KR102428467B1 - 플라즈몬 현상을 이용한 진단 방법, 진단 키트 및 진단 키트의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

제1 나노 입자가 프린팅된 제1 기판을 이용하여 타겟 물질의 진단을 수행하기 위한 방법이 개시된다. 일 예시에 따르면, 상기 타겟 물질과 결합할 수 있는 화합물이 본딩된 제2 나노 입자를 상기 제1 기판과 인접한 거리에 위치시키는 단계;를 포함할 수 있다.

Description

플라즈몬 현상을 이용한 진단 방법, 진단 키트 및 진단 키트의 제조 방법{DIAGNOSIS METHOD USING PLASMON PHENOMENON, DIAGNOSTIC KIT AND MANUFACTURING METHOD OF DIAGNOSTIC KIT}

본 발명은 플라즈몬 현상을 이용한 진단 방법, 진단 키트 및 진단 키트의 제조 방법에 관한 발명이다.

플라즈몬이란 금속 원자와 그 주변의 자유전자의 집단적으로 진동 (oscillation)에 의해 생성되는 모드를 의미한다. 국소표면 플라즈몬 (Localized surface plasmon resonance, LSPR) 센서는 금속 나노구조의 주위 환경 변화로부터 발생하는 미세한 굴절률 변화를 흡광도의 변화를 통하여 측정하는 센싱 기법을 의미한다.

기존의 경우, 플라즈몬 현상을 이용한 검출 센서가 개시된 바 있으나, 검출할 수 있는 단백질의 농도에 한계가 있는 문제점이 있었다.

본 발명에 따르면, 나노입자-나노패턴이 커플링된 플라즈몬 센서를 바탕으로 단백질 기반의 바이오마커 생체물질을 고감도로 검출하는 기술을 제시하고, 진단소자 및 진단키트로 활용될 수 있는 방법을 제안한다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않는다. 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 이하의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 예시에 따른 제1 나노 입자가 프린팅된 제1 기판을 이용하여 타겟 물질의 진단을 수행하기 위한 방법이 개시된다.

일 예시에 따르면, 상기 타겟 물질과 결합할 수 있는 화합물이 본딩된 제2 나노 입자를 상기 제1 기판과 인접한 거리에 위치시키는 단계;를 포함할 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 제1 나노 입자에는 상기 타겟 물질과 결합할 수 있는 화합물이 본딩되어 있을 수 있다.

일 예시에 따르면, 타겟 물질을 인가하는 단계; 를 포함할 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 제1 나노 입자와 상기 제2 나노 입자의 플라즈몬 현상을 통해 상기 타겟 물질을 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 제2 나노 입자의 형상은 정육면체, 직육면체, 구, 원기둥의 형태 중 어느 하나일 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 제1 나노 입자 및 상기 제2 나노 입자는 플라즈몬 현상이 발생할 수 있는 금속 중 어느 하나일 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 인접한 거리는 30nm 내지 200nm일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 제1 나노 입자가 프린팅된 제1 기판;을 포함하는 타겟 물질의 진단을 수행하기 위한 진단 키트가 개시된다.

일 예시에 따르면, 상기 제1 나노 입자와 커플링 될 수 있는 제2 나노 입자;를 더 포함할 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 제1 나노 입자 및 상기 제2 나노 입자에는 상기 타겟 물질과 결합할 수 있는 화합물;이 본딩되어 있을 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 제2 나노 입자는 상기 제1 나노 입자와 인접한 거리에 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 타겟 물질의 진단을 위한 진단 키트를 제조하는 방법이 개시된다.

일 예시에 따르면, 제1 기판에 제1 나노 입자를 프린팅 하는 단계; 상기 제1 나노 입자가 프린팅 된 진단 키트를 플레이트 내에 부착하는 단계;를 포함할 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 타겟 물질과 결합할 수 있는 화합물을 상기 제1 나노 입자에 본딩하는 단계;를 포함할 수 있다.

일 예시에 따르면, 상기 플레이트 내에 상기 타겟 물질과 결합할 수 있는 화합물이 본딩된 제2 나노 입자를 위치시키는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 나노임프린트 기술을 활용하여, 나노줄무늬 (Nanostripe) 구조 플랫폼의 대량생산이 가능하다.

본 발명에 따르면, 나노입자 합성 기술을 통하여, 시료검사에 사용되는 콜로이드 기반 나노입자를 대량생산 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 나노줄무늬 기반 플라즈몬 물질 플랫폼과 나노입자 기반 시료검사 시약들을 바탕으로 질병진단용 단백질 검출 키트(kit)의 구성이 가능할 수 있다.

본 발명의 다른 일 예시에 따르면, 단백질 기반의 바이오마커를 검출함으로써 암, 당뇨병, 퇴행성 뇌질환과 같은 질병 진단 키트 혹은 질병 진단 센서로 활용될 수 있다.

본 발명의 일 예시에 따르면, 기존에 비해 훨씬 적은 양의 단백질도 센싱이 가능한 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상술한 효과들로 제한되지 않는다. 언급되지 않은 효과들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 제1 기판에 제1 나노 입자를 프린팅 하는 것을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 도 1에 따른 프린팅 방법을 보다 상세하게 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 제2 나노 입자를 제조하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 도 3의 방법에 따라 제2 나노 입자를 제조한 일 예시를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 진단 방법 및 플라즈몬 현상을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 표면이 항체로 바이오기능화 된 나노입자를 유도 결합 플라즈마로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 제1 기판에 제1 나노 입자가 프린팅 된 상황에서 화합물의 본딩 여부에 따라 각각 광전자 분광법으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 항체를 고정시킨 후 분광분석기로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 예시에 따른 진단 키트의 제조 방법 및 진단 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 일 예시에 따른 타겟 물질을 검출하는 것을 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 예시에 따른 진단 키트에서의 컨트롤 신호를 비교하는 표를 나타낸다.

아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.

어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 구체적으로, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한 도면에서 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.

본 발명에서는 제1 기판(10)에 형성되는 제1 나노 입자(100) 프린팅과, 그와 인접한 거리에 제공되는 제2 나노 입자(200)의 구조를 커플링 시켜 센서의 감도(Sensitivity)를 높임으로써, 단일 구조로는 검출해내기 어려운 수준의 극소량의 검체를 센싱할 수 있는 진단 키트 및 진단 방법을 제안한다. 본 발명에서는 플라즈몬 증폭현상에 물리적 특성 기반을 둔다. 본 발명의 일 예시에 따르면, 금, 은, 백금과 같은 플라즈몬 물질로 구성된 플라즈몬 나노구조체 두 가지 이상을 커플링 시킴으로써 플라즈몬 신호를 증폭시켜 센서의 감도를 높일 수 있는 효과가 있다. 본 발명의 일 예시에 따르면, 나노임프린트(Nanoimprint) 기반의 나노줄무늬(Nanostripe) 플랫폼 구조, 즉 제1 기판(10)에 형성된 제1 나노 입자(100) 프린팅 구조와, 콜로이드 기반 나노 입자(Nanoparticle) 구조, 즉 제2 나노 입자(200)가 각각에 연결된 화합물(110, 210)과 타겟 물질(T)을 통해 연결되는 형태로 제공될 수 있다. 제1 나노입자(100)는 증착과 같은 하향식 (top-down) 방법에 의해서 형성될 수 있는 나노구조체 혹은 나노패턴이며, 줄무늬 구조가 될 수 있다. 제2 나노입자(200)는 상향식 (bottom-up) 방법에 의해서 형성될 수 있는 나노구조체 혹은 나노패턴이며, 화학적 합성에 의해서 형성될 수 있는 콜로이드 기반 나노입자가 될 수 있다.

일 예시에 따르면 제1 나노 입자(100)와 제2 나노 입자(200)는 항체(110)-항원(T)-항체(210)에 의해 연결되는 형태로 제공될 수 있다. 이 때 항체는 화합물, 항원은 타겟 물질(T)일 수 있으나, 이는 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서는 나노임프린트 기법을 사용하여 제1 기판(10)에 금속물질을 나노줄무늬 형태로 증착 시켜 플라즈몬 현상을 유도한 후, 또 다른 금속 나노입자를 합성하여 항체-항원-항체 형태의 샌드위치 구조를 만드는 것을 통해, 플라즈몬 현상을 크게 증폭시켜 나노몰 (nanomole) 혹은 피코몰 (picomole) 수준으로 항원을 검출할 수 있는 기법을 제시한다. 이하에서 도면을 통해 보다 상세하게 본 발명에 따른 진단 방법 및 진단 키트, 그리고 진단 키트의 제조 방법에 대해 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 제1 기판(10)에 제1 나노 입자(100)를 프린팅 하는 것을 설명하기 위한 도면이다.

도 1을 참조하면, 롤투롤 (Roll-to-roll) 나노임프린트(nanoimprint) 제조기술을 통하여 나노구조를 가지는 칩을 대량으로 생산하고, 그 위에 금속을 열증착을 통해 도포하여 플라즈몬 센서를 제작할 수 있다. 이 때, 금속에는 금, 은, 백금이 포함될 수 있다. 그러나 이 때 증착 하는 금속은 이에 한정되지 아니하고, 플라즈몬 현상을 일으킬 수 있는 금속이면 모두 가능할 수 있다. 이 때 제1 기판(10)에 형성되는 나노 패턴에는 나노 줄무늬, 나노 도트, 나노 스퀘어 구조가 포함될 수 있다. 그러나 이 때 형성되는 나노 패턴은 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 따르면, 제1 기판(10)에 형성된 나노구조 패턴에 금속을 열 증착할 때, 도포된 금속이 다형성의 구조를 가질 수 있도록 증착 스테이지를 기울여 나노 구조의 크기 및 모양을 조절할 수 있다.

도 1은 PET 필름과 같은 연성 기판에 에어 브러시로 레진을 코팅한 후, 롤투롤 나노 임프린트 기술을 통한 나노 스트립 제조의 개략도를 나타낸다. 본 발명에 따르면, 롤투롤 나노임프린트 기술을 사용함으로써, 연성 기판(Flexible substrate)에 나노 구조를 대량으로 빠른 시간 내에 제작할 수 있는 효과가 있다. 또한, 마스터 몰드(Master mold)에 새겨진 나노 패턴을 연성기판에 전사할 수 있는 효과가 있으며, UV 경화용 레진을 사용하여 연성 기판 위에 나노 패턴을 대량으로 생산할 수 있다. 일 예시에 따르면, 제1 기판(10)은 연성 기판일 수 있다. 일 예시에 따르면 제1 기판(10)은 Polyethylene terephthalate (PET), polyimide (PI), polyethylene (PE), poly(vinyl chloride) (PVC), polypropylene (PP), polystyrene (PS), poly(tetrafluoroethylene) (PTFE, Teflon), poly(acrylonitrile), poly(methyl methacrylate) (PMMA, Plexiglas) 와 같은 탄소(C) 기반의 폴리머와 Polydimethylsiloxane (PDMS) 와 같은 실리콘 (Si) 기반의 폴리머 중 어느 하나로 제공될 수 있다. 일 예시에 따르면, 제1 기판(10)에 프린팅되는 제1 나노 입자(100)는 나노 패턴을 형성하며 제공될 수 있다. 이 때, 나노패턴에는 나노줄무늬, 나노도트, 나노스퀘어 구조가 포함될 수 있다. 본 발명의 일 예시에 따른 금속 나노패턴 구조가 형성된 PET 필름은 반투명하여 광원이 통과할 수 있으므로 흡광도의 변화를 관찰할 수 있는 효과가 있다.

도 2는 도 1에 따른 프린팅 방법을 보다 상세하게 설명하기 위한 도면이다. 일 예시에 따르면 도 2는 금속 나노 구조체의 제작방법을 나타낸다. 도 2(a)는 열 증착 챔버의 디지털 카메라 사진을 나타낸다. 도 2(b)는 도 2(a)에서 네모로 표시한 부분을 확대한 사진이다. 도 2(c)는 나노줄무늬 패턴을 가진 PET 필름을 축을 20°로 기울인 스테이지 필름에 고정한 개략도를 나타낸다. 도 2(d)는 나노줄무늬 패턴을 가진 PET 필름에 금을 증착하여 이중으로 구부러진 금 나노구조체를 제작하는 과정을 나타낸다.

도 2를 참조하면, 제1 기판에 형성된 나노구조패턴에 금속을 열 증착할 때, 도포된 금속이 다형성의 구조를 가질 수 있도록 증착 스테이지를 기울여 나노구조의 크기 및 모양을 조절할 수 있다. 일 예시에 따르면, 도 2에 따른 나노구조 제작은 열 증착법(thermal evaporator), 전자빔 증착법(e-gun evaporator), 스퍼터(Sputter)와 같은 물리적 기상 증착(physical vapor deposition, PVD), 화학기상증착(chemical vapor deposition, CVD), 원자층증착(atomic layer deposition, ALD)과 같은 박막증착 공정 중 어느 하나를 이용하여 수행할 수 있다. 그 이후, 주사전자 현미경(Scanning electron microscopy, SEM)을 통하여 다형성 구조물의 형성여부를 확인하는 작업을 수행할 수 있다.

일 예시에 따르면, 금속의 다형성 구조물에서 발생하는 국부적인 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 현상 관찰을 관찰하면, 나노 패턴 구조가 없는 금 증착 PET 필름을 분광분석기로 확인한 결과 LSRPR 현상이 관찰되지 않는다. 일 예시에 따르면, 열 증착기에서 각각 10°, 17.5°, 20° 및 25°의 서로 다른 경사각으로 금 나노구조를 증착할 때, 20°에서 LSPR 신호가 가장 강하게 측정된다.나노패턴이 새겨진 필름 위에 열 증착기를 이용하여 금속의 다형성 구조물을 형성하고자 하는 경우, 필름을 장착하는 스테이지의 각도에 따라서, 구조물의 형태가 달라지며, 이에 따른 광학적 특성이 달라지는 효과가 있다.

도 3은 본 발명에 따른 제2 나노 입자(200)를 제조하는 방법을 설명하기 위한 도면이다. 일 예시에 따르면, 도 3은 금 나노입자(금 나노큐브)의 합성법을 설명하기 위한 도면이다. 도 3 및 이하에서는 제2 나노 입자(200) 및 제1 나노 입자(100)를 금을 이용하여 제조하는 예시가 개시되나, 제1 나노 입자(100) 및 제2 나노 입자(200)의 재료는 금에 한정되지 아니하고, 플라즈몬 현상을 일으킬 수 있는 금속이면 가능하다.

도 3을 참조하면, 금을 나노입자 콜로이드 용액 형태로 제조할 경우 구조 및 크기에 따라 다양한 색과 여러 가지 우수한 물리적 성질이 발현될 수 있다. 금 나노입자 콜로이드 용액은 citrate를 이용한 환원법, 광촉매를 이용한 환원 반응법, seed mediated growth 합성법 중 어느 하나를 이용하여 제조될 수 있다.

일 예시에 따르면, seed mediated growth 합성법은 금속 나노입자를 합성하는데 있어서 가장 다양하고 신뢰성 있는 방법일 수 있다. 본 발명의 일 예시에 따르면, Seed mediated growth 나노입자 합성 기술을 통하여, 시료검사에 사용되는 콜로이드 기반 나노입자를 대량생산 할 수 있다. 일 예시에 따르면 콜로이드 기반의 나노입자는 나노큐브, 나노스타, 나노막대와 같이 다양한 형태와 크기를 가질 수 있다.

도 4는 도 3의 방법에 따라 제2 나노 입자(200)를 제조한 일 예시를 나타내는 도면이다. 도 4에 따르면, 도 3의 방법에 따라 형성된 금 나노입자의 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 관찰결과가 개시된다.

도 4를 참조하면, 균일한 크기와 모양의 금 나노입자가 개시되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 방법을 통해 균일한 크기의 제2 나노입자를 형성할 수 있음을 확인할 수 있다.

도 5는 본 발명에 따른 진단 방법 및 플라즈몬 현상을 설명하기 위한 도면이다.

본 발명에 따른 진단 키트는 플라즈몬 성질을 가지는 플라즈몬 센서를 통하여 단백질을 고감도로 검출하고, 이를 질병의 유무 및 건강상태를 알아보는데 활용할 수 있는 방법을 제시한다.

플라즈몬 구조(plasmon structure)란 금 (gold), 은 (silver), 백금 (platinum) 과 같은 표면 플라즈마 진동 (plasma oscillation)에 의한 플라즈몬 (plasmon) 특성을 가지는 물질을 의미한다. 본 발명에서의 단백질이란 질병의 유무나 건강상태를 알아볼 수 있는 바이오마커를 의미하며, 정상 및 환자(인간) 혹은 동물의 검체 (혈액, 소변, 타액, 안액)에 존재할 수 있다.

도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 제1 기판(10)에 형성된 제1 나노입자(100)를 통한 나노패턴과, 제2 나노입자(200)와의 커플링을 기반으로 한 플라즈몬 센서가 개시된다. 일 예시에 따르면, 도 5(a)에서는 두 가지 이상의 플라즈몬 구조체 커플링 구조를 구현하기 위하여, 제2 나노 입자(200) 및 제1 나노 입자(100)의 표면에 표면처리를 수행한다. 도 5(a) 및 도 5(b)에 따르면 제2 나노입자(200), 즉 금 나노입자(나노큐브) 혹은 제1 나노입자(100), 즉 LSPR 구조 표면에 MUA(11-mercaptoundecanoic acid) 처리를 수행한 후, EDC/NHSS cross-linking 화학을 통하여 아마이드(amide) 결합을 형성시켜 항체(110, 210)를 고정시키는 일 예시가 개시된다. 이 때 항체(110, 210)는 화합물일 수 있다. 즉 본 발명에 따르면 제1 나노 입자(100)와, 제2 나노 입자(200)에 표면처리를 수행하고, 화학결합을 통해 타겟 물질(T)과 결합할 수 있는 화합물(110, 210)을 본딩할 수 있다. 그 후, 도 5(c)를 참조하면 타겟 물질(T)을 삽입하는 것을 통해 나노구조체 샌드위치 구조를 형성함으로써, 타겟 물질(T)을 센싱할 수 있다. 일 예시에 따르면 타겟 물질(T)은 단백질, 사이토카인일 수 있다.

본 발명의 청구항에서는 화합물(110, 210)과 타겟 물질(T)이 결합하는 것으로 작성하였으나, 본 발명의 발명의 설명에서는 항원과 항체로 설명될 수 있다. 그러나 본 발명은 항원 항체 간 결합에 한정되지 아니하고, 결합의 힘은 DNA 간 결합, DNA와 RNA의 결합, 리간드와 수용체의 결합과 같이 다양한 바이오 친화도 (affinity) 결합을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명에서는 플라즈모닉 현상을 띄는 칩에 콜로이드 기반의 나노입자를 도입함으로써 항원을 매개로 하는 두 가지 이상의 플라즈몬 나노구조체로부터 플라즈몬 커플링 현상을 유도하여 신호를 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 일 예시에 따르면, 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 콜로이드 기반의 나노입자에 EDC/NHSS cross-linking 화학과 같은 방법으로 고정할 수 있다.

일 예시에 따르면 검체 시료는 상황에 따라 원심 분리, 필터링 및 희석과 같은 방법으로 전처리 후 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 반복되는 패턴의 나노 구조체에 도포한 금속 표면 위에 특정 질병의 바이오 마커를 특이적으로 검출할 수 있는 면역진단법(immunoassay)을 적용하여 변화된 플라즈몬 신호를 얻을 수 있다.

본 발명에 따르면 항체를 나노패턴 및 나노입자에 아마이드 결합을 통해 연결하고, 검출하고자 하는 바이오마커와 특이적 결합을 하는 샌드위치 구조를 형성시킬 수 있다.

기존의 경우, 플라즈몬 구조체를 하나만 사용하여 검출 민감도 (sensitivity)에 한계가 있으나, 본 발명과 같은 경우 플라즈몬 구조체를 두 가지 이상 사용하여 커플링 시킴으로써 검출 민감도의 한계를 극복할 수 있는 효과가 있다. 본 발명에 따른 진단 키트는 단백질, 사이토카인, 핵산, 세포, 환경오염물질, 약물, 세균, 바이러스, 대장균, 미생물과 같은 생체물질 검출에 활용될 수 있다.

도 6은 표면이 항체로 바이오기능화 된 나노입자를 유도 결합 플라즈마(Inductively coupled plasma, ICP)로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명에 따르면, 나노입자에 항체를 EDC/NHSS 화학으로 결합한 후, 입자의 표면에 존재하는 원소를 분석함으로써, 결합 여부를 확인할 수 있다. 도 6(c)에 따르면, 표면처리를 수행하지 않은 경우에 비해, 표면처리를 수행한 결과 강도가 높게 나타나게 되는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

도 7은 제1 기판(10)에 제1 나노 입자(100)가 프린팅 된 상황에서 화합물의 결합 여부에 따라 각각 광전자 분광법으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

보다 상세하게는, 표면이 항체로 바이오 기능화 된 나노 패턴을 X선 광전자 분광법(XPS)으로 분석한 결과이다. 본 발명에 따르면, 나노패턴에 항체를 EDC/NHSS 화학으로 결합한 후, 입자의 표면에 존재하는 원소를 분석함으로써, 결합 여부를 확인할 수 있는 효과가 있다. 도 7을 참조하면, 화합물이 결합된 제1 나노 입자(100)의 경우 결합 에너지가 확연히 높아지는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

도 8은 제2 나노입자 및 제1 나노 입자(100)로 형성한 나노패턴에 항체를 고정시킨 후 흡광 기반의 분광분석기로 확인한 결과이다. 나노입자 및 나노패턴에 항체를 결합한 후, ICP나 XPS 뿐만 아니라, 흡광 기반의 분광분석기를 이용하여 플라즈몬 현상의 변화를 측정함으로써 제2 나노입자 및 제1 나노입자에 항체 결합 여부를 판단할 수 있다. 나노입자 혹은 나노패턴의 표면에 항체의 결합이 일어날 경우, 표면 플라즈마 현상에 의해서 흡광 피크(extinction peak)의 이동 (shift) 이 일어난다. 도 8(B)의 검은색 점선 및 빨간색 실선은 항체를 고정하기 전의 제2 나노 입자 및 항체를 고정한 후의 제2 나노 입자를 분광분석기를 통해 관찰한 결과이다. 가장 높은 피크(peak) 값이 534 nm에서 537 nm로 이동함을 확인함으로써 항체가 결합되었음을 알 수 있다. 도 8(D)의 검은색 점선 및 빨간색 실선은 항체를 고정하기 전의 제1 나노 입자 및 항체를 고정한 후의 제1 나노 입자를 분광분석기를 통해 관찰한 결과이다. 가장 높은 피크(peak)값이 744 nm에서 749 nm로 이동함을 확인함으로써 항체가 결합되었음을 알 수 있다.

도 9는 본 발명의 일 예시에 따른 진단 키트의 제조 방법 및 진단 방법을 설명하기 위한 도면이다.

도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 진단 키트의 제조 방법이 개시된다. 도 9 (a)에 따르면, 플레이트가 개시된다. 일 예시에 따르면 플레이트는 마이크로 플레이트일 수 있다. 일 예시에 따르면 플레이트는 6/12/24/96/384 마이크로웰 (microwell) 구조일 수 있다. 일 예시에 따르면 플레이트 내에는 제1 나노 입자(100)가 나노프린팅 된 제1 기판(10)이 배치될 수 있다. 도 9(c)를 참조하면, 항체(110)를 제1 나노 입자(100)에 코팅할 수 있다. 그 후, 타겟 물질(T)을 주입할 수 있다. 일 예시에 따르면 타겟 물질(T)은 단백질일 수 있다. 그 후, 항체(210)가 코팅된 금속 나노입자, 즉 제2 나노입자(200)를 주입할 수 있다. 그 후, 흡광도 측정을 통한 흡광 피크 (extinction peak)의 파장 변화를 관찰할 수 있다. 본 발명에 따르면, 나노줄무늬와 나노입자의 커플링 현상으로 발생하는 흡광 피크의 이동 (shift)을 바탕으로 바이오마커의 농도를 알아낼 수 있다.

도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 진단 키트를 통해 플라즈몬 센서를 제조할 수 있고, 본 발명에 따른 플라즈몬 센서는 유연하고 투명한 특성이 있기 때문에 마이크로웰 (microwell) (6/12/24/96/384) 플레이트에 장착하여 마이크로 플레이트 리더기로 분석할 수 있는 효과도 존재한다. 본 발명에 따른 플라즈몬 센서는 96 웰 플레이트(well plate)에 적용하여 마이크로플레이트 리더기와 같은 벤치 탑(bench top) 장비에서 분석될 수 있다. 그러나 이는 이와 같은 실시예에 한정되지 아니하고 다양한 플레이트에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 예시에 따른 나노줄무늬 기반 플라즈몬 물질 플랫폼과 나노입자 기반 시료검사 시약들을 바탕으로 질병진단용 단백질 검출 키트를 구성할 수 있다. 일 예시에 따르면 단백질 검출 키트에는, 항체가 코팅된 LSPR 나노구조체(화합물이 본딩되며, 제1 나노입자가 코팅된 제1 기판), 마이크로 플레이트, 항체가 코팅된 금 나노입자 시약(화합물이 본딩된 제2 나노입자), 표준시약(Standard solution), 세척용액(Washing Buffer)을 포함할 수 있다.

도 10은 일 예시에 따른 타겟 물질(T)을 검출하는 것을 설명하기 위한 도면이다. 도 10은, 나노입자-나노패턴 커플링 기반의 플라즈몬 센서에서 인터루킨-10 검출 성능을 흡광 기반의 분광분석기로 확인한 결과에 해당한다. 도 10은 나노입자-나노패턴 커플링에 의해서 발생하는 흡광 피크(extinction peak)의 이동을 바탕으로 타겟 물질(T)의 농도를 측정한 결과를 보여준다. 도 10(a) 내지 도 10(d)는 타겟 물질(T)의 농도를 200 나노몰(nanomole)에서 20, 2, 그리고 0.2 나노몰로 변화함에 따라 나타나는 흡광 피크의 이동을 나타낸 그래프이다. 검은색 실선은 항체가 고정된 제1 나노입자를, 빨간색 실선은 항체가 고정된 나노입자를 이용하여 항체-인터루킨 10-항체의 샌드위치 구조체의 형성을 분광분석기로 관찰한 결과이다. 각 농도에서 흡광 피크가 18/12/9/6 nm 로 이동한 것을 확인하였다.

도 10(e)는 농도변화에 따른 흡광피크의 이동값을 정리한 그래프이다. 도 10(f)는 200 나노몰의 인터루킨-10에 대해서 도 10(a)의 그래프를 얻고 난 후, 샌드위치 구조체가 형성된 나노패턴-나노입자 커플링 기반 플라즈몬 센서를 주사전자현미경을 이용해 관찰한 결과이다.

이와 같이 나노입자-나노패턴 플라즈몬 커플링을 통한 흡광 피크의 이동을 확인함으로써 나노몰 (nanomole) 수준의 타겟물질(T)을 검출할 수 있음을 보여줄 수 있다.

일 예시에 따르면, IL-10 단백질의 경우, 나노몰 수준에서 검출 가능한 효과가 있다. 또한, 플라즈몬 센서에 면역진단법을 적용한 칩을 주사전자현미경을 통해 관찰할 수 있다.

도 11은 본 발명의 일 예시에 따른 진단 키트에서의 컨트롤 신호를 비교하는 표를 나타낸다.

보다 상세하게는, 도 11은 나노입자-나노패턴 커플링 기반의 플라즈몬 센서에서 포지티브 컨트롤 신호와 네거티브 컨트롤(NC) 신호를 비교한 결과를 나타낸다. 도 11에 따르면, NC1 및 NC2는 인터루킨-10 대신에 인터루킨-2 및 소혈청알부민 (Bovine Serum Albumin, BSA)을 이용하여 비특이적 결합으로 인한 신호 크기를 측정한 경우이며, NC3는 나노입자를 사용하지 않은 경우이며, NC4는 인터루킨-10을 타겟으로 하는 항체 대신에 인터루킨-6와 특이적으로 결합하는 항체를 나노입자에 고정시킨 경우이다. 이러한 네거티브 컨트롤 (NC)의 경우, 흡광피크의 이동을 거의 관찰할 수 없음을 확인하였다. 이에 비해서, 포지티브 컨트롤의 경우, 흡광피크의 이동을 관찰할 수 있었으며, 이는 타겟물질 (T)에 의한 신호임을 확인할 수 있다. 이를 통해 나노입자-나노패턴 커플링 기반의 플라즈몬 센서의 성능을 확인할 수 있다.

이상의 실시 예들은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것으로, 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 이로부터 다양한 변형 가능한 실시 예들도 본 발명의 범위에 속하는 것임을 이해하여야 한다. 본 발명의 기술적 보호범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이며, 본 발명의 기술적 보호범위는 특허청구범위의 문언적 기재 그 자체로 한정되는 것이 아니라 실질적으로는 기술적 가치가 균등한 범주의 발명까지 미치는 것임을 이해하여야 한다.

10: 제1 기판
100: 제1 나노 입자
110: 화합물
200: 제2 나노 입자
210: 화합물
T: 타겟 물질

Claims (17)

1. 플라즈몬 현상을 이용한 진단 키트로서, 상기 진단 키트는:
   나노패턴이 형성된 기판;
   상기 나노패턴이 형성된 기판 상에 형성된 제1 금속 나노패턴; 및
   제2 금속 나노입자; 를 포함하고,
   상기 제1 금속 나노패턴 및 상기 제2 금속 나노입자 각각에 진단 대상 물질과 결합할 수 있는 화합물이 결합되어 있고,
   상기 기판의 나노패턴은 연성 기판에 형성된 레진 나노패턴을 포함하는,
   진단 키트.
2. 제1항에 있어서,
   상기 기판의 나노패턴은 양 측면 및 상면을 포함하고, 상기 제1 금속 나노패턴은 상기 기판의 나노패턴의 양 측면 중 어느 한 측면에 형성되는,
   진단 키트.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 기판의 나노패턴은 나노 줄무늬 패턴이고, 상기 제1 금속 나노패턴은 상기 기판의 상기 나노 줄무늬 패턴의 양 측면 중 어느 한 측면 상에, 상기 나노 줄무늬 패턴의 상면 상에 그리고 상기 나노 줄무늬 패턴 사이의 기판 표면 상에 형성되는,
   진단 키트.
4. 제3항에 있어서,
   상기 제1 금속 나노패턴은 상기 기판의 상기 나노 줄무늬 패턴의 한 측면 및 상면 그리고 기판 표면 상에 나노 줄무늬, 나노 도트, 또는 나노 스퀘어 구조로 형성되는,
   진단 키트.
5. 삭제
6. 진단 키트를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
   나노패턴이 형성된 기판을 준비하는 단계;
   상기 나노패턴이 형성된 기판 상에 제1 금속 나노패턴을 형성하는 단계;
   제2 금속 나노입자를 형성하는 단계;를 포함하며,
   상기 나노패턴이 형성된 기판 상에 제1 금속 나노패턴을 형성하는 단계는:
   상기 나노패턴이 형성된 상기 기판을 기울인 상태에서 상기 제1 금속 나노패턴용 제1 금속을 증착함을 포함하는,
   진단 키트 제조 방법.
7. 삭제
8. 제6항에 있어서,
   상기 나노패턴이 형성된 기판 상에 제1 금속 나노패턴을 형성하는 단계는:
   상기 기판의 상기 나노패턴의 양 측면 중 어느 한 측면 및 상면 상에 그리고 상기 기판의 나노패턴 사이의 기판 표면 상에 제1 금속 나노패턴을 형성함을 포함하는,
   진단 키트 제조 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 나노패턴이 형성된 상기 기판을 기울인 상태에서 상기 제1 금속 나노패턴용 제1 금속을 증착함은:
   상기 나노패턴이 형성된 상기 기판을 그 중심축에 대해서 10도 내지 25도 기울어진 상태에서 상기 제1 금속 나노패턴용 제1 금속을 증착함을 포함하는,
   진단 키트 제조 방법.
10. 제8항에 있어서,
    나노패턴이 형성된 기판을 준비하는 단계는:
    상기 기판 상에 레진을 형성하고;
    상기 레진에 나노임프린트 기술을 적용하여 양 측면 및 상면을 갖는 레진 나노패턴을 형성함을 포함하는,
    진단 키트 제조 방법.
11. 삭제
12. 제1항의 진단 키트를 이용한 진단 방법으로서,
    상기 진단 방법은:
    (a) 상기 나노패턴상에 형성된 제1 금속 나노패턴을 갖는 기판을 타겟 물질과 반응시키는 단계;
    (b) 상기 제2 금속 나노입자를 상기 (a) 단계의 반응 결과물과 반응시키는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 반응 결과물의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는,
    진단 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 마이크로웰에 상기 나노패턴상에 형성된 제1 금속 나노패턴을 갖는 기판과 상기 타겟 물질을 주입함을 포함하고,
    상기 단계 (b)는 상기 나노패턴상에 형성된 제1 금속 나노패턴을 갖는 기판과 상기 타겟 물질을 주입된 상기 마이크로웰에 상기 제2 금속 나노입자를 주입함을 포함하는,
    진단 방법.
14. 플라즈몬 현상을 이용한 진단용 센서로서, 상기 센서는:
    기판 상에 형성되고 각각이 양측면 및 상면을 가지며 서로 이격된 나노패턴들;
    상기 나노패턴들이 형성된 상기 기판 상에 형성되고, 플라즈몬 현상을 일으킬 수 있는 금속 나노패턴들; 그리고,
    상기 금속 나노패턴들 각각에 결합하여 타겟 물질에 결합할 수 있는 화합물을 포함하며,
    상기 기판의 나노패턴은 연성 기판에 형성된 레진 나노패턴을 포함하는,
    센서.
15. 제14항에 있어서,
    상기 금속 나노패턴은 상기 기판의 나노패턴들 각각의 양측면 중 어느 한 측면 및 상면 상에 그리고 상기 기판의 나노패턴들 사이의 기판 표면 상에 형성되는,
    센서.
    
    
16. 삭제
17. 삭제

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