KR20190092446A - 광학 현미경 검사용 투명 시편의 준비방법 - Google Patents
광학 현미경 검사용 투명 시편의 준비방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 광학 현미경 검사용 투명 생물학적 시편의 제조 방법에 관한 것으로서, 생물학적 조직이 알칼리성 전기영동 수용액에 침지된 후 상기 전기영동 수용액 중에서 전계에 노출되어 상기 조직은 전기영동으로 정화된다. 상기 전기영동 용액은 양이온이 50Da 이상의 분자량을 갖는 완충 염기를 5 내지 100 ㏖/㎥의 농도로 함유하고, 비이온성 세제를 0.1 내지 10 % (w/v)의 농도로 함유한다.
Description
본 발명은 광학 현미경 검사용 투명 생물학적 시편(biological preparation)을 준비하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생물학적 조직을 염기와 세제를 함유하는 알칼리성 전기영동(electrophoresis) 수용액에 침지하고 이를 상기 전기영동 용액 중에서 전계에 노출시킴으로써 전기영동으로 정화(clarification)하는 방법에 관한 것이다.
예컨대 광시트현미경을 사용하여 시편을 입체적으로 이미지화할 수 있기 위해서는 투명한 생물학적 시편이 필수적이다. 생물학적 시편의 투명성을 확보하기 위해서는 혈액 안료인 헤모글로빈의 헴기(heme group)와 지질(lipid)이 상기 생물학적 시편에서 제거되어야 한다.
US 2015/0144490 A1호는 현미경 분석용 생물학적 시편을 준비하기 위한 것으로 CLARITY법으로 알려진 과정을 개시한다. 상기 CLARITY 과정에서, 해당 시료는 먼저 하이드로겔에 고정된다. 그 다음, 상기 시료를 알칼리성 전기영동 수용액에 넣고 이 전기영동 용액 중에서 전계에 노출시킨다. 상기 전기영동 용액은 붕산, 0.4% (w/v) 황산도데실나트륨(SDS) 및 수산화나트륨(NaOH)을 pH 8.5로 조정되도록 함유한다. 상기 전기영동 용액은 해당 시료가 상기 전계에 노출되는 챔버 내에서 순환된다. 상기 전기영동 용액의 온도는 37~50℃이고, 인가되는 전압은 10~60V이다 (이 전압이 강하하게 되는 거리의 표시는 없음). 실제로, 상기 CLARITY 방법을 사용하는 전기영동 정화는 수일이 걸린다. 전기영동 정화 후, 상기 시료는 1.5의 굴절률을 갖는 매질로 옮겨지고, 예컨대 항체 염색에 의해 추가로 염색될 수 있다.
US 2005/0130317 A1호는 2개 전극 간에 연장된 반응공간으로 생물학적 분자들의 평행 분석을 위한 장치를 기술한다. 상기 전극들에 전압을 인가시켜 상기 전극들 간에 도입된 생물학적 분자들은 이동하게 된다.
WO 2017/096248 A1호는 본 특허출원의 우선권 주장일 이후에 공개된 것으로서, 종양의 검출 및 모니터링용 종양조직 시료를 준비하고 분석하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 하이드로겔 서브유닛(hydrogel subunit)의 존재하에 시료를 고정하고, 상기 하이드로겔 서브유닛을 중합하여 하이드로겔 포매된(hydrogel-embedded) 시료를 형성하며, 상기 하이드로겔 포매된 시료를 정화하고, 하나 이상의 검출가능 마커를 갖는 정화된 히드로겔-포매된 시료를 표지하는 단계들을 포함한다.
상기 시료의 정화는 예를 들면, 유기 용매로의 노출, 세제(예컨대, 사포닌, Triton X-100 및 Tween-20 등)로의 노출, 계면활성제(예컨대, 황산도데실나트륨(SDS))로의 노출과, 특히 이온성 계면 활성제(특히, 황산도데실나트륨)를 포함하는 완충액을 사용하는 전기영동을 포함한다.
본 발명의 목적은 상기 공지된 CLARITY법보다 더 간단하고 상당히 빠른 광학 현미경 검사용 투명 생물학적 시편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
위 본 발명의 목적은 독립청구항 제1항의 특징을 갖는 방법에 의해 달성된다. 종속청구항들은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태들에 관한 것이다.
광학 현미경 검사용 투명 생물학적 시편을 제조하기위한 본 발명에 따른 방법에 있어서, 생물학적 조직은 이를 알칼리성 전기영동 수용액에 침지하고 상기 전기영동 용액 중에서 전계를 가함으로써 전기영동으로 정화된다. 상기 전기영동 용액은 양이온이 적어도 50Da의 분자량을 갖는 5 내지 100 ㏖/㎥ (5 내지 100 m㏖/ℓ) 범위 농도의 완충 염기와 0.1 내지 10 % (w/v, 즉 체적(리터) 대비 중량(킬로그램)) 범위 농도의 비이온성 세제를 함유한다.
양이온이 적어도 50Da의 분자량을 갖는 상기 완충 염기를 사용함으로써 상기 완충 염기가 실제로 전기영동 용액의 바람직한 알칼리도를 설정하지만, 이의 양이온들은 비교적 크며 잘 움직이지 못한다(특히, 나트륨 이온에 대비하여). 그 결과, 전계는 주로 상기 완충 염기의 교반된 양이온들의 형태로 전류를 유발만하는 것이 아니라, 상기 세제 중에서 헴기(heme group) 및/또는 지질(lipid)이 포함되는 마이셀들(micelles)의 흐름 또한 상당한 정도로 유발한다. 이들 마이셀에 기반한 전류는 생물학적 조직으로부터 마이셀을 유도해내고 따라서 헴기 및 지질을 유도해냄으로써 상기 생물학적 조직의 바람직한 정화를 유도한다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 비이온성 세제를 사용함으로써 인가되는 전계로 인한 세제 이온 형태의 전류는 존재하지 않으며, 상기 생물학적 조직의 원하는 정화에 관련된 완충 염기의 양이온의 흐름만이 기생할 것이다. 이러한 기생 이온 전류의 결과는 특히 상기 생물학적 조직의 정화와 관련됨이 없는 상기 생물학적 조직의 가열이다. 또한, 기생 전류는 상기 생물학적 조직에 걸쳐 더 큰 전계가 형성되는 것을 막는다. 왜냐면, 이로 인해 유도된 큰 전류가 상기 생물학적 조직을 과열시키기 때문이다. 그러나, 보다 더 큰 강도의 이러한 전계는 상기 생물학적 조직으로부터의 더 크고 상응하여 이동성이 없는 마이셀의 전기 전도에 유리하다.
본 발명에 의한 방법에 있어서, 상기 완충 염기의 양이온들은 상대적으로 이동성이 있고 상기 세제는 비이온성이기 때문에, 상기 기생 전류는 작게 유지되고, 이로써 위와 같은 흐름에 대한 전기영동 정화의 효율은 상당히 증가된다. 또한, 비이온성 세제가 단백질에 결합하여 생물학적 조직 내에 함유되는 경향은 SDS 등과 같은 이온성 세제의 경향보다 적다. 이러한 이유로 인해, 본 발명에 따른 방법에서는 하이드로 겔에서의 생물학적 조직의 고정화를 쉽게 생략할 수 있고, 이는 공지된 CLARITY 방법에서 단백질이 각각의 생물학적 조직 내에 반드시 잔류하도록 함을 보장한다. 하이드로 겔에서 상기 생물학적 조직의 고정화 필요성의 제거는 상당한 처리비용이 절감되는 장점을 가질 뿐만 아니라, 인가된 전계에 의해 상기 생물학적 조직으로부터 유도되어나올 마이셀의 이동도가 상기 하이드로 겔에 의해 저하되지 않음이 달성된다.
전반적으로, 광학 현미경 검사용 생물학적 시편의 제조를 위한 생물학적 조직의 정화는 본 발명에 따른 방법으로 수 시간 내에 규칙적으로 달성된다.
용어 "비이온성 세제"는 이온도가 0인 세제만을 의미하는 것으로 이해되어서는 안된다. 오히려, 상기 용어는 뚜렷한 이온도를 갖지 않는, 즉 적어도 이온도를 실질적으로는 갖지 않는 모든 세제를 지칭한다. 또한, 상기 비이온성 세제는 단백질에 대해 가능한 가장 낮은 친화도를 갖도록 선택되는 것이 바람직하다. 당업자라면 본 명세서에 기초하여 적절한 비이온성 세제를 쉽게 선택할 수 있다.
본 발명에 의한 방법의 실제 시험에 따르면, 적어도 다음의 세제가 비이온성 세제로서 적합함이 밝혀졌다: Tween 20, Tween 80, Triton X45, Triton X100, Triton X102, n-옥틸-β-D-글루코피라노시드, 옥틸페놀 에톡실레이트, Brij35 및 Nonidet P40. 특히, 본 발명에 사용하기에 우수한 특성은 비이온성 세제들인 Tween 80, Triton X45, Triton X102, n-옥틸-β-D-글루코피라노시드, Brij35 및 Nonidet P40이 보였다. 가장 유리한 성질은 Tween 80, Triton X102 및 Nonidet P40이 보였다.
본 발명의 방법에 사용되는 비이온성 세제는 또한 상기 언급된 세제들 중에서 2종 이상으로 구성될 수도 있다. 세제들의 혼합물은 전기영동 정화 동안 제거 될 각 생물학적 조직의 상이한 성분들에 맞춰질 수 있다.
전기영동 용액 중의 완충염기의 농도는 바람직하게는 10 내지 50 몰/㎥, 보다 바람직하게는 15 내지 25 몰/㎥, 즉 약 20몰/㎥이다.
전기영동 용액 중의 비이온성 세제의 농도는 바람직하게는 0.5 내지 1.5 % (w/v), 즉 약 1% (w/v)이다.
상기 완충염기의 양이온들의 분자량은 바람직하게는 적어도 100Da이다. 이러한 요건을 이하 언급된 순서대로 점차 충족시키는 완충기 염기는 Tris, Bicine 및 BisTris이다.
전기영동 정화 동안 전기영동 용액의 최대 온도는 20 내지 90 ℃ 범위로 유지될 수 있다. 모든 경우에서, 상기 온도는 전기영동 용액의 비등점 이하로 유지되어야한다. 통상적으로, 전기영동 동안에 전기영동 용액의 최대 온도는 40 내지 60 ℃의 범위, 즉 약 50℃로 유지됨이 바람직하다. 그러나, 이 온도를 초과하면, 단백질들에 대한 항체들의 부착 지점이 열적으로 마스킹되지 않아 이들 단백질이 상기 항체들로 계속 표지될 수 있음이 얻어질 수 있다.
본 발명에 의한 방법은 열로 변환되는 전기 에너지의 유입에 의해 상기 생물학적 조직의 온도가 상승하게된다. 이것은 기본적으로 피할 수 없다. 그러나, 본 발명에 의한 방법에서, 등록된 전기 에너지에 기초한 생물학적 조직의 달성된 정화는 특히 크다. 따라서, 생물학적 조직의 온도를 전술한 범위들의 최대 온도로 제한하는 것이 특히 용이하므로, 이를 위해 예컨대 전기영동 용액의 능동적인 냉각이 필요하지는 않다.
본 발명에 의한 방법을 수행함에 있어서, 전기영동 정화 동안에 전기영동 용액의 pH는 8 내지 9의 범위로 유지될 수 있다. 인가된 전계의 결과로서 흐르는 전류는 상기 버퍼 염기가 OH기에 저장기를 제공하더라도 전기영동 용액의 pH를 감소시킨다. 생물학적 조직의 정화 효율을 높게 유지하기 위해서는, 전기영동 용액의 pH를 상기 알칼리 범위로 유지하는 것이 따라서 유용하다. 이러한 목적으로, 전기영동 정화 동안에 새로운 완충 염기가 첨가될 수 있다. 또한, 전계의 작용하에 상기 마이셀들을 제거하는데 소비된 세제는 새로운 세제를 전기영동 용액에 첨가함으로써 전기영동 세정 동안 보충될 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 최대 효율은 전기영동 용액이 사용되지 않은 전기영동 용액과 연속적으로 교환될 때 달성된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 전기영동 용액과 이에 침지된 상기 생물학적 조직에 전달되는 전력은 전기영동 정화 동안에 조절될 수 있다. 이러한 제어는 상기 생물학적 조직 또는 상기 전기영동 용액의 온도에 따라, 또는 일정한 최대 온도의 유지를 보장하는 일정한 값까지 될 수 있다. 적어도 상기 전력은 전기영동 정화의 일부 기간 동안 그러한 고정값으로 조절될 수 있다. 만일 생물학적 조직의 정화가 잘 진행되고 및/또는 전기영동 용액이 이미 상당한 정도로 소비되었다면, 고정 된 값으로 전력을 추가 조정하는 것이 더 이상 적합하지 않을 수 있다.
생물학적 조직의 정화의 진행은 전기영동 용액과 이에 침지된 생물학적 조직의 전기 저항을 검출함으로써 모니터링될 수 있다. 먼저, 상기 전기 저항, 즉 전기 전도도는 생물학적 조직 내에서 마이셀이 유도되어나옴에 따라 감소한다. 전기영동 용액의 소비, 및/또는 제거될 헴기 및 지질인 필수 부분들의 이미 수행된 유도에 의해 상기 저항은 다시 증가하거나 상기 전기 전도도가 다시 감소한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서, 상기 전기 저항 또는 이의 일시적인 변화가 미리 결정된 한계값을 초과하거나 및/또는 그 미만으로 떨어질 경우, 전기영동 정화의 조건을 변경하거나 및/또는 전기영동 정화를 종료시킬 수 있다.
생물학적 조직이 본 발명에 따른 방법에 따라 전기영동으로 정화되기 이전에, 이는 이미 다른 처리를 받을 수 있다. 이것은 예컨대 포름알데히드 등으로 상기 생물학적 조직을 고정화하는 것을 포함하며, 이는 고정화를 위해 사용되는 하이드로 겔 이외에 마이셀들의 이동성을 제한하지 않는다. 또한, 물이나 또는 전기영동 정화 동안에 사용된 전기영동 용액으로 상기 생물학적 조직을 세척하는 것은 실제 전기영동 정화 이전에 가능한 단계들 중의 하나이다. 또한, 상기 생물학적 조직은 전기영동으로 정화되기 이전에 알칼리성 수용액 중에서 배양(incubation) 될 수 있다. 이러한 배양에서 다음 파라미터들이 적어도 부분적으로 충족되면 유리하다: 상기 배양은 30 내지 120 분, 바람직하게는 45 내지 90 분 동안 수행된다. 상기 배양은 20 내지 50 ℃, 바람직하게는 35 내지 40 ℃, 즉 약 37.5℃의 온도에서 일어난다. 상기 알칼리성 수용액의 알칼리성 농도는 50 내지 2000 ㏖/m3, 바람직하게는 100 내지 1000 ㏖/m3이다. 상기 알칼리성 수용액은 그의 알칼리성 농도를 제공하도록 NaOH를 갖는다. 상기 알칼리성 수용액은 C1-6 알코올이 10 내지 70 % (v/v), 바람직하게는 40 내지 60 % (v/v)의 농도로 존재한다. 상기 알칼리성 수용액은 에탄올을 함유한다; 그리고 상기 알칼리성 수용액은 0.1 내지 10 % (w/v), 바람직하게는 0.5 내지 2 % (w/ v)의 농도로 세제를 함유한다.
상기 알칼리성 전기영동 수용액의 전기영동 정화에 부가하여, 상기 생물학적 조직을 산성 수용액에서 배양한 다음, 추가의 전기영동 정화를 위해 산성 전기영동 수용액 중에서 전계에 노출시킬 수 있다.
상기 조직을 상기 산성 수용액에서 배양할 때, 다음 파라미터들 중의 적어도 하나가 유지될 수 있다: 상기 배양은 30 내지 120 분 동안, 바람직하게는 45 내지 90 분 동안 수행된다. 상기 배양은 20 내지 50 ℃, 바람직하게는 35 내지 40 ℃에서 수행된다. 상기 산성 수용액의 양자 농도는 50 내지 2000 ㏖/m3, 바람직하게는 100 내지 1000 ㏖/m3이다. 상기 산성 수용액은 그의 양자 농도를 제공하도록 트리클로로아세트산을 갖는다. 상기 산성 수용액은 10 내지 70 % (v/v), 바람직하게는 40 내지 60 % (v/v)의 농도로 C1-6 알콜을 갖는다. 상기 산성 수용액은 에탄올을 함유한다; 그리고, 상기 산성 수용액은 0.1 내지 10 % (w/v), 바람직하게는 0.5 내지 2 % (w/v)의 농도로 세제를 함유한다. 또한, 상기 산성 전기영동 수용액은 다음 파라미터들 중의 적어도 하나를 충족할 수 있다: 상기 산성 전기영동 수용액은 5 내지 100 ㏖/m3 범위 농도의 완충 산 및 0.1 내지 10 % (w/v) 범위 농도의 비이온성 세제를 함유한다; 그리고, 상기 산성 전기영동 수용액은 아세트산을 10 내지 50 ㏖/m3의 농도로 함유하고 비이온성 세제는 0.5 내지 2 % (w/v)의 농도로 함유한다.
상기 생물학적 조직은 전기영동으로 정화된 후, 광학 현미경 검사를 위해 추가적으로 더 준비될 수 있다. 이는 다음 단계들 중의 하나 이상이 포함될 수 있다: 상기 생물학적 조직은 적어도 하나의 항체와 함께 배양된다. 상기 생물학적 조직은 항체용액 중에서 전계에 노출된다. 상기 생물학적 조직은 적어도 하나의 염료로 염색된다. 상기 생물학적 조직은 염료용액 중에서 전기장에 노출된다. 상기 생물학적 조직은 유기용매로 세척된다. 상기 생물학적 조직은 크실렌 또는 디클로로메탄으로 세척된다. 상기 생물학적 조직은 n = 1.4 내지 n = 1.6 범위의 굴절률을 갖는 용액에 도입된다. n = 1.4에서 n = 1.6까지의 굴절률 범위, 즉 대략 n = 1.5인 굴절률 범위는 상기 용액은 정화된 상기 생물학적 조직과 동일한 굴절률을 가짐을 의미한다. 따라서, 광학 현미경 검사에서 생물학적 조직의 계면에서 산란이 발생하지 않는다.
구체적으로는, 상기 생물학적 조직이 전기영동으로 정화된 후에, 약 n = 1.5 범위의 굴절률을 갖는 수용액 및/또는 당 또는 폴리올 용액에 상기 생물학적 조직을 도입할 수 있다. 대안적으로는, 전기영동으로 정화된 후, 상기 생물학적 조직은 알코올 농도가 증가하는 알코올 계열에서 탈수되거나 및/또는 약 n = 1.5 범위의 굴절률을 갖는 유기 용매, 메틸 살리실레이트 또는 메틸 살리실레이트 용액에 도입 될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 구체적인 구현을 위해, 전기영동 정화용 조직은 반응챔버 내에 배치될 수 있고, 상기 반응챔버는 수직축에 대해 회전 대칭이고 사이드 컷을 갖고 전기영동 용액으로 채워지는 반응공간과, 상기 사이드 컷 하부의 상기 반응공간 내에서 상향 유도 가스 방출 채널에 연결되는 개방된 저부의 환형 채널과, 상기 환형 채널 내부 및/또는 상기 환형 채널 하부인 상기 반응공간 내의 제1 환형 전극과, 상기 사이드 컷 상부인 상기 반응공간 내의 제2 환형 전극을 갖는다. 그 다음, 상기 제1 및 제2 전극은 DC 전압원의 2개 출력에 연결되어 상기 생물학적 조직을 전계에 노출시킨다. 상기 조직은 거의 균일한 전계가 상기 전극들 간에 집중되는 사이드 컷에서 반응 공간의 감소된 자유 횡단면에 배치된다. 상기 가스 방출 채널은 하부 전극 위에 형성되고 그리로부터 파생된 가스 기포들은 상승함으로써 반응 챔버에 모여 전류의 흐름을 방해하지않도록 된다. 또한, 가스 버블이 가수 분해에 의해 형성된 수소를 함유하고 이것이 가수 분해에 의해 상부 전극에서 형성된 산소와 혼합될 수 있는 경우에 산수소(oxyhydrogen)의 형성이 방지된다. 상기 반응 챔버는 US 2005/0130317 A1호에 공지된 바와 같은 부가의 특징들을 가질 수 있다.
본 발명의 유리한 전개는 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 본 명세서에서 언급된 특징들과 여러 특징의 조합의 장점들은 단지 예시적인 것이며 본 발명에 따른 실시양태들에 의해 달성되어야 할 필요없이 대안적으로 또는 누적적으로 효과를 나타낼 수 있다. 특허청구범위의 내용을 변경함이 없이, 출원 명세서와 특허의 개시내용에 대해서는 다음이 적용된다: 추가적인 특징들(특히, 기하학적 구조들과 여러 구성요소들의 서로에 대한 상대적인 치수 및 상대적인 배치, 그리고 동작 연결)은 도면들에 나타나있다. 본 발명에서 여러 실시양태의 특징들 또는 여러 특허청구항의 특징들의 조합은 또한 특허청구항들의 선택된 관계에서 파생될 수 있고 이로써 활성화된다. 이는 또한 개별 도면에 도시되거나 발명의 상세한 설명에서 언급된 특징들에도 적용된다. 또한, 이들 특징은 여러 특허청구항의 특징들과 결합될 수도 있다. 마찬가지로, 특허청구범위에서 본 발명의 추가 실시양태에 대해 열거된 특징은 생략될 수 있다.
특허청구범위 및 발명의 상세한 설명에 언급된 특징들은 그의 개수면에서 이해하되, "최소한"이라는 부사를 명시적으로 사용하지 않고도 정확히 상기 개수 또는 상기 개수보다 더 많은 개수가 있음을 이해해야한다. 예를 들어, 세제를 언급 할 때, 1개의 세제, 2개의 세제 또는 그 이상의 세제가 있음을 이해해야한다.
특허청구항들에서 언급된 특징들은 다른 특징들로써 보완될 수 있거나 또는 특정 프로세스에서 사용된 특정 프로세스 또는 솔루션을 나타내는 유일한 특징들로써 보완될 수 있다. 특허청구항들에 포함된 도면부호는 특허청구항들에 의해 보호되는 범위를 제한하지 않으며 단지 청구항들을 이해하기 더 쉽게하기위한 목적으로 만 사용된다.
이하, 본 발명은 바람직한 실시양태들에서 도시된 도면들을 참조하여 더 설명되고 기술된다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 수행하기위한 반응 챔버의 분해도이다.
도 2는 상기 반응 챔버의 수정된 실시양태의 수직단면 상세도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법의 일 실시양태의 흐름도이다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 수행하기위한 반응 챔버의 분해도이다.
도 2는 상기 반응 챔버의 수정된 실시양태의 수직단면 상세도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법의 일 실시양태의 흐름도이다.
광학 현미경 검사용 투명 생물학적 시편을 제조하기위한 본 발명에 따른 방법의 일 실시양태에 있어서, 생물학적 조직(2)의 시료(1)은 반응 챔버(4) 내의 시료 홀더(3)의 도움으로 배치되며, 이는 도 1의 사시도로 보인다. 상기 반응 챔버(4)는 반응공간(5)을 갖고, 이는 수직축(6)에 대해 회전 대칭이다. 상기 반응공간(5)에서, 상기 생물학적 조직(2)은 그 높이의 대략 절반에 배치되고, 상기 시료 홀더(3)를 통하여 사이드 컷, 즉 상기 반응공간(5)의 직경 감소부가 형성된다. 상기 생물학적 조직은 상기 사이드 컷에서 상기 반응공간(5)의 감소된 자유 횡단면 (16)의 영역에 배치된다. 본 발명에 따른 공정을 수행할 때, 상기 반응공간(5)은 적어도 알칼리성 전기영동 수용액으로 채워진다. 상기 생물학적 조직(2)이 본 발명에 따른 방법을 수행할 때 접촉하게되는 모든 기타 용액은 또한 상기 반응공간(5) 내로 채워지거나 또는 상기 반응공간(5)을 통과할 수 있다. 이를 위해, 상기 반응공간(5)은 상부 연결부(7) 및 하부 연결부(8)를 갖는다. 이들 포트(7, 8)는 상기 생물학적 조직(2)의 처리 중에 상기 반응공간(5) 내 용액의 조성을 변화시키거나 또는 심지어 다른 용액으로 교환하는데 사용될뿐만 아니라 각 용액을 상기 반응공간(5)을 통해 순환시키는데도 사용될 수 있다. 이러한 순환에서, 각 용액은 예를 들어 열 교환기를 통과하여 온도를 조절하거나 또는 사용된 성분에 대해 재생될 수 있다.
상기 생물학적 조직(2)의 전기영동 정화를 위해, 특히 그로부터 헴기(heme group) 및 지질(lipid)을 제거하기 위해, 상부전극(9) 및 하부전극(10)이 제공되어 상기 반응공간 내에 위치한 상기 용액 내로 잠긴다. 이들 전극(9, 10) 간에 전압을 인가하면, 전계가 상기 생물학적 조직(2)에 걸쳐 형성되며 이는 상기 전기영동 정화를 위한 구동 전기력을 제공한다. 상기 전극들(9, 10) 간에 전압을 인가하기 위해 연결 리드선(11)이 상기 상부전극(9)에, 연결 리드선(12)이 상기 하부전극(10)에 제공되고, 상기 전극들(9, 10)은 DC 전압원(13)에 연결된다. 상기 전극들(9, 10)은 상기 생물학적 조직(2)이 배치되는 상기 사이드 컷의 영역, 즉 상기 시료 홀더(3)의 자유 횡단면 내에서 가능한 균일한 전계를 생성하도록 환형의 형상으로 된다. 상기 시료 홀더(3) 및 반응챔버(4)의 2개 인접부들(14, 15) 모두는 전기 절연물질로 형성되는 것으로 이해된다.
도 2의 수직단면뷰로 도시된 상기 반응챔버(4)의 일 구현예는 상기 시료(1)를 가진 시료 홀더(3)가 삽입되는 상기 반응공간(5)의 하부를 보이며, 이로써 생물학적 조직(2)이 상기 시료 홀더(3)를 통해 상기 반응공간(5)의 사이드 컷의 자유 횡단면(16) 내에 배치된다. 상기 반응공간(5)에 대한 하부 연결부(8)는 여기 도시되지 않지만, 도 1과 같이 존재할 수 있다. 상기 하부전극(10)은 시료 챔버 내로 삽입(29)을 통해 형성된 상향으로 폐쇄된 환형 채널(17)의 하부와 부분적으로 그 내부에 배치된다. 하향 개방된 환형 채널(17)은 인가된 전압으로 인해 상기 전극(10)으로부터 상승하도록 상향 인도하는 가스 방출 채널(18)로 연결되어, 예를 들어 가수분해에 의해 형성된 수소함유 기포(19)가 제어되는 방식으로 제거되며, 이로써 상기 기포는 상기 반응챔버(5) 내에 축적되지 않고 상기 반응챔버(5)를 통한 전류 흐름을 막지않아 상기 반응챔버(5) 내의 산수소(oxyhydrogen)의 형성이 방지된다.
본 발명에 의한 방법은 도 3의 흐름도로 나타내어지며, 상기 생물학적 조직(2)의 고정으로 시작한다(예컨대, 포름알데히드로써)(20). 그리고, 이어서 상기 조직(2)을 세척한다(예컨대, 물로써)(21). 본 발명에 따른 방법을 수행하는 과정에서, 도 3에 부각되지 않은 추가의 세척 단계들이 삽입될 수 있다. 원칙적으로, 상기 조직(2)은 용액 중에서의 임의의 더 긴 처리 이전에 이 용액으로 먼저 세척될 수 있으며, 이는 하기에서 설명된다.
예를 들어 100㏖/㎥ NaOH, 50% EtOH 및 1% (w/v) 세제를 함유하는 수용액에서 37℃로 1시간 동안 알칼리성 배양(22)을 수행한다. 이어서 20㏖/m3 Tris 및 1% (w/v)의 각 세제를 함유하는 알칼리성 전기영동 수용액 중에서 예를 들어 50℃에서 45분간 후속 알칼리성 전기영동(23)을 수행한다. 실제 전기영동은 최대 1000V, 최대 전류 150㎃ 및 전력 제한값 10W로 전극들(9, 10) 간의 DC 전압으로 수행된다. 이는 예를 들어 20㎃의 평균 전류에서 500V의 평균 전압으로 될 수 있다. 그리고 이어서 세척 단계(도시되지 않음)의 개재와 함께 산성 배양(24)이 뒤따를 수 있다. 산성 배양(24)은 NaOH 대신에 트리클로로 아세트산을 첨가하는 것만을 제외하고는 알칼리성 배양(22)에 대응될 수 있다. 마찬가지로, 이후의 산성 전기영동에서도, Tris 대신에 트리클로로 아세트산이 사용된다는 것만을 제외하고는, 알칼리성 전기영동(23)에서와 동일한 조건이 우선한다. 이후, 또는 본 발명에 따른 방법의 기타 적절한 시점에서 항체 염색(26), 즉 상기 전기영동 정화 후에도 여전히 상기 조직(2)에 존재하는 특정 단백질의 면역학적 염색을 수행한다. 이 경우, 항체는 상기 단백질에 특이적으로 부착되고 자신이 염료를 가지고 있거나 이후 염료로 표지되는 것이 사용된다. 상기 정화되고 선택적으로 착색된 생물학적 조직(2)이 수용액 중에서 광학 현미경으로 검사되지 않는 한, 탈수(27)가 따르고, 이어서 약 1.5의 상기 정화된 조직의 굴절률을 갖는 매질로의 이송(28)이 뒤따른다. 적합한 매질은 윈터그린 오일(wintergreen oil)이다. 이어서, 상기 조직은 예컨대 광 시트 기술을 사용하는 광학 현미경 검사에 적합하다. 공지된 CLARITY법과 비교하여, 본 발명에 따른 방법은 몇 시간의 매우 짧은 총 처리시간이 특징이다. 또한, 상기 생물학적 조직(2)을 충분히 정화하는데는 산성 배양(24)과 산성 전기영동(25)이 종종 불필요하다는 점 또한 고려되어야한다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기위한 다음 프로토콜에 따라, 각각 약 250㎎의 돼지 폐 조직인 시료 1이 성공적으로 정화되었다. 조직(2)의 고정(20)은 포름 알데히드 중에서 일어난다. 상기 조직(2)의 세척(21)은 물로 10분간 수행한다. 알칼리성 배양(22)은 500㏖/㎥ NaOH, 50% (v/v) EtOH 및 1% (w/v) 비이온성 세제를 함유하는 수용액에서 37℃로 1시간 동안 수행되었다. 알칼리성 전기영동(23)은 20㏖/㎥의 Tris 및 1% (w/v)의 각 비이온성 세제를 함유하는 전기영동 수용액 중에서 45분 동안 수행되었다. 이는 전극들(9, 10) 사이에 위치하여 최대 1000V의 직류 전압과 150㎃의 최대 전류가 인가되었고, 전력은 최대 10W로 제한되었다. 탈수(27)는 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올로 4회 30분씩 증량하였다. 이송(28)은 윈터그린 오일에서 일어났다. 다양한 입증된 비이온성 세제는 이 프로토콜을 사용할 때 여러 좋은 결과를 나타냈으며, 이는 다음과 같이 0(열등한 정화, 암색 시료)로부터 ++++(양호한 투명성 및 무색)의 등급으로 평가되었다.
0: 세제 없음
+: Tween 20, Triton X100
++: n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드, Brie 35
+++: Nonidet P40, Triton X45(백탁 용액), Tween 80
++++: Triton X102
추가 실험에서, 알칼리성 전기영동(23)에서의 전기 저항의 과정 및 상기 조직(2) 상의 혈액 부하와 그 정화결과 간의 관계가 조사되었다. 상기 전기 저항은 알칼리성 전기영동(23)의 시작시 감소한다. 이는 이동 전하 캐리어로서의 헴기(heme group) 및 지질(lipid)을 함유하는 마이셀(micelle)의 형성 및 방출에 기인하며, 이는 이후 상기 전계를 통해 조직(2) 밖으로 유도될 수 있다. 상기 조직의 높은 혈액 부하에서 보다 더 많은 그러한 전하 캐리어를 형성할 수 있다. 따라서, 상기 전기 저항은 훨씬 더 빠르게 감소하고 또한 더 작은 최소값에 도달하게 된다. 전기영동 용액의 전하 캐리어 형성 성분의 소비로 인해 저항은 다시 증가하는데, 전하 캐리어를 형성하는 상기 조직의 성분(즉, 헴기 및 지질)이 상기 조직으로부터 이미 실질적으로 제거된 경우에도 마찬가지이다. 전기 저항의 이러한 과정은 특히 알칼리성 전기영동을 제어하는데, 특히 알칼리성 전기영동이 유용하게 종결되는 시점을 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 전기 저항의 이러한 과정은 전기영동 용액 자체의 전기 전도성을 가능한한 작게 유지하고 가능한한 전하 캐리어만이 형성되도록 보장하는데 있어 본 발명의 기본적인 아이디어의 정확성을 증명하는 것이며, 이는 정화를 위해 상기 조직으로부터의 헴기 및 지질과 같은 물질을 사실상 제거한다. 이들 조건하에 흐르는 전류는 상기 조직(2)의 전기영동 정화를 효율적으로 유도한다. 따라서, 필요에 따라 기생 전류에 의한 샘플(2)의 전기적 가열뿐만 아니라 시료에 걸친 높은 전계 강도의 형성을 실질적으로 방지하는 그러한 기생 전류가 회피되고, 이로써 마이셀을 포함한 비교적 큰 헴기 및/또는 지질에 이들을 생물학적 조직(2) 밖으로 유도해낼 수있는 충분히 큰 전기력이 인가된다.
1: 시료
2: 생물학적 조직
3: 시료 홀더
4: 반응 챔버
5: 반응공간
6: 수직축
7: 상부 연결부
8: 하부 연결부
9: 상부전극
10: 하부전극
11: 연결 리드선
12: 연결 리드선
13: DC 전압원
14: 반응 챔버(4)의 상부
15: 반응 챔버(4)의 하부
16: 자유 횡단면
17: 환형 채널
18: 가스 방출 채널
19: 가스 기포
20: 고정화
21: 세척
22: 알칼리성 배양
23: 알칼리성 전기영동
24: 산성 배양
25: 산성 전기영동
26: 항체 염색
27: 탈수
28: 이송
29: 삽입
2: 생물학적 조직
3: 시료 홀더
4: 반응 챔버
5: 반응공간
6: 수직축
7: 상부 연결부
8: 하부 연결부
9: 상부전극
10: 하부전극
11: 연결 리드선
12: 연결 리드선
13: DC 전압원
14: 반응 챔버(4)의 상부
15: 반응 챔버(4)의 하부
16: 자유 횡단면
17: 환형 채널
18: 가스 방출 채널
19: 가스 기포
20: 고정화
21: 세척
22: 알칼리성 배양
23: 알칼리성 전기영동
24: 산성 배양
25: 산성 전기영동
26: 항체 염색
27: 탈수
28: 이송
29: 삽입
Claims (25)
- 생물학적 조직(2)을 알칼리성 전기영동 수용액에 침지하고 상기 전기영동 수용액 중에서 전계에 가하되 상기 전기영동 수용액은 5 내지 100 ㏖/㎥ 범위 농도의 염기와 0.1 내지 10 % (w/v) 범위 농도의 세제를 함유하는, 광 현미경 검사용 투명 생물학적 시편을 제조하는 방법에 있어서,
상기 염기는 양이온이 50Da 이상의 분자량을 갖는 완충 염기이고, 상기 세제는 비이온성 세제인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 비이온성 세제는 적어도 주성분이 Tween 20, Tween 80, Triton X45, Triton X100, Triton X102, n-옥틸-β-D-글루코피라노시드(n-octyl-beta-D Glucopyranoside), 옥틸페놀에톡실레이트(Octylphenolethoxylate), Brij35 및 Nonidet P40로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 비이온성 세제는 적어도 주성분이 Tween 80, Triton X45, Triton X102, n-옥틸-β-D-글루코피라노시드(n-octyl-beta-D-Glucopyranoside), Brij35 및 Nonidet P40로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 비이온성 세제는 적어도 주성분이 Tween 80, Triton X102 및 Nonidet P40로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전기영동 수용액은 10 내지 50 ㏖/㎥ 범위 또는 15 내지 25 ㏖/㎥ 범위의 농도로 상기 완충염기를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전기영동 수용액은 0.5 내지 1.5 % (w/v) 범위의 농도로 상기 비이온성 세제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 완충 염기의 양이온의 분자량은 100Da 이상인 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 완충 염기는 적어도 주성분이 Tris, Bicine 및 BisTris로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 구성되는 것을 특징으로하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
전기영동 정화 동안 상기 전기영동 수용액의 최대온도는 상기 전기영동 수용액의 비등점 이하에서 20 내지 90 ℃ 범위로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
전기영동 정화 동안 상기 전기영동 수용액의 최대온도는 40 내지 60 ℃의 범위로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
전기영동 정화 동안 상기 전기영동 수용액의 pH는 8 내지 9의 범위로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
전기영동 정화 동안 새로운 완충 염기 및/또는 세제가 상기 전기영동 수용액에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 전기영동 수용액은 연속적으로 교환되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전기영동 정화 동안 상기 전기영동 수용액 및 상기 전기영동 수용액 내에 침지된 상기 생물학적 조직에 전달되는 전력이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 전력은 상기 전기영동 정화의 적어도 일부 기간 동안 고정된 값으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전기영동 정화 동안 상기 전기영동 수용액 및 상기 전기영동 수용액 내에 침지된 상기 생물학적 조직의 전기 저항이 검출되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 전기 저항 또는 상기 전기 저항의 일시적 변화가 미리 결정된 한계를 초과하거나 및/또는 상기 한계 미만으로 떨어지면, 상기 전기영동 정화의 조건이 변경되거나 및/또는 상기 전기영동 정화가 종료되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 조직(2)은 전기영동으로 정화되기 이전에,
- 고정화되거나; 및/또는
- 포름알데히드로 고정화되거나; 및/또는
- 세척되거나; 및/또는
- 물로 세척되거나; 및/또는
- 상기 전기영동 수용액으로 세척되거나; 및/또는
- 알칼리성 수용액 중에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제18항에 있어서,
상기 생물학적 조직을 상기 알칼리성 수용액 중에서 배양하는 경우, 상기 전기영동으로 정화되기 이전에 하기 파라미터들 중의 하나 이상이 유지되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 상기 배양은 30 내지 120 분간 또는 45 내지 90 분간 수행됨;
- 상기 배양은 20 내지 50 ℃ 또는 35 내지 40 ℃에서 실시됨;
- 상기 알칼리성 수용액의 알칼리 농도는 50 내지 2000 ㏖/㎥ 또는 100 내지 1000 ㏖/㎥임;
- 상기 알칼리성 수용액은 NaOH를 함유함;
- 상기 알칼리성 수용액은 10 내지 70 % 또는 40 내지 60 % (v/v)의 농도로 C1-6 알콜을 함유함;
- 상기 알칼리성 수용액은 에탄올을 함유함; 및
- 상기 알칼리성 수용액은 0.1 내지 10 % 또는 0.5 내지 2 % (w/v)의 농도로 세제를 함유함. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 조직(2)은 상기 알칼리성 전기영동 수용액 중에서 전기영동으로 정화되기 이전 또는 이후에 산성 수용액 중에서 배양된 다음, 산성 전기영동 수용액 중에서 전게에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제20항에 있어서,
상기 산성 수용액 중에서 상기 생물학적 조직을 배양할 경우, 하기 매개 변수 (i)~(vii) 중의 하나 이상을 유지하고, 상기 산성 전기영동 수용액이 하기 매개 변수 (viii)~(ix) 중의 하나 이상을 준수하는 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 상기 배양은 30 내지 120 분간 또는 45 내지 90 분간 수행됨;
(ii) 상기 배양은 20 내지 50 ℃ 또는 35 내지 40 ℃에서 실시됨;
(iii) 상기 산성 수용액은 50 내지 2000 ㏖/㎥ 또는 100 내지 1000 ㏖/㎥의 양자 농도를 가짐;
(iv) 상기 산성 수용액은 트리클로로아세트산을 함유함;
(v) 상기 산성 수용액은 10 내지 70 % 또는 40 내지 60 % (v/v)의 농도로 C1-6 알콜을 함유함;
(vi) 상기 산성 수용액은 에탄올을 함유함;
(vii) 상기 산성 수용액은 0.1 내지 10 % 또는 0.5 내지 2 % (w/v)의 농도로 세제를 함유함;
(viii) 상기 산성 전기영동 수용액은 완충 산을 5 내지 100 ㏖/㎥의 농도로 함유하고 비이온성 세제는 0.1 내지 10 % (w/v)의 농도로 함유함; 및
(ix) 상기 산성 전기영동 수용액은 트리클로로아세트산을 10 내지 50 ㏖/㎥의 농도로 함유하고 비이온성 세제는 0.5 내지 2 % (w/v)의 농도로 함유함. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 조직(2)은 전기영동으로 정화된 이후에,
- 항체와 함께 배양되거나; 및/또는
- 항체 용액 중에서 전계에 노출되거나; 및/또는
- 염료로 염색되거나; 및/또는
- 염료 용액 중에서 전계에 노출되거나; 및/또는
- 유기 용매로 세척되거나; 및/또는
- 크실렌 또는 디클로로메탄으로 세척되거나; 및/또는
- n = 1.4 내지 n = 1.6 범위의 굴절률을 갖는 용액에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 조직(2)은 전기영동으로 정화된 이후에,
- n = 1.4 내지 n = 1.6 범위의 굴절률을 갖는 수용액; 및/또는
- n = 1.4 내지 n = 1.6 범위의 굴절률을 갖는 당 또는 폴리올 용액 중에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 생물학적 조직(2)은 전기영동으로 정화된 이후에,
- 알코올 농도가 증가하는 알코올 계열에서 탈수되거나; 및/또는
- n = 1.4 내지 n = 1.6 범위의 굴절률을 갖는 유기 용매 중에 도입되거나; 및/또는
- n = 1.4 내지 n = 1.6 범위의 굴절률을 갖는 메틸 살리실레이트 또는 메틸 살리실레이트 용액 중에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전기영동 청정용 생물학적 조직은 반응 챔버(4) 내에서 배열되고,
상기 반응챔버(4)는
- 수직축(6)을 중심으로 회전 대칭이고 상기 전기영동 수용액으로 채워지는 사이드 컷을 갖는 반응 공간(5)과;
- 상향으로 유도하는 가스 방출 채널(18)에 연결된 사이드 컷 하부의 상기 반응 공간(5) 내에서 하향 개방된 환형 채널(17)과;
- 상기 환형 채널(17) 내 및/또는 상기 환형 채널(17) 하부의 반응 공간(5) 내의 제1 환형 전극(10)과;
- 상기 사이드 컷 상부의 상기 반응 공간(5) 내의 제2 환형 전극(9)을 갖고,
상기 제1 및 제2 환형 전극(9, 10)은 DC 전압원(13)의 2개 출력에 연결되고, 상기 생물학적 조직은 상기 사이드 컷에서 상기 반응 공간(5)의 감소된 자유 횡단면(16)에 배치되는 것을 특징으로 하는 방법.
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