KR20200065901A

KR20200065901A - 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별 방법

Info

Publication number: KR20200065901A
Application number: KR1020180152821A
Authority: KR
Inventors: 박수형; 이정수; 장석우; 최승국; 장하영
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-06-09
Also published as: KR102167788B1

Abstract

본 발명은 뿌리혹병 저항성 균주 판별용 프라이머 세트와, 이를 사용하는 뿌리혹병 저항성 균주 판별 방법에 관한 것으로, 본원에 따른 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 마커를 이용하는 경우, 다양한 배추 소재에 적용 가능하기 때문에, 뿌리혹병 저항성이 존재하는 품종을 매우 효과적으로 판별해낼 수 있다. 이에 따라 본 발명은 약제 방제에 들어가는 비용 및 인력 소모를 줄일 수 있고, 연속으로 재배해도 병이 재발하지 않는 품종을 선별함으로써 안정적인 배추 생산량을 도모할 수 있다.

Description

뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별 방법{A primer set for discrimination of clubroot disease-resistant cultivar and idenditication method by using the same}

본 발명은 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트와, 이를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 사용하는 뿌리혹병 저항성 균주 판별 방법에 관한 것이다.

뿌리혹병에 감염된 식물의 지상부는 감염되지 않은 경우에 비하여 생육이 부진하고, 병이 진전됨에 따라서 시드는 증세가 심해진다. 생육초기에 감염된 식물의 표현형은 잎이 전체적으로 푸른 상태로 시드는 증상을 나타내며, 생육중기 이후에 감염된 식물은 주로 아래쪽의 잎만 시드는 증세를 나타내거나 시드는 증세를 별로 나타내지 않기도 한다. 병원균에 감염된 식물의 뿌리는 이상비대(異狀肥大)되어, 작거나 큰 부정형의 혹이 여러 개 형성된다. 생육후기에 이르러 혹의 상처부위로 세균이나 다른 균류가 침입하여 뿌리가 썩기도 한다. 상기 토양 중에 존재하는 뿌리혹병 병원균의 휴면포자는 수년간 생존할 수 있으며, 빗물, 관개수, 흙바람, 동물 및 농기구 등에 의해서 전염된다. 토양습도가 80% 이상의 과한 습한 포장과, 20~25℃의 기온, 6.0이하의 산성토양에서 병원균의 발생이 잘 일어날 수 있다. 뿌리혹병은 국내외 십자화과 채소에서 폭넓게 발병하는 것으로, 국내 배추 재배 지역에 자주 발생함으로써 배추의 공급에 차질을 일으키는 병원균에 해당한다. 배추 뿌리혹병은 전국에서 계절에 무관하게 발생되고 있으며, 이에 의해 배추 생산량이 30~70% 감소됨으로써 안정적인 생산에 큰 위협이 된다.

Plasmodiophora brassicae는 십자화과 채소만 특이적으로 공격하는 병원균으로, 병원균과 기주의 상호관계에 의하여 뿌리에 국소적으로 과도하게 생성된 IAA(indole-3-acetic acid) 때문에 혹이 발생된다(Butcher et al., 1976; Dekhuijzen and Overeem, 1971). 십자화과 채소에 특이적으로 존재하는 글루코시놀레이트(glucosinolate)는 미로시나아제(myrosinase) 및 니트릴라아제(nitrilase) 효소에 의해 최종적으로 IAA로 전환된다. 때문에 뿌리혹병의 발병의 원인 중 하나는 체내 화학적 요인으로 간주되어 왔으며, 아라비돕시스(Arabidopsis)의 모델 식물체에 대한 실험을 통하여 글루코시놀레이트가 발병에 깊이 관여되어 있음이 밝혀졌다(Grsic-Rausch et al., 1999, 2000).

한편, 십자화과 채소에 속하는 배추에서 뿌리혹병의 발병과정에서 개별적 글루코시놀레이트의 체내 함량 변화에 대하여 분석되었으며, 병원균의 접종 후 배추 뿌리 내 인돌릭(indolic) 및 지방족 글루코시놀레이트(aliphatic glucosinolate)의 함량이 과도하게 증가하는 것이 확인되었다(Ludwig-Miiller et al., 1997). 뿌리혹병에 저항성과 감수성을 갖는 배추 품종의 발병 정도와 뿌리내 인돌릭 및 페닐글루시놀레이트 함량 변이를 조사한 결과, 배추 뿌리에서 동정된 글루코시놀레이트 중 글루코브라시신(glucobrassicin)과 글루코나스털틴(gluconasturtiin)은 뿌리혹 발병도와 정의 상관관계를 보였고, 4-메톡시-글루코브래시신(4-methoxy-glucobrassicin)의 함량은 부의 상관관계를 보였다(Lee and Kim, 2010).

뿌리혹병의 방제를 위해 화학 약품, 농약 및 길항균을 이용하는 방법이 개발되었으나(Datnoff et al., 1987; Cheah et al., 2000; Yeoung et al., 2003), 매 작기 마다 약제 방제를 해야 하므로 비용과 인력의 소모가 많다. 또한 방제 효과도 처리한 작기에서만 효과가 있고 연속으로 재배할 경우 병이 다시 발생하는 문제가 있다. 따라서 장기적으로는 뿌리혹병에 저항성인 품종의 개발이 필요하다. 그러나 저항성 품종도 3작기 이상 연속으로 재배할 경우 저항성이 무너지는 현상이 발생하였다. Yoshikawa(1981)에 의하면, 일본에서는 European fodder turnip을 이용하여 뿌리혹병에 저항성(CR, clubroot resistance)인 배추 품종을 50개 이상 육성하여 일본에 출시하였다. 그런데 저항성 배추 품종을 재배한 이후에 이들을 침해하는 뿌리혹병균이 출현하여 대부분의 CR 품종의 저항성이 무너지는 일이 발생했다(Kuginuki et al., 1999; Tanaka et al., 1998). 따라서 안정적인 배추의 주년 공급을 위해 저항성 유전자가 서로 다른 다양한 육종 소재를 개발하여 민간 회사에 공급하는 것이 필요하게 되었다.

배추 뿌리혹병 마커로는 현재까지 Crr1a, Crr2, CRb, CRa, Crr3, CRc과 연관된 다양한 마커들이 보고되어 있다. 그러나 상기 마커는 저항성 유전자와 물리적으로 거리가 있고, 다양한 배추 소재에 대해 적용이 가능하지 않는다는 한계점이 존재하였다. 또한, 종래 보고된 상기 마커들은 사용방법이 간단하지 않고, 고가의 장비를 필요로 하므로 영세 농장 또는 기업 등에서 사용하기에는 한계가 있다. 나아가, 이미 개발된 마커는 특정 육종 소재에서는 적용되지 않는다는 한계점이 존재하였다.

1. Butcher et al., 1976; Dekhuijzen and Overeem, 1971 2. Grsic-Rausch et al., 1999, 2000 3. Ludwig-Miiller et al., 1997 4. Datnoff et al., 1987; 5. Cheah et al., 2000; 6. Yeoung et al., 2003 7. Lee and Kim, 2010 8. Kuginuki et al., 1999 9. Tanaka et al., 1998

따라서 본 발명의 주된 목적은 주된 목적은 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하는 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 상기 프라이머 세트를 포함하는 뿌리혹병 저항성 품종 판별 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및

서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, a) 품종을 판별할 십자화과 채소로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;

b) 상기 제한 효소가 처리된 유전체 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및

c) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 c) 분석하는 단계는 제한 효소를 처리하는 단계를 더 포함한다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 제한 효소는 TagⅠ인 것이 바람직하다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 십자화과 채소는 상기 십자화과 채소는 양배추, 배추, 무, 겨자, 케일, 브로콜리, 냉이, 유채, 갓, 콜리플라워(꽃양배추), 브뤼셀스프라우트, 들?잎, 청경채 및 순무로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 십자화과 채소는 배추인 것이 바람직하다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및

서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트인 것이 바람직하다.

판별하는 방법에 있어서, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 뿌리혹병 저항성 유전자에 상보적으로 결합하여 검출 가능한 제제, DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 반응용 완충용액을 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종 판별 키트를 제공한다.

판별 키트에 있어서, 상기 뿌리혹병 저항성 유전자에 상보적으로 결합하여 검출 가능한 제제는 프라이머 세트인 것이 바람직하다.

판별 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및

판별 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트인 것이 바람직하다.

판별 키트에 있어서, 상기 제한 효소는 TagⅠ인 것이 바람직하다.

본원에 따른 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 마커를 이용하는 경우, 다양한 배추 소재에 적용 가능하기 때문에, 뿌리혹병 저항성이 존재하는 품종을 매우 효과적으로 판별해낼 수 있다. 이에 따라 본 발명은 약제 방제에 들어가는 비용 및 인력 소모를 줄일 수 있고, 연속으로 재배해도 병이 재발하지 않는 품종을 선별함으로써 안정적인 배추 생산량을 도모할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 GBS 및 GWAS 방법을 통해 본 발명의 배추 뿌리혹병 연천 균주 저항성 품종을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 세트를 개발하는 방법을 개략적으로 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 GWAS 분석에 연천 균주 접종 발병도를 형질자료로 하여 연관분석을 수행하여 계산된 p-value를 가시화한 Manhattan plots을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 GWAS 분석을 통해 얻어진 1쌍의 최초 프라이머를 이용하여 저항성과 감수성, 중도저항성 자원 96점을 대상으로 중합효소 연쇄반응을 수행한 뒤, 전기영동 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 프라이머를 이용하여 저항성과 감수성, 중도저항성 자원 96점을 대상으로 중합효소 연쇄반응을 수행한 뒤, 전기영동 분석을 수행한 결과 저항성과 감수성이 구별 가능한 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다. 본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하기 위해, 뿌리혹병 저항성 유전자에 특이적으로 결합하여 이를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 프라이머 세트들은 DNA, 특히 뿌리혹병 저항성과 관련된 SNP를 증폭하기 위한 프라이머 세트로 이용되며, 바람직하게는 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 구성된 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트를 기반으로 하여 저항성 유전자의 존재 유무 판별을 위한 제한 효소 사용에 적합하도록 재설계된 프라이머 세트로서, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는데 정확도가 높을 뿐만 아니라, 중도저항성을 띄는 품종의 판별도 가능하다는 장점을 갖는다.

본 발명의 상기 프라이머(primer)는 복제 대상인 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열로서, 중합효소연쇄반응의 합성 산물을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용할 수 있어야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 또한, 상기 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 4의 핵산 서열에 부가, 결실, 또는 치환된 서열도 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 CAPS SNP 마커 밴드의 염기서열을 분석하기 위해 제작된 것으로, 전기영동 상에서 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. CAPS SNp 마커는 다른 분자 마커에 비해 증폭 환경에 비교적 둔감하고 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 십자화 채소의 저항성 유전자를 판별하는데 보다 정확하고 세밀한 프라이머 세트로 사용될 수 있다.

본 발명의 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하기 위한 방법은 a) 품종을 판별할 십자화과 채소로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; b) 상기 추출된 유전체 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 a) 단계에서 유전체 DNA를 추출하는 방법은, 당업계에서 공지된 통상의 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들면 CTAB (CetylTrimethylAmmonium Bromide) 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트(QIagen prep kit)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 a) 단계에서 판별될 수 있는 십자화과 채소는 꽃잎이 4장으로 이루어져 있는 쌍떡잎식물 양귀비목 이판화군의 겨자과 식물로서, 양배추, 배추, 무, 겨자, 케일, 브로콜리, 냉이, 유채, 갓, 콜리플라워(꽃양배추), 브뤼셀스프라우트, 들?잎, 청경채, 순무 등일 수 있고, 바람직하게는 배추일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 b) 단계에서 DNA 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 수행될 수 있다. PCR은 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하거나 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 십자화과 채소에서 추출된 유전체 DNA와 본 발명의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(H₂O)을 포함할 수 있고, 상기 PCR 완충 용액은 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

뿌리혹병 저항성 유전자에 특이적으로 결합하여 이를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 b) 단계에서 증폭된 염기 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예를 들어, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성 동위원소가 증폭 산물에 혼입되어 방사성으로 표지될 수 있다. 또는, 증폭 산물은 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)와 같은 키트 등을 사용하여 가시화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 c) 단계는 제한 효소를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제한 효소로 처리하는 단계는 당업계에서 제한 효소 처리 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 제한 효소 반응 혼합액을 이용하거나 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게 상기 제한 효소는 Tag Ⅰ일 수 있으나, 뿌리혹병 저항성 유전자에 특이적인 SNP를 검출할 수 있는 제한 효소라면 모두 포함될 수 있으므로, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 c) 단계에서 증폭된 DNA 산물을 분석은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의한 것이면 가능하며, 예를 들면 겔 전기영동 및 모세관 전기영동과 같은 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 증폭 산물을 검출하기 위해 모세관 전기영동을 수행할 수 있으며, ABi Sequencer를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 예를 들어, 1 내지 5%, 바람직하게는 1.5% 아가로즈 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 증폭된 DNA 산물을 겔 전기영동을 사용하여 분석하는 경우, 아가로오스 겔 또는 아크릴 아마이드 겔 상에서 증폭 산물을 전기영동하고, 에티디움 브로마이드(EtBr), 실버 염색(silver staining) 등에 의해 밴드를 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 키트는 뿌리혹병 저항성 유전자에 상보적으로 결합하여 검출 가능한 제제, DNA 중합효소, dNTPs, 제한효소 및 PCR 반응용 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 뿌리혹병 저항성 유전자에 상보적으로 결합하여 검출 가능한 제제는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다..

본 발며의 상기 프라이머 세트는 뿌리혹병 저항성 유전자에 특이적으로 결합하여 이를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 PCR 반응용 완충용액은 당업계에서 통상적으로 공지된 조성을 가지며, 예를 들면 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 키트는 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동에 필요한 공지의 성분들을 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예>

실시예 1

배추로부터 게놈 DNA 추출

배추 뿌리혹병 균주 저항성 품종을 특이적으로 선별하기 위한 식물재료를 선정하기 위해, 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보유하고 있는 2006년부터 2016년까지 소포자 배양과 교배를 통하여 육성된 품종, 육성 중 자원 및 도입 자원을 이용하였다. 십자화과에 존재하는 다양한 뿌리혹병 저항성 유전자의 폭넓은 선발을 위하여 다양한 국내 수집 뿌리혹병 균주에 저항성을 보이나 기존 분자표지로는 해석이 어려운 자원 57점, 한국 재래 품종 등 이병성 자원 39점 등 총 96점을 GWAS 분석에 사용하였다.

GBS(Genotyping-by-squencing) 분석

총 96점의 식물 재료가 GBS 분석에 이용되었으며 분석은 ㈜씨더스에서 실시 되었다. Genomic DNA를 추출한 후 이를 ApeKI 제한효소를 이용하여 처리한 후에 표준 프로토콜을 이용하여 GBS 라이브러리를 다음과 같이 구축하였다. 각 96점 식물재료의 Genomic DNA (100 ng/uL)를 75℃ 에서 약 4시간 동안 3.6 U의 ApeKI (New England Biolabs, Ipswitch, MA)으로 처리한 후에 (20 uL reaction volume), 200 U T4 DNA ligase를 사용해 바코드가 들어있는 어뎁터와 일반 어뎁터를 제한효소 처리 단편에 부착시킨 후 96점의 샘플을 pooling하여 준비하였다. Pooling된 샘플은 QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 클린엎 하였으며 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행하였다: 95°C 에서 2분 (one cycle), 95°C 에서 30초 (16 cycles), 62°C 에서 30초, 68°C 에서 30초, 68°C 에서 5 분. 구축된 GBS의 정량은 Agilent Tape station에서 high sensitivity DNA chip을 이용하여 측정하였다. DNA 염기서열 분석은 Illumina Hiseq 2000을 이용하여 실시하였고, GBS sequencing 데이터는 이후 분석을 수행하기에 앞서 barcode sequence를 이용하여 샘플 별로 서열을 분리하는 demultiplexing 과정을 거쳤다. 그 결과 최종 demultiplexed read는 338,111,100개 였다. GBS 데이터의 demultiplexing 과정을 통해 생산된 샘플 별 서열 파일은 barcode 및 adapter sequence를 제거하고, sequence quality trimming을 수행하였다. Adapter trimming은 cutadapt (v.1.8.3) 프로그램을 사용하였고, sequence quality trimming은 SolexaQA (v.1.13) package의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였다.

실시예 2

CAPS SNP 프라이머의 선발 및 교정

뿌리혹병 저항성 연천 균주 접종 발병도를 형질자료로 하여, GWAS분석에 이용 가능한 데이터로 변환 과정을 거친 후, 20, 540 SNP 좌와 함께 GAPIT (v. 2.0) 프로그램을 사용하여 전장유전체 연관분석(Genome-wide Association Study, GWAS)을 수행하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

전장유전체 연관 분석을 통하여 9종의 프라이머 세트와 제한효소를 선발하여 예비실험을 실시하였다. DNA 샘플 구성은 저항성(DS; 1.0), 감수성(DS; 5.0)을 선택하여 수행하였다. 최종적으로 선발된 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)을 이용하여 96계통 및 추가 자원을 대상으로 적용성 검정을 실시하였다. 여기서, 기기(Bioer, Life echo)를 사용하여 95℃; 3min, [95℃; 10sec, 60℃; 30sec, 72℃; 30sec] 35 cycles, 72℃; 5min의 PCR 조건으로, 전체 voulme을 20 uL에, 40ng 주형 DNA, 0.4uM 프라이머를 넣고, 상용 PCR 프리믹스(Onsol, Cat. No. OSP10030096)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 20uL PCR 생성물, 5U TaqⅠ제한 효소, 1×반응완충액으로 하고 전체 볼륨을 30 uL로 하여, 제한효소와 혼합하고 37℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 그런 다음, 상기 반응물을 1.5% agarose gel에 전기영동하여 밴드 양상을 확인하였다.

또한, CAPS 마커의 구분성을 보다 명확하게 하기 위해 감수성의 TaqⅠ 자리를 이용하여 프라이머 세트를 다시 제작하고(서열번호 3 및 4), 상기와 동일한 방법으로 적용성 검정을 수행하였다.

서열번호	프라이머 이름	염기 서열	타겟 (저항성/이병성)
1	23098226(F)	TTCCTCCGCCGACGATTATG	G/T
2	23098858(R)	TTCCTCCGCCGACGATTATG
3	Bra016021(F)	ATCGCATGAAGTTGGGAGCT
4	Bra016021(R)	TTCTCTACACGGTGGTGCTTCT

실시예 3

CAPS SNP 프라이머를 이용한 확인

상기 실시예 2에서 얻은 CAPS SNP 프라이머에 의한 저항성 자원/개체 선별이 가능한지 확인하기 위하여, 다양한 종에서 표현형(phenotype)의 확인과 함께 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 유전형(genotype)을 확인하여, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 도시된 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 GWAS 분석에 사용된 96점을 모두 분석한 결과, 뿌리혹병 표현형이 저항성인 15점 중 증폭이 잘 되지 않은 GW163을 제외한 14점의 자원에서 모두 표현형과 유전형의 결과가 일치함을 확인하였다. 그러나, 중도 저항성의 표현형을 나타내는 자원의 경우에는 유전형의 패턴이 일정치 않고, 대체적으로 저항성 밴드의 양상을 나타내었다. 또한, GW108의 경우에는 감수성 밴드 양상을 나타내었다. 선발된 분자 표지로 추가 검정을 위하여 저항성 11점, 중도저항성 6점, 감수성 6점의 23점을 선발하여 분석한 결과 저항성과 감수성의 phenotype과 genotype 결과가 거의 일치하였다.

도 4에 도시된 바와 같이, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 재검정을 실시한 결과 뿌리혹병 관련 phenotype과 genotype의 구별이 확실하였다. 최종 개발된 분자표지로 96점의 시료를 분석한 결과 저항성과 감수성의 구분이 명확해졌고, GW166의 경우 헤테로 타입의 밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 저항성인 GW10, GW16, GW34, GW46, GW47, GW67의 밴드와, 감수성인 GW51, GW60, GW62, GW63, GW65, GW66의 밴드양상이 뚜렷하게 구분되는 것을 확인하였다.

나아가, GWAS분석에 사용된 자원 9점뿐만 아니라, 신규로 농업유전자원센터로부터 분양 받은 뿌리혹병 저항성 순무 자원 7점에 적용시킨 결과 저항성과 감수성의 밴드 양상이 확연하게 분리된 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 폭 넓은 자원에 활용 가능한 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 해당 분자표지의 밴드 패턴이co-dominant 양상으로 분자표지로의 개발 가능성이 높고 저항성 자원의 선발에는 활용 가능한 것으로 평가되었다. 또한, Bra016021(서열번호 3 및 4)를 바탕으로 제작된 CAPS SNP 프라이머로 저항성과 이병성 자원의 분리가 가능하였다. 또한, 본 발명에서 개발된 마커를 연천 균주에 저항성인 자원을 선발하는데 기존의 마커와 더불어 새로운 마커로 사용할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> primer set for discrimination of clubroot disease-resistant cultivar and idenditication method by using the same <130> 0 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 1 ttcctccgcc gacgattatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 2 ttcctccgcc gacgattatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 3 atcgcatgaa gttgggagct 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 4 ttctctacac ggtggtgctt ct 22

Claims

서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및
서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종 판별용 프라이머 세트.
a) 품종을 판별할 십자화과 채소로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
b) 상기 제한 효소가 처리된 유전체 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 c) 분석하는 단계는 제한 효소를 처리하는 단계를 더 포함하는 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 제한 효소는 TaqⅠ인 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 십자화과 채소는 양배추, 배추, 무, 겨자, 케일, 브로콜리, 냉이, 유채, 갓, 콜리플라워(꽃양배추), 브뤼셀스프라우트, 들?잎, 청경채 및 순무로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 십자화과 채소는 배추인 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및
서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행되는 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별하는 방법.
뿌리혹병 저항성 유전자에 상보적으로 결합하여 검출 가능한 제제, DNA 중합효소, dNTPs, 제한효소 및 PCR 반응용 완충용액을 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종 판별 키트.
제 11항에 있어서,
상기 뿌리혹병 저항성 유전자에 상보적으로 결합하여 검출 가능한 제제는 프라이머 세트인 것인, 뿌리혹병 저항성 품종 판별 키트.
제 11항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트; 및
서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인, 뿌리혹병 저항성 품종 판별 키트.
제 13항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 뿌리혹병 저항성 품종 판별 키트.
제 11항에 있어서,
상기 제한 효소는 TaqⅠ인 것인, 뿌리혹병 저항성 품종을 판별 키트.