KR20200087273A - 란티오닌 합성효소 c-유사 2-계 치료제 - Google Patents

란티오닌 합성효소 c-유사 2-계 치료제 Download PDF

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줄리안 디. 쿠퍼
라퀠 혼테실라스
라?? 혼테실라스
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Abstract

란티오닌 합성효소 C-유사 단백질 2경로를 표적화하는 화합물이 제공된다. 상기 화합물은 전염병, 자가면역 질환, 당뇨병 및 만성 염증성 질환을 포함하는, 다수의 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

란티오닌 합성효소 C-유사 2-계 치료제{LANTHIONINE SYNTHETASE C-LIKE 2-BASED THERAPEUTICS}
관련 출원의 참조
본원은 35USC§119(e)의 규정 하에 2014년 10월 24일 출원된 미국 가출원 62/068,322 및 2015년 1월 8일 출원된 미국 가출원 62/101,164에 대하여 우선권을 주장하며, 이들은 각각 이후에 참고로 전문통합된다.
연방정부 후원에 의한 연구에 대한 진술
본 발명은 부분적으로 BioTherapeutics Inc.에 부여된 SBIR 승인 1R43DK097940-01A1 및 STTR 승인 1R41DK099027-01A1 하에 미국 정부의 건강지원정책에 따라 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
본 발명은 질환 및 장애들의 의학적 치료분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 다른 것들 중에서 염증성 및 면역 매개 질환들, 예컨대 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증 및 제1형 당뇨병 뿐만 아니라 만성 염증성 질환 및 장애, 예컨대 인슐린 내성, 내당능 장애, 당뇨병 전증, 제2형 당뇨병 및 비만-관련 염증을 치료 및 예방하는 생물학적 활성 화합물의 종류에 관한 것이다.
란티오닌 C-유사 단백질 2(LANCL2)(또한, "란티오닌 합성효소 C-유사 단백질 2" 또는 "란티오닌 합성효소 성분 C-유사 단백질 2"라고도 함)는 면역세포, 위장관, 뉴런, 고환 및 췌장을 발현하는 신호전달 경로 단백질이다[1]. LANCL2 경로를 활성화하면, 인슐린 민감성이 증가하고, 여러 자가면역, 염증 및 대사 질환과 관련된 염증이 감소된다. 마우스의 생체내 및 시험관내 시험 결과, 이 경로를 표적으로 삼는 화합물을 사용하면, 중요한 부작용없이, 유효한 치료, 즉 대조군에 비해 내당능 시험에서 글루코스 수준이 2배 감소하고, 처방약 AVANDIA®(GlaxoSmithKline plc, Brentford, 영국)와 균등한 수준을 제공한다는 사실을 보여줬다. LANCL2 경로를 표적으로 삼는 것은 또한 창자 염증을 90%까지 감소시키고, 상응하는 병변 수를 4배 감소시킨다. 이 시험의 결과와 경로의 다른 유효성확인은 12개의 상호-심사 학술지논문에 게시되어 있다[2-13].
자가면역-관련 염증의 범주내에는 현재 자가면역 질환의 세계적 유행병, 예컨대 염증성 장 질환(IBD), 전신 루푸스, 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 건선, 다발성 경화증이 있다. 또한, 대사 증후군, 비만, 당뇨병 전증, 심혈관 질환 및 제2형 당뇨병을 포함한 만성 대사성 염증성 질환의 유행병이 있다. 현재 치료법은 적당히 효과적이지만, 비싸고 심각한 부작용들이 있다. 항-TNF 항체와 같은 자가면역 질환에 가장 효과적인 치료법을 위한 투여 경로는 IV 또는 피하 주사를 통해 이루어지므로, 클리닉/수술을 위한 방문 및 빈번한 모니터링이 필요하다. 항-TNF 항체만큼 효과적이지만 부작용과 고비용없이 경구투여된 치료제를 위해 LANCL2의 독특한 작용 방식이 제공된다. 전체적으로 염증 및 자가면역 질환의 유행병을 감안할 때, LANCL2 경로는 수백만 명의 환자에게 큰 영향을 줄 가능성이 있다.
아브시스산("ABA")은 LANCL2에 결합하는, 원래의 스크리닝 과정에서 발견되는 천연 화합물 중 하나이다.
합성 유기 화학 분야에는 엄청난 수의 화합물들이 있다. 하기 참조문헌에 의해 다양한 화합물들이 제공된다: Diana 등의 WO 1997/036866, Sun 등의 WO 2006/053109, Kim 등의 WO 2006/080821, Nunes 등의 WO 2007/019417, Singh 등의 WO 2009/067600 및 WO 2009/067621, Adams 등의 WO 2008/079277, Urasoe 등의 JP 2008/056615, Stoessel 등의 WO 2011/066898, Bassaganya-Riera 등의 US 2013/0142825 및 Bassaganya-Riera 등의 미국특허 제7,741,367호. 이 참조 문헌에 설명된 화합물들 중 일부는 LANCL2 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, 일부는 그렇지 않다.
LANCL2 경로의 신규한 리간드를 개발하여, 각 질환들에 특화된 치료가 가능하고, 그 효능을 잠재적으로 극대화할 필요가 있다.
따라서, 본 발명은 LANCL2 단백질에 결합하는 능력을 극대화하여, 자가면역, 만성 염증성 질환, 대사성 질환 및 감염성 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 질환 상태에서 유익한 반응을 발휘하기 위해, 새로운 의료화학적 접근법에 의해 개발되고, 인실리코(in silico), 시험관내 및 생체내 기술들을 사용하여 선별된, 일련의 화합물 군을 설명한다.
발명의 요약
본 발명은 구조식 Z-Y-Q-Y'-Z'를 포함하는 화합물들, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 제공하며,
상기 Z는
Figure pat00001
이며;
상기 Y는
Figure pat00002
이며;
상기 Q는 피페라진-1,4-디일; 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵탄-2,5-디일; 2,5-디아자비시클로[2.2.2]옥탄-2,5-디일; 1,4-디아제판-1,4-디일; 벤젠-1,4-디아민-N1,N4-디일; 에탄-1,2-디아민-N1,N2-디일; N1,N2-디알킬에탄-1,2-디아민-N1,N2-디일; 프로판-1,3-디아민-N1,N3-디일; N1,N3-디알킬프로판-1,3-디아민-N1,N3-디일; 1,4-디아미노안트라센-9,10-디온-1,4-디일; C6 아렌-1,4-디아민-N1,N4-디일(상기 아렌은 2,3,5 또는 6번 위치에서 1 내지 4개의 치환체로 치환되고, 상기 치환체는 -C(O)O(C1-C6)알킬, OH, O(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨); 또는 치환된 피페라진-1,4-디일(상기 피페라진은 2,3,5 또는 6번 위치에서 1 내지 8개의 치환체로 치환되고, 치환체는 (C1-C6)알킬, 아릴, 아릴(C1-C6)알킬, C(O)OH 및 C(O)O(C1-C6)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)이고;
상기 Y'는:
Figure pat00003
, 또는 단일 결합이며; 그리고
상기 Z'는:
Figure pat00004
또는 R5이며;
상기 Y'는 Z'가 R5일 경우에만 단일 결합이며;
A1 및 A1'는 각각 독립적으로, N, N(C1-C6)알킬, O, S 또는 CR6이며;
A2 및 A2'는 각각 독립적으로, N 또는 CR7이며;
A3 및 A3'은 각각 독립적으로, NR8, O 또는 S이며;
A4 및 A4'는 각각 독립적으로, N 또는 CR9이며;
A5 및 A5'는 각각 독립적으로, N 또는 CR10이며;
A6 및 A6'은 각각 독립적으로, N 또는 CR11이며;
R1, R1', R2, R2', R3, R3', R4, R4', R5, R6, R7, R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소; 알킬; 할로; 트리플루오로메틸; 디알킬아미노(각 알킬은 독립적으로 선택됨); -NH2; 알킬아미노; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬; 헤테로시클로알킬; -C(O)OH, -C(O)O(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, -CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 2개의 치환체로 치환된, 치환된 헤테로시클로알킬; 및 치환된 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
상기 치환된 헤테로아릴알킬은 -NH2; -NH(C1-C6)알킬; -N((C1-C6)알킬)2(여기에서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택됨); 알킬; 할로; 아릴; -SO2R12, -OR13, -할로, -CN, -CF3, 아미노알킬, -S(O)R14 및 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 아릴; 헤테로시클로알킬; 헤테로아릴; 알킬, -CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 아릴; 알킬 아미노-; 헤테로시클로알킬-알킬-아미노-; 알킬아미노알킬아미노-; -NHC(O)OR15; -NHC(O)NR16R17; -C(O)NR16R17; 및 알킬, 할로, CN, NH2, -NH(C1-C6 알킬), -N(C1-C6 알킬)2(여기서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택됨), -CF3으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 헤테로아릴, 및 -S(O)2R15 및 -CN으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환되며;
R12, R13, R14, R15, R16 및 R17은 각각 C1-C6 알킬, 독립적으로 선택된 C1-C6 알킬을 포함하는 디알킬아미노, -NH2, 알킬아미노, 헤테로시클로알킬, 및 -C(O)O(C1-C6 알킬) 및 C1-C6 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 2개의 치환체로 치환된, 치환된 헤테로시클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 화합물에서, A3 및 A3' 중 적어도 하나는 O 또는 S이다. 일부 화합물에서, A1 및 A1' 중 하나 또는 둘 모두가 N이다. 일부 화합물에서, A2 및 A2' 중 하나 또는 둘 모두가 CH이고, A3은 NH이며, A4는 N이고, A5는 CH이고, 및 A6은 CH이다. 일부 화합물에서, A2 및 A2' 중 하나 또는 둘 모두가 CH이고, A3 및 A3'중 하나 또는 둘 모두가 NH이며, A4 및 A4'중 하나 또는 둘 모두가 N이고, A5 및 A5'중 하나 또는 둘 모두가 CH이고, 및 A6 및 A6' 중 하나 또는 둘 모두가 CH이다. 일부 화합물에서, Q는 피페라진-1,4-디일; 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵탄-2,5-디일; 2,5-디아자비시클로[2.2.2]옥탄-2,5-디일; 1,4-디아제판-1,4-디일; N1,N2-디알킬에탄-1,2-디아민-N1,N2-디일; N1,N3-디알킬프로판-1,3-디아민-N1,N3-디일; 1,4-디아미노안트라센-9,10-디온-1,4-디일; C6 아렌-1,4-디아민-N1,N4-디일(여기에서, 상기 아렌은 2, 3, 5 또는 6번 위치에서 1 내지 4개의 치환체로 치환되고, 각 치환체는 -C(O)O(C1-C6)알킬, OH, O(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 선택됨); 또는 치환된 피페라진-1,4-디일(여기에서, 상기 피페라진은 2, 3, 5 또는 6번 위치에서 1 내지 8개의 치환체로 치환되고, 각 치환체는(C1-C6)알킬, 아릴, 아릴(C1-C6)알킬, C(O)OH 및 C(O)O(C1-C6)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)이다.
일부 화합물에서, 구조식 Z-Y-Q-Y'-Z'는:
Figure pat00005
;
Figure pat00006
;
Figure pat00007
; 또는
그의 염들이다. 일부 화합물들에서, A1 및 A1', A2 및 A2', A3 및 A3', A4 및 A4', A5 및 A5', A6 및 A6', R1 및 R1', R2 및 R2', R3 및 R3', 및 R4 및 R4'로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 쌍의 구성원은 동일하다. 일부 화합물들에서, A1 및 A1', A2 및 A2', A3 및 A3', A4 및 A4', A5 및 A5', A6 및 A6', R1 및 R1', R2 및 R2', R3 및 R3', 및 R4 및 R4'로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 쌍의 구성원은 상이하다. 일부 화합물에서, A1 및 A1', A2 및 A2', A3 및 A3', A4 및 A4', A5 및 A5', A6 및 A6', R1 및 R1', R2 및 R2', R3 및 R3', 및 R4 및 R4'로 구성된 군으로부터 선택된 각 쌍의 구성원은 동일하다. 일부 화합물에서, A1 및 A1', A2 및 A2', A3 및 A3', A4 및 A4', A5 및 A5', A6 및 A6', R1 및 R1', R2 및 R2', R3 및 R3', 및 R4 및 R4'로 구성된 군으로부터 선택된 각 쌍의 구성원은 상이하다.
일부 화합물에서, 구조식 Z-Y-Q-Y'-Z'는:
Figure pat00008
;
Figure pat00009
;
Figure pat00010
; 또는
그의 염들이다.
본 발명의 일부 화합물들은 하기 구조식의 구조를 가진다:
Figure pat00011
Figure pat00012
그의 염들이다.
본 발명은 또한, 구조식 A-B-C를 포함하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 제공하며,
상기 A는:
Figure pat00013
이며;
상기 B는:
Figure pat00014
이며; 그리고
상기 C는:
Figure pat00015
이며,
상기 A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13 및 A14는 각각 CH, CR18 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
A15, A16, A17, A18, A19 및 A20은 각각 CH, CR19, N, NR20, O 및 S로부터 독립적으로 선택되며, 단 A15, A16 및 A17 중 하나만 N, NR20, O 또는 S이고, A18, A19 및 A20 중 하나만이 N, NR20, O 또는 S일 수 있고;
R18 및 R19는 각각 C1-C6 알킬; C1-C6 디알킬아미노(여기서, 각 C1-C6 알킬은 독립적으로 선택됨); -NH2; 알킬아미노; 헤테로시클로알킬; 및 치환된 헤테로시클로알킬로부터 독립적으로 선택되며, 상기 치환된 헤테로시클로알킬은 -C(O)O(C1-C6 알킬) 및 C1-C6 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환체로 치환되고; 하나 이상의 CR18을 갖는 화합물에서, 각 R18은 독립적으로 선택되고, 및 하나 이상의 CR19를 갖는 화합물에서, 각 R19는 독립적으로 선택되고; 그리고
R20은 C1-C6 알킬이다
일부 화합물들에서, B는:
Figure pat00016
이다.
일부 화합물들은 하기 구조식의 화합물들:
Figure pat00017
또는 그의 염들을 갖는다.
본 발명은 또한, 본원에 설명된 임의의 하나 이상의 화합물로 동물의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 설명된 유효량의 하나 이상의 화합물을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 질환은 전염병, 자가면역 질환, 당뇨병 및 만성 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 방법에서, 전염병은 바이러스성 질환, 예컨대 인플루엔자 감염을 포함한다. 일부 방법에서, 자가면역 질환은 자가면성 염증성 질환, 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병을 비롯한 염증성 장 질환을 포함한다. 일부 방법에서, 당뇨병은 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 방법에서, 만성 염증성 질환은 대사 증후군을 포함한다. 일부 방법에서, 상기 방법은 LANCL2의 활성을 증가시키고, 염증을 감소시키고, 및/또는 항-염증 효과를 증가시키는데 효과적인 양의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에 설명된 임의의 하나 이상의 화합물로 동물의 질환을 치료하는데 사용하기 위한 화합물을 제공한다. 상기 용도를 위한 화합물은 본 명세서에 기술된 임의의 화합물을 포함한다. 상기 용도는 본원에 설명된 하나 이상의 화합물의 유효량을 동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 질환은 전염병, 자가면역 질환, 당뇨병 및 만성 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 버전에서, 전염병은 바이러스성 질환, 예컨대 인플루엔자 감염을 포함한다. 일부 버전에서, 자가면역 질환은 자가면성 염증성 질환, 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병을 비롯한 염증성 장 질환을 포함한다. 일부 버전에서, 당뇨병은 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 버전에서, 만성 염증성 질환은 대사 증후군을 포함한다. 일부 버전에서, 화합물은 LANCL2의 활성을 증가시키고, 염증을 감소시키며, 및/또는 항-염증 효과를 증가시키는데 효과적이다.
본 발명의 목적 및 잇점은 이하의 첨부된 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명으로부터 더욱 충분히 나타날 것이다.
도 1a 및 1b. LANCL2에 대한 화합물의 결합에 대한 전산 예측 및 SPR을 이용한 생화학적 실험 검증.
도 2. NSC6160의 상위 5개 클러스터들에 대한 클러스터링(Clustering) 막대그래프. AutoDock Tools를 사용하여 LANCL2에 도킹된 NSC6160에 의해 100회 도킹 운영을 수행했다. RMSD 클러스터 허용오차는 2Å이었다. 결합 에너지는 kJ/mol 단위로 표시된다.
도 3. ABA의 상위 5개 클러스터들에 대한 클러스터링 막대그래프. AutoDock Tools를 사용하여 LANCL2에 도킹된 ABA에 의해 100회 도킹 운영을 수행했다. RMSD 클러스터 허용오차는 2Å이었다. 결합 에너지는 kJ/mol 단위로 표시된다.
도 4. BT-11의 상위 5개 클러스터들에 대한 클러스터링 막대그래프. AutoDock Tools를 사용하여 LANCL2에 도킹된 BT-11에 의해 100회 도킹 운영을 수행했다. RMSD 클러스터 허용오차는 2Å이었다. 결합 에너지는 kJ/mol 단위로 표시된다.
도 5. BT-6의 상위 5개 클러스터들에 대한 클러스터링 막대그래프. AutoDock Tools를 사용하여 LANCL2에 도킹된 BT-6에 의해 100회 도킹 운영을 수행했다. RMSD 클러스터 허용오차는 2Å이었다. 결합 에너지는 kJ/mol 단위로 표시된다.
도 6. BT-15의 상위 5개 클러스터들에 대한 클러스터링 막대그래프. AutoDock Tools를 사용하여 LANCL2에 도킹된 BT-15에 의해 100회 도킹 운영을 수행했다. RMSD 클러스터 허용오차는 2Å이었다. 결합 에너지는 kJ/mol 단위로 표시된다.
도 7. BT-ABA-5a의 상위 5개 클러스터들에 대한 클러스터링 막대그래프. AutoDock Tools를 사용하여 LANCL2에 도킹된 BT-ABA-5a에 의해 100회 도킹 운영을 수행했다. RMSD 클러스터 허용오차는 2Å이었다. 결합 에너지는 kJ/mol 단위로 표시된다.
도 8. 란티오닌 합성효소 C-유사 단백질 2(LANCL2)의 BT-11 및 BT-15와의 결합 동역학. 패널 A 및 C는 고정화 LANCL2에 다양한 농도의 BT-11(A) 및 BT-15(C)의 결합에 대한 표면 플라스몬 공명(SPR) 센서그램을 나타낸다. 패널 B 및 D는 BT-11(B)와 BT-15(D)의 농도 대 최대 공명 단위(RU)의 플롯을 보여준다. 1:1 결합 모델을 이용한 정상상태 해리상수(KD)가 표시된다.
도 9a 및 도 9b. 란티오닌 합성효소 C-유사 단백질 2(LANCL2)의 BT-6(도 9a) 및 BT-ABA-5a(도 9b)와의 결합 동역학. 고정화 LANCL2에 다양한 농도의 BT-6 및 BT-ABA-5a의 결합에 대한 표면 플라스몬 공명(SPR) 센서그램이 도시되어있다.
도 10. 덱스트란 소듐 설페이트(DSS) 대장염을 가진 마우스의 질환 활성 및 전체 병리에 경구 투여가 미치는 효과. 패널 A는 BT-11 또는 부형제만으로 치료된 마우스내 질환활성도를 나타낸다. 패널 B-C는 부형제 또는 BT-11로 치료된 마우스의 (B)비장, (C)장간막 림프절(MLN) 및 (D)결장으로부터의 육안 병리 점수를 나타낸다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표(n=10)로 표시되어 있다.
도 11. DSS 대장염을 가진 마우스의 대장 염증성 병변에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A, D)대조군 (B, E)DSS 및 (C, F)BT-11 처리된 DSS 마우스의 대표 현미경 사진이 도시되어있다. 조직병리학적 병변은 (G)백혈구 침윤, (H)상피미란 및 (I)점막 비후화에 기초하여 평가하였다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표(n=10)로 표시되어 있다.
도 12. DSS 대장염을 가진 마우스의 대장 염증성 병변에 경구 BT-11 투여가 미치는 용량-반응 효과. 조직병리학적 병변은 (A)백혈구 침윤, (B)점막 비후화 및 (C)상피 미란에 기초하여 평가하였다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표(n=10)로 표시되어 있다.
도 13. TNFα, 인터류킨 10(IL-10) 및 LANCL2의 대장 유전자 발현 분석. (A)전 염증성 TNFα, (B)IL-10 및 (C)LANCL2의 수준을 평가하기 위한 대장 유전자 발현이 도시되어 있다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표(n=10)로 표시되어 있다.
도 14. DSS 대장염이 있는 마우스에서 대장 전-염증성 및 항-염증성 면역세포 서브셋(subset)에 BT-11의 경구 투여가 미치는 용량-반응 효과. 대장 점막에서, (A)TNFα+ 세포들, (B)IL-10 + CD4 + T 세포들 및 (C)FOXP3 + CD4 + T 세포들을 측정하기 위해 유동 세포계측법 분석을 사용하였다.
도 15. DSS 대장염이 있는 LANCL2-/-마우스 및 야생형의 육안 병리학적 병변에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. 패널 A는 BT-11 또는 부형제에 의해서만 처리한 야생형 대 LANCL2-/-마우스의 질환 활성도 점수를 나타낸다. 패널 B-D는 부형제 또는 BT-11로 처리된 LANCL2-/-마우스 및 야생형에서 (B)결장, (C)장간막 림프절(MLN) 및 (D)비장으로부터의 육안 병리학적 점수를 나타낸다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표(n=10)로 표시하였다.
도 16. DSS 대장염이 있는 LANCL2-/-마우스 및 야생형의 대장 염증성 병변에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. 조직병리학적 병변은 (A)백혈구 침윤, (B)점막 비후화 및 (C)상피 미란에 기초하여 평가하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 17. 만성 결장염이 있는 LANCL2-/-마우스 및 야생형의 결장 고유판(lamina propria), 비장 및 장간막 림프절(MLN)에 침투하는 면역세포 서브셋에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A)대장 MCP1 + CD45 + 세포들, (B)MLN 중의 MCP1 + CD45 + 세포들, (C)대장 TNFα + CD45 + 세포들, (D)대장 MHC-II + CD11c + 과립구들, (E)대장 IL-10 + CD45 + 세포들, 및 (F)IL-10 + CD45 + 비장세포의 수준을 평가하기 위해 유동 세포계측법을 사용하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 18. 만성 대장염이 있는 IL-10-/-마우스의 질환 활성도(DAI) 점수에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. DAI 점수는 자발적인 대장염을 유발하고, 부형제 단독으로 또는 BT-11 20, 40, 80mg/Kg 체중(n = 10)과 함께 매일 치료한 IL-10 널(null) 마우스에 대한 점수이다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 19. BT-11로 치료한 후 만성 대장염 모델에서, 육안 조직 채점에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. 세 가지 다른 농도(20, 40 및 80mg/Kg)에서 부형제 또는 BT-11로 처리한 마우스의 (A)비장, (B)장간막 림프절(MLN) 및 (C)대장의 육안 점수. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 20. IBD의 만성 IL-10-/-모델에서 대장 조직병리학적 병변에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. 조직병리학적 병변은 (A)백혈구 침윤, (B)상피 미란 및 (C)점막 비후화에 기초하여 평가하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 21. 만성 대장염을 갖는 IL-10 -/-의 대장 고유판에 침투하는 면역세포 서브셋에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. BT-11에 의한 치료 후 대장내 (A)F4/80+ 대식세포, (B)MHC-II + CD11c + 수지상 세포(DC), (C)CD4 + FOXP3 + 조절 T 세포 및 (D)T 헬퍼 1(Th1) 세포의 수준을 분석하기 위해 유동 세포계측법을 사용하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 22. 만성 대장염을 갖는 IL-10 -/-의 비장 및 장간막 림프절에 침윤하는 면역세포 서브셋에 BT-11 경구 투여가 미치는 효과. BT-11에 의한 치료 후 (A)CD4 + RORgt + T 세포, (B)CD4 + FOXP3 + T 세포, (C)CD4 + CD45 + FOXP3 + 조절성 T 세포, 및 (D)T 헬퍼 1(Th1) 세포의 수준을 분석하기 위해 유동 세포계측법을 사용하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 23. LANCL2와 TNFα의 대장 발현에 BT-11에 의한 경구 치료가 미치는 효과. (A)LANCL2 및 (B)TNFα의 수준을 평가하기 위해 대장 유전자 발현을 사용하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 24. 만성 대장염의 입양전달 모델에서, 부형제 대 치료된 마우스의 질환 활성도 점수에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. RAG2-/-마우스를 400,000개의 나이브 CD4 + T 세포를 복강내 주사한 후 부형제 또는 BT-11로 처리하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 25. 만성 대장염의 입양전달 모델에서, 부형제 대 처리된 야생형 대 LANCL2-/-전이된 마우스에서 질환 활성도 점수에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. 야생형 또는 LANCL2-/-공여자로부터 복강내로 400,000개의 나이브 CD4 + T 세포를 전달한 후 RAG2-/-마우스를 부형제 또는 BT-11로 처리하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 26. CD4+-유도된 대장염의 만성 IBD 모델에서 경구 BT-11 투여가 체중 감소에 미치는 효과. 마우스를 칭량하고, 체중 감소율을 계산하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 27. BT-11로 치료한 후 CD4 + T 세포-유도된 대장염의 만성 모델에서 육안적 조직 채점에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. 부형제 또는 80mg/Kg의 BT-11로 처리한 마우스의 (A)비장, (B)MLN, (C)대장 및 (D)회장의 육안 점수를 나타내었다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 28. BT-11에 의한 치료 후 야생형 및 LANCL2-/-마우스의 CD4 + T 세포-유도된 대장염의 만성 모델에서 육안적 조직 채점에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. 부형제 또는 BT-11(80mg/Kg)으로 처리한 LANCL2-/-마우스 및 야생형의 (A)대장, (B)MLN 및 (C)비장의 육안 점수를 나타내었다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 29. 만성 대장염의 입양전달 모델에서, 부형제 대 처리된 마우스의 대장 및 직장 조직병리학에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A, B) 백혈구 침윤, (C, D) 상피 미란 및 (E, F) 점막 비후화에 기초하여 대장(A, C, E) 및 회장(B, D, F)내 조직병리학적 병변을 평가하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 30. 만성 대장염의 입양전달 모델에서 야생형 또는 LANCL2-/-CD4 + T 세포로 전이된 처리된 마우스 대 부형제내 대장 조직병리학에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A)백혈구 침윤, (B)점막 비후화 및 (C)상피 미란에 기초하여 조직병리학적 병변을 평가하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 31. 만성 대장염의 입양전달 모델에서 부형제 대 치료된 마우스의 질환 활성도 점수에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. BT-11로 처리한 후, (A)F4/80 + CD11b + 대식세포, (B)CD45 + IFNg + 세포, (C)CD4 + FOXP3 + 조절 T 세포 및 (D)CD4 + IL-10 + 항-염증 세포의 수준을 분석하기 위해 유동 세포계측법을 사용하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 32. 만성 대장염의 입양전달 모델에서 부형제 대 처리된 마우스의 질환 활성도 점수에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. BT-11 처리 후 비장의 (A)CD4 + FOXP3 + T 세포, (B)CD4 + IL-10 + T 세포, (C)MLN의 CD45 + IFNg + 세포, 및 (D)CD4 + FOXP3 + T 세포, (E)CD4 + IL-10 + T 세포, (F) CD45 + IFNg + 세포의 수준을 분석하기 위해 유동 세포 계측법을 사용하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 33. 만성 대장염의 입양전달 모델에서 부형제 대 처리된 야생형 대 PPARγ-/-전이된 마우스의 질환 활성도 점수에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. 야생형 또는 PPARγ-/-공여자로부터 복강내로 400,000개의 나이브 CD4 + T 세포를 옮긴 후 RAG2-/-마우스를 부형제 또는 BT-11로 처리하였다. (A)질환 활성도 점수 대 전달 후 시간 결과가 표시된다. 결장의 조직병리학적 병변을 (B)백혈구 침윤, (C)점막 비후화 및 (D)상피 미란에 기초하여 평가하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 34. 당뇨병이있는 NOD 마우스에서 공복시 혈당 및 인슐린 수치에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A)공복 혈당 수치는 부형제 또는 BT-11(80mg/kg/d)에 의한 처리의 0, 1, 3, 4, 5, 10 및 11주에 평가되었다. (B)공복 혈청 인슐린 수준은 부형제 또는 BT-11(80mg/kg/d)에 의한 처리 5주째에 평가되었다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표(n=10)로 표시되어 있다.
도 35. 제1형 당뇨병 마우스의 췌장내 병변 형성에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. 조직병리학적 병변은 백혈구 침윤, 병변 형성 및 조직 미란(erosion)에 기초하여 평가되었다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 36. (A)공복 혈당 수준 및 (B)내당능 시험에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A)마우스를 12시간동안 금식시키고, 실험 셋업 후 2주 및 12주에 혈당 수준을 측정하였다. (B)또한 마우스에게 IP 글루코스 주사(2g/Kg)를 시도하고, 글루코스를 측정하였다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 37. 백색 지방 조직(WAT)에 침투하는 염증 유발 모집단에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. WAT를 절제하고 소화시키고, 면역표현형 결과를 유동 세포계측법으로 평가하였다. (A)침윤성 대식세포 및 (B)Ly6chigh GR1 + 침윤 세포의 수준이 도시된다. 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 38. 당뇨병의 db/db 모델에서 글루코스 항상성에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. (A)실험 셋업 후 1주 및 3주후에 BT-11 또는 부형제로 처리한 렙틴 수용체-결핍(db/db) 마우스의 공복 혈당(FBG) 농도를 나타내었다. (B)복강내 포도당 도전(1g/Kg 체중) 후 혈장 글루코스 수준이 표시된다. 글루코스 부하 전에(0), 이어서 15, 30, 60, 90, 120, 180, 220 및 265분 후에 혈액을 수집하였다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
도 39. 식이-유도성 비만 마우스의 백색 지방 조직(WAT)에서 LANCL2, TNFα 및 MCP-1의 발현에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. LANCL2, TNFα 및 MCP-1의 유전자 발현 분석을 미처리 마우스와 비교하여 평가하였다. 0의 선은 부형제만 수용한 마우스의 기준선을 나타낸다.
도 40. 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 임상 점수 및 이환율에 경구 BT-11 투여가 미치는 효과. 마우스를 인플루엔자 바이러스에 감염시켜, 실험동안 내내 임상적으로 채점되었다. 임상 점수는 (A)활동 및 (B)신체적 외모로 나타났다. (C)체중의 15% 이상을 잃은 마우스의 비율은 이환율의 변화를 나타내도록 플롯팅되었다. 그룹들 간에 통계적으로 유의미한 차이(P < 0.05)는 별표로 표시되어 있다.
일반적인 정의
다르게 명시되지 않는한, 본원 전체에 걸쳐 이하의 정의들이 사용된다:
분산 분석(ANOVA): 데이터 세트의 전체 변동을 변동원을 기반으로 특정 구성요소로 분할하기 위한 산술 프로세스. 치료 그룹들 간의 수치적 차이가 통계적으로 중요한지의 여부를 결정하는데 사용되었다.
지방형성(Adipogenesis): 새로운 지방세포 또는 지방 저장세포가 생성되는 과정.
대립유전자: 동일한 유전자를 코딩하는 많은 생존가능한 DNA 중 하나.
접합된 디엔: 단일 결합에 의해 분리된 2개의 이중 결합들을 함유하는 분자.
Db/db 마우스: 렙틴 수용체의 긴 동형의 대립유전자가 둘다 결핍된 마우스의 유형을 정의하기 위해 사용되는 용어. 이 결핍은 제2형 당뇨병에 걸리기 쉬운 소인을 높인다. Db/db 마우스에 대한 자세한 논의는 아래 실시예들을 참조한다.
거울상 이성질체: 광학 이성질체; 시계방향(+) 또는 시계반대방향(-)으로 편광면을 회전시키는 능력에 기초한 분자들의 화학적 분류.
혈당증: 혈중 포도당 농도.
고혈당증: 혈중 포도당 농도가 정상 범위를 넘어서서 증가됨.
고 인슐린 혈증: 혈중 인슐린 농도가 정상 범위를 넘어서서 증가됨.
인슐린 혈증: 혈액 내 인슐린 농도.
인슐린 저항성: 조직이 인슐린에 반응하여 혈중 포도당을 흡수할 수 없는 능력.
실질적으로 순수한: 적어도 90중량%, 바람직하게는 적어도 95중량%, 예컨대 적어도 98중량%, 99중량% 또는 약 100중량% 이상의 순도를 갖는다.
제2형 당뇨병 또는 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병: 인슐린 작용에 대한 세포들의 무반응으로 인한 일반적인 유형의 당뇨병을 지칭하는 용어. 세포가 인슐린에 반응하지 않으면, 혈액에서 포도당을 흡수할 수 없으므로 포도당 독성을 유발한다. 또한, 세포들은 글루코스 산화로부터 유도된 에너지로부터 박탈된다.
IBD: 염증성 장 질환(IBD)은 소화관 전부 또는 일부의 만성 염증을 수반한다. IBD는 주로 궤양성 대장염과 크론병을 포함한다. 둘 다 보통 심한 설사, 통증, 피로감 및 체중 감소를 동반한다. IBD는 쇠약해질 수 있으며 때로는 생명을 위협하는 합병증을 유발할 수 있다.
궤양성 대장염(UC): UC는 대장(결장)과 직장의 안쪽 내벽에 오래 지속되는 염증과 염증(궤양)을 유발하는 IBD이다.
크론병(Crohn's disease): 크론병은 소화관 내벽의 염증을 일으키는 IBD이다. 크론병에서 염증은 종종 감염된 조직으로 깊숙이 퍼진다. 염증은 소화관의 다른 부위들, 즉 대장, 소장 또는 둘다를 포함할 수 있다.
IL-10: 인간 사이토카인 합성 억제 인자(CSIF)로도 알려져있는 인터류킨-10(IL-10)은 항-염증성 사이토카인이다. 인간에서, IL-10은 IL10 유전자에 의해 암호화된다.
FOXP3: 스커핀으로 알려진 FOXP3(forkhead box P3)은 면역계 반응에 관여하는 단백질이다. FOX 단백질 계열의 구성원인, FOXP3은 조절 T 세포의 발달과 기능에서 주 조절자(전사 인자)로 작용하는 것으로 보인다.
TNF-α: 종양괴사인자(TNF, 카켁신(cachexin) 또는 카켁틴(cachectin), 이전에는 종양괴사인자 알파 또는 TNFα로 알려져 있음)는 전신성 염증에 관여하는 사이토카인이며, 급성기 반응을 자극하는 사이토카인 그룹의 일원이다.
MCP1: 단핵구 화학유인물질 단백질-1. 관상동맥 우회술 시술을 받고 있는 환자의 내피 세포, 대식세포 및 혈관 평활근 세포에서 발견되는, 아테롬성 동맥경화 병변의 발병에 중요한 CC 사이토킨에 대한 구 용어. 공식적으로 선호되는 용어는 케모카인(C-C 모티프)리간드 2이다.
인터페론 감마: 인터페론 감마는 인터페론 제II형 종류의 유일한 구성원인, 전-염증성 이량체성 용해성 사이토카인이다.
제1형 당뇨병: 제1형 당뇨병은 한때 소아당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병으로 알려져 있으며, 췌장에서 당(포도당)이 에너지를 생산하기 위해 세포에 들어가는데 필요한 호르몬인 인슐린을 거의 생산하지 않는 만성적인 질환이다.
백혈구 침윤: 백혈구 침윤은 백혈구를 손상된 조직으로 이동시키거나 침투시켜 복구 과정을 시작하는 과정을 의미한다.
화학 정의들
그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, 용어 "알킬"은 다르게 언급하지 않는 한, 완전히 포화된, 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하고, 2가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있으며, 지정된 탄소원자 수(예를 들면, C1-C10은 1~10개의 탄소 원자들을 포함하는 것을 의미함)를 가진다. 알킬기의 예로는 제한없이, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실,(시클로헥실)에틸, 시클로프로필메틸 및 이들의 동족체 및 이성질체, 예를 들면 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등이 포함된다. 다르게 언급되지 않는 한, 용어 "알킬"은 또한 "헤테로알킬" 및 "시클로알킬"로 이하에 보다 자세히 정의된 알킬 유도체들을 포함한다.
용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유한다는 것을 제외하고는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 알케닐 기의 예로는 비닐, 2-프로페닐, 크로 틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐) 등 및 고급 동족체 및 이성질체가 포함된다.
용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유한다는 것을 제외하고는 상기 정의된 바와 같은 알킬 또는 알케닐기를 의미한다. 알키닐기의 예에는 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 등이 포함되며, 보다 고급의 동족체 및 이성질체가 포함된다.
단독으로 또는 또다른 치환체의 일부로서 용어들 "알킬렌", "알케닐렌" 및 "알키닐렌"은 -CH2CH2CH2CH2-에 의해 예시된 바와 같이 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기로부터 각각 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
전형적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이다. 탄소수 10 이하의 기가 본 발명에서 바람직하다. 용어 "저급"은 "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"에서와 같이 이들 기 중 임의의 것에 적용되는 경우, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기를 나타낸다.
"치환된"은 하나 이상의 치환체들, 예컨대 저급 알킬, 아릴, 아실, 할로겐(예를 들면, CF3과 같은 알킬할로), 히드록시, 아미노, 알콕시, 알킬아미노, 아실아미노, 티오아미도, 아실옥시, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 머캅토, 티아, 아자, 옥소, 포화 및 불포화 고리 탄화수소, 헤테로사이클 등을 추가로 포함하는 화학 기를 의미한다. 이들 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 모이어티들의 임의의 탄소 또는 치환체에 부착될 수 있다. 또한, 이들 기들은 탄소 사슬 그 자체와 관련되어 있거나, 탄소 사슬 자체에 통합되어 있을 수 있다.
용어 "아릴"은 방향족 치환체를 의미하는 것으로 본원에서 사용되는데, 방향족 치환체는 함께 융합되거나, 공유 결합되거나 또는 디아조, 메틸렌 또는 에틸렌 모이어티와 같은 공통기에 결합된 단일 방향족 고리 또는 다중 방향족 고리일 수 있다. 공통 연결기는 또한 벤조페논에서와 같은 카르보닐일 수 있다. 방향족 고리(들)은 다른 것들 중에서, 예를 들어 페닐, 나프틸, 비페닐, 디페닐메틸 및 벤조페논을 포함할 수 있다. 용어 "아릴"은 "아릴알킬"및 "치환된 아릴"을 포함한다. 페닐 기에 있어서, 아릴 고리는 일-, 이-, 삼-, 테트라- 또는 펜타-치환될 수 있다. 더 큰 고리는 치환되지 않거나 하나 이상의 치환체들을 가질 수 있다.
"치환된 아릴"은 하나 이상의 작용기, 예컨대 저급 알킬, 아실, 할로겐, 알킬할로(예컨대, CF3), 히드록시, 아미노, 알콕시, 알킬아미노, 아실아미노, 아실옥시, 페녹시, 머캅토 및, 방향족 고리(들)에 융합되거나, 공유 결합되거나, 또는 공통기, 예컨대 디아조, 메틸렌 또는 에틸렌 모이어티에 결합된 포화 및 불포화 고리 탄화수소 모두를 포함하는, 본원에 설명된 아릴을 의미한다. 연결기는 또한 카르보닐, 예컨대 시클로헥실 페닐 케톤일 수 있다. 용어 "치환된 아릴"은 "치환된 아릴알킬"을 포함한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 불소, 브롬, 염소 및 요오드 원자를 지칭하는 것으로 본원에 사용된다.
용어 "히드록시"는 본원에서 -OH 기를 지칭하는 것으로 사용된다.
용어 "아미노"는 NRR'을 나타내기 위해 사용되며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 이들의 치환된 유사체들이다. "아미노"는 2급 및 3급 아민을 나타내는 "알킬아미노" 및, RC(O)NR' 기를 나타내는 "아실 아미노"를 포함한다.
투여
본 발명의 방법의 과정에서, 본 발명의 화합물의 치료적 유효량은 포유류 및 인간을 비롯한 동물에게 여러 방법으로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 경구 또는 비경구로 투여되지만, 의료용 화합물 또는 에어로졸을 통한 투여와 같은 다른 투여 형태도 고려된다.
경구 투여의 경우, 화합물의 유효량은 예를 들어 고체, 반고체, 액체 또는 기체 상태로 투여될 수 있다. 구체적인 예는 정제, 캡슐, 분말, 과립제, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제를 포함한다. 그러나, 화합물은 이들 형태에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물을 정제, 캡슐, 분말, 과립제, 용액 또는 현탁액으로 제형 화하기 위해, 화합물은 결합제, 붕해제 및/또는 윤활제와 바람직하게 혼합된다. 필요하다면, 생성된 조성물은 공지된 방법을 사용하여 희석제, 완충제, 침투제, 방부제 및/또는 향료와 혼합될 수 있다. 결합제의 예로는 결정 셀룰로오스, 셀룰로즈 유도체, 옥수수 전분, 시클로덱스트린 및 젤라틴이 포함된다. 붕해제의 예로는 옥수수 전분, 감자 전분 및 나트륨 카르복시메틸셀룰로스가 포함된다. 윤활제의 예로는 활석 및 마그네슘 스테아레이트가 포함된다. 또한, 통상 사용되는 첨가제, 예컨대 락토스 및 만니톨이 사용될 수도 있다.
비경구 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 직장으로 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 직장 투여를 위해, 좌제가 사용될 수 있다. 좌제는 본 발명의 화합물을 체온에서 용융하지만 실온에서 고체인 약학적으로 적합한 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예로는 카카오 버터, 카본 왁스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 생성된 조성물은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 임의의 원하는 형태로 성형될 수 있다.
주사 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 피하, 피내, 정맥내 또는 근육내 주사될 수 있다. 이러한 주사용 약제는 본 발명의 화합물을 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 오일, 합성 수지 산의 글리세라이드, 고급 지방산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜에 공지의 방법으로 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조할 수 있다. 필요하다면, 통상적으로 사용되는 첨가제, 예컨대 가용화제, 삼투조절제, 유화제, 안정화제 또는 방부제가 또한 첨가될 수 있다. 필수는 아니지만, 조성물을 무균 또는 살균하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화합물을 현탁액, 시럽 또는 엘릭서로 제제화하기 위해, 약학적으로 적합한 용매가 사용될 수 있다. 이들 중에는 물에 대한 비-제한적인 예가 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 의약 약제를 제조하기 위한 다른 약학적으로 적합한 활성을 갖는 추가의 화합물과 함께 사용될 수 있다. 독립형 화합물로서 또는 조성물의 일부로서 본 발명의 화합물을 함유하는 약물은 이를 필요로 하는 대상의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 가스 또는 액체 분무제 및, 필요하다면 공지된 보조제, 예컨대 팽창제와 함께, 액체 또는 미세 분말의 형태로 화합물을 에어로졸 용기 또는 분무기와 같은 비-가압성 용기에 충전함으로써 제조된 에어로졸 또는 흡입제의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 프로판 또는 질소의 가압 기체가 분무제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 정제, 캡슐, 용액 또는 에멀젼과 같은 약학적 조성물로서 그것을 필요로 하는 포유류 및 인간을 비롯한 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 에스테르, 이의 약학적으로 적합한 염, 그의 대사 산물, 구조적으로 관련된 화합물, 이의 유사체 및 이들의 조합들을 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, 본 발명에 기재된 화합물의 다른 형태의 투여는, 또한 본 발명에 의해 고려된다.
본 발명의 화합물은 또한 식품 또는 영양 보조 식품으로서 영양 보조제로서 그것을 필요로 하는 동물에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 용어들 "예방", "치료" 또는 "개선" 및 유사한 용어는 예방 및 완전 또는 부분 치료를 포함한다. 또한 증상 감소, 증상 완화, 증상의 중증도 감소, 질환의 발생률 감소 또는 환자의 임의의 다른 상태 변화로 치료 결과를 향상시키는 변화들을 포함할 수 있다.
본 발명에 기재된 화합물은 바람직하게는 조성물의 형태로 사용 및/또는 투여된다. 적합한 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물, 식품 또는 식품 보조제이다. 이러한 조성물은 화합물을 전달하기 위한 편리한 형태를 제공한다. 본 발명의 조성물은 산화 또는 용해도에 대한 화합물의 안정성을 증가시키는데 효과적인 양으로 항산화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 투여되거나 또는 본 발명의 사용에 투여하기 위한 화합물의 양은 임의의 적합한 양이다. 바람직하게는 약 0.0001g 내지 약 20g(보다 바람직하게는 0.01g 내지 1g, 예를 들어 0.05g 내지 0.5g)의 화합물을 하루에 투여한다. 적합한 조성물이 이에 따라 제형화될 수 있다. 생물학적 활성제를 투여하는 기술 분야의 당업자는 잘 알려져 있고 잘 이해된 파라미터에 기초하여 다양한 대상에 대한 특정 투여 요법을 개발할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 조성물은 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 당의정, 복합 입자(과립, 비드, 펠렛 및 마이크로-캡슐화된 입자를 포함함), 분말, 엘릭서, 시럽, 현탁액 및 용액 형태의 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구 또는 경구 투여에 적합하다. 경구 투여가능한 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있고, 다른 것들 중에서 정제, 분말, 현탁액 및 시럽의 형태를 취할 수 있다. 선택적으로, 조성물은 하나 이상의 향미제 및/또는 착색제를 포함한다. 일반적으로, 치료 및 영양 조성물은 대상에서 화합물의 작용을 현저하게 방해하지 않는 임의의 물질을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 사용하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 약학 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물 0.01 내지 99중량%를 함유 할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 단위 투여량 형태로 제조된다. 바람직하게는, 본 발명에 기재된 화합물의 단위 투여량은 1mg 내지 1000mg(보다 바람직하게는 50mg 내지 500mg)이다. 이러한 조성물의 제조에 사용되는 부형제는 당 분야에 공지된 부형제이다.
조성물을 위한 제품 형태의 추가의 예는 젤라틴, 전분, 변형된 전분, 글루코스, 수크로스, 락토스 및 프룩토스와 같은 전분 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 캡슐화 물질을 포함하는 연질 겔 또는 경질 캡슐의 형태와 같은 식품 보충제이다. 캡슐화 물질은 임의로 가교제 또는 중합제, 안정제, 항산화제, 감광성 충진물을 보호하기 위한 광 흡수제, 방부제 등을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 식품 보충제 중 화합물의 단위 투여량은 1mg 내지 1000mg(보다 바람직하게는 50mg 내지 500mg)이다.
일반적으로, 담체라는 용어는 기재된 화합물이 약학적 담체, 식품, 영양 보충제 또는 식이 보조제와 혼합될 수 있는 조성물을 나타내기 위해 본원 전반에 걸쳐 사용될 수 있다. 상기 설명된 물질은 본 발명의 목적을 위한 담체로 고려될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 담체는 본 발명의 화합물에서 생물학적 활성을 거의 내지 전혀 갖지 않는다.
투여량: 본 발명의 방법은 치료적 유효량의 화합물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 화합물의 유효량은 투여되는 화합물의 형태, 투여 기간, 투여 경로(예를 들면, 경구 또는 비경구), 동물의 연령 및 포유 동물 및 인간을 비롯한 동물의 상태에 따라 다르다.
예를 들면, 제2형 당뇨병, 전당뇨병, 제1형 당뇨병, 내당능 장애, 인슐린 저항성, 궤양성 대장염 또는 크론병, 또는 본원에 기술된 동물에서의 임의의 다른 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적인 화합물의 양은 0.1-10,000mg/kg/day일 수 있다. 화합물의 바람직한 유효량은 1 내지 5,000mg/kg/day이고, 보다 바람직한 투여량은 2 내지 100mg/kg/day이다. 독성학 데이터가 입증하는 것처럼 본 화합물이 비교적 무독성이기 때문에, 투여되는 유효량의 상한은 중요하지 않다. 유효량의 화합물은 약 7 내지 100일동안, 바람직하게는 15 내지 50일동안, 및 가장 바람직하게는 30 내지 42일동안 동물에게 투여될때, 동물의 궤양성 대장염, 크론병, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 당뇨병 전증, 대사 증후군, 내당능 장애 및 인슐린 저항성을 치료 또는 예방하는데 가장 효과적이다.
면역계의 과다-활성화를 예방하는데 가장 효과적인 화합물의 양은 0.1 내지 500mg/kg/day 범위일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 150mg/kg/day일 수 있다.
본 발명의 화합물의 유효량이 영양적, 치료적, 의료적 또는 수의학적 조성물로 투여되는 경우, 바람직한 투여량은 식품 또는 건강기능 제품에 대해 약 0.01 내지 2.0% wt/wt범위이다.
특정 다른 구현예에서, 본 발명은 LANCL2-결합 화합물 및 또한 구조적으로 관련된 화합물, 예컨대 화합물, 그의 에스테르, 그의 약학적으로 적합한 염, 그의 대사 산물, 그의 구조적으로 관련된 화합물, 또는 이들의 조합들로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 IBD 및 위장관 염증의 치료 및 예방에 사용하기 위해 제공된다.
또한, 일반적으로, 본 발명은 관련 성분이 위, 소장, 대장 및 직장을 포함하는 위장관에서 염증의 억제에 관한 것이다. 이 효과는 생물학적 효과를 유도하는 신체의 다양한 세포 유형에 화합물이 노출된 결과이다. 세포는 위장관 조직, 면역세포(즉, 대식세포, 단핵구, 림프구) 또는 상피 세포로부터의 세포를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 예를 들어 식이 보충제로 대상을 치료하여 크론병 또는 궤양성 대장염인 염증성 장 질환과 관련된 염증을 감소 또는 예방한다. 본 발명은 또한 소화관내 세포 부착분자의 발현을 억제하기 위해 위장관에 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 고려한다.
본 발명의 방법은 실시될 때, 상기한 바와 같이 임의의 허용가능한 형태를 사용하여 임의의 허용가능한 투여 경로를 통해 화합물을 대상에게 투여하고, 대상의 몸이 화합물을 표적 세포에 자연 과정을 통해 분포시킬 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 투여는 마찬가지로 표적 세포(즉, 치료될 세포)를 함유하는 부위(예를 들면, 기관, 조직)에 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 투여는 임의의 수의 처방을 따를 수 있다. 따라서 그것은 일정 기간동안 실험 화합물의 단일 투여량 또는 투여, 또는 다중 투여량 또는 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 치료는 원하는 결과가 달성될 때까지 투여 단계를 1회 이상 반복하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 치료는 수주, 수개월 또는 수년과 같은 연장된 기간동안 계속될 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 당 분야의 공지된 파라미터를 기초로 하여 개인에게 적합한 투약 요법을 용이하게 개발할 수 있다. 본 발명의 화합물에 대한 투여량은 본 발명의 상기 구현예의 방법들에 사용될 수 있다. IBD, 위장관 염증 또는 소화관내 세포 부착분자의 발현 억제를 치료하기 위해, 화합물을 약 1mg/day 내지 9,000mg/day의 양으로 투여하는 것이 바람직하다.
투여량은 대상, 질환 또는 장애의 단계, 대상의 나이, 대상의 일반적인 건강 상태, 및 의학 분야의 숙련자에 의해 알려져 있고 통상적으로 고려되는 다양한 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, IBD는 종종 개인이 경험하는 고통의 양과 관련된 위장관 내 염증의 양을 검출가능한 변화로 만들기 위해 충분한 양의 화합물이 투여될 것이다. 현재 IBD 증상이 없는 환자의 경우, 찾고자 하는 변화가 면역세포에 대한 TNFα 발현이나 혈액내 조절 T-세포의 백분율과 같은 면역세포 파라미터를 포함할 수 있다. 적당한 양이 본원에 개시되어 있으며, 추가의 적합한 양은 본원에 개시된 양을 기준으로, 과도하거나 지나친 실험없이 당업자에 의해 확인될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 IBD를 앓는 대상, 또는 다르게는 아마도 IBD를 발생시키는 크론병 또는 궤양성 대장염에 대한 유전적 소인을 가지고 있는, 건강한 개체를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 또한 퇴행성 형태의 IBD로 치료하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "IBD를 앓는 대상"은 IBD의 전형적인 하나 이상의 임상 증상을 나타내는 질환 또는 장애를 갖는 대상(예를 들면, 동물, 인간)을 의미하는데 사용된다. 일반적으로, 본 발명의 이 양태에 따른 치료 또는 예방 방법은 IBD의 하나 이상의 증상 또는 임상 양상을 치료 또는 예방하거나, 또는 그러한 증상(들) 또는 징후(들)의 발병을 예방하는데 효과적인 화합물요법의 양을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명은 IBD, 장염과 관련된 염증 및 자가면역 질환과 관련된 염증의 치료 방법을 제공할 수 있다. 치료 방법은 예방 방법일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 IBD, 장염과 관련된 염증 및 자가면역 질환과 관련된 염증을 치료하는 방법이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 IBD를 예방하는 방법이다. 구현예에서, 상기 방법은 IBD의 완화 형태가 활성이 되는 것을 방지하는 방법이다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 IBD, 장염과 관련된 염증 및 자가면역 질환과 관련된 염증을 갖는 대상의 건강 상태를 개선시키는 방법이다. 위장관 감염을 일으키는 유기체는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 쉬겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 병원성 비브리오(Vibrios), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시나 엔테로콜리티카(Yersina enterocolitica), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica) 및 람블편모충(Giardia lamblia)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 IBD, 장염과 관련된 염증 및 자가면역 질환과 관련된 염증이 발병할 위험이 있거나, IBD, 장염과 관련된 염증 및 자가면역 질환과 관련된 염증을 앓는 대상의 건강, 기관 및/또는 조직을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, IBD를 치료하는 방법은 현재 이용가능한 IBD 치료법의 공통적인 식별가능한 부작용들, 예컨대 현저한 체중 증가, 전신 면역 억제, 쿠싱양(cushingoid) 출현, 골감소증/골다공증 또는 췌장염 없이 IBD를 치료하는 것을 포함한다(즉, 부신피질 호르몬, 종양괴사인자 알파 억제제). 즉, 일부 세포에서 LANCL2의 발현 및/또는 활성화에 영향을 줌으로써, 적어도 부분적으로 치료 효과를 제공하는 본 발명에 따른 치료 방법은 치료를 받지 않은 다른 유사한 대상과 비교하여, 예를 들어 체액 보유에 의한 체중의 상당한 증가없이 유익한 효과를 제공한다는 것을 발견하였다.
이와 같이, 본 발명의 방법은 염증을 감소시키는 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 전신적으로(즉, 대상의 신체 전체) 또는 국소적으로(예를 들면, 투여 부위 또는 T 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 염증 세포의 부위에서) 염증을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 염증의 치료 또는 예방에서, 볼 수 있는 하나의 효과는 장에 침윤하는 혈액 단핵구 또는 대식세포 및 림프구의 수의 감소이다. 다른 하나는 CD4+CD25+FoxP3+ 조절성 T-세포와 같은 조절 면역세포 집단의 증가, 또는 림프구 또는 대식세포(예를 들면, 증가된 인터류킨 4(IL-4) 또는 IL-10의 증가 또는 TNF-α 및 IL-6의 감소)의 조절특성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 하나는 염증 유전자 및/또는 접착 분자의 존재율이 감소될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 또한 화합물 요법이 투여되는 대상의 면역 반응에 영향을 주거나 변경시키는 방법으로 간주될 수 있다. 상기 대상은 염증성 장 질환 또는, T 세포의 면역조절 또는 세포부착 분자의 하향조절이 원하는 결과인 다른 질환을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물로 전염병을 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 전염병의 비-제한적인 예는 바이러스 감염, 박테리아 감염 및 진균 감염을 포함한다.
바이러스 감염의 비-제한적인 예는 다른 것들 중에서, 아데노바이러스과(adenoviridae) 바이러스, 예컨대 아데노바이러스; 헤르페스바이러스과, 예컨대 헤르페스 심플렉스, 제1형, 헤르페스 심플렉스, 제2형, 수두대상포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스 및 제8형; 유두종 바이러스(papillomaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 인간 유두종 바이러스; 폴리오마바이러스과(polyomaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 BK 바이러스 및 JC 바이러스; 폭스바이러스과(poxviridae) 계열의 바이러스, 예컨대, 천연두; 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스; 파보바이러스과(parvoviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 인간 보카 바이러스(bocavirus) 및 파보 바이러스(parvovirus) B19; 아스트로바이러스과(astroviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 인간 아스트로바이러스; 칼리시바이러스과(caliciviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 노르왁(norwalk) 바이러스; 피코르나 바이러스과(picornaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 콕사키바이러스(coxsackievirus), A형 간염 바이러스, 폴리오 바이러스 및 라이노바이러스; 코로나바이러스과(coronaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 급성 호흡기 증후군 바이러스; 플라비바이러스과(flaviviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스, 토가 바이러스과(togaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 풍진 바이러스; 헤페바이러스과(hepeviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 E형 간염 바이러스; 레트로바이러스과(retroviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV); 오르토믹소바이러스과(orthomyxoviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 인플루엔자 바이러스; 아레나바이러스과(arenaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 구아나리토(guanarito) 바이러스, 쥬닌(junin) 바이러스, 라사(lassa) 바이러스, 마츄포(pachupo) 바이러스 및 사비아(sabia) 바이러스; 부니아바이러스과(bunyaviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 크리미안-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스; 필로바이러스과(filoviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 에볼라(ebola) 바이러스 및 마버그(marburg) 바이러스; 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 헨드라(hendra) 바이러스 및 니파(nipah) 바이러스; 랍도바이러스과(rhabdoviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 광견병 바이러스(rabies virus); 비할당 바이러스(unssigned viruses), 예컨대 D형 간염 바이러스; 및 레오 바이러스과(reoviridae) 계열의 바이러스, 예컨대 로타 바이러스(rotavirus), 오르비 바이러스(orbivirus), 콜티 바이러스(coltivirus) 및 반나 바이러스(banna virus)로부터의 감염을 포함한다.
세균 감염의 비-제한적인 예는 탄저균(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 보르데텔라 백일해균(Bordetella pertussis), 보렐리아에 복도페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 캐니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 장구균(Enterococcus faecium), 대장균(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울서란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 이질균(Shigella sonnei), 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 표피 포도상 구균(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 사피로파이티커스(Staphylococcus saprophyticus), 연쇄상구균(Streptococcus agalactiae), 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 매독균(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 페스트균(Yersinia pestis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 여시니아 슈도튜베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 및 상기 유기체들의 속으로부터 다른 종들을 포함한다.
진균 감염의 비-제한적인 예는 아스페르길루스증을 유발하는 아스페르길루스(Aspergillus) 속 균류, 예컨대 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus); 분아균증(blastomycosis)를 유발하는 블라스토마이세스(blastomyces) 속 균류, 예컨대 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis); 칸디다증을 유발하는 칸디다(Candida) 속의 균류, 예컨대 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 콕시디오이데스 진균증(coccidioidomycosis)을 유발하는 콕시디오데스(Coccidioides) 속 균류; 크립토코커스증(cryptococcosis)을 유발하는 크립토코커스(Cryptococcus) 속 균류, 예컨대 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티(Cryptococcus gattii); 백선(ringworm)을 유발하는 피부사상균(dermatophytes) 균류; 진균 각막염(fungal keratitis)을 일으키는 균류, 예컨대 푸사리움(Fusarium) 종, 아스퍼길루스(Aspergillus) 종 및 칸디다(Candida) 종; 히스토플라스마증(histoplasmosis)을 일으키는 히스토플라스마(Histoplasma) 속 균류, 예컨대 히스토플라스마 캡술라툼(Histoplasma capsulatum); 모균증(mucorales)을 유발하는 뮤코랄리스(Mucorales) 목 균류; 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균류, 예컨대 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae); 뉴모시스티스(pneumocystis) 폐렴을 일으키는 뉴모시스티스 속 균류, 예컨대 뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii); 스포로트릭스증을 일으키는 스포르트릭스 센키(Sporothrix schenckii) 스포르트릭스(Sporothrix) 속 균류에 의한 감염을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 화합물로 자가면역 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 염증성 자가면역 질환의 비-제한적인 예는 그 중에서도 염증성 장 질환(IBD), 전신성 루푸스, 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 건선 및 다발성 경화증을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 화합물로 만성 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 만성 염증성 질환의 비-제한적인 예는 그 중에서도 대사 증후군, 비만, 당뇨병 전증, 심혈관 질환 및 제2형 당뇨병을 포함한다.
본 발명은 또한 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 다른 유형의 당뇨병을 포함하여, 본원에 기술된 화합물로 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 용어 "당뇨병" 또는 "진성 당뇨병"은 환자가 고혈당(즉, 고혈당증)을 갖는 대사 장애를 포괄하여 사용된다. 고혈당 질환에는 췌장이 충분한 인슐린을 생산하지 못하거나 세포가 생산되는 인슐린에 반응하지 않는 등의 다양한 원인이 있다. 당뇨병에는 몇 가지 하위 유형이 있다. 제1형 당뇨병은 신체가 인슐린을 완전히 생산하지 못하거나 신체가 충분한 인슐린을 생산하지 못하는 것을 특징으로 한다. 제2형 당뇨병은 일반적으로 세포가 인슐린을 제대로 사용하지 못하는 상태인 인슐린 저항성에 기인한다. 제2형 당뇨병은 때때로 인슐린 결핍과 함께 나타난다. 임신성 당뇨병은 이전에 당뇨병 진단이 없던 임산부가 고혈당으로 진행될 때 발생한다. 덜 일반적인 형태의 당뇨병에는(인슐린 분비와 관련된 유전적 결함으로 인한)선천적인 당뇨병, 낭포성 섬유증-관련 당뇨병, 고용량의 글루코코르티코이드에 의해 유도된 스테로이드 당뇨병, 및 여러 형태의 원발성 당뇨병(소아성인형 당뇨병 포함)이 있다. 원발성 당뇨병은(고혈당을 일으키는 더욱 복잡한 다기능 병인과 대조되는) 하나의 상염색체 우성 유전자의 돌연변이에 의한 여러 가지 유전적 형태의 당뇨병을 포함한다.
상기 방법을 검토할 때, 본 발명은 피험자의 세포 치료와 같은 세포 접촉에 사용하기 위한 LANCL2-결합 화합물 요법을 제공한다는 것이 분명해야한다. 상기 논의는 일반적으로 약학적 또는 의학적 환경을 고려할 수 있는 조성물의 일부로서 본 발명의 화합물의 용도에 초점을 둔다.
IBD, 위장관 염증 및 설명된 다른 질환들의 치료를 위해, 본 발명에서 기술된 화합물은 상기에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이 약제, 영양 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 식이 보조제로서 제형화될 수 있다.
본원에 설명된 요소들 및 방법 단계들은 명시적으로 기술되었든 아니든간에 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
여기에 사용된 방법 단계들의 모든 조합은 별도로 명시되거나 언급된 조합이 작성되는 맥락에 반하는 것이 명백한 경우를 제외하고는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 단수 형태(a, an, the)는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 구체적으로 개시되었는지의 여부와 관계없이, 그 범위내에 포함된 모든 수 및 수의 서브셋을 포함하고자 한다. 또한, 이들 수치 범위는 그 범위내의 임의의 수 또는 서브셋의 수에 대한 청구범위를 지지하는 것으로 해석되어야한다. 예를 들면, 1 내지 10의 개시는 2 내지 8, 3 내지 7, 5 내지 6, 1 내지 9, 3.6 내지 4.6, 3.5 내지 9.9 등의 범위를 지지하는 것으로 해석되어야한다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 공보 및 상호심사 공보들(즉, "참고 문헌")은 각각의 개별적인 참고 문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로 인용 된 것처럼 동일한 범위의 참조로 명시적으로 포함된다. 본 명세서 및 통합된 참조문헌들 사이에 상충되는 경우, 본 명세서가 제어한다.
본 발명은 본 명세서에 도시되고 기술된 부분의 특정 구조 및 배열에 국한되지 않으며, 청구 범위의 범주 내에있는 변형된 형태를 포함한다.
분자 모델링 실시예들
실시예 1: LANCL2 리간드 결합의 분자 모델링
도입부
아브시스산(ABA) 및 NSC61610과 같은 기정의 LANCL2 작용제는 IBD에서 당뇨병 및 인플루엔자에 이르는 광범위한 질환 모델에서 항-염증 활성을 발휘한다. 새로운 치료 표적으로서의 LANCL2의 가치는 만성 대사, 면역 매개 및 감염 질환의 치료를 위한 구강활성 약물의 새로운 부류를 발견하고 개발하려는 노력의 가치가 있다. 본 실시예에 논의된 바와 같이, 컴퓨터 모델링과 실험적 검증을 반복적으로 결합하는 합리적인 약물 설계를 통해 추가적인 LANCL2 작용제가 개발되었다. 본 실시예는 용해도를 증가시키고, LANCL2와의 결합을 증가시키며, 비용을 낮추고, LANCL2 단백질 자체를 이해하기 위한 합리적인 약물 설계 및 의료화학적 노력을 증가시키는 접근법들을 나타낸다.
방법들
LANCL2의 구조. LANCL2의 결정 구조는 존재하지 않는다. 따라서 LANCL2의 구조와 기능을 이해하기 위해, LANCL1의 결정 구조를 주형으로 사용하여, 인간 LANCL2의 상동성 모델링을 수행하였다. 모델의 품질을 평가하고, 에너지 최소화 절차를 통해 개선을 이루었다. 상동성 모델링은 구조가 실험적으로 해결된 다른 단백질 계열의 동족 단백질을 확인함으로써 단백질의 3차원 구조를 예측한다[52]. 단백질이 35% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 가질 때, 이들은 상동성이 있을 수 있다. LANCL1은 LANCL2와 54% 서열 동일성을 공유한다[15].
화합물 생성 및 리간드 구조. LANCL2 작동제의 구조가 생성되었다(도 1A 및 1B). 이 작용제의 SMILES는 NIH의 온라인 SMILES Translator and Converter를 사용하여 생성하였다[53]. 동시에 개별 구조적.pdb 파일이 생성되고, 다운로드되었다. pdb 파일을 가상 스크리닝에 필요한 .pdbqt로 변환하는데 AutoDock Tools가 사용되었다.
가상 스크리닝. AutoDock Tools를 사용하여, 상기 생성된 파생 파일의 도킹을 수행하였다. 그리드 박스 중심과 x, y 및 z 치수를 포함하는 검색 공간이 정의되었다. 도킹은 전체 단백질 표면을 덮는 그리드로 전체 단백질 표적에 적용된다. 그리드는 일정한 직육면체(77.8Å x 77.8Å x 77.8Å)이고, 그리드 포인트는 0.608Å 씩 분리되어있다. 이 그리드는 단백질 가운데에 집중되었다. 이러한 치수와 간격으로 인해 그리드가 LANCL2의 전체 표면을 덮을 수 있다. 유전 알고리즘은 확률론적 전역 최적화에 사용되었다. AutoDock Tools는 각 화합물에 대해 100개의 바운드 구조를 생성했다. 각 유도체의 100개의 결과 포즈는 2.0Å의 RMSD 클러스터 허용 오차로 클러스터링되었다.
가상 스크리닝 결과 분석. AutoDock Vina를 사용하여 각 화합물을 LANCL2에 맞추는 가장 좋은 방법을 찾은 결과, 모든 화합물에 대해 예측된 결합 모드의 결합 에너지를 포함하여, 도킹 기록이 포함된 도킹 로그 파일이 생성되었다. 결합 에너지는 총 분자간 에너지, 총 내부 에너지 및 비틀림 자유 에너지의 합 마이너스 비결합 시스템의 에너지를 나타낸다. 화합물은 가장 음의 에너지 값으로 등급이 매겨졌다. 첫 번째 클러스터에서 가장 낮은 결합 에너지 포즈가 가장 유리한 도킹 포즈로 간주되었다. 보다 낮은 결합 자유 에너지는 보다 안정한 단백질-리간드 시스템 및 단백질과 리간드 사이의 더 높은 친화도를 나타낸다. 예시적인 화합물은 인간 질환의 마우스 모델을 이용한 시험관내 시험 및 전-임상 연구에 의해 추가로 확인된다.
결과들
NSC61610 도킹 요약. 가장 낮은 에너지 위치의 에너지를 가진 NSC61610의 상위 5개 클러스터의 막대그래프가 도 2에 도시되어 있다. NSC61610은 '중앙 갈라진 틈(central cleft)'에 대해 매우 높은 친화도를 가지고 있다. 전체 진행의 7%를 차지하는 상위 2개 클러스터들 각각이 부위를 향한다. 2Å 허용오차 때문에, 다른 클러스터가 이 부위로 직접 향할 가능성이 크다. 다음 두 개의 클러스터들은 청색 랜덤 코일 근처의 '알로스테릭 부위'로 향한다.
ABA 도킹 요약. 가장 낮은 에너지 위치의 에너지를 갖는 ABA의 상위 5개 클러스터들의 막대그래프를 도 3에 나타낸다. ABA는 중간 친화력을 가지지만, 연녹색 나선과 연녹색 랜덤 코일 사이의 '알로스테릭' 부위에 대해 매우 높은 특이성을 갖는다. 진행의 29%가 이 상위 클러스터로 향하였다. 두 번째 클러스터도 또한 이 부위로 향한다. 2Å의 허용오차로 인해 다른 클러스터가 이 부위로 직접 향할 가능성이 크다. 네 번째 클러스터는 '중앙 갈라진 틈'에 있는 것처럼 보인다. 이것은 ABA의 진정한 치료 부위에 대한 의문점을 남긴다.
BT-11 도킹 요약. 가장 낮은 에너지 위치의 에너지를 갖는 BT-11의 상위 5 개 클러스터의 막대 그래프가 도 4에 도시되어 있다. BT-11의 상위 2개 클러스터는 '중앙 균열'로 향하지만 진행의 2%만 나타낸다. 그러나 2Å의 허용오차로 인해 다른 클러스터들이 이 부위로 직접 향할 가능성이 크다. BT-11은 NSC61610보다는 ABA보다 약간 더 친화력이 있다. BT-11은 치료 효능을 입증했다(아래 실시예 참조).
BT-6 도킹 요약. 가장 낮은 에너지 위치의 에너지를 갖는 BT-6의 상위 5개 클러스터의 막대그래프를 도 5에 도시되어 있다. BT-6은 도킹된 임의의 화합물의 가장 높은 친화도를 갖는다. 상위 2개, 아마도 3개 클러스터가 '중앙 갈라진 틈'으로 향하게 된다. 2Å 허용오차로 인해 다른 클러스터가 이 부위로 직접 향할 가능성이 크다. 클러스터 4는 청색 랜덤 코일을 따라 '알로스테릭' 부위로 향한다.
BT-15 도킹 요약. 가장 낮은 에너지 위치의 에너지를 갖는 BT-15의 상위 5개 클러스터의 막대그래프가 도 6에 도시되어 있다. BT-15는 NSC61610 또는 BT-11의 결합 친화력을 갖지 않는다. '중앙 갈라진 틈(central cleft)'쪽으로 향하는 것처럼 보이지만,이 효과는 NSC61610 또는 BT-11만큼 뚜렷하지는 않다.
BT-ABA-5a 도킹 요약. 가장 낮은 에너지 위치의 에너지를 갖는 BT-ABA-5a의 상위 5개 클러스터의 막대그래프가 도 7에 도시되어 있다. BT-ABA-5a의 가장 높은 친화도는 시험된 임의의 이전 도킹에서 관찰되지 않은 스폿에 있다. 그러나 클러스터 2 및 3은 32%에서, 대다수의 진행을 나타낸다. 클러스터 2는 오른쪽 뒤의 알로스테릭 부위로 향한다. 클러스터 3은 ABA의 '알로스테릭' 부위로 향한다. 클러스터 4도 또한 이 부위로 향한다. 2Å 허용오차 때문에, 다른 클러스터들이 이 부위로 직접 향할 가능성이 크다.
논의
ABA와 NSC61610은 모두 LANCL2-의존성 면역-조절, 항-염증 및 항-당뇨 효과를 나타내지만, 컴퓨터 계산에 의하면 LANCL2의 다른 부위에서 결합한다는 것이 밝혀졌다. 예상한 바와 같이, 합리적으로 설계된 리간드는 주로 ABA 및 NSC61610의 주요 결합 부위로 향하게 된다. BT-ABA 화합물은 크기가 작고 -COOH 관능기들을 가지며; 친수성 표면 포켓쪽으로 향하는 직관적인 의미를 갖는다. BT 화합물은 훨씬 더 소수성이므로; 그것은 알파-나선에 둘러싸인 보다 소수성인 중앙 갈라진 틈으로 향하게하는 직관적인 의미를 갖게 한다.
결합 친화도는 SPR 데이터와 적당한 상관 관계가 있다(도 1a 및 1b, 아래 실시예 참조). SPR 데이터(KD 값에 의함)는 NSC61610(2.3 & 6.3), BT-11(6.3 & 7.7), BT-15(11.4 & 21.4), BT-6(18.2)의 결합 강도 순서를 제시한다. 모델링 데이터(최저 BE에 의함)는 BT-6(-10.47), NSC61610(-10.27), BT-11(-9.39), BT-15(-8.87)의 결합 강도 순서를 제시한다. BT-6에서 가장 나쁜 것에서 첫번째까지 뒤집는 것 외에도 SPR 데이터와 모델링 데이터는 결합 강도와 동일한 순서를 제시한다. 합리적인 약물 설계와 결합된 분자 모델링 데이터는 강력한 항-당뇨병 및 항-염증제 성질을 이용하기 위해 LANCL2 경로를 표적화하고 활성화시키는 유사체의 추가 발달을 허용 할 LANCL2 단백질에 대한 더 나은 이해를 가능하게 할 것이다.
의료화학 실시예
실시예 2: BT-11 및 염
반응식 2-1에 나타낸 바와 같이, DMF(100㎖) 중 6-(1H-벤즈이미다졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(12g)의 용액을 0℃로 냉각시킨 후, EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq) 및 DIPEA(1.2eq, 밀도는 추정된 용적으로 표시)를 순차적으로 첨가했다. 혼합물을 0℃에서 10분동안 교반하였다. 피페라진(0.5eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온시키고, 16시간동안 교반하였다. 반응 완료 후(TLC로 모니터링, 용리액: DCM 중 10% MeOH), 반응 혼합물을 얼음물(약 300mL)에 부어 넣고, 침전된 고체를 여과하고, 얼음물로 세척하고 건조시켜, BT-11(10g, 75%)을 담갈색 고체로서 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ 13.0(s, 1H), 12.8(s, 1H), 8.38(dd, 2H), 8.13(dt, 2H), 7.73(dd, 2H), 7.67(d, 2H), 7.57(dd, 2H), 7.25(m, 4H), 3.90(bs, 2H), 3.80(bdd, 2H), 3.65(bdd, 2H), 3.56(bs, 2H) LCMS-ES 529.44[M+H]+, 265.46[(M+2H)/2]++.
Figure pat00018
반응식 2-2에 나타낸 바와 같이, 최소량의 MeOH(5mL) 중의 BT-11(1.0eq)의 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 15-20분동안 4M 메탄올성 HCl(과량, 15mL/1g)을 적가하였다. 혼합물을 서서히 3시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 완료 후(TLC로 모니터링됨, 용리액: CH2Cl2 중의 10% MeOH), 휘발 물질을 감압하에 증발시켰다. 조 물질을 CH2Cl2 중 10% MeOH로 세척하고, 동결 건조하여 회백색 고체(850mg, 75%)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ8.58(dd, 2H), 8.29(dt, 2H), 7.83(m, 6H), 7.44(bd, 4H), 3.91(bs, 2H), 3.81(bm, 2H), 3.64(bm, 2H), 3.55(bs, 2H). LCMS-ES 529.56[M+H]+.
Figure pat00019
실시예 3: BT-12
반응식 3-1에 나타낸 바와 같이, CH2Cl2 중 10% DMF 중 6-(벤즈옥사졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(4.05g)의 용액을 0℃에서 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq) 및 DIPEA(1.2eq, 밀도가 추정된 부피로 취함) 및 0.5eq. 피페라진으로 처리하였다. 그 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 담갈색 고체가 형성되고, 소결-유리 깔때기에서 여과하고, 물로 세척하고, 동결 건조하여 담갈색 고체(3.2g)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, CDCl3), δ 8.45(dd, 2H), 8.05(m, 2H), 7.9(d, 2H), 7.8(dd, 2H), 7.6(dd, 2H), 7.4(m, 2H), 7.35(m, 2H), 4.0(bm, 8H).
Figure pat00020
실시예 4: BT-14 및 염
반응식 4-1에 나타낸 바와 같이, DMF(10mL) 중 6-(벤즈옥사졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(500mg)의 용액을 0℃에서 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq), DIPEA(3eq) 및 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트(1.1eq)로 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 EtOAc로 추출하고, 물로 세척하였다. 유기층을 진공하에 증발시키고, 조 잔류물을 펜탄으로 세척하여 담갈색 고체(120mg, 48%)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ8.4(d, 1H), 8.2(t, 1H), 7.9(t, 2H), 7.8(d, 1H), 7.5(dt, 2H), 3.7(bm, 2H), 3.5(bm, 4H), 3.4(bm, 2H), 1.4(s, 9H). LCMS-ES 409.49[M+H]+, 431.37[M+Na]+, 447.36[M+K]+.
Figure pat00021
반응식 4-2에 나타낸 바와 같이, 반응식 4-1의 생성된 화합물(200mg)을 0℃에서 메탄올성 HCl(6mL)로 처리하였다. 혼합물을 3시간동안 실온으로 가온시켰다. 용매를 증발시키고, 펜탄 및 에테르로 세척하여 담갈색 고체(160mg, 정량적)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ 9.30(bs, 2H), 8.45(d, 1H), 8.25(t, 1H), 7.9(m, 3H), 7.5(quin, 2H), 3.7(bm, 2H), 3.5(bm, 2H), 3.3(bm, 4H), 1.4(s, 9H). LCMS-ES 309.26[M+H]+.
Figure pat00022
반응식 4-3에 나타낸 바와 같이, 반응식 4-2로부터 생성된 염(25mg)을 포화 수성 NaHCO3로 중화시킨 후 동결 건조기에서 건조시켜 본 BT-14 20mg/96%를 얻었다. 수율은 90%였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ8.4(d, 1H), 8.2(t, 1H), 7.90(t, 2H), 7.75(d, 1H), 7.5(quin, 2H), 3.95(bm, 2H), 3.8(bm, 2H), 3.3(bm, 2H), 3.2(bm, 2H); 309.37 LCMS-ES[M+H]+.
Figure pat00023
실시예 5: BT-15
반응식 5-1에 나타낸 바와 같이, DMF(5mL) 중 6-(1H-벤즈이미다졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(50mg)을 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq), DIPEA(3eq) 및 0.9eq.의 BT-14 HCl 염으로 0℃에서 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 소결 깔때기를 통해 여과한 후 물세척하고, 수분을 제거하기 위해 동결 건조하여 20mg의 BT-15를 얻었다. 1H-NMR(400MHz, DMSO-d 6) δ12.93(d, 1H), 8.44(dd, 1H), 8.36(t, 1H) 8.25(t, 1H), 8.17(m, 2H), 7.87(m, 3H), 7.72(m, 2H), 7.54(m, 2H), 7.31(m, 3H), 3.90(s, 2H), 3.82(bm, 2H), 3.67(bm, 2H), 3.58(bm, 2H). LCMS-ES 530.48[M+H]+, 265.94[(M+2H)/2]++.
Figure pat00024
BT-15는 LANCL2 결합을 보여주었다(도 1a). LANCL2에 대한 예측 결합 친화도는 -9.9이며, SPR에 의해 확인된 친화도는 21.4의 Kd 값을 갖는다.
실시예 6: BT-13 염
반응식 6-1에 나타낸 바와 같이, DMF(10mL) 중 6-(1H-벤즈이미다졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(500mg)을 0℃에서 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq), DIPEA(3eq) 및 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트(1.1eq)로 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 얼음물에 부은 후, 침전물을 여과하고 건조시켜 담갈색 고체(600mg, 70%)를 얻었다. TLC(100% 에틸 아세테이트). HNMR & LCMS를 준수한다.(수율: 70%). 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ12.90(s, 1H), 8.4(d, 1H), 8.15(t, 1H), 7.65(td, 3H), 7.25(quin, 2H), 3.7(bm, 2H), 3.5(bm, 2H), 3.3(bm, 4H), 1.4(s, 9H). LCMS-ES 408.35[M+H]+.
Figure pat00025
반응식 6-2에 나타낸 바와 같이, 반응식 6-1에서 수득한 화합물(600mg)을 0℃에서 3시간동안 메탄올성 HCl(6mL)로 처리하였다. 혼합물을 서서히 실온으로 3시간동안 가온시켰다. 과량의 메탄올성 HCl을 증발시켜 담갈색 고체로서 BT-13 HCl(500mg)을 수득하였다.
Figure pat00026
실시예 7: BT-4 및 염
반응식 7-1에 나타낸 바와 같이, DMF(6mL) 중 3-(1H-벤즈이미다졸-2-일) 벤조산(100mg)을 0℃에서 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq), DIPEA(1eq) 및 0.5eq.의 피페라진으로 처리하였다. 그 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. TLC(10% 메탄올:DCM)는 무-극성 스폿의 형성 및 출발 물질의 부재를 나타낸다. 처리 및 에테르에 의해 세척한 후, 30mg/95%의 BT-4를 분리하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ13.0(s, 2H), 8.3(bm, 4H), 7.75(bm, 4H), 7.60(bm, 4H), 7.2(bm, 4H), 3.65(bm, 8H). LCMS-ES 527.36[M+H]+, 264.50[(M+2H)/2]++.
Figure pat00027
반응식 7-2에 나타낸 바와 같이, 30mg/95%의 BT-4를 디옥산 중 4M HCl로 3시간동안 처리하였다. 용매를 증발시키고 에테르로 세척하여, 10mg/97%의 BT-4 HCl 염을 수득하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ 8.45(bm, 4H), 7.80(bm, 8H), 7.50(bm, 4H), 3.65(bm, 8H). LCMS-ES 527.44[M+H]+, 264.50[(M+2H)/2]++.
Figure pat00028
실시예 8: BT-6 및 염
반응식 8-1에 나타낸 바와 같이, DMF(6mL) 중의 3-(1H-벤즈이미다졸-2-일) 벤조산(100mg)을 0℃에서 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq), DIPEA(1eq) 및 벤젠-1,4-디아민(0.5eq)으로 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. TLC(10% 메탄올:DCM)는 무-극성 스폿의 형성 및 출발 물질의 부재를 나타낸다. 처리 및 에테르에 의한 세척 후, 담갈색 고체(60mg)를 분리하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ13.1(s, 2H), 10.45(s, 2H), 8.75(s, 2H), 8.40(d, 2H), 8.05(d, 2H), 7.85(s, 4H), 7.70(t, 4H), 7.55(d, 2H) 7.25(quin, 4H). LCMS-ES 549.0[M+H]+ 275.1[(M+2H)/2]++.
Figure pat00029
반응식 8-2에 나타낸 바와 같이, 60mg/98%의 BT-6을 디옥산 중 4M HCl로 3시간동안 처리하였다. 용매를 증발시킨 후 에테르로 세척하여 50mg/96%의 BT-6 HCl 염을 얻었다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ 10.60(s, 2H), 9.00(s, 2H), 8.55(d, 2H), 8.30(d, 2H), 7.90(s, 4H), 7.85(m, 6H), 7.50(m, 4H). LCMS-ES 549.3[M+H]+ 275.3[(M+2H)/2]++.
Figure pat00030
실시예 9: BT-16 및 염
반응식 9-1에 나타낸 바와 같이, DMF(10mL) 중의 6-(1H-벤즈이미다졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(100mg)을 0℃에서 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq), DIPEA(3eq) 및 벤젠-1,4-디아민(0.5eq)으로 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 얼음물에 부은 후, 침전물을 여과하고 건조시켜 담갈색 고체(60mg)를 얻었다.
Figure pat00031
반응식 9-2에 나타낸 바와 같이, 화합물 BT-16(50mg)을 디옥산(3mL) 중의 HCl로 0℃에서 처리하였다. 혼합물을 실온으로 4시간동안 가온하였다. 과량의 디옥산 HCl을 증발시켜 30mg의 갈색 고체(30mg)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ11.00(s, 2H), 8.6(bm, 2H), 8.35(bm, 4H), 8.05(s, 4H), 7.85(bm, 4H), 7.40(bm, 4H). LCMS-ES 551.84[M+H]+.
Figure pat00032
실시예 10: BT-3 및 염
반응식 10-1에 나타난 바와 같이, DMF(10mL) 중의 3-(2-벤즈옥사졸일)벤조산(50mg)을 EDCㆍHCl(1.25eq), HOBt(1.25eq), DIPEA(1eq) 및 피페라진(1eq)으로 0℃에서 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 얼음물로 희석한 후, 생성된 고체를 버리고, 여과한 후, 건조시켜 BT-3 30mg을 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6) δ 8.2(bm, 4H), 7.8(bm, 4H), 7.7(bm, 4H), 7.45(bm, 4H), 3.6(bm, 8H). LCMS-ES 529.32[M+H]+.
Figure pat00033
반응식 10-2에 나타낸 바와 같이, BT-3(30mg)을 0℃에서 메탄올성 HCl(5mL) 중에서 처리하였다. 혼합물을 4시간동안 실온으로 가온시켰다. 진공하에 과량의 메탄올성 HCl을 증발시킨 후, 갈색 고체(15mg)가 형성되었다.
Figure pat00034
실시예 11: BT-5 및 염
반응식 11-1에 나타난 바와 같이, DMF(10mL) 중의 3-(2-벤즈옥사졸일)벤조산(50mg)을 EDCㆍHCl(1.25eq), HOBt(1.25eq), DIPEA(1eq) 및 벤젠-1,4-디아민(0.5eq)으로 0℃에서 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 얼음물로 희석하고, 고형물을 버리고, 여과하고, 건조시킨 후 담갈색 고체(30mg)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, TFA), δ9.2(bs, 2H), 8.8(bm, 2H), 8.6(bm, 2H), 7.9(bm, 14H).
Figure pat00035
반응식 11-2에 나타낸 바와 같이, 35mg의 BT-5를 HCl 디옥산(5mL) 중에서 0℃에서 처리하였다. 혼합물을 4시간동안 실온으로 가온시켰다. 진공하에 과량의 디옥산을 증발시킨 후, 담갈색 고체(15mg)가 형성되었다. 1H NMR(300MHz, TFA), δ9.3(bs, 2H), 8.8(bm, 2H), 8.6(bm, 2H), 7.9(bm, 14H).
Figure pat00036
실시예 12: BT-17 및 염
반응식 12-1에 나타낸 바와 같이, DMF(10mL) 중 6-(벤즈옥사졸-2-일)피리딘-2-카르복실산(100mg)을 EDCㆍHCl(1.5eq), HOBt(1.5eq) DIPEA(1.2eq) 및 벤젠-1,4-디아민(0.5eq)으로 0℃에서 처리하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 얼음물로 희석하고, 고형물을 버리고, 여과하고, 건조시킨 후 담갈색 고체(70mg)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, TFA), δ 8.85(dd, 4H), 8.55(t, 2H), 8.1(bm, 4H), 7.95(m, 4H), 7.85(s, 4H). LCMS-ES 553.28[M+H]+.
Figure pat00037
반응식 12-2에 나타낸 바와 같이, BT-17(60mg)을 디옥산 HCl(10mL) 중에서 0℃ 내지 실온에서 4시간동안 처리하였다. 동결 건조기를 사용하여 용매를 증발시킨 후, 담갈색 고체(45mg)를 형성하였다. 1H NMR(400MHz, TFA), δ 8.90(bm, 4H), 8.6(bm, 2H), 8.0(bm, 10H).
Figure pat00038
실시예 13: BT-ABA-25
BT-ABA-25의 구조는 반응식 13-1에 나타나 있다. BT-ABA-25는 LANCL2의 리간드이다(도 1b). LANCL2에 대한 예측 결합 친화력은 -7.5이며, SPR에 의해 확인된 친화도는 1.77e-04의 Kd 값을 갖는다.
Figure pat00039
실시예 14: BT-ABA-5a
반응식 14-1에 나타낸 바와 같이, Et3N(2ml) 중의 8-비닐-1,4-디옥사스피로[4.5]데칸-8-올(200mg, 1eq) 및 메틸 5-브로모푸란-2-카르복실레이트(1.5eq)를 아르곤으로 10분동안 탈기시켰다. 그 다음, Pd(OAc)2(0.025eq), DPPF(0.05eq)를 첨가하고, 다시 10분동안 탈기시켰다. 생성된 반응 혼합물을 100℃에서 16시간동안 가열하였다. 컬럼 크로마토그래피(EtOAx/헥산 3:7)에 의해 담갈색 고체(130mg)를 분리하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ7.30(d 1H), 6.60(d 1H), 6.45(dd, 2H), 4.75(s, 1H), 3.85(s, 4H), 3.80(s, 3H), 1.85(m, 2H), 1.65(m, 2H), 1.50(m, 4H), LCMS-ES 291.34[M+H]+.
Figure pat00040
반응식 14-2에 나타낸 바와 같이, THF:H2O:MeOH(2:1:0.5mL) 중의 반응식 14-1에서 생성된 화합물 100mg(화합물 4)의 용액에 LiOH(3eq)를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 감압하에 농축시키고 조 생성물을 최소량의 물에 용해시키고, 2N HCl로 pH 4까지 산성화하였다. 화합물을 EtOAc로 추출하고, 농축시켜 담갈색 고체(54mg)를 수득하였으며, 이를 추가의 정제없이 다음 반응(반응식 14-3)을 위해 사용하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ7.50(d 1H), 6.60(d 1H), 6.45(dd, 2H), 4.75(s, 1H), 3.85(s, 4H), 3.80(s, 3H), 1.85(m, 2H), 1.65(m, 2H), 1.50(m, 4H). LCMS-ES 277.26[M+H]+.
Figure pat00041
반응식 14-3에 나타낸 바와 같이, 3N HCl 0.1㎖를 THF 중 화합물 5(50㎎)에 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 실온으로 가온시켰다. TLC는 SM의 부재 및 무-극성 스폿을 나타낸다. 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 물로 희석하고, EtOAc로 추출하고, 재-농축시켜 갈색 고체(20mg)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ13.00(bs 1H), 7.20(d 1H), 6.95(d 1H), 6.60(d 1H), 6.45(d, 1H), 6.10(t, 1H), 3.05(m, 2H), 2.65(t, 2H), 2.5,(2H). LCMS-ES 233.21[M+H]+ LCMS-ES 231.27 [M-H]-463.15 [2M-H]-.
Figure pat00042
실시예 15: BT-ABA-6
반응식 15-1에 나타낸 바와 같이, 8-비닐-1,4-디옥사스피로[4.5]데칸-8-올(500mg, 1eq), 에틸 3-요오도벤조에이트(0.8eq) 및 PPh3(0.02eq)의 용액을 아르곤으로 10분동안 탈기시켰다. 그 다음, Pd(OAc)2(0.02eq)를 첨가하고 다시 10분간 탈기시켰다. 생성된 반응 혼합물을 95℃에서 16시간동안 가열하였다. 처리 후, 담갈색 고체(500mg)를 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 3:7)로 분리하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ 7.95(s 1H), 7.80(d 1H), 7.71(d 1H), 7.47(t 1H), 6.65(d 1H), 6.49(d, 1H), 4.65(bs 1H), 4.32(q, 2H), 3.68(s, 4H), 1.99-1.68(m, 4H), 1.55-1.50(m, 4H), 1.33(t3H) LCMS-ES 315.38 [M-17]+.
Figure pat00043
반응식 15-2에 나타낸 바와 같이, THF/H2O/EtOH(4:2:1,17.5mL) 중 화합물 4(500mg)의 용액을 0℃로 냉각시키고; LiOH(2.5eq)를 첨가하고, 혼합물을 16시간에 걸쳐 실온으로 상승시키면서 교반하였다. 혼합물을 감압하에 농축시키고, 조 생성물을 최소량의 물에 용해시키고, 1N HCl로 pH 3-4까지 산성화시켰다. 칼럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 1:1)로 정제하여 담황색 고체(220mg)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ13.00(bs 1H), 7.95(s 1H), 7.78(d 1H), 7.67(d 1H), 7.44(t 1H), 6.64(d 1H), 6.48(d, 1H), 4.65(s 1H), 3.86(s, 4H), 1.87-1.61(m, 4H), 1.55-1.50(m, 4H). LCMS-ES 287.34 [M-17]+.
Figure pat00044
반응식 15-3에 나타낸 바와 같이, THF 중 100mg의 화합물 5(100mg)의 혼합물에 2N HCl(1.5mL)을 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 실온으로 가온시켰다. 이어서, 용액을 감압하에 농축시키고, 물로 희석하고, EtOAc로 추출하고, 및 재-농축하여 담황색 고체(20mg)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6), δ13.00(bs 1H), 8.00(s, 1H), 7.80(d 1H), 7.65(d 1H), 7.45(t 1H), 6.75(d 1H), 6.45(d, 1H), 6.10(t,1H), 5.15(s 1H), 2.65(m, 2H), 2.15(m, 2H), 1.90(m, 4H), LCMS-ES 259.37 [M-H]- 519.48 [2M-H]-.
Figure pat00045
실시예 16: BT-ABA-13
반응식 16-1에 나타낸 바와 같이, CH2Cl2(50mL) 중 화합물 2(2.5g, 1eq)의 용액에 0℃에서 교반하면서 디히드로피란(1.3eq) 및 TsOH(0.1eq)를 첨가하였다. 생성된 용액을 14시간동안 서서히 실온으로 가온시켰다. 담황색 액체를 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 1:9)에 의해 분리하였다. 화합물을 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
Figure pat00046
반응식 16-2에 나타낸 바와 같이, 화합물 3(2.5g, 1.0eq), 4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란(1.2eq) 및 비스(시클로펜타디에닐)지르코늄 클로라이드 하이드라이드(0.15eq)를 Et3N에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 60 내지 70℃에서 16시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 헥산으로 희석하였다. 침전물을 실리카 겔의 짧은 패드상에서 여과하여 제거하고, 헥산으로 세척하였다. 헥산 용액이 농축되면, 무색의 유성 액체(1.3g)가 얻어졌다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 6.60(d 1H), 5.60(d 1H), 6.35(d, 1H), 4.75(s, 1H), 3.85(s, 3H), 2.80(m, 2H), 2.35(m, 2H), 2.05(m, 4H).
Figure pat00047
반응식 16-3에 나타낸 바와 같이, DME/H2O 9:1(8mL)의 혼합물 중 화합물 4(550mg, 1.1eq), 메틸 6-브로모피콜리네이트(1.0eq), K2CO3(2.0eq)의 용액을 아르곤으로 10분간 탈기시켰다. 이어서, Pd[(P(Ph)3]4(0.04eq)를 가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 16시간 가열하였다. 반응 용액을 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 1:3)에 의해 담황색 고체(230mg)를 수득하였다. LCMS-ES 404.39[M+H]+, 302.26[M-101]+.
Figure pat00048
반응식 16-5에 나타낸 바와 같이, 아세톤/H2O 1:1(6mL) 중의 화합물 5(230mg, 1.0eq)의 용액에 TsOH(0.1eq)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 반응 혼합물의 농축 후, 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 7:3)에 의해 담황색 액체(110mg)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 8.00(d 1H), 7.80(t, 1H), 7.50(d, 1H), 6.90(m 2H), 4.00(s, 3H), 2.80(m, 2H), 2.35(m, 2H), 2.10(m, 4H), LCMS-ES 276.38[M+H]+.
Figure pat00049
반응식 16-6에 나타낸 바와 같이, THF/H2O 3:1(3mL) 중 화합물 6(75mg)의 용액에 LiOH(2.5eq)를 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 시트르산으로 산성화시키고 THF 및 EtOAc의 혼합물로 추출하였다. 유기 용액을 농축시켜 회백색 고체(10mg)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ13.05(bs, 1H), 7.90(m, 2H), 7.65(d, 1H), 7.05(d, 1H), 6.80(d, 1H), 5.20(s, 1H), 2.65(m, 2H), 2.20(bd 2H), 2.10-1.90(m, 4H), LCMS-ES 262.27[M+H]+.
Figure pat00050
실시예 17: BT-ABA-16
반응식 17-1에 나타낸 바와 같이, DME/H2O 9:1(8mL)의 혼합물 중 화합물 4(437mg, 1.2eq), 메틸 2-브로모이소니코티네이트(1.0eq), K2CO3(2.0eq)의 용액을 아르곤으로 10분동안 탈기시켰다. 이어서, Pd[(P(Ph)3]4(0.04eq)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 90℃에서 12시간 가열하였다. 반응액을 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 1:3)에 의해 담황색 고체(300mg)를 얻었다. 1H NMR(300MHz, CDCl3), δ 8.70(d, 1H), 7.85(s, 1H), 7.65(d, 1H), 6.85(d, 1H), 6.65(m, 1H), 4.70(m, 1H), 3.95(m, 4H), 2.20-1.40(m, 16H), LCMS-ES 404.54[M+H]+, 302.53[M-101]+.
Figure pat00051
반응식 17-2에 나타낸 바와 같이, 아세톤/H2O 1:1(6mL) 중의 화합물 5(300mg, 1.0eq)의 용액에 TsOH(0.1eq)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 RT에서 48시간동안 교반하였다. 반응 혼합물의 농축 후 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 7:3)에 의해 회백색 고체(160mg)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6) δ 8.70(d, 1H), 7.85(s, 1H), 7.65(d, 1H), 7.05(d, 1H), 6.85(d, 1H), 5.20(s, 1H), 3.90(s, 3H), 2.65(td, 2H), 2.15(bd, 2H), 2.00(m, 2H), 1.85(m, 2H), LCMS-ES 276.22 [M+H]+.
Figure pat00052
반응식 17-3에 나타낸 바와 같이, THF/H2O 3:1(3mL) 중 화합물 6(100mg)의 용액에 LiOH(2.5eq)를 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 시트르산으로 산성화시키고 THF 및 EtOAc의 혼합물로 추출하였다. 감압하에 농축하여 회백색 고체(20mg)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6), δ13.60(bs, 1H), 8.70(d, 1H), 7.85(s, 1H), 7.60(d, 1H), 7.00(d, 1H), 6.85(d, 1H), 5.20(s, 1H), 2.65(m, 2H), 2.20-1.80(m, 6H), LCMS-ES 262.28[M+H]+.
Figure pat00053
실시예 18: BT-ABA-14
반응식 18-1에 나타낸 바와 같이, DME/H2O 9:1(8mL)의 혼합물 중 화합물 4(300mg, 1.2eq), 메틸 4-브로모피콜리네이트(1.0eq), K2CO3(2.0eq)의 용액을 아르곤으로 10분동안 탈기시켰다. 이어서, Pd[(P(Ph)3]4(0.04eq)를 첨가하였다. 그 생성된 반응 혼합물을 90℃에서 12시간 가열하였다. 반응액을 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산 1:3)에 의해 담황색 액체(200mg)를 얻었다.1H NMR(300MHz, CDCl3), δ 8.50(d, 1H) 8.20(bs, 1H) 7.45(d, 1H) 6.70(d, 1H) 6.50(d, 1H), 4.60(m, 1H), 3.95(m, 4H), 2.20-1.40(m, 16H), LCMS-ES 390.35[M+H]+.
Figure pat00054
반응식 18-2에 나타낸 바와 같이, 아세톤/H2O 1:1(6mL) 중 화합물 5(200mg, 1.0eq)의 용액에 TsOH(0.1eq)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 48시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 시트르산으로 산성화시키고, THF 및 EtOAc의 혼합물로 추출하였다. 용액을 농축시켜 회백색 고체(18mg)를 수득하였다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d 6) δ 8.60(d, 1H) 8.05(s, 1H) 7.60(d, 1H) 6.90(d, 1H) 6.70(d, 1H) 5.20(bs, 1H), 2.65(m, 2H), 2.15(bd, 2H), 2.05-1.80(m, 4H), LCMS-ES 262.27[M+H]+.
Figure pat00055
수용체 결합 실시예들
실시예 19: LANCL2 결합 실시예
전산 모델링 연구와 생화학적 검증을 조합하여, LANCL2에 결합하는 화합물에 대한 선택을 유도했다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술의 최신 반복은 실시간으로 라벨-없는 단백질과 소분자들(> 25Da) 사이의 분자 상호 작용을 결정하는 시험 관내, 고효율, 정량적 수단을 제공한다. BIACORE™ T200(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 기술은 GMP/GLP 준수 및 24시간 이내의 시간 내에 세부적인 적정 또는 스크린의 자율적인 대규모 데이터 수집의 추가 혜택을 제공한다. 관심있는 분자 상호작용은 BIACORE™ T200 SPR 기술에 의해 정기적으로 검증된다.
방법들
LANCL2-화합물 상호 작용의 분자 모델링을 통한 고효율 스크리닝. Auto-Doc Vina [14]는 LANCL2-식물성 화합물(botanical compound) 결합을 확인하기 위해 고효율 병렬 계산이 가능한 최첨단 소프트웨어 스위트이다. 소프트웨어 스위트는 먼저 (i) 결합된 복합체와 관련된 자유 에너지의 힘 및 (ii) 표적과 리간드 사이의 복합체 형성에 이용가능한 구조적 공간을 계산한다. 이 방법들은 본래 확률적이므로 모든 파라미터 공간을 철저히 검색하고 예측에 확신을 주기 위해 반복적인 독립 스크린이 필요한다. 현재 LANCL2의 모델은 LANCL1의 상동성 모델링을 통해 이용 가능하다[15]. AutoDock 및 AutoGrid의 그래픽 프론트-엔드(front-end)인 AutoDockTools는 그리드 상자 중심 및 x, y, z-치수를 포함하여 검색 공간을 정의하는데 사용되었다[16]. AutoDock Vina는 각 화합물에 대해 5개의 결합된 형태를 생성했다. 도킹은 전체 단백질 타겟에 적용되며, 그리드는 단백질의 전체 표면을 덮는다. 도킹 로그 파일은 모든 표면에 대한 모든 화합물에 대해 예측된 결합 모드의 결합 에너지로 구성되어 생성되었다.
LANCL2-소분자 상호 작용의 동역학적 측정. BIACORE™ T200은 소분자 BT-11, BT-ABA-5a, BT-6 및 BT-15(분석물)의 LANCL2(리간드)에 대한 결합에 대한 동역학적 파라미터를 측정하는데 사용되었다. 데이터는 용량 의존적(5-8 적정점) 방식으로 3 배로 생성되고, 결합 모델(랑 뮤어, 배좌 이동(conformational shift) 등), 실시간 연합 및 해리 상수, 및 평형 해리 상수를 결정하기 위해 분석되었다. SPR 기술은 특정 LANCL2-식물화학적 상호작용의 검증을 허용할 뿐만 아니라 결합기작 및 속도에 대한 금본위(gold-standard) 통찰력을 얻었다. 이 실험은 아민 결합에 의해 LANCL2를 공유 결합시킴으로써 카르복시메틸덱스트란(CM5) 센서 칩상에서 수행되었다. 센서 칩의 유동 세포 1과 2를 0.1M N-히드록시숙신이미드(NHS)와 0.5M 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC)의 1:1 혼합물로 10μl/분에서 720초동안 활성화시켰다. 스톡 LANCL2(0.41mg/mL)를 10mM 아세트산나트륨, pH 5.0에서 8.2μg/mL(1:50 희석)로 희석하고, 10μL/분의 유속으로 1000초동안 활성화 유동 세포 2 표면 상에 주입했다. 플로우 셀 2(11000RU) 상에서 LANCL2를 포획한 후, 1M 에탄올아민을 10㎕/분으로 720초동안 주입하여, 유동 세포 1 및 2의 표면을 비활성화시켰다. 실행 버퍼는 0.05% T-20 및 0.15M NaCl를 함유하는 pH 6.5의 25mM MOPS였다. 동역학적 연구는 다른 농도의 BT-11(25μM, 12.5μM, 6.25μM, 3.13μM, 1.56μM 및 0.76μM), BT-ABA-5a(40μM, 20μM, 10μM, 5μM, 2.5μM 및 1.25μM) 및 BT-15/BT-6(20μM, 10μM, 5μM, 2.5μM, 1.25μM, 0.625μM, 및 0.313μM)을 3배 주입하여 수행하였다. 각 샘플을 60초(접촉시간)동안 주입한 다음 100μL/분의 유속에서 60초의 해리시간을 가졌다. 다음 주사 이전에 180초의 안정화 시간이 사용되었다. 데이터를 BIACORE™ T200 평가 소프트웨어(버전 1)로 분석하여 1:1 결합 모델을 사용하여 친화도 결합 상수(KD)를 측정했다.
결과들
BT-11과 BT-15는 모두 LANCL2에 강력하게 결합된다. LANCL2 단백질에 대한 BT-11 및 BT-15의 결합을 확인하기 위해, BIACORE™ T-200 기기에서 SPR 분석을 수행했다. 분자 상호작용을 검출하기 위해 사용되는 광학 기술인 SPR을 사용하여 LANCL2와 그의 리간드(즉, BT-11 및 BT-15) 사이의 결합 친화도를 측정하였다. 본 발명자들은 BIACORE™ 센서 칩 상에 정제된 재조합 LANCL2 단백질을 고정화시키고, 장비의 마이크로유체 시스템을 사용하여 단백질 표면 위에 소분자를 주입했다. 칩 표면의 총 질량 변화를 측정했는데, 이는 단백질에 대한 작은 결합에 해당한다. 일련의 소분자 농축액을 주입함으로써 본 발명자들은 LANCL2에 대한 BT-11 결합 및 LANCL2에 대한 BT-15 결합에 대한 정상 상태 결합 친화도를 계산할 수 있었다. 결합 센서그램은 매우 빠른 온(on) 속도와 매우 빠른 오프(off) 속도로 전형적인 소분자 단백질 상호작용을 보여주었다(도 8, 패널 A 및 C). 이러한 빠른 상호작용은 장비의 기술적 능력을 뛰어 넘는다. 따라서, 신뢰성있는 연합속도 상수(k a ) 및 해리 속도 상수(k d )는 측정되지 않았다. 평형 해리 상수(K D )는 일반적으로 리간드가 특정 단백질에 얼마나 강하게 결합하는지 등 리간드와 단백질 간의 친화도를 설명하기 위해 사용된다. 리간드-단백질 친화도는 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 및 반 데르 발스 힘과 같은 2 분자들 사이의 비공유 분자간 상호작용에 의해 영향을 받는다. 화합물 농도에 대한 평형 결합 수준을 플로팅함으로써, 본 발명자들은 각 상호 작용에 대한 정상 상태 친화도(K D )을 측정할 수 있었다(도 8, 패널 B 및 D). 두 소분자 모두 LANCL2에 대하여 유사한 결합 친화도를 보였다(BT-11: 7.7uM, BT-15 11.4uM).
BT-ABA-5a 및 BT-6은 LANCL2에 강력하게 결합한다. 상기 결과와 유사하게 BT-6 및 BT-ABA-5a가 LANCL2에 결합하는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 BIACORE™ T-200 장치에서 SPR 분석을 수행하였다. 이 경우 본 발명자들은 BIACORE™ 센서 칩에 정제된 재조합 LANCL2 단백질을 고정화시키고, 장비의 마이크로유체 시스템을 사용하여 단백질 표면 위에 소분자를 주입했다. 칩 표면의 총 질량 변화를 측정했는데, 이는 단백질에 대한 작은 결합에 해당한다. 결합 센서그램(도 9a 및 9b)을 면밀히 살펴보면, BT-6/BT-ABA-5a가 BT-11/BT-15와 비교하여 얼마나 빨리 결합하지만 오프시에는 빠르지 않은지를 보여주며, 이는 온에서는 매우 빠르고, 오프에서는 매우 빠르다. 참고로, BT-ABA-5a의 점유 시간은 가장 느린 오프 속도를 나타내며, 이는 BT-ABA-5a가 LANCL2의 결합 포켓에서 가장 오래 머물러 있음을 의미한다. 이 더 긴 결합은 잠재적으로 보다 효과적인 항-염증 및 항-당뇨병 및 다른 치료 반응을 유발함으로써 LANCL2 경로의 활성화에 영향을 줄 수 있다.
다른 화합물들은 SPR을 통해 시험되며, 및 그 결과들은 도 1a 및 1b에 상세하게 도시된다.
실험연구 실시예들
실시예 20: IBD의 급성 모델 상에서 BT-11의 용도
도입
만성의 재발성 위장관 질환인, 염증성 장 질환(IBD)으로 인해, 미국에서 140만명이 넘는 사람들을 고통받고 있다. IBD는 궤양성 대장염과 크론병이라는 두 가지 증상을 포함한다. IBD에 대한 현재의 치료법은 적당하게 성공적이며, 질환의 장기적인 관리에 심각한 부작용을 가지고있다[17]. 크론병은 만성 병변을 나타내지만, 급성 궤양성 대장염(UC)은 결장 조직에 영향을 미치는 초기 병리학적 증상으로 나타난다. UC는 직장내 점막의 염증을 특징으로하는 위장관의 만성 특발성 염증성 질환으로 지속적인 형태로 대장을 통해 근위로 확장되지만 범위는 다양한다. 이 질환은 재발 및 진행되는 다양한 중증도로 특징 분석된다. 대다수의 환자는 가벼운 정도부터 중등도 정도의 심한 정도의 좌측 또는 원위부 질환을 앓고 있다. 대부분은 유지 관리 의료치료를 통해 오랜 기간동안 완화되어 있다. 그러나 자연사에 대한 연구에 따르면 10~40%는 그들의 질환의 진행과정 중 일부 지점에서 결장 절제술을 받게 된다.
스테로이드 내성 중증의 UC의 치료는 구출제로 시클로스포린(ciclosporin)과 인플릭시맙(infliximab)을 모두 사용할 수 있게 하여 최근 몇 년동안 확장되어왔지만; 여전히 수술이 유일한 "치유적" 치료법으로 남아 있다. 본 발명은 LANCL2라는 신규한 수용체를 표적으로 하여 UC를 치료하기 위한 신규 약제를 제공한다. 본원의 선두 화합물인 BT-11은 경구로 투여되고, 전신으로 분포하며, 장내 면역세포에서 LANCL2를 표적으로 하여 급성 UC에서 면역조절 효과를 나타낸다. 마우스의 급성 UC에 대한 전-임상 효능 연구는 BT-11 투여가 질환 활성도를 감소시키고, 소화관 점막의 백혈구 침윤을 현저히 감소시킬 뿐만 아니라 점막의 비후화 및 상피 미란을 감소시킴으로써 소화관 염증을 개선하는 방법을 보여줬다. 유전자 발현 분석 결과, BT-11의 경구 투여가 IL-10 및 LANCL2의 발현을 상향 조절하고, 마우스에서 급성 DSS-유발 궤양성 대장염의 모델에서 TNFα mRNA의 발현을 하향 조절한다는 것을 확인하였다.
방법들
마우스. C57BL/6은 Jackson Laboratory에서 구입하여 환기된 랙에서 특정 병원균이 없는 상태로 보관했다. LANCL2-/-마우스는 California Davis 대학교의 KOMP 저장소에서 구입했다. 모든 마우스는 동물 시설에서 유지되었다. 모든 실험 계획서는 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아, 실험실 동물 복지 및 공중 보건 서비스 정책 연구소의 국립 보건원(National Institutes of Health Office) 지침을 충족하거나 초과했다.
DSS-유도된 대장염. 식수에 5%(w/v) 덱스트란 황산나트륨(DSS; 분자량 42kDa; ICN Biochemicals, Aurora, OH)을 투여하여, C57BL/6J 마우스에서 대장염을 유도하였다. 대장 염증은 DSS 치료 7일 후에 평가되었다. DSS 프로젝트의 그룹은 i.비-DSS 부형제-처리된 마우스, ii.비-DSS, BT-11(80mg/Kg)-처리된 마우스, iii.DSS-처리된, 부형제-처리된 마우스 및 iv.DSS-처리된, BT-11(80mg/Kg)-처리된 마우스로 구성되었다. 12마리의 마우스가 각 그룹에 포함되었다.
병리학. 마우스의 IBD 연구에서 나온 결장 절편을 10% 완충 중성 포르말린에 고정시킨 다음, 나중에 파라핀에 끼운 후, 절편(5μm)으로 조직 검사를 위해 H&E 염색으로 염색하였다. 결장은 (1)백혈구 침윤, (2)점막 비후화 및 (3)상피세포 미란의 정도를 포함하는 복합 조직학적 점수로 등급을 매겼다. 섹션은 이전 카테고리 각각에 대해 0-4의 점수로 등급이 매겨졌고 데이터는 정규화된 합성 점수로 분석되었다.
정량적 실시간 PCR. 제조회사의 지침에 따라 RNEASY PLUS MINI KIT(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 마우스 결장에서 총 RNA를 분리하였다. ISCRIPT™ cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 총 RNA(1μg)를 사용하여 cDNA 템플릿을 생성했다. 총 반응 부피는 20μL였고, 반응액은 MJ MINI™ 열 순환기(Bio-Rad)에서 배양했으며, 25℃에서 5분, 52℃에서 30분, 85℃에서 5분, 4℃에서 유지했다. Taq DNA 중합효소(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 cDNA 상에서 PCR을 수행하였다. 각 유전자 앰플리콘을 MINELUTE PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하고, DNA 질량 사다리(mass ladder)(Promega, Madison, WI) 및 나노 드롭(nanodrop)을 사용하여 아가로스 겔상에서 정량화하였다. 실시간 PCR 조건을 최적화하고 실시간 PCR 분석에서 표준 곡선을 생성하기 위해, 상기 정제된 앰플리콘을 사용했다. 프라이머는 Oligo 6 소프트웨어를 사용하여 설계되었다. 시스템의 구배 프로토콜을 사용하여 각 프라이머 세트에 대해 ICYCLER IQ ™ 시스템(Bio-Rad)에 프라이머 농도와 어닐링 온도가 최적화되었다. PCR 효율은 최적화동안 및 또한, 샘플 DNA의 실시간 PCR동안, 각각의 프라이머 세트에 대해 92-105% 및 상관 계수 > 0.98로 유지되었다. 대상 유전자에 대한 cDNA 농도는 ICYCLER IQ™ 시스템과 IQ™ SYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 실시간 qPCR로 검사했다. 5pg의 cDNA에서 시작하는 정제된 앰플리콘의 10배 희석액을 사용하여 각 유전자에 대한 표준 곡선을 생성하고, 나중에 미지 시료에서 표적 cDNA의 개시량을 계산하는데 사용하였다. SYBR® green I은 일반적인 이중 가닥 DNA 삽입 염료이므로 관심 대상인 앰플리콘 외에도 비특이적인 제품 및 프라이머/다이머를 검출할 수 있다. 실시간 PCR동안 합성된 생성물의 수를 결정하기 위해, 각각의 생성물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하였다. 실시간 PCR을 사용하여 동일한 96-웰 플레이트상의 cDNA의 각각의 미지 시료의 핵산의 개시량을 측정하였다.
통계 분석. 파라미터 데이터는 ANOVA와 Scheffe의 다중 비교 방법을 사용하여 분석되었다. 비-파라미터 데이터는 Mann-Whitney의 U 검정과 Dunn의 다중 비교 검정을 사용하여 분석되었다. ANOVA는 SAS의 일반적인 선형 모델 절차 6.0.3(SAS Institute)을 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 P≤0.05에서 평가되었다.
결과들
BT-11은 대장염의 DSS 모델에서 질환 및 조직 병리학을 개선시킨다. 이 연구의 목적은 BT-11의 투여가 LANCL2를 활성화시키고, IBD와 관련하여 항-염증 특성을 발휘하는지 여부를 조사하는 것이었다. 급성 IBD 모델에서 본 발명의 화합물 BT-11의 효능을 평가하기 위해, C57BL/6J 마우스를 7 일동안 5% DSS로 처리하였다. 챌린지 기간동안 BT-11에 의한 치료는 질환 활동 점수를 상당히 개선시켰다(도 10, 패널 A). 또한 BT-11을 사용하여 LANCL2 경로의 활성화 후, 도전후 7일째 비장(도 10, 패널 B), MLN(도 10, 패널 C) 및 결장(도 10, 패널 D)의 거대 병변이 또한 유의미하게 감소하였다.
BT-11은 용량 반응 방식으로 급성 염증성 대장염을 앓는 마우스에서 결장 조직병리학을 개선시킨다. 본 발명자들은 다음으로 조직병리학적 대장 염증성 병변에 대한 BT-11의 효과를 조사했다. 우리의 질환 활동 및 육안 병변에 대한 관찰과 병행하여, 조직병리학적 분석은 백혈구 침윤(도 11, 패널 G), 상피 미란(도 11, 패널 H) 및 점막 비후화(도 11, 패널 I)의 평가에 근거하여, BT-11에 의한 치료가 위장 점막에서 염증을 5배까지 유의하게 감소시킴을 확인했다. 대표적인 결장 현미경 사진은 마우스에서 DSS-유도된 대장염동안 BT-11로 치료하면, 상피 세포의 완전성을 향상시키고 여러 가지 면역 서브셋들의 침윤뿐만 아니라 내장 조직의 파괴를 줄임으로써, 소화관 점막의 상태를 유의하게 개선시키는 것을 보여준다(도 11, 패널 A-F). 본 발명자들은 BT-11에 대한 용량-반응 연구를 수행했으며, BT-11의 투여량이 10에서 80mg/Kg으로 증가함에 따라 대장염을 갖는 마우스에서 결장 염증(백혈구 침윤, 점막 비후화 및 상피 미란)의 3가지 특징들이 어떻게 감소되었는지 흥미롭게 관찰하였다(도 12, 패널 A-C).
BT-11을 이용한 경구 치료는 TNFα의 발현을 감소시키고, LANCL2와 IL-10을 상향 조절한다. BT-11이 면역체계의 조절에 미치는 효과를 보다 면밀히 조사하기 위해, IL-10, LANCL2 및 TNFα의 유전적 발현을 평가했다. 결과는 BT-11 처리가 종양괴사인자 알파(TNFα)(도 13, 패널 A)의 발현을 하향-조절하고, 인터류킨 10(IL-10)(도 13, 패널 B) 및 LANCL2 수용체(도 13, 패널 C)의 수준을 상향 조절해서, 항-염증 효과를 촉진하고 TNFα에 의한 염증 반응을 하향-조절하는 양성 피드백 루프를 만드는 방법을 보여준다. 투여량-반응 연구를 수행함으로써, 본 발명자들은 본 리간드 BT-11과 LANCL2 경로의 다음 활성화가 직접적으로 결장 IL-10의 생산을 증가시킨다는 가설을 세울 수 있었으며, 유동성 세포 계측법에 의해 평가된 그의 표현은 BT-11에 의한 투여량-반응 동역학을 따른다(도 14, 패널 B). 본 발명자들은 결장 TNFα 발현 세포의 감소가 BT-11 40 및 80mg/Kg 모두에서 현저히 상이하지만, 10 또는 20mg/Kg와 같은 저용량에서는 유의하지 않음을 관찰했다(도 14, 패널 A). 본 발명자들은 또한, MLN에서 FOXP3 발현이 어떻게 투여량-의존적인지를 관찰했다(도 14, 패널 C).
급성 대장염에서 BT-11의 효과는 LANCL2에 따라 다르다. 마우스에서 급성 대장염에 BT-11 투여에 의한 유익한 효과가 어떻게 발휘되는지 보여주기 위해, 야생형과 LANCL2 녹-아웃(LANCL2-/-) 마우스에서 이러한 효과들을 비교하는 연구를 수행했다. 본 결과는 급성 DSS-유도된 대장염에서 마우스를 회복시키는 것을 LANCL2의 손실로 막을 수 있기 때문에, BT-11이 항-염증 효과를 발휘할 필요가 있음을 입증했다(도 15, 패널 A). 마찬가지로, LANCL2의 결손은 야생형과 LANCL2-/-를 비교할 때, 결장(도 15, 패널 B), MLN(도 15, 패널 C) 및 비장(도 15, 패널 D)에서의 거시적 점수의 감소를 저지하였다. 또한, BT-11이 결장 점막에서의 병변 형성에 미치는 영향은 LANCL2-의존적이므로, 부형제 또는 BT-11로 치료한 LANCL2-/-마우스의 조직병리학적 분석을 평가한 결과, LANCL2의 손실이 BT-11의 효과를 어떻게 완전하게 저지하였는지를 관찰했다(도 16).
BT-11에 의한 치료 후 세포 반응을 특성분석하기 위해, 본 발명자들은 전-염증성 단백질의 감소와 항-염증 인자들의 증가가 제거되었는지 여부를 결정하기 위해, LANCL2 녹아웃 연구를 추가로 수행했다. 본 실시예의 유동 세포계측 결과는 LANCL2 유전자의 결손으로 인하여 BT-11의 효과를 저지시키므로, 결장(도 17, 패널 A) 및 MLN(도 17, 패널 B) 모두에서 전-염증인자 MCP1의 감소가 LANCL2-의존적임을 보여준다. 본 발명자들은 또한 결장내 TNFα의 분비가 LANCL2-의존적이며(도 17, 패널 C), 과립구의 MHC-II+ CD11c+ 개체군을 상향 조절(도 17, 패널 D)함을 발견했다. 이러한 결과에 따라, 본 발명자들은 결장(도 17, 패널 E)과 비장(도 17, 패널 F) 모두 LANCL2 녹아웃 마우스에서 BT-11에 의한 치료 후 IL-10 분비의 상향조절이 완전히 저지된 것을 발견하였으며, 본 발명의 관심 대상과 함께 본 발명의 선두 화합물(top lead compound)의 의존성을 다시 한 번 보여준다.
논의
LANCL2는 염증 및 면역-매개 질환에 대한 새로운 치료표적으로 부상했다[18]. 본 발명의 생체내 결과는 LANCL2 리간드 BT-11에 의한 구강 치료가 염증을 억제함으로써 IBD 마우스 모델에서 장내 면역 병리학을 개선한다는 것을 처음으로 입증한다. LANCL2는 ABA 결합과 관련된 기능 및 신호 전달[19] 및 PPARγ 활성화[8]의 대안적인 막-기반의 메커니즘의 최근 발견으로 인한 잠재적인 치료 목표로주목받고 있다. 또한, 본 발명자들은 일련의 마우스 조직에서 LANCL2 발현을 결정했는데, LANCL2가 또한 뇌와 정소 외에, 다른 조직들, 예컨대 흉선, 비장, 결장, 및 파이어판에서 발현된다는 것을 보여주었으며, 이는 LANCL2와 면역반응 사이에 가능한 관계를 가리키며, 치료제로서 LANCL2의 더 넓은 가능성을 제시한다.
이전에 본 발명자들은 ABA가 시험관내에서 PPARγ를 전사활성화(transactivate)하고, 다른 PPARγ 작용제와 유사한 전신 염증을 억제한다고 보고했다. ABA와 NSC61610 모두 LANCL2를 표적으로 하기 때문에, NSC61610은 PPARγ 활성화를 통해 작용할 수도 있다. 실험 결과에 따르면, NSC61610 치료법은 원시(raw) 대식세포에서 PPARγ를 활성화시킴으로써 LANCL2와 PPARγ 사이의 잠재적인 신호전달의 증거를 제공하고, NSC61610이 시험관내에서 LANCL2-PPARγ 축을 표적으로 할 수 있음을 보여준다. PPARγ의 NSC61610-매개 활성화에서 LANCL2의 중요성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 siRNA를 사용하여 원시 대식세포에서 LANCL2를 녹다운(knocking down)하여, PPARγ 리포터 활성에 대한 NSC61610의 효과를 손상시키거나 폐기할지 여부를 결정하였다. 본 발견은 LANCL2를 녹다운함으로써 PPARγ 활성에 대한 NSC61610의 효과를 현저하게 감소시킨다는 것을 보여준다[12]. 본 실시예에서, 본 발명자들은 BT-11의 투여가 비장, MLN 및 결장의 질환 활성도의 점수 및 거시 점수(도 10)를 감소시킬 뿐만 아니라 조직병리학적 병변(도 11)을 상당히 감소시킴으로써 항-염증 특성을 어떻게 발휘하는지를 입증한다. 본 발명자들은 이 두 가지 특정 효과들이 LANCL2에 어떻게 의존하는지를 보여주었다(도 15 및 도 16). 본 발명자들은 또한 BT-11이 TNFα의 수준을 감소시키고, LANCL2와 IL-10 모두를 상향 조절한다는 것을 입증했다(도 13). 본 발명자들은 LANCL2-/-마우스에서 이러한 경향을 관찰하지 못했기 때문에 그 효과들이 LANCL2-의존성이 있다는 것을 증명했다(도 17). 이러한 결과는 LANCL2가 염증성 질환에 대한 새로운 치료 목표이고, BT-11이 이를 목표로 하는 화합물임을 확인시킨다.
실시예 21: 만성 크론병 모델에 있어서 BT-11의 용도
도입
상기한 바와 같이, 두가지 임상 증상인 궤양성 대장염 및 크론병을 갖는 염증성 장 질환(IBD)은 위장관의 광범위한 염증 및 면역세포침윤을 특징으로 하는 면역-매개 질환이다. IBD의 원인은 다 요인적이며, 유전적 소인, 환경 요인 및 내장 미생물군 간의 상호 작용을 수반한다.
본 실시예는 IBD의 만성 징후인, 크론병에 초점을 맞출 것이다. 궤양성 대장염의 염증은 표재성 점막 및 점막하 층을 포함하지만, 결장에 국한되는 연속적인 패턴을 특징으로 하며, 크론병에서는 이 염증이 경벽성이며, 불연속적이고, 장의 모든 부위가 회장을 넘어 영향을 받을 수 있으며 이것이 가장 영향을 받는다. 크론병의 병인은 복잡하고, 유전적 및 환경적 요인 및 점막 면역계의 장기간 활성화에 의해 유도된 장 점막에 대한 면역-매개 손상에 의해 영향을 받는다.
면역 및 염증반응을 하향조절하는 치료법, 예컨대 코르티코스테로이드 프레드니손 또는 항-종양괴사인자-α 항체인 REMICADE®(Janssen Biotech, Inc., PA, Horsham, PA)(인플릭시맙(infliximab))는 질환의 중증도와 재발율을 줄일 수 있는 가능성을 보여주었다. 그러나 이러한 치료법은 또한 쿠싱양(cushingoid) 외양, 체중 증가 및 전신 면역억제와 같은 다양한 부작용들과 관련되어있어, IBD의 장기 관리를 위한 보다 안전한 대안을 개발할 필요성을 강조한다[20].
본 발명은 LANCL2라는 신규한 수용체를 표적으로 하여, 크론병을 치료하기 위한 신규한 약제를 제공한다. 예시 화합물, BT-11은 경구 투여되고 전신분포되어, 내장 면역세포에서 LANCL2를 표적으로 하여 UC 뿐만 아니라 크론병에서도 면역조절효과를 발휘한다. 마우스의 만성 크론병 모델에서 본 전-임상 효능 연구는 BT-11 투여가 질환 활성도를 감소시키고, 내장 점막의 백혈구 침윤을 현저하게 감소시킬 뿐만 아니라 점막의 비후화 및 상피 미란을 감소시켜, 장의 염증을 어떻게 감소시키는지를 보여주었다. 유전자발현 분석 결과, BT-11의 경구 투여가 LANCL2의 발현을 상향조절하고, 마우스의 만성 IBD 모델에서 TNFα mRNA의 발현을 하향 조절한다는 것을 확인했다. 더욱이, BT-11의 투여는 결장 고유판(colonic lamina propria) 뿐만 아니라 결장내 상향조절된 FOXP3-발현 CD4+ T 세포 및 하향조절된 수의 이펙터 Th1 세포들로의 전 염증성 대식세포 및 수지상 세포 침윤을 감소시킨다. 본 발명자들은 또한 이러한 효과가 LANCL2-의존성임을 확인하기 위해, 녹아웃 연구를 수행하였다. 마지막으로, 유도 부위에서 BT-11은 Th17 세포의 생성을 하향조절할 뿐만 아니라 FOXP3 발현의 상향조절을 통해 조절 CD4+ T 세포 구획을 상향조절할 수 있다.
방법들
마우스. C57BL/6 및 IL-10 녹아웃 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하여 환기된 랙에서 특정 병원균이 없는 상태로 보관했다. LANCL2-/-마우스는 California Davis 대학교의 KOMP 저장소에서 구입했다. 모든 마우스는 동물 시설에서 유지되었다. 모든 실험 계획서는 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아, 실험실 동물 복지 및 공중 보건 서비스 정책 연구소의 국립 보건원(National Institutes of Health Office) 지침을 충족하거나 초과했다.
CD4+ T 세포 농축 및 분류. C57BL/6J(야생형) 마우스로부터 얻은 비장세포를 I-Mag 세포분리 시스템(BD Pharmingen)을 사용하여 자성 음성 분류에 의해 CD4+ T 세포를 농축시켰다. 세포를 비오틴화 Ab의 혼합물과 함께 배양한 다음, 스트렙타비딘 입자와의 2차 배양을 수행하고, 자석에 노출시켜, 원치않는 세포를 제거하였다. CD4+가 강화된 세포 현탁액의 순도는 93% 내지 96%였다. CD4-풍부한 세포는 입양전달을 위해 사용되었으며, 또는 FACS에 의해 더 정제되었다. FACS 선별을 위해, 세포를 CD45RB, CD4 및 CD25로 표지하고 FACSARIA™ 세포 분류기(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 CD4+ CD45RBhigh CD25- 세포(즉, 작동자 T 세포)로 분리하였다. FACS-분류된 CD4+ 서브셋의 순도는 98% 이상이었다.
입양전달. 6주령 SCID 및 RAG2-/-마우스에게 C57BL/6J(야생형) 또는 LANCL2-/-마우스로부터 4x105 CD4 + CD45RBhigh CD25-를 복강내(i.p.) 투여하였다. 마우스를 주당 기준으로 측정하고, 질환의 임상 증상을 14주동안 매일 기록하였다. 질환을 낭비하는 심각한 징후를 보인 마우스는 희생되었다. 그렇지 않으면, 마우스는 입양후 90일 후에 희생되었다. 입양전달 연구 그룹은 다음과 같이 진행되었다: i.처리된, 비-전달된 부형제, ii.비-전달된 BT-11(80mg/Kg), iii.전달된 부형제, iv.치료된, 전달된 BT-11(80mg/Kg). 12마리의 마우스를 각 그룹에 사용하였다.
조직병리학. 마우스의 IBD 연구에서 나온 결장 절편을 10% 완충 중성 포르말린에 고정시킨 다음, 나중에 파라핀에 끼우고, 절편(5μm)으로 조직 검사를 위해 H&E 염색으로 염색하였다. 결장은 (1)백혈구 침윤, (2)점막 비후화 및 (3)상피세포 미란의 정도를 포함하는 복합 조직학적 점수로 등급을 매겼다. 섹션은 이전 카테고리 각각에 대해 0-4의 점수로 등급이 매겨졌고, 데이터는 정규화 합성 점수로 분석되었다.
세포 분리. 비장과 장간막 림프절(MLN)을 잘라내고, 2개의 멸균 현미경슬라이드의 반투명 끝단을 사용하여 1X PBS/5% FBS에 짓눌렀다. 단일 세포 현탁액을 300 x g에서 10분간 원심분리하고 1 x PBS로 1회 세척하였다. 적혈구는 세척 단계전에 삼투분해에 의해 제거하였다. 모든 세포 펠렛을 FACS 완충액(5% FBS 및 0.09% 나트륨 아지드가 보충된 1 x PBS)에 재현탁시키고, 유동 세포계측법 분석을 수행하였다. 이와 병행하여, 결장을 잘라내고,고유판 백혈구(LPL를 분리시켰다. 조직편들을 CMF(1xHBSS/10% FBS/25mM Hepes)로 세척하고, 조직을 37℃에서 15분동안 교반하면서 CMF/5mM EDTA로 2회 배양하였다. 1X PBS로 세척한 후, 조직을 37℃에서 1.5시간동안 교반하면서, 300U/ml 타입 VIII 콜라게나제 및 50U/ml DNAse I(Sigma-Aldrich)로 보충한 CMF에서 추가로 소화시켰다. 상등액을 여과한 후, 세포를 1XPBS로 1회 세척하고, 펠렛을 FACS 완충액에 재현탁시키고 유동 세포계측법 분석을 수행하였다.
유동 세포 계측법에 의한 면역표현형분석 및 사이토카인 분석. 면역세포 서브셋의 형광 염색을 위해, 4-6×105 세포를 형광염색체-결합 주 마우스 특이 항체: 항-CD3 PE-Cy5 클론 145-2C11(eBioscience, San Diego, CA), 항-CD4 PE-Cy7 클론 GK1.5(eBioscience), 항-CD4 APC 클론 RM4-5 및 항-CD25 비오틴 클론 7D4(BD Biosciences)와 함께 20분동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액(5% FBS 및 0.09% 나트륨 아지드가 보충된 1X PBS)로 세척하였다. 전사 인자 및 사이토카인의 세포내 염색을 위해, 제조자의 지침(eBioscience)에 따라 시판중인 키트를 사용하여 세포를 고정시키고, 투과시켰다. 간단히 말하면, 세포를 고정시키고 20분동안 투과시키고, Fc 수용체를 마우스 항-CD16/CD32 FcBlock(BD Biosciences)로 차단시키고, 세포를 항-마우스, FOXP3 FITC 클론 FJK-16s, 항-마우스 ROR 감마(t)PE, 클론 B2B 및 항-마우스 IL17-A APC, 클론 eBio17B7(eBioscience)쪽으로, 형광색소-접합된 항체들에 의해 염색하였다. 모든 샘플은 FACS Aria 유동 세포계측기(BD Biosciences)에서 수집할 때까지 4℃ 암실에서 고정 보관했다. 세포가 특정 마커들의 발현에 대해 분석되기 전에, 모든 샘플에 생세포 게이트(FSC-A, SSC-A)를 적용하여 단일 세포 게이팅(FSC-H, FSC-W)을 수행했다. 데이터 분석은 FACS DIVA™(BD Biosciences) 및 Flow Jo(Tree Star Inc.)를 사용하여 수행되었다.
정량적 실시간 PCR. 제조사의 지시에 따라 RNEASY PLUS MINI KIT(Qiagen)를 사용하여 마우스 콜론으로부터 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA(1μg)는 ISCRIPT™ cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하여 cDNA 주형을 생성하는데 사용되었다. 총 반응 부피는 20μL 였고, 반응은 MJ MINI™ 열 순환기(Bio-Rad)에서 이하와 같이 배양하였다: 25℃에서 5분, 52℃에서 30분, 85℃에서 5분, 및 4℃에서 고정. PCR은 Taq DNA 중합효소(Invitrogen)를 사용하여 cDNA상에서 수행하였다. 각 유전자 앰플리콘을 MINELUTE PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하고, DNA 질량 사다리(Promega) 및 나노 드롭을 사용하여 아가로스 겔 모두에서 정량화하였다. 실시간 PCR 조건을 최적화하고, 실시간 PCR 분석에서 표준 곡선을 생성하기 위해 이들 정제된 앰플리콘을 사용했다. 프라이머는 Oligo 6 소프트웨어를 사용하여 설계되었다. 프라이머 농도와 어닐링 온도는 시스템의 구배 프로토콜을 사용하여 각 프라이머 세트에 대해 ICYCLER IQ™ 시스템(Bio-Rad)에 최적화되었다. PCR 효율은 최적화동안 및 각각의 프라이머 세트에 대해 92-105% 및 상관 계수> 0.98로 유지되었고, 또한 샘플 DNA의 실시간 PCR동안 유지되었다. 대상 유전자에 대한 cDNA 농도는 ICYCLER IQ™ 시스템과 IQ™ SYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 실시간 qPCR로 검사했다. 5pg의 cDNA에서 시작하는 정제된 앰플리콘의 10배 희석액을 사용하여 각 유전자에 대한 표준 곡선을 생성하고, 나중에 미지 시료에서 표적 cDNA의 개시량을 계산하는데 사용하였다. SYBR® green I은 일반적인 이중-가닥 DNA 삽입 염료이므로 관심 대상인 앰플리콘 외에도 비특이적인 산물 및 프라이머/다이머를 검출할 수 있다. 실시간 PCR동안 합성된 산물의 수를 측정하기 위해, 각각의 산물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하였다. 실시간 PCR을 사용하여 동일한 96-웰 플레이트상의 cDNA의 각각의 미지 시료의 핵산의 개시량을 측정하였다.
통계 분석. ANOVA, 이후 Scheffe의 다중 비교 방법을 사용하여 파라미터 데이터를 분석하였다. Mann-Whitney의 U 테스트와 Dunn의 다중 비교 검정을 사용하여 비-파라미터 데이터를 분석하였다. SAS의 일반적인 선형 모델 과정, 릴리스 6.0.3(SAS Institute)을 사용하여, ANOVA를 수행하였다. 통계적 유의성은 P≤0.05에서 평가되었다.
결과들
BT-11은 IBD의 만성 IL-10-/-모델에서 질환 활성을 개선시킨다. 만성 크론병을 연구하기 위한 많은 동물 연구에서, IL-10이 수많은 전 염증 사이토카인의 분비를 억제한다고 알려져 있기 때문에 인터류킨-10 결핍 마우스(IL-10-/-) 마우스 모델을 사용했다[21]. 급성 대장염 모델뿐만 아니라 만성 모델에서 BT-11의 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 대장염 연구의 IL-10 널(null) 마우스 모델을 설정하고, BT-11의 증가된 투여량(20, 40, 및 80mg/kg)으로 마우스를 처리하였다. BT-11으로 처리한 결과, 처리된 마우스의 질환 활성도 점수는 부형제-처리된 한배새끼들과 비교하여 유의미하게 감소하였다(도 18). 또한, 고용량의 BT-11(80mg/Kg)로 처리한 마우스는 13주에 시작하여 실험이 끝날때까지 BT-11 화합물 20mg/Kg 또는 40mg/Kg으로 처리한 마우스와 비교하여, 점수들을 유의미하게 감소시켰다.
BT-11은 IBD의 IL10-/-만성 모델에서 비장, MLN 및 결장에서 육안적 병변을 감소시켰다. 임상적 효능을 처음에 결정하기 위해, 본 발명자들은 BT-11 및 이후의 LANCL2 경로 활성화로 치료한 후 거시적인 조직 병변을 평가했다. 연구 시작하고 19주 후, 안락사 및 조직수집 직후 비장(도 19, 패널 A), MLN(도 19, 패널 B) 및 대장(도 19, 패널 C)을 육안으로 평가했다. BT-11을 20mg/Kg의 낮은 농도로 처리하면 세 조직의 거시적인 점수가 유의하게 감소되었으며 그 효능이 입증되었다.
BT-11은 IBD의 IL-10-/-만성 모델에서 조직병리학적 병변 및 염증을 개선한다. 위장 점막에서 조직병리학적 병변 및 일반적인 병리를 평가하기 위해, 결장 절편을 H&E로 염색하고 현미경으로 관찰하였다. 본 결과는 백혈구 침윤(도 20, 패널 A), 상피 미란(도 20, 패널 B) 및 점막 비후화(도 20, 패널 C)의 감소에 따라 BT-11에 의한 치료가 염증을 크게 감소시키는 방법을 보여준다. 본 발명자들은 또한 점막의 비후화와 상관 관계가 있는 장 점막의 침윤량에 대한 용량-의존적 메커니즘을 관찰했다.
BT-11에 의한 치료는 강력한 항-염증 반응을 유도하고, 결장 고유판, 비장 및 MLN에서 전-염증성 서브셋을 감소시킨다. BT-11이 면역세포 서브셋에 미치는 효과를 측정하기 위해 본 발명자들은 결장, 비장 및 MLN으로부터 분리된 세포를 표현형적으로 특징분석하였다. 이와 같은 분석에 따르면 BT-11이 결장 고유판내 전-염증성 F4/80 + 대식세포(도 21, 패널 A), MHC-II+ CD11c+ 수지상 세포(도 21, 패널 B) 및 이펙터 Th1 세포(도 21, 패널 D)의 비율을 유의미하게 감소시켰음을 보여주었다. 또한, BT-11은 결장 LP내에서 FOXP3-발현 CD4+ T 세포들의 상향조절을 통해 항-염증 특성을 발휘한다(도 21, 패널 C).
FOXP3 발현 CD4+ T 세포의 상향조절은 또한 MLN(도 22, 패널 B) 및 비장(도 22, 패널 C) 모두에서 나타났으며, BT-11이 전신 효과를 갖는 방법을 보여주고 증명하였다. 전 염증성 Th1 세포의 하향조절은 또한 비장에서 투여량 반응 방식으로 관찰되었다(도 22, 패널 D). 마지막으로, RORγt의 발현을 특징으로 하는 이펙터 Th17 세포가 MLN에서 하향조절되었다(도 22, 패널 A).
더욱이, 유전자 발현 분석 결과, BT-11에 의한 치료가 LANCL2의 결장 발현을 상향조절하고(도 23, 패널 A), TNFα의 발현을 하향조절한다는 것을 확인하였다(도 23, 패널 B). 이러한 발현 효과들은 투여된 BT-11의 양에 따라 투여량-의존적이었다.
BT-11은 IBD의 대장염 모델의 CD4+ T 세포 유도에서 질환 활성의 개선을 입증했다. 다른 만성 IBD 모델에서 BT-11의 효능을 추가로 검증하기 위해 본 발명자들은 야생형 및 LANCL2-/-마우스로부터의 순수한 CD4+ T 세포를 RAG2-/- 수령자에게 입양전달했다. RAG2-/-마우스를 실험 설계에 근거하여, 부형제 또는 BT-11로 처리하였다. 본 발명자의 선두 화합물인 BT-11로 치료한 결과, 야생형 한배새끼와 비교했을 때 치료된 마우스의 질환 활성도 점수가 크게 감소했다(도 24). 본 발명자들은 LANCL2의 손실로 인해 BT-11의 효과가 완전히 사라짐에 따라, 이러한 결과가 LANCL2-의존적임을 알았다(도 25).
흥미롭게도, BT-11 처리된 마우스의 체중 감소는 실험 종료까지 7주에서 개시하는 부형제 처리된 마우스와 비교할 때 유의미하게 개선되었다(도 26).
BT-11은 IBD의 입양전달 만성 모델에서 비장, MLN 및 결장의 육안적 병변을 감소시켰다. 만성 대장염의 두 번째 모델에서 임상 효능을 확인하기 위해, 본 발명자들은 야생형 또는 LANCL2-/-세포로 입양전달되고, 부형제 또는 BT-11 세포로 치료받은 마우스에서, BT-11 및 후속 LANCL2 경로 활성화로 치료한 후 거시적인 조직 병변을 평가했다. 본 발명자들은 연구 개시후 11주후에 안락사 및 조직 수집 직후에, 비장(도 27, 패널 A), MLN(도 27, 패널 B), 결장(도 27, 패널 C) 및 회장(도 27, 패널 D)을 육안으로 점수를 매겼다. 80mg/Kg 농도의 BT-11로 처리하면, 네 조직들의 거시적인 점수가 유의미하게 감소되었으며, 그 효능이 입증되었다. 본 발명자들은 이러한 관찰이 LANCL2-의존적이며, LANCL2의 손실이 BT-11의 영향을 완전히 없앤 것을 발견했다(도 28).
BT-11은 또한 만성 대장염의 입양전달 모델에서 조직병리학적 병변 및 염증을 개선한다. IL-10-/-유도된 대장염 실험과 유사하고 IBD의 두 번째 마우스 모델로 장 점막에서 조직병리학적 병변 및 일반적인 병리학을 확인하기 위해, 결장 절편을 H&E로 염색하고, 현미경으로 관찰하였다. 본 결과는 대장과 회장내 백혈구 침윤(도 29, 패널 A와 B)과 점막 비후화(도 29, 패널 E와 F)의 감소에 근거하여, BT-11에 의한 치료가 염증을 현저히 감소시키는지를 확인한다. 유의할 점은, 회장은 상피 미란에 덜 영향을 받았지만(도 29, 패널 D), 본 선두 화합물 BT-11로 치료한 마우스에서 결장내 미란이 현저하게 낮게 발견되었다(도 29, 패널 C). BT-11의 LANCL2에 대한 의존성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 입양전달 연구를 수행하고, LANCL2-/- 공여자로부터 CD4+ T 세포를 입양받았다. 본 연구 결과는 LANCL2-/- 입양된 수령자에서 백혈구 침윤, 상피 미란 및 점막 비후화의 감소가 어떻게 크게 없어졌는지를 보여준다(도 30).
BT-11은 마우스에서 지속적으로 엄청난 항-염증 반응을 유도하고, 전-염증성 매개체를 하향조절한다. BT-11 대 부형제로 처리된 마우스의 면역세포 프로파일을 특성화하기 위해, 결장, 비장 및 장간막 림프절로부터 분리된 세포에서 유세포 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 IBD의 두 번째 만성 마우스 모델에서 11주동안 BT-11로 치료받은 수령자 마우스가 결장에서, 현저하게 낮은 수준의 침윤성 F4/80+ CD11b+ 전-염증성 대식세포(도 31, 패널 A)를 보유하며, 총 CD45+ 백혈구에 대한 분석을 바탕으로 한 IFNγ 수준의 감소(도 31, 패널 B)를 보유함을 확인했다. 또한, BT-11에 의한 치료는 결장 점막의 경우, 국소 염증 부위에서, FOXP3(도 31, 패널 C) 및 강력한 항-염증성 사이토카인 IL-10(도 31, 패널 D)의 발현을 촉진시킴으로써 CD4+ T 세포를 지속적으로 상향조절하였다.
결정 고유판 세포에서 관찰된 프로파일과 유사하게, 본 발명자들은 비장과 MLN과 같은 유도 부위에서 이들 개체군을 특징분석했다. 면역-표현형 결과는 BT-11에 의한 치료가 비장 및 MLN과 같은 유도 부위에서 FOXP3 및 IL-10의 수준을 증가시키는 방법을 보여준다(도 32, 패널 A, B, D 및 E). 주목할 점은, BT-11의 처리는 MLN과 비장 모두에서 CD45+ 집단에서 IFNγ의 발현을 감소시켰다(도 32, 패널 C 및 F).
LANCL2-타겟팅 BT-11의 효과는 PPARγ와는 관계없다. LANCL2의 활성화는 실험 결과를 바탕으로 시스템 수준에서 염증을 조절하는 IL-10-기반 항-염증 반응을 궁극적으로 조절하는 과다한 경로를 활성화시킨다. LANCL2의 하나의 활성화된 하류 경로는 PPARγ 경로이다. 이 핵 및 전사 인자의 2차 활성화에 대한 잠재적인 독성 문제를 극복하기 위해, PPARγ-/- 공여자로부터 CD4+ T 세포를 가진 RAG2-/- 마우스를 전이시켰다. 본 발명자들은 80mg/Kg에서 부형제 또는 BT-11로 이들 마우스를 처리했다. 본 결과는 질환 활성 및 조직 병리학에 대한 LANCL2의 활성화를 통한 BT-11의 유익한 효과가 PPARγ 독립적인 방식으로 일어난다는 것을 명확하게 증명한다(도 33 패널 A 내지 D). 이러한 결과는 LANCL2의 활성화가 LANCL2 활성화의 항-염증 효과를 조절하는 다른 경로를 조절한다는 것을 입증한다.
논의
염증성 장 질환(IBD)에 대한 현재의 치료법들은 완만하게 성공적이며, 질환의 장기적인 관리에 심각한 부작용들을 가지고있다[17]. 식물성 화합물인 아브시스산(ABA)은 대장염 마우스 모델에서 강력한 항-염증 효과를 발휘한다 [22, 23]. 란티오닌 합성효소 성분 C-유사 단백질 2(LANCL2)는 ABA의 결합 및 신호 전달의 표적이다 [15, 19, 24]. 따라서 LANCL2는 염증에 대한 유망한 새로운 치료 표적으로 떠오르고있다[18]. 화합물 61610, 비스(벤즈이미다조일)테레프탈아닐리드(BTT)는 수백만개의 화학물질 라이브러리에서 가장 높은 친화도를 갖는 LANCL2에 결합하는 것으로 확인되었다. 또한, 61610은 내장 염증의 마우스 모델에서 강력한 항-염증 효과를 발휘했다 [25]. 20개의 61610-유도된 BTT의 주제별 라이브러리가 만들어졌으며, BT-11은 최고의 예시적인 화합물로 확인되었다. BT-11은 LANCL2에 결합하여, 구강내 활성을 나타내며 대장염 모델 마우스 세마리에서 항-염증 효과, 및 안전성이 입증되었다.
미국의 크론병 및 대장염 협회(Crohn 's and Colitis Foundation of America에 따르면, IBD는 북미지역에 1백만명 이상, 전 세계적으로 4백만명의 인구들이 앓고 있다. 이러한 광범위하고 쇠약성 질환으로 인해, 삶의 질이 낮아지고 의료-관련 비용이 많이 들게된다 [26]. IBD의 단일 에피소드 치료에 대한 평균 의료비는 환자 당 55,000 달러를 초과하며[27], 총 비용은 미국에서 연간 150억 달러를 초과한다. 그리고, 간접 비용은 재발성 췌장염 치료[28] 또는 다른 IBD 합병증, 예컨대 농양, 장폐색, 빈혈, 혈전증, 항문 주위 병변, 관절염, 포도막염, 홍채염, 또는 피부 병변을 포함한다[29]. IBD는 종종 환자를 사회적으로 고립시키고, 가족 관계에 영향을 미치며, 전문적인 기회를 제한하는 등, 환자들에게 심각한 부담을 준다[17]. 이와 관련하여, IBD 환자들은 노동력에 대한 비참여 비율이 높으며; 이 높은 비율은 시간이 지남에 따라 계속되고 있다[30]. 또한 장염(궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD))은 특히 초령(< 30세)에서 대장암 발병의 위험을 증가시킨다[31]. Global Industry Analysts의 새로운 보고서에 따르면, 세계 IBD 치료제 시장은 2015년까지 43억 달러에 이를 것으로 예상된다.
비록 현재의 IBD 치료가 개선되었지만[17,32], 만성적으로 질환을 관리하기 위해 적당하게 성공적일 뿐, 병원균이나 악성 종양에 대한 방어 면역 반응을 일으키는 면역 체계의 능력 저하와 같은 중요한 부작용을 초래할 수 있다. 환자를 위한 치료 옵션에는 염증 증상을 치료하는 것이 포함된다. 오늘날 시장에서 사용되는 대부분의 약리학적 치료에는 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절제, 항생제, 생물제제(항-종양괴사인자-알파 항체)가 포함된다. 아미노살리실레이트는 매우 효과적이며, 일반적으로 내약성이 우수하다. 그러나, 재발이 있거나 중등도 이상의 질환을 가진 환자는 증상들을 조절하기 위해 단기간에 코르티코스테로이드를 단기 복용하는, 보다 적극적인 치료가 필요할 수 있다. 이런 종류의 신속한 치료법은 오랫동안 용인될 수 없다. 상태 유지를 위해, 면역 조절제는 일반적으로 CD와 UC에도 사용되지만, 느린 작용개시를 가진다(최대 효과의 경우 3~6개월). 이 약물들은 췌장염에서부터 당뇨병, 상처있는 간 및 염증있는 폐에 이르기까지 잠재적으로 심각한 부작용을 나타낸다. 다른 치료법으로 관리가 실패한 질환의 중등도에서 중증의 경우, 환자들은 6-8주마다 통제된 환경에서 정맥 주사로 투여되는 항-TNF-α에 놓이게 된다. 이러한, 비용이 매우 많이 드는 치료법은 투여를 위해 숙련된 인력과 임상 셋팅이 필요하기 때문에, 효과적이기는 하지만 접근하기 어렵다. 또한, 쿠싱 증후군, 조증, 불면증, 고혈압, 고혈당, 골다공증, 악성 종양, 감염 및 긴 뼈의 무혈성 괴사와 같은 심각한 부작용들이 있다.
예시 화합물 BT-11은 엄청나게 안전한 독성학 프로파일을 보여주었다. 만성 IBD 모델의 효능 데이터는 BT-11의 치료가 만성 IBD의 두 모델(도 18 및 24)과 체중 감량(도 26)에서 질환 활성도를 개선시키는 방법을 보여준다. 본 데이터는 이러한 효과들이 얼마나 LANCL2 의존적인지 보여준다(도 25). 본 효능 데이터는 또한 BT-11에 의한 LANCL2 경로의 활성화가 염증 대식세포, 수지상 세포 및 전-염증인자, 예컨대 IFNγ(도 22, 23, 31 및 32)의 유의미한 감소 뿐만 아니라, IL-10 생성 및 FOXP3-발현 CD4+ T 세포(도 21, 22, 31 및 32)를 특징으로 하는 항-염증 반응을 얼마나 촉진시키는 지를 보여준다. 또한, 유전자 발현 분석은 BT-11로 치료한 결과 결장에서 TNFα 수치가 감소하는 것을 보여줌으로써 이러한 세포-기반 소견을 확인한다(도 23). 이 모든 결과들은 만성 IBD의 두 모델에서 백혈구 침윤, 상피 미란 및 점막 비후화와 관련하여 결장 점막에서의 극적인 LANCL2-의존성 개선에 대한 책임이 있다(도 20, 29 및 30). 본 발명자들은 또한 LANCL2에 결합한 BT-11의 효과가 PPARγ과 무관하다는 것을 입증했다(도 33). 이러한 결과들은 LANCL2의 활성화가 PPARγ 독립적 메카니즘을 통해 염증을 조절하는 다량의 하류 활성제를 활성화시킨다는 것을 확인한다. 이와 함께, 이러한 결과들은 LANCL2가 염증성 질환의 새로운 치료 표적이고, BT-11이 신약으로서 유용하다는 사실을 강력히 지지한다.
실시예 22: 제1형 당뇨병(T1D)을 치료하기 위한 BT-11의 용도
도입
단순히 당뇨병으로도 알려져 있는, 당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 장기간에 걸쳐 혈당치가 높은 대사성 질환이다. 당뇨병의 두 유형을 제1형 및 제2형이라고 한다. 이 질환들에 대한 이전 이름은 인슐린-의존성 및 비-인슐린-의존성 당뇨병, 또는 소아당뇨병 및 성년개시 당뇨병이었다. T1D에서 인체는 인슐린을 생성하지 않는다. T2D와 관련하여 T1D는 T2D만큼 일반적이지 않다. 실제로 모든 당뇨병 사례의 약 10%가 유형 1이다. T1D는 300만 명의 미국인들을 괴롭힌다. 매년 15,000명 이상의 어린이와 15,000명의 성인이 미국에서 T1D로 진단된다. 14세 미만 어린이의 T1D 발생률은 전 세계적으로 매년 3%씩 증가하는 것으로 추산된다. T1D 환자들은 생존하기 위해 인슐린 주사를 필요로 하지만, 질환을 치료하거나 심각한 부작용을 예방하지는 못한다.
현재의 항-당뇨병 치료제는 인슐린 감수성을 개선하는데 효과적이지만, 만성 투여는 심혈 관계 합병증, 간 독성, 체중 증가, 체액 저지 및 방광 종양과 같은 중요한 부작용들이 있다. 란티오닌 합성효소 성분인 C-유사 2(LANCL2) 경로는 부작용없이 항-당뇨병 작용을 발휘한다[18]. BT-11은 LANCL2에 결합하고, 경구적으로 활성이며, 마우스에서 항-당뇨병 효능을 입증하고, 탁월한 안전성 프로파일을 보여준다.
방법들
마우스. NOD 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여 환기된 랙에서 특정 병원균이 없는 상태로 보관했다. 마우스는 동물 시설에서 유지되었다. 모든 실험 계획서는 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아, 실험실 동물 복지 및 공중 보건 서비스 정책 연구소의 국립 보건원(National Institutes of Health Office) 지침을 충족하거나 초과했다.
체중과 내당성의 평가. 모든 마우스는 정상혈당(공복 혈당치가 250mg/dl 미만)이었고, 연구 개시 전에 비슷한 체중(20±1.5g)을 가지는 것으로 측정되었다. 마우스는 매주 기준으로 체중을 측정하고, 블라인드 관찰자가 질환의 임상 증상을 검사했다. 표준 12시간 경과후, 글루코스는 ACCU-CHEK® 글루코미터(인디애나 폴리스, IN)를 사용하여 측정되었다. 외측 꼬리 정맥을 통해 혈액을 모으고, 모세관 혈액 수집관에 두었다.
조직병리학. 마우스의 NOD 연구에서 얻은 췌장 절편을 10% 완충 중성 포르말린에 고정시킨 다음, 나중에 파라핀에 끼우고, 절편(5μm)을 조직 검사를 위해 H&E 염색으로 염색하였다. 절편은 림프구 침윤, 세포 손상 및 조직 미란에 따라 0-4점으로 등급을 매겼으며, 데이터는 표준화된 혼합 점수로 분석되었다.
통계 분석. 파라미터 데이터는 ANOVA와 Scheffe의 다중 비교 방법을 사용하여 분석되었다. 비-파라미터 데이터는 Mann-Whitney의 U 검정과 Dunn의 다중 비교 검정을 사용하여 분석되었다. ANOVA는 SAS의 일반적인 선형 모델 절차 6.0.3(SAS Institute)을 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 P≤0.05에서 평가되었다.
결과들
BT-11은 제1형 당뇨병 마우스 모델에서 공복 혈당치를 낮추고 인슐린을 증가시킨다.
T1D 마우스 모델에서 혈당 수치 조절에 미치는 BT-11의 효과를 측정하기 위해, 연구 개시 후 0, 1, 3, 4, 5, 10 및 11주에 공복 혈당 검사를 실시했다. 본 결과는 화합물 BT-11로 치료한 마우스가 12시간의 금식 기간 후에 혈중 포도당 수치가 유의미하게 낮았음을 보여준다(도 34, 패널 A). 이와 동시에, 5주째에 인슐린 수치를 평가한 결과, BT-11로 치료한 마우스에서 혈장내 인슐린 수치가 유의미하게 증가한 것으로 나타났다(도 34, 패널 B).
BT-11은 마우스 NOD 모델에서 임상병리학적 췌장 병변 및 염증을 개선한다. T1D의 마우스 모델에서 조직병리학적 병변을 평가하기 위해, 췌장을 수집하고, 10% 포르말린으로 고정시켰다. 그후, 췌장 절편을 H&E로 염색하고, 현미경으로 관찰하였다. 본 결과는 부형제 처리된 마우스와 비교했을 때 BT-11로 치료한 결과 마우스의 췌장에서 임상병리학적 병변을 상당히 감소시키는 것을 보여준다(도 35).
논의
3백만명 이상의 미국인을 괴롭히는 질환인 제1형 당뇨병(T1D)에 대한 효과적이고, 더욱 안전한 구강 약물 치료제가 필요하다. ABA 치료는 항-당뇨 효과를 나타낸다[2]. 란티오닌 합성효소 성분 C-유사 단백질 2(LANCL2)는 ABA의 결합과 신호 전달의 표적이다[15, 19, 24]. 따라서 LANCL2는 염증에 대한 유망한 새로운 치료 표적으로 떠오르고 있다[18]. ABA는 당뇨병을 개선하는데 효과적이며[2, 33], 및 염증성 장 질환(IBD)과 같은 면역-매개 질환에 효과적이다[22, 23]. 비스(벤즈이미다조일)테레프탈아닐리드(BTT)인, 화합물 61610은 수백만개의 화학 물질 라이브러리에서 가장 높은 친화도로 LANCL2에 결합한다. 또한, 61610은 장 염증의 마우스 모델에서 강력한 면역조절 효과를 발휘했다[25]. BT-11은 NOD 마우스에서 항-당뇨 효과를 나타낸다(도 34 및 35). 또한 ABA는 사람의 췌장 베타-세포에서 인슐린 분비를 증가시켰으며[34], ABA가 제1형 당뇨병(T1D)의 치료제로 사용될 수 있음을 시사한다.
면역세포에서 ABA는 미리스토일화(myristoylation) 후에 세포막과 결합하는 G-단백질 커플 수용체인, LANCL2에 의해 인식된다[19,35]. LANCL2에 결합하는 ABA는 cAMP를 증가시키고, PKA를 통한 신호 전달을 개시하고, 대식세포와 T 세포에서 면역 반응을 조절한다[8]. LANCL1의 결정 구조를 주형으로 사용하여, 상동성 모델링을 수행하여 LANCL2의 3차원 구조를 구축하였다. 분자 도킹(molecular docking)을 이용하여, 처음에는 인실리코(in silico)에서, 그리고 나서 시험관내(in vitro)에서는 ABA가 LANCL2에 결합한다는 것이 입증되었다. 이 계산 예측은 SPR 결과와 인간 LANCL2와의 결합 분석에 의해 입증되었다[35]. 본 발명자들은 새로운 LANCL2 리간드를 발견하기 위해, 상동성 모델링을 통해 얻은 LANCL2의 구조를 사용하여 LANCL2-기반의 가상 스크리닝을 수행했다. NCI Diversity Set II, ChemBridge 및 ZINC 천연물 데이터베이스의 화합물을 Auto Dock으로 LANCL2 모델에 도킹하고 계산 된 친화도로 순위를 매겼다. ABA는 LANCL2에 대해 높은 친화도를 가지지만, 61610과 같은 다른 디엔-함유 천연 화합물도 같은 지역에서 결합할 것으로 예측되었으며, LANCL2 결합 약물로도 사용될 수 있다[12]. BT-11은 또한 T1D의 NOD 마우스 모델에서 LANCL2에 강한 결합 및 치료 효능을 입증했다(도 34). 이 데이터는 LANCL2 경로 및 본 발명의 다른 화합물이 T1D에 대한 면역 조절 약물로서 유용하다는 몇가지 검증을 제공한다. 면역 반응을 조절하고, 자가면역 질환을 개선시키는 수단으로서 LANCL2 경로의 역할을 뒷받침하는 또 다른 증거로는, 염증성 장 질환(IBD)의 마우스 모델에서 LANCL2 결합 및 ABA[22,23], 61610[12,18] 및 BT-11의 보호 효과가 있다.
T1D의 발생률은 전 세계적으로 매년 3%의 추정속도로 증가하고 있다[36-38]. 성공적인 췌장섬 이식술은 T1D를 치료할 수 있지만, 충분한 췌장섬의 부족, 지속적으로 이식된 췌장섬의 지속적인 면역-매개 파괴, 면역 억제제의 부작용이 접근법의 광범위한 사용을 크게 제한한다[39]. 이와 같이, 췌장 β-세포 기능을 촉진시키는 능력과 면역 조절을 안전하게 결합시키는 치료법은 T1D를 치료하는 기본적인 전략이다. 본 데이터는 BT-11에 의한 LANCL2의 활성화가 혈중 글루코스 수준을 개선시킬뿐만 아니라 글루코스 도전 후에도 정상화를 개선시킨다는 것을 입증한다(도 34). 또한, T1d가 발병하는동안 BT-11로 치료하면 췌장의 조직병리학이 향상된다(도 35). 실제로 ABA는 염증을 예방적이고 치료적으로 억제하고, 내당능을 향상시킨다[2, 3]. 따라서 LANCL2의 자연적인 활성화는 IBD에서의 치료 효과[12,18,22,23]와 억제된 염증 및 개선된 인슐린 감수성으로 인한 포도당 항상성의 조절[2, 3]과 같은 면역 조절을 초래한다. 이 배경과 도 34와 35에 제시된 데이터를 토대로, T1D의 치료 목표로 LANCL2의 역할을 조사하는 것이 중요하다.
실시예 23: 제2형 당뇨병(T2D)을 치료하기 위한 BT-11의 용도
도입
당뇨병(DM)은 인체가 인슐린을 충분히 또는 효과적으로 사용할 수 없을 때 발생하며, 환경적 요소들과 결합된 유전적 소인에 의해 유발되는 만성적인 질환이다. 제1형 당뇨병 환자와 달리, 제2형 당뇨병 환자는 인슐린을 생산할 수 있다. 그러나, 그러한 환자의 췌장은 충분한 인슐린을 만들지 못하거나 신체가 인슐린을 충분히 사용할 수 없다. 이 현상을 인슐린 저항성이라고 한다. 인슐린이 충분하지 않거나 인슐린을 사용해야하는 경우에는, 포도당을 처리하여 사용할 수 없다. 결과적으로 포도당이 세포로 들어가서 대사되는 대신 혈류에 축적되면, 시스템의 다른 세포들이 제대로 기능하지 못한다. 실제로, 고혈당증 및 당뇨병은 심혈관 질환(CVD), 신장병증, 신경병증, 발 궤양 및 망막병증으로 인해, 이환율 및 사망률의 중요한 원인이 된다.
약 2830만명의 미국인들이 제2형 당뇨병(T2D)을 앓고 있으며 중년 성인들의 40.1% 이상이 전-당뇨병을 앓고 있으며, 당뇨병은 내당능 장애, 전신성 염증 및 인슐린 저항성을 특징으로 한다. 세계 보건기구(WHO)는 T2D 환자의 숫자가 2030년까지 3억 6600만명으로 증가할 것으로 추산하고 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 현재의 항-당뇨병 치료제는 인슐린 감수성을 개선시키는데 효과적이지만, 만성 투여는 심혈관 합병증, 간독성, 체중 증가, 체액 저지 및 방광 종양과 같은 심각한 부작용이 있다. 란티오닌 합성효소 성분인 C-유사 2(LANCL2) 경로는 부작용없이 항-당뇨병 작용을 발휘한다[18]. BT-11은 LANCL2에 결합하고, 경구적으로 활성이며, 마우스에서 항-당뇨병 효능을 입증하고, 탁월한 안전성 프로파일을 보여준다.
방법들
마우스 및 식이 치료법. C57BL/6 및 db/db 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여 환기된 랙에서 특정 병원균이 없는 상태로 보관했다. 마우스의 다이어트 유도 비만 당뇨병 모델(DIO)에 고지방식(40Kcal% 지방)이 투여되었다. 마우스는 동물 시설에서 유지되었다. 모든 실험 계획서는 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아, 실험실 동물 복지 및 공중 보건 서비스 정책 연구소의 국립 보건원(National Institutes of Health Office) 지침을 충족하거나 초과했다.
체중과 포도당 내성의 평가. 모든 마우스는 정상혈당(공복 혈당치가 250mg/dl 미만)이었고, 연구 개시 전에 비슷한 체중(체중±1.5g)을 가지는 것으로 측정되었다. 마우스는 매주 기준으로 체중을 측정하고, 블라인드 관찰자가 질환의 임상 증상을 검사했다. 표준 12시간 경과후, 포도당은 다른 날에 측정되었다. 간단히 말하자면, 외측 꼬리 정맥을 통해 혈액을 모으고, 모세관 혈액 수집관에 두었다. 그후 D-글루코스(2g/kg 체중)의 복강내 주사에 의해, 및 주사 전(시간 0), 및 포도당 주입 후 15, 60 및 90분(db/db 모델) 또는 15, 30, 60, 90, 120, 180, 220 및 265분(DIO 모델)에 수집된 혈액 샘플(오전 6에 개시하여 12시간 금식후 기준선 FBG 수준에 상응함)에 의한 포도당 내성 시험에 마우스를 투입하였다. 복부(부고환) 백색 지방 조직(WAT), 피하 와트 및 간을 절제하고 칭량하였다. 복부(부고환) WAT를 소화시키고 분획하였다.
백색 지방 조직의 소화. 복부 WAT를 절제하고, 무게를 재고, 작은 <10mg 조각으로 잘게 썬 다음 2.5% HEPES(Mediatech) 및 II 형 콜라게나제를 함유하는 10% 태아소혈청(0.2%, Sigma-Aldrich))을 보충한 소화 배지(1XHBSS(Mediatech, Herndon, VA))에 넣었다. 샘플을 37℃ 배양기에서 30분동안 배양하고, 소화되지 않은 입자를 제거하기 위해 100μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 여과한 후, 1000 x g에서 10분동안 4℃에서 원심분리했다. 스트로마 혈관 세포(SVCs)로 구성된 펠렛을 1XHBSS로 세척하고 4℃, 1000 × g에서 10분동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 9mL 1X PBS로 반응을 정지하기 전에 SVC를 2mL 적혈구 용해 완충액에서 2분동안 배양하여 적혈구를 용해시켰다. 그후 세포를 1000 x g에서 4℃에서 10분간 재스피닝(respun)하고, 1X PBS 1mL에 현탁시키고, Coulter Counter(Beckman Coulter, Fullerton, CA)로 계수하였다.
스트로마 혈관 세포들의 면역표현형 분석. 면역표현형 분석을 위해 96-웰 플레이트(Costar)에 SVC를 2 x 105 세포/웰로 접종하였다. 비-특이적 결합을 억제하기 위해 FcBlock(20μg/mL; BD Biosciences-Pharmingen)으로 초기 20분 배양한 후, 세포를 5% 혈청 및 0.09% 나트륨 아지드(FACS 완충액)를 함유한 PBS로 세척하고, 특정 1차 항-마우스 항체로 염색하였다. 유동 결과를 FacsAria 유동 세포계측기로 계산하고, 데이터 분석은 FACS DIVA™(BD Biosciences) 및 FlowJo(TreeStar)로 수행했다.
실시간 정량 PCR. RNEASY Lipid Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 지방 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 제조자의 지침에 따라 RNEASY Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA는 QSCRIPT™ cDNA 합성 키트(Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD)를 사용하여 상보적인 DNA(cDNA) 템플릿을 생성하는데 사용되었다. MJ MINI™ 열 순환기(Bio-Rad)에서 25℃에서 5분, 52℃에서 30분, 85℃에서 5분간, 및 4℃에서 유지함으로써 배양된 반응에 의해 총 반응용적은 20μL이었다. 각 유전자 앰플리콘을 MINELUTE PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하고, DNA 질량 사다리(Promega)를 사용하여 아가로즈 겔 상에서 정량화하였다. 상기 정제된 앰플리콘은 실시간 PCR 분석에서 실시간 PCR 조건을 최적화하는데 사용되었다. 프라이머 농도와 어닐링 온도는 시스템의 구배 프로토콜을 사용하여, 각 프라이머 세트에 대해 CFX 시스템(Bio-Rad)에 최적화되었다. 최적화동안 및 샘플 DNA의 실시간 PCR동안 각 프라이머 세트에 대해 PCR 효율은 92-105% 사이에서 유지되었으며, 0.98 이상의 상관 계수로 유지되었다. 데이터는 ΔΔCt 정량화 방법을 사용하여 나타내었다.
결과들
BT-11은 T2D의 마우스 DIO 모델에서 공복 혈당 수치를 감소시켰다. T2D 모델에서 예시 화합물 BT-11의 효능을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에게 고지방식(DIO 모델)을 공급했다. 고지방-사료 공급 12주에 부형제-처리된 한배새끼와 비교했을 때, 경구용 BT-11 투여는 BT-11 처리된 마우스에서 혈당 수치를 유의미하게 감소시켰다(도 36, 패널 A). 또한, IP를 통해 체중 2g/Kg에서 12시간의 금식 및 글루코스 접종을 한 후, BT-11로 처리된 마우스는 처리되지 않은 마우스보다 혈당치를 유의미하게 빠르게 정상화할 수 있었다(도 36, 패널 B).
BT-11 처리는 백색 지방 조직에서 전 염증성 과립구 뿐만 아니라 전 염증성 대식세포 침윤을 감소시켰다. 백색 지방 조직에 침윤하는 세포를 특징분석하기 위해, 복부 WAT를 수집하고, 방법 섹션에 명시된대로 소화시켰다. WAT에서 상이한 전-염증군들을 평가하여 유동 세포 계측법 분석을 수행하였다. 본 결과는 BT-11에 의한 치료가 F4/80+ CD11b+ 전 염증성 대식세포의 수준(도 37, 패널 A) 뿐만 아니라 Ly6c(GR1 + Ly6chigh)의 높은 수준을 갖는 전-염증성 과립구의 수(도 37, 패널 B)를 크게 감소시켰음을 보여준다.
BT-11은 T2D의 마우스 db/db 모델에서 공복 혈당 수준을 감소시켰다. 2 마리의 당뇨병 마우스 모델에서 경구 BT-11에 의한 치료의 치료 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 또한 렙틴 수용체의 돌연변이로 인해 자발적 T2D를 발생시키는 db/db 마우스를 사용했다. Db/db 마우스에게 경구용 위관 영양법에 의해 BT-11를 80mg/Kg의 양으로 매일 투여했다. 본 발명자들은 공복 혈당 농도를 측정하여 글루코스 항상성에 대한 BT-11의 효과를 측정했다. BT-11으로 치료한 결과, 일주일만에 부형제-처리된 동종 마우스와 비교하여, 혈당 수준이 현저하게 감소하여 3주째의 시간에 따른 차이를 강조했다(도 38, 패널 A). 동물이 글루코스 항상성을 시작하는 방법을 경구 BT-11에 의한 치료가 조절하는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 실험 동물에게 복강내 글루코스 접종을 실시하고, 글루코스 주입 후 0~265분에서 혈장 글루코스의 동력학을 평가하였다. 주사 전(시간 0)에 혈액 샘플들(기준선 FBG 레벨 후 12시간 금식에 해당)을 수집하였다. 본 결과는 BT-11을 사용한 경구 치료가 IP 글루코스 접종(시간 0, 도 38, 패널 B) 전에 글루코스 수준을 상당히 감소시키는 것을 보여준다. db/db 모델에서 글루코스 시도 후에, 본 결과는 본 선두 화합물들 BT-11로 처리한 마우스의 포도당 수치가 부형제-처리된 마우스보다 빠르게 정상 수준으로 떨어지는 것을 보여준다(도 38, 패널 B).
BT-11은 TNFα 및 MCP-1의 mRNA 수준을 감소시키고 LANCL2를 상향조절하였다. BT-11의 항-염증 효능을 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 방법 섹션에 개시된대로 WAT에 대한 유전자 발현을 평가했다. 본 결과는 치료되지 않은 마우스와 비교했을 때, BT-11로 처리된 마우스가 더 높은 LANCL2의 발현 수준 및 상당히 낮은 전-염증 인자 TNFα 및 MCP-1의 mRNA 수준을 갖는 것을 보여준다(도 39).
논의
미국에서 비만과 제2형 당뇨병(T2D)의 비율이 계속 증가함에 따라, 점점 많은 사람들이 경구용 항-당뇨병 약물에 의존하고 있다. 약 2830만(인구의 8.3%)의 미국인이 T2D를 앓고 있으며, 중년 성인들의 40.1% 이상이 전-당뇨병을 앓고 있으며, 내당능 장애와 인슐린 저항성을 특징으로 하는 질환이다[40]. 미국의 T2D로 인한 총 직접 비용과 간접 비용은 1320억 달러가 넘는다[40]. 이처럼 성장하는 문제에도 불구하고, 제약 회사는 안전하고 효과적인 의약품을 개발할 수 없었다. 가장 널리 사용되고 효과적인 경구 항-당뇨병 치료제 중 하나는 인슐린-감작제인 티아졸리딘디온(TZD) 계열이다. TZD는 인슐린 감수성을 향상시키지만 체중 증가, 울혈성 심부전, 방광암, 간 독성 및 체액 보유 등을 포함한, 유용성을 제한하는 심각한 부작용이 있다[41,42]. 예를 들면, TZD를 사용하는 환자들의 약 10-15%는 부종으로 인해 치료를 중단해야하며, 과도한 수분 유지로 인한 세포외 부피의 증가도 기존의 울혈성 심부전 환자에게는 큰 문제가 된다. 2000년, 트로글리타존(REZULIN®)은 심각한 간 손상 및 사망의 보고로 인해, 출시 3년 후 시장에서 제거되었다[43]. 다른 TZD에 대한 안전성 문제로 인해, 블랙 박스 라벨이 의무적으로 사용되었으며 이후에는 사용 제한이 있었다.
LANCL2는 확인된 LanC-유사 단백질 계열의 두 번째 구성원이었다. 첫 번째 구성원인 LANCL1은 인간의 적혈구 막으로부터 분리되었다[44]. LANCL2는 면역세포, 췌장, 폐 및 장을 포함하는, 신체 전체[1,18]에 걸쳐 확인되고 발현되었다[1,44]. 란티오닌 합성효소 C-유사 2(LANCL2) 경로는 T2D에 대한 새로운 치료 표적으로 등장했다[18]. 광범위한 전-임상 시험은 당뇨병 및 만성 염증성 질환에서 아브시스산(ABA)과 같은 LANCL2 리간드의 치료 가능성에 대한 충분한 증거를 제공한다[2, 3, 22, 23, 45]. 화합물 61610, 비스(벤즈이미다조일)테레프탈아닐리드(BTT)는 수백만가지 화학물질의 라이브러리에서 LANCL2에 가장 높은 친화도로 결합한다.
T2D의 현재 약물이 부작용이없는 혈당 조절인, 환자의 첫 번째 필요성을 충족시키지 못한다는 사실을 감안할 때, BT-11은 매우 매력적인 대체 약물이다. 본 결과는 T2D의 다른 마우스 모델에서 BT-11의 투여가 금식 기간 후에 혈중 포도당 수치를 상당히 낮추는 것을 보여준다(도 36 및 38). 또한,이 화합물의 투여는 글루코스 도전 후에 글루코스 수준을 정상화시키는데 도움을 준다(도 36 및 도 38). BT-11의 항-염증 특성들은 본 면역표현형 검사 결과에도 반영된다. 실제로, BT-11의 투여는 복부 WAT에서 전-염증성 대식세포 및 전-염증성 과립구의 침윤을 덜 일으켰다(도 37). 이러한 결과들은 BT-11으로 치료한 마우스에서 상당히 감소된, 두 가지 매우 중요한 전-염증성 인자인 TNFα 및 MCP-1의 유전자 발현 데이터에 의해 뒷받침되었다(도 39).
실시예 24; 인플루엔자 감염동안 BT-11의 용도
도입
폐렴을 일으키는 호흡기 병원균은 선진국의 전염병 관련 사망의 주요 원인이다. 항-바이러스성 항원의 출현에 대한 우려가 증가하면서 효과적인 백신 및 항-바이러스제가 없기 때문에, 숙주-표적형 면역치료법을 개발해야 할 필요성이 강조된다. 호흡기 감염과 관련된 폐 병리학 및 임상 질환은 종종 바이러스의 세포병리학적 효과와 숙주면역반응의 조합에 기인한다. 이와 관련하여 독창적인 면역반응을 조절하기 위한 치료법이 독감 치료에 고려된다[46].
인플루엔자는 전 세계적으로 주요 공중보건 문제로 남아있다. 계절성 인플루엔자는 상부 호흡기 과정과 관련되어 있으며, 종종 호흡 곤란과 제한된 활동을 필요로 한다. 미국에서만 연간 독감 유행은 3천만 건의 외래 방문과 30만 건의 입원을 초래할 것으로 추산된다. 특정 인구(예를 들면, 어린 자녀, 노인 및 건강 상태가 좋지 않은 사람)는 바이러스성 폐렴의 발병위험이 더 높다. 전문가들은 미국의 계절성 독감으로 매년 25,000명 내지 35,000명이 사망하고, 전세계 재정적 부담은 수십억 달러로 계산된 것으로 추산하고 있다[47]. 대유행 인플루엔자주기는 30-50년마다 발생하며 예측할 수 없는 재현으로 인해 복잡성이 증가하고, 선재 면역이 결여되고, 높은 사망률과 관련되어 있다[48]. 인플루엔자는 심각한 이환율 및 사망률과 관련되어 있지만, 효과적이고 안전한 약물 치료법은 부족하다.
란티오닌 합성효소 성분 C-유사 단백질 2(LANCL2)가 ABA의 결합 및 신호 전달의 표적임을 시사하는 데이터 [15, 19, 24]. 따라서, LANCL2는 면역 조절을 위한 유망한 새로운 치료표적으로 떠오르고있다. 분자 모델링 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여, BTI는 LANCL2에 높은 친화도로 결합하는 화합물 BT-11, 비스(벤즈이미다조일)테레프탈아닐리드(BTT)를 확인했다. 또한, BT-11은 폐에서 강력한 전-해결 영향을 미치고, 인플루엔자 마우스 모델에서 사망률과 이환율을 감소시켰다.
방법들
마우스. C57BL/6 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여, 환기된 랙에서 특정 병원균이 없는 상태로 보관했다. 모든 실험 계획서는 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물 복지 및 공중 보건 서비스 정책 연구소의 국립 보건원(National Institutes of Health Office) 지침을 충족하거나 초과했다.
인플루엔자 바이러스에 의한 마우스의 비강내 감염. 기화기를 사용하여, 마우스를 2-5% 이소플루오란으로 마취시키고, 103 TCID50에서 바이러스 희석액 50μL를 콧구멍(각 25μL)을 통해 투여하였다. 마우스를 케이지에 넣고, 마취 회복을 지켜 보았다.
구강 위관 영양법에 의한 BT-11 경구 투여. BT-11은 상업적으로 이용가능한 안전 볼-팁 가바지 바늘(동물의 무게에 따라, 18-24게이지)을 사용하여, 구강 위관 영양법으로 마우스에 투여하였다. 이 절차는 고통이나 괴로움을 일으키지 않는다. 마우스는 실험 기간동안 매 24시간마다 80mg/Kg의 투여량으로 BT-11로 치료받았다.
마우스 및 질환 활성도 및 체중의 모니터링. 마우스는 감염 후 1일 1회(또는 질환 점수 2에 해당하는 심각한 임상 증상을 보이면 4시간마다) 모니터링하고, 체중 감량(즉, 초기 체중의 25% 점진적 감소)으로 측정했을 때 심각한 질환 증상, 탈수, 이동성 상실, 통증이 있는 부위의 방어/보호, 입모(piloerection)가 나타나면, 계획된 엔드 포인트 이전에 안락사시켰다. 마우스는 실험 기간동안 하루에 한 번 무게를 측정하였다
결과들
BT-11의 경구 투여는 인플루엔자 바이러스가 있는 마우스의 임상 점수와 이환율을 감소시켰다.
BT-11의 치료 효능을 평가하기 위해, 마우스에서 인플루엔자 감염의 마우스 모델을 사용했다. 간단히 말하면, 마우스는 5% 이소플루오란으로 마취한 후 비강 내로 감염시켰다. 마우스를 80 또는 40mg/Kg에서 BT-11의 경구 현탁액으로 매일 처리하였다. 실험 기간(16일)동안 마우스의 무게를 측정하고 점수를 매겼다. 결과는 BT-11의 투여가 3일째에 개시하여, 및 실험 전반에 걸쳐, 어떻게 활동 임상 점수를 감소시켰는지를 보여준다(도 40, 패널 A). 또한, BT-11 40 및 80mg/Kg에 의한 처리를 모두 받은 마우스에서 외형에 대한 임상적 점수가 유의미하게 감소하였다(도 40, 패널 B).
질환의 이환율로 치료의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 체중 감소의 백분율을 계산하고, 각 실험 그룹내에서 15% 이상을 잃어버린 마우스의 수를 더 평가했다. 감염 후 6일부터 개시하여, 80mg/Kg의 BT-11로 치료하면 부형제 군과 비교했을 때, 이환율이 낮아진다. 10일에 개시하여, 12일까지 걸쳐, 차이들이 두드러졌다(도 40, 패널 C).
논의
인플루엔자 확산과 질환을 통제하기 위한 전통적인 접근법은 백신 접종과 항바이러스 치료를 통해 바이러스 측면에 집중되어 있다. 백신은 전 계절의 순환계에 따라 매년 공식화되어야한다. 그러나 계절 독감이나 유행성 독감에 상관없이, 새로운 백신의 효능을 생산, 허가 및 테스트하는데 약 4개월에서 6개월이 소요된다[49]. 항 바이러스제의 가장 큰 단점은 저항성 균주의 출현과 선택이 매우 빈번하다는 것이다. 바이러스 중심의 치료 이외에도, 악화된 숙주 반응을 제어하는 치료법의 개발은 항균 및 예방 전략을 보완하기 위해 채택될 가능성이 매우 높다. 숙주-표적 치료제는 여러 가지 레조르탄트들(reasortants) 사이에서 교차 방어를 제공함으로써, 계절에 따라 효과적이며, 생산되고 저장될 수 있으며, 바이러스 노출 후 질환을 치료하는데 사용될 수 있다[46,50,51].
인플루엔자에 대한 새로운 치료제로서의 LANCL2의 동정은 숙주-표적 치료제에 대한 새로운 길을 열어 준다. 본 발명자들은 BT-11에 의한 LANCL2의 활성화가 활성도 및 임상 점수 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스로 인한 이환율을 감소시키고, 인플루엔자 감염으로부터의 회복을 촉진한다는 것을 증명했다(도 33). 이러한 결과들은 LANCL2가 인플루엔자에 대한 새로운 치료 표적이고, BT-11이 잠재적인 새로운 숙주-표적 약물임을 강력하게 지지한다.
참고문헌들
Figure pat00056
Figure pat00057
Figure pat00058
Figure pat00059
Figure pat00060
Figure pat00061

Claims (1)

  1. 하기 구조식 Z-Y-Q-Y'-Z'를 포함하는 화합물들, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르, 및 담체를 포함하는 조성물이며,
    상기 식에서,
    상기 Z는
    Figure pat00062
    이고;
    상기 Y는
    Figure pat00063
    이며;
    상기 Q는 피페라진-1,4-디일; 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵탄-2,5-디일; 2,5-디아자비시클로[2.2.2]옥탄-2,5-디일; 1,4-디아제판-1,4-디일; 벤젠-1,4-디아민-N1,N4-디일; 에탄-1,2-디아민-N1,N2-디일; N1,N2-디알킬에탄-1,2-디아민-N1,N2-디일; 프로판-1,3-디아민-N1,N3-디일; N1,N3-디알킬프로판-1,3-디아민-N1,N3-디일; 1,4-디아미노안트라센-9,10-디온-1,4-디일; C6 아렌-1,4-디아민-N1,N4-디일(상기 아렌은 2,3,5 또는 6번 위치에서 1 내지 4개의 치환체로 치환되고, 상기 치환체는 -C(O)O(C1-C6)알킬, OH, O(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨); 또는 치환된 피페라진-1,4-디일(상기 피페라진은 2,3,5 또는 6번 위치에서 1 내지 8개의 치환체로 치환되고, 치환체는 (C1-C6)알킬, 아릴, 아릴(C1-C6)알킬, C(O)OH 및 C(O)O(C1-C6)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)이고;
    상기 Y'는:
    Figure pat00064
    , 또는 단일 결합이며; 그리고
    상기 Z'는:
    Figure pat00065
    또는 R5이며;
    상기 Y'는 Z'가 R5일 경우에만 단일 결합이며;
    A1 및 A1'는 각각 독립적으로, N, N(C1-C6)알킬, O, S 또는 CR6이며;
    A2 및 A2'는 각각 독립적으로, N 또는 CR7이며;
    A3 및 A3'은 각각 독립적으로, NR8, O 또는 S이며;
    A4 및 A4'는 각각 독립적으로, N 또는 CR9이며;
    A5 및 A5'는 각각 독립적으로, N 또는 CR10이며;
    A6 및 A6'은 각각 독립적으로, N 또는 CR11이며;
    R1, R1', R2, R2', R3, R3', R4, R4', R5, R6, R7, R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소; 알킬; 할로; 트리플루오로메틸; 디알킬아미노(각 알킬은 독립적으로 선택됨); -NH2; 알킬아미노; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬; 헤테로시클로알킬; -C(O)OH, -C(O)O(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, -CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 2개의 치환체로 치환된, 치환된 헤테로시클로알킬; 및 치환된 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    상기 치환된 헤테로아릴알킬은 -NH2; -NH(C1-C6)알킬; -N((C1-C6)알킬)2(여기에서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택됨); 알킬; 할로; 아릴; -SO2R12, -OR13, -할로, -CN, -CF3, 아미노알킬, -S(O)R14 및 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 아릴; 헤테로시클로알킬; 헤테로아릴; 알킬, -CF3, F, Cl 및 Br로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 아릴; 알킬 아미노-; 헤테로시클로알킬-알킬-아미노-; 알킬아미노알킬아미노-; -NHC(O)OR15; -NHC(O)NR16R17; -C(O)NR16R17; 및 알킬, 할로, CN, NH2, -NH(C1-C6 알킬), -N(C1-C6 알킬)2(여기서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택됨), -CF3으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 헤테로아릴, 및 -S(O)2R15 및 -CN으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된, 치환된 아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환되며;
    R12, R13, R14, R15, R16 및 R17은 각각 C1-C6 알킬, 독립적으로 선택된 C1-C6 알킬을 포함하는 디알킬아미노, -NH2, 알킬아미노, 헤테로시클로알킬, 및 -C(O)O(C1-C6 알킬) 및 C1-C6 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 2개의 치환체로 치환된, 치환된 헤테로시클로알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
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