JP5182809B2 - タンパク質の分析方法及び分析試薬 - Google Patents
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Description
(1)式I:
R1及びR2は、同じか又は異なり、1個以上のアニオン性置換基で置換されたアリール基又はヘテロアリール基である。]
により表される水に易溶な蛍光化合物、又はその塩。
(2)前記化合物が式Ia:
(3)上記(1)若しくは(2)に記載の化合物を用いてタンパク質を検出し、それによりタンパク質を定性的又は定量的に分析することを含む、タンパク質の分析方法。
(4)電気泳動によりタンパク質を分離することを含む、上記(3)に記載の方法。
(5)電気泳動により担体上でタンパク質を分離するステップ、及び該電気泳動担体を上記(1)又は(2)に記載の化合物を含有する水溶液に浸漬するステップを含む、上記(4)に記載の方法。
(6)上記(1)又は(2)に記載の化合物を含有するバッファーを、電気泳動用バッファーとして用いる、上記(4)に記載の方法。
(7)上記(1)又は(2)に記載の化合物を含有する溶液、及び界面活性剤を含有する溶液を用いる、上記(3)〜(6)のいずれか1つに記載の方法。
(8)前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、上記(7)に記載の方法。
(9)前記界面活性剤が、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤である、上記(7)に記載の方法。
(10)上記(1)又は(2)に記載の化合物の、タンパク質分析用試薬としての使用。
R1及びR2は、同じか又は異なり、1個以上のアニオン性置換基で置換されたアリール基又はヘテロアリール基である。]
により表される水に易溶な蛍光化合物又はその塩に関する。
R1及びR2は、同じか又は異なり、1個以上のアニオン性置換基で置換されたアリール基又はヘテロアリール基である。]
により表される水に易溶な蛍光化合物の使用に関する。
ESI-MS(+): [M+Na-H]+ = 574.6
1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)σ6.92(2H, s), 7.20(2H, d, J = 16Hz), 7.37-7.46(4H, m), 7.77-7.88(4H,m), 8.62(2H, d, J = 16Hz).
13C-NMR(100.53MHz, DMSO-d6)σ56.6, 106.5, 115.5, 120.3, 127.2, 127.4, 129.0, 129.3, 132.5, 138.1, 146.4, 156.1, 159.7.
ESI-MS(+):[M+Na-H]+ = 384.8
1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)σ2.45(3H, s), 6.72(1H, dd, J = 0.91, 2.3Hz), 6.94(1H, d, J = 2.3Hz), 7.23(1H, d, J = 16Hz), 7.34-7.42(2H, m), 7.79-7.84(2H, m), 8.63(1H, d, J = 16Hz).
13C-NMR(100.53MHz, DMSO-d6)σ19.5, 55.8, 106.0, 107.3, 115.4, 119.3, 126.4, 127.1, 129.0, 129.1, 132.1, 137.3, 147.0, 156.8, 160.2, 164.1.
ESI-MS(+):[M+Na]+ = 349.1
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, r.t., TMS, δ/ppm) 1.71 (s, 3H), 5.27 (s, 1H), 5.51 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.59 (d, 1H), 7.21 (d, 1H), 7.35 (t, 1H), 7.38 (t, 1H), 8.08 (d, 1H).
化合物1及び2を25μg/mLの濃度で精製水にそれぞれ溶解し、200〜800nmの範囲の波長での吸収スペクトル及び450〜600nmの範囲の波長での蛍光スペクトルを測定した。吸収スペクトルの測定は、U3310(日立ハイテクノロジーズ社製)を用いて行い、蛍光スペクトルの測定はRF−1500(島津製作所社製)を用いて行った。結果を表1に示す。
(1)サンプル調製
市販の分子量マーカー(Protein Standard Mixture IV;メルク社製)2mgに2mLのストック用バッファー(精製水4.2mL、0.5Mトリス−塩酸バッファー(pH8.6)1.0mL、グリセロール0.8mL、100g/Lドデシル硫酸ナトリウム1.6mL、2−メルカプトエタノール0.4mLの混合液)を加え、沸騰水中で2分間加熱した後、冷却した。0.5mLのマイクロチューブに30μLずつ分注し、使用時まで−80℃で凍結保存した。解凍した分子量マーカーにサンプル希釈液(精製水3.8mL、0.5Mトリス−塩酸バッファー(pH8.6)1.0mL、グリセロール0.8mL、100g/Lドデシル硫酸ナトリウム1.6mL、5g/Lブロモフェノールブルー0.8mLの混合液)を添加し、タンパク質濃度が0.4〜200ng/μLの範囲の希釈系列を作製した。
(2)電気泳動によるタンパク質の分離及び検出
電気泳動の条件は以下の通りである:
電気泳動装置:ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽AE6450(アトー社製)
ポリアクリルアミドゲル:マルチゲルIIミニ10/20(13W)(コスモバイオ社製)
電気泳動用バッファー:27.2mMトリス(ヒドロキシル)アミノメタン、192mMグリシン、3.5mMドデシル硫酸ナトリウム(pH8.3)
蛍光イメージアナライザー:ライトキャプチャーII(アトー社製)
光源:緑色LED(中心波長525nm)
カットフィルター:R−60(550nm)
上記(1)で調製した希釈系列の各サンプルをそれぞれ5μL/ウェルでゲルにアプライし(1レーン:167ngタンパク質/バンド、2レーン:83.3ng/バンド、3レーン:41.7ng/バンド、4レーン:20.8ng/バンド、5レーン:10.4ng/バンド、6レーン:5.2ng/バンド、7レーン:2.6ng/バンド、8レーン:1.3ng/バンド、9レーン:0.7ng/バンド、10レーン:0.4ng/バンド)、30mAの定位電流で45分間電気泳動を行った。
実施例1で合成した化合物1及び化合物2を用いて、実施例3に記載の分析条件を用いてタンパク質の検出を行った。電気泳動後のゲルを、まず1%Tween80水溶液に20分間浸漬し、60μg/mLの化合物1又は化合物2を含有するバッファーに10分間浸漬した。続いて、1%Tween80水溶液の入った容器にゲルを移し、30分間浸漬した。この場合も、染色操作の間、溶液中の化合物1の析出は観察されなかった。処理の総所要時間は60分間であった。ゲルを蛍光イメージアナライザーで分析した。結果を図1及び表3に示す。化合物1を用いた場合、2.6ng以上のタンパク質を含むバンドを検出することができ、それと比較して化合物2では検出限界は20ngであった。
これらのことから、化合物1が、タンパク質の種類にかかわらず良好なタンパク質検出を可能にすることが示された。
比較例として、化合物3によるタンパク質検出について検討した。
タンパク質サンプルは、以下のように調製した:市販のBSA(PIERCE社製)2.0mg/mLに、サンプルバッファー(0.0625M Tris−HCl(pH6.8)、5% 2−メルカプトエタノール、2%SDS、20%グリセロール、0.005%BPB)を添加し、それぞれ、200、60、30、12、6、3及び0.2ng/μLの濃度に希釈した。これらのタンパク質サンプルを80℃で5分間加熱した後、放冷した。
電気泳動装置:ERICA XVE−001C(DRC株式会社製)
ポリアクリルアミドゲル:XV PANTERA Gel(DRC株式会社製)
電気泳動用バッファー:XV PANTERA Gel付属電気泳動バッファー
蛍光イメージアナライザー:LS400(TECAN社製)
励起波長:543nm、検出波長:590nm。
電気泳動用バッファー(7.2mMトリス(ヒドロキシル)アミノメタン、192mMグリシン、3.5mMドデシル硫酸ナトリウム(pH8.3))に化合物1又は化合物2を15μg/mLの濃度で溶解した。上記のバッファーを用い、その他の条件は実施例3に記載したものと同様にして、電気泳動を行った。電気泳動完了後、ゲルを1%Tween80水溶液の入った容器に移し、40分間静置し、続いて蛍光イメージアナライザーで分析した。結果を図3及び表4に示す。化合物1を用いた場合、5.2ng以上のタンパク質を含むバンドを検出することができ、それと比較して化合物2ではチトクロムC以外のタンパク質を検出することができなかった。
Claims (10)
- 式I:
[式中、
R1及びR2は、同じか又は異なり、1個以上のスルホン酸基で置換されたアリール基又はヘテロアリール基である。]
により表される水に易溶な蛍光化合物、又はその塩。 - 前記化合物が式Ia:
により表される化合物である、請求項1に記載の化合物。 - 請求項1若しくは2に記載の化合物を用いてタンパク質を検出し、それによりタンパク
質を定性的又は定量的に分析することを含む、タンパク質の分析方法。 - 電気泳動によりタンパク質を分離することを含む、請求項3に記載の方法。
- 電気泳動により担体上でタンパク質を分離するステップ、及び該電気泳動担体を請求項
1又は2に記載の化合物を含有する水溶液に浸漬するステップを含む、請求項4に記載の
方法。 - 請求項1又は2に記載の化合物を含有するバッファーを、電気泳動用バッファーとして
用いる、請求項4に記載の方法。 - 請求項1又は2に記載の化合物を含有する溶液、及び界面活性剤を含有する溶液を用い
る、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項7に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤である、請求項
7に記載の方法。 - 請求項1又は2に記載の化合物の、タンパク質分析用試薬としての使用。
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