KR20200132162A - 치쿤구니야 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 이의 용도 - Google Patents

치쿤구니야 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치쿤구니야 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 치쿤구니야 바이러스 외피단백질 2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 치쿤구니야 바이러스 특이적 단일클론 항체는 치쿤구니야 바이러스 외피단백질 2를 매우 높은 결합 친화도로 인지하며, 다른 모기 매개 바이러스들은 인지하지 않는 매우 높은 특이도를 나타내어 치쿤구니야 바이러스 검출, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

치쿤구니야 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 이의 용도{Monoclonal antibody specific to Chikungunya virus and uses thereof}
본 발명은 치쿤구니야 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 치쿤구니야 바이러스 외피단백질 2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
Chikungunya 발열은 Togaviridae 계통의 Alphavirus 속의 단일 가닥 양성 감수성 RNA 바이러스인 Chikungunya virus (CHIKV)에 감염된 모기 매개 질병이다. CHEKV는 Aedes mosquitoe를 매개로 사람들에게 전염되며 발열, 발진 및 다발성 경화증을 비롯한 여러 증상을 일으킬 수 있다. CHIKV 감염은 지난 10 년 동안 아프리카, 아시아 및 유럽에서 많은 발병을 일으켰으며 2004 년 인도를 포함한 인도양 지역에서 심각한 결과를 야기했다. 이후 CHIKV가 다시 출현할 위험이 전 세계적으로 퍼져 나갔고 전세계의 건강 관련 문제가 되었다. 그 중요성에도 불구하고, Flaviviridae의 Flavivirus 속으로 분류된 DENV(Dengue virus), ZIKV(Zika virus) 및 JEV(Japanese Encephalitis virus)를 포함한 다양한 아르보바이러스(arbovirus)에 의해 유발된 모기 매개 질병에서 CHIKV 감염의 임상 양상이 유사하기 때문에, 임상 증상만으로 감염된 바이러스를 정확하게 식별하는 것은 어렵다.
CHIKV 감염의 진단은 일반적으로 바이러스 RNA와 단백질을 기반으로 하는 두 가지 탐지 방법으로 나뉜다. 역전사 중합효소연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)에 의한 바이러스 RNA의 검출은 민감하지만, CHIKV 감염의 초기 단계에서만 짧게 존재하는 바이러스를 검출할 수 있기 때문에 그 사용이 제한된다. 반면에 단백질 기반 진단은 CHIKV 감염의 급성기 이후에도 사용될 수 있으며 보다 정확하고 보완적이며 신뢰성 있는 방법이다. 단백질 기반의 방법은 ELISA, 면역 형광 분석법 (IFA) 및 면역 크로마토그래피 분석법 (ICA)에 적용되었으며 진단의 핵심 요소는 바이러스 항원과 항체의 강력하고 정확한 반응이다. CHIKV 감염을 검출하기 위해 몇 가지 단백질 기반 진단법이 이용 가능하지만, 낮은 민감도는 최근의 CHIKV 진단의 한계로 남아있다. 따라서 궁극적으로 CHIKV 진단 정확도와 민감도를 향상시키기 위해 더 고민감도를 가지는 특이 항체를 개발할 필요가 있다.
CHIKV는 바이러스 표면을 스파이크 형태로 덮고 숙주 세포 내로의 바이러스 유입을 중재하는 2 개의 외피 당 단백질(envelope protein), E1 및 E2를 갖는다. E2는 세포 부착을 담당하고, E1은 바이러스 감염 중에 막 융합을 조절한다. E2 단백질의 세포 외 부분은 수용체 결합을 위한 도메인을 포함하고 면역원성을 가진다. 따라서 CHIKV 감염에 의해 유발된 가장 풍부한 항체는 CHIKV-E2 단백질을 표적으로 하는 것으로 보고되었다. 즉, CHIKV-E2 단백질은 CHIKV 진단을 향상시키기 위한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 항-CHIKV-E2 단일클론 항체 (mAb)를 개발하는 훌륭한 표적이 될 수 있다.
이에, 본 발명자는 모기 매개 질병을 유발하는 DENV, ZIKV 및 JEV를 포함한 다양한 아르보바이러스(arbovirus)들과 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)를 매우 정확하게 구분하여 검출할 수 있는 치쿤구니야 바이러스 특이적인 단일클론 항체를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 하이브리도마 시스템을 통해 CHIKV의 외피단백질 2에 매우 높은 특이도와 민감도로 결합하는 항-CHIKV-E2 단일클론 항체를 제작할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 생산하는 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 조성물/키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 항체를 생산하는 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 항체를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 조성물/키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
치쿤구니야 바이러스 (CHIKV)는 토가비리다에(Togaviridae) 패밀리의 알파바이러스 속의 외피보유 양성-센스 RNA 바이러스이고, 아에데스(Aedes) 모기에 의해 전염된다. 성숙한 CHIKV 비리온은 단백질 분해 절단에 의해 전구체 폴리단백질 p62-E1로부터 생성된 2개의 당단백질 E1 및 E2를 함유한다. E2는 바이러스 부착에서 기능을 하는 반면, E1은 바이러스 도입을 허용하기 위한 막 융합을 매개한다. 인간에서 CHIKV 감염은 심각하고 일부 사례에는 수년 동안 지속될 수 있는 발열 및 관절통을 유발한다. CHIKV는 사하라 이남 아프리카의 대부분의 지역과 아시아, 유럽 및 인도양과 태평양의 일부 지역에서 발병을 유발하였다. 2013년 12월에, 서반구에서 CHIKV의 첫 번째 전염이 발생하였고, 세인트 마틴에서 토착 사례가 확인되었다. 이러한 바이러스는 중미, 남미 및 북미뿐만 아니라 카리브해의 거의 모든 섬으로 급속히 확산되었다. 1년이 되지 않아, 서반구에서 백만 명이 넘는 CHIKV 의심 사례가 보고되었고, 미국을 포함한 40개국 초과의 나라에서 풍토성 전염이 기록되었다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 생성된 항-CHIKV 단일클론 항체(mAb)는 특히 CHIKV E2 단백질에 효과적으로 결합한다는 것을 보여주었다. 특히, 본 발명의 mAb는 다른 하이브리도마 세포에 의해 생성된 mAb 및 상업적으로 이용 가능한 mAb보다 더 높은 결합 친화성을 보였다.
몇몇 연구에서 CHIKV E2의 domain A는 말초에 위치하고 주로 바이러스 표면에 노출되어 있는 반면 domain B와 C는 E2의 중심에 위치하고 바이러스 막에 가까이 있다는 사실이 밝혀진 바 있다. CHIKV 바이리온의 표면 구조는 80개의 삼 합체 스파이크로 덮여있다. 단일 스파이크는 세 개의 E1/E2 헤테로다이머로 구성된다. 따라서, 본 발명에 따른 mAb가 바이러스 표면에 노출된 에피토프에 결합할 수 있는 반면, 다른 하이브리도마 세포에 의해 생산된 mAb 및 상업적으로 이용가능한 mAb는 E1 및 E2의 이량체화에 의해 바이러스 표면 또는 숨겨진 영역 내부의 에피토프를 인식하기 때문에 본 발명에 따른 mAb보다 CHIKV E2에 대한 결합 친화도가 낮은 것으로 판단되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 mAb는 ZIKV, DENV 및 JEV를 포함한 다른 모기에 의해 전염되는 바이러스를 거의 인식하지 못했다. 대조적으로, 다른 하이브리도마 세포에 의해 생성된 mAb는 PBS 대조군보다 DENV 1-4 형뿐만 아니라 CHIKV에 대한 결합 친화도가 유의하게 더 높았다. 현재 CHIKV 감염의 초기 단계에서 모기에 의해 전염되는 바이러스 사이의 유사한 임상 증상 때문에 임상 진단이 어렵다(Chen and Wilson, 2010; Hoarau et al., 2010). 따라서 CHIKV가 Togaviridea 계통의 Alphavirus에 속하고, DENV, JEV 및 ZIKV는 Flavivirdea 계의 Flavivirus에 속하기 때문에 분자 진단은 감염을 정확하게 진단하는데 매우 중요하다. 따라서 본 발명에 따른 mAb는 모기에 의해 전염되는 다른 바이러스로부터 CHIKV를 식별하는데 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
본 발명에서 용어 '결합 친화도'은 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, '결합 친화도'는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계 공지의 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 '단일클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 단세포군 항체 또는 단일클론 항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
본 명세서에서 제공하는 mAb는 치쿤구니야 바이러스에 특이적인 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 mAb는 IgG2 면역글로불린 아이소타입(isotype)인 것으로 확인이 되었으며, 보다 구체적으로는 IgG2b 면역글로불린 아이소타입인 것으로 확인이 되었으며, 보다 더 구체적으로는 IgG2b kappa 체인 아이소타입(isotype)인 것으로 확인이 되었다.
항원을 검출하기 위해 단일클론 항체를 사용하는 경우의 이점은 단일 에피토프를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블럿팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
본 발명에서 용어 '하이브리도마'는 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포와의 융합에 의해 형성된 세포를 의미한다. 일반적으로 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역세포와 골수종 세포를 융합함으로써 만들어지며, 단클론 항체를 지속적으로 공급할 수 있다.
본 발명에서 용어 '특이적인 결합'에서 '특이적인'은 비특이적인 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 미표지 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 미표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다. 한 실시양태에서, 이같은 용어는 본 발명에 따른 mAb가 다른 유사한 바이러스에는 결합하지 않고 CHIKV 바이러스 항원, 보다 구체적으로는 CHIKV E2에만 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 mAb를 생산하는 하이브리도마 세포주는 2019년 2월 3일자로 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC13814BP로 기탁되었다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 mAb를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 검출용 조성물에는 본 발명의 mAb 외에 면역학적 분석에 사용되는 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지체 및 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어 PBS) 또는 불용성 담체 및 이들의 조합일 수 있으며, 상기 검출 표지체 및 검출 표지의 활성 측정용 시약은 반응에 의해 발색, 형광, 발광 특성 중 어느 하나를 나타내어 이를 측정하기 위함으로 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 검출표지와 각 검출표지에 따른 활성 측정용 시약을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 mAb를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 치쿤구니야 바이러스 E2 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 ELISA 검출방법에 따라, 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장 등의 생물학적 시료는 고체 지지체, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단일클론 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단일클론 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체, 즉, 본 발명에 따른 mAb를 사용하여 확인할 수 있다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 mAb를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 치쿤구니야 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 mAb가 부착된 단백질 칩 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 키트에는 단일클론 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.
상기 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로즈 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 검출방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flowthrough) 디바이스 등을 포함한다.
본 발명이 제공하는 치쿤구니야 바이러스 특이적 단일클론 항체는 치쿤구니야 바이러스 외피단백질 2를 매우 높은 결합 친화도로 인지하며, 다른 모기 매개 바이러스들은 인지하지 않는 매우 높은 특이도를 나타내어 치쿤구니야 바이러스 검출, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 내지 1c를 포함하는 도 1은 항-CHIKV-E2 항체를 생성하는 하이브리도마를 제작한 결과를 나타낸다.
(a) CHIKV-E2 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시블루 염색에 의해 시각화하였다. 면역 블로팅을 위해, 단백질을 겔에서 PVDF 멤브레인으로 옮기고 상업용 단클론 항체 (Chk265 또는 16A12), 이어서 HRP-결합 항-마우스 IgG로 프로빙하였다. 레인 M은 단백질 마커 (kDa)를 나타낸다.
(b) 및 (c) BALB/c 마우스를 2 주 간격으로 footpad 주사에 의해 CHIKV-E2 단백질로 3회 면역화시켰다. 각 면역화로부터 2 주 후에 혈청을 수득하여 항체의 생성량을 평가하였고(b), 면역화된 마우스로부터 수득한 림프구를 이용하여 제작된 하이브리도마의 배양 상등액에 생성된 항체양을 평가하였다(c). CHIKV-E2 단백질에 대한 결합 친화력은 ELISA로 측정하였다.
도 2a 내지 2c를 포함하는 도 2는 CHIKV-E2 단백질에 대한 항-CHIKV-E2 mAb들의 결합 친화도를 비교한 결과이다.
(a) CHIKV-E2 단백질을 용량 의존적으로 ELISA 플레이트상에 코팅 하였다. 플레이트를 PBS 중의 5% 탈지유로 블로킹시키고, 항-CHIKV-E2 mAb, 이어서 HRP- 결합 항-마우스 IgG로 처리하고 흡광도를 측정하였다. 상업적으로 이용가능한 항-CHIKV-E2 mAb인 Chk265 및 16A12를 비교를 위해 사용하였다.
(b) ELISA 플레이트를 CHIKV-E2 단백질로 코팅하고, 블로킹하고, 연속 희석된 항-CHIKV-E2 mAb 및 HRP-결합 항 마우스 IgG로 처리하고 흡광도를 측정하였다. 상업적으로 이용가능한 항-CHIKV-E2 mAb인 Chk265 및 16A12를 비교를 위해 사용하였다.
(c) CHIKV-E2 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 각 항-CHIKV-E2 mAb, 이어서 HRP-결합 항 마우스 IgG로 프로빙하여, 각 mAb가 CHIKV-E2를 검출하는지를 확인하였다. 레인 M은 단백질 마커 (kDa)를 나타낸다. 상업적으로 이용가능한 항-CHIKV-E2 mAb인 Chk265 및 16A12를 비교를 위해 사용하였다.
도 3a 내지 3c를 포함하는 도3은 불활성화된 CHIKV에 대한 항-CHIKV-E2 mAb들의 결합 친화도를 평가한 결과이다.
(a) 연속 희석된 CHIKV를 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중의 5% 탈지유로 블로킹하고, 항-CHIKV-E2 mAb,이어서 HRP-결합 항-마우스 IgG로 처리하고 흡광도를 측정하였다. 상업적으로 이용가능한 항-CHIKV-E2 mAb인 Chk265 및 16A12를 비교를 위해 사용하였다.
(b) ELISA 플레이트를 불활성화 된 CHIKV로 코팅하고, 블로킹하고, 연속 희석된 항-CHIKV-E2 mAb, 이어서 HRP-결합 항-마우스 IgG로 처리하고 흡광도를 측정하였다. 상업적으로 이용가능한 항-CHIKV-E2 mAb인 Chk265 및 16A12를 비교를 위해 사용하였다.
(c) 불활성화된 CHIKV를 12% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 멤브레인을 항-CHIKV-E2 mAb,이어서 HRP-결합 항-마우스 IgG로 프로빙 하였다. 시판중인 항 -CHIKV-E2 mAb 인 Chk265 및 16A12를 비교를 위해 사용하였다. 레인 M은 단백질 마커 (kDa)를 나타낸다.
도 4a 내지 4c를 포함하는 도 4는 항-CHIKV E2 mAb의 특이도를 평가한 결과이다.
불활성화된 아르보바이러스 (CHIKV, ZIKV, JEV 및 DENV 1-4)를 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. PBS 중의 5% 탈지유로 블로킹 한 후, 플레이트를 (a) 19-1 mAb, (b) 21-1 mAb 또는 (c) Chk265 mAb 및 HRP-결합 항-마우스 IgG로 처리하고 흡광도를 측정하였다. 통계적으로 유의미한 차이는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)으로 분석하였다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
1. 마우스 면역화 및 하이브리도마의 제작
6 주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트 바이오 (경기도, 대한민국)에서 구입하여 무균시설에 사육했다. CHIKV-E2는 Sino biological (Sino Biological, Beijing, China)에서 구입하였다. 마우스를 2주 간격으로 foodpad 주사로 TiterMax Gold 보조제 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 혼합한 CHIKV-E2 10μg으로 3회 면역화 하였다. 각 면역화로부터 2주 후에, 면역화된 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 최종 면역화 2주 후에, 세포를 슬와 림프절로부터 분리하고 항-CHIKV-E2 항체를 생성하는 B 세포 하이브리도마를 제조하는데 사용하였다. 골수종 FO 세포와의 융합은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(Heo et al., 2010). 이들 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체의 결합 친화력을 ELISA으로 측정하였다. 단일클론항체는 단백질 G 컬럼(GE Healthcare, Uppsals, Sweden)을 사용하여 정제하였다. 면역글로블린 아이소타이핑 키트 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 각 mAb의 아이소타입을 결정하였다.
2. 바이러스
ZIKV (MR766 주)를 Vero E6 세포에서 증식시키고 유지시켰다. JEV (SA14-14-2 주)는 BHK-21 세포에서 증식 및 유지되었다. Vero E6 (ATCC CRL1586) 및 BHK-21 (ATCC CCL10) 세포를 10% 소태아혈청 (FBS; HyClone Laboratories, Inc.)이 첨가된 Eagle's minimum essential medium (HyClone Laboratories, Inc., UT, USA)에서 유지하였다. 모든 세포주를 37 ℃에서 5% CO2조건에서 배양하였다. 세포를 T75 플라스크에서 60% 컨플루언스까지 시딩하고 16시간 동안 배양하였다. 세포를 신선한 배양 배지로 1:25로 희석된 5 ml의 현탁된 바이러스 스톡으로 감염시켰다. 바이러스 증식을 위해 감염성 현탁액을 대체하고 바이러스를 얻기 위해 배양 상등액을 3-5 일에 수확했다. 배양 상등액을 여과하고 4 시간 동안 PBS에서 12 시간 동안 침전시켰다. 바이러스의 침전물을 원심분리 (14,000 xg, 1 시간, 4 ℃)하여 펠렛화하고, 300ul 멸균 PBS에 재현탁하고 -80 ℃에서 보관하였다. 감염인자 역가는 플라크 분석법에 의해 PFU의 수에 따라 추정되었다. 65 ℃에서 30 분간 배양하여 바이러스를 비활성화시킨 후 실험에 사용하였다. CHIKV와 DENV type 1-4의 불활성화된 바이러스성 용해물은 ZeptoMetrix corperation (ZeptoMetrix Corp., Franklin, MA, USA)에서 얻었다.
3. ELISA 어세이
MaxiSorp 96-웰 플레이트 (Thermo Scientific, Roskilde, Denmark)를 4℃에서 16 시간 동안 PBS에서 CHIKV-E2 (5 μg / ml) 또는 불활성화 CHIKV 용 해물(90 μg / ml)로 코팅하고, 5% 탈지유 PBS로 37 ℃에서 1 시간 동안 처리하고, PBS (PBST) 내 0.05% Tween-20로 세척하였다. 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 CHIKV-E2 면역화 마우스의 1 : 50,000 희석 혈청, 1 차 클론의 배양 상등액 또는 정제된 mAb를 함께 배양한 후, horse-radish peroxidase (HRP) - 컨쥬 게이트된 항-마우스 IgG (1 : 5000) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA)와 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 후, 발색 테트라메틸벤지딘기질 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 사용하여 반응물을 발색시키고 2N H2SO4로 종결시켰다. Versamax 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, San Francisco, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정하였다. 상업적으로 이용가능한 항-CHIKV-E2 mAb, 16A12 및 Chk265는 네이티브 항원 (옥스포드, 영국) 및 앱솔루트 항체 (옥스포드, 영국)로부터 각각 구입하였다.
교차반응 실험에서 MaxiSorp 96-웰 플레이트는 CHIKV (10 μg / ml), ZIKV (1.7 x 105 PFU / ml), JEV (1.7 x 105 PFU / ml) 또는 DENV type 1-4(10 μg / ml)를 포함하는 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.6)을 포함하는 불활성화된 바이러스 용해물로 4 ℃ 에서 16 시간 동안 처리하였다. 플레이트를 PBS 중 5% 탈지우유와 함께 항온에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, PBS 내 0.025% Tween-20로 세척한 다음, 생성된 항-CHIKV-E2 mAb와 함께 37 ℃에서 1 시간 30 분 동안 배양하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 HRP-접합된 항-마우스 IgG (1 : 5000) (Thermo Fisher, Rockford, IL, USA)로 처리하였다. 플레이트를 세척하고 발색성 테트라메틸벤지딘기질 (Thermo Fisher)으로 발색시켰다. 반응을 2N H2SO4로 종결시키고, Versamax 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 면역블로팅(Immunoblotting)
CHIKV-E2 (1 μg) 또는 비활성화된 CHIKV lysate (3 μg)를 37 ℃에서 5 분 동안 환원 시료 완충액과 함께 항온 처리하고 95°C에서 5 분간 가열하였다. 샘플을 12 % SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 분리하고 polyvinylidene fluoride 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 0.05 % Tween-20을 함유한 TBS 내 5 % 탈지 우유로 차단시킨 후, 막을 4 ℃에서 12 시간 동안 항 -CHIKV E2 mAb (2 μg / ml) 또는 시판되는 mAb와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, 막을 세척하고, HRP- 접합된 항-마우스 IgG (1 : 5000) (Cell Signaling Technologies)와 함께 추가 배양하였다. 면역반응성 밴드는 Amersham ECL Western Blotting Detection Reagents (GE healthcare, Buckinghamshire, 영국)로 반응시키고 Azure C300 Western blot 이미저 (Azure Biosystems, D2ublin, CA, USA)를 사용하여 시각화 했다.
실험결과
1. 항-CHIKV-E2 단일클론항체(mAb)의 제조
항-CHIKV-E2 mAb 분비 하이브리도마를 생성하기 위해, 본 발명자는 항원으로서 재조합 CHIKV-E2 단백질을 사용했다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 재조합 CHIKV-E2 단백질의 크기는 거의 40 kDa이다. 면역블로팅을 통해 재조합 CHIKV-E2 단백질이 상업적 항-CHIKV-E2 mAb에 의해 검출되었음이 확인되었다. 따라서 본 발명자는 2 주 간격으로 애주번트(adjuvant) 혼합된 재조합 CHIKV-E2 단백질로 발바닥을 3 회 면역화 시켰다. 각 면역화로부터 2 주 후에, 면역화 된 마우스로부터 혈청을 수득하고, 항-CHIKV-E2 Ab의 생성을 측정하기 위해 ELISA로 평가하였다. 항-CHIKV-E2 Abs의 수준은 첫 번째 면역화 이후의 혈청에서 4 배 증가한 것으로 나타났으며 (그림 1b) 재조합 CHIKV-E2 단백질의 면역화가 반복적으로 항-CHIKV-E2 Abs 생성을 유도한다는 것을 보여주었다. 마지막 면역으로부터 2 주 후에 마우스의 슬와 림프절로부터 림프구를 수득하고 FO 골수종 세포와 융합시켜 항-CHIKV-E2 mAb를 분비하는 하이브리도마를 생성시켰다. ELISA는 하이브리도마의 배양 상등액을 사용하여 Ab-분비 하이브리도마의 생성을 결정하였다. 55 개의 1 차 클론 중 10 개의 클론은 음성 대조군으로서 BSA보다 CHIKV-E2 단백질에 대한 광학밀도 (OD) 값이 더 높았다(도 1c). 특히, 19, 21, 22 및 26이라고 불리는 4 개의 1 차 클론은 2.5 이상의 OD 값을 나타내며, 이러한 하이브리도마가 항-CHIKV-E2 Ab를 효과적으로 생산할 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명자는 서브클로닝을 수행하고 추가 실험을 위해 19-1, 21-1, 22-2 및 26-4로 지정된 4 개의 단일클론을 선택하였다.
2. 결합 친화도의 비교 및 항-CHIKV-E2 mAb의 특성 평가
항-CHIKV-E2 mAb의 결합 친화력을 비교하기 위해, 우리는 다양한 양의 mAb 또는 CHIKV-E2를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 시판중인 항-CHIKV-E2 mAb, 16A12 및 Chk265를 비교를 위해 사용하였다. 생성된 mAb를 연속적으로 희석된 CHIKV-E2 단백질로 코팅된 플레이트에 적용할 때, 모든 mAb는 시판되는 mAb와 비교하여 더 높은 OD 값을 나타냈다(도 2a). 특히, 19-1 mAb는 CHIKV-E2 단백질로 코팅된 플레이트에서 1.2 ng/ml에서 312.5 ng/ml로 가장 높은 OD 값을 보였다. 다음으로 CHIKV-E2 단백질 코팅 플레이트에서 다양한 양의 mAb를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 21-1 mAb는 시판되는 mAb보다 높은 OD 값을 나타내었고, 19-1 mAb는 Chk265와 거의 동일한 OD 값을 나타냈다. 다른 mAb (22-2 및 26-4)는 시판되는 mAb보다 낮은 OD 값을 나타냈다. 단일클론 항체의 아이소타입(Isotype)을 항체 아이소타이핑 키트를 사용하여 결정하였다(표 1). 19-1 및 22-2 mAb는 IgG2b 카파-체인 아이소타입이었고, 21-1 및 26-4 mAb는 IgG1 카파-체인 아이소타입이었다.
Figure pat00001
또한, 본 발명자는 mAb가 CHIKV-E2 단백질의 선형 또는 입체의(conformational) 에피토프를 인지하는지를 조사했다. 도 2c에 도시 된 바와 같이, 면역 블로팅은 모든 항-CHIKV-E2 mAb가 CHIKV-E2 단백질을 검출함으로서, mAb가 CHIKV-E2 단백질의 선형 에피토프를 인식할 수 있음을 암시한다(도 2c). 이러한 결과는 19-1 및 21-1 mAb가 시판되는 단일클론 항체보다 CHIKV-E2 단백질에 더 높은 결합 친화력을 가지며 CHIKV-E2 단백질의 선형 에피토프를 인지한다는 것을 나타낸다.
3. 항-CHIKV-E2 mAb의 바이러스에 대한 민감도 및 특이도
생성된 단일클론항체가 CHIKV 또는 기타 모기 전달 바이러스를 인지하는지 여부를 조사하기 위해 CHIKV-E2 단백질에 강하게 결합할 수 있는 19-1 및 21-1 mAb를 사용하여 ELISA를 수행했다. 먼저, 비활성화 된 CHIKV를 연속 희석하여 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 일정한 양의 항-CHIKV-E2 mAb를 플레이트에 적용하였을 때, ELISA는 19-1 mAb가 21-1 mAb 및 시판되는 mAb의 OD 값과 비교하여 가장 높은 OD 값을 가짐을 보였다 (도 3a). 21-1 mAb는 상업적 Chk265 mAb와 거의 동일한 OD 값을 가졌다. 대조적으로, 상업용 16A12 mAb는 가장 낮은 OD 값을 나타냈다. 다음으로, 우리는 비활성화 된 CHIKV 코팅 플레이트에서 다양한 양의 mAb를 사용하여 ELISA를 검사했다. 일관되게, 19-1 mAb는 다른 mAb의 것보다 가장 높은 OD 값을 가졌지만, 21-1 mAb는 상업적 Chk265 mAb와 유사한 OD 값을 보였다 (도 3b). 그 다음, 우리는 정량적으로 mAh의 결합 친화도를 최대 유효 농도의 절반 (EC50)을 계산하여 분석했다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 19-1 mAb (13.86 ng / ml)의 EC50은 다른 mAb (21-1 mAb의 경우 20.45 ng / ml, Chk265 mAb의 경우 22.75 ng / ml 및 16A12의 경우 24.58 ng / ml)와 비교하여 가장 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 19-1 및 21-1 mAb가 CHIKV-E2의 예측 분자량과 거의 일치하는 50 kDa에서 불활성화 된 CHIKV를 검출한다는 것을 면역 블로팅을 통해 확인하였다. 상업용 단일클론 항체에서는 Chk265가 바이러스성 CHIKV-E2 단백질을 인식하였지만 16A12는 단백질을 약하게 검출하였다 (도 3c). 이 결과는 19-1 mAb가 CHIKV에 효과적으로 결합함을 나타낸다.
CHIKV는 모기에 의한 질병을 유발하는 아르보바이러스(arboviruses) 중의 하나로 알려져 있기 때문에 우리는 생성된 단일클론 항체가 ZIKV, JEV 및 DENV type 1-4와 같은 다른 모기-매개 아르보바이러스와 CHIKV를 구별할 수 있는지를 최종적으로 조사했다. ELISA 플레이트를 불활성화 된 아르보바이러스로 코팅하고, 결합 친화도를 항-CHIKV-E2 단일클론 항체를 사용하여 비교한 후, HRP-접합된 항- 마우스 IgG를 37 ℃에서 한 시간 배양하였다. 비교를 위해 Chk265를 사용하였고, PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. ELISA 결과에서, 19-1 mAb가 CHIKV에서만 유의하게 높은 OD 값을 나타냄을 보였다 (도 4a). 대조적으로, 21-1 mAb는 PBS 대조군보다 DENV 1-4 형 및 CHIKV에서 OD 값의 유의한 증가를 보였다 (도 4b). 상업적 Chk265 mAb는 CHIKV 및 DENV 유형 2-4에서 유의하게 높은 OD 값을 나타냈다 (도 4c). 이러한 결과는 19-1 mAb가 CHIKV에만 유의하게 결합하지만 다른 아르보바이러스에는 결합하지 않음을 나타낸다.
본 발명이 제공하는 치쿤구니야 바이러스 특이적 단일클론 항체는 치쿤구니야 바이러스 외피단백질 2를 매우 높은 결합 친화도로 인지하며, 다른 모기 매개 바이러스들은 인지하지 않는 매우 높은 특이도를 나타내어 치쿤구니야 바이러스 검출, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단 등에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
한국생명공학연구원 KCTC13814BP 20190213

Claims (7)

  1. 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 치쿤구니야 바이러스 외피단백질 2(envelope protein 2)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG2 면역글로불린 아이소타입(isotype)인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  4. 제1항의 항체를 생산하는 기탁번호 KCTC13814BP인 하이브리도마 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 검출용 키트.
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