CN110753838B

CN110753838B - 表面增强拉曼光谱的方法、用途和装置

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Publication number: CN110753838B
Application number: CN201880031165.1A
Authority: CN
Inventors: 朴衡圭; 阿里·阿尔通
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: WO2018206389A1; IL270495B1; IL270495A; IL270495B2; JP2020519874A; US20210080396A1; CN110753838A; KR102459195B1; EP3622273B1; EP3401670A1; KR20200009026A; US11125694B2; EP3622273A1

Abstract

披露了一种利用表面增强拉曼光谱法(SERS)分析分析物(3)的方法，包括以下步骤：a)提供SERS活性金属的基本平坦的或者拓扑结构化的金属面(1)；b)在平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上沉积该分析物(3)或开孔基材(5)；c)分别在所述分析物(3)或开孔基材(5)上沉积大量的SERS活性金属的纳米液滴(2)；d)通过扫描激光辐射并利用SERS来光谱分析夹在平坦的或拓扑结构化的金属面(1)与大量的纳米液滴(2)之间的所述分析物；其中，纳米液滴(2)的数均直径在5‑70纳米范围内，且在相邻的纳米液滴(2)之间的数均间距小于它们的数均直径，并且步骤c)通过物理气相沉积(PVD)或者通过溅射SERS‑活性金属进行，条件是若在步骤b)中开孔基材(5)被沉积在平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上，则分析物(3)在步骤d)之前被引入该孔中。

Description

表面增强拉曼光谱的方法、用途和装置

技术领域

本发明涉及利用表面增强拉曼光谱法(SERS)分析分析物的方法、这种方法的用途以及用在这样的方法中的多层结构。

现有技术

我们物理空间的化学足迹的识别对我们的安全、安保和健康至关重要。作为化学分析技术，拉曼光谱法有许多优点。它是通用的，因为人们可以在文献中找到几乎任何分子、病毒或细菌的拉曼光谱。它是高选择性的，因为其信号(频谱)对分析物是高特异性的。此外，相比于其它光谱学技术如高效液相层析法(HPLC)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和基质辅助激光解吸/电离法(MALDI)，它简单且廉价许多。但是，低灵敏度限制了其广泛用作综合性化学分析工具。

表面增强拉曼光谱法(SERS)是用于应对拉曼光谱学灵敏度问题的有效方法。采用金属纳米结构，SERS能以多个量级增强拉曼信号。这样的显著增强近40年来将大量研究人员吸引到该领域。但该技术的广泛商业化尚未得以实现。最重要的挑战是要扩展能被SERS检测的分析物领域。现实中，SERS在分析物对金属表面强烈亲和的情况下已经是有效的。换言之，SERS能提高灵敏度，但显著的代价是通用性损失。

US9.036,144披露了一种利用贵金属粒子捕获空气传播分析物并随后在表面上沉积连同所捕获的分析物在内的贵金属粒子的方法。因此，为了空气中有机化学物的快速实时的SERS检测，胶体银和/或金纳米粒子溶液以纳米/微米尺寸液滴的形式在存在有感兴趣的分析物的空气中被喷洒。

EP-A-2433102披露了一种扫描拉曼分光计用于蛋白质免疫印迹或酶联免疫吸附试验方法的扫描拉曼光谱。测量灵敏度通过将在蛋白质印迹法和ELISA方法中使用的二级抗体与表面增强拉曼散射(SERS)标签相结合而被提高。所得到的印迹或阱板用形成样本像素图的拉曼系统来分析。确切说，拉曼系统产生有效线形发光图案并在垂直于该线的方向上扫描样本，同时信号在探测器上累积。每个像素因此是由发光长度和样本在探测器上的信号累积的持续时间内所走过的距离限定的矩形。该像素被依次获取以产生样本图。

JP2010181352披露了一种拉曼光谱仪，其能稳定增强拉曼散射强度并获得具有较小尺寸和较小量的材料的拉曼光谱。在拉曼光谱仪中，其上安放有分析物的样本基材被连续覆盖金属膜且被激光照射，由此，拉曼散射光被稳定增强，并获得了具有较小尺寸和较小量的材料的拉曼光谱。

WO2015009239披露了一种表面增强拉曼散射(SERS)活性装置，其包括至少一个附接至基材的SERS活性拓扑构图化纳米结构，其中在基材上布置的至少一个SERS活性纳米结构适于提供表面增强拉曼信号，信号强度依据以下条件可调：(i)至少一个SERS活性纳米结构的方位角，(ii)入射偏振光的偏振，或者(iii)入射偏振光的波长。也提供包含SERS活性装置的识别标签、用识别标签识别物体的方法、SERS活性装置的制造方法。

KR20160021488披露了一种生化材料诊断平台，其包含：金属纳米板；附接在金属纳米板的表面上的生物受体；由生物受体捕获的生物标志物；用于捕获生物标志物的金属纳米粒子；和用于分析所捕获的生物标志物的光谱探测单元。具体说，在表面上沉积化学捕获部分(如AB)，随后分析物被这些捕获部分捕获，接着，贵金属粒子附至分析物。该平台能够通过夹持并固定生物标志物很灵敏地检测生化材料。因此它是具有化学识别能力/选择性的量化工具。识别通过捕获选择性来进行，而不是通过光谱学。

US2008174775提出了与如下相关的组合物和分析方法，即使用复合基材确定样本中是否有分析物，该复合基材通过利用′金属/分析物/金属′形式的“热点”促成表面增强拉曼光谱法。为此提供包含呈纳米线刷形式的柱状体的很特殊的拓扑结构化金属面，分析物被沉积在其上。它们是包含′金属/分析物/金属′形式的“热点”的基材，以及提出了促成′金属/分析物/金属′形式的“热点”形成的基材以及制造所述基材的方法。

HONGYUN GUO等人在“用于表面增强拉曼散射的定向夹层结构的高效构建”(纳米技术，第24卷，第4号，2013.01.08，第45608页)中披露了一种方法，在此，利用聚苯乙烯纳米球产生具有棱柱形银凸起的拓扑结构化表面，随后是银沉积和随后去除聚苯乙烯纳米球。在后续步骤中，化学结合部分被关联至具有其中一个化学结合功能的棱柱形银凸起，接着，银纳米球通过在对应的银纳米球分散体中浸渍该表面与其中另一结合化学功能相关联。WO2015/160923披露了一种很相似的方法，在此，纳米球的特点是在纳米球表面上有凸起。

发明内容

因此，本发明的目的是提供改进的借助表面增强拉曼光谱法的光谱分析方法。所提出的方法应该高度灵敏、高度特异性且同时可通用，并且例如应容许例如在食品饮料质检中、但也可在药品研究以及医学诊断中的快速、廉价且可靠的光谱学分析。鉴于此，申请人研发了一种新颖的SERS方法学，其在保留SERS通用性的同时提高了灵敏度。所谓的通用表面增强拉曼光谱法(U-SERS)是在本申请中描述的核心技术。

机器学习算法可与U-SERS组合。这样一来，灵敏的、选择性的、通用的、快速的且买得起的并且能简单标定的工具可以被加入以执行复杂化学混合物的分析。

确切说，本发明涉及一种利用表面增强拉曼光谱法(SERS)分析分析物的方法。

所提出的方法至少包括以下步骤：

a)提供SERS活性金属的基本平坦的或拓扑结构化的金属面；

b)在所述平坦的或拓扑结构化的金属面上沉积所述分析物或开孔基材；

c)分别在该分析物或开孔基材上沉积SERS活性金属的大量的纳米液滴；

d)通过扫描激光辐射且利用SERS来光谱分析被夹在平坦的或拓扑结构化的表面与大量的纳米液滴之间的分析物。

分析物的沉积可以作为分析物成分的结构来进行，例如通过与时间相关地以可变的成分加入该分析物。例如可以使用色谱分离装置的输出物作为分析物源并与时间相关地执行上述步骤a)-d)。为了这样做，可以在相应的基材上沉积一连串分析物液滴并对所述点进行分析，考虑所述点的沉积之间的时间演变。例如可以将所提出的分析装置与作为分析物源的液相色谱(LC)或高效液相色谱(HPLC)装置相结合。借助扫描激光辐射并利用SERS的光谱分析也可以依次或同时地与其它分析技术例如XRF或LIBS相结合，优选在同一装置和同一样本空间中：拉曼光谱法给出一个分子信号并且能被用来检测有机和无机杂质。金属杂质能利用元素分析技术例如x射线荧光光谱分析(XRF)、优选微区XRF或者激光诱导机击穿光谱法(LIBS)来检测。XRF尤其在检测高分子量杂质方面很有效，而LIBS在检测低分子量杂质方面很有效。在真空或受控惰性气体条件下运行元素分析模块(XRF或LIBS)消除了来自空气元素的背景信号，改善了信噪比。

关于SERS活性金属的基本平坦的或拓扑结构化的金属面，以下：尽管平坦的金属底面因其可靠和易制作而是优选的，但人们也可以使用下述的拓扑结构化的金属面：

化学糙化的SERS活性金属面；SERS活性金属涂覆的糙化表面(例如KOH蚀刻硅(硅金字塔体)或者不稳晶体表面的小刻面)；SERS活性金属涂覆光刻构图面(光刻可以是光学蚀刻、电子束蚀刻、离子束蚀刻、自组装(纳米球蚀刻、嵌段共聚物蚀刻)、纳米压印技术)；SERS活性金属涂覆合成纳米线(纳米结构从下到上合成，例如碳纳米结构、金属氧化物纳米线)。

平坦的金属面是如下金属面，其例如根据EN ISO 4287：2000的评测轮廓的算术平均偏差在低于20纳米、优选低于10纳米的范围内。除此之外或替代地，平坦的金属面的特点可以是与平均水平的最大偏差小于15纳米、优选小于10纳米。就底面、SERS活性金属的基本平坦的或拓扑结构化的金属面的材料而言，以下替代可选方式是可行的：

导电金属氧化物：氧化铟锡(ITO)，铝掺杂氧化锌(AZO)，镓掺杂氧化锌(GZO)；

石墨烯也可以被用作底面。

金属底面相对于导电金属氧化物或石墨烯的优点如下：

1.更强SERS增强，

2.无背景SERS信号(石墨烯和金属氧化物所具有的SERS光谱可能干扰分析物光谱)。

因此，如果对于基本平坦的或拓扑结构化的金属面提到SERS活性金属，则这将最广义地包含上述导电金属氧化物或石墨烯。

虽然SERS活性金属底面可以包含多个孔(如用于作为过滤件或网以仅留住分析物结构)，但优选的是整个表面以连续方式覆有SERS活性金属，而并非仅某些区域，尤其是该SERS活性金属底面优选不是由SERS活性金属的单独分开的凸起所形成的，在凸起之间的层膜面未覆有金属。为了获得在溶液样本中的杂质的可再现检测，在沉积于底面上的所有分析物上形成金属-分析物-金属纳米液滴夹层结构可能是重要的。为了做到这一点，底面优选以连续方式在沉积有分析物的区域中被金属完全覆盖。在表面上不应该有无金属涂层的任何固体部分。因此，当溶液样本在金属涂覆面上被蒸发或通过金属涂覆面被过滤时，余留在表面上的所有杂质将接触到涂覆金属。优选地，在表面上不应该有无可沉积杂质的金属涂层的任何基材区。

就分析物而言，分析物原则上可以是任何类型的分析物。优选排除含有或由化学结合剂体系构成的体系，其通过化学键附着至SERS活性金属基层和/或纳米液滴。为了获得期望的灵敏度、特异度和通用性，纳米液滴的数均直径被选择为在5-70纳米范围内，在相邻的纳米液滴之间的数均间距被选择为小于其数均直径。

根据本发明，纳米液滴的数均直径是在考虑沿垂直于所述平坦的或拓扑结构化的金属面的方向看的可见直径的情况下测量的。

在相邻的纳米液滴之间的数均间距均通过取相邻的纳米液滴之间的最短间距且计算其数均来计算。

当然，以上情况的条件是，如果开孔基材在步骤b)中被沉积在平坦的或拓扑结构化的金属面上，分析物在未与开孔基材仪器共同被引入的情况下在步骤d)前被引入所述孔中。

平坦的或拓扑结构化的金属面的、纳米液滴的或最好两者的SERS活性金属一般选自以下组，该组由(元素)贵金属优选是银、金、铂或者铜、铝或其混合物或含有这样的金属的合金组成。优选银或银合金。

钠金属或钾金属(再次以元素形式而不是作为例如氧化物中的阳离子)也可能导致很强的SERS增强(甚至强过Ag)。但是，这些金属在氧气下很不稳定。但如果SERS扫描机被安放在钠或钾沉积设备的超低真空室内，则人们也能够使用这些金属。尽管将拉曼系统安放在真空室内可能听起来不实际，但它是可行的。拉曼系统能按照口袋尺寸来构建。

根据一个优选实施例，步骤b)包括将分析物处理为固体或在载体液体中的溶液、悬浮体或乳化液的步骤(例如通过液滴沉积、旋涂或喷涂技术)以及去除载体液体的步骤。如果有载体液体，则优选通过蒸发、优选高温蒸发(也可以通过辐射等实现)和/或通过降低压力和/或通过过滤进行去除。如果采用过滤，则平坦的或拓扑结构化的金属面最好配设有孔，其允许载体液体和不想要的微粒透过同时保持分析物微粒在平坦的或拓扑结构化的金属面上。此技术的优点是，仅分析物的悬浮微粒被保持在基材上，同时在载体液体中的分子被除去，但在载体液体被蒸发的情况下并不总是如此。结果就是特异性和灵敏度更高且重叠的不希望的信号更少。

步骤c)可以通过物理气相沉积(PVD)或溅射SERS活性金属进行，可选地后伴随有退火或伴随有退火(例如在40-300℃范围内的温度和在1秒至5分钟之间)。在样本退火的同时溅射SERS-活性金属也是可行的，例如可以为此将小的热板放置在溅射设备中。优选地，执行沉积过程，直到层厚不大于50纳米、优选不大于30纳米。最优选的厚度是不大于15纳米和不大于9纳米。金属厚度一般通过(i)蒸发器设备的石英晶体监视器(QQM)或者(ii)根据溅射设备的厚度/时间标定曲线控制沉积时间来测量。

实际上，通过以自排序过程形式定制上述沉积过程，自动产生高度有序的液滴结构，其数均直径值的波动很小并且其在相邻的纳米液滴之间的数均间距的可变性很小。结果就是，当在光谱学过程中执行两维扫描时，测得信号的强度可变性很低，允许高许多的灵敏度、特异度和通用性。一般，强度变化不到20％，甚至不到10％。

形成所述底面的平坦的或拓扑结构化的金属层的准备：

对于平坦的表面：在硅晶圆/玻璃晶圆/滑玻片/聚合物基材、铝片/铜片上，铬(或钛)作为粘附层被涂覆(如3-20纳米厚)。接着，以如10-300纳米的厚度涂覆银(或金或其它上述金属)。

金属总厚度应该优选大于20纳米，(i)以保证连续金属膜而没有孔穴或孔洞，(ii)以消除到达支承底面的拉曼激光(以消除支承底面的拉曼光谱的获取)。

接着，分析物可以通过滴涂、旋涂或过滤被沉积在表面上。优选地，分析物沉积在真空条件下发生。真空度应高于20毫巴。或者，所述气氛可以是惰性气体环境，例如氮气或氩气氛围，此时的惰性气体例如氮气或氩气由纯度水平优选高于99.9％的超纯惰性气体(氮气或氩气)罐供应。这对于例如在下述装置中避免污染而言是尤其优选的，在这里，在步骤a)中利用溅射或PVD在真空条件下原位产生金属基层，接着也在真空条件下或惰性气体条件下进行步骤b)和c)以及d)。

滴涂：如果分析物可溶于乙醇中，则采用具有最高蒸汽压的溶剂(如丙酮)。溶剂的快速蒸发导致了更均匀的分析物沉积，消除/尽量减轻了咖啡环效应。咖啡环效应应该被消除，因为分析物的厚度需要小于1微米以便有效增强。为促成快速蒸发，基材温度可被提高到50-80℃和/或压力可被降低。

在蒸发后，所沉积的分析物可以在50-250℃被退火30秒至20分钟。这可能有助于相似分析物的结块和分离。最后，纳米/微米尺寸的分析物晶粒形成在所述表面上。滴涂法对于小浓度和小样本量(小于几毫升)是理想的。此方法的优点是(1)简单，并且(2)所有的分析物被沉积在表面上(无分析物损失)。

旋涂：分析物溶液可以被旋涂在金属面上。一般采用500-2000rpm/s斜升和500-3000rpm自旋速度。此方法的优点是分析物的均匀涂覆，不论溶剂蒸发速度如何(无咖啡环效应)。此方法的缺点是分析物在旋涂过程中有损失。产出率(留在表面上的分析物与在旋涂中损失的分析物的百分比)取决于：(i)分析物分子质量，(ii)分析物在溶剂中的可溶性，和(iii)金属表面对分析物的亲和性。在溶液样本中的分析物的沉积产出率可能是不同的。因此，该效率须在标定特定溶液样本的测量结果时被考虑进来。此方法对于杂质分析是理想的(例如以便分析药物样本的杂质)。

喷涂：在金属表面上产生微小液滴。单独微小液滴的溶剂的蒸发可能导致大量的小咖啡环。大量的小咖啡环将会具有小于1微米的环厚度，其足以有效增强SERS信号。但是，喷涂可能导致分析物损失。代替喷涂，(如利用喷墨打印机)的微量分配也可以被用来消除分析物损失。

过滤：此技术对于检测纳微级颗粒是理想的(聚合物颗粒、病原体、细胞等)。孔尺寸决定了分析物的排除。大于所述孔的分析物留在表面上。

作为过滤支承体，可以采用聚合物膜(聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚亚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、硝化纤维素、醋酸纤维素、纤维素酯、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯等)、陶瓷膜(氧化铝、碳化硅、二氧化锆、二氧化钛等)、烧结金属膜或另一种多孔支承体。过滤件可以被共同使用如下：具有清晰限定(受控)的孔径的聚合物膜可以被安放在具有较大的孔的支承层上。膜表面被作为粘附层(5-50纳米厚)所涂覆的铬(或钛)涂覆。接着，银(或金或其它上述金属)以20-500纳米的厚度被涂覆。金属涂层使膜的孔收缩，决定了尺寸排阻极限。

在金属涂覆膜上，溶液样本可被连续地倾倒或以液滴形式用微分配器配发。溶剂流速取决于孔径、孔长度和膜材料。为了促成快速过滤，可以选择大孔径作为孔径。在孔入口处的孔径可以通过控制该金属涂层厚度被精细调整。在过滤过程中，使基材自旋以提高溶剂流速。

金属镀敷：在所沉积的分析物上可以通过金属蒸镀(热束或电子束)或溅射来涂覆金属液滴。

蒸发：该试验可以使用电子束蒸发器(BAK501，Evatec)来进行。样本用双面胶带被安装在金属夹具上。在金属源和基材表面之间的距离优选约为600mm。腔室压力优选低于5x10^-7托。典型沉积速率优选为0.5埃/秒。在试验中，金属厚度优选在3-50纳米之间，一般小于30纳米。

溅射：可以使用Q150R旋转泵浦溅射涂覆机进行溅射试验。样本可以被安放在腔室底面上以消除由氩气等离子体造成的任何损伤。腔室压力优选一般是3x10^-2托。沉积时间优选在1分钟至6分钟范围内，这导致了优选在5-30纳米之间的厚度。

对于可能被真空损伤的细胞，其可通过在大气压下执行溅射被涂覆。在此情况下，真空阀和氩气输入阀优选被打开以用氩气冲扫空气，同时保持压力高到足以保护细胞。另一替代可选做法是利用电极丝的大气压溅射。

拉曼扫描：在该试验中，采用Renishaw inVia显微拉曼光谱仪。典型的优选参数如下：激光波长785纳米，激光器功率0.5mW，积分时间1ms，物镜50倍，NA＝0.75。

拉曼扫描可以利用X-Y滑台进行，在这里，银/分析物/银样本在入射拉曼激光器下移动。或者，拉曼激光器能在垂直于样本滑台运动的方向上运动。在这样的X-Y扫描技术中，金属/分析物/金属结构能以直立形式来制作。

更快速的扫描做法是带平移运动的样本转动。在此情况下，样本或拉曼激光器能做平移运动。为了在样本上保持恒定的焦斑区，转速需要根据样本相互间的径向距离被调整。在这样的回转扫描技术中，金属/分析物/金属样本的理想形状为圆形。

作为另一替代可选的做法，振荡微电子机械(MEMS)反光镜可以被安放在拉曼激光器下方，同时使样本在单轴向上平移。振荡反光镜所反射的激光可以在样本在垂直于反光镜振荡方向上平移时绘制所述区域。在此情况下，金属/分析物/金属样本可以被制作出具有长半圆形缝，从而来自MEMS反光镜的反射光束将总是在样本表面具有相同的焦斑区。此策略可以与分子分离技术(如毛细管电泳)组合以研究蛋白混合物。

对于任一扫描技术可施用两步法。首先用低放大倍率物镜(如5倍、10倍、20倍)进行扫描以便快速筛选。接着仅用高放大倍率(如50倍或者100倍)镜头扫描相关区域(提供光谱的区域)以获得详细的更高分辨率数据。

在扫描后，可以用两个参数进行分析物的量化：(1)提供分析物光谱的像素数和(2)SERS信号强度。在高浓度下，仅像素数目数据可能对分析物量化就够了。在低浓度下，SERS信号强度也需要被考虑进来。

在微型颗粒或细胞情况下，可以拍摄具有相关像素的相机图像以获得颗粒或细胞的形貌学信息。与细胞形貌学信息相结合的SERS光谱可能对于肿瘤(癌)细胞的诊断是独特的。

光谱数据可以利用处理器被后处理。但是，后处理数十万光谱可能需要相当长的时间和计算能力。理想策略是在获取过程中的光谱实时处理。这可以通过编程附属至检测装置(如CMOS光电传感器)的逻辑卡(如FPGA卡)来进行。利用实时处理，只能将相关光谱发送至计算机以便最终的后处理。

在步骤c)中产生基本呈半球形的纳米液滴。

纳米液滴的数均直径一般在10-60纳米、优选是15-50纳米的范围内，和/或其中在相邻的纳米液滴之间的数均间距在1-30纳米、优选是5-50纳米的范围内。

夹在平坦的或拓扑结构化的金属层与纳米液滴之间的分析物层厚度和/或开孔基材厚度优选小于1微米，优选在1-900纳米、或者5-100纳米范围内。

平坦的或拓扑结构化的金属面可以是在基材(例如二氧化硅晶圆)上的厚度在5-500纳米、优选是10-100纳米范围内的银层和/或金层，其中平坦的或拓扑结构化的金属面的表面粗糙度最好低于其厚度的50％、优选低于25％、最优选低于10％，或者粗糙度小于100纳米、优选小于50纳米、最优选小于20纳米。

分析物可以基本上是可被沉积在金属面上且于是可以被纳米液滴覆盖的任何东西。该分析物例如可以是以下当中的至少一个：无机分子或微粒，有机分子，包括小分子、DNA分子、蛋白质、肽、维他命、食品成分，细胞，包括细菌细胞、病毒、原生动物、人类细胞、血细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞。

在步骤d)中，采用在600-900nm范围内、优选在700-800nm范围内、最优选在750-800nm范围内的辐照频率，其中更优选地扫描两维区以便光谱检测。

平坦的或拓扑结构化的金属面可以为了作为仅在平坦的或拓扑结构化的金属面上保留分析物过滤件而配设有大量的孔，其孔径小于待测的分析物颗粒，其中该孔优选具有在20-200纳米、最优选是50-100纳米范围内的直径。

步骤b)可以包括在平坦的或拓扑结构化的金属面上固定分析物的步骤，优选通过添加另一固定层、添加固定物质或者通过交联载体材料或添加的固定物质，其或是与分析物一起沉积在平坦的或拓扑结构化的金属面上，或是在分析物沉积之前或之后沉积在平坦的或拓扑结构化的金属面上。

如果开孔基材如伸展的聚合物材料在步骤b)中被沉积在平坦的或拓扑结构化的表面上，则分析物在步骤d)且优选在步骤c)后被引入所述孔中，其中更优选地，该分析物从气相通过扩散被引入所述孔中或在液相中或作为溶液通过浸渍被引入所述孔中。

本发明还涉及将上述方法用于食品和饮料质检、药物发现、医学诊断的用途。尤其优选的应用领域是将该方法用于例如在芯片制造领域中的高纯度水质检测，尤其是用于在两个加工过程之间的硅晶圆冲洗。冲洗水是超纯水。超纯水(UPW)的杂质可以沉积在芯片表面上，产生缺陷。这样的缺陷对制造生产率还有芯片可靠性是致命的。为了尽量减小芯片缺陷，UPW中的杂质应被减至最少。为此，UPW的杂质应该在在线杂质监视器上被监视。某些类型的杂质与在超纯水过滤循环系统中的一定污染源相关。例如，超纯水中的增大的二氧化硅含量可能表明超滤膜开裂。增大的硼含量可能表明离子交换树脂耗尽。增大的碳含量可能表明在水循环管内的生物膜形成、O形圈毁坏或膜材料降解。

另外，本发明涉及一种分析装置，其具有：至少一个用于a)优选以覆盖在对应底面上的任何类型的表面污染的连续层的形式产生SERS活性金属的基本平坦的拓扑结构化的金属面的模块；至少一个用于b)在所述平坦的或拓扑结构化的金属面上沉积分析物或开孔基材的模块；至少一个用于c)分别在分析物或开孔基材上方沉积SERS活性金属的大量纳米液滴的模块；至少一个用于d)借助扫描激光辐射并利用SERS光谱学分析被夹在平坦的或拓扑结构化的金属面与大量纳米液滴之间的分析物的模块；其中上述模块的功能可以通过单独的单元或在联合单元内执行，其中优选用于a)的模块和c)的模块是同一单元。

另外，本发明涉及用于利用表面增强拉曼光谱法(SERS)分析分析物的多层结构，包含以下要素：

a)SERS活性金属的基本平坦的金属面或拓扑结构化金属面；

b)在所述平坦的拓扑结构化的金属面上的分析物或开孔基材；

c)分别沉积在分析物或开孔基材上的SERS活性金属的大量纳米液滴，其适于通过扫描激光辐射并利用SERS光谱学分析被夹在平坦的或拓扑结构化的金属面与大量纳米液滴之间的分析物；

其中该纳米液滴的数均直径在5-70纳米范围内，其中在相邻的纳米液滴之间的数均间距小于它们的数均直径。

再次，在这里这也有以下条件，如果开孔基材在步骤b)中被沉积在平坦的或拓扑结构化的金属面上，则分析物在步骤d)之前被加入该孔中。

在这种多层结构中的纳米液滴的数均直径可以在10-60纳米、优选是15-15纳米的范围内，和/或其中在相邻的纳米液滴之间的数均间距在1-30纳米、优选是5-50纳米的范围内。

另外，这种多层结构的所述平坦的或拓扑结构化的金属面可以是在基材上的厚度在5-500纳米范围内、优选是10-100纳米范围内的银层和/或金层，其中优选地，平坦的或拓扑结构化的金属面的表面粗糙度低于其厚度的50％、优选低于25％、最优选低于10％，或者粗糙度小于100纳米、优选小于50纳米、最优选小于20纳米。

在从属权利要求中规定了本发明的其它实施例。

附图简介

以下参照附图来描述本发明的优选实施例，附图是用于示出现存的本发明优选实施例而不是要限制它，其中：

图1示出银/分析物/银结构的横截面：U-SERS的核心技术，其中，a)剖视示出了被蒸镀或以其它方式沉积的夹在银元素之间的分析物的状况，b)剖视示出了多孔基质被夹在银元素之间的状况，该基质的孔能吸收分析物以便探测，c)示出了这种结构的俯视图。

图2示出U-SERS程序的示意图，待分析溶液被滴涂到平坦银表面上，在溶剂蒸发之后，几纳米的银被沉积，产生如图1所示的银/分析物/银结构；最终，在整个表面上进行拉曼扫描以便检测；

图3在(a)中示出某些杀虫剂和微污染物的独特的SERS光谱，从下到上是：BPE、阿替洛尔、雌甾二醇、BTAH、布洛芬、对-克利西丁、2-萘胺、1，2-二氯苯、4-氨苯基二硫化物，在(b)中示出1毫升溶液混合物的U-SERS绘图，该混合物具有30微克雌甾二醇、10微克阿替洛尔、5微克布洛芬、1微克BTAH和0.1微克BPE；

图4示出了主成分降维例子；SERS光谱(左)可以表现为主成分的线性和(在右侧的三个光谱)；因此，SERS光谱可以仅由主成分因子(α1、α2和α3)来描绘，而不是就SERS强度和拉曼波数而言的成千上万的参数；

图5示出了用于化学混合物实时分析的主成分分析的主步骤的示意图：(1)针对具体溶液混合物确定主成分；(2)确定分析物分布函数作为参考数据库；(3)降维(见图4)；(4)在某个像素处的光谱与参考数据库的相似度的量化；(5)质谱数量化；

图6示出U-SERS设备的硬件的示意图；

图7示出平坦的银基材可配设有筛(a)意义上的孔，以及呈微粒形式的分析物，包括细菌和病毒，如何通过允许载运分析物的液体穿过保留分析物微粒在基材上的孔而被沉积；

图8示出可以如何通过在分析装置中直接现场产生SERS活性金属的金属面避免交叉污染；

图9示出在执行所提出方法的分析装置上方的可能的模块组；

图10在左侧示出分析用结构的另一示意图并在右侧示出SEM照片；

图11示出另一SEM图像，其示出了在杂质(分析物)所处位置的金属纳米液滴形成；

图12示出金属纳米液滴形成如何使得在金属面上的沉积杂质可见；

图13示出在金属纳米液滴沉积后对超纯水杂质的拉曼扫描的例子；其中(a)示出在金属纳米液滴涂覆后在金表面上的300微升超纯水的杂质的显微镜图像；(b)示出快速拉曼扫描的区域，图中示出了拉曼扫描参数；(c)示出扫描的平均拉曼光谱，这是10000拉曼光谱的平均值；

图14示出改善信噪比以检测少数杂质的信号处理例子；

图15示出区域强度；

图16示出与杂质含量相比的区域强度。

优选实施例说明

U-SERS基于如图1所示的Ag/分析物/Ag(Ag：银)夹层结构7。根据图1a)的结构包括平坦的薄银膜1、一层分析物3和被间隙4分开的多个银纳米岛2，其能实现强电场增强放大来自所夹分析物的拉曼信号。

图1b)示出相应夹层结构7，在此，夹层5不是，如果需要的话，与对应的粘合材料一起的分析物，而是这里夹层由开孔材料层给出。分析物3″可通过扩散或浸泡透入该开孔材料层中。

图1c)示出这种结构的俯视图，示出了单独的纳米液滴2相互靠得很近并且在通常具有半球形形状和相当均匀的30、40或50纳米直径(取决于制造过程)的纳米液滴之间的平均间距明显小于纳米液滴2的直径。

一种可能的制作银/分析物/银结构的程序如下。如图2所示，溶液样本被滴涂在平坦的银薄膜上。干燥时，溶剂蒸发而溶质(分析物)沉积在银表面上的随机位置上。可以提供热以加速干燥过程，其能促成分析物的更均匀涂层。接着，利用溅射或金属蒸发沉积几纳米厚的银，在分析物层上形成纳米岛。银纳米岛形成将颜色变为深蓝色调，表明光谱红色部分的光的强烈耦合。确实，相比于绿色和蓝色激光，银/分析物/银结构展现出针对红色激发激光(785纳米)的更强的SERS增强。在样本制备程序之后执行拉曼扫描。银/分析物/银结构的独特的蓝色在选择待扫描区时提供视觉引导。关于试验细节，参照上述讨论。

图3示出U-SERS概念的证明。某些杀虫剂和微污染物的光谱在图3a中被示出。应该注意，这些分析物中仅BPE和BTAH具有强的金属亲和性。因为U-SERS消除了分子对金属表面的亲和性效果，我们能自任何分析物获得SERS光谱，只要它不是极其易挥发的。

U-SERS的一个重要优点是同时检测多种分析物的能力。图3b是这种多路检测的例子。可以用15分钟长的扫描来容易地解析含五种分析物的溶液。在光谱图中，每种颜色代表其中一种分析物。关于试验细节，参照上述内容。

绘图中的灰色阴影面积与混合物中的分析物的相对量有关。甚至可以在某些像素处检测到溶液中的少数物种(BPE)。增加绘图中的像素数量将提高灵敏度和量化精度。

U-SERS的样本准备程序花费约5分钟。另一方面，扫描时间取决于像素数量(或扫描面积)。目前最先进的拉曼扫描仪受限于约100光谱/秒的扫描速率。在这里，重要的是要注意到100光谱/秒已经对于普通拉曼扫描而言相当快速，因为拉曼信号低强度对于每个像素需要较长的检测时间(积分时间)。但是，银/分析物/银结构将该信号放大五个数量级，表明扫描速率提升有显著的空间。

U-SERS系统应该包含液体处理模块、金属镀敷模块和扫描模块。

最新高科技的拉曼系统在完成数据获取后执行数据处理。但是，如果需要处理成百万的光谱，则后处理不是可行策略。U-SERS的标靶捕获速度是10000光谱/秒。这样的高扫描速率要求实时数据处理。确实，实时图形识别是包含各种不同的应用领域的已被确定的领域。一种示例性应用是在监控相机上的人脸实时识别。此计划的申请人想要将此技术用于SERS光谱实时处理。要采用的具体算法是主成分分析(PCA)。PCA基于利用其主成分的光谱的维度(尺寸)降低。利用图4中的假设性例子来描述降维现象。

为了实施PCA，主成分需要先被确定。对于U-SERS试验，这项任务是新溶液样本标定过程的一部分。溶液中的每种分析物需要与主成分统计学分布函数相关地来描绘。用于双分析物溶液的系统标定可以利用U-SERS分子扫描仪在不到1小时的时间内进行，这比最先进的化学分析技术如HPLC快速了许多，这种情况标定可能需要好几周时间。具有用于分析物的标定数据库，PCA代码将能够实时处理数据。图5示出了典型的PCA算法的步骤。

U-SERS有助于需要高效能和用得起的化学分析技术的任何领域。

根据市场研究，三个领域被认定为市场：(1)食品和饮料质量检测，(2)医药发现和(3)医学诊断。

食品检测的瓶颈是样本纯化时间。在典型样本中，和可能的杀虫剂一起，大量其它分子例如维他命、氨基酸和脂肪也将残留。这样的复杂混合物需要在HPLC试验前被净化。净化过程可能要用两天到五天。因为其保质期短，故新鲜食品在获得试验结果前已投放在超市货架上。质检结果的延迟显然让公众健康受到威胁。U-SERS能因其多路能力而使净化程序减至最少。它甚至可以提供关于食品成分(如维他命、脂肪含量)和杀虫剂污染的综合信息。

U-SERS在药物发现中也具有明显潜力，在该领域人们始终在努力研发新型高效液相色谱法以获得新解决方案。具有很短标定时间的U-SERS能明显缩短整个药品发现过程。U-SERS的另一领域是医学诊断。血中细菌和病毒的直接检测是U-SERS应用的主题。再次，U-SERS的多路能力能够促成多种不同的病原体的检测，同时提供关于血液的附加信息例如胰岛素水平，将许多不同试验糅合到单个U-SERS试验中。

如图6所示，硬件基于快速且买得起的CMOS型分光计。因为SERS信号已通过银/分析物/银结构被放大，故可补偿低效率CMOS光电探测器。U-SERS基材(涂银CD)的转动控制和物镜线性移动控制通过电子告示板进行。

分析物的量化利用两个参数来完成：(i)分子光谱所检测的像素数量(ii)某些SERS峰值的平均强度。在相对较高浓度下，仅前一参数就足以用于量化。

在样本准备过程中，滴涂可能在溶剂蒸发速率不够高时导致被称为咖啡环效应的不均匀分析物涂覆。在此情况下，采用略微渐缩的阱而不使用平坦基材。这种结构使得成千上万更小的咖啡环形成，这足以用于U-SERS测量。

尽管通过U-SERS信号增强是通用的，其中一些分析物还是具有固有更大的拉曼横截面。当这样的拉曼共振分析物与另一种分析物共存时，前者的信号在组合谱中占主要地位。考虑到这种挑战，构建了机器学习算法。

图7示出可如何使基材具有合适尺寸的孔8以保留人们想要分析的相应微粒。微粒可以是细菌或病毒，因此该基材可被用作筛定向器，也是在连续工作过程中。

图8示出可如何很高效地避免在金属施加前，由在基材即平坦的或拓扑结构化的表面上的表面杂质引起的交叉污染。可能包含表面污染11的背衬10直接在分析装置中被涂覆洁净的金属底膜1。来自空气的交叉污染可被如此消除，蒸发过程发生(i)在此时压力约为或大于20毫巴的真空下，或者(ii)在惰性气体如氮气或氩气氛围下。

在拉曼扫描后，人们可以识别杂质区。人们能进一步对杂质执行微区XRF扫描以执行杂质的“元素分析”。拉曼光谱法可以被用来识别无机和有机杂质。利用微区XRF，也可以检测金属杂质。

实际设备可以由不同的模块组成，如图9所示：(1)溅射模块，(2)水蒸发模块，(3)消耗品模块，(4)拉曼扫描模块，(5)微区XRF模块，和(6)用于在不同模块之间输送消耗品的主控台。所有模块可以处于氮气或氩气氛围以尽量减小交叉污染。

图10示出了如何在层1的金属溅射(或金属蒸镀)后仅在杂质所处位置上形成金属的纳米液滴2，例如在水分析情况下杂质就是分析物2，因为杂质的表面能低于金属。我们在无杂质(分析物)的位置上未形成纳米液滴。应该注意，此过程是免化学处理的(未由化学物引起交叉污染)。如果我们采用了胶体纳米粒子来在杂质上形成这种纳米粒子，则我们将会引入胶体溶液的杂质。另外，纳米粒子是密集的且均匀涂覆在杂质上。金属纳米液滴形成是可重现的，因为它基于可再现过程(溅射或金属蒸镀)。另外，我们不需要在杂质和纳米液滴之间的化学键合。基于胶体溶液的过程需要在沉积杂质(分析物)和纳米粒子之间的化学键。图11进一步示出另一SEM图像，其示出在杂质所处位置上的金属纳米液滴形成。

图12示出了在杂质上沉积金属纳米液滴，金属纳米液滴-分析物-金属结构吸收光。这改变杂质所处位置的颜色。因此，分析物所处位置变得易看到。此光学效果促成更高效的拉曼扫描。

图13给出在金属纳米液滴沉积后对超纯水的杂质的拉曼扫描的一个例子。(a)在金属纳米液滴涂覆后在金表面上的300微升超纯水杂质的显微镜图像，其中6纳米的银以1埃/秒的沉积速率来涂覆。(b)快速拉曼扫描区域。拉曼扫描参数如图所示。(c)扫描的平均拉曼光谱。这是10000拉曼光谱平均数。在此试验中，在超纯水中的总二氧化硅、总碳和总硼浓度分别为3000ppt、1800ppt和13ppt。在平均光谱下，人们可以清楚看到限定二氧化硅(970cm^-1)和碳(1600cm^-1)的波段。但是，我们也能刚好看到处于814cm^-1的硼(硼酸)的特定波段。

图14示出我们如何实现信号处理方法以使得杂质的拉曼波段更加可见。该信号处理对于少数物种(它在此试验中是硼酸)的检测尤其有用。图14的光谱(原始数据)是图12所述的扫描图的10000光谱的样本光谱。在这些10000光谱的每一个上执行相似的信号处理以识别峰值位置(就拉曼位移而言)和峰值强度。我们在以下图中所解释的工作过程中采用该信号处理方法的结果。

图15示出了，在先前图中所解释的信号处理之后我们能计算“区域强度”，其是每个被测拉曼波段的总覆盖区和总拉曼计数的乘积。图15a是与图13c所示一样的平均谱。图15b是数据处理后的变换谱。图15a中的y轴是拉曼计数。图15b的y轴是区域强度。区域强度是经过扫描区的某个拉曼位移的覆盖区和总强度的乘积。图15c是图15b的放大图像，示出了描绘硼酸的峰值。硼酸的代表性U-SERS波段是814cm^-1。当我们计算区域强度时，我们放大来自杂质的拉曼波段。所述放大尤其有助于识别来自少数杂质的拉曼波段。在此试验中，在超纯水中的总二氧化硅、总碳和总硼浓度分别为3000ppt、1800ppt和13ppt。我们能容易地在信号处理之后检测到硼(硼酸)，因为我们能显著提高信噪比。应该注意到，硼酸的代表性U-SERS波段814cm^-1在图15a中是几乎看不到的。

图16示出了，当我们对具有不同的硼(硼酸)量的样本进行试验时，我们能获得就与其在蒸发超纯水中的重量相关的硼的区域强度而言的标定曲线。

附图标记列表

1 平坦的银基材，薄膜

2 银纳米液滴

3 分析物

3′ 待测的沉积分析物

3″ 在5的孔内的分析物

4 在2之间的间隙

5 多孔基材

6 溶液混合物

1 银/分析物/银结构

8 1中的孔

9 微粒，病毒/细菌

10 背衬

11 表面污染

Claims

1.一种利用表面增强拉曼光谱法(SERS)分析分析物(3)的方法，包括以下步骤：

a)提供SERS活性金属的基本平坦的或者拓扑结构化的金属面(1)；

b)在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上沉积该分析物(3)或开孔基材(5)；

c)分别在所述分析物(3)或开孔基材(5)上沉积大量的SERS活性金属的纳米液滴(2)；

d)通过扫描激光辐射并利用SERS来光谱分析被夹在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)与大量的纳米液滴(2)之间的所述分析物；

其中，所述纳米液滴(2)的数均直径在5-70纳米范围内，并且其中，在相邻的纳米液滴(2)之间的数均间距小于它们的数均直径，

条件是若在步骤b)中开孔基材(5)被沉积在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上，则所述分析物(3)在步骤d)之前被引入所述孔中，

其特征在于，

步骤c)通过物理气相沉积(PVD)或者通过溅射SERS-活性金属进行。

2.根据权利要求1的方法，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1 )的、所述纳米液滴(2)的或者两者的SERS活性金属选自以下组，该组由贵金属或者铜、钠、钾或铝或其混合物或者含这种金属的合金组成，其中，该方法能够在一个分析装置中进行，其中在同一分析装置中发生根据步骤a)的SERS活性金属的平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的实际产生、根据步骤b)的分析物沉积、根据步骤c)的纳米液滴沉积以及根据步骤d)的光谱分析。

3.根据权利要求2的方法，其中所述贵金属是银、金、铂。

4.根据前述权利要求之一的方法，其中，步骤b)包括将所述分析物(3)处理为在载体液体中的溶液、悬浮液或乳化液的步骤，以及去除所述载体液体的步骤，其中，所述去除能够通过蒸发、和/或通过过滤进行，其中，在后者情况下，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)能够配设有多个孔(8)，所述孔允许载体液体和不想要的微粒透过同时保持分析物微粒在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1 )上。

5.根据权利要求4的方法，其中所述蒸发是通过升高的温度和/或通过降低的压力而实现。

6.根据权利要求1的方法，其中，步骤c)通过物理气相沉积(PVD)或通过溅射SERS活性金属进行，可选地随后退火或同时进行伴随退火，其中，所述沉积过程能够进行直到层厚不大于50纳米。

7.根据权利要求6的方法，其中所述沉积过程能够进行直到层厚不大于30纳米。

8.根据权利要求6的方法，其中所述沉积过程能够进行直到层厚不大于15纳米。

9.根据权利要求6的方法，其中所述沉积过程能够进行直到层厚不大于9纳米。

10.根据权利要求1的方法，其中，在步骤c)中产生大致半球形的纳米液滴(2)。

11.根据权利要求1的方法，其中，所述纳米液滴(2)的数均直径在10-60纳米范围内，和/或其中，在相邻的纳米液滴(2)之间的数均间距在1-30纳米范围内，或者在5-50纳米范围内。

12.根据权利要求11的方法，其中，所述纳米液滴(2)的数均直径在15-50纳米范围内。

13.根据权利要求1的方法，其中，夹在平坦的或拓扑结构化的金属面 (1)和纳米液滴(2)之间的分析物层和/或开孔基材(5)的厚度小于1微米。

14.根据权利要求1的方法，其中，夹在平坦的或拓扑结构化的金属面 (1)和纳米液滴(2)之间的分析物层和/或开孔基材(5)的厚度在1-900纳米范围内。

15.根据权利要求1的方法，其中，夹在平坦的或拓扑结构化的金属面 (1)和纳米液滴(2)之间的分析物层和/或开孔基材(5)的厚度在5-100纳米的范围内。

16.根据前述权利要求1的方法，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)是在基材(10)上的厚度在5-500纳米范围内的银和/或金层，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的表面的粗糙度能够低于其厚度的50％，或者所述粗糙度小于100纳米。

17.根据前述权利要求16的方法，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)是在基材(10)上的厚度在10-100纳米范围内的银和/或金层。

18.根据前述权利要求16的方法，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的表面的粗糙度能够低于其厚度的25％。

19.根据前述权利要求16的方法，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的表面的粗糙度能够低于其厚度的10％。

20.根据前述权利要求16的方法，其中，所述粗糙度小于50纳米。

21.根据前述权利要求16的方法，其中，所述粗糙度小于20纳米。

22.根据权利要求1的方法，其中，该分析物是以下当中的至少一个：无机分子或微粒，有机分子，包括小分子、DNA分子、蛋白质、肽、维他命、食品成分，细胞，包括细菌细胞、病毒、原生动物、人类细胞、血细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞，其中，在细胞情况下在步骤d)的扫描过程中还能够确定形态学信息。

23.根据权利要求1的方法，其中，在步骤d)中采用在600-900nm范围内的辐照频率，并且其中，能够扫描两维区域以便光谱检测

和/或其中，在步骤d)中扫描激光辐射和使用SERS通过扫描来进行，在所述扫描中使激光和/或夹在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)和大量的纳米液滴(2)之间的分析物彼此相对移动，其中，该扫描能够

借助X-Y扫描，此时在两个正交的方向上使激光和/或所夹的分析物移动，或者能够

借助与激光平移运动相结合的所夹的分析物转动，

或者能够借助安放在拉曼激光下的振荡的反光镜同时使样本在单个轴向上平移，

和/或其中，对于在步骤d)中的扫描，首先利用第一放大倍率物镜进行扫描以便快速筛选，接着仅在产生光谱的区域中利用第二放大倍率物镜进行扫描，所述第二放大倍率大于所述第一放大倍率和/或其中，在步骤d)中的分析之前、之中或之后，分析所述分析物，在相同的装置中，采用其它的分析技术，包括XRF、LIBS或其组合。

24.根据权利要求23的方法，其中，在步骤d)中采用在700-800nm范围内的辐照频率。

25.根据权利要求23的方法，其中，在步骤d)中采用在750-800nm范围内的辐照频率。

26.根据权利要求23的方法，所述反光镜为微电子机械(MEMS)的反光镜。

27.根据权利要求23的方法，其中，在步骤d)中的分析之前、之中或之后，对所述分析物的分析，进行为在相同的装置中并且采用相同的样本空间和制备。

28.根据权利要求1的方法，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)包含大量的孔(8)，孔的直径小于待测的分析物微粒，其中，所述孔(8)能够具有在20-200纳米范围内的直径。

29.根据权利要求28的方法，其中，所述孔(8)能够具有在50-100纳米的范围内的直径。

30.根据权利要求1的方法，其中，步骤b)包括将所述分析物固定在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上的步骤，其能够通过添加另一固定层、添加固定物质或通过交联载体材料而进行，所述交联载体材料或者与所述分析物(3)一起或者在所述分析物沉积在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上之前或之后沉积在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上，

和/或其中，如果在步骤b)中开孔基材(5)被沉积在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上，则所述分析物(3)在步骤d)之前，或者在步骤c)之后被引入所述孔中，其中所述分析物能够从气相中通过扩散或者在液相或作为溶液通过浸泡被引入所述孔中。

31.根据权利要求1的分析分析物(3)的方法，用于溶剂，其中，进行所有步骤a)-d)。

32.根据权利要求31的分析分析物(3)的方法，用于水质检测。

33.根据权利要求31的分析分析物(3)的方法，用于高纯度水检测。

34.根据权利要求31的分析分析物(3)的方法，用于在芯片制造领域，食品和饮料质量检测，药物发现，医学诊断。

35.根据权利要求31的分析分析物(3)的方法，采用一个分析装置。

36.分析装置，具有：

至少一个用于a)产生SERS-活性金属的基本平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的模块；

至少一个用于b)在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上沉积所述分析物(3)或开孔基材(5)的模块；

至少一个用于c)分别在所述分析物(3)或开孔基材(5)上沉积SERS活性金属的大量的纳米液滴(2)的模块；

至少一个用于d)借助扫描激光辐射并利用SERS来光谱分析被夹在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)和大量的纳米液滴(2)之间的所述分析物的模块；

其中，上述模块的功能能通过单独的单元或在联合单元中进行，并且其中，用于a)的模块和用于c)的模块能够是同一单元，其能够是用于供应的在线设备并且能是全自动的，

其特征在于，所述用于c)分别在所述分析物(3)或开孔基材(5)上沉积SERS活性金属的大量的纳米液滴(2)的模块是通过物理气相沉积(PVD)或通过溅射SERS活性金属来沉积SERS活性金属的大量的纳米液滴(2)的模块。

37.一种用于根据前述权利要求1至29中任一项所述的方法与表面增强拉曼光谱法(SERS)一起使用来分析分析物(3)的多层结构，包括以下要素：

a)SERS活性金属的基本平坦的或拓扑结构化的金属面(1)；

b)在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上的分析物(3)或开孔基材(5)；

c)分别沉积在所述分析物(3)或开孔基材(5)上的大量的SERS活性金属的纳米液滴(2)，

它们适于通过扫描激光辐射和利用SERS被光谱分析，被夹在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)与大量的纳米液滴(2)之间的所述分析物；

条件是若在步骤b)中开孔基材(5)被沉积在所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)上，则所述分析物(3)在根据前述权利要求1至29中任一项所述的方法的步骤d)之前被引入所述孔中，

其特征在于，所述SERS活性金属的大量的纳米液滴(2)是通过物理气相沉积(PVD)或通过溅射SERS活性金属来沉积的。

38.根据权利要求37的多层结构，其中，所述纳米液滴(2)的数均直径在10-60纳米范围内，和/或其中，在相邻的纳米液滴(2)之间的数均间距在1-30纳米范围内，或者在5-50纳米范围内，和/或其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)是在基材(10)上的厚度在5-500纳米范围内的银和/或金层，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的表面的粗糙度能够低于其厚度的50％、或者所述粗糙度小于100纳米。

39.根据权利要求38的多层结构，其中，所述纳米液滴(2)的数均直径在10-15纳米范围内。

40.根据权利要求38的多层结构，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)是在基材(10)上的厚度在10-100纳米范围内的银和/或金层。

41.根据权利要求38的多层结构，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的表面的粗糙度能够低于其厚度的25％。

42.根据权利要求38的多层结构，其中，所述平坦的或拓扑结构化的金属面(1)的表面的粗糙度能够低于其厚度的10％。

43.根据权利要求38的多层结构，其中，所述粗糙度小于50纳米。

44.根据权利要求38的多层结构，其中，所述粗糙度小于20纳米。