KR101793008B1 - 표면증강 라만 산란을 이용한 진단 플랫폼 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

표면증강 라만 산란을 이용한 진단 플랫폼 및 이를 이용한 진단 방법

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KR101793008B1 KR1020140106760A KR20140106760A KR101793008B1 KR 101793008 B1 KR101793008 B1 KR 101793008B1 KR 1020140106760 A KR1020140106760 A KR 1020140106760A KR 20140106760 A KR20140106760 A KR 20140106760A KR 101793008 B1 KR101793008 B1 KR 101793008B1
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Abstract

생화학 물질 진단 플랫폼은 금속 나노 플레이트, 금속 나노 플레이트의 표면 상에 부착된 바이오 리셉터, 바이오 리셉터에 의해 포획된 바이오마커, 바이오마커를 캡핑하는 금속 나노 입자, 및 포획된 바이오마커를 분석하기 위한 분광 검출부를 포함한다. 바이오마커를 샌드위치시켜 고정함으로써 고민감도로 생화학물질을 검출할 수 있다.

Description

표면증강 라만 산란을 이용한 진단 플랫폼 및 이를 이용한 진단 방법{DIAGNOSIS PLATFORMS AND DIAGNOSIS METHODS USING SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING}
본 발명은 표면 증강 라만 산란을 이용한 진단 플랫폼 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 표면 증강 라만 산란을 이용한 생화학 물질 진단 플랫폼 및 이를 이용한 생화학 물질 진단 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 급성 심근 경색(acute myocardial infarction: AMI) 또는 류마티스 관절염과 같은 질병의 조기 진단을 위해, 상기 질병에 특이적인 바이오마커(biomarker)의 정밀한 모니터링이 필요하다.
현재, 상기 바이오마커의 검출은 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA)과 같은 다양한 면역 분석법 들이 이용되고 있으나, 이들은 미량의 바이오마커를 측정하기 위한 별도의 증폭과정이 필요하고, 이는 부정확한 진단 결과와 높은 의료 수가의 원인이 되어왔다. 따라서 별도의 증폭과정 없이도 극미량의 바이오마커들을 측정 가능한 초고감도 진단센서가 필요하다.
최근에는, 금속 나노구조 표면에 분자가 흡착될 때 라만산란의 세기가 변화함을 이용하는 표면 증강 라만 산란(surface-enhanced raman scattering: SERS) 분광법을 통한 바이오 센서 혹은 메디컬 센서의 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.
예를 들면, 특허문헌 1은 생물학적 물질의 존재 또는 함량을 검출하기 위한 SERS 광 센서가 개시되어 있다.
[특허문헌 1] 대한민국 등록특허공보 제10-0892629호(2009. 4. 8)
본 발명의 일 과제는 높은 민감도 및 분해능을 갖는 생화학 물질 진단 플랫폼을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 과제는 높은 민감도 및 분해능을 갖는 생화학 물질 진단 플랫폼을 이용한 생화학 물질 진단 방법을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급된 과제에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위에서 다양하게 확장될 수 있을 것이다.
상술한 본 발명의 일 과제를 달성하기 위하여 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 플랫폼은 금속 나노 플레이트, 상기 금속 나노 플레이트의 표면 상에 부착된 바이오 리셉터, 상기 바이오 리셉터에 의해 포획된 바이오마커(biomarker), 상기 바이오마커를 캡핑하는 금속 나노 입자, 및 포획된 상기 바이오마커를 분석하기 위한 분광 검출부를 포함한다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 금속 나노 플레이트 및 상기 금속 나노 입자는 각각 단결정 금 나노 플레이트 및 금 나노 입자를 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 금속 나노 플레이트는 RMS(Root Mean Square) 표면 거칠기가 1 nm 이하인 금 나노 플레이트일 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 리셉터는 상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 상에 수직 배향될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오마커는 상기 바이오 리셉터 및 상기 금속 나노 입자 사이에 샌드위치되어 포획 구조체가 형성될 수 있다. 상기 포획 구조체는 상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 상에 수직 배향될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼은 상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 중 상기 바이오 리셉터가 부착되지 않은 부분에 부착되는 블로킹 분자를 더 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 블로킹 분자는 6-머캅토헥산올(6-mercaptohexanol)을 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 마커는 심근 단백질(Cardiac Troponin I: cTnI)를 포함하며, 급성 심근 경색 진단을 위해 활용될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 리셉터는 트로포닌 압타머(Troponin Aptamer)를 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 마커는 항-CCP(anti-cyclic citrullinated peptide: anti-CCP)를 포함하며, 류마티스 관절염 진단을 위해 활용될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 리셉터는 CCP를 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 금속 나노 입자 표면 상에 라만 염료가 부착될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 분광 검출부는 표면 증강 라만 산란 (Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 센서를 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 금속 나노 입자 표면에 표면 개질 분자가 부착되며, 상기 바이오마커는 상기 표면 개질 분자와 결합될 수 있다.
상술한 본 발명의 일 과제를 달성하기 위하여 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 방법에 따르면, 금속 나노 플레이트를 제조한다. 상기 금속 나노 플레이트의 표면 상에 바이오 리셉터를 부착한다. 바이오마커를 도입하여 상기 바이오 리셉터 및 상기 바이오마커가 결합된 1차 포획 구조체를 형성한다. 금속 나노 입자로 상기 바이오마커를 캡핑하여 2차 포획 구조체를 형성한다. 포획된 상기 바이오 마커를 정량 분석한다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 금속 나노 플레이트는 금 슬러그를 이용하여 사파이어 기판으로부터 에피텍셜(epitaxial) 성장되어 제조될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 리셉터는 티올화(thiolated)되어 부착될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오 리셉터가 부착되지 않은 상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 부분 상에 블로킹 분자를 부착할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 포획된 상기 바이오 마커의 정량 분석은 SERS 신호를 측정하여 수행될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 바이오마커는 cTnI 또는 항-CCP를 포함하며, 상기 바이오리셉터는 트로포닌 압타머 또는 CCP를 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 예시적인 실시예들에 따르면, 예를 들면 금 나노 플레이트에 특정 바이오마커에 특이적인 바이오 리셉터를 고정시킬 수 있다. 상기 바이오 리셉터에 상기 바이오 마커가 포획되면, 이를 예를 들면, 금 나노입자로 캡핑할 수 있다. 따라서, 상기 바이오 마커가 상기 바이오 리셉터 및 상기 금 나노 입자에 샌드위치되므로 극미량의 상기 바이오 마커를 고민감도로 검출할 수 있다. 또한, SERS 분광법을 이용해 상기 바이오 마커 검출의 민감도를 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1은 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 플랫폼을 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질의 진단 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 3 내지 도 6은 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질의 진단 방법을 설명하기 위한 개략도들이다.
도 7은 실험예 1에 따라 제조된 금 나노 플레이트의 주사 전자 현미경(scanning electron microscope: SEM) 및 투과전자현미경(transmission electron microscope: TEM) 사진들이다.
도 8은 Tro4 압타머의 이차 구조를 나타내는 모식도이다.
도 9는 실시예 1에 따라 cTnI의 SERS 신호를 기록한 그래프이다.
도 10 및 도 11은 각각 버퍼 용액 및 20% 혈청 용액에서의 cTnI의 농도에 따른 SERS 신호 강도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 트로포닌 압타머들을 이용하여 다양한 생화학물질을 대상으로 한 SERS 신호 강도를 나타내는 그래프이다.
도 13은 실시예 2에 따라 블로킹 분자 및 바이오 리셉터가 부착된 단결정 금 나노 플레이트 표면을 나타내는 이미지이다.
도 14는 실시예 2에 따라 단결정 금 나노 플레이트 상에 부착된 바이오 리셉터의 높이 분포를 나타내는 그래프이다.
도 15는 비교예에 따라 바이오 리셉터만을 부착시킨 단결정 금 나노 플레이트 표면을 나타내는 이미지이다.
도 16은 도 15의 바이오 리셉터들의 높이 분포를 나타내는 그래프이다.
도 17 및 도 18은 각각 실시예 2 및 비교예에 따른 SERS 신호 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 플랫폼을 설명하기 위한 개략도이다.
도 1을 참조하면, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼은 금속 나노 플레이트(100), 바이오 리셉터(bio-receptor)(110), 바이오마커(biomarker)(120) 및 금속 나노 입자(130)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼은 바이오 마커(120) 검출을 위한 분광 검출부(200) 및 광원(210)을 더 포함할 수 있다.
바이오 마커(120) 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 플랫폼을 통해 검출되는 타겟 물질일 수 있다. 예를 들면, 바이오 마커(120)는 각종 질병의 조기 진단을 위한 표적 물질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼은 급성 심근 경색(acute myocardial infarction: AMI)의 조기 진단을 위해 활용될 수 있다. 이 경우, 바이오 마커(120)는 심근 손상에 의해 혈중 농도가 변화하는 심근 단백질(Cardiac Troponin I: cTnI)를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼은 류마티스 관절염의 조기 진단을 위해 활용될 수 있다. 이 경우, 바이오마커(120)는 항-CCP(anti-cyclic citrullinated peptide: anti-CCP)를 포함할 수 있다.
그러나, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼이 활용되는 질병의 종류가 제한되는 것은 아니며, 상기 질병에 따라 다양한 바이오마커(120)가 사용될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 금속 나노 플레이트(100)로서 금 나노 플레이트를 사용할 수 있다.
예를 들면, 상기 금 나노 플레이트는 단결정 금 나노 플레이트일 수 있다. 이 경우, 반응로(furnace) 내부에서 금 슬러그(slug)를 전구 물질로 사용하여, 상기 금 나노 플레이트를 r-절단(r-cut) 사파이어 기판 상에서 에피텍셜(epitaxial) 성장시킬 수 있다. 이에 따라, 단결정 구조의 상기 금 나노 플레이트가 수득될 수 있다.
금속 나노 플레이트(100)는 실질적으로 표면 결함이 제거된 매끄러운 표면 프로파일을 가질 수 있다. 따라서, 바이오 리셉터(110)이 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에 응집 현상 없이 균일하게 일정한 배향을 가지고 부착될 수 있다.
금속 나노 플레이트(100)는 다각 판 형상, 예를 들면, 삼각형 또는 육각형 형상을 가질 수 있다.
바이오 리셉터(110)는 타겟 물질은 바이오마커(120)에 특이적이며, 금속 나노 플레이트(100)에 고정되어 바이오마커(120)를 포획할 수 있다.
바이오 리셉터(110)는 바이오마커(120)에 대해 결합-친화도(binding-affinity)를 갖는 물질을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 바이오마커(120)가 cTnI를 포함하는 경우, 바이오 리셉터(110)로서 트로포닌 압타머(Troponin Aptamer)를 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 트로포닌 압타머는 셀렉스(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment: SELEX)법을 이용해 선별될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 바이오마커(120)가 항-CCP를 포함하는 경우, 바이오 리셉터(110)로서 CCP를 사용할 수 있다.
그러나, 바이오 리셉터(110)가 상술한 물질로 한정되는 것은 아니며, 바이오마커(120)의 종류에 따라 적절한 바이오 리셉터(110)가 선택될 수 있다.
예시적인 실시예들에 있어서, 바이오 리셉터(110)는 금속 나노 플레이트(100) 표면으로의 부착을 촉진하기 위해 표면 개질될 수 있다. 예를 들면, 티올(thiol)기가 바이오 리셉터(110) 분자 표면에 결합될 수 있다. 금속 나노 플레이트(100)로서 상기 금 나노 플레이트가 사용되는 경우, Au-S 결합을 통해 바이오 리셉터(110)가 금속 나노 플레이트(100) 상에 효과적으로 고정될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에는 블로킹 분자들(105)이 결합될 수 있다. 블로킹 분자(105)로서 분자의 양 말단에 히드록시기(-OH) 및 머캅토(-SH)기가 노출된 유기분자를 사용할 수 있다. 예를 들면, 블로킹 분자(105)로서 6-머캅토헥산올(6-mercaptohexanol)을 사용할 수 있다.
블로킹 분자들(105)은 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에 부착되어 바이오 리셉터(110)의 배향을 보다 일정하게 유지시키는 역할을 수행할 수 있다. 이에 따라, 바이오 리셉터(110)의 결합 부위가 용이하게 노출되어 바이오마커(120)와의 결합이 촉진될 수 있다.
또한, 블로킹 분자들(105) 바이오 리셉터(110)가 위치하지 않은 금속 나노 플레이트(100)의 나머지 사이트들(site)에 결합되어, 라만 염료 분자들로 개질된 금속 나노입자들(130)이 금속 나노 플레이트(100) 혹은 바이오 리셉터(110)와 직접 결합하는 것을 방지할 수 있다.
금속 나노 입자(130)는 바이오마커(120)와 결합하여 바이오마커(110)의 노출 말단을 캡핑할 수 있다. 이에 따라, 바이오마커(120)는 바이오 리셉터(110) 및 금속 나노 입자(130)에 의해 샌드위치되어 완전히 고정될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 금속 나노 입자(130) 표면 상에는 표면 개질 분자(132)가 결합되어, 바이오마커(120)와 결합이 촉진될 수 있다. 예를 들면, 표면 개질 분자(132)로서 면역 글로불린 G(immunoglobulin G, IgG)를 사용할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 금속 나노 입자(130) 표면 상에는 염료 분자(134)가 결합될 수 있다. 예를 들면, 염료 분자(134)는 표면 증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 분광법을 통한 검출을 위한 라만 염료(Raman dye)를 포함할 수 있다. 이 경우, 염료 분자(134)로서 Cy5 또는 MGITC를 사용할 수 있다. 이 경우, 금속 나노 입자(130)는 분광 분석을 위한 리포터(reporter) 물질 역할을 수행할 수 있다.
예시적인 실시예들에 있어서, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼은 포획된 바이오마커(120)의 정량 분석을 위한 분광 검출부(200)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 분광 검출부(200)는 SERS 센서를 포함할 수 있으며, SERS 신호 발생을 위한 레이저 빔 조사를 위한 광원(210)과 결합될 수 있다.
상술한 예시적인 실시예들에 따르면, 실질적으로 표면 결함이 없고, 원자 수준의 매끄러운 표면을 갖는 금속 나노 플레이트(100) 상에 바이오 리셉터들(110)을 균일한 분포 및 배향으로 부착시킬 수 있다. 예시적인 실시예들에 따르면, 금속 나노 플레이트(100)의 RMS(Root Mean Square)로 표시된 표면 거칠기는 약 1 nm 이하일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 금속 나노 플레이트(100)의 표면 거칠기는 약 0.1 nm 이상 약 1 nm 이하일 수 있다.
이에 따라, 바이오마커(120)가 바이오 리셉터(110)에 결합되고 추가적으로 금속 나노 입자(130)에 의해 캡핑되어 금속 나노 플레이트(100) 상에 안정하게 고정될 수 있다. 또한, SERS 법을 사용하여 포획된 바이오마커(120)의 정량 분석을 고민감도로 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 생화학 물질 진단 플랫폼을 사용하여 서브-pM 농도(예를 들면, 0.1 ng/ml 이하) 레벨의 민감도로 바이오마커(120)를 검출할 수 있다.
도 2는 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질의 진단 방법을 설명하기 위한 흐름도이다. 도 3 내지 도 6은 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질의 진단 방법을 설명하기 위한 개략도들이다.
도 2를 참조하면, 금속 나노 플레이트(100)를 제조할 수 있다(단계 S10).
예시적인 실시예들에 따르면, 금속 나노 플레이트(100)는 단결정 기판 상에서 금속 전구 물질을 공급하여 에피택셜 성장 공정을 통해 제조될 수 있다. 예를 들면, 반응로(furnace) 내부의 r-절단(r-cut) 사파이어 기판 상에 상기 금속 전구 물질로서 금 슬러그를 주입하여, 에피텍셜 성장된 금 나노 플레이트를 수득할 수 있다. 상기 금 나노 플레이트는 단결정 구조의 다각형 플레이트 형상을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 추가적으로 상기 금 나노 플레이트 표면을 예를 들면, 에탄올을 사용해 세척하고, 질소(N2) 가스 또는 아르곤 가스(Ar)와 같은 비활성 가스 분위기 하에서 건조시킬 수 있다. 이에 따라, 금속 나노 플레이트(100)의 표면을 깨끗한 상태로 보관할 수 있다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 금속 나노 플레이트(100) 상에 바이오 리셉터들(110)을 부착시킬 수 있다(단계 S20).
예시적인 실시예들에 따르면, 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에 바이오 리셉터들(110)을 도입한 후, 상온에서 약 12 시간 동안 배양함으로써 바이오 리셉터들(110)을 부착시킬 수 있다.
예를 들면, 바이오 리셉터(110)로서 트로포닌 압타머 또는 CCP를 사용할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 바이오 리셉터(110)를 티올화(thiolated)하여, 예를 들면 분자 말단에 티올기를 부착시켜, 예를 들면, Au-S 결합을 통해 바이오 리셉터(110)의 금속 나노 플레이트(100)로의 부착이 촉진될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 바이오 리셉터들(110)은 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에서 실질적으로 균일하게 분포될 수 있으며, 금속 나노 플레이트(100)의 상기 표면에 대해 실질적으로 수직 배향될 수 있다. 이에 따라, 바이오 리셉터(110)의 바이오마커(120)와의 결합을 위한 결합 말단이 금속 나노 플레이트(100)의 상기 표면으로부터 완전히 노출될 수 있다.
도 2 및 도 4를 참조하면, 금속 나노 플레이트(100) 상에 블로킹 분자들(105)을 부착시킬 수 있다(단계 S25).
예를 들면, 블로킹 분자들(105)은 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에 도입되어 상온에서 약 30분 간의 배양을 통해 부착될 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 블로킹 분자들(105)은 금속 나노 플레이트(100)의 결합 사이트들 중 바이오 리셉터(110)가 부착되지 않은 사이트들에 부착될 수 있다. 블로킹 분자들(105)은 인접하는 바이오 리셉터들(110) 사이에 게재되어 바이오 리셉터들(110)의 수직 배향을 촉진할 수 있다.
예시적인 실시예들에 따르면, 블로킹 분자(105)로서 분자의 양 말단에 히드록시기 및 머캅토기가 결합된 유기분자, 예를 들면 6-머캅토헥산올을 사용할 수 있다.
한편, 일부 실시예들에 있어서, 블로킹 분자(105)의 부착은 생략될 수도 있다.
도 2 및 도 5를 참조하면, 금속 나노 플레이트(100) 상에 바이오마커(120)를 도입하여 바이오 리셉터(110)에 결합시킬 수 있다. 이에 따라, 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에는 바이오 리셉터(110) 및 바이오마커(120)가 결합된 1차 포획 구조체(125)가 부착될 수 있다(단계 S30).
예시적인 실시예들에 따르면, 바이오마커들(120)을 금속 나노 플레이트(100) 상에 공급하여 상온에서 약 2 내지 약 6시간 동안 배양하여 1차 포획 구조체(125)를 형성할 수 있다.
바이오마커(120)는 검출의 타겟 물질로서 예를 들면, AMI 또는 류마티스 관절염의 조기 진단을 위한 cTnI 또는 항-CCP를 포함할 수 있다. 그러나, 바이오마커(120)는 진단 대상 질병에 따라 다양한 생화학 물질을 포함할 수 있으며, 바이오마커(120)에 특이성을 갖는 적절한 바이오 리셉터(110)가 선택될 수 있다.
1차 포획 구조체(125)는 바이오 리셉터(110)의 분포 및/또는 배향에 따라, 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에 균일하게 수직 배향될 수 있다. 이에 따라, 바이오마커(120) 말단의 결합 사이트가 외부로 균일하게 노출될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 블로킹 분자들(105)에 의해 1차 포획 구조체(125)의 기울어짐, 쓰러짐 등의 현상이 방지되어 상기 수직 배향이 유지될 수 있다.
도 2 및 도 6을 참조하면, 금속 나노 플레이트(100) 상에 금속 나노 입자(130)를 도입하여 바이오마커(120)의 말단을 캡핑할 수 있다. 이에 따라, 금속 나노 플레이트(100) 표면 상에는 바이오마커(120)가 바이오 리셉터(110) 및 금속 나노 입자(120) 사이에 샌드위치된 2차 포획 구조체(140)가 부착될 수 있다(단계 S40).
예시적인 실시예들에 따르면, 금 나노 입자를 금속 나노 플레이트(100) 상에 공급하여 상온에서 약 45분 내지 약 90분 동안 배양하여 2차 포획 구조체(140)를 형성할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 금속 나노 입자(130) 표면 상에는 표면 개질 분자(132)를 부착시켜, 바이오마커(120)와 결합을 매개할 수 있다. 예를 들면, 표면 개질 분자(132)로서 IgG를 사용할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 금속 나노 입자(130) 표면 상에는 염료 분자(134)를 추가적으로 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 염료 분자(134)로서 Cy5 또는 MGITC와 같은 라만 염료를 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 금속 나노 플레이트(100) 상에는 블로킹 분자(105)가 부착되어 있으므로, 금속 나노 입자(130)가 금속 나노 플레이트(100)와 직접 결합되는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 금속 나노 입자(130)는 바이오마커(120)와 고선택성을 가지고 결합되므로, 검출 또는 분석의 민감도 및 정확도를 향상시킬 수 있다.
다시 도 2를 참조하면, 바이오 리셉터(110) 및 금속 나노 입자(130)에 의해 포획된 바이오 마커(120)를 정량 분석할 수 있다(단계 S50).
예시적인 실시예들에 따르면, 상기 정량 분석은 SERS 분광법을 통해 수행될 수 있다. 이 경우, 금속 나노 플레이트(100)에 바이오마커(120)가 결합됨에 따라 발생하는 라만산란의 세기 증폭을 측정하여 상기 정량 분석을 수행할 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조로 상술한 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 방법에 대해 보다 상세히 설명한다.
[실시예 1] cTnI의 검출
단결정 금 나노 플레이트의 제조
석영(quartz) 튜브가 삽입된 1 inch 지름의 반응로 내부에 100 sccm 유량의 Ar 가스를 공급하여 반응로 내부를 30분 동안 퍼지(purge)시켰다. 금 슬러그를 알루미나 보트를 사용하여 상기 반응로의 히팅 존 중심에 재치시키고 약 1,200oC 의 온도에서 가열하였다, 이에 따라, 금 증기가 상기 히팅 존 중심에 소정의 거리로 이격되어 배치된 r-cut 사파이어 기판으로 이동하여 단결정 금 나노 플레이트가 상기 기판 상에서 에피텍셜 성장하였다. 상기 성장 공정은 약 60분 내지 약 90분 동안 유지되었다.
이후, 성장된 단결정 금 나노 플레이트를 분리하여 실리콘 기판 상에 이동시킨 후, 에탄올 용액 및 질소 가스를 이용해 세척 및 건조 공정을 수행하였다.
도 7은 실시예 1에 따라 제조된 금 나노 플레이트의 SEM 및 TEM 사진들이다.
도 7을 참조하면, 상기 기판 상에서 넓은 [111]면을 가지는 실질적으로 삼각형 판 형상의 단결정 금 나노 플레이트가 제조되었음을 확인할 수 있다.
트로포닌 압타머의 제조
박테리아 발현 시스템으로부터 재조합 cTnI와 트로포닌 복합체들을 정제하였다. 이들을 SELEX 방법을 통해 6 종류의 트로포닌 압타머들을 수득하였다. cTnI의 고정화 및 용출을 위해 His-tag 마그네틱 비드가 사용되었으며, cTnI와 결합하는 단일가닥 DNA(ssDNA)는 PCR 과정에 의해 증폭되어 다음 라운드(round)의 라이브러리(library)로 사용되었고, 총 11회의 SELEX 라운드를 통해 최종적으로 상기 트로포닌 압타머들을 선별할 수 있었다. 최종적으로 6 종류의 트로포닌 압타머들이 선별되었으며, 이들의 염기서열을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112014077580398-pat00001
상기 표 1을 참조하면, 6종류의 상기 트로포닌 압타머들은 염기서열 유형에 따라 3개의 그룹으로 분류되었다. 제1 그룹은 (Tro1, Tro2) 스템 루프(stem loop)에 포함되는 'TTT-T'와 'TCCC' 염기서열을 가지고, 제2 그룹은 (Tro3, Tro4) 스템 루프에 포함되는 'TTT-TCA' 염기서열과 'CCCTC' 염기서열을 가진다. 제3 그룹은 (Tro5, Tro6) 스템 루프에 포함되는 'AA-GT'와 'CCTC' 염기서열을 가진다. 상기 분석결과를 통해 트로포닌 압타머들이 단일 스템-루프와 반복적인 퓨린(purine) 서열을 가지고 있음을 추정할 수 있다.
추가적으로, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)법을 이용해 각 트로포닌 압타머들과 cTnI간의 결합 친화도를 해리 상수(Kd) 값을 통해 측정하였다. cTnI에 대한 Tro4 압타머의 Kd 값이 다른 트로포닌 압타머들 중에서 가장 낮은 270 pM으로 측정되었으며 즉, cTnI와 보다 강한 결합을 형성함을 알 수 있다.
도 8은 Tro4 압타머의 이차 구조를 나타내는 모식도이다.
도 8에 도시된 바와 같이, Tro4의 내부에 형성되는 긴 상보적인 염기서열에 의해 이뤄지는 상대적으로 보다 견고한 이차 구조에 기인하여 cTnI와 보다 강한 친화도를 가질 수 있음을 추측할 수 있다.
트로포닌 압타머의 금 나노 플레이트에의 부착
상기에 제조된 단결정 금 나노 플레이트를 1μM의 티올화된(thiolated) Tro6 압타머 용액과 함께 SELEX 버퍼(0.1M PBS, 10mM NaCl, 5mM KCl,1mM MgCl2, pH 7.4) 내에서 12시간 동안 상온에서 배양시켰다. 상기 배양 후에, Tro6으로 개질된 상기 단결정 금 나노 플레이트를 상술한 SELEX 버퍼 및 탈이온수로 린스하였다.
금 나노 입자의 제조
직경 10 nm이하의 금 나노 입자(Sigma-Aldrich사 제조)를 준비하고 이를 13,200rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상기 금 나노 입자를 티올화되고 라만 염료(Cy5)가 부착된 Tro4 압타머 용액(SH-Tro4-Cy5, 리포터 압타머) 1μM에 상온에서 3시간 동안 분산시켰다. 희석된 SELEX 버퍼(0.05M PBS, 5mM NaCl, 2.5mM KCl, 0.5 mM MgCl2, pH 7.4)를 사용하여 염 형성에 의한 금 나노입자의 응집을 방지하였다. 과량의 리포터 압타머를 제거하기 위해, 상기 수득된 용액을 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 이에 따라, 저부에는 금 나노 입자의 펠렛이 잔류하였다.
혼성(Hybridization)
타겟 물질인 바이오마커로서 cTnI가 혼성 버퍼(20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 20%(w/v) 글리세롤, 0.5 mM 베타-머캅토에탄올, 0.05% Tween 20, pH 8.0)에 첨가되었다. 먼저, 상기의 금 나노 입자와 결합된 리포터 압타머를 35oC에서 30분 동안 cTnI 용액에 분산시키고, 이후, 상술한 트로포닌 압타머가 결합된 금 나노 플레이트를 35oC에서 5시간 동안 침지시켰다. 이후, 혼성 버퍼 및 탈이온수로 세척하고, 질소 가스를 주입하여 건조시켰다.
SERS 측정
올림푸스(Olympus) BX41 현미경을 기반으로 한 마이크로-라만 시스템으로부터 SERS 스펙트럼을 측정하였다. 633nm 조사파장의 He-Ne 레이저(Melles Griot사 제품)이 여기 광원으로 사용되었으며, 레이저 광은 상술한 샘플 상에 ㅧ100 대물렌즈(NA = 0.7, Mitutoyo사 제품)를 통해 집중되었다. SERS 신호들은 200 그루브(groove)/mm 격자를 갖는 분광기 상에 재치된 열역학적으로 냉각된 전자 증폭 전하 결합 장치(electron multiplying charge coupled device: EMCCD, Andor사 제품)를 이용하여 기록되었다.
도 9는 실시예 1에 따라 cTnI의 SERS 신호를 기록한 그래프이다.
도 9를 참조하면, cTnI의 농도가 100 pM인 경우 0 M인 경우에 비해 강한 SERS가 얻어짐을 확인할 수 있다.
도 10 및 도 11은 각각 버퍼 용액 및 20% 혈청 용액에서의 cTnI의 농도에 따른 SERS 신호 강도를 나타낸 그래프들이다.
도 10을 참조하면, 버퍼 용액에서는 100 aM의 검출한계로 cTnI를 검출할 수 있으며, 20% 혈청 용액에서도 10 fM의 검출한계로 cTnI를 검출할 수 있음을 알 수 있다, 따라서, AMI 조기 진단을 위해 충분한 감도로 예시적인 실시예들에 따른 플랫폼 및 방법이 활용될 수 있음을 알 수 있다.
도 12는 트로포닌 압타머들을 이용하여 다양한 생화학물질을 대상으로 한 SERS 신호 강도를 나타내는 그래프이다.
도 12를 참조하면, 실시예 1에 따라 발굴된 트로포닌 압타머들이 실질적으로 cTnI에만 선택적으로 결합하여 SERS 신호를 생성함을 확인할 수 있다.
[실시예 2] 항-CCP(anti-CCP)의 검출
바이오마커로서 cTnI 대신 항-CCP를 사용하고, 바이오 리셉터로서 트로포닌 압타머 대신 티올화된 CCP(SH-CCP)를 사용하고, 라만 염료로서 Cy5 대신 MGITC를 사용한 것을 제외하고는, 실질적으로 실시예 1과 유사한 방법으로 포획된 항-CCP의 SERS 신호를 측정하였다. 또한, 단결정 금 나노 플레이트 표면 상에 블로킹 분자로서 6-머캅토헥산올을 사용하여 SH-CCP가 미부착된 사이트를 블로킹시켰다.
한편, 상기 블로킹 분자의 부착을 생략하고 나머지는 실시예 2와 동일한 방법으로 SERS 신호를 측정하였다(비교예).
도 13은 실시예 2에 따라 블로킹 분자 및 바이오 리셉터가 부착된 단결정 금 나노 플레이트 표면을 나타내는 이미지이다. 도 14는 실시예 2에 따라 단결정 금 나노 플레이트 상에 부착된 바이오 리셉터의 높이 분포를 나타내는 그래프이다.
도 13을 참조하면, 상기 단결정 금 나노 플레이트 상에 상기 바이오 리셉터가 균일하고 촘촘하게 분포 및 배향된 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 14를 참조하면, 상기 바이오 리셉터들이 상기 단결정 금 나노 플레이트 표면으로부터 약 7 내지 8nm의 높이로 수직 배향됨을 알 수 있다.
도 15는 비교예에 따라 바이오 리셉터만을 부착시킨 단결정 금 나노 플레이트 표면을 나타내는 이미지이다. 도 16은 도 15의 바이오 리셉터들의 높이 분포를 나타내는 그래프이다.
도 15를 참조하면, 상대적으로 바이오 리셉터가 부착되지 않은 사이트들을 관찰할 수 있다. 또한, 도 16을 참조하면, 도 14에 도시된 실시예 2의 경우에 비해 바이오 리셉터의 높이 분포가 2nm 이내로 감소됨을 알 수 있다. 따라서, 블로킹 분자가 존재하는 실시예 2의 경우보다 수직 배향 정도가 감소되었음을 알 수 있다.
도 17 및 도 18은 각각 실시예 2 및 비교예에 따른 SERS 신호 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 17을 참조하면, 실시예 2의 경우 40 aM의 극미량의 농도까지 유의미한 SERS 신호가 측정됨을 확인할 수 있다. 특히 pM 이하의 농도에서, 예시적인 실시예들에 따른 플랫폼 및 방법들이 항-CCP의 초미세 농도변화를 정확하게 모니터링하기 위해 활용될 수 있음을 예측할 수 있다.
도 18을 참조하면, 비교예의 경우 블로킹 분자의 부존재로 인해 상대적으로 SERS 신호의 민감도가 감소됨을 알 수 있다. 도 18에 표시되었듯이 유의미한 정량이 가능한 검출 한계가 약 4 fM 레벨로 감소하였다. 따라서, 블로킹 분자의 부존재로 인해 금 나노입자의 응집 현상 및 바이오마커 포획 특이성 감소가 발생하였음을 추측할 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 생화학 물질 진단 플랫폼 및 생화학 물질 진단 방법에 따르면, 금속 나노 플레이트 및 금속 나노 입자 사이에 바이오 리셉터를 이용하여 바이오마커를 포획할 수 있다. 포획된 상기 바이오마커를 SERS법을 통해 정량함으로써 고민감도의 타겟 생화학 물질의 검출이 가능하다.
상술한 생화학 물질 검출 플랫폼 및 생화학 물질 검출 방법은 AMI 및 류마티스 관절염 뿐만 아니라 다양한 질병의 조기 진단에 효과적으로 활용될 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 예시적인 실시예들을 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
100: 금속 나노 플레이트 105: 블로킹 분자
110: 바이오 리셉터 120: 바이오 마커
125: 1차 포획 구조체 130: 금속 나노 입자
132: 표면 개질 분자 134: 염료 분자
140: 2차 포획 구조체 210: 광원
200: 분광 검출부

Claims (17)

  1. 금속 나노 플레이트;
    상기 금속 나노 플레이트의 표면 상에 부착된 바이오 리셉터(bio receptor);
    상기 바이오 리셉터에 의해 포획된 바이오마커(biomarker);
    상기 바이오마커를 캡핑하는 금속 나노 입자; 및
    포획된 상기 바이오마커를 분석하기 위한 분광 검출부를 포함하며,
    상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 중 상기 바이오 리셉터가 부착되지 않은 부분에 부착되어 상기 바이오리셉터의 배향을 보조하며, 양 말단에 히드록시기 및 머캅토기가 노출된 블로킹 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노 플레이트 및 상기 금속 나노 입자는 각각 단결정 금 나노 플레이트 및 금 나노 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노 플레이트는 RMS(Root Mean Square) 표면 거칠기가 1 nm 이하인 금 나노 플레이트인 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 상에 수직 배향되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바이오마커는 상기 바이오 리셉터 및 상기 금속 나노 입자 사이에 샌드위치되어 포획 구조체가 형성되며,
    상기 포획 구조체는 상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 상에 수직 배향되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이오 마커는 심근 단백질(Cardiac Troponin I: cTnI)을 포함하며, 급성 심근 경색 진단을 위해 활용되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 트로포닌 압타머(Troponin Aptamer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  9. 제1항에 있어서, 상기 바이오 마커는 항-CCP(anti-cyclic citrullinated peptide: anti-CCP)를 포함하며, 류마티스 관절염 진단을 위해 활용되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 CCP를 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 검출 플랫폼.
  11. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노 입자 표면 상에 라만 염료가 부착된 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  12. 제11항에 있어서, 상기 분광 검출부는 표면 증강 라만 산란 (Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  13. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노 입자 표면에 표면 개질 분자가 부착되며, 상기 바이오마커는 상기 표면 개질 분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 플랫폼.
  14. 금속 나노 플레이트를 제조하는 단계;
    상기 금속 나노 플레이트의 표면 상에 바이오 리셉터를 부착하는 단계;
    상기 금속 나노 플레이트의 상기 표면 중 상기 바이오 리셉터가 부착되지 않은 부분에, 상기 바이오 리셉터의 배향을 보조하며, 양 말단에 히드록시기 및 머캅토기가 노출된 블로킹 분자를 부착하는 단계;
    바이오마커를 도입하여 상기 바이오 리셉터 및 상기 바이오마커가 결합된 1차 포획 구조체를 형성하는 단계;
    금속 나노 입자로 상기 바이오마커를 캡핑하여 2차 포획 구조체를 형성하는 단계; 및
    포획된 상기 바이오 마커를 정량 분석하는 단계를 포함하는 생화학 진단 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 금속 나노 플레이트는 금 슬러그를 이용하여 사파이어 기판으로부터 에피텍셜(epitaxial) 성장되어 제조되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 방법.
  16. 제14항에 있어서, 포획된 상기 바이오 마커를 정량 분석하는 단계는 SERS 신호를 측정하는 단계를 포함하는 생화학 물질 진단 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 바이오마커는 cTnI 또는 항-CCP를 포함하며, 상기 바이오리셉터는 트로포닌 압타머 또는 CCP를 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 진단 방법.
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