KR20200009026A

KR20200009026A - 표면 증강 라만 분광의 방법, 사용 및 장치

Info

Publication number: KR20200009026A
Application number: KR1020197035968A
Authority: KR
Inventors: 박형규; 알리 알툰
Original assignee: 에테하 쭈리히
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2020-01-29
Also published as: EP3401670A1; CN110753838A; EP3622273B1; IL270495B2; EP3622273A1; CN110753838B; KR102459195B1; US20210080396A1; WO2018206389A1; JP2020519874A; IL270495B1; US11125694B2; IL270495A

Abstract

본 발명은 표면증강 라만분광(Surface Advanced Raman Spectroscopy, SERS)을 사용해 분석 물질(3)을 분석하는 방법에 관한 것으로:
a) (1) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면을 제공하고;
b) 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5)를 상기한 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1) 에 증착시키고;
c) 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5) 위에 각각 SERS 활성 금속의 많은 나노 액적 (2)을 증착시키고;
d) 레이저 조사를 스캔하고 SERS를 사용하여 평면 또는 위상 구조의 표면 (1)과 다량의 나노 액적 (2) 사이에 끼어 있는 분석 물질을 분광학적으로 분석하는 단계를 포함한다.
여기서 나노 액적 (2) 의 수평균 직경은 5~70 nm 범위이고, 인접한 나노 액적 (2) 사이의 수평균 거리는 해당 수평균 직경보다 작으며, 단계 c)는 물리적 증기 증착(PVD) 또는 SERS 활성 금속 스퍼터링에 의해 수행한다.
개방형 기공 매트릭스 재료 (5)가 b) 단계에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)에 증착된 경우, 분석물질 (3)이 d) 단계 이전에 기공에 유입된다는 것을 조건으로 한다.

Description

표면 증강 라만 분광의 방법, 사용 및 장치

본 발명은 표면증강 라만 분광(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)을 이용한 분석물질 분석의 방법 및 이러한 방법의 사용과 이 방법에 사용을 위한 다층 구조에 관한 것이다.

물리적 공간의 화학적 발자국을 확인하는 것은 안전, 보안 및 건강에 매우 중요하다. 라만 분광법은 화학 분석 기법으로서 많은 장점을 가지고 있다. 이 기법은 문헌에서 거의 모든 분자, 바이러스 또는 박테리아의 라만 스펙트럼을 찾을 수 있을 정도로 보편적이다. 신호(스펙트럼)가 분석물에 매우 특정적이기 때문에 선택성이 매우 높다. 또한 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC), 질량 분광기(MS), 핵자기공명(NMR), 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 등 다른 분광기법에 비해 훨씬 단순하고 저렴하다. 그러나 민감도가 낮아 포괄적인 화학 분석 도구로서 광범위하게 사용할 수 없다.

SERS는 라만 분광법의 민감도 문제를 해결하는 효과적인 방법이다. SERS는 금속 나노 구조를 사용하여 라만 신호를 크기 별로 증폭시킬 수 있다. 이러한 강력한 개선으로 인해 최근 40년 동안 수많은 연구자들이 이 분야에 발을 들여 놓았다. 그러나 이 기술은 아직 광범위하게 상용화되지 않고 있다. 가장 중요한 과제는 SERS가 검출할 수 있는 분석물의 영역을 확장하는 것이다. 사실 분석물질이 금속 표면에 강한 친화력을 가지는 경우 SERS가 효과적이다. 즉, SERS는 민감도를 개선할 수 있지만 비용이 높아 보편성을 확보할 수 없다.

US 9.036,144는 귀금속 입자를 사용하여 공기 중 분석물질을 포획한 후 귀금속 입자를 표면에 증착하는 방법을 개시한다. 따라서 공기 중 유기 화학물질의 신속한 실시간 SERS 검출을 위해서는 해당 분석물질이 존재하는 공기에서 콜로이드 은 및/또는 금 나노입자 용액을 나노/마이크로 크기의 액적 형태로 분사한다.

EP-A-2433102는 단백질 면역 블롯(immunoblot) 또는 효소결합 면역흡착 측정 절차의 라만 스펙트럼을 스캔하는 스캐닝 라만 분광계를 개시한다. 웨스턴블롯(Western blot) 검사와 ELISA 분석법에 사용되는 이차 항체를 표면증강 라만산란(surface enhanced Raman Scattering, SERS) 라벨에 결합하여 측정 민감도를 높인다. 그 결과로 나온 블롯 또는 웰 플레이트는 샘플의 픽셀 지도를 만드는 라만 시스템으로 분석한다. 더욱 구체적으로, 라만 시스템은 효과적인 선형 조명 패턴을 생성하고 신호가 검출기에 축적되는 동안 선에 수직 방향으로 샘플을 스캔한다. 따라서 각 픽셀은 조명 길이 및 검출기의 신호가 축적되는 시간 내에 샘플이 이동한 거리로 정의되는 직사각형이다. 픽셀은 샘플 지도를 생성하기 위해 순차적으로 획득한다.

JP2010181352는 라만 산란 강도(Raman scattering intensity)를 안정적으로 향상시키고 크기와 양이 더 작은 소재의 라만 스펙트럼을 얻을 수 있는 라만 분광 장치를 개시한다. 라만 분광 장치에서는 분석물질을 위에 놓은 샘플 기판을 금속막으로 인접해 덮고 레이저 광선으로 조사함으로써 라만 산란 광선이 안정적으로 강화되며, 크기와 양이 더 작은 재료의 라만 스펙트럼을 구한다.

WO2015009239는 기판에 부착된 하나 이상의 SERS 활성이며 위상학적 패턴의 나노 구조를 포함하는 표면증강 라만산란(SERS) 활성 장치를 개시하며, 여기서 기판에 있는 하나 이상의 SERS 활성 나노 구조의 배열을 조정하여, (i) 하나 이상의 SERS 활성 나노 구조의 방향각, (ii) 입사 편광(incident polarized light)의 분극화 또는 (iii) 입사 편광의 파장에 따라 강도를 조정할 수 있는 표면증강 라만 신호를 제공한다. SERS 활성 장치를 포함한 식별 태그, 식별 태그를 사용하여 물체를 식별하는 방법, SERS 활성 장치 제작 방법도 제공한다.

KR20160021488은 금속 나노플레이트(nanoplate), 금속 나노플레이트 표면에 부착된 바이오리셉터(bioreceptor), 상기 바이오리셉터에 의해 포획된 바이오마커(biomarker), 바이오마커를 캡핑하는 금속 나노 입자 및 포획된 바이오마커를 분석하기 위한 분광 검출부로 구성된 생화학 물질 진단 플랫폼을 개시한다. 구체적으로는, 표면에 화학적 포획 성분(예: AB)이 증착된 다음, 이러한 포획 성분에 의해 분석물질이 포획되고, 그 후에 귀금속 입자가 분석 물질에 부착된다. 플랫폼은 바이오마커를 끼워 넣고 고정함으로써 고민감도로 생화학물질을 검출할 수 있다. 따라서 화학적 식별/선택성을 가진 수량화 도구다. 식별은 분광학적으로가 아니라 포획의 선택성에 의해 이루어진다.

US 2008174775는 '금속/분석물질/금속' 형태의 '핫스폿(hot spot)'을 통해 표면증강 라만 분광을 촉진하는 복합 기판을 이용하여 샘플 내에 분석물질의 존재 여부를 알아내는 분석 방법 및 그와 관련된 구성을 제시한다. 이를 위해 나노 와이어 브러시 형태의 필러(pillar)를 포함한 매우 특수한 위상 구조의 금속 표면을 제공하며 여기에 분석물질이 증착된다. '금속/분석물질/금속' 형태의 '핫스팟'을 포함한 기판이며, '금속/분석물질/금속' 형태의 '핫스팟' 형성을 돕는 기판을 이러한 기판 제조 방법과 함께 제시한다.

NANOTECHNOLOGY, 2013년 1월 8일 vol. 24, no. 4, 45608 페이지 HONGYUN GUO 외 "표면증강 라만 산란을 위한 샌드위치 구조의 고효율적 구축; 표면증강 라만 산란을 위한 샌드위치 구조의 고효율적 구축"에서 폴리스티렌 나노 구체를 사용한 다음 은 증착 후 폴리스티렌 나노 구체를 제거하여 프리즘 은 돌출부(prismatic silver elevation)가 있는 위상 구조 표면을 생성하는 방법을 개시한다. 그 다음 단계에서, 화학적 결합 성분은 결합 화학 작용기 중 하나를 사용해 프리즘 은 돌출부에 부착되며, 이후 상응하는 은 나노 구체 확산에 표면을 침지시킴으로써 은 나노 구형체는 다른 결합 화학 작용기에 부착된다. 매우 유사한 방법이 WO 2015/160923에 개시되어 있으며, 여기에서 나노 구형체는 나노 구형 표면에 돌출된 것이 특징이다.

그러므로 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 표면증강 라만 분광법을 이용한 분광 분석의 개선된 방법을 제공하는 것이다. 제안하는 방법은 매우 민감하고, 매우 구체적이며, 동시에 보편적으로 적용할 수 있어야 하며, 예를 들어 식품 및 음료 품질 시험뿐 아니라 의약품 연구와 의료 진단에서도 빠르고 저렴하며 신뢰할 수 있는 스펙트럼 분석이 가능해야 한다.

이러한 점에서 출원인은 SERS의 보편성을 지키면서 민감도를 개선하는 새로운 SERS 방법을 개발했다. 이른바 범용 표면증강 라만 분광기(U-SERS)가 이 출원에서 기술하는 핵심 기술이다.

기계 학습(machine-learning) 알고리즘을 U-SERS와 결합할 수 있다. 그렇게 함으로써, 민감하고 선택적이며 보편적이고 빠르고 경제적이며 쉽게 교정할 수 있는 도구를 도입하여 복잡한 화학 혼합물의 분석을 수행할 수 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 SERS(Surface Advanced Raman Spectroscopy)를 이용하여 분석물질을 분석하는 방법에 관한 것이다.

제안하는 방법은 최소한 다음 단계로 구성된다.

a) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면을 제공한다.

b) 분석 물질 또는 개방형 기공 매트릭스 재료를 상기한 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 증착시킨다.

c) 분석 물질 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 위에 각각 SERS 활성 금속의 다량의 나노 액적을 증착시킨다.

d) 레이저 조사를 스캔하고 SERS를 사용하여 평면 또는 위상 구조의 표면과 두꺼운 나노 액적 사이에 끼어 있는 분석 물질을 분광학적으로 분석한다.

분석물질의 증착은 분석물질을 가변 구성의 시간 함수로 넣는 등 분석물질 구성의 구조로서 수행할 수 있다. 예를 들어 크로마토그래피 분리 장치(chromatographic separation device)의 배출구를 분석물질 출처로 사용하고 상기한 단계 a)~d)를 시간 함수로 수행할 수 있다. 이를 위해 일련의 분석물질 액적을 해당 기판에 침적시키고, 증착 지점 간의 시간 변화를 고려하여 그 지점에 대한 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어 제안하는 분석 장치를 분석 물질 출처로서의 액체 크로마토그래피(LC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치와 결합할 수 있다. 레이저 조사를 스캔하고 SERS를 사용하는 분광 분석은 XRF 또는 LIBS와 같은 다른 분석 기술과 순차적으로 또는 그에 부수적으로 결합할 수 있으며, 가급적 동일한 장치와 동일한 샘플 공간을 사용하는 것이 좋다. 라만 분광은 분자 신호를 주며 유기질 및 무기질의 불순물을 검출하는 데 사용할 수 있다. 금속 불순물은 형광 X선(XRF), 가급적이면 마이크로 XRF 또는 레이저 보조 파열 분광법(LIBS)과 같은 원소 분석 기술로 검출할 수 있다. XRF는 특히 고분자량 불순물을 검출하는 데 강력한 반면, LIBS는 저분자량 불순물을 검출하는 데 매우 효과적이다. 진공 또는 제어된 불활성 기체 상태에서 원소 분석 모듈(XRF 또는 LIBS)을 작동시키면 공기 요소에서 오는 배경 신호가 제거되어 신호대잡음비(signal-to-noise)가 개선된다.

SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 관해서는 다음과 같다. 평평한 금속 바닥 표면은 안정적이고 만들기 쉽기 때문에 더욱 선호되지만, 다음과 같이 위상 구조의 금속 표면도 사용할 수 있다.

화학적으로 거친 SERS 활성 금속 표면, SERS 활성 금속 코팅 질감의 표면(예: KOH 식각 실리콘(실리콘 피라미드) 또는 불안정 결정 표면의 형성), SERS 활성 금속 코팅 리소그래피 패턴 표면(리소그래피는 광 리소그래피, e-빔 리소그래피, 이온-빔 리소그래피, 자가 조립(나노 구형 리소그래피, 블록-코폴리머 리소그래피), 나노임프린트 리토그래피가 될 수 있음), SERS 활성 금속 코팅 합성 나노와이어(나노 구조의 상향식(bottom-up) 합성, 예: 탄소 나노구조물, 금속산화물 나노와이어.

평평한 금속 표면은 20 nm 이하, 가급적 10 nm 이하인 금속 표면(예를 들어, EN ISO 4287:2000에 따라 윤곽 곡선의 산술 평균 높이(arithmetical mean deviation of the assessed profile))를 말한다. 또한, 평평한 금속 표면은 평균 수준으로부터의 최대 편차가 15 nm 미만이거나, 가급적 10 nm 미만으로 특징지을 수 있다.

SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면인 바닥 표면의 재료에 대해서는 다음과 같은 대안이 가능하다.

전도성 금속산화물: 인듐 주석 산화물(ITO), 알루미늄 도핑된 산화아연(AZO), 갈륨 도핑된 산화아연(GZO);

그래핀(Graphene)도 바닥 표면으로 사용할 수 있다.

전도성 금속 산화물 또는 그래핀보다 나은 금속 바닥 표면의 장점은 다음과 같다.

1. 더 강력한 SERS 강화

2. 배경 SERS 신호가 없음(그래핀 및 금속 산화물에는 분석물 스펙트럼을 방해할 수 있는 SERS 스펙트럼이 있음).

그러므로, 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 대해 SERS 활성 금속을 참조하는 경우, 가장 포괄적인 의미에서 상기한 전도성 금속 산화물 또는 그래핀을 포함해야 한다.

베이스 SERS 활성 금속 표면에는 구멍(분석물 구조를 유지하는 필터 또는 그물 역할을 함)이 포함될 수 있지만, 특정 영역만이 아닌 전체 표면에 SERS 활성 금속이 인접한 상태로 덮여야 바람직하다. 특히 이러한 베이스 SERS 활성 금속 표면은, 그 사이에 금속으로 덮여 있지 않은 층 표면이 있고 개별적으로 분리된 SERS 활성 금속 돌출부가 형성되지 않는 것이 바람직하다. 용액 샘플에서 불순물의 재현 가능한 탐지를 위해서는 베이스 표면에 증착된 모든 분석물질에 금속-분석물-금속 나노-액적 샌드위치 구조를 형성하는 것이 중요할 수 있다. 이를 위해 베이스 표면은 분석물이 증착된 부위에 금속이 인접한 상태로 완전히 덮이는 것이 바람직하다. 금속 코팅이 없는 표면에 단단한 부분이 있어서는 안 된다. 따라서, 용액 샘플이 금속 코팅된 표면에서 증발하거나 그 표면에 의해 필터링될 때, 표면에 남아 있는 모든 불순물이 코팅된 금속과 접촉하게 된다. 불순물이 증착될 수 있는 금속 코팅이 없는 표면에는 가급적 베이스 재료 부분이 없어야 한다.

분석 물질에 대해서는, 원칙적으로 분석물은 모든 종류의 분석 물질이 될 수 있다. 화학 결합을 통해 SERS 활성 금속 베이스 층 및/또는 나노 액적에 부착되는 화학 링커(chemical linker) 시스템을 포함하거나 이로 구성된 시스템은 가급적 제외하는 것이 바람직하다.

원하는 민감도, 특이성 및 보편성을 얻기 위해 나노 액적의 수평균 직경은 5~70 nm로 선택하고 인접한 나노 액적 사이의 수평균 거리는 그 수평균 직경보다 낮도록 선택한다.

본 발명에 따른 나노 액적의 수평균 직경은 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 수직인 방향을 따라 관측되는 직경을 고려하여 측정한다.

인접한 나노 액적 사이의 수평균 거리는 각 경우의 인접한 나노 액적 사이의 최단 거리로 그 수평균을 계산하여 얻는다.

물론 상기한 설명은 개방형 기공 매트릭스 재료가 b) 단계에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 증착된 경우, 분석 물질을 개방형 기공 매트릭스 재료와 함께 넣지 않으면 d) 단계 이전에 기공에 유입된다는 것을 조건으로 한다.

평면 또는 위상 구조의 금속 표면이나 나노 액적 또는 가급적 두 가지 모두의 SERS 활성 금속은 일반적으로 (원소)귀금속, 가급적이면 은, 금, 백금, 또는 구리, 알루미늄 또는 그 혼합물이나 그러한 금속을 포함하는 합금으로 구성된 그룹에서 선택한다. 은이나 은 합금이 바람직하다.

나트륨 금속 또는 칼륨 금속(산화물 등의 양이온이 아닌 원소 형태)도 SERS 증강 효과를 크게 높인다(Ag보다 훨씬 강력함). 단, 이러한 금속들은 산소에 대해 매우 불안정하다. 그러나 SERS 스캐닝 기계를 Na 또는 K 증착기의 초저 진공실 내부에 설치하면 이러한 금속도 사용할 수 있다. 라만 시스템을 진공실 내부에 설치하는 것이 현실적으로 불가능하게 들릴 수 있지만, 가능하다. 라만 시스템은 소형으로 제작할 수 있다.

바람직한 구현 예에 따라, b) 단계에는 고체 또는 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태의 분석 물질을 캐리어 용액에 옮기고(예: 액적 증착, 스핀 코팅, 또는 분사 기법), 해당 캐리어 용액을 제거하는 단계가 포함된다. 캐리어 액체가 있는 경우, 가급적 온도 상승(조사(irradiation) 또는 이와 유사한 방법으로도 가능)에 의한 증발 및/또는 압력 감소 및/또는 필터링에 의해 제거하는 것이 바람직하다. 여과에 의한 경우, 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 분석 입자를 그대로 유지하면서 캐리어 액체 및 불필요한 입자는 투과할 수 있는 구멍을 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 두는 것이 바람직하다. 이 기법은 분석물질의 부유 입자만 기판에 남고 캐리어 액체에 존재하는 분자는 제거된다는 장점이 있지만, 캐리어 액체가 증발하는 경우 반드시 그렇게 되지는 않는다. 그 결과 특수성과 민감도가 더 높아지고 원하지 않는 신호 중복이 덜하다.

단계 c)는 물리적 증기 증착(PVD) 또는 SERS 활성 금속 스퍼터링(sputtering)으로 수행할 수 있으며, 선택적으로 그 이후 또는 동시에 어닐링(annealing)을 수행할 수 있다(예를 들어 40~300 °C에서 1초 내지 5분 사이). 샘플을 어닐링하면서 SERS 활성 금속을 스퍼터링하는 것도 가능하다. 예를 들어, 이러한 용도의 스퍼터링 기계에 작은 핫 플레이트를 설치할 수 있다. 층 두께가 50 nm 이하, 가급적 30nm 이하가 될 때까지 증착 프로세스를 수행하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 두께는 15 nm 이하 및 9 nm 이하이다. 금속 두께는 일반적으로 (i) 증발기의 수정 결정 모니터(QQM)로 또는 (ii) 스퍼터링 기계의 두께/시간 보정 곡선에 따라 증착 시간을 제어하여 측정한다.

사실 자체 순서 지정 공정(self-ordering process)으로 위에 제시된 증착 공정을 맞춤화함으로써, 수평균 직경 값의 분산이 거의 없고 인접 나노 액적 사이의 수평균 거리에 거의 변동이 없는, 매우 질서 있는(highly ordered) 액적 구조가 자동으로 생성된다. 그 결과 분광 공정에서 2차원 스캔을 수행할 때, 측정되는 신호의 강도에 변동성이 거의 없어 민감도, 특수성 및 보편성이 훨씬 높아진다. 일반적으로 강도의 분산(variance)은 20% 미만 또는 10% 미만까지이다.

바닥 표면을 형성하는 평면 또는 위상 구조 금속 층의 준비는,

평평한 표면의 경우: 실리콘 웨이퍼 / 유리 웨이퍼 / 유리 슬립 / 폴리머 기판에서는 알루미늄/구리 시트 Cr(또는 Ti)를 고착층(예: 두께 3~20nm)으로 코팅한다. 그런 다음, Ag(또는 Au 또는 상기한 다른 금속)를 10~300 nm의 두께로 코팅한다.

금속의 총 두께는 (i) 빈 공간이나 구멍이 없는 연속적 금속막을 보장하고, (ii) 라만 레이저가 바닥 지지 표면에 도달하지 않도록(하부 지지 표면이 라만 스펙트럼을 획득하지 않도록 하기 위해) 가급적 20 nm 보다 큰 것이 좋다.

그런 다음, 드롭 캐스팅, 스핀 코팅, 분사 또는 필터링을 통해 분석 물질을 표면에 증착시킬 수 있다. 가급적 분석 물질 증착은 진공 상태에서 이루어지는 것이 좋다. 진공은 20 mbar 이상으로 한다. 또는, 순도가 가급적이면 99.9%보다 높은 초순도 불활성 기체(N2 또는 Argon) 탱크에서 N2 또는 Argon과 같은 불활성 기체가 공급되는 N2 또는 Argon 환경 등의 불활성 기체 환경으로 할 수 있다. 이러한 환경은 특히 교차 오염을 피하기 위해 바람직하다. 예를 들어, 진공 상태에서 스퍼터링 또는 PVD를 사용하여 a) 단계에서 금속 기초층을 생성하고, 이후 진공 상태 또는 불활성 기체 환경에서 b) 단계와 c) 단계, d) 단계까지 그 자리에서 수행되는 장치의 경우이다.

드롭 캐스팅(Drop casting): 분석 물질을 알코올에 용해할 수 있는 경우, 증기압이 가장 높은 용제(예: 아세톤)를 사용한다. 용제가 빠르게 증발하면 분석 물질 증착이 더욱 균일해지면서 커피 링(coffee-ring) 효과를 제거/최소화한다. 효과적인 개선을 위해서는 분석 물질의 두께가 1미크론 미만이어야 하므로 커피링 효과를 제거해야 한다. 빠른 증발을 촉진하기 위해 기판 온도를 50-80℃까지 올리고/올리거나 압력을 줄일 수 있다.

증발 후, 증착된 분석물질을 50~250도에서 30초 내지 20분 동안 어닐링할 수 있다. 이는 유사한 분석물질의 집적 및 분리에 도움이 될 수 있다. 최종적으로, 분석물질의 나노/마이크로 크기 결정이 표면에 형성된다. 드롭 캐스팅 방법은 소량 농축(small-concentration) 및 소량 샘플(몇 밀리리터 이하)에 이상적이다. 이 방법의 장점은 (1) 간단하고, (2) 모든 분석물질이 표면에 증착된다(분석물질의 무손실)는 점이다.

스핀코팅(Spin-coating): 분석 용액은 금속 표면에 스핀코팅할 수 있다. 일반적으로 500~2000 rpm/s 램프(ramp) 및 500~3000 rpm 회전 속도를 이용한다. 이 방법의 장점은 용제 증발 속도에 관계없이 분석물질이 균일하게 코팅된다는 점이다(커피링 효과 없음). 이 방법의 단점은 스핀코팅 중 발생하는 분석물질의 손실이다. 수율(스핀코팅 중 손실된 분석물질에 대해 표면에 남은 분석물질의 비율)은 (i) 분석 물질 분자량, (ii) 용제에서 분석물질의 용해도 및 (iii) 분석 물질에 대한 금속 표면의 친화력에 따라 달라진다. 용액 샘플에서 분석물질의 증착수율은 다를 수 있다. 그러므로, 특정 용액 샘플의 측정을 교정할 때 이러한 영향을 고려해야 한다. 이 방법은 불순물 분석(예: 의약품 샘플의 불순물 분석)에 이상적이다.

분사(Spraying): 금속 표면에 작은 액적을 생성한다. 개별 미세 액적의 용제가 증발하면서 작은 커피 링이 대량 생성될 수 있다. 다수의 작은 커피 링은 링 두께가 1미크론보다 작으며, 이는 SERS 신호를 실질적으로 증강하기에 충분하다. 단, 분사로 인해 분석물질의 손실이 발생할 수 있다. 분사 대신 마이크로-디스펜싱(micro-dispensing)(예: 잉크젯 프린터 사용)을 사용하여 분석물질의 손실을 방지할 수도 있다.

필터링(Filtering): 이 기법은 나노마이크로 크기의 입자(폴리머 입자, 병원균, 세포 등)를 검출하는 데 이상적이다. 기공의 크기로 분석물질의 차단이 결정된다. 기공보다 큰 분석 물질은 표면에 남는다.

필터 지지층으로는 고분자 막(폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 에스테르, 폴리비닐렌플루오이드, 폴리염화비닐 등), 세라믹 막(알루미나, 실리콘 카바이드, 지르코니아, 티타니아등), 소결 금속막 또는 다른 다공성 지지층을 사용할 수 있다. 필터는 다음과 같이 함께 사용할 수 있다: 기공 지름이 잘 정의된(제어된) 고분자 막을 기공이 더 큰 지지층에 설치할 수 있다. 막 표면에는 Cr(또는 Ti)을 고착층(5~50nm 두께)으로 코팅한다. 그런 다음, Ag(또는 Au 또는 상기한 다른 금속)를 20~500 nm의 두께로 코팅한다. 금속 코팅은 막의 기공을 수축시켜 크기 배제 한도를 결정한다.

금속 코팅 막에 용액 샘플을 지속적으로 붓거나 마이크로 디스펜서를 통해 액적으로 공급할 수 있다. 용제의 유량은 기공 지름, 기공 길이, 막 재료에 따라 달라진다. 필터링의 속도를 높이기 위해 기공 직경을 더 큰 것으로 선택할 수 있다. 기공 입구의 기공 직경은 금속 코팅 두께를 제어하여 미세 조정할 수 있다. 필터링 중에 기판을 회전시켜 용제 유속을 높일 수 있다.

금속화(Metallization): 증착된 분석물질에 대해 금속 증발(열 또는 전자빔) 또는 스퍼터링으로 금속 액적을 코팅할 수 있다.

증발(Evaporation): e-빔 증발기(BAK501, Evatec)를 사용하여 실험을 수행할 수 있다. 양면 테이프를 사용하여 샘플을 금속 고정구에 올린다. 금속원(metal source)와 기판 표면 사이의 거리는 가급적 600mm 정도로 한다. 챔버의 압력은 5x10-7 Torr 미만으로 하는 것이 좋다. 일반적인 증착률은 0.5 Angstroms/sec이다. 실험에서 금속 두께는 3 nm ~ 50 nm 범위가 바람직하며, 일반적으로 30nm 미만으로 한다.

스퍼터링(Sputtering): 스퍼터링 실험은 (Q150R Rotary-Pumped Sputter Coater)를 사용하여 수행할 수 있다. 샘플은 Ar 플라즈마로 인한 손상을 방지하기 위해 챔버 바닥에 배치할 수 있다. 챔버의 압력은 일반적으로 3x10^-2 Torr로 하는 것이 바람직하다. 증착 시간은 가급적 1분 내지 6분 사이로 하며, 그로 인한 두께는 5~30 nm 사이가 바람직하다.

진공으로 손상될 수 있는 세포는 대기압에서 스퍼터링을 수행하여 코팅할 수 있다. 이 경우, 세포를 보호할 정도로 압력을 높게 유지하면서 아르곤으로 배기시키기 위해 진공 밸브와 아르곤 흡입 밸브를 여는 것이 바람직하다. 또 다른 대안은 전극 와이어를 이용한 기압 스퍼터링이다.

라만 스캐닝(Raman-scanning): 이 실험에서는 Renishaw inVia Raman 현미경을 사용한다. 일반적인 파라미터는 다음과 같다: 레이저 파장: 785nm, 레이저 전력: 0.5mW, 통합 시간: 1Ms, 대물 렌즈: x50, NA=0.75.

라만 스캐닝은 X-Y 스테이지를 사용하여 수행할 수 있으며, 여기서 Ag/분석물질/Ag 샘플이 입사 라만 레이저 하에서 이동한다. 또는, 라만 레이저가 샘플의 스테이지 이동과 수직 방향으로 이동할 수 있다. 이러한 X-Y 스캐닝 기법에서 금속/분석물질/금속 구조를 수직 형태로 제작할 수 있다.

더 빠른 스캐닝 방법은 병진 이동(translational movement)으로 샘플을 회전하는 것이다. 이 경우, 샘플 또는 라만 레이저가 병진 이동을 할 수 있다. 초점 영역이 샘플 위에 오도록 유지하려면 샘플로부터 반경 거리에 대해 회전 속도를 조정할 필요가 있다. 이러한 회전식 스캐닝 기법에서 금속/분석물질/금속 샘플의 이상적인 모양은 원형이다.

또 다른 대안으로는, 샘플을 단일 축 방향으로 병진시키면서, 진동하는 MEMS(microelectromechanical) 미러를 라만 레이저 하에 배치하는 것이다. 샘플이 미러 진동 방향에 수직으로 병진함에 따라 진동 미러에 반사된 레이저가 해당 영역을 매핑할 수 있다. 이 경우 MEMS 미러에서 반사된 빔이 샘플 표면에 항상 동일한 초점 영역을 유지할 수 있도록 금속/분석물질/금속 샘플을 긴 반원형 슬릿으로 제작할 수 있다. 이 전략을 분자 분리 기법(예: 모세관 전기영동)과 결합하여 단백질 혼합물을 연구할 수 있다.

스캐닝 기법에 대해 2단계 접근법을 적용할 수 있다. 첫째, 스캐닝은 빠른 스크리닝을 위해 저배율 대물 렌즈(예: x5, x10, x20)를 사용하여 수행한다. 그런 다음 관련 영역(스펙트럼을 제공하는 영역)만 고배율(예: x50 또는 x100) 렌즈로 스캔하여 상세한 고해상도 데이터를 얻을 수 있다.

스캔 후 다음 두 파라미터를 사용해 분석물질의 정량화를 수행할 수 있다. (1) 분석 물질 스펙트럼을 제공하는 픽셀 수 및 (2) SERS 신호 강도. 고농도에서는 분석 물질의 정량화에 픽셀 계수 데이터만으로도 충분할 수 있다. 저농도에서는 SERS 신호 강도도 고려해야 한다.

미세 입자 또는 세포의 경우 해당 픽셀의 카메라 이미지를 촬영하여 입자나 세포의 형태학적 정보를 얻을 수 있다. 세포의 형태학적 정보와 결합된 SERS 스펙트럼은 종양(암) 세포의 진단에 탁월할 수 있다.

스펙트럼 데이터는 프로세서를 사용하여 후처리할 수 있다. 그러나, 수십만 개의 스펙트럼을 후처리하려면 상당한 시간과 연산 능력이 필요할 수 있다. 이상적인 방법은 스펙트럼을 획득하는 중에 실시간으로 처리하는 것이다. 이는 검출기(예: CMOS 포토 센서)에 부착된 로직 카드(예: FPGA 카드)를 프로그래밍하여 구현할 수 있다. 실시간 처리를 사용하여, 관련된 스펙트럼만 컴퓨터로 보내 최종 후처리를 할 수 있다.

c) 단계에서 본질적 반구형의 나노 액적이 생성된다.

나노 액적의 수평균 직경은 일반적으로 10~60 nm 범위, 가급적 15~50 nm 범위가 바람직하며, 및/또는 인접한 나노 액적 사이의 수평균 거리는 1~30 nm 범위, 가급적 5~50 nm 범위가 바람직하다.

분석 층의 두께 및/또는 평면 또는 위상 구조의 금속 층과 나노 액적 사이에 끼어 있는 개방형 기공 매트릭스 재료의 두께는 가급적 1μm 미만이 바람직하며, 가급적 1~900 nm 범위 또는 5~100 nm 범위가 바람직하다.

평면 또는 위상 구조의 금속 표면은 기판 재료상(예: 이산화규소 웨이퍼)에서 5~500 nm, 가급적이면 10~100 nm 두께의 은 및/또는 금 층이 될 수 있으며, 이 때 평면 또는 위상 구조 금속 표면의 표면 거칠기는 50% 미만, 가급적 25% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만으로 하고, 거친 부분의 두께는 100 nm 미만, 가급적 50 nm 미만, 가장 바람직하게는 20 nm으로 한다.

분석 물질은 기본적으로 금속 표면에 증착된 다음 나노 액적으로 덮이는 것은 어떤 물질이라도 될 수 있다. 예를 들어 분석 물질은 최소한 다음 중 하나가 될 수 있다: 무기물 분자 또는 입자, 작은 분자, DNA 분자, 단백질, 펩타이드, 비타민, 식품 성분을 포함한 유기 분자, 박테리아 세포, 바이러스, 원생세포, 인간세포, 혈액세포, 암세포, 순환 종양 세포를 포함한 세포.

d) 단계에서, 조사 빈도(irradiation frequency)는 600~900 nm 범위, 가급적이면 700~800 nm 범위가 바람직하며, 750~800 nm 범위가 가장 좋다. 또한, 분광 검출을 위해 2차원 영역을 스캔하는 것이 더욱 좋다.

평면 또는 위상 구조의 금속 표면에는 평판 또는 위상 구조 금속 표면에 분석물질만 남기는 필터 역할을 할 수 있도록 측정할 분석 입자보다 직경이 작은 다수의 구멍을 제공할 수 있으며, 구멍의 직경은 20~200 nm 범위, 가급적이면 50~100 nm 범위가 가장 바람직하다.

b) 단계에는 가급적 고정 층을 더 추가하거나, 고정 물질을 추가하거나, 또는 평면 또는 위상 구조 금속 표면에 분석물질과 함께 증착되거나 평면 또는 위상 구조 금속 표면에 분석물질이 증착되기 이전 또는 이후에 증착된 교차 연결 캐리어 소재 또는 추가된 고정 물질에 의해 분석물질을 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 고정하는 단계가 포함될 수 있다.

예를 들어 확장된 고분자 소재 등 개방형 기공 매트릭스 재료가 b)단계에서 평면 또는 위상 구조의 표면에 증착된 경우 분석물질은 d) 단계 이전, 가급적 c) 단계 이후 기공에 유입되는 것이 바람직하며, 더 나아가 분석물질은 확산에 의한 기체상으로 또는 액체상으로 또는 침지에 의한 용액으로 기공에 유입되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 식품 및 음료 품질 테스트, 의약품 개발, 의료 진단을 위해 앞서 기술한 방법의 사용에 관한 것이다. 특히 바람직한 사용 분야는 예를 들어 칩 제조 분야에서 고순도 수질 검사를 위한 방법으로 사용하는 것이다. 특히 두 제조 공정 사이에 실리콘 웨이퍼를 세척하는 용도에 사용할 수 있다. 헹굼수는 초순수(Ultrapure Water, UPW)이다. UPW의 불순물이 칩 표면에 증착되면 결함이 발생할 수 있다. 이러한 결함은 제조 수익률과 칩의 신뢰성에 악영향을 미친다. 칩 결함을 최소화하기 위해 UPW의 불순물을 최소화해야 한다. 이러한 용도로 UPW의 불순물은 인라인 불순물 감시장치로 모니터링을 해야 한다. 특정 불순물 유형은 초순수의 여과 및 순환 시스템의 특정 오염원과 관련이 있다. 예를 들어 초순수에서 실리카 함량이 증가하는 것은 한외여과막(ultrafiltration membrane)의 균열을 의미할 수 있다. 붕소 함량의 증가는 이온 교환 레진의 소모를 나타낼 수 있다. 탄소 함량 증가는 물 순환 파이프에서 생물막 형성, O링 노후, 또는 막 재료의 노후를 나타낼 수 있다.

또한 본 발명은 a) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면을 가급적 해당 베이스 표면에 존재하는 모든 종류의 표면 오염을 포함하는 연속적인 층 형태로 생성하기 위한 하나 이상의 모듈,

b) 상기한 평면 또는 위상 구조 금속 표면에 분석물질 또는 개방형 기공 매트릭스 재료를 증착시키기 위한 하나 이상의 모듈,

c) 분석물질 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 위에 각각 SERS 활성 금속의 나노 액적을 대량 증착시키기 위한 하나 이상의 모듈,

d) 레이저 조사를 스캔하고 SERS을 사용하여 평면 또는 위상 구조의 금속 표면과 다량의 나노 액적 사이에 낀 분석물질을 분광학적으로 분석하기 위한 하나 이상의 모듈을 가지는 분석 장치에 관한 것이며,

여기서 상기한 모듈의 기능은 개별 장치 별로 또는 공동 장치 내에서 수행할 수 있으며, 가급적 a)용 모듈과 c)용 모듈은 동일한 장치로 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 다음과 같은 요소로 구성되는 SERS를 사용해 분석물질을 분석하기 위한 다층 구조에 관한 것이다.

a) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면

b) 상기한 평면 또는 위상 구조 금속 표면 상의 분석물질 또는 개방형 기공 매트릭스 재료

c) 평면 또는 위상 구조의 금속 표면과 다량의 나노 액적 사이에 낀 분석물질을 레이저 조사 스캔 및 SERS를 사용하여 분광학적으로 분석하기 위해 조정된, 분석물질 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 위에 각각 증착된 SERS 활성 재료의 다량의 나노 액적.

여기서 나노 액적의 수평균 직경은 5~70 nm 범위이며, 인접한 나노 액적 사이의 수평균 거리는 해당 수평균 직경보다 작다.

물론 여기서도 개방형 기공 매트릭스 재료가 b) 단계에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면에 증착된 경우, 분석물질이 d) 단계 이전에 기공에 유입된다는 것을 조건으로 한다.

이러한 다층 구조에서는 나노 액적의 수평균 직경이 10~60 nm 범위, 가급적 15~15 nm 범위가 바람직하며, 그리고/또는 인접한 나노 액적 사이의 수평균 거리는 1~30 nm 범위, 가급적 5~50 nm 범위가 바람직하다.

또한, 이러한 다층 구조에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면은 기판 재료 상에서 5~500 nm 범위, 가급적이면 10~100 nm 범위의 두께로 된 실버 및/또는 골드 층이 될 수 있으며, 이 때 평면 또는 위상 구조 금속 표면의 표면 거칠기는 50% 미만, 가급적 25% 미만이 바람직하며 10% 미만이 가장 좋다. 거친 부분의 두께는 100 nm 미만, 가급적 50 nm 미만이 바람직하며, 20 nm이 가장 좋다.

본 발명의 상세한 구현은 종속 청구항에 명시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예를 도면을 참조하여 다음에서 설명하며, 이는 본 발명의 바람직한 구현을 설명하기 위한 것이며 이와 동일하게 실시하도록 제한하려는 목적이 아니다. 도면에서,
도 1은 U-SERS의 핵심 기술인 Ag/분석물질/Ag 구조의 단면도이다: a)에서는 Ag 요소 사이에서 증발하거나 또는 증착된 분석물질의 상태가 단면으로 나타나 있다. b)는 다공성 매트릭스가 Ag 요소 사이에 낀 상태로, 해당 매트릭스의 기공이 검출을 위해 분석물질을 흡수할 수 있다. C)는이러한 구조의 상면도이다.
도 2는 U-SERS 절차에 대한 도식적 설명이다. 분석할 용액을 평평한 Ag 표면에 드롭 캐스팅한다. 용제 증발 후, 몇 nm의 Ag가 증착되어 도 1에 표시된 Ag/분석물질/Ag 구조를 만든다. 최종적으로 검출할 표면에서 라만 스캐닝을 수행한다.
도 3은 (a)에서 일부 살충제와 미세오염물질의 특징적 SERS 스펙트럼(아래에서 위로: BPE, Atenolol, Estradiol, BTAH, Ibuprofen, para-Cresidine, 2-Naphthylamine, 1,2-Dichlorobenzene, 4-Aminophenyl disulphide; (b)에서 30 μg Estradiol, 10 μg Atenolol, 5 μg Ibuprofen, 1 μg BTAH, 0.1 μg BPE를 포함한 1 ml 용액 혼합물의 U-SERS 지도를 보여준다.
도 4는 주성분에 대한 차원 축소의 예를 보여준다. SERS 스펙트럼(왼쪽)은 주성분의 선형 조합으로 표현될 수 있다(오른쪽 3개 스펙트럼). 따라서 SERS 스펙트럼은 SERS 강도 및 라만 파상수(wavenumber) 측면에서 수천 개의 파라미터가 아닌 주성분(α1, α2 및 α3)의 요인만으로 설명할 수 있다.
도 5는 화학 혼합물의 실시간 분석을 위한 주성분 분석의 주요 단계에 대한 도식적 설명이다. (1) 특정 용액 혼합물의 주성분 결정, (2) 기준 라이브러리로서의 분석물질 분포 함수 결정, (3) 차원 축소(도 4 참조), (4) 기준 라이브러리에 대해 특정 픽셀에서의 스펙트럼 유사도 수량화, (5) 스펙트럼 카운트의 수량화.
도 6은 U-SERS 장치의 하드웨어에 대한 도식적 설명이다.
도 7은 체(a) 역할을 하는 구멍이 포함된 평면 실버 기판과, 분석물질을 운반하는 액체가 구멍을 통과하는 동안 분석물 입자는 기판 상단에 남김으로써, 박테리아 및 바이러스를 포함한 입자 형태의 분석물질을 증착시키는 방법을 보여준다.
도 8은 SERS 활성 금속의 금속 표면을 분석 장치에서 직접 생성함으로써 교차 오염을 방지할 수 있는 방법을 보여준다.
도 9는 제안하는 방법을 수행하는 분석 장치 상에서 실행 가능한 모듈 세트를 보여준다.
도 10은 좌측의 분석 구조 및 우측의 SEM 사진을 보여주는 또 다른 개략도이다.
도 11은 불순물(분석물)의 위치에 금속 나노 액적 형성을 보여주는 또 다른 SEM 이미지이다.
도 12는 금속 나노 액적 형성에 의해 금속 표면에 증착된 불순물이 어떻게 가시화되는지 보여준다.
도 13은 금속 나노 액적 증착 후 초순수의 불순물에 대한 라만 스캐닝의 예를 나타낸다. (a) 금속 나노 액적을 코팅한 후 금 표면에 있는 초순수 300 마이크로리터의 불순물을 현미경으로 촬영한 이미지가 주어진다. (b) 고속 라만 스캐닝의 영역이 정해진다. 라만 스캐닝을 위한 파라미터는 그림에 나타나 있다. (c) 스캔의 평균 라만 스펙트럼이 주어진다. 이는 10,000 라만 스펙트럼의 평균이다.
도 14는 소수 불순물을 검출하는 신호 대 잡음비를 개선하기 위한 신호 처리 예를 나타낸다.
도 15는 밀도(areal intensity)를 나타낸다.
도 16은 밀도별 불순물 함량을 나타낸다.

U-SERS는 도 1에 나타난 Ag/분석물질/Ag(Ag: 은) 샌드위치 구조 7을 기반으로 한다. 도 1a)에 따른 구조는 평평한 Ag 박막 1, 분석물질 계층 3, 사이 공간 4로 분리된 Ag 나노섬(nonoisland) 2로 구성되어, 샌드위치 구조에 낀 분석물질에서 나오는 라만 신호를 증강시키는 강력한 전기장 개선을 실현할 수 있다.

도 1b)는 이에 상응하는 샌드위치 구조 7로, 여기서 샌드위치 계층 5는 해당 결합 재료와 함께 필요한 경우 분석물질이 아니며, 개방형 기공 재료 계층에 의해 샌드위치 층이 정해진다. 분석 물질 3"은 확산 또는 침지에 의해 이 개방형 기공 재료 계층으로 투과할 수 있다.

도 1c)는 이러한 구조의 상면도로, 개별 나노 액적 2가 서로 매우 가까이 위치하고, 일반적으로 반구형이고 직경이 30, 40 또는 50nm로 다소 균등한 나노 액적 사이의 평균 거리는 제조 공정에 따라 나노 액적 2의 직경보다 상당히 작다는 것을 보여준다.

Ag/분석물질/Ag 구조를 만드는 가능한 절차는 다음과 같다. 도 2에 나타난 바와 같이, 용액 샘플을 평평한 Ag 박막에 드롭 캐스팅한다. 건조 후, 용제는 증발하고 용매(분석물질)는 Ag 표면의 임의의 위치에 증착된다. 열을 가해 건조 공정을 가속화하면 분석물질을 더욱 균일하게 코팅할 수 있다. 그런 다음 스퍼터링 또는 금속 증발을 사용하여 몇 나노미터 두께의 Ag를 증착시켜 분석물질 계층 위에 나노섬을 형성한다. Ag 나노섬이 형성되면서 색상이 짙은 청색으로 변화하는 것은 스펙트럼의 적색 부분에서 강력한 빛의 결합을 나타낸다. 실제로, Ag/분석물질/Ag 구조는 녹색 및 파란색 레이저에 비해 빨간색 자극 레이저(785nm)에서 더욱 강력한 SERS 증강을 보여준다. 샘플 준비 절차 후, 라만 스캐닝을 수행한다. Ag/분석물질/Ag 구조의 뚜렷한 파란색은 스캔할 영역을 선택하는 데 있어 시각적 지침을 제공한다. 실험 세부 사항은 상기한 내용을 참조한다.

도 3은 U-SERS 개념의 증명이다. 일부 살충제와 미세오염물질의 스펙트럼은 도 3a에 나타나 있다. 이러한 분석물질 중 BPE와 BTAH만이 금속에 친화력이 강하다는 점을 유의한다. U-SERS는 분자가 금속 표면에 대해 가진 친화력의 영향을 방지하므로, 분자의 휘발성이 크지 않은 한 어떤 분석물질에서도 SERS 스펙트럼을 얻을 수 있다.

U-SERS의 주요 장점은 여러 분석물질을 동시에 검출할 수 있다는 것이다. 도 3b는 그러한 복합 검출의 한 예다. 다섯 개의 분석 물질로 이루어진 용액을 15분 동안의 스캔으로 간편하게 분해할 수 있었다. 스펙트럼 지도에서 각 색상은 하나의 분석물질을 나타낸다. 실험의 세부 사항은 상기한 내용을 참조한다.

지도에서 회색 음영 부분은 혼합물에 포함된 분석물질의 상대량과 상관관계가 있다. 일부 픽셀에서는 용액(BPE)의 소수 종류도 검출할 수 있었다. 지도에서 픽셀 수를 늘리면 민감도와 수량화 정확도가 향상된다.

U-SERS의 샘플 준비 절차는 약 5분이 소요된다. 반면 스캔 시간은 픽셀 수(또는 스캔 영역)에 따라 다르다. 최신 라만 스캐너는 초당 약 100 스펙트럼의 스캐닝 속도로 제한된다. 여기서, 저강도 라만 신호는 픽셀당 검출 시간(통합 시간)이 더 많이 필요하기 때문에 일반적인 라만 스캐닝에는 초당 100 스펙트럼도 충분히 빠르다는 점이 중요하다. 그러나, Ag/분석물질/Ag 구조는 신호를 약 5배로 증폭시켜, 스캔 속도 개선의 여지가 상당히 높다는 점을 시사한다.

U-SERS 시스템은 액체 취급 모듈, 금속화 모듈 및 스캐닝 모듈로 구성해야 한다.

최신 라만 시스템은 데이터 수집을 완료한 뒤, 데이터 처리를 수행한다. 그러나 수백만 개의 스펙트럼을 처리해야 한다면 후처리는 실행 가능한 전략이 아니다. U-SERS의 목표 획득 속도는 초당 10,000 스펙트럼이다. 이렇게 높은 스캔 속도는 실시간 데이터 처리가 필요하다. 실제로 실시간 패턴 인식은 다양한 응용 분야에서 잘 정립된 분야이다. 응용 분야의 한 예로는 감시 카메라에서 사람 얼굴을 실시간으로 인식하는 것이다. 본 발명의 출원인은 SERS 스펙트럼의 실시간 처리를 위해 이러한 기술을 적용할 예정이다. 활용할 구체적인 알고리즘은 주성분 분석(PCA)이다. PCA는 주성분을 사용하는 스펙트럼의 차원(크기) 축소에 근거한다. 차원 축소 현상은 도 4에 가상의 사례를 사용하여 설명되어 있다.

PCA를 적용하기 위해서는 우선 주성분을 결정해야 한다. U-SERS 실험의 경우, 이 작업은 새로운 용액 샘플에 대한 교정 프로세스의 일환이다. 용액에 포함된 각 분석물은 주성분의 통계적 분포 함수의 측면에서 설명해야 한다. 이중 분석(bi-analyte) 용액의 시스템 교정은 U-SERS 분자 스캐너를 사용하여 1시간 이내에 수행할 수 있으며, 이는 교정에 몇 주가 걸릴 수 있는 HPLC 등의 최신 화학 분석 기법보다 상당히 빠르다. 분석물질에 대한 교정 라이브러리를 갖춘 PCA 코드는 데이터를 실시간으로 처리할 수 있다. 일반적인 PCA 알고리즘의 단계는 도 5에 나타나 있다.

U-SERS는 고성능의 경제적 화학 분석 기술이 필요한 모든 분야에 기여한다.

시장 조사에 따르면, 다음 세 가지 분야가 시장으로 나타났다: (1) 식품 및 음료 품질 시험, (2) 의약품 개발, (3) 의료 진단이다.

식품 테스트의 병목 현상은 샘플 정재 시간에서 나타난다. 표준 샘플에는, 살충제가 존재할 가능성과 함께, 비타민, 아미노산, 지방과 같은 다른 분자도 다수 서식할 것이다. 그렇게 복잡한 혼합물은 HPLC 시험 전에 정제해야 한다. 정제 작업은 2일 내지 5일이 소요될 수 있다. 신선한 음식은 유통 기한이 짧기 때문에 시험 결과를 얻기 전에 슈퍼마켓의 진열대에 놓인다. 품질 시험 결과가 지연되면 분명 공중 보건에 위험이 초래된다. U-SERS는 복합적인 기능 때문에 정제 절차를 최소화할 수 있다. 농약 오염과 함께 식품의 성분(예: 비타민, 지방 함량)에 대한 종합적인 정보까지 제공할 수 있다.

U-SERS는 또한 새로운 솔루션에 대해 새 HPLC 프로토콜을 개발하기 위해 지속적으로 노력하는 의약품 개발에 뚜렷한 잠재력을 갖고 있다. 교정 시간이 매우 짧은 U-SERS는 전반적인 의약품 개발 프로세스를 현저하게 줄일 수 있다. U-SERS의 또 다른 분야는 의료 진단이다. 혈액 내 박테리아 및 바이러스의 직접 검출은 U-SERS 적용에 대한 주제이다. 다시 말하자면, U-SERS의 복합 기능은 여러 가지 다른 병원체의 검출을 지원하는 동시에 다양한 테스트를 하나의 U-SERS 테스트로 통합하여 인슐린 수준 등 혈액에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다.

도 6에 나타난 바와 같이 하드웨어는 빠르고 저렴한 CMOS형 분광계(spectrometer)에 기반한다. SERS 신호는 이미 Ag/분석물질/Ag 구조를 통해 증폭되므로 저효율 CMOS 광검출기를 보정할 수 있다. U-SERS 기판(Ag-코팅 CD)의 회전 제어와 대물 렌즈의 선형 이동 제어는 전광판을 통해 이루어진다.

분석물질의 수량화는 다음 두 파라미터를 사용하여 수행한다. (i) 분자의 스펙트럼이 검출되는 픽셀 수 및 (ii) 특정 SERS 피크의 평균 강도. 상대적으로 더 높은 농도에서는 수량화에 첫번째 파라미터만으로 충분하다.

샘플 준비 절차 중 용제 증발율이 충분히 높지 않을 경우 드롭 캐스팅으로 인해 분석물질이 균일하지 않게 코팅(커피링 효과)될 수 있다. 이 경우 평면 기판 대신 약간 좁아지는 용기를 사용한다. 이러한 구조로 인해 U-SERS 측정에 충분할 정도로 수천 개의 더 작은 커피링이 형성된다.

신호 강화는 U-SERS를 통한 영역이지만, 일부 분석물질은 본질적으로 라만 단면적이 더 크다. 이러한 라만-공명(Raman-resonant) 분석물질이 다른 분석물질과 공존하는 경우, 전자인 라만 공명 분석물질의 신호가 결합 스펙트럼을 좌우할 수 있다. 기계학습 알고리즘은 그러한 과제를 고려하여 구성된다.

도 7은 분석하려는 해당 입자를 유지하기 위해 적절한 크기의 구멍 8개를 기판에 설치하는 것이 가능한 방법을 보여준다. 입자는 박테리아나 바이러스가 될 수 있으므로, 기판을 연속 프로세스에서도 체 디렉터(sieve director)로 사용할 수 있다.

도 8은 기본 기판 즉 금속을 적용하기 전 평면 또는 위상 구조의 표면에 있는 표면 불순물로 인한 교차 오염을 얼마나 효과적으로 방지할 수 있는지 보여준다. 표면 오염 11을 포함할 수 있는 받침 기판 10은 깨끗한 바닥 금속 필름 1로 코팅된 분석 장치에 바로 있다. 증발 과정은 (i) 압력이 20 mbar 이상인 진공 상태 또는 (ii) N2 또는 아르곤과 같은 불활성 기체 환경에서 진행된다는 점에서 공기로 인한 교차 오염은 제거할 수 있다.

라만 스캐닝 후 불순물 영역을 확인할 수 있다. 불순물에 대한 마이크로 XRF 스캐닝을 추가로 실시하여 불순물에 대한 "원소 분석(elemental analysis)"을 수행할 수 있다. 라만 분광법은 무기 및 유기 불순물을 식별하는 데 사용할 수 있다. 마이크로 XRF를 사용하면 금속 불순물도 검출할 수 있다.

실제 기계는 도 9에 도시된 바와 같이 여러 모듈로 구성할 수 있다: (1) 스퍼터링 모듈, (2) 수분 증발 모듈, (3) 소모품 모듈, (4) 라만 스캐닝 모듈, (5) 마이크로 XRF 모듈 및 (6) 서로 다른 모듈 간에 소모품을 전달하는 메인 콘솔. 모든 모듈은 N2 또는 아르곤 환경에 구성하여 교차 오염을 최소화할 수 있다.

도 10은 계층 1의 금속 스퍼터링(또는 금속 증발) 후 금속의 나노 액적 2가 어떻게 불순물(분석물질 2) 위치에만 형성되는지 도시한다. 예컨대, 불순물의 표면 에너지가 금속보다 낮다. 불순물(분석 물질)이 존재하지 않는 위치에서는 나노 액적이 형성되지 않는다. 이 프로세스는 화학물질이 없다(화학 물질로 인한 교차 오염이 없음)는 점에 유의한다. 콜로이드 나노 입자를 사용하여 불순물에 그러한 나노 입자를 형성했다면 콜로이드 용액의 불순물을 사용했을 것이다. 또한, 나노 입자는 불순물에서 밀도가 높고 균일하게 코팅되어 있다. 금속 나노 액적 형성은 재현 가능한 프로세스(스퍼터링 또는 금속 증발)에 기초해 재현할 수 있다. 또한 불순물과 나노 액적 간에 화학적 결합이 필요하지 않다. 콜로이드 용액에 기반한 프로세스는 증착된 불순물(분석물질)과 나노 입자 사이의 화학적 결합을 필요로 한다. 도 11은 불순물 위치에 금속 나노 액적의 형성을 보여주는 또 다른 SEM 이미지이다.

도 12는 금속 나노 액적을 불순물에 증착하면 금속 나노-액적-분석물-금속 구조가 빛을 흡수하는 것을 보여준다. 이는 불순물 위치의 색상을 바꾼다. 그러므로 분석물질의 위치가 쉽게 가시화된다. 이 광학적 효과로 라만 스캔의 효율성이 더욱 높아진다.

도 13은 금속 나노 액적 증착 후 초순수의 불순물에 대한 라만 스캔의 예를 보여준다. (a) 금속 나노 액적을 코팅한 후 금 표면에 300 마이크로리터의 초순수 불순물을 현미경으로 촬영한 이미지. 여기서 Ag 6 nm는 1 옹스르롬/s 증착률로 코팅된다. (b) 고속 라만 스캔 영역. 라만 스캐닝에 대한 파라미터는 그림에 나타나 있다. (c) 스캔의 평균 라만 스펙트럼. 이는 1만 라만 스펙트럼의 평균이다. 이 실험에서 초순수의 총 실리카, 총 탄소, 총 붕소 농도는 각각 3000 ppt, 1800 ppt, 13 ppt이었다. 평균 스펙트럼에서 실리카(970 cm-1) 및 탄소(1600 cm-1)를 정의하는 대역을 명확히 볼 수 있다. 그러나 814 cm-1에 있는 붕소(보르산)에 특정된 대역도 볼 수 있다.

도 14는 불순물의 라만 대역을 더욱 가시화하기 위해 신호 처리 방법을 구현하는 방법을 보여준다. 이 신호 처리는 소수종(이 실험에서는 붕산)의 검출에 특히 유용하다. 도 14의 스펙트럼(원시 데이터)은 도 12에 기술된 스캔 지도에서 10,000 스펙트럼의 샘플 스펙트럼이다. 이러한 10,000 스펙트럼 각각에 대해 유사한 신호 처리를 수행하여 (라만 시프트(Raman shift) 측면에서) 피크 위치 및 피크 강도를 식별한다. 이 신호 처리 방법의 결과를 다음 그림에 설명된 절차에 사용한다.

도 15는 앞의 그림에 설명된 신호 처리 후에 "밀도"를 계산할 수 있음을 보여주며, 이는 검출된 각 라만 대역의 총 라만 수와 총 면적 범위를 곱한 것이다. 도 15a는 도 13c와 같은 《평균 스펙트럼》이다. 도 15b는 데이터 처리 후 《변환 스펙트럼》이다. 도 15a의 y축은 라만 계수이다. 도 15b의 y축은 밀도이다. 밀도는 스캔된 영역에서 전체 강도와 특정 라만 시프트(Raman shift)의 면적 범위(areal coverage)의 곱이다. 도 15c는 도 15b의 확대 이미지로서, 붕산을 설명하는 피크를 나타낸다. 붕산의 대표적인 U-SERS 대역은 814cm^-1이다. 밀도를 계산할 때는 불순물에서 비롯되는 라만 대역을 증폭시킨다. 이러한 증폭은 소수 불순물에서 오는 라만 대역을 식별하는 데 특히 도움이 된다. 이 실험에서 초순수의 총 실리카, 총 탄소, 총 붕소 농도는 각각 3000 ppt, 1800 ppt, 13 ppt이었다. 신호 처리 후 신호 대 잡음비를 크게 개선할 수 있어 붕소(보르산)를 쉽게 검출할 수 있었다. 붕산의 대표적인 U-SERS 대역인 814 cm^-1은 도 15a에서 거의 보이지 않는다는 점에 유의한다.

도 16은 붕산(보르산)의 양이 다양한 샘플에 대해 실험을 수행할 때 증발된 초순수에서 붕산의 무게와 관련하여 붕산의 밀도 측면에서 보정 곡선을 얻을 수 있음을 보여준다.

1 평평한 은 기판, 박막
2 은 나노 액적
3 분석물질
3' 검출할 증착 분석물질
3" 5의 기공에 있는 분석물질
4 2 사이의 공간
5 다공성 매트릭스
6 용액 혼합물
7 Ag/분석물질/Ag 구조
8 1의 구멍
9 입자, 바이러스/박테리아
10 받침 기판
11 표면 오염

Claims

표면증강 라만분광(Surface Advanced Raman Spectroscopy, SERS)을 사용해 분석 물질(3)을 분석하는 방법에 있어서:
a) (1) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면을 제공하고;
b) 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5)를 상기한 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1) 에 증착시키고;
c) 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5) 위에 각각 SERS 활성 금속의 많은 나노 액적 (2)을 증착시키고;
d) 레이저 조사를 스캔하고 SERS를 사용하여 평면 또는 위상 구조의 표면 (1)과 많은 나노 액적 (2) 사이에 끼어 있는 분석 물질을 분광학적으로 분석하는;
단계를 포함하는 분석 물질 분석 방법,
여기서 나노 액적 (2)의 수평균 직경은 5~70 nm으로, 인접한 나노 액적 (2) 사이의 수평균 거리는 해당 수평균 직경보다 작게 하는 방법,
단계 c)는 물리적 증기 증착(PVD) 또는 SERS 활성 금속 스퍼터링에 의해 수행하는 방법;
개방형 기공 매트릭스 재료 (5)가 b) 단계에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)에 증착된 경우, 분석물질 (3)이 d) 단계 이전에 기공에 유입된다는 것을 조건으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
평면 또는 위상 구조 금속 표면 (2), 나노-액적 (2) 또는 가급적 둘 모두의 금속을 가급적 은, 금, 백금 또는 구리 등 귀금속, 나트륨, 칼륨 또는 알루미늄 또는 그 혼합물 또는 그러한 금속을 포함하는 합금으로 구성된 그룹에서 선택하는 방법,
가급적 한 분석 기기에서 수행하며, a) 단계에 따른 SERS 활성 금속의 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1)의 실제 생성, b) 단계에 따른 분석 물질 증착, c) 단계에 따른 나노 액적의 증착, d)에 따른 분광학적 분석을 동일한 분석 장치 내에서 수행하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)는 용액, 현탁액 또는 에멀젼인 분석물질 (3)을 캐리어 액체에 옮기는 방법 및 캐리어 액체를 제거하는 단계를 포함하는 방법,
제거는 가급적 증발에 의해, 가급적 온도 상승 및/또는 압력 감소 및/또는 여과에 의하는 방법,
후자의 경우, 분석 입자를 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (2)에 유지하면서 캐리어 액체 및 불필요 입자가 투과할 수 있도록 평면 또는 위상 구조의 금속 평면 (1)에 구멍(8)을 제공하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)는 물리적 증기 증착(PVD) 또는 SERS 활성 금속 스퍼터링으로 수행하며, 선택적으로 그 이후 또는 동시에 어닐링을 수행하는 방법.
가급적 층 두께가 50 nm 이하, 30 nm 이하, 15 nm 또는 9 nm 이하가 될 때까지 증착 프로세스를 수행하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)에서 본질적으로 반구형인 나노-액적 (2)을 생성하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
나노 액적 (2)의 수평균 직경을 일반적으로 10~60 nm, 가급적 15~50 nm으로 하고, 그리고/또는 인접한 나노 액적 (2) 사이의 수평균 거리는 1~30 nm 범위, 가급적 5~50 nm 범위로 하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
분석 층의 두께 및/또는 평면 또는 위상 구조의 금속 층 (1)과 나노 액적 (2) 사이에 끼어 있는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5)의 두께는 가급적 1μm 미만, 가급적 1~900 nm 범위 또는 5~100 nm 범위로 하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)은 기판 재료 (10) 상에서 5~500 nm, 가급적이면 10~100 nm 두께의 은 및/또는 금 층이며, 이 때 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1)의 표면 거칠기는 50% 미만, 가급적 25% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만으로 하고, 거친 부분의 두께는 100 nm 미만, 가급적 50 nm 미만, 가장 바람직하게는 20 nm으로 하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
분석 물질은 무기물 분자 또는 입자, 작은 분자, DNA 분자, 단백질, 펩타이드, 비타민, 식품 성분을 포함한 유기 분자, 박테리아 세포, 바이러스, 원생세포, 인간세포, 혈액세포, 암세포, 순환 종양 세포를 포함한 세포 중 하나 이상으로 하는 방법.
세포의 경우 가급적 형태학적 정보가 단계 d)의 스캔 프로세스에서 결정하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
d) 단계에서, 조사 빈도(irradiation frequency)는 600~900 nm 범위, 가급적이면 700~800 nm, 가장 바람직하게는 750~800 nm 범위로 하고, 더욱 바람직하게는 분광 검출을 위해 2차원 영역을 스캔하는 방법.
및/또는 d) 단계에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)과 다량의 나노 액적 (2) 사이에 낀 레이저 및/또는 분석물질이 서로에 상대적으로 이동하는 스캔을 통해 스캐닝 레이저 조사 및 SERS 사용을 수행하는 방법.
이 스캐닝에 있어서 레이저 및/또는 샌드위치 구조에 낀 분석물질이 두 방향, 가급적 직교 방향으로 이동하는 X-Y 스캐닝에 의해,
또는 샌드위치 구조에 낀 분석물질의 회전과 레이저의 병진 이동과의 결합에 의해,
또는 샘플을 단일 축 방향으로 병진시키면서, 진동하는 MEMS(microelectromechanical) 미러를 라만 레이저 하에 배치함으로써 스캔하는 방법,
그리고/또는 d) 단계의 스캐닝에서 먼저 빠른 스크리닝을 위해 첫 번째 확대 대물 렌즈를 사용해 스캐닝을 수행한 다음 가급적이면 스펙트럼을 제공하는 영역에서만 두 번째 확대 대물 렌즈를 사용하여 스캐닝을 수행하는 방법(상기한 두 번째 확대 렌즈는 상기한 첫 번째 확대렌즈보다 큼),
그리고/또는 단계 d)의 분석 전후 또는 분석 이후, XRF, LIBS 또는 이들의 조합을 포함한 다른 분석 기법을 사용하여, 가급적 동일한 장치 및 가장 바람직하게는 동일한 샘플 공간과 준비를 사용해 분석물질을 분석하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)에 측정할 분석 입자보다 직경이 작은 다수의 구멍 (8)을 포함시키는 방법,
구멍 (8)의 직경은 가급적 20-200 nm 범위, 가장 바람직하게는 50-100 nm 범위로 하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
b) 단계에 가급적 고정 층을 더 추가하거나, 고정 물질을 추가하거나, 또는 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1)에 분석물질 (3)과 함께 증착되거나 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1)에 분석물질이 증착되기 이전 또는 이후에 증착된 교차 연결 캐리어 소재에 의해 분석물질을 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)에 고정하는 단계를 포함시키는 방법.
및/또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5)가 b)단계에서 평면 또는 위상 구조의 표면 (1)에 증착된 경우 분석물질 (3)은 d) 단계 이전, 가급적 c) 단계 이후 기공에 유입하는 방법,
더욱 바람직하게는 분석물질을 확산에 의한 기체상으로 또는 액체상으로 또는 침지에 의한 용액으로 기공에 유입하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
용제에 대해, 특히 수질 검사, 가급적 고순도 수질 검사에서, 특히 칩 제조 분야, 식음료 품질 테스트, 의약품 개발, 의료 진단에서 가급적 a)~d) 모든 단계를 수행하는 하나의 분석 장치를 사용.
그리고/또는 a) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)을 생성하기 위한 하나 이상의 모듈,
b) 상기한 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1)에 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5)를 증착시키기 위한 하나 이상의 모듈,
c) 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5) 위에 각각 SERS 활성 금속의 나노 액적 (2)을 다량 증착시키기 위한 하나 이상의 모듈,
d) 레이저 조사를 스캔하고 SERS을 사용하여 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)과 다량의 나노 액적 (2) 사이에 낀 분석물질을 분광학적으로 분석하기 위한 하나 이상의 모듈을 가지는 분석 장치,
여기서 상기한 모듈의 기능은 개별 장치 별로 또는 공동 장치 내에서 수행할 수 있으며, 가급적 a)용 모듈과 c)용 모듈은 동일한 장치로 사용, 더욱 바람직하게는 공급용 인라인 장치로 완전 자동화할 수 있는 장치를 사용.
SERS를 사용해 분석물질 (3)을 분석하기 위한 다층 구조에 있어서,
a) SERS 활성 금속의 본질적 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1);
b) 상기한 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1) 상의 분석물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5);
c) 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)과 다량의 나노 액적 (2) 사이에 낀 분석물질을 레이저 조사 스캔 및 SERS를 사용하여 분광학적으로 분석하기 위해 조정된
분석 물질 (3) 또는 개방형 기공 매트릭스 재료 (5) 위에 각각 증착된 SERS 활성 금속의 다량의 나노 액적 (2) 요소를 포함하는 다층 구조;
여기서 나노 액적 (2)의 수평균 직경은 5~70 nm으로, 인접한 나노 액적 (2) 사이의 수평균 거리는 해당 수평균 직경보다 작게 하는 구조.
개방형 기공 매트릭스 재료 (5)가 b) 단계에서 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)에 증착된 경우, 분석물질 (3)이 d) 단계 이전에 기공에 유입된다는 것을 조건으로 하는 구조.
제14항에 있어서,
나노 액적 (2)의 수평균 직경은 10~60 nm, 가급적 15~15 nm 범위로 하며, 및/또는 인접한 나노 액적 (2) 사이의 수평균 거리는 1~30 nm 범위, 가급적 5~50 nm 범위로 하는 다층 구조,
및/또는 평면 또는 위상 구조의 금속 표면 (1)은 기판 재료 (10) 상에서 5~500 nm, 가급적이면 10~100 nm 두께의 은 및/또는 금 층이며, 이 때 평면 또는 위상 구조 금속 표면 (1)의 표면 거칠기는 50% 미만, 가급적 25% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만으로 하고, 거친 부분의 두께는 100 nm 미만, 가급적 50 nm 미만, 가장 바람직하게는 20 nm으로 하는 다층 구조.