KR20190118954A

KR20190118954A - 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20190118954A
Application number: KR1020190028106A
Authority: KR
Inventors: 박의균
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-11
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2019-10-21
Also published as: KR102181571B1

Abstract

본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 시클로피록스는 파골세포에서 NF-κB 신호전달 경로를 억제하여 파골세포의 분화 및 기능을 억제하는 바, 상기와 같은 효과를 가지는 시클로피록스는 골다공증을 포함한, 파골세포 과다 분화 또는 과다 활성화로 인해 야기되는 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating bone diseases comprising ciclopirox}

본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골 질환은 생체 내에서 뼈를 흡수하는 파골세포와 뼈를 형성하는 조골세포의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 대표적인 골 질환인 골다공증은 파골세포와 조골세포의 골 항상성 조절 불균형으로 인해 발생하며, 조골세포에 비하여 파골세포의 활성이 증가함으로써 총 골량(total bone mass)이 감소하게 되고, 이에 경미한 충격에도 뼈가 쉽게 부서지게 된다.

상기 골 항상성 조절의 불균형은 노화, 전신질환, 폐경 등의 다양한 원인으로 인하여 발생할 수 있으며, 골밀도 감소 및 골조직의 미세구조 퇴화는 골절의 위험을 증가시켜 전신에 영향을 미친다. 즉, 낡은 뼈의 소멸과 새로운 뼈의 생성이 균형있게 유지되면서 골밀도가 유지되는데 여러 가지 원인으로 인해 새로운 뼈의 대체가 원활히 이루어지지 않아 뼈가 엉성해지고 이런 과정이 반복되면서 뼈가 얇아지고 부러지거나 부서질 위험성이 커지게 되는 것이다.

현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 화합물로는 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 호르몬 제제(랄록시펜), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제, 칼슘 제제 등이 있으나, 일반적으로 골다공증 치료제에 대한 환자의 순응도가 낮고, 지속적인 복용이 잘 이루어지지 않는다는 단점이 있다. 경구용 비스포스네이트 제제는 상부 위장에 부작용이 있을 수 있으며, 오랫동안 사용하면 뼈의 리모델링(remodeling)을 과도하게 억제하고 골절과 미세 손상을 회복하지 못하게 하여 지나친 골화와 미소 균열 증가를 유발하는 심각한 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다. 호르몬 대체 요법은 치료 효과만큼 그에 따른 부작용이 크고, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH)은 매일 피하로 주사해야 되는 불편함과 비싼 비용을 지불해야 하는 단점이 있다. 또한, 칼슘과 비타민 D 보급만으로는 치료 효과가 불충분하다는 한계가 있다. 더욱이, 골다공증은 약물의 단기 투여로 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이다.

따라서, 상기와 같은 부작용을 최소화하고 골 질환 치료에 우수한 약효를 가지는 새로운 화합물의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0028018호 (2018.03.15. 공개)

본 발명의 목적은 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 NF-κB 신호전달 억제용 시약 조성물 또는 파골세포 마커 발현 억제용 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) NF-κB 신호전달 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 파골세포 마커 발현 억제용 시약 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 시클로피록스는 파골세포에서 NF-κB 신호전달 경로를 억제하여 파골세포의 분화 및 기능을 억제하는 바, 상기와 같은 효과를 가지는 시클로피록스는 골다공증을 포함한, 파골세포 과다 분화 또는 과다 활성화로 인해 야기되는 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 시클로피록스에 의한 파골세포 분화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 시클로피록스 처리 후 골수 대식세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 3은 시클로피록스에 의한 파골세포 특이적 마커의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다[TRAP(Acp5), cathepsin K(Ctsk), DC-STAMP(Dcstamp), MMP9(Mmp9), NFATc1(Nfatc1)].
도 4는 시클로피록스에 의한 액틴 고리 형성 및 NFATc1 국소화(localization) 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 시클로피록스에 의한 골 흡수 구멍 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 시클로피록스에 의한 RANKL 유도 NF-κB 신호전달 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 난소 절제로 유도된 골다공증 마우스 동물모델에서 시클로피록스에 의한 골 손실 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 난소 절제로 유도된 골다공증 마우스 동물모델에서 시클로피록스에 의한 파골세포 및 골 흡수 억제 효과를 나타낸 것이다.

본 발명의 발명자들은 미국 식약처의 허가된 약물(US FDA-approved drugs)에 대하여 파골세포의 분화 및 기능에 미치는 영향을 분석한 결과, 시클로피록스가 파골세포의 분화 및 기능을 억제하는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 조성물은 NF-κB 신호전달을 억제하여 파골세포의 분화 및 기능을 억제할 수 있다.

상기 조성물은 TRAP, cathepsin K, DC-STAMP, MMP9 및 NFATc1으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 파골세포 마커의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

상기 파골세포 마커는 TRAP, cathepsin K, DC-STAMP, MMP9 및 NFATc1으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 파골세포 형성(Osteoclastogenesis)

6주령의 수컷 C57BL/6 마우스(대한바이오링크)로부터 골수세포(bone marrow cell; BMC)를 채취하였다. 골수세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 M-CSF(30 ng/mL)를 포함하는 α-MEM 배지를 이용하여 3일 동안 배양하였다.

파골세포를 형성하기 위해, 골수 대식세포(bone marrow macrophage; BMM)를 96 웰 플레이트에 접종하고, RANKL(20 ng/mL) 및 M-CSF(10 ng/mL)의 존재 하에 다양한 농도(0, 1, 2.5, 5 μM)의 시클로피록스(ciclopirox)와 함께 배양하였다.

배양 4일 후, 세포를 고정시키고, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 세포를 염색하였다. 이후, 현미경을 사용하여 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP 양성 다핵세포(multinucleated cell; MNC)를 계수하였다.

실시예 2: 세포 생존율 분석

골수 대식세포의 세포 생존율은 MTT 분석(Sigma-Aldrich)으로 측정하였다. 간략하게, 골수 대식세포를 M-CSF(10 ng/mL)의 존재 하에 다양한 농도의 시클로피록스와 함께 배양하였다. 배양 3일 후, 각 웰에 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 마이크로플레이트 판독기(BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 3: 정량 실시간 PCR 분석

TRI 용액(Bioscience, Seoul, Korea)을 이용하여 세포로부터 총 RNA는 분리하고, SuperScript II 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 정량 실시간 PCR은 SYBR green(Enzynomics, Daejeon, Korea) 및 Topreal qPCR 2T PreMIX를 사용하여 LightCycler 1.5 real-time PCR(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)에서 수행하였으며, TRAP(Acp5), cathepsin K(Ctsk), MMP9(Mmp9), DC-STAMP(Dcstamp), NFATc1(Nfatc1)의 발현 수준은 아래의 프라이머를 사용하여 확인하였다.

Acp5	5′-TCCCCAATGCCCCATTC-3‘	5′-CGGTTCTGGCGATCTCTTTG-3′
Ctsk	5′-GGCTGTGGAGGCGGCTAT-3′	5′-AGAGTCAATGCCTCCGTTCTG-3′
Mmp9	5′-AAAGACCTGAAAACCTCCAACCT-3′	5′-GCCCGGGTGTAACCATAGC-3′
Dcstamp	5′-CTTCCGTGGGCCAGAAGTT-3′	5′-AGGCCAGTGCTGACTAGGATGA-3′
Nfatc1	5′-ACCACCTTTCCGCAACCA-3′	5′-TTCCGTTTCCCGTTGCA-3′

실시예 4: 웨스턴 블롯 분석

단백질 가수분해 효소(protease) 및 인산 가수분해 효소(phosphatase) 억제제가 포함된 RIPA 완충액을 사용하여 총 단백질을 추출하였다. 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였고, 동량의 총 단백질(30 μg)을 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 이후, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membranes, Whatman, Florham Park, NJ, USA)으로 단백질을 이동시켰다. 멤브레인에 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해, TBS-T(25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.1% Tween 20)에 용해된 3% 탈지유로 블로킹(blocking) 하였다. 이후, 멤브레인을 1차 항체[phopho-p38 (#9211), phopho-ERK (#9101), phopho-JNK (#9251), phopho-AKT (#4058), phopho-IκBα (#2859) (Cell Signaling Tech.)]와 4℃에서 밤새 배양하고, 2차 항체[Goat anti-rabbit IgG (#31460) (Thermo Fisher Scientific)]와 상온에서 배양한 다음 WesternBright enhanced chemiluminescent 기질(Advansta, Menlo Park, CA, USA)을 사용하여 단백질을 검출하였다.

실시예 5: 면역형광법 분석

골수 대식세포는 시클로피록스(2.5 μM) 존재 또는 부재 하에 RANKL(20 ng/mL) 및 M-CSF(10 ng/mL)와 유리 커버 슬립에서 4일 동안 배양하였다. 이후, 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정시키고, 0.25% Triton X-100을 사용하여 세포를 투과시킨 다음 블로킹 완충액(인산완충식염수에 용해된 3% 우혈청 알부민)으로 1시간 동안 블로킹 하였다. 이후, 세포를 anti-NFATc1 항체와 배양하고, Alexa Fluor-488이 접합된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 배양하였다. F-actin은 로다민(rhodamine)이 접합된 팔로이딘(phalloidin)(Cytoskeleton, Denver, CO, USA) 및 DAPI(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 염색하였다. 형광 이미지는 BX51 형광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 획득하였다.

실시예 6: 골 흡수 구멍 분석(Resorption pit assay)

마우스 골 대식세포를 뼈 조각(IDS Nordic, Herlev, Denmark)에 접종한 다음 M-CSF(10 ng/mL) 및 RANKL(20 ng/mL)과 함께 3일 동안 배양하여 파골세포 분화를 유도하였다. 이후, 세포를 시클로피록스(2.5 μM) 존재 또는 부재 하에 2일 동안 배양하였다. 모든 세포를 뼈 조각에서 제거하고, 구멍 부분을 헤마톡실린으로 염색하여 시각화 하였다. 재흡수된 구멍의 면적은 i-Solution 영상 분석 소프트웨어(IMT i-Solution, 대전, 한국)를 사용하여 측정하였다.

실시예 7: 난소 절제 동물모델

1) 난소 절제 동물모델 제작

8주령의 암컷 ICR 마우스(대한바이오링크)는 일주일 동안의 순화 과정을 거친 후 실험에 사용하였다. 아베르틴(avertin)으로 마우스를 마취시킨 후 등의 털을 제거하고, 미세가위로 피부와 근육층을 절개하여 난소를 절제하였다. 난소를 완전히 절제한 후 봉합사로 피부와 근육층을 봉합하였다. 난소를 적출하지 않고 피부와 근육층을 봉합한 비 난소 절제 정상대조군(Sham), 난소를 절제하여 골다공증을 유발시킨 대조군(OVX), 난소 절제 후 시클로피록스(5 mg/kg)를 복강 투여한 실험군(OVX+Cic)으로 분류하여 4주간 실험을 진행하였다.

2) Micro-CT 분석

마우스를 희생시키고 경골을 절취하여 고정시킨 다음 micro-CT(Skyscan 1272, Bruker, Kontich, Belgium)를 이용하여 3차원 영상 이미지를 재건하고 다양한 골 지표를 분석하였다.

3) 조직학적 분석

고정된 경골은 EDTA로 탈회한 후 통상적인 방법에 따라 파라핀에 포매하고 절편을 제작하였다. 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin; H&E) 및 TRAP 염색을 통해 조직학적 분석을 수행하였다.

4) 혈청 분석

실험 종료 후 마우스에서 채취한 혈액에서 혈청을 분리하고, 혈청 내 CTX 함량은 RatLapsTM(CTX-1) EIA (Immunodiagnosticsystems Ltd.)를 사용하여 분석하였다.

실시예 8: 통계 분석

모든 실험은 3회 반복 수행하였으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시하였다. 통계 분석은 two-tailed Student's t-test 또는 one-way analysis of variance with Tukey's multiple comparison post-hoc test로 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험예 1: 시클로피록스에 의한 RANKL 유도 파골세포 분화 억제

RANKL 유도 파골세포 분화에 있어서 시클로피록스가 미치는 영향을 분석하기 위해, 골수 대식세포를 RANKL(20 ng/mL) 및 M-CSF(10 ng/mL)의 존재 하에 다양한 농도(0, 1, 2.5, 5 μM)의 시클로피록스와 4일 동안 배양하여 TRAP 양성 다핵세포로 분화시켰다.

그 결과, 도 1과 같이, 시클로피록스에 의해 파골세포의 분화가 억제되고, 2.5 μM의 농도에서 TRAP 양성 골수 대식세포의 분화가 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(약 97% 억제).

상기와 같은 시클로피록스의 억제 효과가 세포 독성에 의한 것인지 여부를 확인하기 위해, 파골세포 전구체의 생존율을 MTT 분석으로 평가하였다.

그 결과, 도 2와 같이, 시클로피록스는 골수 대식세포에 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다(최대 2.5 μM).

실험예 2: 시클로피록스에 의한 파골세포 특이적 마커 발현 억제

시클로피록스에 의한 파골세포의 특이적 마커 발현 수준을 실시간 PCR(qPCR)로 분석하였다. 도 3과 같이, RANKL은 TRAP(Acp5), cathepsin K(Ctsk), DC-STAMP(Dcstamp), MMP9(Mmp9), NFATc1(Nfatc1)의 발현 수준을 현저하게 증가시킨 반면, 시클로피록스는 RANKL에 의해 증가된 마커의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.

다음으로 골수 대식세포를 파골세포로 분화시키는 주요 전사인자인 NFATc1의 핵 국소화를 면역형광법으로 평가하였다. 그 결과, 도 4와 같이, 핵 NFATc1에 대하여 양성인 세포의 수가 시클로피록스에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다. 또한, Dcstamp의 감소 수준에 따라 다핵 거대세포의 형성이 시클로피록스에 의해 억제되었다. 상기 결과는 시클로피록스가 파골세포 분화 및 기능에 관여하는 RANKL 유도 유전자의 발현을 억제함을 보여준다.

실험예 3: 시클로피록스에 의한 골 흡수 활성 억제

성숙 및 활성 파골세포는 흡수 단계 동안 세포와 골 기질(bone matrix) 사이에 sealing zone을 만드는 액틴 고리 구조를 포함한다. 이에, 골 흡수 구멍 분석을 수행하여 시클로피록스가 파골세포의 활성을 조절할 수 있는지 여부를 평가하였다.

그 결과, 도 5와 같이, 시클로피록스는 양성 대조군과 비교하여 재흡수 구멍의 형성을 현저하게 억제하였다(80% 감소). 상기 결과는 시클로피록스가 파골세포의 골 흡수 활성을 강력하게 억제함을 보여준다.

실험예 4: 시클로피록스에 의한 RANKL 유도 NF-κB 신호전달 억제

시클로피록스가 파골세포 분화와 활성화를 극적으로 억제함을 입증한 후, 시클로피록스가 RANK 신호전달 경로를 억제하는지 여부를 평가하였다.

도 6과 같이, RANKL 자극 후 p38, Akt/PKB, 세포 외 신호 관련 키나아제(ERK), c-Jun N 말단 키나아제(JNK) 및 IκBα의 인산화가 유도되었으며, 시클로피록스의 전처리는 RANKL 유도 IκBα의 인산화를 감소시킨 반면, p38, Akt/PKB, ERK 및 JNK의 인산화는 감소시키지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 시클로피록스가 NF-κB 신호전달의 활성화를 억제하여 RANKL 유도 파골세포 분화를 억제함을 보여준다.

실험예 5: 난소 절제 동물모델에서 시클로피록스의 효과

난소를 절제하여 골다공증을 유발한 마우스 동물모델에서 시클로피록스의 효과를 평가하였다.

도 7과 같이, Micro-CT를 통해 획득한 3차원 영상 이미지를 통해, 난소 절제로 골다공증을 유발한 대조군(OVX)이 비 난소 절제 정상대조군에 비하여 골 손실이 심화된 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 골 손실은 시클로피록스에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 시클로피록스는 골밀도(BMD)와 골부피(BV/TV(%))를 유의하게 개선시켰다.

또한, 도 8과 같이, 조직학적 분석을 통해, 난소 절제로 골다공증을 유발한 대조군(OVX)에 의해 감소된 섬유주(trabeculae)의 수적 회복을 확인할 수 있었고, 파골세포의 수 또한 시클로피록스에 의해 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 혈청 분석에서도 골 흡수 마커인 CTX가 시클로피록스에 의해 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.

상기 결과는 시클로피록스에 의해 파골세포가 감소함으로써 골 흡수가 감소되고, 결과적으로 골 지표가 개선되는 것을 보여준다. 이에, 시클로피록스는 골다공증을 포함한 여러 종류의 파골세포 과기능에 의해 유발되는 골 질환 치료에 적용이 가능할 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB 신호전달을 억제하여 파골세포의 분화 및 기능을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 TRAP, cathepsin K, DC-STAMP, MMP9 및 NFATc1으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 파골세포 마커의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) NF-κB 신호전달 억제용 시약 조성물.
시클로피록스를 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 파골세포 마커 발현 억제용 시약 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 파골세포 마커는 TRAP, cathepsin K, DC-STAMP, MMP9 및 NFATc1으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 시험관 내 파골세포 마커 발현 억제용 시약 조성물.