 수질, 시상 하부, 중뇌개, 중뇌피개, 또는 흑질로의 국소 실질내 전달), 안구내, 안와내, 결막하, 유리체내, 망막하, 및 경골 경로를 들 수 있다. 전신적으로 투여될 때 (예를 들어, 정맥내)와 비교하여 국소적으로 투여될 때 (예를 들어, 실질내 또는 유리체내) 상당히 더 적은 양의 구성요소 (전신적 접근법과 비교하여)가 효과를 발휘할 수 있다. 국소 투여 양식은 또한 치료적 유효량의 구성요소가 전신적으로 투여될 때 발생할 수 있는 잠재적 독성 부작용의 발생을 감소시키거나 제거할 수 있다.
생체내 투여는, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척수강내, 복강내, 국소적, 비강내, 또는 근육내를 포함한, 임의의 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 특정 예는 정맥내 주입이다. 비강 흡입 및 유리체내 주사는 다른 특정 예이다. 가이드 RNA (또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)을 포함하는 조성물은 하나 이상의 생리적으로 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 선택된 투여 경로에 좌우될 수 있다. 용어 "제약학적으로 허용되는"은 담체, 희석제, 부형제, 또는 보조제가 제제의 다른 성분과 부합할 수 있고 그것의 수령체에게 실질적으로 유해하지 않은 것을 의미한다.
투여 빈도 및 투여량 수는 다른 요인들 중에서 외인성 도너 핵산 또는 가이드 RNA (또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)의 반감기 및 투여 경로에 좌우될 수 있다. 핵산 또는 단백질의 세포 또는 비인간 동물에의 도입은 일정 기간 동안 1회 또는 여러 번 수행될 수 있다. 예를 들어, 도입은 일정 기간 동안 적어도 2회, 일정 기간 동안 적어도 3회, 일정 기간 동안 적어도 4회, 일정 기간 동안 적어도 5회, 일정 기간 동안 적어도 6회, 일정 기간 동안 적어도 7회, 일정 기간 동안 적어도 8회, 일정 기간 동안 적어도 9회, 일정 기간 동안 적어도 10회, 일정 기간 동안 적어도 11회, 일정 기간 동안 적어도 12회, 일정 기간 동안 적어도 13회, 일정 기간 동안 적어도 14회, 일정 기간 동안 적어도 15회, 일정 기간 동안 적어도 16회, 일정 기간 동안 적어도 17회, 일정 기간 동안 적어도 18회, 일정 기간 동안 적어도 19회, 일정 기간 동안 적어도 20회 수행될 수 있다.
D. 생체내에서 CRISPR/Cas 활성 측정 및 표적 유전자의 발현 평가
본원에서 개시된 방법은 표적 유전자의 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 발현 또는 활성을 측정하는 방법은 변형되는 표적 유전자에 좌우될 것이다.
예를 들어, 만약 표적 유전자가 RNA 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다면, 발현을 평가하는 방법은 암호화된 RNA 및/또는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 만약 암호화된 단백질이 혈청으로 방출되는 단백질이라면, 암호화된 단백질의 혈청 수준이 측정될 수 있다. RNA 및 단백질의 수준 및 활성을 측정하기 위한 검정은 잘 알려져 있다.
비인간 동물에서 표적 유전자의 발현을 평가하는 것은 임의의 조직 또는 장기로부터의 임의의 세포 유형에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 발현은 동일한 조직 또는 장기로부터의 다중 세포 유형에서 또는 조직 또는 장기 내의 다중 위치로부터의 세포에서 평가될 수 있다. 이것은 표적 조직 또는 장기 내의 어떤 세포 유형이 표적화되는지 또는 조직 또는 장기의 어떤 섹션이 CRISPR/Cas에 의해 도달되고 변형되는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 특정 조직 또는 장기가 표적화되는 방법에서, 이것은 조직 또는 장기가 얼마나 효과적으로 표적화되고 다른 조직 또는 장기에서 표적 외 효과가 있는지으 l여부에 대한 정보를 제공할 수 있다.
IV. Cas 발현 카세트 및/또는 재조합효소 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법
본원의 다른 곳에서 개시된 시너지 활성화 매개자 (SAM) 발현 카세트 (키메라 Cas 단백질 코딩 서열 및 키메라 어댑터 단백질 발현 코딩 서열을 포함함), 가이드 RNA 발현 카세트, 및 재조합효소 발현 중 하나 이상 또는 전부를 포함하는 비인간 동물를 제조하기 위한 다양한 방법이 제공된다. 마찬가지로, 본원의 다른 곳에서 개시된 키메라 Cas 단백질 발현 카세트, 키메라 어댑터 단백질 발현 카세트, 가이드 RNA 발현 카세트, 및 재조합효소 발현 중 하나 이상 또는 전부를 포함하는 비인간 동물를 제조하기 위한 다양한 방법이 제공된다. 유전자 변형된 유기체를 제조하기 위한 임의의 편리한 방법 또는 프로토콜이 이러한 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하기에 적합하다. 예컨대, Cho et al. (2009) Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22 및 Gama Sosa et al. (2010) Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이러한 유전자 변형된 비인간 동물은, 예를 들어, 표적화된 유전자좌 (예컨대, Rosa26과 같은 안전한 은닉 유전자좌)에서의 유전자 녹인을 통해 또는 무작위로 통합되는 도입유전자의 사용을 통해 생성될 수 있다. 예컨대, WO 2014/093622 및 WO 2013/176772 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 에 대한 구성물의 표적화 방법은, 예를 들어, 2012/0017290, US 2011/0265198, 및 US 2013/0236946 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
예를 들어, 본원의 다른 곳에서 개시된 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하도록 만능 세포의 게놈을 변형시키는 단계; (2) 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 유전자 변형된 만능 세포를 확인 또는 선택하는 단계; (3) 유전자 변형된 만능 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 배아를 대리 모체에 이식하고 임신시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 개시된 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하도록 만능 세포의 게놈을 변형시키는 단계; (2) 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 유전자 변형된 만능 세포를 확인 또는 선택하는 단계; (3) 유전자 변형된 만능 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 배아를 대리 모체에 임신시키는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 변형된 만능 세포 (예컨대, 비인간 ES 세포)를 포함하는 숙주 배아는 F0 비인간 동물을 생성하기 위해 대리 모체에 이식되고 임신되기 전 배반포 단계까지 인큐베이션될 수 있다. 그런 후 대리 모체는 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 F0 세대 비인간 동물을 생산할 수 있다.
방법은 변형된 표적 게놈 유전자좌를 가지는 세포 또는 동물을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 방법이 표적화된 유전자 변형을 가지는 세포 및 동물을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
게놈을 변형시키는 단계는 본원의 다른 곳에서 개시된 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하도록 표적 게놈 유전자좌를 변형시키기 위해, 예를 들어, 외인성 도너 핵산 (예컨대, 표적화 벡터)을 이용할 수 있다. 한 예로서, 표적화 벡터는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열을 표적화하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열을 표적화하는 3' 상동성 팔을 포함할 수 있다. 외인성 도너 핵산은 또한 표적 게놈 유전자좌에 통합될 DNA의 분절을 포함한 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. 핵산 삽입물의 표적 게놈 유전자좌에의 통합은 표적 게놈 유전자좌에 관심 있는 핵산 서열의 첨가, 표적 게놈 유전자좌에 관심 있는 핵산 서열의 삭제, 또는 표적 게놈 유전자좌에 관심 있는 핵산 서열의 대체 (즉, 삭제 및 삽입)를 초래할 수 있다. 상동성 팔은 표적화된 게놈 유전자좌를 생성하기 위하여 본원의 다른 곳에서 개시된 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 삽입 핵산의 측면에 있을 수 있다.
외인성 도너 핵산은 비상동성-단부-연결-매개된 삽입 또는 상동성 재조합을 위한 것일 수 있다. 외인성 도너 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 포함할 수 있고, 그것들은 단일-가닥이거나 또는 이중-가닥이며, 그것들은 선형 또는 원형 형태로 있을 수 있다. 예를 들어, 수복 주형은 단일 가닥의 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)일 수 있다.
외인성 도너 핵산은 또한 표적화되지 않은 내인성 표적 게놈 유전자좌에 존재하지 않는 이종성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산은 선택 카세트, 예컨대 재조합효소 인식 부위가 측면에 있는 선택 카세트를 포함할 수 있다.
일부 외인성 도너 핵산은 상동성 팔을 포함한다. 만약 외인성 도너 핵산이 또한 핵산 삽입물을 포함한다면, 상동성 팔은 핵산 삽입물 측면에 있을 수 있다. 참조를 용이하게 하기 위하여, 상동성 팔은 본원에서 5' 및 3' (즉, 상류 및 하류) 상동성 팔로 언급된다. 이 용어는 외인성 도너 핵산 내의 핵산 삽입물에 대한 상동성 팔의 상대적인 위치에 관한 것이다. 5' 및 3' 상동성 팔은, 본원에서 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로서 언급되는, 표적 게놈 유전자좌 내의 영역에 상응한다.
상동성 팔 및 표적 서열은 두 영역이 상동성 재조합 반응을 위한 기질로서 작용하도록 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때 서로에게 "상응한다" 또는 "상응하는" 것이다. 용어 "상동성"은 상응하는 서열에 대해 동일하거나 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 주어진 표적 서열과 외인성 도너 핵산에서 찾을 수 있는 상응하는 상동성 팔 사이의 서열 동일성은 상동성 재조합이 일어나는 것을 허용하는 임의의 정도의 서열 동일성일 수 있다. 예를 들어, 외인성 도너 핵산의 상동성 팔 (또는 그것의 단편)과 표적 서열 (또는 그것의 단편)에 의해 공유된 서열 동일성의 양은, 서열이 상동성 재조합을 진행하도록 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있다. 더욱이, 상동성 팔과 상응하는 표적 서열 사이의 상동성의 상응하는 영역은 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이의 것일 수 있다. 일부 표적화 벡터에서, 표적 게놈 유전자좌의 의도된 돌연변이는 상동성 팔이 측면에 있는 삽입물 핵산에 포함된다.
1세포기 배아 이외의 세포에서, 외인성 도너 핵산은 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용된 것보다 큰 핵산 서열에 상응하고 그것으로부터 유래된 상동성 팔을 포함하는 표적화 벡터를 포함하는, "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"일 수 있다. LTVEC는 또한 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용된 것보다 큰 핵산 서열을 가지는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVEC는 크기 제한으로 인해 전통적인 플라스미드-기반 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 큰 유전자좌의 변형을 가능하게 만든다. 예를 들어, 표적화된 유전자좌는 종래 방법을 사용하여 표적화될 수 없거나 또는 뉴클레아제 작용제 (예컨대, Cas 단백질)에 의하여 유도된 닉 또는 이중-가닥 파괴의 부재하에 부정확하게만 또는 상당히 낮은 효율로만 표적화될 수 있는 세포의 유전자좌 일 수 있다(즉, 5' 및 3' 상동성 팔이 이것에 사응할 수 있다). LTVEC는 임의의 길이의 것일 수 있고 전형적으로 길이가 적어도 10 kb이다. LTVEC에서 5' 상동성 팔 및 3' 상동성 팔의 총 합은 전형적으로 적어도 10 kb이다.
스크리닝 단계는, 예를 들어, 모(parental) 염색체의 대립유전자 (MOA)의 변형을 평가하기 위한 정량적 검정을 포할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR (qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 유전자좌를 인식하는 제1 프라이머 세트 및 비표적화된 참조 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머를 이용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다.
적합한 정량적 검정의 다른 예는 형광-매개 제자리 혼성화 (FISH), 비교 게놈 혼성화, 등온성 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, INVADER® 프로브, TAQMAN® 분자 비콘 프로브, 또는 ECLIPSETM 프로브 테크놀로지를 들 수 있다 (예컨대, US 2005/0144655 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
적합한 만능 세포의 예는 배아 줄기 (ES) 세포 (예컨대, 마우스 ES 세포 또는 래트 ES 세포)이다. 변형된 만능 세포는, 예를 들어, (a) 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터를 세포에 도입하는 단계, 여기서 삽입물 핵산은 본원에서 개시된 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 것인 단계; 및 (b) 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에서 통합된 삽입물 핵산을 포함하는 적어도 한 세포를 확인하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 대안으로, 변형된 만능 세포는 (a) 세포에: (i) 표적 게놈 유전자좌 내의 인식 부위에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 인식 부위에 충분히 근접한 곳에 위치한 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터, 여기서 삽입물 핵산은 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 것인 표적화 벡터를 도입하는 단계; 및 (c) 표적 게놈 유전자좌에서 변형 (예컨대, 삽입물 핵산의 통합)을 포함하는 적어도 한 세포를 확인하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 원하는 인식 부위에 닉 eh는 이중-가닥 파괴를 유도하는 임의의 뉴클레아제 작용제가 사용될 수 있다. 적합한 뉴클레아제의 예로는 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 및 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/CRISPR-회합된 (Cas) 시스템 또는 이러한 시스템의 구성요소 (예컨대, CRISPR/Cas9)를 들 수 있다. 예컨대, US 2013/0309670 및 US 2015/0159175 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
도너 세포는 임의의 단계, 예컨대 배반포 단계 또는 전-상실기 (즉, 4세포 단계 또는 8세포 단계)에서 숙주 배아에 도입될 수 있다. 자손은 생식선이 생성되지만 유전자 변형을 전파할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 7,294,754호 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
대안으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 1세포기 배아의 게놈을, 만능 세포를 변형시키기 위해 상기 기술된 방법을 사용하여 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 유전자 변형된 배아를 선택하는 단계; 및 (3) 유전자 변형된 배아를 대리 모체에 이식시키고 임신시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 1세포기 배아의 게놈을, 만능 세포를 변형시키기 위해 상기 기술된 방법을 사용하여 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 유전자 변형된 배아를 선택하는 단계; 및 (3) 유전자 변형된 배아를 대리 모체에 임신시키는 단계를 포함할 수 있다. 자손은 생식선이 생성되지만 유전자 변형을 전파할 수 있다.
비인간 포유류 동물을 생성하기 위해 핵 전달 기법이 또한 사용될 수 있다. 간단하게 설명하면, 핵 전달 방법은: (1) 난모세포를 탈핵화하는 단계 또는 탈핵화된 난모세포를 제공하는 단계; (2) 탈핵화된 난모세포와 조합될 도너 세포 또는 핵을 분리 또는 제공하는 단계; (3) 세포 또는 핵은 탈핵화된 난모세포에 삽입하여 재구성된 세포를 형성하는 단계; (4) 재구성된 세포를 배아를 형성하기 위하여 동물의 자궁에 이식하는 단계; 및 (5) 배아가 발생하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법으로, 난모세포는 일반적으로 죽은 동물로부터 회수되지만, 그것들은 살아있는 동물의 난관 및/또는 난소로부터 분리될 수도 있다. 난모세포는 탈핵화 전에 잘 알려져 있는 다양한 배지에서 성숙될 수 있다. 난모세포의 탈핵화는 잘 알려져 있는 많은 방식으로 수행될 수 있다. 재구성된 세포를 형성하기 위한 도너 세포 또는 핵의 탈핵화된 난모세포에의 삽입은 융합 전에 투명대 아래에서 도너 세포의 미세주입에 의해 이루어질 수 있다. 융합은 접촉/융합 면을 가로지르는 직류 전기 펄스의 인가에 의해 (전기융합), 세포의 융합-촉진 화학물질, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에의 노출에 의해, 또는 비활성화된 바이러스, 예컨대 센다이 바이러스에 의해 유도될 수 있다. 재구성된 세포는 핵 도너와 수령체 난모세포의 융합 전에, 중에, 및/또는 후에 전기적 및/또는 비전기적 수단에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 방법은 전기 펄스, 화학적으로 유도된 충격, 정자에 의한 침투, 난모세포의 이가 양이온의 수준 증가, 및 난모세포에서 세포 단백질의 인산화 (키나제 억제제에 의한 것와 같이) 감소를 포함한다. 활성화된 재구성된 세포, 또는 배아는 잘 알려져 있는 배지에서 배양된 후 동물의 자궁에 전달될 수 있다. 예컨대, US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390, WO 2008/017234, 및 미국 특허 제 7,612,250호 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본원에 제공된 다양한 방법은 유전자 변형된 F0 동물의 세포가 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 포함하는 유전자 변형된 비인간 F0 동물의 생성을 허용한다. F0 동물을 생성하기 위해 사용된 방법에 따라, 발현 카세트를 하나 이상 또는 전부 가지는 F0 동물 내에서 세포 수는 달라질 것이 인지된다. 예를 들어 VELOCIMOUSE® 방법을 통해 상응하는 유기체로부터의 전-상실기 배아 (예컨대, 8-세포기 마우스 배아)에의 도너 ES 세포의 도입은 F0 동물의 더 큰 백분율의 세포 집단이 표적화된 유전자 변형을 포함하는 관심 있는 뉴클레오타이스 서열을 가지는 세포를 포함하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 비인간 F0 동물의 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 세포 분포가 표적화된 변형을 가지는 세포 집단을 포함할 수 있다.
유전자 변형된 F0 동물의 세포는 본원에서 개시된 하나 이상의 또는 전부의 발현 카세트에 대해 이형접합성이거나 또는 본원에서 개시된 하나 이상의 또는 전부의 발현 카세트에 대해 동형접합성일 수 있다.
상기 또는 하기에서 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 출판물, 수탁 번호 등은 각각의 별개의 항목이 구체적으로, 그리고 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 포함된다. 만약 상이한 버전의 서열이 상이한 때의 수탁 번호와 관련이 있다면, 본 출원의 유효 출원일의 수탁 번호와 관련된 버전이 의미있다. 유효 출원일은 적용된다면 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 실제 출원일 또는 출원일보다 앞선 것을 의미한다. 마찬가지로, 만약 상이한 버전의 출판물, 웹사이트 등이 다른 때에 공개된다면, 다르게 표시되지 않는 한 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전이 의미있다. 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구체예, 또는 측면은 구체적으로 다르게 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명이 명료함과 이해를 목적으로 예시와 실시예에 의하여 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 특정 수정 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있을 것이 명백해질 것이다.
서열의 간단한 설명
첨부되는 서열 목록에서 열거된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대한 3-문자 코드를 사용하여 제시된다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부를 향해 진행하는 (즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 표준 관례를 따른다. 각 뉴클레오타이드 서열의 한 가닥만이 제시되지만, 상보하는 가닥이 표시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공될 때, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 코돈 축퇴성 변이체 또한 제공되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단을 향해 진행하는 (즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 표준 관례를 따른다.
서열의 설명.
SEQ ID NO 유형 설명
1 단백질 dCas9-VP64 키메라 Cas 단백질
2 단백질 dCas9 단백질
3 단백질 VP64 전사 활성화 도메인
4 단백질 링커 v1
5 단백질 링커 v2
6 단백질 MCP-p65-HSF1 키메라 어댑터 단백질
7 단백질 MS2 코트 단백질 (MCP)
8 단백질 p65 전사 활성화 도메인
9 단백질 HSF1 전사 활성화 도메인
10 RNA crRNA 꼬리
11 RNA tracrRNA
12 RNA gRNA 스캐폴드 v1
13 RNA gRNA 스캐폴드 v2
14 RNA gRNA 스캐폴드 v3
15 RNA gRNA 스캐폴드 v4
16 RNA MS2-결합 루프
17 DNA 가이드 RNA 표적 서열 + PAM v1
18 DNA 가이드 RNA 표적 서열 + PAM v2
19 DNA 가이드 RNA 표적 서열 + PAM v3
20 단백질 T2A
21 단백질 P2A
22 단백질 E2A
23 단백질 F2A
24 DNA dCas9 단백질을 암호화하는 핵산
25 DNA dCas9-VP64 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 핵산
26 DNA MCP를 암호화하는 핵산
27 DNA MCP-p65-HSF1 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산
28 DNA VP64 전사 활성화 도메인을 암호화하는 핵산
29 DNA p65 전사 활성화 도메인을 암호화하는 핵산
30 DNA HSF1 전사 활성화 도메인을 암호화하는 핵산
31 DNA 시너지 활성화 매개자 (SAM) 이중시스트론성 발현 카세트 (dCas9-VP64-T2A-MCP-p65-HSF1)
32 DNA 일반적인 가이드 RNA 어레이 발현 카세트
33 DNA Ttr 가이드 RNA 어레이 발현 카세트
34 DNA 마우스 Ttr 가이드 RNA 표적 서열 v1
35 DNA 마우스 Ttr 가이드 RNA 표적 서열 v2
36 DNA 마우스 Ttr 가이드 RNA 표적 서열 v3
37 RNA 마우스 Ttr 단일 가이드 RNA v1
38 RNA 마우스 Ttr 단일 가이드 RNA v2
39 RNA 마우스 Ttr 단일 가이드 RNA v3
40 RNA MS2 결합 루프를 가진 gRNA 스캐폴드
41 RNA 마우스 Ttr 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v1
42 RNA 마우스 Ttr 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v2
43 RNA 마우스 Ttr 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v3
44 단백질 시너지 활성화 매개자 (SAM) (dCas9-VP64-T2A-MCP-p65-HSF1)
45 DNA XBA-TDP 전방향
46 DNA XBA-TDP 프로브
47 DNA XBA-TDP 역방향
48 DNA Neo 전방향
49 DNA Neo 프로브
50 DNA Neo 역방향
51 DNA SAM TD 전방향
52 DNA SAM TD 프로브
53 DNA SAM TD 역방향
54 DNA MS2_T 전방향
55 DNA MS2_T 프로브
56 DNA MS2_T 역방향
57 DNA P65_T 전방향
58 DNA P65_T 프로브
59 DNA P65_T 역방향
60 DNA WPRE_TP 전방향
61 DNA WPRE_TP 프로브
62 DNA WPRE_TP 역방향
63 RNA 일반적인 단일 gRNA with MS2 결합 루프s
64 DNA 시너지 활성화 매개자 (SAM) 코딩 서열 (dCas9-VP64-T2A-MCP-p65-HSF1)
65 DNA 일반적인 가이드 RNA 어레이 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열
66 DNA Ttr 가이드 RNA 어레이 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열
67 DNA pscAAV Ttr 어레이
68 DNA pAAV Ttr g1
69 DNA pAAV Ttr g2
70 DNA pAAV Ttr g3
71 DNA pcsAAV Ldlr 어레이
72 DNA pAAV Ldlr g1
73 DNA pAAV Ldlr g2
74 DNA pAAV Ldlr g3
75 DNA 마우스 Ldlr 가이드 RNA 표적 서열 v1
76 DNA 마우스 Ldlr 가이드 RNA 표적 서열 v2
77 DNA 마우스 Ldlr 가이드 RNA 표적 서열 v3
78 RNA 마우스 Ldlr 단일 가이드 RNA v1
79 RNA 마우스 Ldlr 단일 가이드 RNA v2
80 RNA 마우스 Ldlr 단일 가이드 RNA v3
81 RNA 마우스 Ldlr 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v1
82 RNA 마우스 Ldlr 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v2
83 RNA 마우스 Ldlr 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v3
84 DNA Ldlr 가이드 RNA 어레이 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열
85 DNA pcsAAV Pcsk9 어레이
86 DNA pAAV Pcsk9 g1
87 DNA pAAV Pcsk9 g2
88 DNA pAAV Pcsk9 g3
89 DNA 마우스 Pcsk9 가이드 RNA 표적 서열 v1
90 DNA 마우스 Pcsk9 가이드 RNA 표적 서열 v2
91 DNA 마우스 Pcsk9 가이드 RNA 표적 서열 v3
92 RNA 마우스 Pcsk9 단일 가이드 RNA v1
93 RNA 마우스 Pcsk9 단일 가이드 RNA v2
94 RNA 마우스 Pcsk9 단일 가이드 RNA v3
95 RNA 마우스 Pcsk9 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v1
96 RNA 마우스 Pcsk9 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v2
97 RNA 마우스 Pcsk9 가이드 RNA DNA-표적화 분절 v3
98 DNA Pcsk9 가이드 RNA 어레이 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열
실시예
실시예 1. SAM-준비된 마우스의 생성
dCas9 시너지 활성화 매개자 (SAM) 시스템을 사용하기 위하여, 전형적으로 3개의 구성요소를 도입할 필요가 있다: (1) VP64 도메인에 직접 융합된 dCas9; (2) 2개의 추가적인 활성화 전사 인자 (열-충격 인자 1 (HSF1) 및 전사 인자 65 (p65))에 융합된 MS2 코트 단백질 (MCP); 및 (3) MS2-루프-함유 sgRNA. 각각의 구성요소는 전형적으로 별도의 렌티바이러스에 도입될 필요가 있다. 기술된 3-구성요소 시스템이 세포 배양에서 약간의 유연성을 허용하는 한편, 이 설정은 동물 모델에서는 덜 바람직하다. 대신, 본 발명자들은 dCas9 SAM 구성요소 (dCas9-VP64 및 MCP-p65-HSF1)를 내인성 Rosa26 프로모터에 의해 구동된 한 전사체로서 도입할 것을 선택하였다. 처음에, dCas9 SAM 시스템의 발현을 플록스된 네오마이신 중단 카세트의 존재에 의해 차단한다. Cre 재조합효소를 도입하여, 중단 카세트를 삭제하고 dCas9 SAM 발현을 가동시킨다. 그런 후 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 어레이 (예컨대, U6 프로모터로부터 발현됨)를, 그것을 다른 Rosa26 대립유전자에 통합시키거나 AAV 도입에 의해 도입한다. dCas9 SAM 대립유전자를 다양한 Cre 전달 방법과 쌍을 이룸으로써, 유전자 조절의 타이밍 및 조직 특이성을 제어한다. 하기에서 나타내는 것과 같이, 시스템을 생체내에서 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용할 수 있고 질환 모델링과 같은 적용을 위해 사용할 수 있다.
마우스 Rosa26 유전자좌를 표적화하는 상동성 팔을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를, Rosa26 유전자좌의 제1 인트론에 dCas9 SAM 발현 카세트를 도입하기 위하여 생성하였다. 박테리아 인공 염색체 (BAC) DNA로부터 VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 사용하는 박테리아 상동성 재조합 (BHR) 반응을 통해 유래된 LTVEC의 생성 및 용도는, 예컨대, US 6,586,251 및 Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(6):652-659 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 시험관내 어셈블리 방법을 통한 LTVEC의 생성은, 예컨대, US 2015/0376628 및 WO 2015/200334 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
발현 카세트에서 스트렙토코쿠스 피오게네스 dCas9 코딩 서열 (CDS)을 마우스에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다. 암호화된 dCas9는 Cas9 뉴클레아제를 비활성으로 만드는 다음의 돌연변이를 포함한다: D10A 및 N863A. dCas9-NLS-VP64-T2A-MCP-NLS-p65-HSF1-WPRE 발현 카세트를 도 1A 및 SEQ ID NO: 31에 도시한다. 시너지 활성화 매개자 (SAM) 코딩 서열 (dCas9-VP64-T2A-MCP-p65-HSF1)은 SEQ ID NO: 64에 제시하고 SEQ ID NO: 44에 제시한 단백질을 암호화한다. 발현 카세트를 Rosa26 유전자좌의 강력한 보편적인 발현 및 Rosa26 유전자좌의 표적화의 용이함의 장점을 취하기 위하여 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론 (도 2 참조)을 표적으로 하였다. 발현 카세트 앞에는 적절한 스플라이싱 신호 및 강력한 폴리아데닐화 (폴리A) 신호가 포함된 플록스된 네오마이신 내성 카세트 (neo 카세트)가 있었다. 5'에서 3' 쪽으로의 dCas9 SAM 발현 카세트의 구성요소를 하기 표 4에 나타낸다.
dCas9 SAM 발현 카세트 구성요소.
구성요소 SEQ ID NO: 31 내에서의 뉴클레오티드 영역
제1 loxP 부위 1 - 34
네오마이신 패밀리 항생물질 (예컨대 G418)에 대한 내성에 대해 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 125 - 928
폴리아데닐화 신호 937 - 2190
제2 loxP 부위 2218 - 2251
코돈-최적화된 dCas9 코딩 서열 2306 - 6457
NLS 2309 - 2356
NLS 6512 - 6532
VP64 6533 - 6719
5' GSG를 가진 T2A 6719 - 6781
MCP 6782 - 7171
NLS 7226 - 7246
p65 7262 - 7804
HSF1 7829 - 8200
우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE) 8224 - 8820
표적화된 Rosa26 대립유전자를 생성하기 위하여, LTVEC를 F1H4 마우스 배아 줄기 세포에 도입하였다. 항생물질 선택 후, 콜로니를 선택하고, 팽창시키고, TAQMAN®에 의해 스크리닝하였다. 대립유전자-변형 검정을 수행하여 정확한 표적화를 확인하였다. 대립유전자-상실 (LOA) 및 대립유전자-획득 (GOA) 검정을 포함하는 대립유전자-변형 (MOA) 검정은, 예를 들어, US 2014/0178879; US 2016/0145646; WO 2016/081923; 및 Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 대립유전자-상실 (LOA) 검정은 종래의 스크리닝 로직을 반전시키며 돌연변이가 지정된 천연 유전자좌의 게놈 DNA 샘플에서 복사물 수를 정량화한다. 정확하게 표적화된 이형접합성 세포 클론에서, LOA 검정은 2개의 천연 대립유전자 중 하나를 검출하고 (X 또는 Y 염색체 상에 없는 유전자의 경우), 다른 대립유전자는 표적화된 변형에 의해 파괴되었다. 동일한 원리를 역으로 대립유전자-획득 (GOA) 검정으로서 적용하여 게놈 DNA 샘플에서 삽입된 표적화 벡터의 복사물 수를 정량화할 수 있다. 스크리닝에 사용한 프라이머 및 프로브를 표 5에 제공한다.
프라이머 및 프로브.
프라이머/프로브 서열 SEQ ID NO
XBA-TDP 전방향 CGTGATCTGCAACTCCAGTCTT 45
XBA-TDP 프로브 AGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGC 46
XBA-TDP 역방향 CACACCAGGT태그CCTTTAAGCC 47
Neo 전방향 GGTGGAGAGGCTATTCGGC 48
Neo 프로브 TGGGCACAACAGACAATCGGCTG 49
Neo 역방향 GAACACGGCGGCATCAG 50
SAM TD 전방향 ACCGGCTGTCCGACTACGAT 51
SAM TD 프로브 TGGACCACATCGTGCCTCAGA 52
SAM TD 역방향 CGGGCCTTGTCGCTTCTG 53
MS2_T 전방향 GGCTCCTTCTAATTTCGCTAATGG 54
MS2_T 프로브 TGGCAGAGTGGATCAGCTCCA 55
MS2_T 역방향 CTGACGCTGCATGTCACCTT 56
P65_T 전방향 AGGGCGTGTCCATGTCTCA태그 57
P65_T 프로브 ACAGCCGAACCAATGCTGATGGA 58
P65_T 역방향 CCAGCCGGGTAATGGCTTC 59
WPRE_TP 전방향 TGTGTTGCCACCTGGATTCTG 60
WPRE_TP 프로브 CGCGGGACGTCCTTCTGCTAC 61
WPRE_TP 역방향 GGAAGGTCCGCTGGATTGAG 62
F0 마우스를 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 생성하였다. 예컨대, US 7,576,259; US 7,659,442; US 7,294,754; US 2008/0078000; 및 Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(1):91-99 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. VELOCIMOUSE® 방법에서, 표적화된 마우스 배아 줄기 (ES) 세포를 레이저 보조-주사를 통해 전-상실기 배아, 예컨대 8-세포기 배아에 주입하였고, 그것으로 전체적으로 ES-세포-유래된 F0 세대 마우스를 효율적으로 생산하였다.
Cre 재조합효소의 작용에 의한 플록스된 네오마이신 내성 카세트 (neo 카세트)의 제거 전에, 네오마이신 내성 유전자를 전사하고 번역한다; 그러나, dCas9-NLS-VP64 CDS 및 MCP-NLS-p65-HSF1 CDS는 런스루(run-through) 전사를 효과적으로 차단하는 강력한 폴리(A) 영역의 존재로 인해 발현되지 않는다. 도 1A를 참조한다. 그러나, Cre 재조합효소의 작용에 의한 neo 카세트의 제거 시에, dCas9 및 MCP 융합 단백질에 대한 하이브리드 mRNA는 Rosa26 프로모터에 의해 구성적으로 발현된다. 도 1B를 참조한다. dCas9 및 MCP 발현을 플록스된 네오마이신 내성 카세트 (neo 카세트)가 제거되어 있는 표적화된 mESC로부터 총 RNA를 추출하고, 역전사된 cDNA를 검출하기 위한 cDNA 및 TAQMAN® qPCR를 생성하기 위한 역전사 (RT-qPCR)에 의해 확인하였다. Cas9 및 p65 mRNA 수준을 측정하였다. 각각 도 3A 및 3B를 참조한다. dCas9 발현을 또한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 도 4를 참조한다. 이들을 함께 취합하면, 생성된 시스템은 mESC 및 그것으로부터 유래된 마우스에서 연속적으로 또는 조건부로 (네오마이신 내성 카세트의 제거를 필요로 함) 일관된 수준의 dCas9 융합 단백질 및 MCP 융합 단백질을 발현할 수 있다.
실시예 2. Ttr 가이드 RNA를 가진 SAM-준비된 마우스의 확인
이 시스템을 생체내에서 확인하기 위하여, 이형접합성 dCas9 SAM mESC를 마우스 Rosa26 유전자좌의 제1 인트론을 표적화하는 상동성 팔을 포함하는 Ttr 가이드 RNA 어레이 표적화 벡터로 표적화하였다. Ttr 가이드 RNA 어레이를 도 5 및 SEQ ID NO: 33에 제시한다. 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 포함하는 영역을 SEQ ID NO: 66에 제시한다. 어레이에서 가이드 RNA에 의해 표적화된 마우스 Ttr 유전자의 가이드 RNA 표적 서열 (PAM을 포함하지 않음)을 SEQ ID NO: 34 (ACGGTTGCCCTCTTTCCCAA), SEQ ID NO: 35 (ACTGTCAGACTCAAAGGTGC), 및 SEQ ID NO: 36 (GACAATAAG태그TCTTACTC)에 각각 제시한다. SEQ ID NO: 34는 Ttr 전사 시작 부위의 -63에 위치하고, SEQ ID NO: 35는 Ttr 전사 시작 부위의 -134에 위치하며, SEQ ID NO: 36은 Ttr 전사 시작 부위의 -112에 위치한다. 이들 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 단일 가이드 RNA를 각각 SEQ ID NO: 37, 38, 및 39에 제시한다. 상동성 팔은 Ttr 유전자좌를 표적화하는 3개의 MS2-스템 루프-함유 가이드 RNA를 포함하는 Ttr 가이드 RNA 어레이의 양옆에 있다. Ttr 가이드 RNA 어레이를 록스를 포함한(roxed) 퓨로마이신 중단 카세트를 가진 Rosa26 유전자좌에서 통합하였다. 이 카세트는 Rosa26 런스루 전사체가 U6 프로모터 활성을 간섭하지 못하게 한다. 중간 카세트 후에, MS2 스템 루프를 함유한 3개의 sgRNA 서열을 그것들을 분리시키는 확장된 PolIII 종결 서열과 나란히 있는 U6 프로모터에 의해 발현시켰다. 가이드를 Ttr 전사al 시작 부위 (TSS)의 상류로 100 내지 200 bp 영역으로 dCas9 SAM 구성요소를 지시하도록 설계하였다. 도 6을 참조한다. 5'에서 3' 쪽으로 Ttr 가이드 RNA 어레이 발현 카세트의 구성요소를 하기 표 6에 나타낸다. MS2 스템 루프를 포함하는, 각각의 가이드 RNA의 구조의 일반적인 개략도를 도 7에 도시한다.
Ttr 가이드 RNA 어레이 발현 카세트 구성요소.
구성요소 SEQ ID NO: 33 내에서의 뉴클레오타이드 영역
제1 rox 부위 1 - 32
퓨로마이신 패밀리 항생물질에 대한 내성에 대해 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 111 - 710
폴리아데닐화 신호 797 - 2338
제2 rox 부위 2363 - 2394
제1 U6 프로모터 2401 - 2640
제1 Ttr 가이드 RNA 코딩 서열 2642 - 2798
제2 U6 프로모터 2884 - 3123
제2 Ttr 가이드 RNA 코딩 서열 3125 - 3281
제3 U6 프로모터 3366 - 3605
제3 Ttr 가이드 RNA 코딩 서열 3606 - 3762
표적화된 mESC 클론이 dCas9 SAM 발현 카세트에 대해 이형접합성이고 가이드 RNA 어레이 발현 카세트에 대해 이형접합성인 것을 확인한 후, 본 발명자들은 상대적인 유전자 발현을 측정하기 위하여 RT-qPCR을 사용하였다. Ttr의 경우에, RT-qPCR은 중단 카세트에 의해 차단된 dCas9 SAM 구성요소를 함유한 본 발명자들의 WT mESC, 및 능동적으로 발현된 dCas9 SAM 대립유전자를 가진 mESC (중단 카세트 제거됨)에서 35의 ct 값에 도달하였다. 그러나, 각 세포주에 대해 U6 SAM Ttr 가이드 어레이를 표적화한 후에, 활성 dCas9 SAM 시스템 + 가이드 발현을 함유한 세포주만이 20으로 ct 값이 감소하는 것을 보였다. 도 8A를 참조한다. 이런 15 ct 값의 저하는 상대적인 유전자 발현에서 2500배 증가로 해석된다. Ttr 발현에서 이러한 상당한 증가로, 본 발명자들은 인접한 유전자가 dCas9 SAM 활성화 구성요소의 밀접한 근접성에 의해 영향을 받지 않는 것을 확실히 하기를 원하였다. 이 목적을 위해, Dsg2 및 B4galt6 (Ttr의 각 측면에 있는 유전자)을 RT-qPCR에 의해 평가하였고 상기 언급한 세포주 중 어느 것에서도 발현의 상당한 증가가 나타나지 않은 것으로 결정하였다. 각각 도 8B 및 8C를 참조한다.
이 유전자 상향조절이 안정적이고 마우스 모델로 번역될 수 있는지를 확인하기 위하여, 표적화된 클론을 8-세포 마우스 배아에 미세주입하여 마우스 라인을 유도하였다. 구체적으로 설명하면, 작은 구멍을 투명대에 생성하여 표적화된 mESC의 주사를 용이하게 하였다. 이들 주입된 8-세포 배아를 대리 모체에 옮겨서 도입유전자를 포함한 살아있는 새끼를 생산하였다. 대리 모체에서 임신되었을 때, 주입된 배아는 검출 가능한 숙주 배아 기여를 갖지 않은 F0 마우스를 생산하였다. 전체적으로 ES-세포-유래 마우스는 정상이었고, 건강하였고, 수정 가능하였다 (생식선 전달됨).
RT-qPCR에 의해 검정한 Ttr mRNA 발현을 야생형 마우스, dCas9 SAM 마우스, 및 게놈상으로 통합된 Ttr 가이드 RNA 어레이를 가진 dCas9 SAM 마우스로부터 수득한 다양한 조직에서 관찰하였다. 이들 조직에서 각각 RNA 추출하였다. 게놈 DNA는 그것이 qPCR 반응을 향해 사용되지 않도록 분해하였다. RNA를 역전사한 후 Ttr에 대해 특이적인 검정을 사용하여 Ttr 전사체를 검출하였다. 실험에서, 각 조직으로부터 동등한 질량의 RNA를 RT-qPCR에 의해 검정하였다. 데이터는 Ttr 발현의 수준이, 정상적으로는 TTR이 나타날 것으로 예상하지 못하였던 일부 장기를 포함하여, 모든 조직에서 상승된 것을 보여준다. 표 7을 참조한다. TTR 단백질 발현은 또한 간, 비장, 심장, 폐, 골격근, 고환, 흉선, 눈, 췌장, 림프절, 신장, 및 뇌를 포함한, 조사한 모든 조직에서 상승하였다. 각각 도 9A-9L을 참조한다. 그러나, 상대적 발현은 조직에 의해 영향을 받았다. 전체적으로, 대조군 마우스로부터의 조직에서 낮은 Ttr 발현은 SAM 시스템에 의한 더 높은 상향조절과 상관이 있었다. 폐 및 비장에서 사이클 한계값에 의해 측정된 Ttr mRNA 발현 수준을 각각 도 10A 및 10B에 나타낸다. RT-qPCR에서, 양성 반응은 형광 신호의 축적에 의해 검출된다. 사이클 한계값 (ct)은 형광 신호가 바탕값 수준을 초과하기 위해 필요한 사이클 수로서 규정하고, ct 값이 낮을수록 더 높은 발현을 가리킨다. 더욱이, mESC 클론에서의 스크리닝과 같이, Dsg2 및 B4galt6 (Ttr의 각 측면에 있는 유전자)을 RT-qPCR에 의해 평가하였고 발현의 상당한 증가가 없는 것으로 결정하였다. 예컨대, 도 10C, 10D, 10E, 및 10F를 참조한다.
대조군에 비교한 TTR 발현의 증가.
조직 WT
TTR (avg Ct) 		R26SAM
TTR (avg CT) 		R26TTR:R26SAM TTR (avg CT) 상대적 발현
간 14.11 14.45 13.01 2.9
뇌 17.89 18.04 16.29 3.19
눈 18.84 19.38 16.78 6.89
신장 19.49 20.25 13.05 110.13
췌장 22.72 23.04 14.29 238.68
흉선 27.28 27.93 20.29 247.99
고환 27.47 27.60 17.64 1935.15
심장 28.36 29.56 17.71 1015.33
비장 29.70 28.63 18.08 3323.59
폐 30.43 31.90 15.17 79415.55
골격근 32.32 29.89 19.86 5918.21
dCas9 SAM 구성요소 및 Ttr을 표적화하는 SAM 가이드 RNA 어레이에 대해 이형접합성인 F0 마우스는, 야생형 마우스 또는 dCas9 SAM 구성요소 단독을 발현하는 마우스와 비교할 때, ELISA에 의해 혈청에서 검출된 1000 μg/mL의 순환 TTR로부터 4000 μg/mL로 증가한 것을 보여주었다. 도 11을 참조한다.
본 발명자들은 다음에 Rosa26 유전자좌로부터 Ttr을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 마우스에서 TTR 수준의 증가가 안정적인지를 평가하였다. 3개 그룹의 마우스를 사용하였다: (1) F1H4 (WT); (2) 이형접합성 Rosa26-dCas9-SAM; 및 (3) Rosa26-dCas9-SAM:Rosa26-U6-TTR 가이드 어레이 (Ttr을 표적화하는 3개의 가이드). 이들 마우스를 상기에서 기술한 것과 같이 mESC로부터 생성하였고, F0 세대를 1년까지로 하였다. TTR의 혈청 양을 ELISA에 의해 매월 측정하였고, 임의의 병리적 변화에 대해 동물을 관찰하였다. 이들 동물에서 1년 후에 관찰된 병리적 변화는 없었지만, 동물들은 순환 TTR에서 2배 내지 2.5배 증가를 유지하였다. 도 13을 참조한다. 이들 데이터는 Ttr 발현 및 순환 TTR 수준이 Rosa26 유전자좌로부터의 Ttr에 대해 표적화된 가이드를 발현하는 마우스에서 적어도 1년 동안 안정적인 것을 보여준다.
dCas9 SAM 구성요소 및 가이드 RNA 어레이 둘 다에 대한 발현 구성물이 게놈상으로 통합되어 있는 시스템은 마우스의 전 수명을 통해 매우 높은 유전자 발현을 생성하기 위한 큰 시스템이다. 그러나, 본 발명자들은 또한 발현의 급성 증가를 모방할 수 있기를 원하였다. 이것을 실행하기 위하여, 본 발명자들은 Rosa26에 의해 발현된 dCas9 SAM 구성요소에 대해 이형접합성인 성인 마우스에 동일한 Ttr 가이드 어레이를 은닉한 AAV를 도입하였다. AAV (혈청형 8)를 꼬리 정맥 주사를 통해 표적 간 세포에 도입하였다. 본 발명자들은 ELISA에 의해 순환 TTR을 주사 후 5, 19, 및 60일째에 분석하여 주사의 성공 여부를 결정하였다. 놀랍게도, 마우스에서 순환 TTR의 수준은 5일 째에 미처리 마우스 또는 GFP를 발현하는 AAV로 처리된 대조군 마우스에서의 1000 μg/mL로부터 AAV 처리된 마우스에서 7000 μg/mL로 급상승하였다. 19일 째에, 혈청 수준은 계속해서 11,000 μg/mL로 증가하였다. 60일 째에, 혈청 수준은 여전히 대략 8000 μg/mL이었다. 도 12를 참조한다.
본 발명자들은 다음에 주사 후 8개월 후에 이 실험을 수행하였다. 상기에서와 같이, 3개 그룹의 마우스를 평가하였다: (1) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (미처리); (2) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-GFP); 및 (3) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-gTTR 어레이 (TTR을 표적화하는 3개의 가이드)). 이들 마우스에 생후 8주 째에 AAV8-GFP 또는 AAV8-gTTR 어레이로 주사하고 주사 후 8개월까지 추적하였다. TTR의 혈청 양을 ELISA에 의해 다양한 초기 시점에 및 매월 측정하였고, 이들 동물을 임의의 병리적 변화에 대해 관찰하였다. 이들 동물에서 주사 후 8개월째에 병리적 변화는 관찰하지 못하였지만, 동물들은 순환 TTR에서 19일 째에 11배의 초기 증가를 보였고, 주사 후 5개월까지 약 4배의 상승된 TTR의 꾸준한 상태의 수준이 관찰되었다. 도 14를 참조한다.
다중 가이드 RNA가 생체내에서 상향조절을 허용하기 위해 필요한지 또는 단일 가이드 RNA로 충분한 것인지를 추적하기 위하여, 본 발명자들은 가이드 RNA 어레이로부터 각각의 가이드 RNA를 취하였고 그것들을 개별적으로 AAV8에 포장하였다. 6개 그룹의 마우스를 이 실험에서 평가하였다: (1) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (미처리); (2) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-GFP); (3) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-gTTR 어레이 (TTR을 표적화하는 3개의 가이드)); (4) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-gTTR#1); (5) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-gTTR#2); 및 (6) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM (AAV8-gTTR#3)). 그룹 (3) 내지 (6)에서 가이드 RNA 발현 카세트에 대한 서열을 각각 SEQ ID NO: 67-70에 제시한다. 이들 마우스에게 가이드 RNA 또는 GFP를 함유한 AAV8을 생후 8주 째에 주사하였고, 주사 후 8개월까지 추적하였다. TTR의 혈청 을 ELISA에 의해 3주까지는 다양한 초기 시점에 측정하였다. 그 결과를 도 15에 도시한다. 주사 후 1주 째에, gTTR 가이드 어레이는 대조군 그룹보다 6.5배 증가한 순환 TTR을 나타냈고, 단일 가이드 RNA의 각각은 혈청에서 3배 증가된 순환 TTR을 나타냈다. 주사 후 2주 째에, gTTR 가이드 어레이는 대조군 그룹에 비해 순환 TTR이 5.5배로 감소하였고, 단일 가이드 중 둘은 혈청에서 3.5배 양의 순환 TTR을 유지하였으며, gRNA#3은 혈청 중의 순환 TTR에서 거의 5배 증가로 상승하였다. 주사 후 3주 째에, 모든 gRNA는 야생형 대조군에 비해 혈청 중의 순환 TTR에서 약 3.5배 증가 수준을 나타냈다. 이들 결과는 가이드 RNA 어레이가 단백질의 초기 고도 탈진을 제공할 수 있지만, 시간이 경과하면서 단일 gRNA가 유전자 상향조절에서 동등하게 잘 수행하여 순환 TTR 단백질을 초래할 수 있음을 시사하였다.
계속해서 AAV에 통합된 단일 가이드 또는 다중 가이드가 Rosa26-dCas9-SAM 마우스에서의 유전자 상향조절에서 보다 더 성공적인지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 1개의 가이드 RNA 또는 2개의 가이드 RNA를 사용하여 간에서 표적 유전자 1 발현을 평가하였다. RNA 발현을 주사 후 3주 째에 TAQMAN을 통해 평가하였다. 본 발명자들은 미처리 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM과 비교하여 3개 그룹 ((1) (1) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-표적 유전자 1 가이드 RNA #1), (2) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-표적 유전자 1 가이드 RNA #2), 및 (3) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-표적 유전자 1 가이드 RNA #1&2)) 전부에서 표적 유전자 1의 상당한 상향조절을 관찰하였다. 이런 주사 후 3주 시점에서 1개의 가이드 RNA 그룹과 비교할 때 2개의 가이드 RNA 그룹에서 RNA 발현의 상당한 증가가 있었다. 2개의 가이드 RNA를 가진 AAV8의 사용은 미처리된 것에 비해 간 발현에서 200배를 초과하는 증가를 초래한 반면, 1개의 가이드 RNA를 가진 AAV8의 사용은 미처리된 것에 비해 간 발현에서 100배를 초과하는 증가를 초래하였다. 도 19를 참조한다.
상기에서 기술한 실험이 주로 마우스 Ttr 유전자의 상향조절에 초점을 맞추었지만, 유사하게 증가된 발현이 또한 다른 유전자를 표적화할 때에도 관찰되었따 (데이터 미도시). 추가로, 상이한 혈청형을 사용함으로써 또는 조직-특이적 Cre 처리를 사용하여 dCas9 SAM 발현을 제어함으로써, 본 발명자들은 강력한, 믿을 수 있는 질환 모델을 생성하기 위하여 유전자 상향조절 타이밍 및 조직 특이성을 제어할 수 있다.
실시예 3. Pcsk9 및 Ldlr 가이드 RNA를 가진 SAM-준비된 마우스의 확인
이 시스템을 생체내에서 추가로 확인하는 것으로서, 콜레스테롤 경로에 관여하는 2개 유전자 (Pcsk9 및 Ldlr)를 상향 조절에 대한 표적으로서 선택하였고, 콜레스테롤 수준에 대한 생리적 효과를 5주 시간 동안 관찰하였다. 3개 그룹의 마우스를 평가하였다: (1) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-Pcsk9 가이드 어레이); (2) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-Ldlr 가이드 어레이); 및 (3) 동형접합성 Rosa26-dCas9-SAM(미처리).
Pcsk9 가이드 RNA 어레이에 대한 서열을 SEQ ID NO: 85에 제시한다. 가이드 RNA 어레이는 3개의 가이드 RNA를 암호화한다. 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 포함하는 영역을 SEQ ID NO: 98에 제시한다. 어레이의 가이드 RNA에 의해 표적화된 마우스 Pcsk9 유전자의 가이드 RNA 표적 서열 (PAM을 포함하지 않음)을 SEQ ID NO: 89-91에 제시한다. 이들 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 단일 가이드 RNA를 각각 SEQ ID NO: 92-94에 제시한다.
Ldlr 가이드 RNA 어레이에 대한 서열을 SEQ ID NO: 71에 제시한다. 가이드 RNA 어레이는 3개의 가이드 RNA를 암호화한다. 프로모터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 포함하는 영역을 SEQ ID NO: 84에 제시한다. 어레이의 가이드 RNA에 의해 표적화된 마우스 Ldlr 유전자의 가이드 RNA 표적 서열 (PAM을 포함하지 않음)을 SEQ ID NO: 75-77에 제시한다. 이들 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 단일 가이드 RNA를 각각 SEQ ID NO: 78-80에 제시한다.
그 결과를 도 16A에 도시한다. 주사 후 2주 째에, Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-Pcsk9 가이드 어레이)은 주사 전 콜레스테롤 수준보다 콜레스테롤 수준의 3.5배 증가를 나타냈다. 대조적으로, Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-Ldlr 가이드 어레이)은 주사 전 수준보다 75%만큼의 총 콜레스테롤 수준의 감소를 보였다. 미처리된 동물은 그들의 콜레스테롤을 유지하였다. 주사 후 5주 째에, Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-Pcsk9 가이드 어레이)은 주사 전 콜레스테롤 수준보다 콜레스테롤 수준의 3배 증가를 나타냈다. 대조적으로, Rosa26-dCas9-SAM(AAV8-Ldlr 가이드 어레이)은 주사 전 수준보다 50%만큼의 총 콜레스테롤 수준의 감소를 보였다. 미처리된 동물은 그들의 콜레스테롤을 유지하였다. 유사한 효과를 LDL 수준으로 관찰하였다. 도 16B를 참조한다.
다음에, Ldlr 및 Pcsk9의 발현을 평가하였다. 상기 실험에서 주사 후 5주 째의 마우스의 간에서 Ldlr 및 Pcsk9의 TAQMAN 발현 수준을 각각 도 17A 및 17B에 도시한다.
dCAS9-SAM 시스템을 통한 LDLR의 증가가 장기간 유익으로 이어질 수 있음을 보여주는 추가의 확인으로서, 본 발명자들은 고지방 식단을 급식하고 AAV8-Ldlr 가이드 RNA 어레이를 주사한 후 20주 동안 추적한 동형접합성 dCas9-SAM 마우스에서 AAV8-Ldlr 가이드 RNA 어레이를 평가하였다. 마우스를 초기 콜레스테롤 수준에 대해 사전 출혈한 후 8주 동안 고지방 식단 (HFD)을 공급하였다 (콜레스테롤 수준을 테스트하기 위하여 4주마다 출혈시킴). 콜레스테롤 및 LDL 수준에 대한 결과를 각각 도 18A 및 18B에 도시한다. 8주 후에, 마우스에게 AAV8-Ldlr 가이드 어레이를 주사하거나 미처리로 두었다. 마우스를 매달 출혈하고, 그들의 총 콜레스테롤 및 LDL 수준을 평가하였다. 이 기간 동안, AAV8-Ldlr 가이드 어레이로 처리된 마우스는 HFD를 받은 미처리 마우스와 비교하여 더 낮은 총 콜레스테롤 및 더 낮은 LDL 수준을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> TRANSCRIPTION MODULATION IN ANIMALS USING CRISPR/CAS SYSTEMS <130> 57766-527578 <150> US 62/644,961 <151> 2018-03-19 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 20 25 30 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 35 40 45 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 65 70 75 80 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 100 105 110 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 115 120 125 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 130 135 140 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 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cattgcaata gtgtgttgga 1740 attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc aaatcattta aaacatcaga 1800 atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag 1860 gttggctata aagaggtcat cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc 1920 atagaaaagc cttgacttga ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt 1980 ctttaacatc cctaaaattt tccttagatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct 2040 gactactccc agtcatagct gtccctcttc tcttatggag atccctcgag gacatgaggt 2100 cgtcgctgta atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2160 acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat 2220 tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 2280 tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtcga 2340 cactgggtcg tgatcgggta cctaacttta aataatgcca attatttaaa gttagctagc 2400 tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattgga 2460 attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 2520 tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 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cttgtggaaa ggacgaaaca ccgcttcacc tcactgagcg ggggttttag 1260 agctaggcca acatgaggat cacccatgtc tgcagggcct agcaagttaa aataaggcta 1320 gtccgttatc aacttggcca acatgaggat cacccatgtc tgcagggcca agtggcaccg 1380 agtcggtgct ttttttgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 1440 ttggtcaccc agtgaggaag ctaggacaga cctaggacgg ttgcctgcag g 1491 <210> 72 <211> 490 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> mU6 promoter <220> <221> misc_feature <222> (320)..(339) <223> Guide1 <220> <221> misc_feature <222> (340)..(476) <223> SAM Tracr <220> <221> misc_feature <222> (477)..(482) <223> Small terminator <400> 72 tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60 gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120 gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180 tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240 gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt 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<400> 80 cuucaccuca cugagcgggg guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc 60 agggccuagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac 120 ccaugucugc agggccaagu ggcaccgagu cggugcu 157 <210> 81 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 aagcggugaa auucuguggg 20 <210> 82 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 cacucaaaca gcaacgcggg 20 <210> 83 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 cuucaccuca cugagcgggg 20 <210> 84 <211> 1415 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattgga 60 attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 120 tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc 180 gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc 240 gaagcggtga aattctgtgg ggttttagag ctaggccaac atgaggatca cccatgtctg 300 cagggcctag caagttaaaa taaggctagt 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tatcttgtgg aaaggacgaa 1200 acaccgcttc acctcactga gcgggggttt tagagctagg ccaacatgag gatcacccat 1260 gtctgcaggg cctagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttgg ccaacatgag 1320 gatcacccat gtctgcaggg ccaagtggca ccgagtcggt gctttttttg ttttagagct 1380 agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttt 1415 <210> 85 <211> 1490 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (28)..(267) <223> hU6 promoter <220> <221> misc_feature <222> (268)..(287) <223> Guide1 <220> <221> misc_feature <222> (288)..(424) <223> SAM Tracr <220> <221> misc_feature <222> (425)..(476) <223> Extended terminator <220> <221> misc_feature <222> (510)..(749) <223> hU6 promoter <220> <221> misc_feature <222> (751)..(770) <223> Guide2 <220> <221> misc_feature <222> (771)..(907) <223> SAM Tracr <220> <221> misc_feature <222> (908)..(959) <223> Extended terminator <220> <221> misc_feature <222> (992)..(1231) <223> hU6 promoter <220> <221> misc_feature <222> (1233)..(1252) <223> Guide3 <220> <221> 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cgaaacaccg caggcggggt gccaactcag gttttagagc 780 taggccaaca tgaggatcac ccatgtctgc agggcctagc aagttaaaat aaggctagtc 840 cgttatcaac ttggccaaca tgaggatcac ccatgtctgc agggccaagt ggcaccgagt 900 cggtgctttt tttgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgtttta 960 tgcatgtggc tcccatttat acctggccgg ctttcccatg attccttcat atttgcatat 1020 acgatacaag gctgttagag agataattgg aattaatttg actgtaaaca caaagatatt 1080 agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt 1140 atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc 1200 tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac cgaatattaa ctaacttctc ctgttttaga 1260 gctaggccaa catgaggatc acccatgtct gcagggccta gcaagttaaa ataaggctag 1320 tccgttatca acttggccaa catgaggatc acccatgtct gcagggccaa gtggcaccga 1380 gtcggtgctt tttttgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt 1440 tggtcaccca gtgaggaagc taggacagac ctaggacggt tgcctgcagg 1490 <210> 86 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> 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Sequence <220> <223> Synthetic <400> 92 gaagagucau gggucacagg guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc 60 agggccuagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac 120 ccaugucugc agggccaagu ggcaccgagu cggugcu 157 <210> 93 <211> 157 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 93 caggcggggu gccaacucag guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc 60 agggccuagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac 120 ccaugucugc agggccaagu ggcaccgagu cggugcu 157 <210> 94 <211> 157 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 94 aauauuaacu aacuucuccu guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc 60 agggccuagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac 120 ccaugucugc agggccaagu ggcaccgagu cggugcu 157 <210> 95 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 gaagagucau gggucacagg 20 <210> 96 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 caggcggggu gccaacucag 20 <210> 97 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 97 aauauuaacu aacuucuccu 20 <210> 98 <211> 1414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 98 tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattgga 60 attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 120 tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc 180 gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc 240 gaagagtcat gggtcacagg gttttagagc taggccaaca tgaggatcac ccatgtctgc 300 agggcctagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttggccaaca tgaggatcac 360 ccatgtctgc agggccaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttgttttag agctagaaat 420 agcaagttaa aataaggcta gtccgttttg agctccataa gactcggcct tagaacaagc 480 tttttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataattg 540 gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 600 aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 660 ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca 720 ccgcaggcgg ggtgccaact caggttttag agctaggcca acatgaggat cacccatgtc 780 tgcagggcct agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttggcca acatgaggat 840 cacccatgtc tgcagggcca agtggcaccg agtcggtgct ttttttgttt tagagctaga 900 aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt ttatgcatgt ggctcccatt tatacctggc 960 cggctttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat 1020 tggaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta 1080 ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct 1140 taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa 1200 caccgaatat taactaactt ctcctgtttt agagctaggc caacatgagg atcacccatg 1260 tctgcagggc ctagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttggc caacatgagg 1320 atcacccatg tctgcagggc caagtggcac cgagtcggtg ctttttttgt tttagagcta 1380 gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg tttt 1414

Claims (109)

  1. 제1 게놈상으로 통합된 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물로서, 제1 발현 카세트는:
    (a) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 포함하는 키메라 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 회합된 (Cas) 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 어댑터를 포함하는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 비인간 동물.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 발현 카세트를 추가로 포함하며, 각각의 가이드 RNA는 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하고,
    하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 Cas 단백질과 복합체를 형성하여 그것을 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내할 수 있는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  3. 제1항에 있어서, 각각이 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하고 있는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 제2 게놈상으로 통합된 발현 카세트를 추가로 포함하며,
    하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 Cas 단백질과 복합체를 형성하여 그것을 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내할 수 있는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 표적 서열은 표적 유전자 내의 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  5. 제4항에 있어서, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 표적 유전자의 전사 시작 부위의 200 염기쌍 내에 있는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  7. 제6항에 있어서, 표적 서열은 전사 시작 부위의 상류로 200 염기쌍 및 전사 시작 부위의 하류로 1 염기쌍의 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각을 암호화하는 서열은 상이한 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 어댑터-결합 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  10. 제9항에 있어서, 제1 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제1 루프 내에 있고, 제2 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제2 루프 내에 있는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 교차활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 부분에 융합된 CRISPR RNA (crRNA) 부분을 포함하는 단일 가이드 RNA이고,
    제1 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 13-16에 상응하는 테트라루프이며, 제2 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 53-56에 상응하는 스템 루프 2인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터-결합 요소는 SEQ ID NO: 16에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 SEQ ID NO: 40 또는 63에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Ttr 유전자를 표적으로 하고, 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34-36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Ttr-가이드 RNA는 SEQ ID NO: 37-39 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  15. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Pcsk9 유전자를 표적으로 하고, 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89-91 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 92-94 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  16. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Ldlr 유전자를 표적으로 하고, 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75-77 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 78-80 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 둘 이상의 표적 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 적어도 3개의 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  20. 제19항에 있어서, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ttr 유전자좌를 표적으로 하고, 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 37에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 35를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 36을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 39에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  21. 제19항에 있어서, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Pcsk9 유전자좌를 표적으로 하고, 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 92에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 90을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 91을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  22. 제19항에 있어서, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ldlr 유전자좌를 표적으로 하고, 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 78에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 76을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 79에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 SEQ ID NO: 80에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  24. 제23항에 있어서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 단백질과 최적으로 정렬될 때 D10A 및 N863A에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 암호화하는 서열은 비인간 동물에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 Cas 단백질에서 하나 이상의 전사 활성자 도메인은: VP16, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9, 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  28. 제27항에 있어서, 키메라 Cas 단백질에서 하나 이상의 전사 활성자 도메인은 VP64를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  29. 제28항에 있어서, 키메라 Cas 단백질은 N-말단에서 C-말단 쪽으로: 촉매적으로 비활성인 Cas 단백질; 핵 국지화 신호; 및 VP64 전사 활성자 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  30. 제29항에 있어서, 키메라 Cas 단백질은 SEQ ID NO: 1에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  31. 제30항에 있어서, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 SEQ ID NO: 25에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트는 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 분절의 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 추가로 포함하고,
    폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 재조합효소 인식 부위가 양옆에 있으며,
    폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 조직-특이적 방식으로 절제된 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  33. 제32항에 있어서, 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 간에서 절제된 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 재조합효소는 Cre 재조합효소인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합효소 코딩 서열을 포함하는 게놈상으로 통합된 재조합효소 발현 카세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소 유전자는 표 2에 제시된 프로모터 중 하나에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터는 키메라 어댑터 단백질의 N-말단부에 있고, 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 키메라 어댑터 단백질의 C-말단부에 있는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터는 MS2 코트 단백질 또는 그것의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 어댑터 단백질에서 하나 이상의 전사 활성화 도메인은: VP16, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9, 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  40. 제39항에 있어서, 키메라 어댑터 단백질에서 하나 이상의 전사 활성화 도메인은 p65 및 HSF1을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  41. 제40항에 있어서, 키메라 어댑터 단백질은 N-말단에서 C-말단 쪽으로: MS2 코트 단백질; 핵 국지화 신호; p65 전사 활성화 도메인; 및 HSF1 전사 활성화 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  42. 제41항에 있어서, 키메라 어댑터 단백질은 SEQ ID NO: 6에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  43. 제42항에 있어서, 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 SEQ ID NO: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트는 다중시스트론성인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  45. 제44항에 있어서, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절로부터 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  46. 제44항에 있어서, 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절은 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 제1 발현 카세트의 분절로부터 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  47. 제46항에 있어서, 2A 펩타이드는 T2A 펩타이드인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌에 통합되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  49. 제2항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트 및/또는 제2 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌에 통합되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  50. 제49항에 있어서, 비인간 동물은 제1 발현 카세트에 대해 이형접합성이고 제2 발현 카세트에 대해 이형접합성이며,
    제1 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌의 제1 대립유전자 내에 게놈상으로 통합되고, 제2 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌의 제2 대립유전자 내에 게놈상으로 통합되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 안전한 은닉 유전자좌는 Rosa26 유전자좌인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트는 안전한 은닉 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  54. 제53항에 있어서, 포유류는 설치류인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  55. 제54항에 있어서, 설치류는 래트 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  56. 제55항에 있어서, 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  57. 게놈상으로 통합된 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물 세포로서, 발현 카세트는:
    (a) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 포함하는 키메라 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 회합된 (Cas) 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 어댑터를 포함하는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 비인간 동물 세포.
  58. 게놈상으로 통합된 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물 게놈으로서, 발현 카세트는:
    (a) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 포함하는 키메라 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 회합된 (Cas) 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 어댑터를 포함하는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 비인간 동물 게놈.
  59. 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열을 표적화하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적화 서열을 표적화하는 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하는 표적화 벡터로서, 삽입물 핵산은 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는:
    (a) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 뉴클레아제-비활성 Cas 단백질을 포함하는 키메라 군집된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 회합된 (Cas) 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    (b) 하나 이상의 전사 활성화 도메인에 융합된 어댑터를 포함하는 키메라 어댑터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 표적화 벡터.
  60. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 비인간 동물의 제조 방법으로서,
    (a) 비인간 동물 배아 줄기 (ES) 세포에:
    (i) 표적 게놈 유전자좌의 표적 서열을 표적으로 하는 뉴클레아제 작용제; 및
    (ii) 표적 게놈 유전자좌의 5' 표적 서열에 상응하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌의 3' 표적 서열에 상응하는 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터
    를 도입하는 단계로,
    표적화 벡터는 표적 게놈 유전자좌와 재조합하여 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 생성하는 것인 단계;
    (b) 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및
    (c) 비인간 동물 숙주 배아를 대리 모체에서 임신시키는 단계로, 대리 모체는 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 F0 자손 유전자 변형된 비인간 동물을 생산하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 표적화 벡터는 길이가 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터이거나 5' 및 3' 상동성 팔의 총 합의 길이가 적어도 10 kb인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 비인간 동물의 제조 방법으로서,
    (a) 비인간 동물 1세포기 배아에:
    (i) 표적 게놈 유전자좌의 표적 서열을 표적으로 하는 뉴클레아제 작용제; 및
    (ii) 표적 게놈 유전자좌의 5' 표적 서열에 상응하는 5' 상동성 팔 및 표적 게놈 유전자좌의 3' 표적 서열에 상응하는 3' 상동성 팔이 양옆에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터
    를 도입하는 단계로,
    표적화 벡터는 표적 게놈 유전자좌와 재조합하여 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 유전자 변형된 비인간 ES 세포를 생성하는 것인 단계;
    (b) 유전자 변형된 비인간 동물 1세포기 배아를 대리 모체에 임신시켜서 그것의 게놈에 표적 게놈 유전자좌에 있는 제1 발현 카세트를 포함하는 유전자 변형된 F0 세대 비인간 동물을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, Cas 단백질은 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌 내의 제2 표적 서열을 표적으로 하는 제2 가이드 RNA를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 비인간 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 비인간 동물의 생체내에서 표적 유전자의 발현을 증가시키는 방법으로서, 비인간 동물에 각각이 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하고 있는 하나 이상의 가이드 RNA를 도입하는 단계를 포함하고,
    하나 이상의 가이드 RNA는 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질과 복합체를 형성하여 그것을 표적 유전자 내의 표적 서열로 안내함으로써, 표적 유전자의 발현을 증가시키는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, AAV는 AAV8인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제68항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 지질-나노입자-매개 전달 또는 유체역학적 전달을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자는 간에서 발현되는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 비인간 동물로의 투여 경로는 정맥내 주사, 실질내 주사, 복강내 주사, 비강 흡입, 또는 유리체내 주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 표적 유전자 내에 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 표적 유전자의 전사 시작 부위의 200 염기쌍 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 표적 서열은 표적 서열은 전사 시작 부위의 상류로 200 염기쌍 및 전사 시작 부위의 하류로 1 염기쌍의 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 DNA의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 상이한 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제68항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 어댑터-결합 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 제1 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제1 루프 내에 있고, 제2 어댑터-결합 요소는 하나 이상의 가이드 RNA의 각각의 제2 루프 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 교차활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 부분에 융합된 CRISPR RNA (crRNA) 부분을 포함하는 단일 가이드 RNA이고,
    제1 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 13-16에 상응하는 테트라루프이며 제2 루프는 SEQ ID NO: 12의 잔기 53-56에 상응하는 스템 루프 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제68항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터-결합 요소는 SEQ ID NO: 16에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 SEQ ID NO: 40 또는 63에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제68항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 질환-관련 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 질환-관련 유전자는 Ttr 유전자이고, 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34-36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Ttr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 37-39 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제68항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Pcsk9 유전자를 표적으로 하고, 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89-91 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Pcsk9-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 92-94 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 방법은 비인간 동물에서 고콜레스테롤혈증을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제68항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA 중 적어도 하나는 Ldlr 유전자를 표적으로 하고, 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75-77 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 선택적으로 Ldlr-표적화 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 78-80 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제68항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 둘 이상의 표적 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제68항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 적어도 3개의 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ttr 유전자좌를 표적으로 하고, 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 37에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 35를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 36을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 39에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제93항에 있어서, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Pcsk9 유전자좌를 표적으로 하고, 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 89를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 92에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 90을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 91을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제93항에 있어서, 적어도 3개의 가이드 RNA는 마우스 Ldlr 유전자좌를 표적으로 하고, 제1 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 75를 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 78에 제시된 서열을 포함하며, 제2 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 76을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 79에 제시된 서열을 포함하고, 제3 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 서열을 표적으로 하거나 또는 SEQ ID NO: 80에 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제68항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자의 발현의 증가는 대조군 비인간 동물에 비하여 적어도 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 20배 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제68항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트는 키메라 Cas 단백질을 암호화하는 분절의 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자를 추가로 포함하고,
    폴리아데닐화 신호 또는 전사 종결자는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식된 재조합효소 인식 부위가 양옆에 있으며,
    방법은 비인간 동물에 재조합효소를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 재조합효소는 Cre 재조합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 재조합효소는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, AAV는 AAV8인 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제98항 또는 제99항에 있어서, 재조합효소는 지질-나노입자-매개 전달 또는 유체역학적 전달을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소는 조직-특이적 방식으로 도입되거나 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소는 단백질의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소는 DNA 또는 RNA의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 재조합효소는 표 2에 제시된 프로모터 중 하나에 작동 가능하게 연결된 DNA의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제98항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소의 비인간 동물로의 투여 경로는 정맥내 주사, 실질내 주사, 복강내 주사, 비강 흡입, 또는 유리체내 주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제68항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 전달을 통해 도입되고, 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 상이한 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 하나 이상의 가이드 RNA는 단일 표적 유전자를 표적으로 하는 다중 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 생체내에서 비인간 동물의 고콜레스테롤혈증을 모델화하는 방법으로서,
    제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 비인간 동물에 Pcsk9를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA를 도입하는 단계, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA의 각각은 키메라 어댑터 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 어댑터-결합 요소를 포함하는 것인 단계를 포함하고,
    하나 이상의 가이드 RNA는 키메라 Cas 단백질 및 키메라 어댑터 단백질과 복합체를 형성하여 그것을 Pcsk9 내의 표적 서열로 안내함으로써, Pcsk9의 발현을 증가시키고 고콜레스테롤혈증을 유발시키는 방법.
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