KR20200005742A - 혈관 모델 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 각각의 채널 부재가 각각의 마이크로채널이 형성되는 대향면을 포함하는, 서로 상호 대향하는 한 쌍의 채널 부재; 및 두께 방향으로 관통하는 복수의 관통홀을 포함하고, 한 쌍의 채널 부재의 대향면 사이에 배치되고 마이크로채널 사이를 구획하는 다공성 막을 포함하고, 다공성 막에는 혈관내피세포층이 제공되어 마이크로채널 중 하나에 대향하는 일면을 덮고, 관통홀의 평균 개구 직경은 1 μm 내지 20 μm이고, 관통 홀의 개구 커버리지 비율은 30% 내지 70%인 혈관 모델을 제공한다.

Description

혈관 모델
본 개시는 혈관 모델에 관한 것이다.
최근에, 마이크로미터 단위의 폭을 갖는 채널인 마이크로채널이라고 불리는 것을 포함하는 장치를 사용하여 혈관, 내장, 간 및 폐와 같은 내부 장기를 모델링하려는 시도가 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공개공보 (US) 제2011/0053207호, 일본 특허출원 공고공보 (JP-B) 제5415538호, 및 JP-B 제5815643호 각각에는 표면에 세포층이 제공된 다공성 막, 및 다공성 막에 의하여 구획된 적어도 두 마이크로채널을 포함하는 내부 장기 모델이 개시되어 있다.
US 제2011/0053207호, JP-B 제5415538호, 및 JP-B 제5815643호에 개시된 것과 같은 내부 장기 모델을 사용하여 다양한 실험 및 시험이 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로채널 중 하나를 통해 약물을 함유하는 혈액을 주행시킨 후, 다공성 막을 통해 하나의 마이크로채널에서 또 다른 마이크로채널로 이동한 적혈구, 바이오 마커 등의 수 또는 양을 측정함으로써 일출 시험 (extravasation test)이라고 불리는 것이 수행될 수 있다. 이 일출 시험은 다공성 막의 표면에 제공된 세포층에 대한 약물성 손상 수준의 평가를 가능하게 하여 약물 독성 시험을 수행할 수 있게 한다.
그러나, 종래의 내부 장기 모델에 사용된 다공성 막의 세공은 트랙 에칭 공정으로 알려진 것을 사용하여 생성되는데, 여기서, 예를 들어, 다공성 막을 구성하는 물질에 중이온이 조사된다. 따라서, 막의 세공의 개구 커버리지 비율은 예를 들면 2% 내지 20%로 낮고, 막이 또한 두껍기 때문에 적혈구 등의 통과는 다공성 막에 의해 방해된다. 즉, 종래의 내부 장기 모델에서는, 다공성 막의 표면에 제공된 세포층에 대한 약물성 손상 수준이 정확하게 평가되지 않을 수 있는 경우가 있었다.
본 개시는 일출 시험 동안 적혈구 등의 이동이 다공성 막에 의해 방해되는 것을 억제하게 해 줄 수 있는 혈관 모델을 제공한다.
본 개시의 제1 양태에 따른 혈관 모델은 각각의 채널 부재가 각각의 마이크로채널이 형성되는 대향면을 포함하는, 서로 상호 대향하는 한 쌍의 채널 부재; 및 두께 방향으로 관통하는 복수의 관통홀을 포함하고, 한 쌍의 채널 부재의 대향면 사이에 배치되고 마이크로채널 사이를 구획하는 다공성 막을 포함하고, 여기에서 다공성 막에는 혈관내피세포층이 제공되어 마이크로채널 중 하나에 대향하는 일면을 덮고, 관통홀의 평균 개구 직경은 1μm 내지 20μm이고, 관통 홀의 개구 커버리지 비율은 30% 내지 70%이다.
상기 구성에 있어서, 마이크로채널 사이를 구획하는 다공성 막의 관통홀의 평균 개구 직경은 1μm 내지 20μm이고, 관통홀의 개구 커버리지 비율은 30% 내지 70%이다. 따라서, 일출 시험 중에, 적혈구 등이 다공성 막의 관통홀을 통해 유동하여 마이크로채널 중 하나에서 마이크로채널 중 다른 하나로 이동할 때, 적혈구 등의 이동이 다공성 막에 의해 방해되는 것이 억제될 수 있다.
본 개시의 제2 양태에 있어서, 제1 양태에서, 다공성 막의 막 두께는 관통홀의 평균 개구 직경의 절반 이하일 수 있다.
상기 제2 양태에 있어서, 다공성 막의 막 두께는 관통홀의 평균 개구 직경의 절반 이하이므로, 다공성 막의 막 두께가 관통홀의 개구의 평균 개구 직경의 절반보다 큰 경우에 비하여, 적혈구 등이 다공성 막의 관통홀을 좀더 수월하게 통과할 수 있다. 따라서, 제2 양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
본 개시의 제3 양태에 있어서, 제1 또는 제2 양태에서, 관통홀을 서로 연통시키는 연통홀이 다공성 막의 내측에 형성될 수 있으며; 관통홀은 허니콤 패턴으로 배열될 수 있으며; 관통홀의 개구 직경의 변동 계수는 10% 이하일 수 있고; 다공성 막의 다공율은 50% 이상일 수 있다.
상기 제3 양태에 있어서, 관통홀은 허니콤 패턴으로 배열되고, 연통홀을 통하여 서로 연통된다. 관통홀의 개구의 개구 직경의 변동 계수는 10% 이하이고, 다공성 막의 다공율은 50% 이상이다. 이에 의해, 제 3 양태에서는 적혈구 등을 보다 균일하게 통과하게 할 수 있다. 따라서, 제 3 양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
본 개시의 제4 양태에 있어서, 제1 내지 제3 양태에서, 세포들의 세포층은 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있고, 다른 하나의 마이크로채널에 대향하는 다공성 막의 타면에 제공될 수 있다.
상기 제4 양태에 있어서, 혈관내피세포층이 형성되는 면과 반대측의 다공성 막의 타면에 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹으로부터의 세포들의 세포층을 형성하는 것에 기인하여, 실제 혈관과 더 유사한 혈관 모델이 달성될 수 있다.
본 개시의 제5 양태에 있어서, 제1 양태 내지 제4 양태에서, 다공성 막의 파단 인장 신율은 50% 이상일 수 있고; 다공성 막의 10% 신장에 필요한 응력은 1000gf/mm2 이하일 수 있다.
상기 제5 양태에 있어서, 다공성 막은 파단 인장 신율이 50% 이상이고 10% 신장에 필요한 응력이 1000gf/mm2 이하인 가요성 재료로 형성되므로, 실제 혈관과 더 유사한 혈관 모델이 달성될 수 있다.
본 개시의 제6 양태에 있어서, 제1 양태 내지 제5 양태에서, 관통홀은 평면에서 볼 때 편평한 형상을 가질 수 있으며, 장축 및 단축을 포함할 수 있다.
상기 제6 양태에 있어서, 관통홀은 평면에서 볼 때 타원형과 같은 편평한 모양을 가지므로, 적혈구 등은 관통홀을 좀더 수월하게 통과할 수 있다. 따라서, 제6 양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
본 개시의 제7 양태에 있어서, 제1 양태 내지 제6 양태에서, 다공성 막은 관통홀이 형성되는 다공성 영역 및 관통홀이 형성되지 않는 비-다공성 영역을 포함할 수 있다.
상기 제7 양태에 있어서, 예를 들면, 마이크로채널의 입구 부근 및 출구 부근에 배치된 다공성 막의 일부는 관통홀이 형성되지 않은 비-다공성 영역으로서 구성되므로, 마이크로채널 내부의 적혈구 등의 유동이 조절될 수 있다. 따라서, 제7 양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
상기 양태에 따르면, 본 개시는 일출 시험 동안의 적혈구 등의 이동이 다공성 막에 의해 방해되는 것을 억제하게 해 줄 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태를 하기 도면에 기초하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 예시적인 실시양태의 혈관 모델의 전체 구성을 나타내는 사시도이다.
도 2는 예시적인 실시양태의 혈관 모델의 전체 구성을 나타내는 분해 사시도이다.
도 3은 예시적인 실시양태의 혈관 모델의 다공성 막을 나타내는 확대 단면도이다.
도 4는 예시적인 실시양태의 혈관 모델의 다공성 막을 나타내는 평면도이다.
도 5는 변형예의 혈관 모델의 다공성 막을 나타내는 평면도이다.
도 6은 변형예의 혈관 모델의 다공성 막을 나타내는 평면도이다.
도 7a는 실시예 1의 다공성 막의 현미경사진이다.
도 7b는 비교예 1의 다공성 막의 현미경사진이다.
도 8a는 실시예 3의 세포층 부착 혈관 모델의 마이크로채널에서 이미지 형광의 결과이다.
도 8b는 비교예 3의 세포층 부착 혈관 모델의 마이크로채널에서 이미지 형광의 결과이다.
도 9a는 실시예 3의 세포층 부착 혈관 모델에서 FITC-덱스트란 투과성 시험의 결과이다.
도 9b는 비교예 3의 세포층 부착 혈관 모델에서 FITC-덱스트란 투과성 시험의 결과이다.
도 10a는 실시예 4의 다공성 막의 현미경사진이다.
도 10b는 도 10a의 부분 확대도이다.
도 11은 실시예 5의 다공성 막의 현미경사진이다.
도 1 내지 도 6을 참조하여 본 개시의 예시적인 실시양태의 실시예 및 변형례에 관한 설명이 이어진다. 다음의 예시적인 실시양태는 단지 본 개시의 일례일 뿐이며, 본 개시의 범위를 제한하지 않는다. 또한, 도면에서의 다양한 구성의 치수는 다양한 구성의 설명을 용이하게 하기 위해 적절하게 수정된다. 따라서, 도면의 스케일은 실제의 스케일과 다를 수 있다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 예시적인 실시양태의 혈관 모델(10)은 서로 적층된 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)를 포함한다. 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)는 예를 들면, 폴리디메틸실록산 (PDMS)과 같은 탄성 물질로 구성되고, 실질적인 직사각형 판 형상을 갖는다.
PDMS 외에, 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)를 구성하는 재료의 다른 예는 사이클릭 올레핀 중합체 (COP), 에폭시 수지, 우레탄 수지, 스티렌계 열가소성 엘라스토머, 올레핀계 열가소성 엘라스토머, 아크릴계 열가소성 엘라스토머, 폴리비닐 알코올 등을 포함한다.
상부 마이크로채널(16)을 규정하는 오목부(18)는 상부 채널 부재(12)의 하면, 즉, 하부 채널 부재(14)에 대향하는 대향면(12A)에 형성된다. 오목부(18)는 입구(18A), 출구(18B), 및 입구(18A)와 출구(18B)를 연통시키는 채널부(18C)를 포함한다.
관통홀(20A, 20B)은 상부 채널 부재(12)에 형성되고, 상부 채널 부재(12)를 두께 방향으로 관통하며, 입구(18A) 및 출구(18B)와 각각 연통하는 하단부를 갖는다. 관통홀(20A, 20B)의 상단부는 상부 채널 부재(12)의 상면에서 개방된다. 관통홀(20A, 20B)의 상단부에는 액체 공급 튜브 (비도시)가 접속된다.
마찬가지로, 하부 마이크로채널(22)을 규정하는 오목부(24)는 하부 채널 부재(14)의 상면, 즉, 상부 채널 부재(12)에 대향하는 대향면(14A)에 형성된다. 오목부(24)는 입구(24A), 출구(24B), 및 입구(24A)와 출구(24B)를 연통시키는 채널부(24C)를 포함한다.
하부 채널 부재(14)의 입구(24A)와 출구(24B) 및 상부 채널 부재(12)의 입구(18A)와 출구(18B)는 평면에서 볼 때 겹치지 않는 위치에 제공된다. 그에 반하여, 하부 채널 부재(14)의 채널부(24C) 및 상부 채널 부재(12)의 채널부(18C)는 평면에서 볼 때 겹치는 위치에 제공된다.
관통홀(26A, 26B)이 또한 상부 채널 부재(12)에 형성되고, 상부 채널 부재(12)를 두께 방향으로 관통하며, 입구(24A) 및 출구(24B)와 각각 연통되는 하단부를 갖는다. 관통홀(26A, 26B)의 상단부는 상부 채널 부재 (12)의 상면에서 개방된다. 관통홀(26A, 26B)의 상단부에는 액체 공급 튜브 (비도시)가 접속된다.
다공성 막(28)은 상부 채널 부재(12)와 하부 채널 부재(14)의 대향면(12A, 14A) 사이에 제공된다. 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)는 그 사이에 개재된 상태에서 다공성 막 (28)과 함께 접합된다. 또한, 상부 채널 부재 (12)와 하부 채널 부재 (14)를 함께 접합하는 방법으로는, 접착제를 사용하여 함께 접합하는 것 외에, 용착, 인력 (자기 부착) 또는 볼트로의 접합 등의 다양한 방법을 채용할 수 있다.
다공성 막(28)은 예를 들면, 소수성 유기 용매에 용해되는 소수성 중합체이다. 소수성 유기 용매는 25°C의 물에서 10 이하 (g/100g 물)의 용해도를 갖는 액체이다.
소수성 중합체의 예는 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리에스테르 (예를 들면, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 및 폴리-3-히드록시부티레이트), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리헥사플루오로프로펜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐카바졸, 폴리비닐 아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리우레아, 다환 방향족 화합물, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리실록산 유도체, 및 셀룰로스 아실레이트 (예를 들면, 트리아세틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프로피오네이트, 및 셀룰로스 아세테이트 부티레이트)와 같은 중합체를 포함한다. 예를 들면 JP-B 제4,734,157호에 개시된 제조방법을 이용하여 허니콤 멤브레인을 제조하는 관점에서, 소수성 유기용매에 용해되는 중합체가 바람직하다.
예를 들면, 용매에 대한 용해도, 광학 특성, 전기적 특성, 막 강도, 및 탄성의 관점에서, 이들 중합체는 필요에 따라 단독중합체, 공중합체, 중합체 블렌드 또는 중합체 알로이의 형태를 취할 수 있다. 이들 중합체는 단독으로 또는 둘 이상 조합하여 사용될 수 있다. 다공성 막(28)의 재료는 소수성 중합체로 제한되지 않으며, 세포의 접착성과 같은 관점에서 다양한 재료가 선택될 수 있다.
다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B) (이하, 상면(28A) 및 하면(28B)은 총칭하여"주면"으로 호칭될 수 있다)은 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)의 채널부(18C, 24C)를 실질적으로 덮도록 크기가 정해져서, 상부 마이크로채널(16)이 하부 마이크로채널(22)로부터 구획된다.
구체적으로, 다공성 막(28)의 상면(28A), 즉, 상부 채널 부재(12)에 대향하는 주면은 상부 채널 부재(12)의 오목부(18)와 함께 상부 마이크로채널(16)을 규정한다. 다공성 막(28)의 하면(28B), 즉, 하부 채널 부재(14)에 대향하는 주면은 하부 채널 부재(14)의 오목부(24)와 함께 하부 마이크로채널(22)을 규정한다.
도 3에 도시된 바와 같이, 예를 들면 혈관내피세포층(36)이 다공성 막 (28)의 상면(28A)에 제공되어 상면(28A)을 완전히 덮는다. 그리하여 상부 마이크로채널(16)의 내부는 혈관의 내부와 매우 유사한 환경을 구성한다. 혈관내피세포의 예는 제대 정맥, 제대 동맥, 대동맥, 관상 동맥, 폐 동맥, 폐 미세혈관, 또는 진피 미세혈관으로부터 기원하는 혈관내피세포; 및 만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포를 포함한다.
예를 들면, 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포로부터 구성된 세포층(38)이 다공성 막(28)의 하면(28B)에 제공되어 하면(28B)을 완전히 덮는다. 그리하여 하부 마이크로채널(22)은 혈관 외부와 매우 유사한 환경을 구성한다. 간엽줄기세포 (MSC)는 근육세포, 지방세포, 연골세포 등으로 분열할 수 있는 체세포 줄기세포이다.
다공성 막(28)의 상면(28A)에는 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포의 세포층(38)이 제공될 수 있고, 다공성 막(28)의 하면(28B)에는 혈관내피세포층(36)이 제공될 수 있다. 더욱이, 다공성 막(28)의 주면 중 적어도 하나에 혈관내피세포층(36)이 제공되는 것으로 충분하다. 다공성 막(28)의 다른 하나의 주면에는 세포층(38)이 제공되지 않도록 구성될 수도 있다.
세포의 접착성의 관점에서, 다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B) 중 적어도 하나에 세포가 파종되는 영역은 피브로넥틴, 콜라겐 (예를 들면, 타입 I 콜라겐, 타입 IV 콜라겐 또는 타입 V 콜라겐), 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 펠리칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나에 의하여 피복되는 것이 바람직하다. 또한, 다공성 막(28) 및 후술하는 관통홀(30)의 내부는 이들 중 적어도 하나에 의해 코팅되어 있는 것이 바람직하다.
혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)을 다공성 막(28)의 각각의 주면에 제공하기 위해서, 예를 들면, 세포 현탁액을 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)에 부어 다공성 막(28)의 주면에 세포를 파종하는 방법이 채용될 수 있다. 추가로, 별도의 배양장치 내에서 다공성 막(28)의 주면에 세포를 파종하여 배양한 다음, 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)이 형성되어 있는 다공성 막(28)을 혈관 모델(10)에 장착하는 방법도 채용될 수 있다.
도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 다공성 막(28)을 두께 방향으로 관통하는 복수의 관통홀(30)이 다공성 막(28)에 형성된다. 관통홀(30)의 개구(30A)가 다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B) 각각에 제공된다. 도 4에 도시된 바와 같이, 개구(30A)는 평면에서 볼 때 원형이다. 개구(30A)는 서로 분리되어 제공된다. 편평부(32)는 인접한 개구(30A) 사이에서 연장한다. 개구(30A)는 원형으로 제한되지 않으며, 다각형으로 구성될 수도 있다.
복수의 개구(30A)는 규칙적인 방식으로 배열되고, 본 예시적인 실시양태에서는, 도 4에 도시된 바와 같이, 예를 들면, 허니콤 패턴으로 배열된다. 허니콤 패턴 배열은, 개구(30A)의 중심이 평행 육각형의 단위 (정육각형이 바람직하다) 또는 이에 가까운 형상에 대한, 꼭지점의 위치와 대각선이 교차하는 지점에 배치되는 배열이다. 여기에서, "개구의 중심"이란 평면에서 볼 때 개구(30A)의 중심을 의미한다.
개구(30A)의 배열은 허니콤 패턴으로 제한되지 않는다. 개구(30A)는 또한 격자 패턴 또는 면심 격자 패턴으로 구성될 수 있다. 격자 패턴 배열은 개구의 중심이 평행 사변형 (정사각형, 직사각형, 마름모꼴이 포함된다는 것은 말할 나위도 없으며, 정사각형이 바람직하다) 또는 이에 가까운 형상의 단위에 대한 꼭지점의 위치에 배치되는 배열이다. 면심 격자 패턴 배열은 개구의 중심이 평행 사변형 (정사각형, 직사각형, 마름모꼴이 포함된다는 것은 말할 나위도 없으며, 정사각형이 바람직하다) 또는 이에 가까운 형상의 단위에 대한 꼭지점의 위치 및 대각선이 교차하는 지점에 배치되는 배열이다.
개구(30A)의 배열은 임의적일 수 있다. 그러나, 다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B)에서의 개구(30A)의 균일한 밀도를 달성하는 관점에서 복수의 개구(30A)는 규칙적인 방식으로 배열되는 것이 바람직하다. 규칙적인 배열은 상기 배열의 평행 육각형 또는 평행 사변형 단위의 표면적의 변동 계수가 예를 들어 10% 이하인 배열이다. 개구(30A) 중 일부는 누락될 수 있거나 개구(30A)는 정렬되어 있지 않을 수 있다. 그러나, 개구(30A)는 그들 사이에 갭 없이 모든 방향으로 연속적으로 배열되는 것이 바람직하다. "변동 계수"는 주어진 모집단의 표준편차를 그 평균으로 나눔으로써 도달한 값이고, 모집단의 분산 정도를 백분율로 나타내는 지수이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 다공성 막 (28)의 각 관통홀(30)은 구의 세그먼트 형상을 가지며, 이는 구의 상단 및 하단이 절단된 형상이다. 서로 인접하는 관통홀(30)은 다공성 막(28) 내부의 각 연통홀(34)을 통해 서로 연통되어 있다.
각 관통홀(30)은 모든 인접 관통홀(30)과 연통하는 것이 바람직하다. 복수의 관통홀(30)의 개구(30A)가 본 예시적인 실시양태에서와 같이 허니콤 패턴으로 배열되는 경우, 각각의 관통홀(30)은 6개의 연통홀(34)을 통해 인접한 6개의 관통홀(30)과 각각 연통된다. 관통홀(30)은 배럴 형상, 원기둥 형상, 다각기둥 형상 등을 가질 수 있으며, 연통홀(34)은 인접한 관통홀(30)을 함께 연결하는 튜브형 보이드일 수 있다.
관통홀(30)의 각각의 개구(30A)의 개구 직경 D는 예를 들면, 혈액 내의 적혈구가 통과할 수 있는 크기이다. 구체적으로, 평균 개구 직경은 바람직하게는 1 μm 내지 20 μm이고, 더 바람직하게는 3 μm 내지 10 μm이다. 평균 개구 직경을 1 μm 이상으로 설정하는 것은 관통홀(30)로 하여금 적혈구가 그를 통과하도록 허용하는 사이즈가 되게 해주고, 평균 개구 직경을 20 μm 이하로 설정하는 것은 다공성 막(28)의 주면에 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)의 보유를 가능케 해준다.
여기에서, "개구 직경 D"는 개구(30A)의 장축이고, "평균 개구 직경"은 10개 이상의 임의로 선택된 개구(30A)에 대해 측정된 개구 직경 D의 계산된 평균이다. "장축"은 개구의 윤곽에서 임의로 선택된 두 지점 사이의 가장 긴 거리를 의미한다. 그러나, 방향이 특정된 경우 "장축"은 해당 방향을 따라 임의로 선택된 두 지점 사이의 가장 긴 거리를 의미한다.
관통홀(30)의 개구(30A)의 개구 커버리지 비율은 바람직하게는 30% 내지 70%, 더 바람직하게는 40% 내지 60%이다. 개구 커버리지 비율을 30% 이상으로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있게 해주고, 개구 커버리지 비율을 70% 이하로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 필요한 강도가 달성될 수 있게 해준다.
여기에서, "개구 커버리지 비율"은 백분율로 S2 대 S1의 비율을 나타내고, S1은 다공성 막(28)의 주면이 매끄럽다는 가정하에 (즉, 다공성 막(28)에 개구(30A)가 없다는 가정하에), 다공성 막(28)의 표면적의 단위를 나타내고, S2는 단위 표면적당 제공된 개구(30A)의 표면적의 합을 나타내며, 여기서 S1 및 S2에 대해 동일한 측정 단위가 사용된다.
다공성 막(28)의 막 두께 T는 바람직하게는 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경의 절반 이하이다. 구체적으로, 두께 T는 바람직하게는 0.5 μm 내지 10 μm이고, 더 바람직하게는 1 μm 내지 10 μm이다. 다공성 막(28)의 막 두께 T를 관통홀(30)의 평균 개구 직경의 절반 이하인 두께로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있게 해준다.
또한, 다공성 막(28)은 세포가 부착하여 성장하는 스캐폴드이므로, 다공성 막(28)의 일면의 세포와 다공성 막(28)의 타면의 세포 사이의 세포간 상호작용, 즉, 체액 인자를 통한 정보전송 또는 세포간 접촉 중 적어도 하나는 다공성 막(28)상의 개구 커버리지 비율이 커질수록 및 다공성 막(28)의 막 두께가 얇아질수록 더욱 활성화된다. 다공성 막(28)의 주면에 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)을 제공하기 위한 세포 배양 동안 세포간 상호 작용이 더 활발할수록, 생체내 조직의 것과 유사한 기능성을 갖는 혈관 모델이 더 잘 생성될 수 있다.
개구(30A)의 개구 직경 D의 변동 계수는 바람직하게는 10% 이하이고, 변동 계수가 작을수록 더 바람직하다. 개구 직경 D의 변동 계수가 작을수록, 보다 균일하게 적혈구 등이 다공성 막(28) 내의 복수의 관통홀(30)을 통과할 수 있다.
다공성 막(28)의 다공율은 바람직하게는 50% 이상이다. 다공율을 50% 이상으로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있게 해준다. 다공율이 너무 크면, 다공성 막(28)의 강도는 그에 요구되는 강도와 관련하여 불충분해지고, 따라서 다공율은 바람직하게는 95% 이하이다.
여기에서, "다공율"은 백분율로 V2 대 V1의 비율을 나타내고, V1은 다공성 막(28)의 주면이 매끄럽다는 가정하에 (즉, 다공성 막(28)에 개구(30A)가 없다는 가정하에), 다공성 막(28)의 부피의 단위를 나타내고, V2는 단위 부피당 제공된 관통홀(30) 및 연통홀(34)의 부피의 합을 나타내며, 여기서 V1 및 V2에 대해 동일한 측정 단위가 사용된다.
다공성 막(28)의 파단 인장 신율은 바람직하게는 50% 이상이고, 더 바람직하게는 100%이며, 보다 더 바람직하게는 200% 이상이다. 다공성 막(28)의 10% 신장에 필요한 응력은 바람직하게는 1000 gf/mm2 이하이다. 파단 인장 신율이 증가하고 10% 신장에 필요한 응력이 감소함에 따라 재료는 보다 가요성이 된다. 따라서, 다공성 막(28)을 구부리고, 신장시키고, 압축하는 것이 가능하여, 혈관 모델(10)이 실제 혈관과 더 유사하도록 해준다.
여기에서, "파단 인장 신율"은 JIS K 6251:2010에 정의된 방법에 따라 다공성 막(28)의 인장 파단 신율을 측정함으로써 평가될 수 있다. "10% 신장에 필요한 응력"은 JIS K 6251:2010에 정의된 방법에 따라 다공성 막(28)이 10% 신장될 때 다공성 막(28)에 가해지는 응력을 측정함으로써 평가될 수 있다.
관통홀(30)이 형성된 다공성 막(28)을 제조하는 방법의 예는 나노-프린팅 공정, 응축 공정, 에칭 공정, 샌드 블라스팅 공정 또는 프레스 성형 공정을 포함한다. 나노-프린팅 공정은 다공성 막(28)을 구성하는 재료를 돌출부 및 오목부를 갖는 몰드에 붓거나, 또는 이러한 몰드를 다공성 막(28)을 구성하는 재료에 대해 가압함으로써 관통홀(30)을 생성하는 방법이다. 응축 공정이란 다공성 막(28)을 구성하는 재료의 표면에 응결을 유도하여, 물방울을 몰드로 하여 관통홀(30)을 형성하는 방법이다.
타 방법과 비교하여, 응축 공정은 다공성 막(28)의 막 두께가 더 얇아질 수 있게 하고, 개구(30A)의 다공율 및 개구 커버리지 비율이 증가될 수 있게 하며, 또한 연통홀(34)이 다공성 막(28)내에 제공될 수 있게 한다. 따라서, 본 예시적인 실시양태에 있어서, 다공성 막(28)은 응축 공정을 이용하여 제조된다. 응축 공정은 예를 들면, JP-B 제4945281호, JP-B 제5422230호, JP-B 제5405374호, 및 일본 특허출원 공개공보 (JP-A) 제2011-74140호에 상세하게 기재되어 있다.
다음으로, 본 예시적인 실시양태의 혈관 모델 (10)을 사용하여 약물 독성 평가가 수행되는 경우에 대해 예로서 설명한다. 약물 독성 시험을 수행할 때, 먼저 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)는 이들 사이에 개재된 상태에서 다공성 막(28)과 함께 접합되어 도 2에 도시된 바와 같이 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)을 포함하는 혈관 모델(10)을 생성한다. 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)은 다공성 막(28)의 주면에 제공된다.
그리고, 펌프를 사용하여 약물을 함유하는 혈액 희석액을 튜브 (도면에 도시되지 않음) 및 관통홀(20A)을 통해 주행시켜 상부 마이크로채널(16) 내로 흐르게 하여, 상부 마이크로채널(16)의 내부를 통과시킨 다음, 관통홀(20B) 및 튜브 (도면에 도시되지 않음)를 통과시켜 혈관 모델(10)을 빠져나가게 한다.
한편, 펌프를 사용하여 배양액 또는 생리 식염수 용액을 튜브 (도면에 도시되지 않음) 및 관통홀(26A)을 통과하여 하부 마이크로채널(22) 내로 주행시켜, 하부 마이크로채널(22)의 내부를 통과시킨 다음, 관통홀(26B) 및 튜브 (도면에 도시되지 않음)를 통과시켜 혈관 모델(10)을 빠져나가게 한다. 혈액 희석액이 흐르는 상부 마이크로채널(16)의 압력은 배양액 또는 생리 식염수 용액이 흐르는 하부 마이크로채널(22)의 압력보다 높다.
독성 시험을 시작할 때, 도 3에 도시된 바와 같이, 다공성 막(28)의 상면(28A)의 전체 및 하면(28B)의 전체는 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)에 의해 각각 덮힌다. 따라서, 혈액 내의 적혈구는 다공성 막(28)을 통과할 수 없고 하부 마이크로채널(22) 내로 누출되지 않는다.
그러나, 독성 검사의 시작으로부터 일정 시간이 경과하면, 혈관내피세포층(36)은 약물의 독성에 의해 손상된다. 혈관내피세포층(36) 외에, 세포층(38)도 약물에 의해 손상된다. 이러한 손상된 부분으로 인해 다공성 막(28)을 통과하여 하부 마이크로채널(22)로 유입된 적혈구의 수를 측정함으로써, 즉 일출 시험을 수행함으로써, 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)에 대한 약물성 손상의 수준을 평가하는 것이 가능하다.
또한, 약물의 독성에 의해 혈관내피세포층(36)이 손상되는 경우, 혈관내피세포층(36)과 세포층(38) 사이의 세포간 상호작용으로 인해 세포층(38)을 구성하는 세포의 상태가 변하며, 결과적으로, 세포층(38)에 갭이 형성될 수 있다. 갭을 통과하여 하부 마이크로채널(22)로 유입된 적혈구의 수를 측정함으로써, 즉 일출 시험을 수행함으로써, 혈관내피세포층(36)에 대한 약물성 손상의 수준 및 세포층(38)의 반응의 수준을 평가하는 것이 가능하다.
혈관내피세포층(36)과 세포층(38) 사이의 세포간 상호작용은 다공성 막(28)상의 개구 커버리지 비율이 커질수록 및 다공성 막(28)의 막 두께가 얇아질수록 더욱 활성화되므로, 이 시험은 높은 감도로 수행될 수 있다.
또한, 상기 독성 시험에 있어서, 혈액 희석액 대신에 상부 마이크로채널(16)을 통해 약물 및 트레이서를 함유하는 용액을 주행시킬 수 있다. 트레이서의 예는 형광-표지 화학 물질, 방사성동위원소-함유 화학 물질, 염료 화합물 등, 보다 구체적으로는 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 및 FITC 마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 형광 염료는 바람직하게는 여기 파장/형광 파장이 580 nm/605 nm인 적색이다.
혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)에 대한 약물성 손상의 수준은 트레이서의 타입에 따라 형광 강도, 방사선 또는 색도를 측정하여 트레이서를 정량화하고, 다공성 막(28)을 통과하여 상부 마이크로채널(16)로부터 하부 마이크로채널(22) 내로 유입된 트레이서의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 예시적인 실시양태는 하부 마이크로채널(22)로부터 상부 마이크로채널(16)을 구획하는 다공성 막(28)에 있어서, 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경이 1 μm 내지 20 μm이고, 관통홀(30)의 개구(30A)의 개구 커버리지 비율이 30% 내지 70%이도록 구성된다. 따라서, 상부 마이크로채널(16)을 통해 주행하는 적혈구가 다공성 막(28)의 관통홀(30)을 통과하여 하부 마이크로채널(22)로 이동할 때의 일출 시험 동안, 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있다.
또한, 본 예시적인 실시양태는 다공성 막(28)의 막 두께가 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경의 절반 이하가 되도록 구성된다. 따라서, 다공성 막(28)의 막 두께가 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경의 절반보다 큰 경우와 비교하여, 적혈구가 다공성 막(28)내 관통홀(30)을 보다 수월하게 통과할 수 있다. 따라서, 본 예시적인 실시양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
또한, 본 예시적인 실시양태는 허니콤 패턴으로 배열된 관통홀(30)의 개구부(30A)로 구성되고, 다공성 막(28) 내의 관통홀(30)은 연통홀(34)을 통해 서로 연통된다. 관통홀(30)의 개구(30A)의 개구 직경의 변동 계수는 10% 이하이고, 다공성 막(28)의 다공율은 50% 이상이다. 따라서, 적혈구는 다공성 막(28)내 복수의 관통홀(30)을 보다 균일하게 통과할 수 있다. 따라서, 본 예시적인 실시양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
또한, 본 예시적인 실시양태는 다공성 막(28)의 상면(28A)에 제공된 혈관내피세포층(36), 및 다공성 막(28)의 하면(28B)에 제공된 세포층(38)으로 구성된다. 세포층(38)은 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포로 구성된다. 또한, 다공성 막(28)은 파단 인장 신율이 50% 이상이고, 10% 신장에 필요한 응력이 1000 gf/mm2 이하인 가요성 재료로 구성된다. 그리하여, 본 예시적인 실시양태에 있어서, 혈관 모델(10)은 실제 혈관과 더 유사하도록 구성될 수 있다.
본 개시의 예시적인 실시양태의 예에 관해 설명하였다. 그러나, 본 개시는 상기에 제한되지 않고, 본 개시의 취지를 벗어나지 않는 범위 내에서 상기 이외에도 다양한 변형이 구현될 수 있다.
예를 들면, 비록 상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)에서의 관통홀(30)의 개구(30A)는 평면에서 볼 때 원형 형상을 갖지만, 도 5에 도시된 바와 같이, 다공성 막(48)에서의 관통홀(50)의 개구(50A)는 평면에서 볼 때 타원형 형상을 가질 수 있다. 관통홀(50)의 개구(50A)를 타원형으로 구성함으로써, 예를 들면 원판형 적혈구가 관통홀(50)의 개구(50A)를 용이하게 통과할 수 있고, 혈액 중의 다른 세포는 이를 통해 통과하기 쉽지 않을 수 있다.
관통홀(50)의 개구(50A)의 개구(50A)를 타원형으로 형성하는 방법의 예는 다공성 막(48)에 도 4에 도시된 바와 같은 원형 개구(30A)를 형성한 후, 다공성 막(48)을 한 방향 (도 4의 좌우 방향)을 따라 연신하는 방법을 포함한다. 이 방법은 동일한 방향 (도 5의 좌우 방향)을 따라 장축 방향을 갖는 복수의 타원형 개구(50A)가 형성될 수 있게 해 준다.
또한, 다공성 막(48)을 연신하지 않고, 프레스 성형 등을 이용하여 다공성 막(48)에 타원형의 개구(50A)를 직접 형성해도 된다. 또한, 개구(50A)의 형상이 평면에서 볼 때 장축 및 단축을 갖는 편평한 형상인 한, 개구(50A)의 형상은 예를 들어, 정다각형을 연신시킴으로써 도달된 편평한 다각형 형상일 수 있다.
상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)에 있어서, 관통홀(30)의 개구(30A)는 다공성 막(28)의 주면 전체에 걸쳐서 규칙적인 방식으로 배열된다. 그러나, 도 6에 도시된 바와 같이, 다공성 막(58)은 관통홀(60)의 개구(60A)가 형성되는 다공성 영역(62) 및 관통홀(60)의 개구(60A)가 형성되지 않은 비-다공성 영역(64) (도 6에서 이중 점선으로 표시된 영역)을 구비할 수 있다.
구체적으로, 다공성 막(58)에 있어서, 도 1에 도시된 상부 마이크로채널(16)을 구성하는 오목부(18)의 입구(18A) 부근 및 출구(18B) 부근, 및 도 1에 도시된 하부 마이크로채널(22)을 구성하는 오목부(24)의 입구(24A) 부근 및 출구(24B) 부근에 배치된 부분들은 예를 들어 비-다공성 영역(64)으로서 구성된다.
일반적으로, 혈액과 같은 액체의 흐름은 입구(18A, 24A) 및 출구(18B, 24B)에서 쉽게 교란된다. 따라서, 비-다공성 영역(64)으로서 입구(18A, 24A) 부근 및 출구(18B, 24B) 부근에 다공성 막(58)을 구성함으로써, 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)에서의 혈액과 같은 액체의 흐름이 조절될 수 있다. 따라서, 다공성 막(58)은 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
본 개시의 혈관 모델은 적혈구와 같은 누출 물질의 약물 독성을 동반한 혈관 외부로의 이동이 다공성 막에 의해 방해 받는 것이 억제되는 상태에서 일출 시험을 수행하게 해 줄 수 있다. 따라서, 본 개시의 혈관 모델은 높은 정확도로 독성 시험을 수행할 수 있는 혈관 모델로서 유용할 수 있다.
본 개시의 예시적인 실시양태의 예에 관한 상세한 설명이 이어진다. 본 개시의 예시적인 실시양태는 이하에 예시된 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도 7A는 실시예 1의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다. 실시예 1에서는 복수의 관통홀의 개구는 허니컴 패턴으로 배열되었고 관통홀은 연통홀을 통해 연통된, 상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)과 유사하게 폴리카보네이트로 형성된 다공성 막이 사용되었다. 실시예 1의 다공성 막에서 개구의 평균 개구 직경은 5 μm이고, 개구의 개구 커버리지 비율은 55%이고, 다공성 막의 막 두께는 2.2 μm이고, 개구의 개구 직경의 변동 계수는 3.5%이고, 다공성 막의 다공율은 75%이고, 파단 인장 신장률은 250%이고, 10% 신장에 필요한 응력은 100 gf/mm2이었다.
제조된 다공성 막의 미세 구조는 프로파일 스캐닝 레이저 현미경 (제품명: VK-X100, 일본 Keyence사 제조)을 사용하여 측정하였다. 단일 스크린에 50개 이상의 개구가 나타나는 배율을 사용하여 관찰하였다. 관찰된 현미경사진을 기초로, 각각의 개구 직경 D를 측정하고 개구 직경 D의 평균 개구 직경 DAV 및 변동 계수 σD를 구하기 위해, 하나의 스크린 상에 존재하는 개구에 대해 이미지 분석을 수행하였다. 개구 직경의 변동 계수 (백분율로 제공)는 계산 (σD/DAV)Х100을 사용하여 달성될 수 있다.
평균 개구 직경 및 개구 커버리지 비율은 2D 이미지 분석 소프트웨어 WinROOF (Mitani Corp.)를 사용하여 현미경사진상에서 이진화 처리 및 이미지 처리를 수행함으로써 달성되었다. 다공성 막의 막 두께는 프로파일 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 10개 지점에서 측정된 개구부 두께의 평균값이다.
다공성 막의 단면을 주사 전자 현미경 (SEM, 제품명: SU8030, 일본 Hitachi 제조)을 사용하여 관찰하였고 관통홀과 동등한 구의 직경을 다공성 막의 다공율로서 계산하였다. 평가될 다공성 막 샘플을 마이크로톰 (제품명: FCS, 오스트리아 Reichert 제조)으로 세절하여 단면 관찰용 샘플을 생성하고, 단면 관찰용 샘플의 표면을 Os 층으로 두께 6 nm로 코팅하고, 샘플을 2 kV의 가속 전압을 사용하여 SEM으로 관찰하였다. 다공성 막의 파단 인장 신율 및 10% 신장에 필요한 응력은 FUDOH RHEO METER RT-2002D·D (Rheotech Corp. 제조)를 사용하여 측정되었다
도 7B는 비교예 1의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다. 비교예 1에서는 트랙 에칭 공정에 의해 개구를 형성하는 폴리카보네이트로 형성된 종래 기술의 다공성 막이 사용되었다. 또한, 비교예 1의 다공성 막에 있어서의 개구의 평균 개구 직경은 5.7 ㎛이고, 개구의 개구 커버리지 비율은 12.4%이고, 다공성 막의 막 두께는 10.6 ㎛이고, 개구의 개구 직경의 변동 계수는 35%이고, 다공성 막의 다공률은 15%이고, 파단 인장 신율은 150%이고, 10% 신장에 필요한 응력은 5800 gf/mm2이었다.
다공성 막은 양면에 의료용지가 부착되어 제조된다. 다공성 막의 일면의 의료용지를 핀셋을 사용하여 제거하고, 의료용지가 제거된 면은 하부 채널 부재에서 아래로 향하게 설정한다. 이어서, 다공성 막을 면봉을 사용하여 에탄올에 침지시켜 다공성 막 및 하부 채널 부재를 함께 접합시킨다.
다음으로, 다공성 막의 타면의 의료용지를 핀셋을 사용하여 제거하고, 상부 채널 부재를 다공성 막의 타면에 적층한다. 상부 채널 부재와 하부 채널 부재의 위치를 현미경상에서 체크하면서 정렬시키고, 상부 채널 부재와 하부 채널 부재를 함께 접합시킨다. 그리하여, 실시예 1의 혈관 모델 및 비교예 1의 혈관 모델이 각각 제조되었다.
실시예 1 및 비교예 1에서, 다공성 막의 적혈구에 대한 투과성을 평가하기 위하여, 사용된 다공성 막은 그 주면에 제공된 혈관내피세포층(36) 또는 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포들의 세포층을 갖지 않았다.
실시예 2에서는, 실시예 1의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포층을 형성하고, 다공성 막의 하면에 래트 평활근세포로 구성된 세포층을 형성함으로써 세포층이 부착된 혈관 모델을 제조하였다.
비교예 2에서는, 비교예 1의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포층을 형성하고, 다공성 막의 하면에 래트 평활근세포로 구성된 세포층을 형성함으로써 세포층이 부착된 혈관 모델을 제조하였다.
실시예 2 및 비교예 2에 있어서, Angio-Proteomie 제조의 래트 동맥내피세포를 래트 혈관내피세포에 사용하였고, Lonza 제조의 래트 대동맥평활근세포를 래트 평활근세포에 사용하였다. 하부 마이크로채널을 초기에 세포 농도가 3x106 세포/ml인 래트 평활근세포의 세포 현탁액 100 μL로 파종하였다. 배양 1일 후, 상부 마이크로채널에 세포 농도가 3x106 세포/ml인 래트 혈관내피세포의 세포 현탁액 100 μL로 파종하였다. 배양 2 일 후, 실시예 2 및 비교예 2의 세포층 부착 혈관 모델을 수득하였다.
3.7x105 세포/ml의 적혈구 수를 갖는 혈액 희석액을 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 생리 식염수 용액을 하부 마이크로 채널을 통해 주행시켰다. 혈액 희석액 및 생리 식염수 용액의 유체 전달 속도는 500 μL/분으로 설정하고, 상부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 8.7 kPa로 설정하고, 하부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 1.3 kPa로 설정하여 실제 혈관 내부의 혈류 및 혈압 조건에 근접한 파라미터를 확립하였다.
유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 생리 식염수 용액 내부의 적혈구의 수는 실시예 1에서는 9.2Х104 세포/ml의 적혈구 수를 제공하고 비교예 1의 혈관 모델에서는 2.2x104 세포/ml의 적혈구 수를 제공하였다.
이 시험은 실시예 1 및 비교예 1의 다공성 막 모두가 혈압의 조건과 동등한 조건 하에서 적혈구에 대한 투과성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비교예 1의 다공성 막과 비교하여, 실시예 1의 다공성 막은 적혈구에 대해 보다 쉽게 투과될 수 있어, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막이 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있음을 확인시켜 준다.
트레이서에 대해 1.81x106 비드/ml 농도의 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액을 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지를 하부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. 형광 비드는 직경이 4 ㎛이고, 여기 파장이 580 nm이고 형광 파장이 605 nm인 적색 형광 염료로 표지되었다. 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액 및 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지의 유체 전달 속도는 500μL/분으로 설정하고, 상부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 8.7 kPa로 설정하고, 하부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 1.3 kPa로 설정하여 실제 혈관 내부의 혈류 및 혈압 조건에 근접한 파라미터를 확립하였다.
유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 배양 배지 내부의 형광 비드의 수는 실시예 2에서는 6.5x104 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하고 비교예 2에서는 9.2x103 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 1.81x106 비드/ml로 형광 비드를 함유하는 생리 식염수 희석액을 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 생리 식염수를 하부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. 유체 전달 속도는 500 μL/분으로 설정되었다. 하부 마이크로채널 내부의 형광 비드의 수는 실시예 1에서는 1.7Х105 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하고 비교예 1에서는 4.3Х104 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 이 시험은 다공성 막의 양면에 세포층을 형성하는 것이 다공성 막의 형광 비드에 대한 투과성을 저감시키고, 다공성 막에 배리어성을 부여한다는 것을 확인할 수 있었다.
약물인 사이토칼라신을 상부 마이크로채널과 하부 마이크로채널 각각을 통해 하루 동안 50 μg/ml의 농도 및 0.7 μL/min의 유속으로 주행시킴으로써 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 다공성 막의 양면에 있는 세포층을 약물에 노출시켰다.
*약물 노출 후, 상기 기재된 세포층 부착 혈관 모델에 대한 형광 비드 투과성 시험과 동일한 방법을 사용하여 형광 비드 투과성 시험을 수행하였다. 유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 배양 배지 내부의 형광 비드의 수는 실시예 2에서는 1.7Х105 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하고 비교예 2에서는 6.7Х103 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다.
이 시험은 약물에 의해 세포층이 손상된 후 실시예 2 및 비교예 2의 세포층 부착 혈관 모델에서 형광 비드가 다공성 막을 통과할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 비교예 2의 다공성 막에 비하여, 실시예 2의 다공성 막은 형광 비드에 대해 보다 투과성이었으므로, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 형광 비드의 이동이 방해되는 것을 억제하게 해 주는 것을 확인시켜준다. 따라서, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 고감도로 혈관 모델에서 약물 독성의 평가를 가능하게 한다는 것이 확인되었다.
실시예 3에서는, 실시예 2와 유사하게, 세포층 부착 혈관 모델을 다공성 막의 상면에 형성된 래트 혈관내피세포층과 다공성 막의 하면에 형성된 래트 평활근세포층으로 제조하였다.
비교예 3에서는, 비교예 2와 유사하게, 세포층 부착 혈관 모델을 다공성 막의 상면에 형성된 래트 혈관내피세포층과 다공성 막의 하면에 형성된 래트 평활근세포층으로 제조하였다.
실시예 3 및 비교예 3에 사용된 세포는 실시예 2 및 비교예 2에 사용된 것과 동일하였다. 세포층을 형성하기 위하여, 하부 마이크로채널을 초기에 세포 농도가 3x106 세포/ml인 래트 평활근세포의 세포 현탁액 100 μL로 파종하였다. 배양 1일 후, 상부 마이크로채널을 세포 농도가 1x106 세포/ml인 래트 혈관내피세포의 세포 현탁액 100 μL로 파종하고 6시간 동안 배양하였다. 이어서, 각각의 배양 배지 (래트 EC 배지/SMC 배지)를 펌프를 사용하여 0.7 μL/분의 유체 전달 속도로 각 채널을 통해 주행시켰다. 배양 2일 후, 실시예 3 및 비교예 3의 세포층 부착 혈관 모델을 수득하였다.
실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 하부 마이크로채널을 폐쇄하고, 트레이서에 대해 12.5 μg/50 μl의 농도로 FITC-덱스트란 (46945, Sigma-Aldrich 제조)을 함유하는 배양 배지 희석액을 상부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. FITC-덱스트란을 함유하는 배양 배지 희석액의 유체 전달 속도는 7 μL/분으로 설정하였다.
채널을 통해 FITC-덱스트란을 주행시킨 지 2분 후, 도립 현미경 (제품명: Eclipse Ts2, Nikon 제조)을 사용하여 마이크로채널에서의 형광을 이미지화 하였다. 이미지화 파라미터에 대해, 배율: 4배, 이득: 1600, 및 노출 시간: 60 ms가 사용되었다. 이들 결과는 도 8A 및 도 8B에 도시되어 있다. 실시예 3 및 비교예 3 양쪽 모두에서, 하부 채널에서 형광이 관찰되지 않았다. 이는 FITC-덱스트란이 상부 채널에서 하부 채널로 침투하지 않았음을 나타낸다. 이 시험은 다공성 막의 양면에 세포층을 형성하는 것이 FITC-덱스트란 투과를 억제하고, 다공성 막에 배리어성을 부여함을 확인할 수 있었다.
약물인 페놀도팜을 상부 마이크로채널을 통해 하루 동안 500 ng/ml의 농도 및 0.7 μL/min의 유속으로 주행시킴으로써 실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 다공성 막의 혈관내피세포층을 약물에 노출시켰다.
약물 노출 후, 상기 기재된 세포층 부착 혈관 모델에 대한 FITC-덱스트란 투과성 시험과 동일한 방법을 사용하여 FITC-덱스트란 투과성 시험을 수행하였다. 이들 결과는 도 9A 및 도 9B에 도시하였다. 실시예 3의 세포층 부착 혈관 모델에서는, 상부 마이크로채널에 추가하여, 하부 마이크로채널을 포함하여 광범위에 걸쳐서 형광이 관찰되었다. 비교예 3의 세포층 부착 혈관 모델에서는, 하부 마이크로채널에서 관찰된 형광은 최소였다. 이 시험은 약물에 의해 세포층이 손상된 후 실시예 3 및 비교예 3 양쪽 모두의 세포층 부착 혈관 모델에서 FITC-덱스트란이 다공성 막을 통과할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 3의 다공성 막은 비교예 3의 다공성 막보다 FITC-덱스트란에 대해 보다 투과성이었으므로, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 FITC-덱스트란의 이동을 방해하지 않는다는 것을 확인시켜준다. 따라서, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 고감도로 혈관 모델에서 약물 독성의 평가를 가능하게 한다는 것이 확인되었다.
실시예 4에서는, 실시예 1의 혈관 모델의 상부 및 하부 채널의 직선 부분에 12 mmХ0.2 mm 개구를 제공함으로써 혈관 모델을 제조하였다. 개구는 하부 채널 부재와 다공성 막 사이에 0.2 mm 폭의 슬릿이 형성된 폴리프로필렌 보강 부재를 삽입함으로써 형성되었다. 보강 부재는 100 ㎛의 두께를 가졌다. 도 10A 및 도 10B는 실시예 4의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다.
실시예 5에서는, 실시예 1의 혈관 모델의 다공성 막에 60°C에서 15분 동안 콜라겐 (5005-100ML, Advanced BioMatrix 제조)을 분무한 다음, 콜라겐을 건조시켜 두꺼운 코팅을 형성하고, 이어서 다공성 막의 상면에는 래트 혈관내피세포층을 형성하고 다공성 막의 하면에는 래트 평활근세포층을 형성함으로써 세포층 부착 혈관 모델을 제조하였다. 도 11은 실시예 5의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다.
실시예 6에서는, 실시예 4의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포층을 형성함으로써 단일 세포층이 부착된 혈관 모델을 제조하였다.
트레이서에 대해 1.81x106 비드/ml 농도의 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액을 실시예 6에서 제조된 단일 세포층 부착 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지를 하부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. 형광 비드는 직경이 4 ㎛이고, 여기 파장이 580 nm이고 형광 파장이 605 nm 인 적색 형광 염료로 표지되었다. 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액 및 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지의 유체 전달 속도는 500 μL/분으로 설정하고, 상부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 8.7 kPa로 설정하고, 하부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 1.3 kPa로 설정하여 실제 혈관 내부의 혈류 및 혈압 조건에 근접한 파라미터를 확립하였다.
유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 배양 배지 내부의 형광 비드의 수는 실시예 6에서 2.67x104 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 실시예 4의 혈관 모델의 상부 채널을 통해 1.81x106 비드/ml의 형광 비드를 함유하는 생리 식염수 희석액을 주행시키는 것 및 500 μL/분의 유체 전달 속도로 하부 채널을 통해 생리 식염수를 주행시키는 것은 실시예 4에서 7.23x105 비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 이 시험은 다공성 막의 단일면에 세포층을 형성하는 것이 다공성 막의 형광 비드에 대한 투과성을 저감시키고, 다공성 막에 배리어성을 부여한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7에서는, 실시예 1의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 도 1 내지 도 6을 참조하여 본 개시의 예시적인 실시양태의 실시예 및 변형예에 관한 설명이 이어진다. 다음의 예시적인 실시양태는 단지 본 개시의 일례일 뿐이며, 본 개시의 범위를 제한하지 않는다. 또한, 도면에서의 다양한 구성의 치수는 다양한 구성의 설명을 용이하게 하기 위해 적절하게 수정된다. 따라서, 도면의 스케일은 실제의 스케일과 다를 수 있다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 예시적인 실시양태의 혈관 모델(10)은 서로 적층된 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)를 포함한다. 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)는 예를 들면, 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 탄성 물질로 구성되고, 실질적인 직사각형 판 형상을 갖는다.
PDMS 외에, 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)를 구성하는 재료의 다른 예는 사이클릭 올레핀 중합체(COP), 에폭시 수지, 우레탄 수지, 스티렌계 열가소성 엘라스토머, 올레핀계 열가소성 엘라스토머, 아크릴계 열가소성 엘라스토머, 폴리비닐 알코올 등을 포함한다.
상부 마이크로채널(16)을 규정하는 오목부(18)는 상부 채널 부재(12)의 하면, 즉, 하부 채널 부재(14)에 대향하는 대향면(12A)에 형성된다. 오목부(18)는 입구(18A), 출구(18B), 및 입구(18A)와 출구(18B)를 연통시키는 채널부(18C)를 포함한다.
관통홀(20A, 20B)은 상부 채널 부재(12)에 형성되고, 상부 채널 부재(12)를 두께 방향으로 관통하며, 입구(18A) 및 출구(18B)와 각각 연통하는 하단부를 갖는다. 관통홀(20A, 20B)의 상단부는 상부 채널 부재(12)의 상면에서 개방된다. 관통홀(20A, 20B)의 상단부에는 액체 공급 튜브 (비도시)가 접속된다.
마찬가지로, 하부 마이크로채널(22)을 규정하는 오목부(24)는 하부 채널 부재(14)의 상면, 즉, 상부 채널 부재(12)에 대향하는 대향면(14A)에 형성된다. 오목부(24)는 입구(24A), 출구(24B), 및 입구(24A)와 출구(24B)를 연통시키는 채널부(24C)를 포함한다.
하부 채널 부재(14)의 입구(24A)와 출구(24B) 및 상부 채널 부재(12)의 입구(18A)와 출구(18B)는 평면에서 볼 때 겹치지 않는 위치에 제공된다. 그에 반하여, 하부 채널 부재(14)의 채널부(24C) 및 상부 채널 부재(12)의 채널부(18C)는 평면에서 볼 때 겹치는 위치에 제공된다.
관통홀(26A, 26B)이 또한 상부 채널 부재(12)에 형성되고, 상부 채널 부재(12)를 두께 방향으로 관통하며, 입구(24A) 및 출구(24B)와 각각 연통되는 하단부를 갖는다. 관통홀(26A, 26B)의 상단부는 상부 채널 부재 (12)의 상면에서 개방된다. 관통홀(26A, 26B)의 상단부에는 액체 공급 튜브 (비도시)가 접속된다.
다공성 막(28)은 상부 채널 부재(12)와 하부 채널 부재(14)의 대향면(12A, 14A) 사이에 제공된다. 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)는 그 사이에 개재된 상태에서 다공성 막 (28)과 함께 접합된다. 또한, 상부 채널 부재 (12)와 하부 채널 부재 (14)를 함께 접합하는 방법으로는, 접착제를 사용하여 함께 접합하는 것 외에, 용착, 인력 (자기 부착) 또는 볼트로의 접합 등의 다양한 방법을 채용할 수 있다.
다공성 막(28)은 예를 들면, 소수성 유기 용매에 용해되는 소수성 중합체이다. 소수성 유기 용매는 25°C의 물에서 10 이하 (g/100g 물)의 용해도를 갖는 액체이다.
소수성 중합체의 예는 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리에스테르 (예를 들면, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 및 폴리-3-히드록시부티레이트), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리헥사플루오로프로펜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐카바졸, 폴리비닐 아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리우레아, 다환 방향족 화합물, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리실록산 유도체, 및 셀룰로스 아실레이트 (예를 들면, 트리아세틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프로피오네이트, 및 셀룰로스 아세테이트 부티레이트)와 같은 중합체를 포함한다. 예를 들면 JP-B 제4,734,157호에 개시된 제조방법을 이용하여 허니콤 멤브레인을 제조하는 관점에서, 소수성 유기용매에 용해되는 중합체가 바람직하다.
예를 들면, 용매에 대한 용해도, 광학 특성, 전기적 특성, 막 강도, 및 탄성의 관점에서, 이들 중합체는 필요에 따라 단독중합체, 공중합체, 중합체 블렌드 또는 중합체 알로이의 형태를 취할 수 있다. 이들 중합체는 단독으로 또는 둘 이상 조합하여 사용될 수 있다. 다공성 막(28)의 재료는 소수성 중합체로 제한되지 않으며, 세포의 접착성과 같은 관점에서 다양한 재료가 선택될 수 있다.
다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B) (이하, 상면(28A) 및 하면(28B)은 총칭하여 "주면"으로 호칭될 수 있다)은 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)의 채널부(18C, 24C)를 실질적으로 덮도록 크기가 정해져서, 상부 마이크로채널(16)이 하부 마이크로채널(22)로부터 구획된다.
구체적으로, 다공성 막(28)의 상면(28A), 즉, 상부 채널 부재(12)에 대향하는 주면은 상부 채널 부재(12)의 오목부(18)와 함께 상부 마이크로채널(16)을 규정한다. 다공성 막(28)의 하면(28B), 즉, 하부 채널 부재(14)에 대향하는 주면은 하부 채널 부재(14)의 오목부(24)와 함께 하부 마이크로채널(22)을 규정한다.
도 3에 도시된 바와 같이, 예를 들면 혈관내피세포층(36)이 다공성 막 (28)의 상면(28A)에 제공되어 상면(28A)을 완전히 덮는다. 그리하여 상부 마이크로채널(16)의 내부는 혈관의 내부와 매우 유사한 환경을 구성한다. 혈관내피세포의 예는 제대 정맥, 제대 동맥, 대동맥, 관상 동맥, 폐 동맥, 폐 미세혈관, 또는 진피 미세혈관으로부터 기원하는 혈관내피세포; 및 만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포를 포함한다.
예를 들면, 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포로부터 구성된 세포층(38)이 다공성 막(28)의 하면(28B)에 제공되어 하면(28B)을 완전히 덮는다. 그리하여 하부 마이크로채널(22)은 혈관 외부와 매우 유사한 환경을 구성한다. 간엽줄기세포 (MSC)는 근육세포, 지방세포, 연골세포 등으로 분열할 수 있는 체세포 줄기세포이다.
다공성 막(28)의 상면(28A)에는 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포의 세포층(38)이 제공될 수 있고, 다공성 막(28)의 하면(28B)에는 혈관내피세포층(36)이 제공될 수 있다. 더욱이, 다공성 막(28)의 주면 중 적어도 하나에 혈관내피세포층(36)이 제공되는 것으로 충분하다. 다공성 막(28)의 다른 하나의 주면에는 세포층(38)이 제공되지 않도록 구성될 수도 있다.
세포의 접착성의 관점에서, 다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B) 중 적어도 하나에 세포가 파종되는 영역은 피브로넥틴, 콜라겐 (예를 들면, 타입 I 콜라겐, 타입 IV 콜라겐 또는 타입 V 콜라겐), 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 펠리칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나에 의하여 피복되는 것이 바람직하다. 또한, 다공성 막(28) 및 후술하는 관통홀(30)의 내부는 이들 중 적어도 하나에 의해 코팅되어 있는 것이 바람직하다.
혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)을 다공성 막(28)의 각각의 주면에 제공하기 위해서, 예를 들면, 세포 현탁액을 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)에 부어 다공성 막(28)의 주면에 세포를 파종하는 방법이 채용될 수 있다. 추가로, 별도의 배양장치 내에서 다공성 막(28)의 주면에 세포를 파종하여 배양한 다음, 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)이 형성되어 있는 다공성 막(28)을 혈관 모델(10)에 장착하는 방법도 채용될 수 있다.
도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 다공성 막(28)을 두께 방향으로 관통하는 복수의 관통홀(30)이 다공성 막(28)에 형성된다. 관통홀(30)의 개구(30A)가 다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B) 각각에 제공된다. 도 4에 도시된 바와 같이, 개구(30A)는 평면에서 볼 때 원형이다. 개구(30A)는 서로 분리되어 제공된다. 편평부(32)는 인접한 개구(30A) 사이에서 연장한다. 개구(30A)는 원형으로 제한되지 않으며, 다각형으로 구성될 수도 있다.
복수의 개구(30A)는 규칙적인 방식으로 배열되고, 본 예시적인 실시양태에서는, 도 4에 도시된 바와 같이, 예를 들면, 허니콤 패턴으로 배열된다. 허니콤 패턴 배열은, 개구(30A)의 중심이 평행 육각형의 단위 (정육각형이 바람직하다) 또는 이에 가까운 형상에 대한, 꼭지점의 위치와 대각선이 교차하는 지점에 배치되는 배열이다. 여기에서, "개구의 중심"이란 평면에서 볼 때 개구(30A)의 중심을 의미한다.
개구(30A)의 배열은 허니콤 패턴으로 제한되지 않는다. 개구(30A)는 또한 격자 패턴 또는 면심 격자 패턴으로 구성될 수 있다. 격자 패턴 배열은 개구의 중심이 평행 사변형 (정사각형, 직사각형, 마름모꼴이 포함된다는 것은 말할 나위도 없으며, 정사각형이 바람직하다) 또는 이에 가까운 형상의 단위에 대한 꼭지점의 위치에 배치되는 배열이다. 면심 격자 패턴 배열은 개구의 중심이 평행 사변형 (정사각형, 직사각형, 마름모꼴이 포함된다는 것은 말할 나위도 없으며, 정사각형이 바람직하다) 또는 이에 가까운 형상의 단위에 대한 꼭지점의 위치 및 대각선이 교차하는 지점에 배치되는 배열이다.
개구(30A)의 배열은 임의적일 수 있다. 그러나, 다공성 막(28)의 상면(28A) 및 하면(28B)에서의 개구(30A)의 균일한 밀도를 달성하는 관점에서 복수의 개구(30A)는 규칙적인 방식으로 배열되는 것이 바람직하다. 규칙적인 배열은 상기 배열의 평행 육각형 또는 평행 사변형 단위의 표면적의 변동 계수가 예를 들어 10% 이하인 배열이다. 개구(30A) 중 일부는 누락될 수 있거나 개구(30A)는 정렬되어 있지 않을 수 있다. 그러나, 개구(30A)는 그들 사이에 갭 없이 모든 방향으로 연속적으로 배열되는 것이 바람직하다. "변동 계수"는 주어진 모집단의 표준편차를 그 평균으로 나눔으로써 도달한 값이고, 모집단의 분산 정도를 백분율로 나타내는 지수이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 다공성 막 (28)의 각 관통홀(30)은 구의 세그먼트 형상을 가지며, 이는 구의 상단 및 하단이 절단된 형상이다. 서로 인접하는 관통홀(30)은 다공성 막(28) 내부의 각 연통홀(34)을 통해 서로 연통되어 있다.
각 관통홀(30)은 모든 인접 관통홀(30)과 연통하는 것이 바람직하다. 복수의 관통홀(30)의 개구(30A)가 본 예시적인 실시양태에서와 같이 허니콤 패턴으로 배열되는 경우, 각각의 관통홀(30)은 6개의 연통홀(34)을 통해 인접한 6개의 관통홀(30)과 각각 연통된다. 관통홀(30)은 배럴 형상, 원기둥 형상, 다각기둥 형상 등을 가질 수 있으며, 연통홀(34)은 인접한 관통홀(30)을 함께 연결하는 튜브형 보이드일 수 있다.
관통홀(30)의 각각의 개구(30A)의 개구 직경 D는 예를 들면, 혈액 내의 적혈구가 통과할 수 있는 크기이다. 구체적으로, 평균 개구 직경은 바람직하게는 1μm 내지 20μm이고, 더 바람직하게는 3μm 내지 10μm이다. 평균 개구 직경을 1μm 이상으로 설정하는 것은 관통홀(30)로 하여금 적혈구가 그를 통과하도록 허용하는 사이즈가 되게 해주고, 평균 개구 직경을 20μm 이하로 설정하는 것은 다공성 막(28)의 주면에 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)의 보유를 가능케 해준다.
여기에서, "개구 직경 D"는 개구(30A)의 장축이고, "평균 개구 직경"은 10개 이상의 임의로 선택된 개구(30A)에 대해 측정된 개구 직경 D의 계산된 평균이다. "장축"은 개구의 윤곽에서 임의로 선택된 두 지점 사이의 가장 긴 거리를 의미한다. 그러나, 방향이 특정된 경우 "장축"은 해당 방향을 따라 임의로 선택된 두 지점 사이의 가장 긴 거리를 의미한다.
관통홀(30)의 개구(30A)의 개구 커버리지 비율은 바람직하게는 30% 내지 70%, 더 바람직하게는 40% 내지 60%이다. 개구 커버리지 비율을 30% 이상으로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있게 해주고, 개구 커버리지 비율을 70% 이하로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 필요한 강도가 달성될 수 있게 해준다.
여기에서, "개구 커버리지 비율"은 백분율로 S2 대 S1의 비율을 나타내고, S1은 다공성 막(28)의 주면이 매끄럽다는 가정하에 (즉, 다공성 막(28)에 개구(30A)가 없다는 가정하에), 다공성 막(28)의 표면적의 단위를 나타내고, S2는 단위 표면적당 제공된 개구(30A)의 표면적의 합을 나타내며, 여기서 S1 및 S2에 대해 동일한 측정 단위가 사용된다.
다공성 막(28)의 막 두께 T는 바람직하게는 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경의 절반 이하이다. 구체적으로, 두께 T는 바람직하게는 0.5μm 내지 10μm이고, 더 바람직하게는 1μm 내지 10μm이다. 다공성 막(28)의 막 두께 T를 관통홀(30)의 평균 개구 직경의 절반 이하인 두께로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있게 해준다.
또한, 다공성 막(28)은 세포가 부착하여 성장하는 스캐폴드이므로, 다공성 막(28)의 일면의 세포와 다공성 막(28)의 타면의 세포 사이의 세포간 상호작용, 즉, 체액 인자를 통한 정보전송 또는 세포간 접촉 중 적어도 하나는 다공성 막(28)상의 개구 커버리지 비율이 커질수록 및 다공성 막(28)의 막 두께가 얇아질수록 더욱 활성화된다. 다공성 막(28)의 주면에 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)을 제공하기 위한 세포 배양 동안 세포간 상호 작용이 더 활발할수록, 생체내 조직의 것과 유사한 기능성을 갖는 혈관 모델이 더 잘 생성될 수 있다.
개구(30A)의 개구 직경 D의 변동 계수는 바람직하게는 10% 이하이고, 변동 계수가 작을수록 더 바람직하다. 개구 직경 D의 변동 계수가 작을수록, 보다 균일하게 적혈구 등이 다공성 막(28) 내의 복수의 관통홀(30)을 통과할 수 있다.
다공성 막(28)의 다공율은 바람직하게는 50% 이상이다. 다공율을 50% 이상으로 설정하는 것은 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있게 해준다. 다공율이 너무 크면, 다공성 막(28)의 강도는 그에 요구되는 강도와 관련하여 불충분해지고, 따라서 다공율은 바람직하게는 95% 이하이다.
여기에서, "다공율"은 백분율로 V2 대 V1의 비율을 나타내고, V1은 다공성 막(28)의 주면이 매끄럽다는 가정하에 (즉, 다공성 막(28)에 개구(30A)가 없다는 가정하에), 다공성 막(28)의 부피의 단위를 나타내고, V2는 단위 부피당 제공된 관통홀(30) 및 연통홀(34)의 부피의 합을 나타내며, 여기서 V1 및 V2에 대해 동일한 측정 단위가 사용된다.
다공성 막(28)의 파단 인장 신율은 바람직하게는 50% 이상이고, 더 바람직하게는 100%이며, 보다 더 바람직하게는 200% 이상이다. 다공성 막(28)의 10% 신장에 필요한 응력은 바람직하게는 1000gf/mm2 이하이다. 파단 인장 신율이 증가하고 10% 신장에 필요한 응력이 감소함에 따라 재료는 보다 가요성이 된다. 따라서, 다공성 막(28)을 구부리고, 신장시키고, 압축하는 것이 가능하여, 혈관 모델(10)이 실제 혈관과 더 유사하도록 해준다.
여기에서, "파단 인장 신율"은 JIS K 6251:2010에 정의된 방법에 따라 다공성 막(28)의 인장 파단 신율을 측정함으로써 평가될 수 있다. "10% 신장에 필요한 응력"은 JIS K 6251:2010에 정의된 방법에 따라 다공성 막(28)이 10% 신장될 때 다공성 막(28)에 가해지는 응력을 측정함으로써 평가될 수 있다.
관통홀(30)이 형성된 다공성 막(28)을 제조하는 방법의 예는 나노-프린팅 공정, 응축 공정, 에칭 공정, 샌드 블라스팅 공정 또는 프레스 성형 공정을 포함한다. 나노-프린팅 공정은 다공성 막(28)을 구성하는 재료를 돌출부 및 오목부를 갖는 몰드에 붓거나, 또는 이러한 몰드를 다공성 막(28)을 구성하는 재료에 대해 가압함으로써 관통홀(30)을 생성하는 방법이다. 응축 공정이란 다공성 막(28)을 구성하는 재료의 표면에 응결을 유도하여, 물방울을 몰드로 하여 관통홀(30)을 형성하는 방법이다.
타 방법과 비교하여, 응축 공정은 다공성 막(28)의 막 두께가 더 얇아질 수 있게 하고, 개구(30A)의 다공율 및 개구 커버리지 비율이 증가될 수 있게 하며, 또한 연통홀(34)이 다공성 막(28)내에 제공될 수 있게 한다. 따라서, 본 예시적인 실시양태에 있어서, 다공성 막(28)은 응축 공정을 이용하여 제조된다. 응축 공정은 예를 들면, JP-B 제4945281호, JP-B 제5422230호, JP-B 제5405374호, 및 일본 특허출원 공개공보 (JP-A) 제2011-74140호에 상세하게 기재되어 있다.
다음으로, 본 예시적인 실시양태의 혈관 모델 (10)을 사용하여 약물 독성 평가가 수행되는 경우에 대해 예로서 설명한다. 약물 독성 시험을 수행할 때, 먼저 상부 채널 부재(12) 및 하부 채널 부재(14)는 이들 사이에 개재된 상태에서 다공성 막(28)과 함께 접합되어 도 2에 도시된 바와 같이 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)을 포함하는 혈관 모델(10)을 생성한다. 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)은 다공성 막(28)의 주면에 제공된다.
그리고, 펌프를 사용하여 약물을 함유하는 혈액 희석액을 튜브 (도면에 도시되지 않음) 및 관통홀(20A)을 통해 주행시켜 상부 마이크로채널(16) 내로 흐르게 하여, 상부 마이크로채널(16)의 내부를 통과시킨 다음, 관통홀(20B) 및 튜브 (도면에 도시되지 않음)를 통과시켜 혈관 모델(10)을 빠져나가게 한다.
한편, 펌프를 사용하여 배양액 또는 생리 식염수 용액을 튜브 (도면에 도시되지 않음) 및 관통홀(26A)을 통과하여 하부 마이크로채널(22) 내로 주행시켜, 하부 마이크로채널(22)의 내부를 통과시킨 다음, 관통홀(26B) 및 튜브 (도면에 도시되지 않음)를 통과시켜 혈관 모델(10)을 빠져나가게 한다. 혈액 희석액이 흐르는 상부 마이크로채널(16)의 압력은 배양액 또는 생리 식염수 용액이 흐르는 하부 마이크로채널(22)의 압력보다 높다.
독성 시험을 시작할 때, 도 3에 도시된 바와 같이, 다공성 막(28)의 상면(28A)의 전체 및 하면(28B)의 전체는 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)에 의해 각각 덮힌다. 따라서, 혈액 내의 적혈구는 다공성 막(28)을 통과할 수 없고 하부 마이크로채널(22) 내로 누출되지 않는다.
그러나, 독성 검사의 시작으로부터 일정 시간이 경과하면, 혈관내피세포층(36)은 약물의 독성에 의해 손상된다. 혈관내피세포층(36) 외에, 세포층(38)도 약물에 의해 손상된다. 이러한 손상된 부분으로 인해 다공성 막(28)을 통과하여 하부 마이크로채널(22)로 유입된 적혈구의 수를 측정함으로써, 즉 일출 시험을 수행함으로써, 혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)에 대한 약물성 손상의 수준을 평가하는 것이 가능하다.
또한, 약물의 독성에 의해 혈관내피세포층(36)이 손상되는 경우, 혈관내피세포층(36)과 세포층(38) 사이의 세포간 상호작용으로 인해 세포층(38)을 구성하는 세포의 상태가 변하며, 결과적으로, 세포층(38)에 갭이 형성될 수 있다. 갭을 통과하여 하부 마이크로채널(22)로 유입된 적혈구의 수를 측정함으로써, 즉 일출 시험을 수행함으로써, 혈관내피세포층(36)에 대한 약물성 손상의 수준 및 세포층(38)의 반응의 수준을 평가하는 것이 가능하다.
혈관내피세포층(36)과 세포층(38) 사이의 세포간 상호작용은 다공성 막(28)상의 개구 커버리지 비율이 커질수록 및 다공성 막(28)의 막 두께가 얇아질수록 더욱 활성화되므로, 이 시험은 높은 감도로 수행될 수 있다.
또한, 상기 독성 시험에 있어서, 혈액 희석액 대신에 상부 마이크로채널(16)을 통해 약물 및 트레이서를 함유하는 용액을 주행시킬 수 있다. 트레이서의 예는 형광-표지 화학 물질, 방사성동위원소-함유 화학 물질, 염료 화합물 등, 보다 구체적으로는 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 및 FITC 마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 형광 염료는 바람직하게는 여기 파장/형광 파장이 580nm/605nm인 적색이다.
혈관내피세포층(36) 및 세포층(38)에 대한 약물성 손상의 수준은 트레이서의 타입에 따라 형광 강도, 방사선 또는 색도를 측정하여 트레이서를 정량화하고, 다공성 막(28)을 통과하여 상부 마이크로채널(16)로부터 하부 마이크로채널(22) 내로 유입된 트레이서의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 예시적인 실시양태는 하부 마이크로채널(22)로부터 상부 마이크로채널(16)을 구획하는 다공성 막(28)에 있어서, 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경이 1μm 내지 20μm이고, 관통홀(30)의 개구(30A)의 개구 커버리지 비율이 30% 내지 70%이도록 구성된다. 따라서, 상부 마이크로채널(16)을 통해 주행하는 적혈구가 다공성 막(28)의 관통홀(30)을 통과하여 하부 마이크로채널(22)로 이동할 때의 일출 시험 동안, 다공성 막(28)에 의해 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있다.
또한, 본 예시적인 실시양태는 다공성 막(28)의 막 두께가 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경의 절반 이하가 되도록 구성된다. 따라서, 다공성 막(28)의 막 두께가 관통홀(30)의 개구(30A)의 평균 개구 직경의 절반보다 큰 경우와 비교하여, 적혈구가 다공성 막(28)내 관통홀(30)을 보다 수월하게 통과할 수 있다. 따라서, 본 예시적인 실시양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
또한, 본 예시적인 실시양태는 허니콤 패턴으로 배열된 관통홀(30)의 개구부(30A)로 구성되고, 다공성 막(28) 내의 관통홀(30)은 연통홀(34)을 통해 서로 연통된다. 관통홀(30)의 개구(30A)의 개구 직경의 변동 계수는 10% 이하이고, 다공성 막(28)의 다공율은 50% 이상이다. 따라서, 적혈구는 다공성 막(28)내 복수의 관통홀(30)을 보다 균일하게 통과할 수 있다. 따라서, 본 예시적인 실시양태는 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
또한, 본 예시적인 실시양태는 다공성 막(28)의 상면(28A)에 제공된 혈관내피세포층(36), 및 다공성 막(28)의 하면(28B)에 제공된 세포층(38)으로 구성된다. 세포층(38)은 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포로 구성된다. 또한, 다공성 막(28)은 파단 인장 신율이 50% 이상이고, 10% 신장에 필요한 응력이 1000gf/mm2 이하인 가요성 재료로 구성된다. 그리하여, 본 예시적인 실시양태에 있어서, 혈관 모델(10)은 실제 혈관과 더 유사하도록 구성될 수 있다.
본 개시의 예시적인 실시양태의 예에 관해 설명하였다. 그러나, 본 개시는 상기에 제한되지 않고, 본 개시의 취지를 벗어나지 않는 범위 내에서 상기 이외에도 다양한 변형이 구현될 수 있다.
예를 들면, 비록 상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)에서의 관통홀(30)의 개구(30A)는 평면에서 볼 때 원형 형상을 갖지만, 도 5에 도시된 바와 같이, 다공성 막(48)에서의 관통홀(50)의 개구(50A)는 평면에서 볼 때 타원형 형상을 가질 수 있다. 관통홀(50)의 개구(50A)를 타원형으로 구성함으로써, 예를 들면 원판형 적혈구가 관통홀(50)의 개구(50A)를 용이하게 통과할 수 있고, 혈액 중의 다른 세포는 이를 통해 통과하기 쉽지 않을 수 있다.
관통홀(50)의 개구(50A)의 개구(50A)를 타원형으로 형성하는 방법의 예는 다공성 막(48)에 도 4에 도시된 바와 같은 원형 개구(30A)를 형성한 후, 다공성 막(48)을 한 방향 (도 4의 좌우 방향)을 따라 연신하는 방법을 포함한다. 이 방법은 동일한 방향 (도 5의 좌우 방향)을 따라 장축 방향을 갖는 복수의 타원형 개구(50A)가 형성될 수 있게 해 준다.
또한, 다공성 막(48)을 연신하지 않고, 프레스 성형 등을 이용하여 다공성 막(48)에 타원형의 개구(50A)를 직접 형성해도 된다. 또한, 개구(50A)의 형상이 평면에서 볼 때 장축 및 단축을 갖는 편평한 형상인 한, 개구(50A)의 형상은 예를 들어, 정다각형을 연신시킴으로써 도달된 편평한 다각형 형상일 수 있다.
상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)에 있어서, 관통홀(30)의 개구(30A)는 다공성 막(28)의 주면 전체에 걸쳐서 규칙적인 방식으로 배열된다. 그러나, 도 6에 도시된 바와 같이, 다공성 막(58)은 관통홀(60)의 개구(60A)가 형성되는 다공성 영역(62) 및 관통홀(60)의 개구(60A)가 형성되지 않은 비-다공성 영역(64) (도 6에서 이중 점선으로 표시된 영역)을 구비할 수 있다.
구체적으로, 다공성 막(58)에 있어서, 도 1에 도시된 상부 마이크로채널(16)을 구성하는 오목부(18)의 입구(18A) 부근 및 출구(18B) 부근, 및 도 1에 도시된 하부 마이크로채널(22)을 구성하는 오목부(24)의 입구(24A) 부근 및 출구(24B) 부근에 배치된 부분들은 예를 들어 비-다공성 영역(64)으로서 구성된다.
일반적으로, 혈액과 같은 액체의 흐름은 입구(18A, 24A) 및 출구(18B, 24B)에서 쉽게 교란된다. 따라서, 비-다공성 영역(64)으로서 입구(18A, 24A) 부근 및 출구(18B, 24B) 부근에 다공성 막(58)을 구성함으로써, 상부 마이크로채널(16) 및 하부 마이크로채널(22)에서의 혈액과 같은 액체의 흐름이 조절될 수 있다. 따라서, 다공성 막(58)은 일출 시험의 정확도를 추가로 개선할 수 있다.
본 개시의 혈관 모델은 적혈구와 같은 누출 물질의 약물 독성을 동반한 혈관 외부로의 이동이 다공성 막에 의해 방해 받는 것이 억제되는 상태에서 일출 시험을 수행하게 해 줄 수 있다. 따라서, 본 개시의 혈관 모델은 높은 정확도로 독성 시험을 수행할 수 있는 혈관 모델로서 유용할 수 있다.
본 개시의 예시적인 실시양태의 예에 관한 상세한 설명이 이어진다. 본 개시의 예시적인 실시양태는 이하에 예시된 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도 7a는 실시예 1의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다. 실시예 1에서는 복수의 관통홀의 개구는 허니컴 패턴으로 배열되었고 관통홀은 연통홀을 통해 연통된, 상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)과 유사하게 폴리카보네이트로 형성된 다공성 막이 사용되었다. 실시예 1의 다공성 막에서 개구의 평균 개구 직경은 5μm이고, 개구의 개구 커버리지 비율은 55%이고, 다공성 막의 막 두께는 2.2μm이고, 개구의 개구 직경의 변동 계수는 3.5%이고, 다공성 막의 다공율은 75%이고, 파단 인장 신장률은 250%이고, 10% 신장에 필요한 응력은 100gf/mm2이었다.
제조된 다공성 막의 미세 구조는 프로파일 스캐닝 레이저 현미경 (제품명: VK-X100, 일본 Keyence사 제조)을 사용하여 측정하였다. 단일 스크린에 50개 이상의 개구가 나타나는 배율을 사용하여 관찰하였다. 관찰된 현미경사진을 기초로, 각각의 개구 직경 D를 측정하고 개구 직경 D의 평균 개구 직경 DAV 및 변동 계수 σD를 구하기 위해, 하나의 스크린 상에 존재하는 개구에 대해 이미지 분석을 수행하였다. 개구 직경의 변동 계수 (백분율로 제공)는 계산 (σD/DAV)Υ100을 사용하여 달성될 수 있다.
평균 개구 직경 및 개구 커버리지 비율은 2D 이미지 분석 소프트웨어 WinROOF (Mitani Corp.)를 사용하여 현미경사진상에서 이진화 처리 및 이미지 처리를 수행함으로써 달성되었다. 다공성 막의 막 두께는 프로파일 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 10개 지점에서 측정된 개구부 두께의 평균값이다.
다공성 막의 단면을 주사 전자 현미경 (SEM, 제품명: SU8030, 일본 Hitachi 제조)을 사용하여 관찰하였고 관통홀과 동등한 구의 직경을 다공성 막의 다공율로서 계산하였다. 평가될 다공성 막 샘플을 마이크로톰 (제품명: FCS, 오스트리아 Reichert 제조)으로 세절하여 단면 관찰용 샘플을 생성하고, 단면 관찰용 샘플의 표면을 Os 층으로 두께 6nm로 코팅하고, 샘플을 2kV의 가속 전압을 사용하여 SEM으로 관찰하였다. 다공성 막의 파단 인장 신율 및 10% 신장에 필요한 응력은 FUDOH RHEO METER RT-2002D·D (Rheotech Corp. 제조)를 사용하여 측정되었다
도 7b는 비교예 1의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다. 비교예 1에서는 트랙 에칭 공정에 의해 개구를 형성하는 폴리카보네이트로 형성된 종래 기술의 다공성 막이 사용되었다. 또한, 비교예 1의 다공성 막에 있어서의 개구의 평균 개구 직경은 5.7 ㎛이고, 개구의 개구 커버리지 비율은 12.4%이고, 다공성 막의 막 두께는 10.6 ㎛이고, 개구의 개구 직경의 변동 계수는 35%이고, 다공성 막의 다공률은 15%이고, 파단 인장 신율은 150%이고, 10% 신장에 필요한 응력은 5800gf/mm2이었다.
다공성 막은 양면에 의료용지가 부착되어 제조된다. 다공성 막의 일면의 의료용지를 핀셋을 사용하여 제거하고, 의료용지가 제거된 면은 하부 채널 부재에서 아래로 향하게 설정한다. 이어서, 다공성 막을 면봉을 사용하여 에탄올에 침지시켜 다공성 막 및 하부 채널 부재를 함께 접합시킨다.
다음으로, 다공성 막의 타면의 의료용지를 핀셋을 사용하여 제거하고, 상부 채널 부재를 다공성 막의 타면에 적층한다. 상부 채널 부재와 하부 채널 부재의 위치를 현미경상에서 체크하면서 정렬시키고, 상부 채널 부재와 하부 채널 부재를 함께 접합시킨다. 그리하여, 실시예 1의 혈관 모델 및 비교예 1의 혈관 모델이 각각 제조되었다.
실시예 1 및 비교예 1에서, 다공성 막의 적혈구에 대한 투과성을 평가하기 위하여, 사용된 다공성 막은 그 주면에 제공된 혈관내피세포층(36) 또는 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포들의 세포층을 갖지 않았다.
실시예 2에서는, 실시예 1의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포층을 형성하고, 다공성 막의 하면에 래트 평활근세포로 구성된 세포층을 형성함으로써 세포층이 부착된 혈관 모델을 제조하였다.
비교예 2에서는, 비교예 1의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포층을 형성하고, 다공성 막의 하면에 래트 평활근세포로 구성된 세포층을 형성함으로써 세포층이 부착된 혈관 모델을 제조하였다.
실시예 2 및 비교예 2에 있어서, Angio-Proteomie 제조의 래트 동맥내피세포를 래트 혈관내피세포에 사용하였고, Lonza 제조의 래트 대동맥평활근세포를 래트 평활근세포에 사용하였다. 하부 마이크로채널을 초기에 세포 농도가 3x106세포/ml인 래트 평활근세포의 세포 현탁액 100μL로 파종하였다. 배양 1일 후, 상부 마이크로채널에 세포 농도가 3x106세포/ml인 래트 혈관내피세포의 세포 현탁액 100μL로 파종하였다. 배양 2 일 후, 실시예 2 및 비교예 2의 세포층 부착 혈관 모델을 수득하였다.
3.7x105세포/ml의 적혈구 수를 갖는 혈액 희석액을 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 생리 식염수 용액을 하부 마이크로 채널을 통해 주행시켰다. 혈액 희석액 및 생리 식염수 용액의 유체 전달 속도는 500μL/분으로 설정하고, 상부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 8.7kPa로 설정하고, 하부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 1.3kPa로 설정하여 실제 혈관 내부의 혈류 및 혈압 조건에 근접한 파라미터를 확립하였다.
유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 생리 식염수 용액 내부의 적혈구의 수는 실시예 1에서는 9.2Υ104세포/ml의 적혈구 수를 제공하고 비교예 1의 혈관 모델에서는 2.2x104세포/ml의 적혈구 수를 제공하였다.
이 시험은 실시예 1 및 비교예 1의 다공성 막 모두가 혈압의 조건과 동등한 조건 하에서 적혈구에 대한 투과성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비교예 1의 다공성 막과 비교하여, 실시예 1의 다공성 막은 적혈구에 대해 보다 쉽게 투과될 수 있어, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막이 적혈구의 이동이 방해되는 것을 억제할 수 있음을 확인시켜 준다.
트레이서에 대해 1.81x106비드/ml 농도의 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액을 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지를 하부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. 형광 비드는 직경이 4㎛이고, 여기 파장이 580nm이고 형광 파장이 605nm인 적색 형광 염료로 표지되었다. 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액 및 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지의 유체 전달 속도는 500μL/분으로 설정하고, 상부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 8.7kPa로 설정하고, 하부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 1.3kPa로 설정하여 실제 혈관 내부의 혈류 및 혈압 조건에 근접한 파라미터를 확립하였다.
유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 배양 배지 내부의 형광 비드의 수는 실시예 2에서는 6.5x104비드/ml의 형광 비드 수를 제공하고 비교예 2에서는 9.2x103비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 1.81x106비드/ml로 형광 비드를 함유하는 생리 식염수 희석액을 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 생리 식염수를 하부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. 유체 전달 속도는 500μL/분으로 설정되었다. 하부 마이크로채널 내부의 형광 비드의 수는 실시예 1에서는 1.7Υ105비드/ml의 형광 비드 수를 제공하고 비교예 1에서는 4.3Υ104비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 이 시험은 다공성 막의 양면에 세포층을 형성하는 것이 다공성 막의 형광 비드에 대한 투과성을 저감시키고, 다공성 막에 배리어성을 부여한다는 것을 확인할 수 있었다.
약물인 사이토칼라신을 상부 마이크로채널과 하부 마이크로채널 각각을 통해 하루 동안 50μg/ml의 농도 및 0.7μL/min의 유속으로 주행시킴으로써 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 다공성 막의 양면에 있는 세포층을 약물에 노출시켰다.
약물 노출 후, 상기 기재된 세포층 부착 혈관 모델에 대한 형광 비드 투과성 시험과 동일한 방법을 사용하여 형광 비드 투과성 시험을 수행하였다. 유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 배양 배지 내부의 형광 비드의 수는 실시예 2에서는 1.7Υ105비드/ml의 형광 비드 수를 제공하고 비교예 2에서는 6.7Υ103비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다.
이 시험은 약물에 의해 세포층이 손상된 후 실시예 2 및 비교예 2의 세포층 부착 혈관 모델에서 형광 비드가 다공성 막을 통과할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 비교예 2의 다공성 막에 비하여, 실시예 2의 다공성 막은 형광 비드에 대해 보다 투과성이었으므로, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 형광 비드의 이동이 방해되는 것을 억제하게 해 주는 것을 확인시켜준다. 따라서, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 고감도로 혈관 모델에서 약물 독성의 평가를 가능하게 한다는 것이 확인되었다.
실시예 3에서는, 실시예 2와 유사하게, 세포층 부착 혈관 모델을 다공성 막의 상면에 형성된 래트 혈관내피세포층과 다공성 막의 하면에 형성된 래트 평활근세포층으로 제조하였다.
비교예 3에서는, 비교예 2와 유사하게, 세포층 부착 혈관 모델을 다공성 막의 상면에 형성된 래트 혈관내피세포층과 다공성 막의 하면에 형성된 래트 평활근세포층으로 제조하였다.
실시예 3 및 비교예 3에 사용된 세포는 실시예 2 및 비교예 2에 사용된 것과 동일하였다. 세포층을 형성하기 위하여, 하부 마이크로채널을 초기에 세포 농도가 3x106세포/ml인 래트 평활근세포의 세포 현탁액 100μL로 파종하였다. 배양 1일 후, 상부 마이크로채널을 세포 농도가 1x106세포/ml인 래트 혈관내피세포의 세포 현탁액 100μL로 파종하고 6시간 동안 배양하였다. 이어서, 각각의 배양 배지 (래트 EC 배지/SMC 배지)를 펌프를 사용하여 0.7μL/분의 유체 전달 속도로 각 채널을 통해 주행시켰다. 배양 2일 후, 실시예 3 및 비교예 3의 세포층 부착 혈관 모델을 수득하였다.
실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 하부 마이크로채널을 폐쇄하고, 트레이서에 대해 12.5μg/50μl의 농도로 FITC-덱스트란 (46945, Sigma-Aldrich 제조)을 함유하는 배양 배지 희석액을 상부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. FITC-덱스트란을 함유하는 배양 배지 희석액의 유체 전달 속도는 7μL/분으로 설정하였다.
채널을 통해 FITC-덱스트란을 주행시킨 지 2분 후, 도립 현미경 (제품명: Eclipse Ts2, Nikon 제조)을 사용하여 마이크로채널에서의 형광을 이미지화 하였다. 이미지화 파라미터에 대해, 배율: 4배, 이득: 1600, 및 노출 시간: 60ms가 사용되었다. 이들 결과는 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다. 실시예 3 및 비교예 3 양쪽 모두에서, 하부 채널에서 형광이 관찰되지 않았다. 이는 FITC-덱스트란이 상부 채널에서 하부 채널로 침투하지 않았음을 나타낸다. 이 시험은 다공성 막의 양면에 세포층을 형성하는 것이 FITC-덱스트란 투과를 억제하고, 다공성 막에 배리어성을 부여함을 확인할 수 있었다.
약물인 페놀도팜을 상부 마이크로채널을 통해 하루 동안 500ng/ml의 농도 및 0.7μL/min의 유속으로 주행시킴으로써 실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 세포층 부착 혈관 모델의 다공성 막의 혈관내피세포층을 약물에 노출시켰다.
약물 노출 후, 상기 기재된 세포층 부착 혈관 모델에 대한 FITC-덱스트란 투과성 시험과 동일한 방법을 사용하여 FITC-덱스트란 투과성 시험을 수행하였다. 이들 결과는 도 9a 및 도 9b에 도시하였다. 실시예 3의 세포층 부착 혈관 모델에서는, 상부 마이크로채널에 추가하여, 하부 마이크로채널을 포함하여 광범위에 걸쳐서 형광이 관찰되었다. 비교예 3의 세포층 부착 혈관 모델에서는, 하부 마이크로채널에서 관찰된 형광은 최소였다. 이 시험은 약물에 의해 세포층이 손상된 후 실시예 3 및 비교예 3 양쪽 모두의 세포층 부착 혈관 모델에서 FITC-덱스트란이 다공성 막을 통과할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 3의 다공성 막은 비교예 3의 다공성 막보다 FITC-덱스트란에 대해 보다 투과성이었으므로, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 FITC-덱스트란의 이동을 방해하지 않는다는 것을 확인시켜준다. 따라서, 본 예시적인 실시양태의 다공성 막은 고감도로 혈관 모델에서 약물 독성의 평가를 가능하게 한다는 것이 확인되었다.
실시예 4에서는, 실시예 1의 혈관 모델의 상부 및 하부 채널의 직선 부분에 12mmΥ0.2mm 개구를 제공함으로써 혈관 모델을 제조하였다. 개구는 하부 채널 부재와 다공성 막 사이에 0.2mm 폭의 슬릿이 형성된 폴리프로필렌 보강 부재를 삽입함으로써 형성되었다. 보강 부재는 100㎛의 두께를 가졌다. 도 10a 및 도 10b는 실시예 4의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다.
실시예 5에서는, 실시예 1의 혈관 모델의 다공성 막에 60°C에서 15분 동안 콜라겐 (5005-100ML, Advanced BioMatrix 제조)을 분무한 다음, 콜라겐을 건조시켜 두꺼운 코팅을 형성하고, 이어서 다공성 막의 상면에는 래트 혈관내피세포층을 형성하고 다공성 막의 하면에는 래트 평활근세포층을 형성함으로써 세포층 부착 혈관 모델을 제조하였다. 도 11은 실시예 5의 다공성 막의 현미경사진을 도시한다.
실시예 6에서는, 실시예 4의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포층을 형성함으로써 단일 세포층이 부착된 혈관 모델을 제조하였다.
트레이서에 대해 1.81x106비드/ml 농도의 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액을 실시예 6에서 제조된 단일 세포층 부착 혈관 모델의 상부 마이크로채널을 통해 주행시키고, 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지를 하부 마이크로채널을 통해 주행시켰다. 형광 비드는 직경이 4㎛이고, 여기 파장이 580nm이고 형광 파장이 605nm 인 적색 형광 염료로 표지되었다. 형광 비드를 함유하는 배양 배지 희석액 및 형광 비드를 함유하지 않은 배양 배지의 유체 전달 속도는 500μL/분으로 설정하고, 상부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 8.7kPa로 설정하고, 하부 마이크로채널의 내부 압력은 대략 1.3kPa로 설정하여 실제 혈관 내부의 혈류 및 혈압 조건에 근접한 파라미터를 확립하였다.
유체 전달을 시작한 후 일정 시간이 경과한 후 하부 마이크로채널 내부, 즉 배양 배지 내부의 형광 비드의 수는 실시예 6에서 2.67x104비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 실시예 4의 혈관 모델의 상부 채널을 통해 1.81x106비드/ml의 형광 비드를 함유하는 생리 식염수 희석액을 주행시키는 것 및 500μL/분의 유체 전달 속도로 하부 채널을 통해 생리 식염수를 주행시키는 것은 실시예 4에서 7.23x105비드/ml의 형광 비드 수를 제공하였다. 이 시험은 다공성 막의 단일면에 세포층을 형성하는 것이 다공성 막의 형광 비드에 대한 투과성을 저감시키고, 다공성 막에 배리어성을 부여한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7에서는, 실시예 1의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 유도만능줄기세포로부터 유래된 인간 혈관내피세포층을 형성하고 다공성 막의 하면에 인간 간엽줄기세포를 형성함으로써 세포층 부착 혈관 모델을 생성하였다.
실시예 8에서는, 복수의 관통홀의 개구가 허니콤 패턴으로 배열되고 관통홀이 연통홀을 통해 연통되는, 상기 예시적인 실시양태의 다공성 막(28)과 유사하게 폴리카보네이트로 형성된 다공성 막이 사용되었다. 실시예 8의 다공성 막에서 개구의 평균 개구 직경은 3μm이고, 개구의 개구 커버리지 비율은 52%이고, 다공성 막의 막 두께는 1.2μm이며, 개구의 개구 직경의 변동 계수는 5.0%이고, 다공성 막의 다공율은 80%였다.
실시예 9에서는, 실시예 8의 혈관 모델을 취하여 다공성 막의 상면에 래트 혈관내피세포를 형성하고, 다공성 막의 하면에 래트 평활근세포를 형성함으로써 세포층 부착 혈관 모델을 제조하였다.

Claims (8)

  1. 각 마이크로채널이 형성되는 대향면을 각각 포함하는, 서로 상호 대향하는 한 쌍의 채널 부재; 및
    두께 방향으로 관통하는 복수의 관통홀을 포함하고, 한 쌍의 채널 부재의 대향면 사이에 배치되고 마이크로채널 사이를 구획하는 다공성 막을 포함하고,
    다공성 막에는 혈관내피세포층이 제공되어 마이크로채널 중 하나에 대향하는 일면을 덮고, 관통홀의 평균 개구 직경은 1μm 내지 20μm이고, 관통 홀의 개구 커버리지 비율은 30% 내지 70%인 혈관 모델.
  2. 제1항에 있어서, 다공성 막의 막 두께는 관통홀의 평균 개구 직경의 절반 이하인 혈관 모델.
  3. 제1항에 있어서, 다공성 막의 내측에 형성되는, 관통홀을 서로 연통시키는 연통홀을 추가로 포함하고,
    관통홀은 허니콤 패턴으로 배열되며;
    관통홀의 개구 직경의 변동 계수는 10% 이하이며;
    다공성 막의 다공율은 50% 이상인 혈관 모델.
  4. 제1항에 있어서, 다른 하나의 마이크로채널에 대향하는 다공성 막의 타면에 제공되는, 평활근세포, 간엽줄기세포, 주피세포, 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포들의 세포층을 추가로 포함하는 혈관 모델.
  5. 제1항에 있어서, 다공성 막의 파단 인장 신율은 50% 이상이고;
    다공성 막의 10% 신장에 필요한 응력은 1000gf/mm2 이하인 혈관 모델.
  6. 제1항에 있어서, 관통홀은 평면에서 볼 때 편평한 형상을 가지며, 장축 및 단축을 포함하는 혈관 모델.
  7. 제1항에 있어서, 다공성 막은 관통홀이 형성되는 다공성 영역 및 관통홀이 형성되지 않는 비-다공성 영역을 포함하는 혈관 모델.
  8. 제1 항의 혈관 모델을 제공하는 단계;
    혈관내피세포층이 제공되는 다공성 막의 면에 대향하는 마이크로채널에서 약물을 함유하는 혈액 희석액을 주행시키는 단계; 및
    다공성 막의 타면에 대향하는 마이크로채널 내로 누출되는 적혈구의 수를 계수하는 단계를 포함하는,
    약물을 함유한 혈액 희석액을 사용하여 일출 시험을 실행하는 방법.
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