JP3130872B2 - 二本鎖ｄｎａの高感度検出用染料 - Google Patents

二本鎖ｄｎａの高感度検出用染料

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の分野は、核酸挿入蛍
光染料である。
【０００２】
【従来の技術】アガロース又はアクリルアミドゲル上に
おける、又は毛管電気泳動（capillary electrophoresi
s)中におけるｄｓＤＮＡの検出のための標準手順では、
フェナントリジニウム染料、臭化エチジウムを利用す
る。一般的に、ゲル上における検出は、２つの方法のう
ちの１つの方法において達成される。第一の手順では、
ゲル電気泳動の終わりに、ゲルを臭化エチジウムの水溶
液中に置き、染料溶液と平衡にした後、短時間で染料を
含まない溶液に移して、ゲル中の染料の量を増加させ
る。ＤＮＡ含有バンドを、その後、トランスイルミネー
ター(transilluminator)において近紫外線により可視化
する。第二の手順では、低濃度の臭化エチジウムを電気
泳動分離用のランニングバッファー中に導入し、可視化
を更なる操作なしに上述のように行う。後者の手順は、
また、オンラインでの蛍光検出を可能にするシステム中
において、毛管ゾーン(capillary zone)電気泳動により
分離されたｄｓＤＮＡ成分の検出に使用する。これらの
通常使用される手順は、いくつかの不利な点に悩まされ
ている。高レベル(0.5-2.5μｇ／ml) の量の臭化エチジ
ウム（突然変異誘導原）を使用する。検出には、ＵＶト
ランスイルミネーターの使用が含まれる。従って、使用
者は、危険な近紫外線にさらされる。臭化エチジウムの
ｄｓＤＮＡへの結合における蛍光強化が約35倍であり、
染料は比較的弱くｄｓＤＮＡに結合する（Ｋdias＝10-6
Ｍ-1) 。従って、ｄｓＤＮＡ検出の感度が低い。一般
に、検出限界は、ゲル上における１mm×５mmバンドにお
いてｄｓＤＮＡ約１ngである。
【０００３】近年、他の染料、つまり不斉シアニン染
料、チアゾールオレンジ(4-[3-メチル-2,3- ジヒドロ-
(ベンゾ-1,3- チアゾール)-2-エチリデン]-キノリニウ
ムヨージド) が報告されている。この染料は、臭化エチ
ジウムを越えた多くの利点を示すが、サンプル中におけ
る二本鎖核酸を検出するためのより感度の高い技術を提
供し得ることについて継続した興味が存在しており、特
には、ＤＮＡの種々のフラグメントを分離し、その対象
フラグメントが極度に低い濃度で存在していてもよいと
いったものである。関連文献 リー（Lee)らの(1986)Cytometry ７:508-517は、エチジ
ウムより14倍高い吸光係数を有するチアゾールオレンジ
が、約3000倍の蛍光強化でｄｓＤＮＡに結合することを
報告している。染料は、網赤血球（上記のリーらの(198
6)；及びリー及びマイズ(Mize)の(1989)米国特許第4,88
3,867 号) 及び血液−骨パラサイト（blood-borne para
site)(リーとマイズの(1990)米国特許第4,937,198 号)
の検出に適用された。ライ(Ryeらの(1991)Nucleic Acid
s Res, 19:327-333 は、0.05μｇ／mlのチアゾールオレ
ンジをランニングバッファーに添加した時、20pgと同じ
位少ないＤＮＡバンドを含むＤＮＡ制限フラグメント
を、レーザー励起同焦点蛍光ゲルスキャナー(laser-exc
ited confocal fluorescence gel scanner) (Quesadaら
の(1991)Biotechniques 10:616-625;Mathies及びHuang
の(1992)毛管ゾーン電気泳動におけるバッファー中のチ
アゾールオレンジの混入により、ピコグラム量のｄｓＤ
ＮＡを10-6−10-7Ｍの存在下で染料なしに検出できる
（Schwartz及びUhfelderの(1992)Anal. Chem. 64:1737-
1740) 。
【０００４】
【発明の概要】溶液又はゲル中において２本鎖ＤＮＡ
（ｄｓＤＮＡ）を高感度で検出する蛍光染料である新規
組成物及びそれらの使用法を提供する。これらの化合物
は、ポリカチオン性鎖の存在、利用可能な類似物と比較
してｄｓＤＮＡに対する親和力が高いこと、及びｄｓＤ
ＮＡ結合における蛍光強化が高いことにより特徴付けら
れる。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明に従って、ゲル中及び溶液
中におけるＤＮＡ検出用の蛍光染料、特に、フェナント
リジニウム及び不斉シアニンポリカチオン性染料を提供
する。両方のケースにおいて、本発明の染料は、ｄｓＤ
ＮＡに対してかなり高い結合親和力を有し、市場で入手
可能な蛍光染料の蛍光強化のロスがない。より高い結合
親和力により、ｄｓＤＮＡ結合のためにより少ない量の
染料で十分であり、より多い洗浄を行い、ｄｓＤＮＡに
挿入された染料の実質的により少ないロスで、バックグ
ラウンドの染料を除去することができる。不斉シアニン
誘導体の場合、挿入複合体の増加安定性を有するだけで
なく、挿入における増加強化、及び危険なＵＶ暴露の可
能性を除去する緑色光での発光能力が得られる。それ
は、臭化エチジウムで染色されたゲル上のＤＮＡ検出の
ために今では使用されているトランスイルミネーターと
関連している。
【０００６】本発明の染料は、環員（annular member)
に結合した少なくとも１つのポリカチオン性鎖を有する
ことにより特徴付けられ、該環員は、通常は炭素又は窒
素であろう。側鎖は、染料が使用される条件下で、少な
くとも２つの陽電荷、通常は５個以下の陽電荷、より一
般には約４個以下の陽電荷を有するであろう。大抵は、
陽電荷はアミノ基をベースとしているが、硫黄、燐、ヨ
ウ素等の陽電荷を支持する他のエレメントも、これらの
カチオンが使用条件で安定である程度において適用でき
ることを見いだした。鎖の内部のアミノ基は、少なくと
も２つ置換されており、３又は４つ置換されていてもよ
い。アミノ末端基は、１つ〜４つ置換されていてもよ
い。通常、窒素は、少なくとも２つの炭素原子により分
離されるが、ピペラジン又はビピリジル等の複素環の基
を伴う場合、窒素原子間には、ただ１つの炭素原子、好
ましくは少なくとも２つの炭素原子が間に合ってもよ
い。窒素は、好適などのような基、通常、10個以下の炭
素原子、より一般には約６個以下の炭素原子（アルキ
ル、アリール、シクロアルキルであってもよい）により
置換されていてもよく、又は複素環により置換されてい
てもよく、即ち窒素は複素環の部分であってもよい。好
ましくはアルキレンアミンを使用し、該アルキレンは、
置換が１〜３個の炭素原子２又は３個の炭素原子を有す
る低級アルキル基での置換である場合、２又は３個の炭
素原子及び窒素原子を有している。大抵、側鎖は、線状
であり、鎖中の異原子に結合したソール枝（sole branc
h)を有する。
【０００７】使用することを見いだされた染料は、結合
が染料及び核酸の反対の電荷に関するものである挿入染
料又は非挿入染料であってもよい。それぞれの例におい
て、染料の核酸への結合における蛍光の実質的な強化が
存在することが観察された。種々の染料、特に、臭化エ
チジウム、チアゾールオレンジ、フルオレスセイン、チ
アゾールブルー及びアクリジンオレンジ等のモノマー染
料並びにそれらの誘導体を使用することができることを
見いだした。特に興味あるものは、一般に核酸には結合
するが、二本鎖核酸に挿入される染料である。発蛍光成
分は、環式、又は多環式の、特に、少なくとも２個で、
約６個以下の環、より一般的には約５個以下の環を有
し、少なくとも２個の環が融合し、通常は４個以下の環
が融合している多環式芳香族のものであってもよい。芳
香族化合物は、特に１〜３個、より一般的には１又は２
個の窒素原子を複素環原子（heteroannular atom) とし
て有する炭素環式又は複素環式のものであってもよい。
他の複素環的原子としては、酸素及び硫黄（カルコゲ
ン）がある。環は、幅広い種々の置換基により置換され
ていてもよく、該置換基としては、１〜４個、通常１又
は２個の炭素原子を有するアルキル基；ヒドロキシ、ア
ルコキシ及びカルボキシエステルを含み、一般的に１〜
４個の炭素原子を有するオキシ；モノ及びジ置換アミ
ノ、特にモノ及びジアルキルアミノを含み、０〜８個、
通常０〜６個の炭素原子を有するアミノ；チオ、特に１
〜４個、通常１又は２個の炭素原子を有するアルキルチ
オ；シアノ；カルボキシ及びその誘導体、特にカルボキ
シアミド又はカルボキシアルキルを含み、１〜８個、通
常１〜６個の炭素原子を有する非オキソカルボニル；一
般的に１〜４個の炭素原子を有するオキソカルボニル又
はアシル、特に原子番号９〜35までのハロゲンが挙げら
れる。
【０００８】特に興味ある発蛍光成分は、芳香族成分と
連結している１以上のエチレン基を有するリンキング基
（linking group)又は結合により連接している２つの環
システム(ring system) を包含している。興味ある芳香
族基として、フェナントリジン（ベンゾキノリン）、ベ
ンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾ
ール、キノリン、アクリジン及びキサンチン（xanthin
e) がある。例として、チアゾールオレンジ、チアゾー
ルブルー、エチジウム、フルオレスセイン、アクリジ
ン、フェナントリジン、キサンテン及びフルオロン(flu
orones) が挙げられる。側鎖は、従来のいずれの手段に
より発蛍光団に結合してもよい。従って、側基の異原子
を使用して、活性ハロゲン又は疑似ハロゲン(pseudohal
ogen) を置換して、カルボニル基での還元アミノ化を起
こさせ、カルボキシル基と反応して、アミドを形成し、
所望なら、その後、還元してメチレンアミン等にする。
他の異原子について、文献ちけうに記載されている類似
技術を使用することができる。本発明の化合物は、ラベ
リング剤として使用することができることを見いださ
れ、該化合物は、核酸の検出工程において使用される。
そのような適用として、現場でのハイブリッド形成にお
ける蛍光、気泡数(cell population) の流動不斉分析(f
low cytometric analysis)がある。
【０００９】本発明の組成物は、電界を使用する分離
（例えば電気泳動）において使用することができること
を見いだした。本発明の化合物を使用する際、核酸、通
常ＤＮＡ及び染料の両方を、適切な緩衝媒体に入れ、十
分な時間染料についてインキュベートして非共有結合さ
せ、核酸中に挿入する。染料の二本鎖核酸への結合比
は、所望の程度の感度に依存して、塩基対あたり染料約
１分子から、４００塩基対あたり染料１分子程度まで、
通常、１００塩基対あたり染料１分子の低さまでの幅広
い範囲で変動してもよい。約15bp／染料分子未満で、更
なる染料の添加における発光の増加は、上記15bp／染料
のものほど有効ではない。４塩基対又はそれ以上を越え
て存在する染料により、有為な抑制が生じ得、４塩基対
に対して染料１分子のモル比を越えた染料の量における
いかなる増加も望ましくない。しかしながら、ＤＮＡと
結合した染料の量は、キエンチング(quenching) が観察
されない場合、２塩基対あたり１の比、又は１塩基対あ
たり１の比又はそれより高い比であってもよい。一般的
に、最適結果のためには、染料の量の範囲は、４〜１０
０塩基対に対して、通常約１０〜５０塩基対に対して約
１の挿入染料である。異なるサンプルと異なる染料を組
み合わせ、その後、電気的に分離される異なるサンプル
を組み合わせることができる。従って、同一チャンネル
において、電気電気泳動を行う際、適切な場合には、同
一の波長の、照射用に使用されるＵＶ光を用いて、種々
のバンドの蛍光波長における違いを検出することにより
種々のバンドを検出することができる。
【００１０】核酸の量は、一般的に、電気泳動用に使用
される従来の量、一般的には、約５pg／μｌ〜５ng／μ
ｌの範囲である。蛍光能率のために、毛管電気泳動を効
果的に行うことができる。トリスアセテート又はトリス
ボレート等の種々の従来のバッファーを、一般的に約１
〜50mMの範囲、より通常は約１〜20mMの範囲で使用し
て、約５〜10の範囲、より通常は約７〜９の範囲のpHを
提供することができる。また、金属イオンのキレート
が、最小量で、一般的には、約0.05〜0.5mM で存在して
いてもよい。都合良くは、EDTAを使用することができ
る。染料及び核酸を少なくとも約５分、約２時間以内で
インキュベートすることができ、複合体形成は、通常、
室温で、約１時間未満、通常30分内にで完了する。イン
キュベートされた溶液は、直接使用してもよいが、適切
には、ゲルに適用する前に更に希釈する。電気泳動は、
都合の良い及び従来のいずれの手段においても行うこと
ができ、バンドは、今では、非共有結合の及び挿入染料
の蛍光により検出することができる。電気泳動により、
非結合染料をバンド領域から除去し、核酸において保持
されている染料が見いだされ、個々のバンドを蛍光スキ
ャンにより容易に検出することが確実なものとなる。核
酸をゲルに施す前に染料を有する核酸をインキュベート
する代わりに、分離された後の染料を施すことかでき
る。挿入染料は、非挿入染料と実質的に異なる吸収発光
範囲（absorption-emission range)（及びかなり強化さ
れた蛍光強度）を有するので、非挿入染料の有効量の存
在下でさえ、挿入染料を容易に検出することができる。
同様に、ゲル中及び残存バッファー中におけるかなり低
濃度、実質的に約0.2 未満、特に約0.1 μｇ／ml未満の
染料の存在下において電気泳動することができる。
【００１１】従来の検出システムのいずれのものも、個
々のバンドを検出するために使用することができる。使
用する具体的な染料に依存して、励起光を、吸収染料の
主な吸収バンド内に存在するように選択する。特に興味
があるのは、同焦点レーザースキャニング蛍光イメージ
システムの使用である。都合が良いことが見いだされて
いるシステムは、長期通過二色ビームスプリッター(lon
g-pass dichroic beam splitter)を使用して、レーザー
ビームを顕微鏡の対物レンズを通してサンプル上へ反射
させる。蛍光発光を、対物レンズにより集め、ビームス
リッターを介してフォトデテクター(photodetector) に
通す。次いで、その蛍光発光を、立体(spatial) フィル
ターを通過させて、長期通過又はバンド通過色又は干渉
フィルターにおける同焦点検出を、光電子倍増管に達す
る前に、実施する。適切なサーボモーター駆動ＸＹトラ
ンスレーション段階を、2.5 μｍ分解で用いて、従来の
スピード、即ち約１〜５cm／秒でレーザービームを通過
させたゲルをトランスレートする。マイクロコンピュー
ターを使用して、ＸＹトランスレーション段階を調節
し、イメージを得て、表示する。蛍光イメージを、その
後、疑似彩色（pseudo-color) 及びコードして、イメー
ジを強化するためのヒストグラム均等化方法により伸長
された異なる強度レベル及びコントラストを表す。イメ
ージデータを定量するために、核酸バンドを含むイメー
ジカラムを抽出(extract) 及び統合(integrate) するこ
とができる。核酸を、更なる使用のために、挿入蛍光染
料なしに容易に分離することができる。核酸の50％又は
それ以上の回収のためにGeneclean(登録商標) キットを
使用することができる。核酸を含む挿入染料とグラスミ
ルク(Glassmilk) （例えば約約１〜10ｎｇの核酸（１〜
５μｇ／ml核酸）と約１〜10μｇ／mlのグラスミルク）
とをアルカリ金属ヨージドの水溶液中において組み合わ
せ、約５〜60分間攪拌しながらインキュベートし、遠心
分離することにより、得られたペレットを分離する。ペ
レットを、適切なエタノール緩衝水溶液中（例えば１：
１）において再懸濁(resuspend) し、遠心分離し、そし
てこの洗浄手順を繰り返した後、実質的に蛍光染料を含
まない核酸を得る。
【００１２】電気泳動中における本発明の挿入蛍光染料
の使用により、かなり少ないバックグラウンドの成功と
同等に得られる高レベルの蛍光強度のために、かなり強
化された感度が達成される。知られていない組成物の混
合物におけるＤＮＡフラグメントのサイズ及び量は、該
混合物の複雑さに依存して100pg 〜１ngの範囲の材料の
全量、及びフラグメントのサイズの範囲により測定する
ことができる。従って、本発明の方法は、約５ng未満、
特に約１ng未満、頻繁には約100pg 未満、約50pg未満に
おいてさえも核酸の検出における適用が見いだされた。
電気泳動における核酸バンドの検出用の本発明の染料を
使用する代わりに、ｄｓＤＮＡ及び本発明の染料を実質
的に飽和で含む組成物を使用することができ、該ｄｓＤ
ＮＡは、共有的又は非共有的のいずれかで、他の内在物
(entity)へ結合するための内在物に接している。内在物
は、相違内在物に対する特定の親和力を有するので、種
々の他のタイプの分子と比較して、特定結合ペアと称さ
れるか、又は、ポリペプチド又はサッカライド等の他の
分子と反応するための共有結合官能価として称される。
所望の蛍光強度に依存して、ｄｓＤＮＡの長さ、並びに
非共有結合及び挿入のレベルを変えて、分子当たりの蛍
光強度を増加させることができる。通常、少なくとも約
16塩基対、より一般的には、少なくとも20塩基対が存在
し、少なくとも約1kbp又は2kbp以上ものｄｓＤＮＡを有
していてもよい。ｄｓＤＮＡの具体的な長さは本発明で
は厳格なものではなく、分子あたりに必要とされる蛍光
強度、ラベルの目的、都合等に従って変更することがで
きる。
【００１３】ｄｓＤＮＡにより他の分子に結合する方法
が提供されるべきである。これは、ラベルが使用される
方法に依存して、幅広い種々の方法において達成するこ
とができる。例えば、ｄｓＤＮＡは、ビオチン結合ヌク
レオチド、１種以上のビオチンを含んでいてもよく、該
ビオチンは、アビジン又はストレプトアビジン(strepta
vidin)（以降、両者は“アビジン”として言及する）に
結合するであろう。ビオチンは、手順の性質、条件に依
存してヌクレオチドあたり１つのビオチンからヌクレオ
チドの0.1 ％まで変動してもよい。あるいはまた、いず
れの分子も、特に、興味あるサンプル中においてカウン
トされなる小さな有機分子（約２kdal未満）を使用する
ことができ、その小さな有機分子は、それが特異的に結
合する特定のレセプター又は抗体、特にモノクローナル
抗体を有している。従って、チロキシン、コルチコステ
ロイド、エストロゲン、レチノイン及びマンノース等
を、そのような分子に特異的に結合するタンパクと共に
使用することができる。あるいはまた、抗体が製造され
る合成分子、例えば、2,4-ジニトロフェニル、バルビツ
ール酸塩及びホスファリチジルコリン等を使用すること
ができる。これらの分子は、ＤＮＡ合成の間、内部又は
末端ヌクレオチドに結合されることにより含まれていて
もよく、該ＤＮＡは、従来の自動手順に従って合成さ
れ、又はＤＮＡの合成後、利用可能なヒドロキシル基又
はアミノ基のいずれかへの結合により添加されてもよ
い。
【００１４】結合内在物は、アミノ、ヒドロキシル、チ
オ、カルボニル、活性オレフィン又はアリール等の安定
共有結合を形成することが可能な官能価を有する分子に
共有結合する活性官能価であってもよく、該官能価は、
天然に発生したヌクレオチドの官能価とは異なる。ラベ
ルは、チオール基との反応のためのマレイル、アミンと
の反応のためのカルボキシル等の活性オレフィンにより
改質することができる。この方法において、多くの異な
るタイプの分子を、診断、競争アッセイ及び非競争アッ
セイ、組織学、細胞学、そして電気泳動、HPLC、FACS等
の分離における使用のために蛍光ラベルすることができ
る。ＤＮＡのストランドは種々の構造をしていてもよ
い。多くの場合、ｄｓＤＮＡは二本鎖であり、該ストラ
ンドは完全に又は部分的にのみオーバーラップしていて
もよく、その末端は5'及び／又は3'方向に伸長していて
もよく、一方のストランドは他方のストランドより実質
的に長くてもよく、他方のストランドは、5'近辺、3'近
辺又は中央で結合していてもよい。あるいはまた、二本
のストランドは、オーバーラップして付着末端を提供し
てもよく、該ＤＮＡの単一ストランド部分を、その後、
使用して相補性配列に結合することができる。あるいは
また、逆方向反復単一ストランドを提供することがで
き、該ストランドはそれ自体において環を形成して二本
鎖部分を提供する。ヘアピン構造をラベリングのために
単独で使用してもよく、ヘアピンの単一ストランド部分
を、相補性配列へのハイブリッド化のために使用しても
よい。ハイブリッド化単一ストランド部分は、付着末端
を提供する、5'又は3'末端のいずれかで伸長したもので
あってもよく、又はヘアピンのループ中に存在していて
もよい。
【００１５】本発明のラベルは、直接的又は関節的にラ
ベルが結合する分子、使用媒体、及び使用状況から、妨
害なしに、高いレベルの蛍光強度を提供する、幅広い種
々の環境及び関係において使用することができる。従っ
て、本発明のラベルは、特定の結合ペアアッセイ(bindi
ng pair assay)において使用することができ、該ラベル
は、特定の結合ペアコンビネーションを通して他の分子
に容易に結合され得る。例えば、診断アッセイにおい
て、アビジン結合抗体（該抗体は興味のある分子に結合
する）を、ビオチンラベルＤＮＡ染料組成物に結合し
て、蛍光ラベル抗体を提供することができる。あるいは
また、抗体をビオチンでラベルし、アビジンが、ビオチ
ンラベル抗体とビオチンラベルＤＮＡ染料組成物との間
の橋（bridge) として機能してもよい。この方法におい
て、蛍光ラベルは、サンプルを相補性特定結合ペアメン
バーと結合し、アッセイ（その後、ラベルを添加及び全
ての非特定的結合ラベルを除去）した後に添加すること
ができる。単一ストランドＤＮＡ配列がラベルの部分と
して提供され、これは相補性ＤＮＡ又はＲＮＡ配列への
ハイブリッド化のために使用することができる。非共有
結合及び挿入染料の存在により、ｄｓＤＮＡの安定性が
かなり高まる。従って、本発明のラベルは、変性媒体中
に、非共有結合及び挿入ｄｓＤＮＡが安定であり、一方
ではサンプルＤＮＡが変性されて単一ストランドが提供
される条件下において導入することができる。単一スト
ランドＤＮＡ又はＲＮＡが存在する場合、変性条件を提
供する必要はないであろう。従って、本発明の分子は、
ＤＮＡ配列を確認するためのプローブとして、サザンブ
ロット法及びノーザンブロット法における電気泳動、ポ
リメラーゼ鎖反応等の幅広い種々の条件下において使用
することができ、該ストランド配列はプライマーとして
機能してもよい。
【００１６】本発明の染料は、単一ストランド核酸鎖を
用いて調製し、該染料が飽和の少なくとも約25％、飽和
の約100 ％まで存在する組成物を提供することができ
る。通常、単一ストランドは、少なくとも約50塩基対、
より一般には少なくとも約100塩基対を有しており、１k
b以上であってもよい。染料を、単一ストランド核酸、
特に単一ストランドＤＮＡに結合することにより、単一
ストランドＤＮＡを含むサンプルの検出に直接使用する
ことができる試薬を提供する。サンプルは、異なる配列
のナンバーについて、異なる染料を有する異なるプロー
ブを用いることによって試験することができ、該プロー
ブは、次の染料の添加前に、過剰単一ストランドプロー
ブ及び染料の洗浄(washing away)と同時に又は連続的
に、好ましくは連続的に添加することができる。また、
本発明の蛍光非共有結合及び挿入ＤＮＡは、現場でのハ
イブリッド形成研究、一方の二本鎖ストランド核酸分子
から他方への蛍光分子の分子間移行のために、例えば、
蛍光体が媒体に移行されることなく蛍光染料を移行する
ために、使用することができる。これは、トリプレック
スフォーメーション(triplex ormation)を有するクロモ
ソームの製造において、ゲル中における又は膜上等にお
ける核酸への移行の際に使用することができることを見
いだした。蛍光挿入ＤＮＡは磁気等の粒子へ結合して、
使用後に移行剤(transfer agent)として除去されてもよ
い。本発明の化合物は、同焦点蛍光イメージシステムに
より有利に使用することができ、100pg 未満のＤＮＡが
いつくかの染料により検出され、一方、約５pg未満のＤ
ＮＡが、他の組み合わせにより検出されてもよい。組織
学及び細胞学においては、本発明の蛍光ラベルにより、
ターゲットエピトープ（特に低いレベル）の検出におい
て高い感度が提供される。
【００１７】多くの適用のために、複数の蛍光分子が望
まれている。キットを提供することができ、該キット中
における蛍光分子は、比較的狭い範囲の一般的に約460
〜540 nm内の最大吸収、少なくとも約15nm、好ましくは
少なくとも約25nm、通常は約100nm 以下に離れて位置す
る最大発光を有することにより特徴付けることができ
る。既に示したように、試薬を調製することができ、該
染料は、核酸プローブと結合し、コンテナ中において、
便宜のために、直接使用のために適用される。従って、
そのキットは、異なる染料を有する異なるプローブを含
むコンテナを２以上、同一の染料を有するプローブを２
以上、又はそれらの組み合わせを有していてもよい。あ
るいはまた、染料中のプローブは、分離コンテナ中にお
いて分離して保持することができる。以下の実施例は、
説明のために示したのであって、限定されるものとして
示したのではない。
【００１８】
【実施例】染料の合成 N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾール
オレンジの合成 反応性シアニン染料中間体を、図１に記載したように合
成した。化合物１を、還流ジオキサン中でレピジン(lep
idine)を５当量の1,3-ジヨードプロパンでアルキル化し
て高収率で製造し、一方、３当量のヨードメタンを、3-
メチルベンゾチアゾール-2- チオンと還流エタノール中
において反応させ、かつエタノールにより沈殿させて、
定量的に化合物２を形成させた。ヨードプロピルレピジ
ン１を、Brooker ら((1941) J, Am, Chem, Soc. 63:319
2-3203;Brookerら(1942)同64:199-210) の方法によりベ
ンゾチアゾール誘導体２と15分以内で反応させて、ヨー
ドプロピルチアゾールオレンジ誘導体３を高収率で生成
した。化合物３を、過剰のN,N'- テトラメチル-1,3- ジ
アミノプロパンと反応させて、N,N'- テトラメチル-1,3
- ジアミノプロピルチアゾールオレンジ４を高収率で形
成した。
【００１９】ジエチレントリアミンエチジウムの合成
（図２） フェナントリジニウム誘導体５を無水ピリジン中に懸濁
させた。カーボベンジルオキシクロライド（2.2 当量）
を０℃で滴加し、反応混合物を室温で12時間攪拌し、エ
ーテル／石油エーテルで沈殿させ、固形物をCH2Cl2中に
懸濁させ、そして、10％NaHCO3で洗浄した。有機層を、
MgSO4 で乾燥し、濃縮し、フラッシュカラム(flash col
umn)MeOH:CH2Cl2(1:50) により精製した。淡褐色固形物
を無水ニトロベンゼン中に懸濁させ、５当量の1,3-ジヨ
ードプロパンを添加した。混合物を、160 ℃で砂浴中に
おいて４時間加熱し、その後、化合物６をエーテルによ
り沈殿させた。精製は、フラッシュカラムMeOH:CH2Cl
2(1:10) により行った。固形物を無水MeOH中に懸濁さ
せ、10当量の1,3-ジエチレントリアミンを添加した。混
合物を７時間還流した。生成物を、H2O により沈殿さ
せ、固形物をEtOH中に懸濁させ、濃縮HCl により酸性に
し、そしてエーテルにより沈殿させた。精製はフラッシ
ュカラムEtOAc:AcOH:H2O (容量で6:3:2)により行った。
カーボベンズオキシ基をHBr/AcOHを用いて除去し、ジエ
チレントリアミンエチジウム７を得た。テトラメチレン
エタンジアミンチアゾールオレンジ及びプロパンジアミ
ンエチジウムを上述の手順と同様の手順により合成し
た。
【００２０】結果 ポリカチオン性鎖を有するエチジウム染料の蛍光強化
は、本質的に、臭化エチジウムについてものと同様のも
のであった。チアゾールオレンジ誘導体についても、正
に同一であった（表１）。チアゾールオレンジ及びN,N'
- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレ
ンジ（共に7.9 ×10-7Ｍ染料）での溶液中におけるｄｓ
ＤＮＡの滴定の比較を図３に示した。染料（7.9 ×10-7
Ｍ）を、室温で、pH8.2 で４mMのTAE バッファーのＤＮ
Ａ溶液（10-500ng/ml)に添加した。励起が488nm に存在
し、かつそれぞれの染料について、そのＤＮＡ複合体の
最大発光 (emission maximum) での蛍光を測定した。挿
入図は、10-100ngＤＮＡ／mlの滴定曲線の領域を拡大型
で示したものである。N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミ
ノプロパンチアゾールオレンジ及びチアゾールオレンジ
の両方とも、10-500ngＤＮＡ／mlにおいて、ｄｓＤＮＡ
濃度における蛍光発光（fluorescence emission)の直線
的な関連性得た。N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプ
ロパンチアゾールオレンジにより、チアゾールオレンジ
より３倍高い蛍光シグナルが得られたことに注意すべき
である。更に、前者の染料により、ｄｓＤＮＡ測定を、
より低いＤＮＡ濃度まで容易に拡大することができた。
【００２１】ｄｓＤＮＡ染料複合体の解離速度及びゲル
上におけるｄｓＤＮＡ検出の感度 電気泳動における染料の消失は、臭化エチジウム、チア
ゾールオレンジ及びポリカチオン性鎖を有する誘導体に
ついての厳格な第１次速度（first order kinetics) に
従う（図４及び５）。電気泳動終了時、ゲルを、レーザ
ー励起蛍光ゲルスキャナー(laser-excited fluorescenc
e gel scanner)によりスキャンした。イメージプロセッ
シング（image processing) を、それぞれのレーンにつ
いてImage(商標) ソフトウェアを用いて行い、それぞれ
の時間についての蛍光強度プロットを得た。時間に対す
る蛍光強度のlog プロット（図５を参照されたい）によ
り、染料の消失が第１次速度に従うことが示され、かつ
ｄｓＤＮＡ染料複合体の解離についてのｔ1/2 の測定が
可能となる。チアゾールオレンジ及び臭化エチジウムに
ついて、HindIII により線状化されたプラスミドＭ13の
50ngアリコートを、ＤＮＡｂｐ：染料２：１で、4mM の
TAE 、ph8.2 中において染料と混合し、かつ５分間隔で
ゲルに施した。他の染料について、３ngアリコートのλ
ＤＮＡ／HindIII フラグメントを、ＤＮＡｂｐ：染料
５：１で、4mM のTAE-80mM のNaCl、ph8.2 中におい
て、それぞれの染料と混合し、かつ15分間隔で添加し
た。
【００２２】上記の結果から、本発明の組成物により、
新規かつ重要な一群のＤＮＡ結合蛍光体が提供されるこ
とは明らかである。これらの組成物により、強化された
蛍光性が提供され、電気泳動条件下における半減期が、
一般的に利用可能な類似物と比べ、実質滴に強化されて
いる蛍光体の強化された結合が示される。遊離染料及び
ＤＮＡに結合した染料間の平衡は、ポリカチオン性側鎖
をもたない類似物と比較して、結合染料についてかなり
望ましいものである。従って、少ない染料を用いて、か
なり少ないバックグラウンドで、極少量のＤＮＡを検出
して、より感度の高い及びより精度の高いＤＮＡ検出が
提供される。ポリカチオン性フェナントリジン誘導体に
ついて、厳格な結合（tighter binding)の利点は、ゲル
の染色（ＤＮＡ及び溶液の検出）を、臭化エチジウムを
用いた場合より10倍少ない染料で達成することができる
ことである。更に、染色後のゲルのより多い洗浄を、結
合染色のより少ないロスで行うことができ、それは、ｄ
ｓＤＮＡ検出の感度における10倍の改良につながる。
【００２３】ポリカチオン性不斉シアニン誘導体につい
て、ｄｓＤＮＡ染料複合体は、チアゾールオレンジを用
いて形成されたものより安定性がかなり高いが、それら
は、約500nm での高い吸光係数及びｄｓＤＮＡへの結合
における高い蛍光強化(3000倍より高い) を保持してい
る。これらの新規な染料は、従って、感度が10倍高いｄ
ｓＤＮＡ検出用ゲルの後染色(post-staining) を可能に
し、また、溶液中のｄｓＤＮＡをより高い感度で検出す
ることを可能にする。更に、緑色光を有するｄｓＤＮＡ
染料複合体の有効励起は、臭化エチジウムにより染色さ
れたゲルにおけるＤＮＡ検出のために今や一般的に使用
されているトランスイルミネーター(transilluminator)
と関連している危険なUV暴露の可能性を除去する。これ
らの染料は、特に、可視スペクトル範囲内における励起
を用いる感度ゲルスキャナー(sensitive gel scanner)
について適用される。複合体の相対安定性は、ｔ1/2 値
を比較することにより便宜的に評価する（図６における
表Ｉ）。この比較から、ポリカチオン性置換基を含んだ
染料が、かなりより強力にｄｓＤＮＡに結合することは
明らかである。これらの結果から期待されるように、チ
アゾールオレンジ（２×10-7Ｍ）より10倍低い濃度（２
×10-8 Ｍ）でのN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプ
ロパンチアゾールオレンジでのゲルの後染色により、ｄ
ｓＤＮＡ検出の感度が14倍高くなった。臭化エチジウム
（２×10-6Ｍ）より10倍低い濃度（２×10-7Ｍ）でのジ
エチレントリアミンエチジウムにより、ｄｓＤＮＡ検出
の感度が1.7 倍高くなった。
【００２４】ゲル電気泳動 電気泳動を、40mMのトリスアセテート−10mMのEDTA(TA
E) 、pH8.2 中において10V/cm、厚さ１mmの鉛直0.9 ％
アガロースゲルランにおける、Mini-ProteanII装置(Bio
Rad, Richmond, CA)において行った。ゲルを、サンプル
添加の前に１時間、予備電気泳動(pre-electrophorese)
した。50mMのNaClを含み、pH8.2 の４mM TAEへの希釈に
よる各実験前に、染料溶液を、濃縮貯蔵染料（MeOH又は
DMSO中の１×10-4M)から調製した。
【００２５】ｄｓＤＮＡ染料複合体の解離速度の測定 ｄｓＤＮＡ染料複合体からの染料の消失速度(off-rate)
を、下記アッセイにより測定した。λＤＮＡ／HindIII
を、臭化エチジウム及びチアゾールオレンジについては
ＤＮＡ塩基対と染料の比を２：１で、他の染料について
は５：１で、それぞれの染料と混合した。混合物の等し
い量を、電気泳動中に、５〜15分（適切に）の間隔でゲ
ル上に添加した。電気泳動の時間の関数としてのそれぞ
れのバンドにおける染料保持の量を、アルゴンイオンレ
ーザー励起蛍光ゲルスキャナー（Quesada ら(1991)Biot
echniques 10, 616-625;Mathies and Huang(1992) Natu
re359, 167-169)を用いてスキャンすることにより測定
した。
【００２６】異なる染料での後染色による検出の感度の
比較 ５〜30ngまで変動する量のλＤＮＡ／HindIII フラグメ
ントを含むサンプルを、同一のゲル上において繰り返し
電気泳動した。電気泳動の45分後、ゲルを半分にカット
し、40mM TAEバッファーにおいて染色した。半分のゲル
をN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾー
ルオレンジ（２×10-8M)中に浸漬し、残りの半分のゲル
をチアゾールオレンジ（２×10-7M)中に浸漬した。第２
ゲルの半分を、ジエチレントリアミンエチジウム（２×
10-7M)中に浸漬し、残りの半分をエチジウム（２×10-6
M)中に浸漬した。これは、全て40mMのTAE 中において行
った。浸漬40分後、ゲルを、20分間染料を含まない40mM
TAE溶液に移動させ、その後上述のようにスキャンし
た。本明細書において記載した全ての文献及び特許出願
は、それぞれの文献又は特許出願が具体的に及び個々に
本明細書中に含まれるものとして示されている程度にお
いて本明細書に含まれるものとする。本発明は、十分に
記載されており、多くの変化及び変更が、添付クレーム
の精神及び範囲を逸脱することなく行うことができるこ
とは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチ
アゾールオレンジの合成を示す図式である。
【図２】ジエチレントリアミンエチジウムの合成を示す
図式である。
【図３】チアゾールオレンジとN,N'- テトラメチル-1,3
- ジアミノプロパンチアゾールオレンジを用いた溶液に
おける子牛の内分泌腺ＤＮＡの量を示すグラフである。
【図４】図において示した長さについて、Ｒｙｅらの(1
991)Nucleic Acids Res, 19, 327-333に記載されたよう
なアガロースゲル(0.9％) 上において電気泳動された、
４mMのTAE-80mMのNaCl、pH8.2 の中における、５：１の
ＤＮＡｂｐ染料比でのN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミ
ノプロパンチアゾールオレンジと混合されたλＤＮＡ／
HindIII 消化(digest)のサンプルのグラフである。
【図５】図４に関連して記載された電気泳動の条件下に
おける、種々のｄｓＤＮＡ染料複合体の解離速度の比較
である。（Ａ）では、臭化エチジウム、1,3-プロパンジ
アミンエチジウム及びジエチレントリアミンエチジウム
でのｄｓＤＮＡ複合体の解離を比較している。（Ｂ）
は、トリアゾールオレンジ及びN,N'- テトラメチル-1,3
- ジアミノプロパンチアゾールオレンジとのｄｓＤＮＡ
複合体の解離を比較している。
【図６】表１にｄｓＤＮＡ染料複合体の相対安定性（ｔ
1/2 ）及びＦ結合／Ｆ遊離を染料の構造とともに示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/533 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３０１Ｂ ３１５Ｚ (72)発明者 ベンソン スコット シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94706アルバニー アダムス ストリー ト 818 (56)参考文献 特表 平８−505776（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／6482（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．87，3851−５, 1990 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，17 （24），5071−８，1978 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C09B 69/00 B C09K 11/06 Z C12Q 1/68 Z G01N 27/26 G01N 33/533 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共
    有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベ
    ンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、アク
    リジン及びキサンテンからなる群から選択されたただ１
    つの発蛍光基を含む蛍光化合物であって、該鎖がアミノ
    末端基を有し、該アミノ基が置換されている場合には該
    置換基が１０個以下の炭素原子を含み、かつ、該蛍光化
    合物がフェナントリジンを含む場合には該フェナントリ
    ジン基が３又は８位に未置換のアミノ基を含む蛍光化合
    物。
  2. 【請求項２】 少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共
    有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベ
    ンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、アク
    リジン及びキサンテンからなる群から選択されたただ１
    つの発蛍光基から本質的になる蛍光化合物であって、該
    蛍光化合物がフェナントリジンを含む場合には該フェナ
    ントリジン基が３又は８位に未置換のアミノ基を含む蛍
    光化合物。
  3. 【請求項３】 前記鎖が２〜５個の窒素原子を有する請
    求項１又は２に記載の蛍光化合物。
  4. 【請求項４】 前記発蛍光基がエチジウム基である請求
    項１又は２に記載の蛍光化合物。
  5. 【請求項５】 前記発蛍光基がチアゾールオレンジ基で
    ある請求項１又は２に記載の蛍光化合物。
  6. 【請求項６】 前記鎖が２〜５個の窒素原子を有するア
    ルキレンアミンである請求項１又は２に記載の蛍光化合
    物。
  7. 【請求項７】 前記蛍光化合物がキノリン及びベンゾチ
    アゾールの少なくとも１つを含む請求項１又は２に記載
    の蛍光化合物。
  8. 【請求項８】 蛍光染料を用いる核酸検出法において、
    該蛍光染料として、少なくとも２つの陽電荷を有する鎖
    に共有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾー
    ル、ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリ
    ン、アクリジン及びキサンテンからなる群から選択され
    たただ１つの発蛍光基を含む蛍光化合物であって、該鎖
    がアミノ末端基を有し、該アミノ基が置換されている場
    合には該置換基が１０個以下の炭素原子を含む蛍光化合
    物を使用することを含む該検出法。
  9. 【請求項９】 少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共
    有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベ
    ンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、アク
    リジン及びキサンテンからなる群から選択されたただ１
    つの発蛍光基を含む蛍光化合物であって、該鎖がアミノ
    末端基を有し、該アミノ基が置換されている場合には該
    置換基が１０個以下の炭素原子を含む蛍光化合物の少な
    くとも１つに非共有結合した核酸分子。
  10. 【請求項１０】 少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に
    共有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、
    ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、ア
    クリジン及びキサンテンからなる群から選択されたただ
    １つの発蛍光基から本質的になる蛍光化合物の少なくと
    も１つに非共有結合した核酸分子。
  11. 【請求項１１】 チアゾールオレンジテトラメチルプロ
    パンジアミン又はチアゾールオレンジテトラメチルエタ
    ンジアミン。
  12. 【請求項１２】 エチジウムエタンジアミン又はエチジ
    ウムジエチレントリアミン。
  13. 【請求項１３】 核酸の検出用に蛍光染料を用いてゲル
    電気泳動を行う方法において、少なくとも２つの陽電荷
    を有する鎖に共有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾ
    チアゾール、ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、
    キノリン、アクリジン及びキサンテンからなる群から選
    択されたただ１つの発蛍光基を含む蛍光化合物であっ
    て、該鎖がアミノ末端基を有し、該アミノ基が置換され
    ている場合には該置換基が１０個以下の炭素原子を含む
    蛍光化合物を該蛍光染料として使用することを含む該ゲ
    ル電気泳動を行う方法。
  14. 【請求項１４】 核酸の検出用に蛍光染料を用いてゲル
    電気泳動を行う方法において、少なくとも２つの陽電荷
    を有する鎖に共有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾ
    チアゾール、ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、
    キノリン、アクリジン及びキサンテンからなる群から選
    択されたただ１つの発蛍光基から本質的になる蛍光化合
    物を該蛍光染料として使用することを含む該ゲル電気泳
    動を行う方法。
  15. 【請求項１５】 前記発蛍光基がチアゾールオレンジ又
    はエチジウムである請求項13又は14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に
    共有結合したベンゾチアゾール、フェナントリジン及び
    キノリンからなる群から選択されたただ１つの発蛍光基
    を含む蛍光化合物であって、該鎖が２〜５個の窒素原子
    を有するアルキレンアミンであり、該窒素原子の１つが
    該鎖の末端原子であり、該蛍光化合物がフェナントリジ
    ンを含む場合には該フェナントリジン基が３又は８位に
    未置換のアミノ基を含む蛍光化合物。
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