KR20200028362A - 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도 - Google Patents

신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포막을 가로지로는 생물학적 활성 분자의 횡단을 용이하게 하는 신규한 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드를 기술한다. 상기 MTD 펩티드를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드, 상기 MTD 펩티드를 동정하는 방법, 상기 MTD 펩티드를 이용하여 생물학적 활성 분자가 세포 투과성을 갖도록 유전적으로 조작하는 방법, 상기 MTD 펩티드를 이용하여 세포 내로 생물학적 활성 분자를 유입시키는 방법, 및 이의 용도가 또한 기술된다.

Description

신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도{NOVEL MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAINS AND METHODS FOR IDENTIFICATION AND USES THEREOF}
본 발명은 세포막을 가로지로는 생물학적 활성 분자의 횡단을 용이하게 하는 신규한 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드, 상기 MTD 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 MTD 펩티드를 동정하는 방법, 상기 MTD 펩티드를 이용하여 생물학적 활성 분자가 세포 투과성을 갖도록 유전적으로 조작하는 방법, 상기 MTD 펩티드를 이용하여 세포 내로 생물학적 활성 분자를 유입시키는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
DNA, RNA, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드와 같은, 거대분자들의 세포 내재화(cellular internalization)는, 이러한 분자들에 대해 불투과성 장벽을 구성하는, 원형질막의 존재로 인해 여전히 도전적인 과제이다. 조직 또는 세포 내로의 저조한 침투, 특정 조직 또는 세포를 표적하는 특이성의 부족으로 인해 전신적으로 전달될 때의 독성, 특정 표적 세포 또는 조직에서 적당한 국소 농도를 달성하기 위하여 고 농도로 전달될 때의 부작용, 및 불충분한 양이 표적에 전달되게 하는 분해 및/또는 분해의 부산물이 바람직하지 못한 부작용을 야기하게 하는 분해를 포함하는, 수많은 장애들이 이러한 분자들을 목적하는 표적에 전달하는데 직면하게 된다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 몇몇 담체-매개 전달 시스템(carrier-mediated delivery systems)이 개발되었다. 이들 중에서, 최근에 펩티드-계(peptide-based) 전달 시스템의 사용에 많은 관심이 집중되고 있다. 세포 투과성을 갖는 펩티드의 사용은 여러 장점을 갖는데, 이는 주로 상기 펩티드 서열에 이루어질 수 있는 다양한 변형에 기인한다. 이는 다른 세포 하부도메인(subdomains)을 지정할 수 있고/있거나 다양한 형태의 화물 분자들(cargo molecules)을 운반할 수 있는 담체의 조작을 가능케 한다.
많은 세포 투과성 펩티드들이 재조합 단백질, 신호 펩티드, 막횡단 도메인, 및 항미생물 펩티드와 같은, 막-상호작용(membrane-interacting) 단백질의 서열로부터 고안된다. 이러한 서열들 내에서, 단백질 전달 도메인(protein transduction domains, PTDs)이라고 불리는 짧은 서열들은 담체 또는 수용체를 요구하지 않으면서 생물학적 막을 효과적으로 가로지르고 펩티드 또는 단백질을 세포내 구역으로 전달하는 것이 입증되었다. PTD-계 펩티드의 사용이 바이러스성 질환 또는 암의 치료에 매우 중요할 수 있음이 많은 연구에서 제시되었다. 상기 PTD-계 펩티드들 중에서, 페네트라틴(penetratin)이라고 불리는 안테나페디아(antennapedia)의 호메오도메인(homeodomain)의 제3 헬릭스(Joliot, A. 및 A. Prochiantz, Nat. Cell Biol. 6(3): 189-96 (2004)), HIV-1의 전이활성(transactivating) 단백질 Tat 유래 Tat 펩티드(Wadia, J.S. 및 S.F. Dowdy, Cum Opin . Biotechnol . 13(1): 52-6 (2002)), 트랜스포탄(transportan)(Pooga 등, Faseb J. 12(1): 67-77 (1998)), 및 VP22(Elliott, G. 및 P. O'Hare, Cell 88(2): 223-33 (1997))가 펩티드, 단백질, 및 올리고뉴클레오티드의 세포 유입을 향상시키는 것으로 나타났다.
양친매성(amphipathic) 펩티드로 불리는, 두 번째 범주의 세포-침투성(cell-penetrating) 펩티드가 또한 기술되었다. 양친매성 분자는, 간략히, 두 개의 도메인: 친수성(극성) 도메인 및 소수성(비-극성) 도메인으로 구성되는 것으로 정의될 수 있다. 펩티드에서, 양친매성 특성은 일차 구조 또는 이차 구조로부터 기인할 수 있다. 일차 양친매성 펩티드는 소수성 잔기 도메인과 친수성 잔기 도메인의 연속적인 조립(sequential assembly)으로 정의될 수 있다. 이차 양친매성 펩티드는 분자의 반대편에 소수성 및 친수성 잔기들의 위치선정(positioning)을 허용하는 형태학적 상태에 의해 형성된다.
폴리아르기닌(polyarginine)-계 펩티드, 칼시토닌(calcitonin)-유래 펩티드, 및 올리고머와 같은, 다른 펩티드들이 또한 치료제의 세포내 전달을 위한 수단으로 제안되어 왔다.
그러나 현재 공지된 전달 시스템은 그들의 효율 부족 및/또는 그들의 독성으로 인해 제한적인 것으로 보이고, 그들의 효율을 향상시키는데 핸디캡(handicap)을 구성하는, 그들의 세포내 유입 기작에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 또한, 수많은 전달 시스템이 세포막 및 핵막을 가로지르는 이들의 능력에 있어 제한적이다. 이러한 전달 펩티드들이 세포막을 가로지르는 경우에도, 이들은 엔도솜(endosome) 내 이들의 포착(entrapment)으로 인해 이들의 효율에 있어서 종종 제한적이다.
본 발명은 종래 기술에 있어 이러한 결함을 극복하기 위한 것으로서, 본 발명은 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 운반을 매개할 수 있는 단리된 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드 및 상기 펩티드들을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 세포 투과성을 갖는 MTD 펩티드 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포 투과성을 갖는 단리된 재조합 단백질을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 MTD 펩티드를 생물학적 활성 분자에 부착하여 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 MTD가 생물학적 활성 분자에 부착되어 있는 세포 투과성 재조합 단백질을 포함하는 세포에 생물학적 활성 분자의 전달을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 운반을 매개할 수 있는 단리된 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 그러한 MTD 펩티드들을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 세포 투과성을 갖는 MTD 펩티드를 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 MTD 펩티드를 생물학적 활성 분자에 부착하여 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포 투과성을 갖는 MTD 펩티드 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포 투과성을 갖는 단리된 재조합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 MTD가 생물학적 활성 분자에 부착되어 있는 세포 투과성 재조합 단백질을 포함하는 세포에 생물학적 활성 분자의 전달을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 생물학적 활성 분자에 부착된 MTD 펩티드를 포함하는 세포 투과성 재조합 단백질을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상 내에서 세포 내로 생물학적 활성 분자를 운반하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 약물 전달, 백신 투여, 단백질 요법, 및 유전자 요법을 위한 MTD 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 세포 내로 생물학적 활성 분자의 운반을 용이하게 할 수 있고, 그로 인해, 약물 전달, 백신 투여, 펩티드 요법, 및 유전자 요법에 효과적으로 사용될 수 있는 세포 투과성을 갖는 MTD 펩티드를 제공한다.
도 1aa 내지 1od는 본 발명의 방법에 따라 동정된 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드의 아미노산 서열 및 구조적 특징을 설명하는 표를 보여준다.
도 2는 세포 투과성을 갖고 본 발명에 따라 제작된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 설명하는 모식도이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명에 따른 PCR에 의해 증폭된 MTDs-EGFP를 인코딩하는 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석의 사진이다.
도 4a는 본 발명에 따라 pGEM-Teasy 벡터 내로 MTD-EGFP를 인코딩하는 DNA 단편의 서브클로닝을 설명하는 모식도이고, 도 4 b내지 4d는 본 발명에 따라 pGEM-Teasy 벡터 내로 서브클로닝된 MTDs-EGFP를 인코딩하는 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석의 사진이다.
도 5a는 본 발명에 따라 pET 28(+) 벡터 내로 MTD-EGFP를 인코딩하는 DNA 단편의 클로닝을 설명하는 모식도이고, 도 5b 내지 5c는 본 발명에 따라 pET 28(+) 벡터 내로 클로닝된 MTDs-EGFP를 인코딩하는 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석의 사진이다.
도 6a 및 6b는 본 발명에 따른 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 유도성 발현을 설명하는 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 7a 및 7b는 본 발명에 따른 변성 조건 하에서 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 순도를 나타내는 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 탈변성 조건 하에서 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 정제를 나타내는 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
도 9a 내지 9g는 본 발명에 따른 유세포측정에 의해 분석된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 세포 투과성을 설명하는 그래프이다.
도 10a 내지 1Oi는 본 발명에 따라 동초점 레이저 주사 현미경에 의해 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 세포 투과성을 시각화한 사진이다.
도 11a 및 11b는 본 발명에 따른 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 세포 투과성을 양성 대조군과 비교한 그래프이다.
도 12a 내지 12i는 본 발명에 따라 형광 현미경에 의해 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 in vivo 분포를 시각화한 사진이다.
도 13aa 내지 13k는 본 발명의 방법에 따라 동정된 MTD 펩티드의 특징을 요약한 표를 보여준다.
본 발명은 세포막을 가로지로는 생물학적 활성 분자의 횡단을 용이하게 하는 세포 투과성을 갖는 신규한 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 MTD 펩티드는 세포막을 통과하여 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 포함하는, 생물학적 활성 분자의 유입을 매개할 수 있는 세포 투과성 폴리펩티드이다. 본 발명의 MTD 펩티드는 이들의 N-말단에 단일 소수성 영역(single hydrophobic region)을 가지고, 헬릭스 구조(helix structure)를 형성하며, 유연성을 나타내고, 상대적으로 짧은 길이의 아미노산(7개 내지 17개 아미노산)을 갖는 것을 특징으로 한다(도 1Aa 내지 1Od 참고).
본 발명의 일 실시형태는 세포 투과성을 갖는 단리된 MTD 펩티드에 관한 것으로, 상기 MTD 펩티드는 서열번호: 1 내지 193으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 이들의 유사체, 유도체, 아미드화(amidated) 변이, 및 보존적 변이를 갖는다.
당업계의 통상적인 지식을 가진 자는 보다 높은 세포 투과성 및 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 펩티드를 수득하기 위하여 유사한 치환을 만들 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 펩티드의 세포 투과성이 유지되는 한, 이들의 유사체, 유도체, 및 아미드화 유도체뿐만 아니라, 서열번호: 1 내지 193의 아미노산 서열에 상응하는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드의 일차 아미노산 서열에 대한 미미한(minor) 변형은 본원에 기술된 특정한 펩티드와 비교하여, 실질적으로 동등하거나 증가된 세포 투과성을 갖는 펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해서와 같이, 의도적일 수 있고, 자연발생적일 수 있다. 본래 펩티드의 세포 투과성이 여전히 존재하거나, 상기 펩티드의 아미드화 변이의 경우에는, 상기 아미드화 펩티드가 치료적으로 유용하도록 본래 펩티드의 세포 투과성이 증가하거나 변형되는 한, 이러한 변형에 의해 생성된 모든 펩티드들은 본 발명에 포함된다. 이러한 변형은 특정 펩티드의 세포 투과성을 변형시키거나 증강시키는데 유용함이 예상된다.
나아가, 하나 이상의 아미노산의 결실이 또한 그의 세포 투과성에 있어서의 어떠한 유의미한 변화 없이 결과 분자의 구조에 대한 변형을 야기할 수 있다. 이는 또한 유용성(utility)을 가질 수 있는 보다 작은 활성 분자의 개발로 이어질 수 있다. 예를 들어, 특정 펩티드의 세포 투과성에 요구되지 않을 수 있는 아미노- 또는 카르복시-말단 아미노산이 제거될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 본원에 기술된 바와 같이, 세포 투과성을 유지하는 한, 본 출원에 기술된 펩티드의 임의의 유사체(analog), 동족체(homolog), 돌연변이체, 이성질체(isomer), 또는 유도체(derivateive)를 포함한다. 모든 펩티드는 L-아미노산을 사용하여 합성되었다; 그러나, 모든 펩티드의 D 형태가 합성적으로 생산될 수 있다. 또한, C-말단 메틸 에스테르 및 C-말단 아미데이트(amidate)와 같은, C-말단 유도체가 본 발명의 펩티드의 세포 투과성을 증가시키기 위해 제조될 수 있다.
본 발명의 "펩티드"는 본원에 특정하게 예시된 그러한 펩티드들의 보존적 변이(conservative variation)인 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "보존적 변이"는 한 아미노산 잔기의 다른, 생물학적으로 유사한 잔기로의 치환을 의미한다. 보존적 변이의 예시에는 다른 잔기의 소수성 잔기, 예컨대 아이소류우신, 발린, 류우신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류우신(norleucine), 또는 메티오닌으로의 치환, 또는 다른 잔기의 극성 잔기로의 치환, 예컨대 라이신의 아르기닌으로, 아스파르트산의 글루탐산으로, 또는 아스파라긴의 글루타민으로와 같은 치환이 포함된다. 하나의 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산에는 아스파라긴, 글루타민, 세린, 및 트레오닌이 포함된다. 용어 "보존적 변이"는 또한, 치환된 폴리펩티드에 대해 야기된 항체가 비치환된 폴리펩티드와 면역적으로 반응한다면, 비치환된 모체(parent) 아미노산 대신에 치환된 아미노산의 사용을 포함한다. 이러한 보존적 치환은 본 발명의 펩티드의 종류의 정의 내에 포함된다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 상기 MTD 펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 예시적인 뉴클레오티드들은 서열번호: 1 내지 193으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 MTD 펩티드들, 및 이의 유사체, 유도체, 아미드화 변이, 및 보존적 변이를 인코딩한다. 본 발명의 MTD 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 194 내지 386으로 표시되는 염기 서열을 갖는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 상기 코딩 서열은 서열번호: 194 내지 386으로부터 선택되는 염기 서열과 동일할 수 있고, 또는 다른 코딩 서열일 수 있는데, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 상기에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함하는데, 이는 서열번호: 1 내지 193의 연역된(deduced) 아미노산 서열을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 단편, 유사체, 및 유도체를 인코딩한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 194 내지 386으로부터 선택되는 염기 서열을 특징으로 하는 코딩 서열의 자연적으로 발생하는 대립 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기 서열의 교대(alternate) 형태이다.
본원에 기술된 서열과 유사하거나 동종인(예컨대, 적어도 약 70% 서열 동일성) 서열이 또한 본 발명의 일부분이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 아미노산 수준에서 서열 동일성은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 수준에서, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드 분절(segment)이 상기 가닥의 보체(complement)에 선택적인 혼성화 조건(즉, 매우 높은 엄격성(stringency) 혼성화 조건) 하에서 혼성화될 때 실질적인 동일성이 존재한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전세포 내에, 세포 용해물(lysate) 내에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩티드를 인코딩하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 앞서 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 교대 염기 서열을 포함한다. 상기 청구된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 상기 청구된 서열과 청구된 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 위치한 임의의 아미노산들의 임의의 조합을 인코딩하는 염기 서열을 포함한다.
본 발명의 아미노산 및 핵산 서열은 부가적인 잔기들, 특히 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 서열이 재조합 단백질의 폴리펩티드 또는 단백질 모이어티(moiety)에 막 투과성을 부여하는 한, 본원에 기술된 서열에 개시된 바와 같이 여전히 본질적일 수 있다.
본 발명은 또한 세포 투과성을 갖는 MTD 펩티드를 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 다수의 아미노산 서열 데이터베이스로부터 신호 서열-유사 도메인(signal sequence-like domain)을 갖는 분비 단백질을 동정하는 단계;
2) 상기 동정된 분비 단백질로부터 그들의 N-말단에 단일 소수성 영역을 갖고 헬릭스 구조를 형성하는 소수성 펩티드를 선발하는 단계; 및
3) MTD 펩티드로 사용하는데 적합한 펩티드를 제조하기에 효과적인 조건 하에서 상기 선발된 소수성 펩티드를 최적화하고 최소화하는 단계.
잠재적으로 원형질막을 통과할 수 있는 특정한 후보 펩티드를 동정하기 위하여, 단계 1)에 기술된 바와 같이, 신호 서열-유사 도메인을 갖는 분비 단백질들을 다수의 아미노산 서열 데이터베이스로부터 동정한다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 이들 분비 단백질은 "신호 서열의 소수성 영역", "신호 서열 소수성 영역", "분비 단백질의 신호 서열", "소수성 신호 서열", 및 "분비 단백질의 소수성 도메인"과 같은, 다양한 검색어를 사용하여 PubMed Entrez Protein Database로부터 선발된다. 그 결과, 신호 서열-유사 도메인을 갖는 1,500개 이상의 분비 단백질들이 동정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신호 서열-유사 도메인"은 원형질막을 가로지르는 거대분자 전위(translocation)를 매개할 수 있는 펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "신호 펩티드"는 단백질의 후-번역 운반(post-translational transport)을 지시하는 짧은(3개 내지 60개 아미노산 길이) 펩티드이다. 신호 펩티드는 또한 표적화(targeting) 신호, 신호 서열, 전이(transit) 펩티드, 또는 국소화(localization) 신호로 불릴 수 있다. 신호 펩티드의 아미노산 서열은 단백질(세포질 내에서 합성됨)을 핵, 미토콘드리아 기질, 세포질그물(endoplasmic reticulum), 엽록체, 탈원형질체(apoplast) 및 과산화소체(peroxisome)와 같은 특정한 기관으로 유도한다. 일부 신호 펩티드는 상기 단백질이 운반된 후 신호 펩티다제(signal peptidase)에 의해 단백질로부터 절단된다. 분비 단백질의 N-말단 서열은 세포막을 통과하는 운반에 요구된다.
신호 펩티드의 예시에는 핵으로의 운반(NLS: -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-), 세포질그물로의 운반(H2N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-), 세포질그물에의 잔류(retention)(-Lys-Asp-Glu-Leu-COOH), 미토콘드리아 기질로의 운반(H2N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-), 과산화소체로의 운반(PTS1: -Ser-Lys-Leu-COOH), 과산화소체로의 운반(PTS2: H2N----Arg-Leu-X5-His-Leu-)(상기에서, H2N은 단백질의 N-말단이고, COOH는 단백질의 C-말단임)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
신호 서열-유사 도매인의 예시에는 페네트라틴(penetratin)(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys), 전이활성 단백질 HIV-1의 Tat 유래 Tat 펩티드(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Pro), 트랜스포탄(transportan)(Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys-Ile-Asn-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu), 부포린(Buforin) Ⅱ(Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Arg-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys), MAP(모델 양친매성 펩티드: Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Ser-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala), k-FGF(Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro), Ku 70(Val-Pro-Met-Leu-Lys-Pro-Met-Leu-Lys-Glu), 프리온(prion)(Met-Ala-Asn-Leu-Gly-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Met-Trp-Thr-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro), pVEC(Leu-Leu-Ile-Ile-Leu-Arg-Arg-Arg-Ile-Arg-Lys-Gln-Ala-His-Ala-His-Ser-Lys), pep-1(Lys-Glu-Thr-Trp-Trp-Glu-Thr-Trp-Trp-Thr-Glu-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val), SynB1(Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Arg), pep-7(Ser-Asp-Leu-Trp-Glu-Met-Met-Met-Val-Ser-Leu-Ala-Cys-Gln-Tyr), 및 HN-1(Thr-Ser-Pro-Leu-Leu-Ile-His-Asn-Gly-Gln-Lys-Leu)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
이어서, 단계 2)에 기술된 바와 같이, 그의 N-말단에 단일 소수성 영역을 갖고 헬릭스 구조를 형성하는 소수성 펩티드를 단계 1)에서 동정된 분비 단백질로부터 선발한다. 단계 1)에서 동정된 신호 서열-유사 도메인을 갖는 모든 분비 단백질은 이들이 그의 N-말단에 단일 소수성 영역(H-영역)을 포함하는지 여부를 결정하기 위하여 수치법(hydropathy) 분석에 적용되고, 이어서 이들이 헬릭스 구조를 형성하는지 여부를 결정하기 위하여 컴퓨터-보조 게놈 및 프로테옴 분석(computer-aided genomic and proteomic information analysis)에 적용된다. 소수성 영역은 보통 단백질에 막-전위 활성(membrane-translocating activity)을 부여하는 헬릭스 구조를 형성한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 막 단백질을 위한 분류 및 이차 예측 시스템으로 SOSUI 시스템이 상기 컴퓨터-보조 게놈 및 프로테옴 분석을 위해 사용될 수 있다. SOSUI 시스템은 단백질 서열로부터 막 단백질의 이차적인 구조 예측에 유용한 도구로서 온-라인 상에서 자유로이 이용가능하다(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui 참고). SOSUI 시스템은 일반적으로 분석되는 펩티드가 적어도 약 20개의 아미노산 길이를 가질 것을 요구하기 때문에, 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein)의 N-말단 도메인으로부터 유래되는 부가적인 아미노산이 상기 신호 서열-유사 도메인의 말단에 부가된다. SOSUI 시스템을 이용하여, 그들의 N-말단에 단일 소수성 영역을 갖고 막횡단(transmembrane) 헬릭스 구조를 형성하는 220개의 소수성 펩티드를 선발한다.
마지막으로, 단계 2)에서 선발된 소수성 펩티드는, 단계 3)에 기술된 바와 같이, 이들이 MTD 펩티드로서 사용하기에 적합하도록 최적화되고 최소화된다. 선발된 소수성 펩티드를 최적화하기 위하여, 이들은 하기와 같이 실험적(empirical) 변형이 이루어진다: i) 친수성, 비극성, 및 양으로 또는 음으로 대전된(charged) 아미노산을 선발된 소수성 펩티드로부터 제거하고; ii) 5개의 소수성 아미노산, 즉 알라닌(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 프롤린(Pro 또는 P), 류우신(Leu 또는 L), 및 아이소류우신(Ile 또는 I)의 다양한 조합을 실험적으로 생성함. 상기 소수성 아미노산은 신호 서열의 소수성 영역이 헤어핀-유사 고리(hairpin-like loop)를 형성하는 것을 가능케 하여 인지질 이중층(phospholipid bilayer)의 불안정화된 형태학적 변화를 야기할 수 있는, H-영역에 유연성을 제공하는 것으로 알려져 있다. 유연한 H-영역과의 접촉에 의해 유도되는 비-이중층 지질 구조의 이러한 국부적이고 일시적인 형성은 위상적인 변환(topological transformation)을 야기한다.
상기에 기술된 바와 같이 최적화된 소수성 펩티드의 길이를 최소화하기 위해, 이들로부터 어떤 아미노산이 제거되어야 하는지를 결정하는데 하기 원리를 이용한다: i) 소수성 펩티드의 좌측 또는 우측에서 그의 소수성 영역은 유지하면서, 크기를 최소화하기 위해 비-소수성 아미노산이 제거되고; ii) 유연성 또는 휨 가능성(bending potential)을 제공하기 위해 소수성 펩티드의 중간 또는 우측에서 비-소수성 아미노산이 소수성 아미노산인 프롤린(Pro 또는 P)으로 치환되고; iii) 소수성 펩타드의 크기를 줄이기 위해 반복된 소수성 아미노산의 개수를 최소화함. 이와 같이, MTD 후보자들은 소수성 및 유연성을 나타내고, 상대적으로 짧은 아미노산(7개 내지 17개) 길이를 가지며, 헬릭스 구조를 형성하는 변형된 펩티드로서 특정된다.
상기에 기술된 본 발명의 방법에 따르면, 서열번호: 1 내지 193으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고 세포막을 가로지르는 생물학적 활성 분자의 횡단을 용이하게 할 수 있는 신규한 MTD 펩티드들이 동정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 신규한 MTDs 중의 하나인, JO-98(서열번호: 98)은 하기 과정에 의해 동정될 수 있다:
i) 인간 유래 면역글로불린 도메인 함유 4를 신호 서열-유사 도메인을 갖는 분비 단백질로서 PubMed Entrez Protein Database로부터 선발하고;
ii) 수치법 분석을 통해, 상기 단백질이 단일 N-말단 소수성 영역을 포함하는지를 확인하고;
iii) 상기 소수성 영역(H-영역)을 MGILLGLLLLGHLTVDTYGRPIL(23개 아미노산 길이)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 상기 단백질의 전장 신호 서열로부터 선발하고;
iv) SOSUI 시스템을 이용한 구조적 분석을 통해, 선발된 소수성 영역이 헬릭스 구조를 형성하는지를 확인하고;
v) 상기 소수성 영역의 좌측에서 비-소수성 아미노산(메티오닌: M; 글리신: G)을 제거하여 상기 소수성 영역의 첫 번째 아미노산을 소수성 아미노산으로 만들어, ILLGLLLLGHLTVDTYGRPIL(21개 아미노산 길이)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 소수성 펩티드를 수득하고;
vi) 염기성(히스티딘: H; 아르기닌: R) 및 친수성(트레오닌: T; 아스파르트산: D; 티로신: Y) 아미노산을 상기 소수성 영역으로부터 제거하여 펩티드의 길이를 15개 아미노산 이하로 줄이고, 그 결과 ILLGLLLLGLVGPIL(15개 아미노산 길이)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 수득하고;
vii) 구조 분석으로, 상기에 기술된 바와 같은, 변형된 펩티드가 헬릭스 구조를 형성함을 확인하고;
viii) 상기 펩티드에 유연성을 부여하기 위해, 펩티드의 중간 및 우측에서 비극성 아미노산(글리신: G)을 각각 소수성 아미노산인 프롤린(P)으로 치환하여, 그 결과 ILLPLLLLGLVPPIL(15개 아미노산 길이)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 수득하고;
ix) 상기 펩티드 서열의 극우측(far right side)에서 반복되는 소수성 아미노산의 일부를 제거하여 펩티드의 길이를 10개 아미노산 이하로 줄인다.
따라서, 거대분자 전달 도메인으로서 최종적으로 최적화된 펩티드는 ILLPLLLLP(9개 아미노산 길이; 서열번호: 98)로 표시되는 아미노산 서열을 가지며 헬릭스 구조를 형성하는데, 이는 "JO-98"로 명명되었다. 상기 JO-98 펩티드의 마지막 아미노산인 프롤린은 재조합 단백질을 형성하기 위해 생물학적 활성 분자와의 상호작용을 위한 유연성 부위이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 MTD 펩티드를 이용하여 세포 투과성을 갖도록 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 활성 분자의 치료적 용도는 이들의 낮은 세포 투과성에 의해 종종 제한된다. 생물학적 활성 분자가 세포내 이입(endocytic) 과정을 통해 세포 내로 유입되는 것처럼 보인다고 하더라도, 이러한 방식으로 세포 내로 들어오는 분자는 일반적으로 세포내 이입 소포(vesicle) 내에 포획되고 리소좀(lysosome) 내에서 분해된다.
본 발명의 MTD는 세포막을 가로지르는 고분자량을 갖는 생물학적 활성 분자의 효율적인 운반을 제공하는 반면, 이전에 조사된 다른 막 운반 펩티드는 약 25개 아미노산보다 큰 크기의 분자를 운반하지 못하는 것으로 나타났다. 본 발명의 MTD는 펩티드 또는 폴리펩티드의 막 투과성을 증강시키기 위해 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 상기 MTD는 키트의 형태로 제공될 수 있는데, 이는 표적 폴리펩티드에 대한 펩티드의 연결을 용이하게 하기 위해 당업계의 숙련자에게 공지된 필요한 구성요소를 포함한다. 이러한 방식으로 MTD에 부착되는 표적 단백질은 이어서 세포내 유입을 위하여 in vitro 또는 in vivo로 세포에 전달될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기에 기술된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 MTD 펩티드의 작용에 의해 세포의 외부에서 내부로 유입될 수 있는 단백질을 생산하도록 단백질 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
발현 벡터는 생물학적 활성 분자로서 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 관심 대상의 전장 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 방향으로, 그리고 거대분자 전달 도메인과 표적 생물학적 활성 분자로 이루어지는 재조합 단백질이 발현될 수 있도록 정확한 해독틀(reading frame) 내로 MTD를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위해 유전적으로 조작된다. 발현 벡터는 원핵(prokaryotic) 또는 진핵(eukaryotic) 발현 시스템에서 사용하기에 손쉽게 이용가능한 것들 중에서 선택될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, MTD는 세포의 외부로부터 내부로 표적 단백질의 세포내 운반을 지시하는, 본 발명의 거대분자 전달 도메인이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, MTD는 세포막을 관통하여 세포의 내부로 펩티드 또는 폴리펩티드의 유입을 매개하는 교대 서열을 포함할 수 있다.
표적 단백질은 일반적으로 세포막을 관통하는 최적 이하의 투과성을 나타내지만, 본 발명의 MTD에 N-말단 및/또는 C-말단이 부착되면, 세포의 외부로부터 내부로 운반되는 단백질이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 절단 부위(cleavage site)가 MTD와 표적 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질 사이에 위치한다. 이 부위는 대안적으로 대상 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 MTD를 물리적으로 제거하기 위해 재조합 단백질의 절단과 관련하여 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 인자(factor) X 부위 또는 다른 부위일 수 있다.
본 발명의 방법은 이들의 작용이 세포 조절 및 생합성 기작을 추가로 설명하는데 도움이 되는, 세포 내부로의 도입을 위해 세포 투과성을 갖는 단백질을 제조하기 위한 수단을 제공한다. 이 방법은 또한 Bcl-2의 도입에 의한 아폽토시스(apoptosis) 억제와 같은, 표적화된 세포 변화를 양산하기 위해 세포 내로 세포내 단백질을 도입하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 세포주기 조절은 비정상적인 p53 단백질로 인해 발암성(tumorigenic)이 되는 그러한 세포 내로 기능성 p53 단백질의 도입에 의해 변경될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 분자"는, 세포 내로 유입되는 경우, 생물학적 효과를 나타낼 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 약 100,000 내지 약 100만 범위의 분자량을 갖는 매우 큰 단백질들(예컨대, 항체, 피브리노겐, 및 마크로글로불린)은 세포에 의해 유출(export)되기 때문에, 매우 큰 단백질들은 본 발명의 방법에 의해 세포 내로 유입될 수 있다. 따라서, 소수 개의 아미노산부터 약 수천 개의 아미노산 범위의 크기를 갖는 단백질이 사용될 수 있다. 단백질의 바람직한 크기 범위는 소수 개의 아미노산부터 약 250개의 아미노산까지이다. 임의의 분자에 대하여, 크기는 약 100만의 분자량까지, 구체적으로 약 25,000의 분자량까지, 및 더욱 구체적으로 약 3,000의 분자량까지일 수 있다. 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 신호 펩티드로서 MTD 펩티드에 부착될 수 있는 그러한 분자들만이 본 발명의 범위 내에 속한다.
생물학적 활성 분자의 예시에는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드가 포함되고, 이들은 성장인자(growth factor), 효소, 전사인자(transcription factor), 독소, 항원 펩티드(백신용), 항체, 및 항체 단편과 같은, 생물학적 활성 분자의 기능적 도메인이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 생물학적 활성 분자의 부가적인 예시에는 플라스미드(plasmid), 코딩 핵산 서열, mRNAs 및 안티센스 RNA 분자와 같은 핵산, 탄수화물, 지질 및 당지질이 포함된다. 생물학적 활성 분자의 다른 예시에는 치료제, 구체적으로 낮은 세포막 투과성을 갖는 것들이 포함된다. 이러한 치료제의 일부 예시에는 다우노루비신(Daunorubicin)과 같은 항암제, 및 이 방법에 의해 투여될 때 사용될 수 있는 보다 낮은 투여량으로 인해, 더 안전하게 투여될 수 있는, 독성 화합물이 포함된다. 생물학적 활성 분자의 또 다른 예시는 항원성(antigenic) 펩티드이다. 항원성 펩티드는 면역반응에 관여하는 세포에 의해 유입될 때 면역학적 보호를 제공하도록 투여될 수 있다. 다른 예시에는 면역억제(immunosuppressive) 펩티드(예컨대, 당업계에 공지된, 자가반응(autoreactive) T 세포를 차단하는 펩티드)가 포함된다. 수많은 다른 예시들이 숙련된 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 적합한 생물학적 활성 분자의 대표적인 예시에는 이들의 기능면에서 효소, 호르몬, 운반 단백질 면역글로불린 또는 항체, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질 및 저장 단백질; 및 이들의 위치 및 역할면에서 막 또는 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 또는 분비 단백질, 바이러스 단백질, 선천성(native) 단백질, 당단백질, 절단된 단백질, 이황화 결합을 갖는 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질 및 프리온(prions)이 포함될 수 있다.
표준 재조합 핵산 방법이 유전적으로 조작된 재조합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 거대분자 전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 예컨대, 적합한 신호 및 처리(processing) 서열 및 전사 및 번역을 위한 조절 서열을 갖는, 핵산 발현 벡터 내로 클로닝된다. 다른 실시형태에서, 단백질은 자동화(automated) 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 단백질을 생산하기 위한 합성 방법은, 예를 들어, 문헌[Methods in Enzymology, Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis by Gregg B. Fields (Editor), Sidney P. Colowick, Melvin I. Simon (Editor), Academic Press (1997)]에 기술되어 있다.
클로닝된 유전자 또는 핵산, 예컨대 MTD 펩티드를 인코딩하는 cDNA의 높은 수준의 발현을 얻기 위하여, MTD 서열은 전형적으로 전사를 유도하는 강력한 프로모터, 전사/번역 종결인자(terminator), 및, 단백질을 인코딩하는 핵산의 경우에는, 전사 개시를 위한 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝(subcloned)된다. 적합한 세균성 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989)]에 개시되어 있다. 본 발명의 MTD 펩티드를 발현하기 위한 세균성 발현 시스템은 예컨대, 대장균(E. coli), 바실러스 종(Bacillus sp.), 및 살모넬라(Salmonella)(Palva 등, Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach 등, Nature 302: 543-545 (1983))에서 이용가능하다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트가 상업적으로 이용가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템이 당업계에 잘 알려져 있고 또한 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 진핵 발현 벡터는 아데노바이러스(adenoviral) 벡터, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated) 벡터, 또는 레트로바이러스(retroviral) 벡터이다.
세포 투과성 재조합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터는 예를 들어, 거대분자 전달 도메인을 인코딩하는 서열에 작동적으로(operably) 부착된, 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 유도성(inducible) 프로모터의 비-제한적인 예시에는 스테로이드-호르몬 반응성 프로모터(예컨대, 엑디손(ecdysone)-반응성, 에스트로겐(estrogen)-반응성, 및 글루타코르티코이드(glutacorticoid)-반응성 프로모터), 테트라사이클린(tetracycline) "Tet-On" 및 "Tet-Off" 시스템, 및 금속-반응성 프로모터가 포함된다. 상기 컨스트럭트(construct)은 적합한 숙주 세포, 예컨대, 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 조직 배양 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 컨스트럭트는 또한 모델 대상으로서 형질전환(transgenic) 유기체를 형성하기 위하여 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 매우 많은 적합한 벡터 및 프로모터가 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며 본 발명의 재조합 컨스트럭트를 형성하기 위해 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 적합한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 벡터를 제작하기 위해 공지된 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 in vitro 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 in vivo 재조합/유전적 재조합이 포함된다. 예를 들어, 이러한 기술은 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기술되어 있다.
*세포 투과성 재조합 단백질을 생산하기에 적합한 숙주 세포에는 세균 세포 및 진핵 세포(예컨대, 진균, 곤충, 식물, 및 포유동물 세포)가 포함된다. 숙주 세포는 냉동-해동 순환(freeze-thaw cycling), 초음파처리(sonication), 기계적 파괴, 또는 세포 용해제(cell lysing agents)의 사용을 포함하는, 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다. 문헌[Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, New York: Springer-Verlag (1994)]은 재조합 (및 비-재조합) 단백질을 정제하기 위한 수많은 일반적인 방법을 기술한다. 상기 방법으로, 예컨대 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 크기-배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피, 선택적 침전, 투석, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 포함될 수 있다. 이들 방법은 세포 투과성 재조합 단백질을 위한 정제 전략을 고안하도록 개조될 수 있다. 만약 상기 세포 투과성 재조합 단백질이 에피토프 태그(epitope tag) 또는 금속 킬레이트(chelating) 서열과 같은, 정제 도구(handle)를 포함한다면, 친화 크로마토그래피가 상기 단백질을 상당히 정제하는데 사용될 수 있다.
생산된 단백질의 양은 직접적으로(예컨대, 웨스턴(Western) 분석 이용) 또는 간접적으로(예컨대, 전기영동 운동성 이동 분석(electrophoretic mobility shift assay)에 의해서와 같이, 특이적 DNA 결합 활성에 대해 세포 유래 물질을 분석함에 의해) 거대분자 전달 도메인을 검출함으로써 평가될 수 있다. 단백질은 정제 전에, 정제의 임의의 단계 중에, 또는 정제 후에 검출될 수 있다. 일부 실행에서는, 정제 또는 완벽한 정제가 필요하지 않을 수 있다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 발현 벡터는 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP)을 포함하는 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, pEGFP-C1(Clontech, Mountain View, CA)이다. 본 발명에 따른 MTD를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 벡터 pEGFP-C1 내(상기 벡터의 EGFP 유전자의 5' 및/또는 3'에)로의 삽입은 MTD 및 EGFP 모두를 도입하는 재조합 단백질의 발현을 가능케 한다. EGFP의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된, MTD는 세포의 내부로 EGFP 단백질을 운반한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 유전적으로 조작된 재조합 단백질은 세포 투과성 단백질이고, 특히 사멸된 또는 약독화된(attenuated) 전(whole) 유기체 백신이 실용적이지 못한 경우에, 단백질-계 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 투과성 단백질은 또한 질환, 특히 암의 치료에 사용될 수 있다. 세포 투과성 단백질은 재조합 벡터로 세포를 형질감염(transfect) 또는 형질전환(transform)시키는 필요성을 배제하면서, 세포의 내부로 전달될 수 있다. 본 발명의 세포 투과성 단백질은 단백질 기능을 조사하기 위해 in vitro로 사용될 수 있거나 세포를 바람직한 상태로 유지하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 MTD는 in vitro 또는 in vivo로 표적 세포의 내부에 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 단백질을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 상기 MTD는 재조합 DNA 또는 RNA 분자로부터 재조합 단백질의 발현에 의해 형성된 펩티드 결합(linkage)을 통해 표적 단백질에 부착될 수 있거나 MTD에 공유적으로 부착되는 링커(linker)에 의해 표적 단백질에 부착될 수 있다. 공유 결합은 세포 내로의 유입을 위하여, 폴리뉴클레오티드와 같은, 비-단백질 분자에 본 발명의 MTD를 부착하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 MTD 펩티드가 생물학적 활성 분자에 작동적으로 부착되어 있는, 본 발명의 세포 투과성 재조합 단백질을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 투과성 재조합 단백질은 배양 배지에 상기 재조합 단백질의 첨가에 의해서와 같이, 당업계의 숙련자에게 공지된 표준적인 방법들 중의 하나에 의해 in vitro로 투여될 수 있다. 또한, 이 방법에 의해 제조된 재조합 단백질이 비경구(parenteral) 투여, 정맥내(intravenous) 투여, 국소(topical) 투여, 에어로졸(aerosol) 투여 또는 흡입(inhalation), 경구(oral) 투여(특히 피막화된(encapsulated) 형태로 제공될 때)를 포함하는 단백질/약물 전달에 이용되는 표준적인 방법들에 의해, 또는 직장(rectal) 또는 질(vaginal) 투여(특히 좌약 형태로 제공될 때)에 의해 in vivo로 전달될 수 있다.
투여의 예시에는 비경구 투여, 예컨대, 국소 관류(regional perfusion)를 포함하는 정맥내 주사, 에어로졸의 흡입, 피하(subcutaneous) 또는 근육내(intramuscular) 주사, 피부 상처 및 병소(lesion)에로와 같은 국소 투여, 예컨대, 대상에게로의 이식 및 이후(subsequent)의 이식을 위해 준비된 골수 세포 내로의 직접 형질감염(transfection), 및 이후에 대상에게 이식되는 기관 내로의 직접 형질감염이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 사용된다면, 비경구 투여, 예컨대 국소 관류는 일반적으로 주사를 특징으로 한다. 주사제(injectables)는 액체 용액, 부유액(suspension) 또는 유화제(emulsion)와 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 일정한 수준의 투여량 유지를 가능케 하면서, 느린 분비 또는 지연된(sustained) 분비 시스템이 또한 사용될 수 있다.
다른 투여 방법으로 특히 복합체가 피막화될 때는, 경구 투여, 또는 특히 복합체가 좌약 형태일 때는, 직장 투여가 포함된다. 약학적으로 허용가능한 담체에는 생물학적이지 않거나 다르게는 바람직하지 않은 임의의 물질, 즉, 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 야기하지 않거나 투여되는 약학적 조성물의 다른 성분들 중의 어느 것과도 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 선택된 복합체와 함께 개체에 투여될 수 있는 물질이 포함된다.
의도된 투여 방식(예컨대, 정맥내, 비경구, 경피(transcutaneous), 피하, 근육내, 두개내(intracranial), 안와내(intraorbital), 안구내(ophthalmic), 뇌실내(intraventricular), 피막내(intracapsular), 척수강내(intraspinal), 수조내(intracisternal), 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal), 직장내(intrarectal), 질내(intravaginal), 에어로졸, 또는 경구 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아님)에 따라서, 약학적 조성물은 예를 들어, 정제, 좌약, 알약, 캡슐, 분말, 액제, 부유액, 로션, 크림, 겔 등과 같은, 바람직하게는 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투약 형태(unit dosage form)로 고체, 반-고체 또는 액체 투여 형태일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 상기에 언급된 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체와 병용하여 유효량의 세포 투과성 재조합 단백질을 포함할 것이고, 추가로, 다른 의학적 제제, 약학적 제제, 담체, 항원보강제(adjuvant), 희석제 등을 포함할 수 있다.
고체 조성물을 위한 통상적인 비독성 고체 담체에는, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 사카린나트륨(sodium saccharin), 탈크(talc), 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘(magnesium carbonate) 등이 포함된다. 약학적으로 투여가능한 액체 조성물은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 활성 화합물, 및 선택적인 약학적 항원보강제를 예를 들어, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 부형제(excipient) 내에 용해시키거나 분산시켜 용액 또는 부유액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 바람직하다면, 투여되는 약학적 조성물은 또한 습윤제(wetting agent) 또는 유화제(emulsifying agent), pH 완충제(buffering agent) 등과 같은, 미량의 비독성 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 투약 형태를 제조하는 실질적인 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있고, 또는 자명할 것이다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 투과성 재조합 단백질의 투여는, 특히 상기 투여가 in vitro 용도로 배양 배지에 재조합 단백질의 첨가에 의해 수행될 때, 10분 내지 72시간 범위의 기간 동안에 수행될 수 있다. in vivo 또는 in vitro 용도를 위하여, 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포 투과성 재조합 단백질의 효과적인 투여 시간은 관련 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
in vivo 또는 in vitro 용도를 위하여, 세포 투과성 재조합 단백질은 임의의 효과적인 농도로 투여될 수 있다. 효과적인 농도는 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 유입을 야기하는 그런 농도이다. 이러한 농도-배양 배지 농도(in vitro) 또는 혈청 농도(in vivo)-는 전형적으로 약 0.1 nM 내지 약 500 μM일 것이다. 특정 재조합 단백질 및/또는 특정 표적 세포를 위한 최적 농도는 본원의 교시에 따라 용이하게 결정될 수 있다. 따라서 재조합 단백질의 in vivo 투여량은 재조합 단백질의 혈청 농도가 약 0.1 nM 내지 약 500 μM, 더욱 구체적으로는, 약 0.5 nM 내지 약 100 μM이 되게 할 농도이다. 물론, 투여되는 재조합 단백질의 양은 치료되는 대상, 대상의 연령 및 체중, 투여 방식, 및 숙련된 관리자의 판단에 좌우될 것이다. 복합체의 정확한 양은 더욱이 대상의 전신 상태, 상기 투여에 의해 치료되는 질환/상태의 중증도(severity), 및 선택된 특정 복합체에 좌우될 것이다. 그러나 적당한 양은 본원에 제공된 교시에 따라서, 통상적인 최적화를 이용하여, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 투과성 재조합 단백질은 백신 투여를 위해 사용될 수 있다(Linqnan 등, Expert. Rev. Vaccines 6: 741-746, 2007; O' Haqan 등, Methods 40: 10-19, 2009).
세포 투과성 재조합 단백질을 이용한 백신은 전형적인 펩티드 백신에 비하여 이점을 제공한다. 항원의 면역 체계 인식은 적당한 항원 처리(antigen processing)에 좌우된다. 예전에는, 전체 단백질 또는 단백질 도메인이 이러한 처리를 야기하도록 세포 내로 전달될 수 없었다. 그 결과, 항원 에피토프를 제시하는 펩티드가 그러한 에피토프를 제시하는 작은 펩티드의 세포 내로의 전달 전에 확인되어야 했다. 본 발명의 방법은 항원성 처리가 야기될 수 있는 세포 내로 전체 단백질 또는 단백질 도메인이 유입되는 것을 가능케 한다. 이는 1회 투여로 다중 항원성 에피토프를 제공하며, 백신 개발을 위한 특정 에피토프의 실험적 확인에 대한 요구를 배제한다.
전형적으로, 이러한 백신은 인간 또는 포유동물 대상 내로의 주사용으로 제조된다. 주사가능 백신은 액체 용액 또는 부유액으로 제조될 수 있다. 주사 전에, 액체 내 용액, 또는 부유액으로 적당한 고체 형태가 제조될 수 있다. 상기 조제품은 또한 유화될 수 있다. 활성 면역성 성분은 종종 상기 활성 성분과 친화성(compatible)이 있는 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된다. 적합한 담체로는 물, 덱스트로스, 글리세롤, 식염수, 에탄올, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 상기 백신의 효과를 증강시키는 항원보조제와 같은, 부가적인 제제를 포함할 수 있다.
상기 백신은 통상적으로 비경구로 투여될 수 있다. 피하 또는 근육내 주사가 적합하다. 다른 투여 방식으로, 펩티드 면역원(immunogen)과, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 또는 다른 담체와 같은, 약학적으로 허용가능한 담체의 병용을 포함할 수 있는, 경구 투여, 비강 투여, 직장 투여, 및 질 투여가 포함될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 용액, 부유액, 정제, 알약, 캡슐, 지연된 분비(sustained release) 제형, 또는 분말을 형성할 수 있다. 본 발명의 단백질-계 백신은 창자의 관내강(lumen) 속으로 상기 폴리펩티드의 분비를 위해 장용-코팅된(enteric-coated) 캡슐에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 세포 투과성 재조합 단백질은 중성 또는 염 형태로 백신 내에 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 산부가염(폴리펩티드의 유리 아미노기를 이용하여 형성됨)을 포함하고 이는, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 아세트산, 만델산, 옥살산, 및 타르타르산과 같은 유기산을 이용하여 형성된다. 폴리펩티드의 유리(free) 카르복실기를 이용하여 형성된 염은 또한, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화철과 같은 무기염, 및 아이소프로필아민(isopropylamine), 트라이메틸아민(trimethylamine), 2-에틸아미노 에탄올(2-ethylamino ethanol), 및 히스티딘(histidine)과 같은 유기염으로부터 유래될 수 있다.
상기 백신은 투약 제형과 친화적인 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적이고 면역원성이 되는 그러한 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 예를 들어, 항체를 합성하는 개인의 면역 체계의 능력 및 바람직한 보호의 정도를 고려하여, 치료되는 대상에 좌우된다. 투여되는 활성 성분(펩티드 면역원)의 정확한 양은 진료의의 판단에 좌우된다. 적합한 투여량 범위는 일반적으로 1회 접종 당 수백 마이크로그램의 활성 성분을 요구한다. 초기 투여 및 추가(booster) 접종을 위한 요법이 또한 가변적인데, 이는 전문의의 판단에 따라 결정되어야만 한다. 백신의 투여량은 투여 경로에 따라 좌우될 것이고 숙주의 크기에 따라 달라질 것이다.
나아가, 본 발명의 세포 투과성 재조합 단백질은 약물 전달 시스템에 효과적으로 사용될 수 있다(Spencer 및 Verma, Proc . Natl . Acad . Sd . USA 104: 7594-7599, 2007; Choi 등, Nat. Med . 12: 574-579, 2006; Vives 등, J. Biol . Chem . 272: 16010-16017, 1997; Kumar 등, Nature 448: 39-43, 2007; Jo 등, Nat. Med . 11 : 892-898, 2005).
본 발명에 따라 세포막 투과성을 갖는 단백질을 유전적으로 조작하는 방법은 세포 내로 치료적 단백질 생성물을 전달하는 수단을 제공한다. 본 발명과 세포외 단백질 전달의 이전에 기술된 방법과의 조합은 제어-분비(controlled-release) 방식으로 안정화된, 기능성 형태로 세포 내로의 유입을 위한 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
폴리펩티드가 적합한 발현 벡터 및 발현 시스템을 이용하여 제조된다. 세포 투과성이 상기 발현된 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치한 MTD와 재조합 단백질의 발현에 의해 단백질 또는 폴리펩티드에 부여된다. 덜 안정한 단백질은 당업계의 숙련자에게 공지되고 앞서 기술된 방법에 의해 안정화된다. 세포외 환경으로의 전달은 마이크로스피어(microsphere) 담체와 같은, 적당한 담체 내에 안정화된 재조합 단백질을 제공함으로써 달성된다. 정선한 단백질은 적당한 안정화 및 전달 기술뿐만 아니라, 적당한 벡터 및 발현 시스템을 지정할 것이다. 약물 전달 시스템 분야의 통상의 지식을 가진 자는 기술된 것들로부터 적당한 기술을 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은 암의 치료를 위한 세포 투과성 단백질을 생산하는 수단을 제공한다. 아폽토시스 및 세포주기 제어의 조절인자(regulator)는 종양발생(oncogenesis)에 중요한 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌고, 한편 p53 유전자를 인코딩하는 아데노바이러스 발현 벡터의 종양내(intratumoral) 주사를 이용하는, 유전자 요법(gene therapy) 기술(Balaggan 등, Gene Therapy 13(15): 1153-1165, 2006; Kuo 등, Proc . Natl . Acad . Sd . USA 10; 98(8): 4605-4610, 2001)은 일부 종양의 제어에 대한 가능성을 보여주었다. 그러나 바이러스 벡터의 사용을 통한 특정 단백질 생성물의 전달은 문제가 있는 것으로 판명되었다. 본 발명의 MTDs 및 방법은 암 상태의 전개에 역할을 담당하는 것으로 확인된 다른 단백질뿐만 아니라, 세포주기 조절인자 및 아폽토시스의 조절인자 중에서 세포 투과성 단백질을 생산하는 수단을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시형태에서, p53 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터 내, 본 발명의 MTD 서열의 5' 또는 3'에 삽입될 수 있다. 정선한 벡터에 적당하고 당업계의 숙련자에게 공지된 발현 조건 하에서, MTD 및 p53 단백질을 포함하는 재조합 단백질이 발현될 수 있다. p53 단백질에 MTD의 부착은 p53 단백질이 세포 투과성을 갖게 하고, 이 단백질은 종양 발달을 억제하기 위해 종양 세포에 투여될 수 있다. 세포 투과성 단백질의 투여는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 종양내 주사, 주입(infusion), 및 정맥내 투여를 포함하는, 다양한 방식으로 달성될 수 있다. Bax 및 Bcl-xL은 세포주기 제어 및 아폽토시스에 영향을 미치고, 따라서, 암 요법에 효과적인 것으로 결정되었던 매우 다양한 단백질들 중에서 다른 예시의 단백질이다. 본 발명의 방법은 종양 세포에 대해 항-종양발생 단백질의 전달을 위한 보다 효율적이고, 덜 노동-집약적이며, 더 저렴한 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포막"은 세포외 공간으로부터 세포 또는 세포 집단을 분리하는 지질-함유 장벽(lipid-containing barrier)을 지칭한다. 세포막은 원형질막, 세포벽, 세포내 소기관(organelle) 막, 예컨대 미토콘드리아막, 핵막 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 분자"는 체계 내에서 생물학적 반응을 촉발시키거나 변형시킬 수 있는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 생물학적 활성 분자의 비-제한적인 예시에는 항체(예컨대, 단일클론, 키메라(chimeric), 인간화(humanized) 등), 콜레스테롤, 호르몬, 항바이러스제(antivirals), 펩티드, 단백질, 화학요법제(chemotherapeutics), 소분자, 비타민, 보조인자(co-factors), 뉴클레오시드(nucleosides), 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소적(enzymatic) 핵산, 안티센스 핵산, 삼중체 형성(triplex forming) 올리고뉴클레오티드, 2,5-A 키메라(chimeras), siNA, siRNA, miRNA, RNAi 억제제, dsRNA, 알로자임(allozymes), 앱타머(aptamers), 이들의 유인물(decoys) 및 유사체가 포함된다. 본 발명의 생물학적 활성 분자는 또한 다른 생물학적 활성 분자. 예를 들어, 지질 및 폴리아민(polyamines), 폴리아미드(polyamides), 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 폴리에테르와 같은 중합체의 약물동태학(pharmacokinetics) 및/또는 약동학(pharmacodynamics)을 조절할 수 있는 분자를 포함하다. 특정 실시형태에서, 용어 생물학적 활성 분자는 용어 "거대분자"와 호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "거대분자"는 펩티드, 단백질, 및 생물학적 또는 합성 기원의 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 예시되는 큰 분자(1000 달톤 이상의 분자량)를 지칭하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "펩티드"는 단일 사슬의 D- 또는 L-아미노산 또는 펩티드 결합에 의해 연결된 D- 및 L-아미노산의 혼합물로 만들어진 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 펩티드는 두 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 길이가 약 50개 아미노산 이하이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 부착된 선형적으로(linearlly) 배열된 아미노산들로 구성되지만, 펩티드와는 달리, 뚜렷한(well-defined) 형태를 갖는다. 펩티드와는 대조적으로, 단백질은 바람직하게는 50개 이상의 아미노산 사슬을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리펩티드"는 하나 이상의 펩티드 결합을 포함하는 두 개 이상의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드가 뚜렷한 형태를 갖는지 여부와 상관없이, 폴리펩티드는 펩티드 및 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "핵산"은, 예를 들어 그들 모두가 단일 또는 이중 가닥 형태인 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는, RNA 또는 DNA의 유사체뿐만 아니라, 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 및 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)과 같은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
아미노산 잔기는 이들의 표준 1-문자 또는 3-문자 표시법에 의해 또는 이들의 완전한 이름에 의해 본원에서 언급된다: A, Ala, 알라닌; C, Cys, 시스테인; D, Asp, 아스파르트산; E, Glu, 글루탐산; F, Phe, 페닐알라닌; G, Gly, 글리신; H, His, 히스티딘; I, Ile, 아이소류우신; K, Lys, 라이신; L, Leu, 류우신; M, Met, 메티오닌; N, Asn, 아스파라긴; P, Pro, 프롤린; Q, Gln, 글루타민; R, Arg, 아르기닌; S, Ser, 세린; T, Thr, 트레오닌; V, Val, 발린; W, Trp, 트립토판; X, Hyp, 하이드록시프롤린; 및 Y, Tyr, 티로신.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "거대분자 전달 도메인(MTD)"은 세포 내로 거대분자의 운반을 용이하게 하는 펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단리된" 폴리뉴클레오티드는 자연계 내에 그것이 관련되어 있는 서열이 실질적으로 없는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 실질적으로 없다는 것은 자연계 내에 그것과 관련되어 있는 물질이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 및 더욱 더 바람직하게는 90% 이상 없는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 또한, 기원 또는 조작에 의해: (1) 자연계 내에 그것과 관련되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 관련되어 있지 않고, (2) 자연계 내에 그것에 연결되는 것과는 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되고, 또는 (3) 자연계 내에 발생하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "작동적으로 부착된"은 프로모터의 DNA 단편, MTD 펩티드 또는 다른 유전자들이 유전자의 발현을 지시하고 조절하기에 충분하게 연결되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "상동성(homology)" 또는 "유사성(similarity)"은 두 서열들(예컨대, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열들) 사이의 유사함 또는 동일함의 비율을 지칭한다. 전형적으로, 서열들에서 보다 높은 유사성은 물리적 또는 화학적 특성 또는 생물학적 활성에 있어 보다 유사함을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 통상적인 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실행하거나 검사하는데 사용될 수 있다고 하더라도, 특정 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 상기 간행물이 인용된 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 기술하고 설명하기 위해 그 전체로서 참고로 본원에 포함된다. 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an", 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 논의된 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 명세서에 대해 단독으로 제공된다. 본원의 어떠한 사항도 본 발명이 이전의 발명에 의해 이러한 간행물에 선행하지 않는다는 승인으로 해석되지는 않는다. 또한, 제공되는 공개 일자는 개별적으로 확인할 필요가 있을 수 있는 실제 공개 일자와 다를 수 있다.
[ 실시예 ]
실시예 1 - 신규한 거대분자 전달 도메인 펩티드의 동정
살아있는 세포의 원형질막을 잠재적으로 통과할 수 있는 신규한 거대분자 전달 도메인(MTD) 후보자를 동정하기 위하여, 신호 서열-유사 도메인을 갖는 분비 단백질을 "신호 서열의 소수성 영역", "신호 서열 소수성 영역", "분비 단백질의 신호 서열", "소수성 신호 서열" 및 "분비 단백질의 소수성 도메인"을 포함하는 몇몇 검색어를 이용하여 PubMed Entrez Protein Database로부터 선발하였다. 그 결과, 신호 서열-유사 도메인을 갖는 1,500개 이상의 분비 단백질이 선발되었다.
신호 서열-유사 도메인을 갖는 선발된 분비 단백질 모두는 이들이 그들의 N-말단에 단일 소수성 영역을 포함하는지 여부를 결정하기 위하여 수치법 분석에 적용되었다. 이어서, 이들은 컴퓨터-보조 게놈 및 프로테옴 정보 분석, 즉 SOSUI 시스템(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui에 기술된 바와 같음)에 적용되어, 이들이 헬릭스 구조를 형성하는지 여부를 결정하였다. SOSUI 시스템은 일반적으로 분석되고자 하는 펩티드가 약 20개 이상의 아미노산 길이를 가질 것을 요구하기 때문에, 증강된 녹색 형광 단백질의 N-말단 도메인으로부터 유래된 부가적인 아미노산을 상기 신호 서열-유사 도메인의 말단에 부가하였다. SOSUI 시스템을 사용하여, 그들의 N-말단에 단일 소수성 영역을 가지며 막횡단 헬릭스 구조를 형성하는 220개의 펩티드 서열을 선발하였다.
선발된 펩티드 서열을 신호 서열로 최적화하기 위하여, 실험적 변경이 하기와 같이 수행되었다: 먼저, 친수성, 비극성, 및 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산을 선발된 펩티드 서열로부터 제거하고, 이어서, 다섯 개의 소수성 아미노산(즉, 알라닌: A, 발린: V, 프롤린: P, 류우신: L, 아이소류우신: I)의 다양한 조합을 실험적으로 고안하였다.
그 후에, 상기 펩티드 서열의 좌측 또는 우측에서 비-소수성 아미노산을 제거하여 이들의 소수성 영역을 유지하면서 크기를 최소화하였고, 이어서 펩티드 서열의 중간 또는 우측에 프롤린을 부가하거나 비-소수성 아미노산을 프롤린으로 치환하여 상기 펩티드에 유연성을 부여하였다. 마지막으로, 반복되는 소수성 아미노산의 개수를 최소화하여 상기 펩티드 서열의 길이를 감소시켰다. MTD 후보자로서 그 결과 펩티드는 소수성 및 유연성을 나타내고, 상대적으로 짧은 아미노산(7개 내지 17개 길이)을 가지며, 헬릭스 구조를 형성한다.
상기에 기술된 방법에 따라, 각각 서열번호: 1 내지 193으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 세포막을 가로지르는 생물학적 활성 분자의 횡단을 용이하게 할 수 있는 신규한 193개 MTD 펩티드들이 동정되었다. 상기 193개 MTDs는 각각 JO-01 내지 JO-193으로 명명되었고, 이들의 구조적 특성 및 서열은 도 1aa 내지 1od에 나타내었다.
실시예 2 - MTDs에 융합된 재조합 단백질의 발현
상기 실시예 1에서 동정된 MTD 펩티드들의 세포 유입의 실행가능성을 증명하고자, 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 전장-단백질 화물 분자로 사용하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 해파리, 아쿠오레아 빅토리아(Aquorea Victoria)로부터 클로닝된 단백질이다. GFP는 가장 폭넓게 사용되는 리포터 단백질들 중의 하나로 청색 또는 자외선 광원이 조사될 때 녹색 빛을 생성한다(Inouye 등, FEBS Letters 351(2): 211-14 (1994)). 본 발명의 일 실시형태에서는, 상업적으로 이용가능한 GFP 발현 벡터, pEGFP-C1(Clontech)을 사용한다. pEGFP-C1에 의해 인코딩되는 EGFP 단백질은 야생형(wild-type) GFP의 돌연변이로, 이는 보다 강한 녹색 빛을 생성하도록 변형되었다. 또한, 외래 유전자(foreign gene)는 pEGFP-C1 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites) 내로 삽입되고, 삽입된 외래 유전자는 EGFP와의 재조합 단백질 형태로 발현된다.
각각의 신규한 MTD에 융합된 EGFP 단백질(His-MTD-EGFP: HME)의 발현 벡터를 제작하기 위하여(도 2), 하기 표 1 및 2에 기술된 올리고뉴클레오티드들(MTD JO-01 내지 JO-193 각각에 대해 정방향(forward) 시발체로 서열번호: 393 내지 585; MTD JO-01 내지 JO-193에 대해 역방향(reverse) 시발체로 서열번호: 586)을 시발체 쌍(primer set)으로, pEGFP-C1 플라스미드를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간의 초기 변성 후에 95℃에서 45초, 68℃에서 45초 및 72℃에서 1분을 30회 수행하고, 72℃에서 5분간의 최종 연장을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 제한효소(restriction enzyme) NdeI으로 절단하고 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행하였다. kFGF-4 유래 MTD 16 머(mer)(FGF-V, AAVALLP AVLLALLAP, Lin 등, J. Biol . Chem . 275: 16774-16778, 2000; Veach 등, J. Biol . Chem. 279: 11425-11431, 2004), kFGF-4 유래 MTD 12 머(FGF-J, AAVLLPVLLAAP, Jo 등, Nat. Biotech. 19: 929-933, 2001; Jo 등, Nat. Med . 11: 892-898, 2005(서열번호: 389), HIV-Tat 유래 단백질 전달 도메인(HIV-Tat, YGRKKRRQRRR, Schwarze 등 Science 285: 1569-1572, 1999), 및 HIV-Tat 동족체(homologous)(Hph-1, YAR VRRRGPRR)를 양성 대조군으로 사용하였고, 스크램블(scramble) 펩티드(서열번호: 387)를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 3a 내지 3c에 나타난 바와 같이, MTDs-EGFP를 인코딩하는 DNA 단편들이 성공적으로 증폭되었음을 확인하였다.
각각의 MTD-EGFP 단백질에 대한 PCR 정방향 시발체 서열
MTD 서열 서열번호
JO-01 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGGTGTGCGCGATTGTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 393
JO-02 5'-CCGCATATGCCGCTGGCGCTGCTGGTGCTGCTGCTGCTGGGCCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 394
JO-03 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGTTTGCGCTGCTGTGCCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 395
JO-04 5'-CCGCATATGCTGCTGGGCGCACTGGCGGCGGTGCTGCTGGCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 396
JO-05 5'-CCGCATATGCCGGTGCTGCTGGCGCTGGGCGTGGGCCTGGTGCTGCTGGGCCTGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 397
JO-06 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGCGGTGCTGCTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 398
JO-07 5'-CCGCATATGATTGTGGTGGCGGTGGTGGTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 399
JO-08 5'-CCGCATATGGCGGTGCTGGCGCCGGTGGTGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 400
JO-09 5'-CCGCATATGCTGGCGGTGTGCGGCCTGCCGGTGGTGGCGCTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 401
JO-10 5'-CCGCATATGCTGGGCGGCGCGG348TGGTGGCGGCGCCGGTGGCGCGGCGGTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 402
JO-11 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGTGCTGGCGGTGCTGCTGGCGGTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 403
JO-12 5'-CCGCATATGCTGCTGATTCTGCTGCTGCTGCCGCTGCTGATTGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 404
JO-13 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGGCGGCGCTGGCGGTGCTGCCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 405
JO-14 5'-CCGCATATGTTTCTGATGCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 406
JO-15 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTGGGTCTGGCGGCGGCGGTGCCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 407
JO-16 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGGCGCTGCTGCTGATTGCGTTTGCGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 408
JO-17 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGGCGGTGGTGCTGATTCCGCTGGGCATTGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 409
JO-18 5'-CCGCATATGGCGGCGCTGATTGGCGCGGTGCTGGCGCCGGTGGTGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 410
JO-19 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGTGGCGGTGGCGGGCCTGGCGCCGCTGGCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 411
JO-20 5'-CCGCATATGATTGCGGTGGCGATTGCGGCGATTGTGCCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 412
JO-21 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGCGGTGCTGGCGGCGCCGGCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 413
JO-22 5'-CCGCATATGGCGGCGCTGGCGCTGGGCGTGGCGGCGGCGCCGGCGGCGGCGCCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 414
JO-23 5'-CCGCATATGCTGGCGGTGCTGGTGCTGCTGGTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 415
JO-24 5'-CCGCATATGGTGGTGGCGGTGCTGGCGCCGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 416
JO-25 5'-CCGCATATGGCGGCGCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT G-3' 417
JO-26 5'-CCGCATATGCCGGCGGCGGTGGCGGCGCTGCTGGTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 418
JO-27 5'-CCGCATATGCTGCTGATTGCGGCGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 419
JO-28 5'-CCGCATATGGCGGCGGTGGTGCTGCTGCCGCTGGCGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 420
JO-29 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 421
JO-30 5'-CCGCATATGCTGCCGGTGGTGGCGCTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 422
JO-31 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCTGGCGGCGCCGCTGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 423
JO-32 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGCTGCTGCTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 424
JO-33 5'-CCGCATATGGCGGTGGCGGTGGTGGCGCTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 425
JO-34 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGATTATTGTGCTGCTGATTGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 426
JO-35 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGGCGGCGGCGGTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 427
JO-36 5'-CCGCATATGCCGGCGGCGCTGGCGCTGCTGCTGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 428
JO-37 5'-CCGCATATGATTGTGGCGCTGCTGCTGGTGCCGCTGGTGCTGGCGATTGCGGCGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 429
JO-38 5'-CCGCATATGATTGTGGCGCTGCTGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 430
JO-39 5'-CCGCATATGCCGCTGGTGCTGGCGATTGCGGCGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 431
JO-40 5'-CCGCATATGCCGCTGGTGCTGGCGGCGCTGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 432
JO-41 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCTGCTGGCGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 433
JO-42 5'-CCGCATATGCCGCTGCTGCTGCTGGCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 434
JO-43 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGCTGGTGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 435
JO-44 5'-CCGCATATGGTGGCGGCGGTGGTGGTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 436
JO-45 5'-CCGCATATGCCGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 437
JO-46 5'-CCGCATATGGTGGTGCTGGTGGTGGTGCTGCCGCTGGCGGTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 438
JO-47 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGTGCCGGTGCTGGTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 439
JO-48 5'-CCGCATATGCCGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGCGGTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 440
JO-49 5'-CCGCATATGCCGCTGGCGATTCTGCTGCTGCTGCTGATTGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 441
JO-50 5'-CCGCATATGCCGCTGCTGGCGCTGGTGCTGCTGCTGGCGCTGATTGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 442
JO-51 5'-CCGCATATGGTGGTGGCGGTGCTGGCGCTGGTGCTGGCGGCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 443
JO-52 5'-CCGCATATGCCGCTGCTGCTGCTGCTGCCGGCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 444
JO-53 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGGTGGCGGCGCTGGCGGTGGTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 445
JO-54 5'CCGCATATGCTGCTGCTGCTGGTGCTGATTCTGCCGCTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 446
JO-55 5'-CCGCATATGCTGGCGGTGGTGGTGGTGGCGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 447
JO-56 5'CCGCATATGGTGCTGCTGGCGGCGGCGCTGATTGCGGTGAGCAAGGGCGAGGA GCTG-3' 448
JO-57 5'-CCGCATATGCTGATTGCGCTGCTGGCGGCGCCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 449
JO-58 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGCTGCTGCTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 450
JO-59 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGGCGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 451
JO-60 5'-CCGCATATGGTGATTATTGCGCTGATTGTGATTGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 452
JO-61 5'-CCGCATATGGTGGTGCTGGTGGTGGCGGCGGTGCTGGCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 453
JO-62 5'-CCGCATATGGTGGCGGTGGCGATTGCGGTGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 454
JO-63 5'-CCGCATATGCCGCTGATTGTGGTGGTGGCGGCGGCGGTGGTGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 455
JO-64 5'-CCGCATATGCCGCTGGCGGTGGCGGTGGCGGCGGTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 456
JO-65 5'-CCGCATATGGCGGCGATTGCGCTGGTGGCGGTGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 457
JO-66 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCTGGCGGCGATTGCGGTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 458
JO-67 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCCGGCGGTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 459
JO-68 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 460
JO-69 5'-CCGCATATGGCGCTGCTGGCGGTGGTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 461
JO-70 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGGTGGTGCTGCCGATTCTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 462
JO-71 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGCTGCTGCTGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 463
JO-72 5'-CCGCATATGCTGGTGGTGCTGCTGGCGGCGCTGCTGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 464
JO-73 5'-CCGCATATGCCGGTGCTGCTGCTGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 465
JO-74 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGGTGGTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 466
JO-75 5'-CCGCATATGGTGATTGTGGCGCTGCTGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 467
JO-76 5'-CCGCATATGGCGCTGGTGCTGCCGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 468
JO-77 5'-CCGCATATGGCGGTGGCGCTGCTGATTCTGGCGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 469
JO-78 5'-CCGCATATGGTGCTGCTGGCGGTGATTCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 470
JO-79 5'-CCGCATATGCTGATTGTGGCGGCGGTGGTGGTGGTGGCGGTGCTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 471
JO-80 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGGTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 472
JO-81 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGGTGCTGCTGCTGATTCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 473
JO-82 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCGGTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 474
JO-83 5'-CCGCATATGGCGGTGGCGCTGGTGGCGGTGGTGGCGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 475
JO-84 5'-CCGCATATGCTGGTGGCGGCGCTGCTGGCGGTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 476
JO-85 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG -3' 477
JO-86 5'-CCGCATATGCTGGCGGTGCTGGCGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 478
JO-87 5'-CCGCATATGGTGGTGGTGCTGCTGGTGCTGCTGGCGCTGGTGGTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 479
JO-88 5'-CCGCATATGGTGGTGATTGCGGTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 480
JO-89 5'-CCGCATATGGTGCTGCTGGTGCTGCTGGCGCTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 481
JO-90 5'-CCGCATATGGTGCTGCTGGTGCTGCTGGCGCTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 482
JO-91 5'-CCGCATATGCCGGTGCTGGTGCCGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 483
JO-92 5'-CCGCATATGCCGGCGCTGGCGCTGGCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 484
JO-93 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGCGCCGGCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 485
JO-94 5'-CCGCATATGATTGTGCTGCCGGTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 486
JO-95 5'-CCGCATATGCTGGTGCTGCTGCTGCTGCCGCTGCTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 487
JO-96 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGGTGGCGCCGGCGCTGGCGGTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 488
JO-97 5'-CCGCATATGATTCTGGTGCTGGTGCTGCCGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 489
JO-98 5'-CCGCATATGATTCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 490
JO-99 5'-CCGCATATGATTGCGCCGGCGGTGGTGGCGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 491
JO-100 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGTGGCGGTGGTGCCGCTGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 492
JO-101 5'-CCGCATATGCTGATTCTGCTGCTGCTGCCGATTATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 493
JO-102 5'-CCGCATATGGCGGTGCTGGCGGCGCCGGCGGTGCTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 494
JO-103 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGCCGGTGCTGCTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 495
JO-104 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGGCGCTGCTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 496
JO-105 5'-CCGCATATGGTGGCGGTGCCGCTGCTGGTGGTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGG AGCTG-3' 497
JO-106 5'-CCGCATATGGCGGTGGCGGTGGCGCCGGTGGCGGCGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 498
JO-107 5-CCCATATGGCGGCGGCGGTGGTGGCGGCGGTGCCGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 499
JO-108 5-CCCATATGGCGCTGCTGGCGGCGCTGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 500
JO-109 5-CCCATTGCGCTGGCGCTGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 501
JO-110 5'-CCGCATATGGCGCTGCTGGCGGCGCTGCTGGCGCTGCTGGCGCTGCTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 502
JO-111 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCTGCCGCTGCTGGTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 503
JO-112 5-CCCATATGGCGGCGGCGGTGCCGGCGGCGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 504
JO-113 5-CCCATTGGCGGCGCTGGCGGTGGCGGCGCTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 505
JO-114 5-CCCATTGGCGGTGCTGGCGGCGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 506
JO-115 5'-CCGCATATGGTGGCGGCGCTGCCGGCGCCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 507
JO-116 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGCTGGCGGTGCCGGCGGTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 508
JO-117 5'-CCGCATATGGCGGCGCTGCTGCCGGCGGCGGTGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 509
JO-118 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGGTGGCGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 510
JO-119 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGGTGGCGCTGCCGGCGGCGGCGGCGCTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 511
JO-120 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGCTGCCGCTGGCGCTGGTGGCGGTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 512
JO-121 5'-CCGCATATGCTGGTGGCGCTGCCGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 513
JO-122 5'-CCGCATATGGTGGTGGTGCCGCTGCTGCTGATTGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 514
JO-123 5'-CCGCATATGCTGGCGGTGGTGCTGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 515
JO-124 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGGTGCCGATTCTGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 516
JO-125 5'-CCGCATATGCTGGTGGCGCTGGTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 517
JO-126 5'-CCGCATATGCTGGTGCTGCTGCTGGCGGTGCTGCTGCTGGCGGTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 518
JO-127 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGCCGGTGGTGGCGCTGGTGATTCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 519
JO-128 5'-CCGCATATGGTGCTGGCGGTGCTGGCGGTGCCGGTGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 520
JO-129 5'-CCGCATATGGTGGTGATTGCGGTGGTGCCGGTGGTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 521
JO-130 5'-CCGCATATGCTGCTGGTGCTGCTGGCGCTGGTGGTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 522
JO-131 5'-CCGCATATGGTGCTGCTGGCGCTGCCGGTGGTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 523
JO-132 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGGTGCCGGCGATTGTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 524
JO-133 5'-CCGCATATGGCGGTGCTGGTGCCGGCGGCGGCGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 525
JO-134 5'-CCGCATATGGTGGTGGCGGCGCTGCCGCTGGTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 526
JO-135 5'-CCGCATATGGCGGCGGTGGCGCTGCCGGCGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 527
JO-136 5'-CCGCATATGCTGATTGCGCTGCCGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 528
JO-137 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGCTGCCGCTGGTGCTGGTGCTGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 529
JO-138 5'-CCGCATATGATTGTGCCGCTGCTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 530
JO-139 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 531
JO-140 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGCTGCCGGTGGCGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 532
JO-141 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGGTGATTGTGCTGGTGCTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 533
JO-142 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGCTGCTGCCGGCGGCGCTGATTCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 534
JO-143 5'-CCGCATATGGCGCTGCTGCCGCTGCTGGCGGTGGTGCTGCCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 535
JO-144 5'-CCGCATATGGCGATTGCGGTGCCGGTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 536
JO-145 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCCGGTGCTGCTGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 537
JO-146 5'-CCGCATATGGCGGCGGCGCCGGTGCTGCTGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 538
JO-147 5'-CCGCATATGGCGGCGCTGGCGGCGCTGGTGGTGGCGGCGCCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 539
JO-148 5'-CCGCATATGGCGGCGCTGGCGGCGGTGCCGCTGGCGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 540
JO-149 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGGTGGCGGCGCCGGCGCTGGCGCTGCTGCCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 541
JO-150 5'-CCGCATATGCTGGTGGCGCTGGTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TG-3' 542
JO-151 5'-CCGCATATGCTGGTGCTGCTGCTGGCGGTGCTGCTGCTGGCGGTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 543
JO-152 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGCCGGTGGTGGCGCTGGTGATTCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 544
JO-153 5'-CCGCATATGGTGCTGGCGGTGCTGGCGGTGCCGGTGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 545
JO-154 5'-CCGCATATGGTGGTGATTGCGGTGGTGCCGGTGGTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 546
JO-155 5'-CCGCATATGCTGCTGGTGCTGCTGGCGCTGGTGGTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 547
JO-156 5'-CCGCATATGGTGCTGCTGGCGCTGCCGGTGGTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 548
JO-157 5'-CCGCATATGGCGGTGGTGGTGCCGGCGATTGTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 549
JO-158 5'-CCGCATATGGCGGTGCTGGTGCCGGCGGCGGCGCTGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 550
JO-159 5'-CCGCATATGGTGGTGGCGGCGCTGCCGCTGGTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 551
JO-160 5'-CCGCATATGGCGGCGGTGGCGCTGCCGGCGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 552
JO-161 5'-CCGCATATGCTGATTGCGCTGCCGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 553
JO-162 5'-CCGCATATGCTGCTGGCGCTGCCGCTGGTGCTGGTGCTGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 554
JO-163 5'-CCGCATATGATTGTGCCGCTGCTGCTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 555
JO-164 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTGCTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 556
JO-165 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGCTGCCGGTGGCGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 557
JO-166 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGGTGATTGTGCTGGTGCTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 558
JO-167 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGCTGCTGCCGGCGGCGCTGATTCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 559
JO-168 5'-CCGCATATGCTGGCGGCGGTGGTGCCGGTGGCGGCGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 560
JO-169 5'-CCGCATATGGTGGCGGCGCCGGCGGCGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 561
JO-170 5'-CCGCATATGGCGGTGCCGGTGCCGGTGCCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 562
JO-171 5'-CCGCATATGCTGCTGATTCTGCCGATTGTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 563
JO-172 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGCTGCCGGCGCTGGCGATTGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 564
JO-173 5'-CCGCATATGGCGGTGATTCCGATTCTGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 565
JO-174 5'-CCGCATATGCTGATTCTGCTGCTGCCGGCGGTGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 566
JO-175 5'-CCGCATATGATTGTGCTGGCGCCGGTGCCGGCGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 567
JO-176 5'-CCGCATATGGTGGTGGTGGTGCCGGTGCTGGCGGCGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 568
JO-177 5'-CCGCATATGCTGGTGGCGGTGGCGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 569
JO-178 5'-CCGCATATGCTGGTGCTGGCGGCGCCGGCGGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 570
JO-179 5'-CCGCATATGCTGATTGCGCCGGCGGCGGCGGTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 571
JO-180 5'-CCGCATATGGCGCTGGCGGCGCTGCCGATTGCGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 572
JO-181 5'-CCGCATATGGCGGTGCTGCTGCTGCCGGCGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 573
JO-182 5'-CCGCATATGATTGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 574
JO-183 5'-CCGCATATGGTGCTGCTGGCGGCGGCGCTGATTGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 575
JO-184 5'-CCGCATATGGCGCCGGCGGTGCTGCCGCCGGTGGTGGTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 576
JO-185 5'-CCGCATATGGTGGTGGGCCTGCTGGTGGCGGCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 577
JO-186 5'-CCGCATATGGCGGCGATTGCGGCGGCGGCGCCGCTGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 578
JO-187 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGGCGGTGGCGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 579
JO-188 5'-CCGCATATGCTGATTCTGCTGCTGCCGCTGGCGGCGCTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 580
JO-189 5'-CCGCATATGGCGCTGCTGCTGCTGGTGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 581
JO-190 5'-CCGCATATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCCGCTGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 582
JO-191 5'-CCGCATATGCTGGCGCTGCCGCTGCTGCTGCCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 583
JO-192 5'-CCGCATATGCTGCTGGTGCTGCCGCTGCTGATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 584
JO-193 5'-CCGCATATGCTGCCGCTGCTGCCGGCGGCGCTGGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3' 585
각각의 MTD-EGFP 단백질에 대한 PCR 역방향 시발체 서열
MTD 서열 서열번호
JO-1~
JO-193		 3'-TTA TCT AGA TCC GGT GGA TCC CGG GCC-5' 586
도 4a를 참고로, PCR로 증폭된 생성물 각각을 TA 클로닝 방법에 따라, T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 pGEM-Teasy 벡터(Promega, Madison WI, USA) 내로 서브클로닝하고, E. coli DH5α에 형질전환(transformed)시킨 후, 형질전환체(transformants)를 50 μg/mL 암피실린(ampicillin), IPTG 및 X-gal을 포함하는 LB 평판 배지(plate media) 상에서 선별하였다. pGEM-Teasy 벡터에 삽입된 재조합 단편을 제한효소 NdeI으로 처리하여 분리한 후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 약 1 kb의 DNA 단편 및 약 3 kb의 벡터 단편이 검출되었고, 이는 MTD-EGFP의 삽입물(insert) DNA가 pGEM-Teasy 벡터 내로 적절하게 서브클로닝되었음을 확인한다(도 4b 내지 4d).
도 5a에 나타난 바와 같이, MTDs-EGFP를 인코딩하는 각각의 단리된 삽입물 DNA 단편을 E. coli 발현 플라스미드 pET-28a(+)(노바젠(Novagen)으로부터 상업적으로 이용가능함, Madison, WI) 내에 클로닝하였다. 상기 pET-28a(+) 플라스미드는 N- 또는 C-말단에서 His-tag 융합을 용이하게 하고 T7 파아지(phage) 프로모터로부터 E. coli 내 유전자의 강력한 발현을 제공하도록 고안된다. 유전자를 인코딩하는 각각의 MTD-EGFP의 3' 말단에서, 상기 코딩 서열은 번역 정지 코돈(translation stop codon)에 뒤이어 His-tag 서열에 NdeI 부위에서 틀 내로 융합되고, 이는 니켈 칼럼 상에서의 용이한 정제를 위하여 C-말단에 부가된 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 MTD-EGFP 재조합 단백질을 생성한다.
상기 클론들을 제한효소 NdeI으로 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 수행한 후, 약 1 kb의 DNA 단편 및 약 5 kb의 벡터 단편이 검출되는 것이 증명되었고, 이는 도 5b 내지 5c에 나타난 바와 같이, MTD-EGFP의 삽입물 DNA가 pET-28a(+) 벡터 내로 클로닝되었음을 확인한다. 나아가, 193개의 신규한 MTDs 중에서, 148개의 MTDs가 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 발현을 위해 성공적으로 클로닝되었음이 확인되었다.
실시예 3 - MTDs에 융합된 재조합 단백질의 유도성 발현 및 정제
상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 MTDs에 융합된 세포 투과성 재조합 단백질을 발현시키기 위하여, His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 포함하는 발현 벡터를 BL21(DE3), BL21-Gold(DE3), BL21-CodonPlus(DE3) 및 BL21-GoldpLysS(DE3) 균주 각각에 형질감염시켰다. kFGF4-유래 MTD(서열번호: 387)를 포함하는 EGFP 발현 벡터를 양성 대조군으로 사용하였고, 아무런 기능을 갖지 않는 스크램블 펩티드(서열번호: 389)에 융합된 EGFP 발현 벡터를 음성 대조군으로 사용하였다. 형질감염 후, 흡광도(optical density) 600(OD600)이 0.4 및 0.6 사이에 도달할 때까지 세포를 격렬한 교반 하에서 카나마이신(kanamycin)(30 μg/ml)을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 배양하였다. 이어서 IPTG(isoprophyl-β-D-thiogalactoside)를 0.6 mM의 최종 농도로 배양액에 첨가하여 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 단백질 유도는 37℃에서 3시간 동안 지속하였다. IPTG를 이용하여 E. coli에서 발현된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔에 로우딩(loading)하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색한 후, 탈염색하였다. 도 6a 및 6b에 나타난 바와 같이, BL21-GoldρLysS(DE3) 균주에서 발현된 일부 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 제외하고는, 대부분의 His-MTD-EGFP 재조합 단백질이 BL21-CodonPlus(DE3)에서 높은 수준으로 발현되었다. 일부 His-MTD-EGFP 재조합 단백질은 발현되지 않았다.
E. coli 시스템에서 His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 유도성 발현은 봉입체(inclusion body)로 알려져 있는, 불용성 응집체(insoluble aggregate)의 형성을 야기한다. 이러한 봉입체를 완벽하게 용해시키기 위해, 상기에 발현된 단백질 모두를 8 M 우레아(urea)에 용해시켜 변성시켰다. 변성된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 니켈 니트릴로트리아세테이트 수지(nickel nitrilotriacetate resin)(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하는, 히스티딘 태그 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 8 M 우레아와 같은 강력한 변성제(denaturant)는 봉입체를 완벽하게 용해시키기 때문에, 이 정제 방법은 pH-의존성(dependent) 변성 조건 하에서 수행되었다.
상기 E. coli 배양액을 4,000× g에서 20분간 원심분리(centrifugation)하여 회수하고, 용해 완충액(lysis buffer)(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, 8 M 우레아, pH 8.0)에 재-부유시키고, 탐침(probe)이 장착된 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 얼음 중에서 초음파처리를 수행하였다. 세포 용해물(lysate)을 7,000× g에서 20분간 원심분리하여, 상청액(supernatant)과 세포 조직파편(debris) 펠렛(pellet)을 분리하였다. 상청액을 취하여 상기 용해 완충액으로 평형화된(equilibrated) Ni-NTA 수지와 가벼운 교반(회전 진탕기(rotary shaker) 이용) 하에서 2시간 내지 밤새 인큐베이션(incubate)하였다. 세척 완충액(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, 8 M 우레아, pH 6.3)으로 5회 세척한 후, 상기 수지에 결합된 단백질을 용출 완충액(elution buffer)(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, 8 M 우레아, pH 4.5)으로 용출하였다. 상기에 기술된 변성 조건 하에서 정제된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였고, 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다.
상기에서 정제된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 탈변성(renature)시키기 위하여, 상기 변성제를 제거함으로써 변성된 단백질을 재중첩(refolding)시켰다. 상기 단백질을 재중첩 완충액(0.55 M 구아니딘(Guanidine) HCl, 0.44 M L-아르기닌, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NDSB, 2 mM 산화형 글루타치온(Glutathione Oxidized), 및 0.2 mM 환원형(Reduced) 글루타치온) 중에서 투석함으로써 우레아를 상기 단백질로부터 제거하였다. 재중첩 재조합 단백질 모두를 세포 배양 배지(예컨대, EMDM(Dulbecco's modified Eagle's Medium))와 같은 생리 완충액(physiological buffer) 중에서 9시간 동안 투석하였다 재중첩 완충액을 DMEM으로 교체한 후, 모든 정제된 재조합 단백질의 세포 투과성은 in vitro 및 in vivo에서 결정되도록 준비되었다. 도 8에 나타낸 SDS-PAGE 분석 결과에 따르면, 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 확립된 148개의 형질전환체 중에서, His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 유도성 발현이 112개의 형질전환체에서 시각적으로 검출된 반면, 4개의 His-MTD-EGFP 재조합 단백질은 시각적으로 검출되기에 충분하게 발현되지는 않았지만 세포 투과성 분석을 위해서는 충분히 정제되었다. 116개 His-MTD-EGFP 재조합 단백질이 가용성(soluble) 형태로 제조되었다.
실시예 4 - MTDs에 융합된 재조합 단백질의 정량적 세포 투과성 결정
His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 세포 투과성을 정량적으로 결정하기 위하여, 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 가용성 형태로 정제된 116개의 재조합 단백질을 0.7 μg/μl의 FITC(fluorescein isothiocyanate)와 혼합하고 교반하면서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. FITC가 완벽하게 제거될 때까지 상기 반응 용액을 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, WeIGENE Inc., Korea) 중에서 2일간 투석하여 FITC-접합(conjugated) 재조합 단백질을 수득하였다. 마우스 대식세포로부터 유래된 RAW 264.7 세포를 10 μM의 FITC-표지된 단백질로 처리하였다. 상기 RAW 264.7 세포를 10% 우 태아 혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린(500 mg/ml, WeIGENE Inc.)이 보충된 DMEM 내에 유지하고, 공기 중 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 세포를 상기에서 제조된 10 μM의 FITC-접합 재조합 단백질 각각과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 이어서 트립신(Trypsin)/EDTA(T/E, Invitrogen, Carlsbad CA, USA)로 처리하여 세포 표면 결합 단백질을 제거하고 냉각 PBS로 3회 세척하였다.
FITC-접합 His-MTD-EGFP 재조합 단백질을 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 분석(FACS Calibur, Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)에 적용하였다. 각각의 시료에 대하여, 세포(1× 104)를 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQuest Pro cytometric analysis) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 각각의 실험을 2회 이상 수행하였다. 신규한 MTDs(JO-01 내지 JO-193)에 융합된 His-MTD-EGFP 재조합 단백질 각각의 세포 투과성 효능을 kFGF4-유래 MTD에 용합된 양성 대조군 단백질의 세포 투과성과 시각적으로 비교하였다.
도 9a 내지 9g는 유세포측정(flow cytometry) 분석 결과를 나타낸 것으로, 여기서 회색으로 채워진 곡선은 세포 단독을 나타내고, 검정색 곡선은 FITC 단독을 나타내고, 청색 곡선은 음성 대조군(스크램블 펩티드)의 세포 투과성을 나타내고, 적색 곡선은 양성 대조군(kFGF4-유래 MTD)의 세포 투과성을 나타내고, 녹색 곡선은 재조합 단백질 각각의 세포 투과성을 나타낸다. 포유동물 세포에서 각 MTD의 세포 투과성을 평가하기 위해, 각각의 FITC-접합 His-MTD-EGFP 재조합 단백질과 인큐베이션 후 정중(median) 형광에 있어서의 변화를 평가함으로써, His-MTD-EGFP 재조합 단백질의 세포 유입(uptake) 효율을 kFGF4-유래 MTD에 융합된 양성 대조군 단백질 및 스크램블 펩티드에 융합된 음성 대조군 단백질의 효율과 비교하였다.
도 9a 내지 9g에 나타난 결과를 참고로, 10 μM의 FITC-접합 His-MTD-EGFP 단백질로 37℃에서 1시간 동안 처리된 세포 모두는 상기 처리 후 정중 형광이 음성 대조군으로 처리된 세포의 것보다 현저히 낮아지는 것과 같은 정중 형광에 있어서의 변화를 수반하지 않았다. 반면, 검사된 111개의 단백질 중에서, 80개의 His-MTD-EGFP 재조합 단백질은 양성 대조군의 것보다 0.5배(50%) 이상 높은 형광 신호를 나타내었디. 이러한 결과는 화물 분자 EGFP와 융합된 새롭게 개발된 신규한 MTDs가 단백질과 같은 거대분자를 살아있는 세포 내로 전달하기에 충분한 현저히 높은 수준의 원형질막-침투 능력을 나타냄을 암시한다.
실시예 5 - MTDs에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성 및 세포내 국소 화(Intracellular Localization) 결정
유세포측정으로 검사된 111개의 FITC-접합 His-MTD-EGFP 재조합 단백질 중에서, 60개의 His-MTD-EGFP 재조합 단백질이 이들의 세포 투과성 및 세포내 국소화의 시각화를 위해 선발되었다. 이들 중에서, 50개의 His-MTD-EGFP 재조합 단백질은 kFGF4-유래 MTD에 융합된 양성 대조군 단백질과 비교하여 0.5배 높은 세포 투과성을 나타내었다.
NIH 3T3 세포를 처리하지 않거나(세포 단독), 또는 FITC(FITC 단독), 또는 음성 대조군(His-스크램블 펩티드-EGFP), 양성 대조군(His-kFGF4-유래 MTD-EGFP) 또는 신규 MTDs에 융합된 재조합 단백질(His-MTDs-EGFP)과 같은 FITC-접합 재조합 단백질로 처리하고, 동초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)으로 시각화하였다. NIH 3T3 세포를 8-웰 챔버 슬라이드(8-well chamber slide)(LabTek, Nalgen Nunc, Rochester NY, USA) 내에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 하에서 10% 우 태아 혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 보충된 DMEM에서 유지하였다. 상기 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 37℃, 5% CO2 하에서 DMEM, DMEM과 유리(free) FITC, 또는 10 μM FITC-접합 재조합 단백질 함유 DMEM으로 1시간 동안 처리하였다. 상기 처리 1시간 후, 관찰을 위하여 세포를 실온에서 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)로 20분간 고정하였다.
내재화된(internalized) FITC-접합 재조합 단백질의 직접적인 검출을 위하여, 상기 세포를 PBS로 3회 세척하고 핵 형광 염색 용액인 1 μg/ml 농도의 요오드화 프로피디움(propidium iodide)(PI, Sigma-Aldrich, St Louis MO, USA)으로 대조염색(counterstain)을 수행하였다. 5분간의 PI 염색 후, 상기 세포를 PBS로 3회 세척하고 DABCO(Fluca, St Louis MO, USA)와 함께 폴리비닐 알코올 봉입제(mountain medium)로 고정하였다. 형광의 세포내 분포가 동초점 레이저 주사 현미경(conforcal laser scanning microscope)으로 분석된 단일 세포의 중심부에서 결정되었고, 그 결과를 도 10a 내지 1Oi에 나타내었다. 각각의 플루오로크롬(fluorochrome)에 대해 특이적인 매개변수는 다음과 같다: FITC: 488 nm 광원에서 여기되고(excited), 530 nm 주파수폭(bandpass) 필터로 검출됨.
놀랍게도, 도 10a 내지 1Oi, 11a, 및 11b에 나타난 바와 같이, 스크램블 펩티드에 융합된 음성 대조군 단백질과 비교하여, FITC-접합 His-MTD-EGFP 재조합 단백질(JO-13, -18, -49, -58, -68, -101, -108, -116, -118, -122, -123, -127, -132, -133, -136, -138, -140, -148, -162, -169, -170, 및 -172)은 세포질 또는 핵 내 또는 모두에 대규모로 고르게 분포하였다. 양성 대조군(1.0배)과 비교하여 0.5배 낮은 세포 투과성을 나타내는, 10개의 MTDs(JO-17, -18, -21, -31, -41, -49, -88, -107, -116, 및 -169)는 1시간 처리 후 세포내 국소화 능력을 나타내었다. 이러한 결과는 유세포측정 분석으로부터 얻은 결과와 완벽하게 일치하였다.
실시예 6 - MTDs에 융합된 재조합 단백질의 in vivo 조직 분포의 결정
in vivo 조직 분포 능력의 분석을 위하여 유세포측정으로 검사된 111개 FITC-접합 재조합 단백질로부터 43개 재조합 단백질을 선발하였다. FITC 단독(DMEM에 유리 FITC 첨가), 음성 대조군(스크램블 펩티드에 융합된 FITC-접합 재조합 단백질), 양성 대조군(kFGF4-유래 MTD에 융합된 FITC-접합 재조합 단백질) 또는 His-MTD-EGFP 재조합 단백질(선발된 신규 MTDs에 융합된 FITC-접합 재조합 단백질) 각각을 Balb/c 마우스(6주령, 암컷, Central Lab. Animal Inc., Korea)에게 300 μg/500 μl/마우스의 투여량으로 복강내로 주사하였다. 2시간 후, 각 마우스의 장기 6곳(즉, 간, 신장, 비장, 폐, 심장 및 뇌)를 적출하고, PBS로 세척하고, O.C.T. 화합물(Sakura, Japan)로 드라이아이스 중에서 신속하게 냉동시켰다. 각 장기의 동결절편(cryosections)(20 μm 두께)을 마이크로톰 냉동박절기(microtome cryostat, Sakura)를 이용하여 제조하고, 이를 글래스 슬라이드 위에 올려 놓은 후, 벡타쉴드 봉입제(Vectashield mounting medium, Vecta lab, Burlingame CA, USA) 내에 봉입하였다. 선발된 신규 MTDs의 in vivo 조직 분포를 형광현미경(fluorescence microscope, Nikon, Japan)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 12a 내지 12i에 나타내었다.
음성 대조군에서는, 어떠한 유의미한 수준의 형광도 관찰되지 않았다. 이와 반대로, kFGF4-유래 MTD에 융합된 양성 대조군 단백질은 모든 장기에서 고르게 분포된 형광 활성을 나타내었다. 선발된 신규한 MTDs에 융합된 재조합 단백질이 주사된 마우스에 대해서는, 장기들 사이에 약간의 미미한 차이가 있다고 하더라도, 유세포측정에 의해 결정된 바와 같이 양성 대조군보다 0.5배 이상 높은 세포 투과성을 갖는 대부분의 MTDs는 모든 장기에서 상대적으로 강력한 in vivo 조직 분포 능력을 나타내었다. 구체적으로, JO-13(1.3배) 및 JO-133(1.5배) MTDs가 뇌를 제외한 모든 장기에서 고르게 분포하였다. 이러한 결과는 유세포측정 및 동초점 레이저 주사 현미경에 의해 그들의 강력한 세포 투과성 및/또는 세포내 국소화 능력이 입증된 신규한 MTDs가 in vitro 및 in vivo에서 거대분자 세포내 전달을 효과적으로 매개할 수 있음을 나타내는 것이다.
요약하면, 본 발명의 방법에 따라 동정된 거대분자 전달 도메인은 도 13aa 내지 13k에 나타난 바와 같은 유도성 단백질 발현, 정제 및 세포 투과성의 특성을 갖는다.
본 발명은 그의 특정한 실시형태를 참고로 상세히 기술되었다. 그러나 그의 범위가 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의되는, 발명의 원리 및 요지를 벗어나지 않으면서 이들 실시형태에 변경이 이루어질 수 있음이 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 인식될 것이다.
<110> ProCell Therapeutics, Inc. <120> NOVEL MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAINS, METHOD FOR THE IDENDTIFICATION AND USES THEREOF <130> PB11-09324D13 <150> US60/887,060 <151> 2007-01-29 <160> 586 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD JO-01 <400> 1 Ala Val Val Val Cys Ala Ile Val Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD JO-02 <400> 2 Pro Leu Ala Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Gly Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD JO-03 <400> 3 Leu Leu Leu Ala Phe Ala Leu Leu Cys Leu Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD JO-04 <400> 4 Leu Leu Gly Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD JO-05 <400> 5 Pro Val Leu Leu Ala Leu Gly Val Gly Leu Val Leu Leu Gly Leu Ala 1 5 10 15 Val <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD 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ccgcatatgc tgctggtgct gctggcgctg gtggtggtgc cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 548 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-156 <400> 548 ccgcatatgg tgctgctggc gctgccggtg gtggcggcgc cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 549 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-157 <400> 549 ccgcatatgg cggtggtggt gccggcgatt gtgctggcgg cgccggtgag caagggcgag 60 gagctg 66 <210> 550 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-158 <400> 550 ccgcatatgg cggtgctggt gccggcggcg gcgctggtgc cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 551 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-159 <400> 551 ccgcatatgg tggtggcggc gctgccgctg gtgctgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 552 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-160 <400> 552 ccgcatatgg cggcggtggc gctgccggcg gcggcgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 553 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-161 <400> 553 ccgcatatgc tgattgcgct gccgctgctg ccggtgagca agggcgagga gctg 54 <210> 554 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-162 <400> 554 ccgcatatgc tgctggcgct gccgctggtg ctggtgctgg cgctgccggt gagcaagggc 60 gaggagctg 69 <210> 555 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-163 <400> 555 ccgcatatga ttgtgccgct gctgctggcg gcgccggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 556 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-164 <400> 556 ccgcatatgc tgctgctggc gccgctgctg ctggcgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 557 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-165 <400> 557 ccgcatatgc tggcggcgct gccggtggcg gcggtgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 558 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-166 <400> 558 ccgcatatgg cgctggcggt gattgtgctg gtgctgctgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 559 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-167 <400> 559 ccgcatatgc tggcgctgct gctgccggcg gcgctgattc cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 560 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-168 <400> 560 ccgcatatgc tggcggcggt ggtgccggtg gcggcggcgg tgccggtgag caagggcgag 60 gagctg 66 <210> 561 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-169 <400> 561 ccgcatatgg tggcggcgcc ggcggcggcg gcgccggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 562 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-170 <400> 562 ccgcatatgg cggtgccggt gccggtgccg ctggtgagca agggcgagga gctg 54 <210> 563 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-171 <400> 563 ccgcatatgc tgctgattct gccgattgtg ctgctgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 564 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-172 <400> 564 ccgcatatgg cgctggcgct gccggcgctg gcgattgcgc cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 565 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-173 <400> 565 ccgcatatgg cggtgattcc gattctggcg gtgccggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 566 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-174 <400> 566 ccgcatatgc tgattctgct gctgccggcg gtggcgctgc cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 567 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-175 <400> 567 ccgcatatga ttgtgctggc gccggtgccg gcggcggcgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 568 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-176 <400> 568 ccgcatatgg tggtggtggt gccggtgctg gcggcggcgg cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 569 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-177 <400> 569 ccgcatatgc tggtggcggt ggcggcgccg gtgagcaagg gcgaggagct g 51 <210> 570 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-178 <400> 570 ccgcatatgc tggtgctggc ggcgccggcg gcgctgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 571 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-179 <400> 571 ccgcatatgc tgattgcgcc ggcggcggcg gtgccggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 572 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-180 <400> 572 ccgcatatgg cgctggcggc gctgccgatt gcgctgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 573 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-181 <400> 573 ccgcatatgg cggtgctgct gctgccggcg gcggcggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 574 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-182 <400> 574 ccgcatatga ttgcgctggc gctgctgccg ctgctggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 575 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-183 <400> 575 ccgcatatgg tgctgctggc ggcggcgctg attgcgccgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 576 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-184 <400> 576 ccgcatatgg cgccggcggt gctgccgccg gtggtggtga ttgtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 577 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-185 <400> 577 ccgcatatgg tggtgggcct gctggtggcg gcgctggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 578 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-186 <400> 578 ccgcatatgg cggcgattgc ggcggcggcg ccgctggcgg cggtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 579 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-187 <400> 579 ccgcatatgc tgctgctggc ggtggcgccg gtgagcaagg gcgaggagct g 51 <210> 580 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-188 <400> 580 ccgcatatgc tgattctgct gctgccgctg gcggcgctgg tgagcaaggg cgaggagctg 60 60 <210> 581 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-189 <400> 581 ccgcatatgg cgctgctgct gctggtgctg gcggtgagca agggcgagga gctg 54 <210> 582 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-190 <400> 582 ccgcatatgc tgctgctgct gctgctgccg ctggcggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 583 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-191 <400> 583 ccgcatatgc tggcgctgcc gctgctgctg ccggtgagca agggcgagga gctg 54 <210> 584 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-192 <400> 584 ccgcatatgc tgctggtgct gccgctgctg attgtgagca agggcgagga gctg 54 <210> 585 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for JO-193 <400> 585 ccgcatatgc tgccgctgct gccggcggcg ctggtggtga gcaagggcga ggagctg 57 <210> 586 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for JO-01 to JO-193 <400> 586 ttatctagat ccggtggatc ccgggcc 27

Claims (15)

  1. 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 운반을 매개할 수 있는 펩티드로, 상기 펩티드가 서열번호: 173의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 단리된 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드.
  2. 제1항에 따른 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 366의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 서열번호: 173의 아미노산 서열로 이루어진 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드; 및 생물학적 활성 분자를 포함하는, 세포 투과성을 갖는 단리된 재조합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 재조합 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 성장인자, 효소, 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 항체, 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 재조합 단백질.
  7. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 효소, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 항체, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 선천성(native) 단백질, 당단백질, 절단된 단백질, 이황화 결합을 갖는 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질 및 프리온(prions)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 재조합 단백질.
  8. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNAs, 안티센스 RNA 분자, 탄수화물, 지질 및 당지질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 재조합 단백질.
  9. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 치료제인 것인 단리된 재조합 단백질.
  10. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 치료 약물 및 독성 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 재조합 단백질.
  11. 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법으로, 상기 방법은 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드를 생물학적 활성 분자에 부착하는 단계를 포함하고, 상기 MTD 펩티드가 서열번호: 173의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 부착이 생물학적 활성 분자의 N-말단, C-말단, 이들 모두 또는 그의 중간에 MTD 펩티드를 부착하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 부착이 펩티드 결합에 의해 MTD 펩티드를 생물학적 활성 분자에 부착하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 부착이 공유 결합에 의해 MTD 펩티드를 생물학적 활성 분자에 부착하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 서열번호: 173의 아미노산 서열로 이루어진 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩티드를 포함하는, 약물 전달용 조성물.
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