JPH09500403A - 二本鎖ｄｎａの高感度検出用染料 - Google Patents

二本鎖ｄｎａの高感度検出用染料

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JPH09500403A JP6525478A JP52547894A JPH09500403A JP H09500403 A JPH09500403 A JP H09500403A JP 6525478 A JP6525478 A JP 6525478A JP 52547894 A JP52547894 A JP 52547894A JP H09500403 A JPH09500403 A JP H09500403A
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Abstract

(57)【要約】 少なくとも２つの陽電荷を有するポリカチオン性鎖に結合した蛍光体を有することにより特徴付けることができる新規な蛍光染料を提供する。染料は、ポリカチオン性鎖を持たない蛍光体と比べて、核酸への結合における高い強化を提供し、核酸への強い結合親和性を有することを見いだした。染料は、実質的に少ない染料を用いて、実質的により高い感度で、ゲル電気泳動及び溶液におけるｄｓＤＮＡを検出する際に使用できることを見いだした。

Description

【発明の詳細な説明】 二本鎖ＤＮＡの高感度検出用染料 概論 技術分野 本発明の分野は、核酸挿入蛍光染料である。 技術背景 アガロース又はアクリルアミドゲル上における、又は毛管電気泳動(capillary electrophoresis)中におけるｄｓＤＮＡの検出のための標準手順では、フェナン トリジニウム染料、臭化エチジウムを利用する。一般的に、ゲル上における検出 は、２つの方法のうちの１つの方法において達成される。第一の手順では、ゲル 電気泳動の終わりに、ゲルを臭化エチジウムの水溶液中に置き、染料溶液と平衡 にした後、短時間で染料を含まない溶液に移して、ゲル中の染料の量を増加させ る。ＤＮＡ含有バンドを、その後、トランスイルミネーター(transilluminator) において近紫外線により可視化する。第二の手順では、低濃度の臭化エチジウム を電気泳動分離用のランニングバッファー中に導入し、可視化を更なる操作なし に上述のように行う。後者の手順は、また、オンラインでの蛍光検出を可能にす るシステム中において、毛管ゾーン(capillary zone)電気泳動により分離された ｄｓＤＮＡ成分の検出に使用する。これらの通常使用される手順は、いくつかの 不利な点に悩まされている。高レベル(0.5-2.5μｇ／ml)の量の臭化エチジウム （突然変異誘導原）を使用する。検出には、ＵＶトランスイルミネーターの使用 が含まれる。従って、使用者は、危険な近紫外線にさらされる。臭化エチジウム のｄｓＤＮＡへの結合における蛍光強化が約35倍であり、染料は比較的弱くｄｓ ＤＮＡに結合する（Ｋdias＝10-6Ｍ-1）。従って、ｄｓＤＮＡ検出の感度が低い 。一般に、検出限界は、ゲル上における１mm×５mmバンドにおいてｄｓＤＮＡ約 １ngである。 近年、他の染料、つまり不斉シアニン染料、チアゾールオレンジ(4-[3-メチル -2,3-ジヒドロ-(ベンゾ-1,3-チアゾール)-2-エチリデン]-キノリニウムヨージ ド）が報告されている。この染料は、臭化エチジウムを越えた多くの利点を示す が、サンプル中における二本鎖核酸を検出するためのより感度の高い技術を提供 し得ることについて継続した興味が存在しており、特には、ＤＮＡの種々のフラ グメントを分離し、その対象フラグメントが極度に低い濃度で存在していてもよ いといったものである。関連文献 リー(Lee)らの(1986)Cytometry 7:508-517は、エチジウムより14倍高い吸光係 数を有するチアゾールオレンジが、約3000倍の蛍光強化でｄｓＤＮＡに結合する ことを報告している。染料は、網赤血球（上記のリーらの(1986)；及びリー及び マイズ(Mize)の(1989)米国特許第4,883,867号）及び血液−骨パラサイト(blood- borne parasite)(リーとマイズの(1990)米国特許第4,937,198号)の検出に適用さ れた。ライ(Ryeらの(1991)Nucleic Acids Res，19:327-333は、0.05μｇ／mlの チアゾールオレンジをランニングバッファーに添加した時、20pgと同じ位少ない ＤＮＡバンドを含むＤＮＡ制限フラグメントを、レーザー励起同焦点蛍光ゲルス キャナー(laser-excited confocal fluorescence gel scanner)(Quesadaらの(19 91)Biotechniques 10:616-625;Mathies及びHuangの(1992)毛管ゾーン電気泳動に おけるバッファー中のチアゾールオレンジの混入により、ピコグラム量のｄｓＤ ＮＡを10-6−10-7Ｍの存在下で染料なしに検出できる(Schwartz及びUhfelderの( 1992)Anal．Chem．64:1737-1740)。 発明の概要 溶液又はゲル中において２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を高感度で検出する蛍光 染料である新規組成物及びそれらの使用法を提供する。これらの化合物は、ポリ カチオン性鎖の存在、利用可能な類似物と比較してｄｓＤＮＡに対する親和力が 高いこと、及びｄｓＤＮＡ結合における蛍光強化が高いことにより特徴付けられ る。 図の簡単な説明 図１は、N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレンジの合 成を示す図式である。 図２は、ジエチレントリアミンエチジウムの合成を示す図式である。 図３は、チアゾールオレンジとN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチ アゾールオレンジを用いた溶液における子牛の内分泌腺ＤＮＡの量を示すグラフ である。 図４は、図において示した長さについて、Ｒｙｅらの(1991)Nucleic Acids Re s, 19，327-333に記載されたようなアガロースゲル(0.9％)上において電気泳動さ れた、４mMのTAE-80mMのNaCl、pH8.2の中における、５：１のＤＮＡｂｐ染料比 でのN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレンジと混合され たλＤＮＡ／HindIII消化(digest)のサンプルのグラフである。 図５は、図４に関連して記載された電気泳動の条件下における、種々のｄｓＤ ＮＡ染料複合体の解離速度の比較である。パネルＡでは、臭化エチジウム、1,3- プロパンジアミンエチジウム及びジエチレントリアミンエチジウムでのｄｓＤＮ Ａ複合体の解離を比較している。パネルＢは、トリアゾールオレンジ及びN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレンジとのｄｓＤＮＡ複合体 の解離を比較している。 具体的な実施態様の記載 本発明に従って、ゲル中及び溶液中におけるＤＮＡ検出用の蛍光染料、特に、 フェナントリジニウム及び不斉シアニンポリカチオン性染料を提供する。両方の ケースにおいて、本発明の染料は、ｄｓＤＮＡに対してかなり高い結合親和力を 有し、市場で入手可能な蛍光染料の蛍光強化のロスがない。より高い結合親和力 により、ｄｓＤＮＡ結合のためにより少ない量の染料で十分であり、より多い洗 浄を行い、ｄｓＤＮＡに挿入された染料の実質的により少ないロスで、バックグ ラウンドの染料を除去することができる。不斉シアニン誘導体の場合、挿入複合 体の増加安定性を有するだけでなく、挿入における増加強化、及び危険なＵＶ暴 露の可能性を除去する緑色光での発光能力が得られる。それは、臭化エチジウム で染色されたゲル上のＤＮＡ検出のために今では使用されているトランスイルミ ネーターと関連している。 本発明の染料は、環員（annular member）に結合した少なくとも１つのポリカ チオン性鎖を有することにより特徴付けられ、該環員は、通常は炭素又は窒素で あろう。側鎖は、染料が使用される条件下で、少なくとも２つの陽電荷、通常は ５個以下の陽電荷、より一般には約４個以下の陽電荷を有するであろう。大抵は 、陽電荷はアミノ基をベースとしているが、硫黄、燐、ヨウ素等の陽電荷を支持 する他のエレメントも、これらのカチオンが使用条件で安定である程度において 適用できることを見いだした。鎖の内部のアミノ基は、少なくとも２つ置換され ており、３又は４つ置換されていてもよい。アミノ末端基は、１つ〜４つ置換さ れていてもよい。通常、窒素は、少なくとも２つの炭素原子により分離されるが 、ピペラジン又はビピリジル等の複素環の基を伴う場合、窒素原子間には、ただ １つの炭素原子、好ましくは少なくとも２つの炭素原子が間に合ってもよい。窒 素は、好適などのような基、通常、10個以下の炭素原子、より一般には約６個以 下の炭素原子（アルキル、アリール、シクロアルキルであってもよい）により置 換されていてもよく、又は複素環により置換されていてもよく、即ち窒素は複素 環の部分であってもよい。好ましくはアルキレンアミンを使用し、該アルキレン は、置換が１〜３個の炭素原子２又は３個の炭素原子を有する低級アルキル基で の置換である場合、２又は３個の炭素原子及び窒素原子を有している。大抵、側 鎖は、線状であり、鎖中の異原子に結合したソール枝(sole branch)を有する。 使用することを見いだされた染料は、結合が染料及び核酸の反対の電荷に関す るものである挿入染料又は非挿入染料であってもよい。それぞれの例において、 染料の核酸への結合における蛍光の実質的な強化が存在することが観察された。 種々の染料、特に、臭化エチジウム、チアゾールオレンジ、フルオレスセイン、 チアゾールブルー及びアクリジンオレンジ等のモノマー染料並びにそれらの誘導 体を使用することができることを見いだした。特に興味あるものは、一般に核酸 には結合するが、二本鎖核酸に挿入される染料である。 発蛍光成分は、環式、又は多環式の、特に、少なくとも２個で、約６個以下の 環、より一般的には約５個以下の環を有し、少なくとも２個の環が融合し、通常 は４個以下の環が融合している多環式芳香族のものであってもよい。芳香族化合 物は、特に１〜３個、より一般的には１又は２個の窒素原子を複素環原子(heter oannular atom)として有する炭素環式又は複素環式のものであってもよい。他の 複素環的原子としては、酸素及び硫黄（カルコゲン）がある。 環は、幅広い種々の置換基により置換されていてもよく、該置換基としては、 １〜４個、通常１又は２個の炭素原子を有するアルキル基；ヒドロキシ、アルコ キシ及びカルボキシエステルを含み、一般的に１〜４個の炭素原子を有するオキ シ；モノ及びジ置換アミノ、特にモノ及びジアルキルアミノを含み、０〜８個、 通常０〜６個の炭素原子を有するアミノ；チオ、特に１〜４個、通常１又は２個 の炭素原子を有するアルキルチオ；シアノ；カルボキシ及びその誘導体、特にカ ルボキシアミド又はカルボキシアルキルを含み、１〜８個、通常１〜６個の炭素 原子を有する非オキソカルボニル；一般的に１〜４個の炭素原子を有するオキソ カルボニル又はアシル、特に原子番号９〜35までのハロゲンが挙げられる。 特に興味ある発蛍光成分は、芳香族成分と連結している１以上のエチレン基を 有するリンキング基(linking group)又は結合により連接している２つの環シス テム(ring system)を包含している。興味ある芳香族基として、フェナントリジ ン（ベンゾキノリン）、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサ ゾール、キノリン、アクリジン及びキサンチン(xanthine)がある。例として、チ アゾールオレンジ、チアゾールブルー、エチジウム、フルオレスセイン、アクリ ジン、フェナントリジン、キサンテン及びフルオロン(fluorones)が挙げられる 。 側鎖は、従来のいずれの手段により発蛍光団に結合してもよい。従って、側基 の異原子を使用して、活性ハロゲン又は疑似ハロゲン(pseudohalogen)を置換し て、カルボニル基での還元アミノ化を起こさせ、カルボキシル基と反応して、ア ミドを形成し、所望なら、その後、還元してメチレンアミン等にする。他の異原 子について、文献ちけうに記載されている類似技術を使用することができる。 本発明の化合物は、ラベリング剤として使用することができることを見いださ れ、該化合物は、核酸の検出工程において使用される。そのような適用として、 現場でのハイブリッド形成における蛍光、気泡数(cell population)の流動不斉 分析(flow cytometric analysis)がある。 本発明の組成物は、電界を使用する分離（例えば電気泳動）において使用する ことができることを見いだした。本発明の化合物を使用する際、核酸、通常ＤＮ Ａ及び染料の両方を、適切な緩衝媒体に入れ、十分な時間染料についてインキュ ベートして非共有結合させ、核酸中に挿入する。染料の二本鎖核酸への結合比は 、 所望の程度の感度に依存して、塩基対あたり染料約１分子から、４００塩基対あ たり染料１分子程度まで、通常、１００塩基対あたり染料１分子の低さまでの幅 広い範囲で変動してもよい。約15bp／染料分子未満で、更なる染料の添加におけ る発光の増加は、上記15bp／染料のものほど有効ではない。４塩基対又はそれ以 上を越えて存在する染料により、有為な抑制が生じ得、４塩基対に対して染料１ 分子のモル比を越えた染料の量におけるいかなる増加も望ましくない。しかしな がら、ＤＮＡと結合した染料の量は、キエンチング(quenching)が観察されない 場合、２塩基対あたり１の比、又は１塩基対あたり１の比又はそれより高い比で あってもよい。一般的に、最適結果のためには、染料の量の範囲は、４〜１００ 塩基対に対して、通常約１０〜５０塩基対に対して約１の挿入染料である。 異なるサンプルと異なる染料を組み合わせ、その後、電気的に分離される異な るサンプルを組み合わせることができる。従って、同一チャンネルにおいて、電 気電気泳動を行う際、適切な場合には、同一の波長の、照射用に使用されるＵＶ 光を用いて、種々のバンドの蛍光波長における違いを検出することにより種々の バンドを検出することができる。 核酸の量は、一般的に、電気泳動用に使用される従来の量、一般的には、約５ pg／μｌ〜５ng／μｌの範囲である。蛍光能率のために、毛管電気泳動を効果的 に行うことができる。トリスアセテート又はトリスボレート等の種々の従来のバ ッファーを、一般的に約１〜50mMの範囲、より通常は約１〜20mMの範囲で使用し て、約５〜10の範囲、より通常は約７〜９の範囲のpHを提供することができる。 また、金属イオンのキレートが、最小量で、一般的には、約0.05〜0.5mMで存在 していてもよい。都合良くは、EDTAを使用することができる。 染料及び核酸を少なくとも約５分、約２時間以内でインキュベートすることが でき、複合体形成は、通常、室温で、約１時間未満、通常30分内にで完了する。 インキュベートされた溶液は、直接使用してもよいが、適切には、ゲルに適用す る前に更に希釈する。 電気泳動は、都合の良い及び従来のいずれの手段においても行うことができ、 バンドは、今では、非共有結合の及び挿入染料の蛍光により検出することができ る。電気泳動により、非結合染料をバンド領域から除去し、核酸において保持さ れている染料が見いだされ、個々のバンドを蛍光スキャンにより容易に検出する ことが確実なものとなる。 核酸をゲルに施す前に染料を有する核酸をインキュベートする代わりに、分離 された後の染料を施すことかできる。挿入染料は、非挿入染料と実質的に異なる 吸収発光範囲(absorption-emission range)（及びかなり強化された蛍光強度） を有するので、非挿入染料の有効量の存在下でさえ、挿入染料を容易に検出する ことができる。同様に、ゲル中及び残存バッファー中におけるかなり低濃度、実 質的に約0.2未満、特に約0.1μｇ／ml未満の染料の存在下において電気泳動する ことができる。 従来の検出システムのいずれのものも、個々のバンドを検出するために使用す ることができる。使用する具体的な染料に依存して、励起光を、吸収染料の主な 吸収バンド内に存在するように選択する。 特に興味があるのは、同焦点レーザースキャニング蛍光イメージシステムの使 用である。都合が良いことが見いだされているシステムは、長期通過二色ビーム スプリッター(long-pass dichroic beam splitter)を使用して、レーザービーム を顕微鏡の対物レンズを通してサンプル上へ反射させる。蛍光発光を、対物レン ズにより集め、ビームスリッターを介してフォトデテクター(photodetector)に 通す。次いで、その蛍光発光を、立体(spatial)フィルターを通過させて、長期 通過又はバンド通過色又は干渉フィルターにおける同焦点検出を、光電子倍増管 に達する前に、実施する。適切なサーボモーター駆動ＸＹトランスレーション段 階を、2.5μｍ分解で用いて、従来のスピード、即ち約１〜５cm／秒でレーザー ビームを通過させたゲルをトランスレートする。マイクロコンピューターを使用 して、ＸＹトランスレーション段階を調節し、イメージを得て、表示する。蛍光 イメージを、その後、疑似彩色(pseudo-color)及びコードして、イメージを強化 するためのヒストグラム均等化方法により伸長された異なる強度レベル及びコン トラストを表す。イメージデータを定量するために、核酸バンドを含むイメージ カラムを抽出(extract)及び統合(integrate)することができる。 核酸を、更なる使用のために、挿入蛍光染料なしに容易に分離することができ る。核酸の50％又はそれ以上の回収のためにGeneclean(登録商標)キットを使用 することができる。核酸を含む挿入染料とグラスミルク(Glassmilk)（例えば約 約１〜10ｎｇの核酸（１〜５μｇ／ml核酸）と約１〜10μｇ／mlのグラスミルク ）とをアルカリ金属ヨージドの水溶液中において組み合わせ、約５〜60分間攪拌 しながらインキュベートし、遠心分離することにより、得られたペレットを分離 する。ペレットを、適切なエタノール緩衝水溶液中（例えば１：１）において再 懸濁(resuspend)し、遠心分離し、そしてこの洗浄手順を繰り返した後、実質的 に蛍光染料を含まない核酸を得る。 電気泳動中における本発明の挿入蛍光染料の使用により、かなり少ないバック グラウンドの成功と同等に得られる高レベルの蛍光強度のために、かなり強化さ れた感度が達成される。知られていない組成物の混合物におけるＤＮＡフラグメ ントのサイズ及び量は、該混合物の複雑さに依存して100pg〜１ngの範囲の材料 の全量、及びフラグメントのサイズの範囲により測定することができる。従って 、本発明の方法は、約５ng未満、特に約１ng未満、頻繁には約100pg未満、約50p g未満においてさえも核酸の検出における適用が見いだされた。 電気泳動における核酸バンドの検出用の本発明の染料を使用する代わりに、ｄ ｓＤＮＡ及び本発明の染料を実質的に飽和で含む組成物を使用することができ、 該ｄｓＤＮＡは、共有的又は非共有的のいずれかで、他の内在物(entity)へ結合 するための内在物に接している。内在物は、相違内在物に対する特定の親和力を 有するので、種々の他のタイプの分子と比較して、特定結合ペアと称されるか、 又は、ポリペプチド又はサッカライド等の他の分子と反応するための共有結合官 能価として称される。 所望の蛍光強度に依存して、ｄｓＤＮＡの長さ、並びに非共有結合及び挿入の レベルを変えて、分子当たりの蛍光強度を増加させることができる。通常、少な くとも約16塩基対、より一般的には、少なくとも20塩基対が存在し、少なくとも 約1kbp又は2kbp以上ものｄｓＤＮＡを有していてもよい。ｄｓＤＮＡの具体的な 長さは本発明では厳格なものではなく、分子あたりに必要とされる蛍光強度、ラ ベルの目的、都合等に従って変更することができる。 ｄｓＤＮＡにより他の分子に結合する方法が提供されるべきである。これは、 ラベルが使用される方法に依存して、幅広い種々の方法において達成することが できる。例えば、ｄｓＤＮＡは、ビオチン結合ヌクレオチド、１種以上のビオチ ンを含んでいてもよく、該ビオチンは、アビジン又はストレプトアビジン(strep tavidin)（以降、両者は“アビジン”として言及する）に結合するであろう。ビ オチンは、手順の性質、条件に依存してヌクレオチドあたり１つのビオチンから ヌクレオチドの0.1％まで変動してもよい。あるいはまた、いずれの分子も、特 に、興味あるサンプル中においてカウントされなる小さな有機分子（約２kdal未 満）を使用することができ、その小さな有機分子は、それが特異的に結合する特 定のレセプター又は抗体、特にモノクローナル抗体を有している。従って、チロ キシン、コルチコステロイド、エストロゲン、レチノイン及びマンノース等を、 そのような分子に特異的に結合するタンパクと共に使用することができる。ある いはまた、抗体が製造される合成分子、例えば、2,4-ジニトロフェニル、バルビ ツール酸塩及びホスファリチジルコリン等を使用することができる。これらの分 子は、ＤＮＡ合成の間、内部又は末端ヌクレオチドに結合されることにより含ま れていてもよく、該ＤＮＡは、従来の自動手順に従って合成され、又はＤＮＡの 合成後、利用可能なヒドロキシル基又はアミノ基のいずれかへの結合により添加 されてもよい。 結合内在物は、アミノ、ヒドロキシル、チオ、カルボニル、活性オレフィン又 はアリール等の安定共有結合を形成することが可能な官能価を有する分子に共有 結合する活性官能価であってもよく、該官能価は、天然に発生したヌクレオチド の官能価とは異なる。ラベルは、チオール基との反応のためのマレイル、アミン との反応のためのカルボキシル等の活性オレフィンにより改質することができる 。この方法において、多くの異なるタイプの分子を、診断、競争アッセイ及び非 競争アッセイ、組織学、細胞学、そして電気泳動、HPLC、FACS等の分離における 使用のために蛍光ラベルすることができる。 ＤＮＡのストランドは種々の構造をしていてもよい。多くの場合、ｄｓＤＮＡ は二本鎖であり、該ストランドは完全に又は部分的にのみオーバーラップしてい てもよく、その末端は5'及び／又は3'方向に伸長していてもよく、一方のストラ ンドは他方のストランドより実質的に長くてもよく、他方のストランドは、5'近 辺、3'近辺又は中央で結合していてもよい。あるいはまた、二本のストランドは 、 オーバーラップして付着末端を提供してもよく、該ＤＮＡの単一ストランド部分 を、その後、使用して相補性配列に結合することができる。あるいはまた、逆方 向反復単一ストランドを提供することができ、該ストランドはそれ自体において 環を形成して二本鎖部分を提供する。ヘアピン構造をラベリングのために単独で 使用してもよく、ヘアピンの単一ストランド部分を、相補性配列へのハイブリッ ド化のために使用してもよい。ハイブリッド化単一ストランド部分は、付着末端 を提供する、5'又は3'末端のいずれかで伸長したものであってもよく、又はヘア ピンのループ中に存在していてもよい。 本発明のラベルは、直接的又は関節的にラベルが結合する分子、使用媒体、及 び使用状況から、妨害なしに、高いレベルの蛍光強度を提供する、幅広い種々の 環境及び関係において使用することができる。従って、本発明のラベルは、特定 の結合ペアアッセイ(binding pair assay)において使用することができ、該ラベ ルは、特定の結合ペアコンビネーションを通して他の分子に容易に結合され得る 。例えば、診断アッセイにおいて、アビジン結合抗体（該抗体は興味のある分子 に結合する）を、ビオチンラベルＤＮＡ染料組成物に結合して、蛍光ラベル抗体 を提供することができる。 あるいはまた、抗体をビオチンでラベルし、アビジンが、ビオチンラベル抗体 とビオチンラベルＤＮＡ染料組成物との間の橋（bridge）として機能してもよい 。この方法において、蛍光ラベルは、サンプルを相補性特定結合ペアメンバーと 結合し、アッセイ（その後、ラベルを添加及び全ての非特定的結合ラベルを除去 ）した後に添加することができる。単一ストランドＤＮＡ配列がラベルの部分と して提供され、これは相補性ＤＮＡ又はＲＮＡ配列へのハイブリッド化のために 使用することができる。非共有結合及び挿入染料の存在により、ｄｓＤＮＡの安 定性がかなり高まる。従って、本発明のラベルは、変性媒体中に、非共有結合及 び挿入ｄｓＤＮＡが安定であり、一方ではサンプルＤＮＡが変性されて単一スト ランドが提供される条件下において導入することができる。単一ストランドＤＮ Ａ又はＲＮＡが存在する場合、変性条件を提供する必要はないであろう。従って 、本発明の分子は、ＤＮＡ配列を確認するためのプローブとして、サザンブロッ ト法及びノーザンブロット法における電気泳動、ポリメラーゼ鎖反応等の幅広い 種 々の条件下において使用することができ、該ストランド配列はプライマーとして 機能してもよい。 本発明の染料は、単一ストランド核酸鎖を用いて調製し、該染料が飽和の少な くとも約25％、飽和の約100％まで存在する組成物を提供することができる。通 常、単一ストランドは、少なくとも約50塩基対、より一般には少なくとも約100 塩基対を有しており、１kb以上であってもよい。染料を、単一ストランド核酸、 特に単一ストランドＤＮＡに結合することにより、単一ストランドＤＮＡを含む サンプルの検出に直接使用することができる試薬を提供する。サンプルは、異な る配列のナンバーについて、異なる染料を有する異なるプローブを用いることに よって試験することができ、該プローブは、次の染料の添加前に、過剰単一スト ランドプローブ及び染料の洗浄(washing away)と同時に又は連続的に、好ましく は連続的に添加することができる。 また、本発明の蛍光非共有結合及び挿入ＤＮＡは、現場でのハイブリッド形成 研究、一方の二本鎖ストランド核酸分子から他方への蛍光分子の分子間移行のた めに、例えば、蛍光体が媒体に移行されることなく蛍光染料を移行するために、 使用することができる。これは、トリプレックスフォーメーション(triplex for mation）を有するクロモソームの製造において、ゲル中における又は膜上等にお ける核酸への移行の際に使用することができることを見いだした。蛍光挿入ＤＮ Ａは磁気等の粒子へ結合して、使用後に移行剤(transfer agent)として除去され てもよい。 本発明の化合物は、同焦点蛍光イメージシステムにより有利に使用することが でき、100pg未満のＤＮＡがいつくかの染料により検出され、一方、約５pg未満 のＤＮＡが、他の組み合わせにより検出されてもよい。組織学及び細胞学におい ては、本発明の蛍光ラベルにより、ターゲットエピトープ（特に低いレベル）の 検出において高い感度が提供される。 多くの適用のために、複数の蛍光分子が望まれている。キットを提供すること ができ、該キット中における蛍光分子は、比較的狭い範囲の一般的に約460〜540 nm内の最大吸収、少なくとも約15nm、好ましくは少なくとも約25nm、通常は約10 0nm以下に離れて位置する最大発光を有することにより特徴付けることができ る。既に示したように、試薬を調製することができ、該染料は、核酸プローブと 結合し、コンテナ中において、便宜のために、直接使用のために適用される。従 って、そのキットは、異なる染料を有する異なるプローブを含むコンテナを２以 上、同一の染料を有するプローブを２以上、又はそれらの組み合わせを有してい てもよい。あるいはまた、染料中のプローブは、分離コンテナ中において分離し て保持することができる。 以下の実施例は、説明のために示したのであって、限定されるものとして示し たのではない。 実験 染料の合成 N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレンジの合成 反応性シアニン染料中間体を、図１に記載したように合成した。化合物１を、 還流ジオキサン中でレピジン(lepidine)を５当量の1,3-ジヨードプロパンでアル キル化して高収率で製造し、一方、３当量のヨードメタンを、3-メチルベンゾチ アゾール-2-チオンと還流エタノール中において反応させ、かつエタノールによ り沈殿させて、定量的に化合物２を形成させた。ヨードプロピルレピジン１を、 Brookerら((1941)J，Am，Chem，Soc．63:3192-3203;Brookerら(1942)同64:199-2 10)の方法によりベンゾチアゾール誘導体２と15分以内で反応させて、ヨードプ ロピルチアゾールオレンジ誘導体３を高収率で生成した。化合物３を、過剰のN, N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンと反応させて、N,N'- テトラメチル-l ,3- ジアミノプロピルチアゾールオレンジ４を高収率で形成した。 ジエチレントリアミンエチジウムの合成（図２） フェナントリジニウム誘導体５を無水ピリジン中に懸濁させた。カーボベンジ ルオキシクロライド（2.2当量）を０℃で滴加し、反応混合物を室温で12時間攪 拌し、エーテル／石油エーテルで沈殿させ、固形物をCH2Cl2中に懸濁させ、そし て、10％NaHCO3で洗浄した。有機層を、MgSO4で乾燥し、濃縮し、フラッシュカ ラム(flash column)MeOH:CH2Cl2(1:50)により精製した。淡褐色固形物を無水ニ トロベンゼン中に懸濁させ、５当量の1,3-ジヨードプロパンを添加した。混合物 を、160℃で砂浴中において４時間加熱し、その後、化合物６をエーテルにより 沈殿させた。精製は、フラッシュカラムMeOH:CH2Cl2(1:10)により行った。固形 物を無水MeOH中に懸濁させ、10当量の1,3-ジエチレントリアミンを添加した。混 合物を７時間還流した。生成物を、H2Oにより沈殿させ、固形物をEtOH中に懸濁 させ、濃縮HClにより酸性にし、そしてエーテルにより沈殿させた。精製はフラ ッシュカラムEtOAc:AcOH:H2O(容量で6:3:2)により行った。カーボベンズオキシ 基をHBr/AcOHを用いて除去し、ジエチレントリアミンエチジウム７を得た。 テトラメチレンエタンジアミンチアゾールオレンジ及びプロパンジアミンエチ ジウムを上述の手順と同様の手順により合成した。結果 ポリカチオン性鎖を有するエチジウム染料の蛍光強化は、本質的に、臭化エチ ジウムについてものと同様のものであった。チアゾールオレンジ誘導体について も、正に同一であった（表１）。 チアゾールオレンジ及びN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾー ルオレンジ（共に7.9×10-7Ｍ染料）での溶液中におけるｄｓＤＮＡの滴定の比 較を図３に示した。 染料（7.9×10-7Ｍ）を、室温で、pH8.2で４mMのTAEバッファーのＤＮＡ溶液( 10-500ng/ml)に添加した。励起が488nmに存在し、かつそれぞれの染料について 、そのＤＮＡ複合体の最大発光(emission maximum)での蛍光を測定した。挿入図 は、10-100ngＤＮＡ／mlの滴定曲線の領域を拡大型で示したものである。 N,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレンジ及びチアゾー ルオレンジの両方とも、10-500ngＤＮＡ／mlにおいて、ｄｓＤＮＡ濃度における 蛍光発光(fluorescence emission)の直線的な関連性得た。N,N'- テトラメチル- 1,3-ジアミノプロパンチアゾールオレンジにより、チアゾールオレンジより３倍 高い蛍光シグナルが得られたことに注意すべきである。更に、前者の染料により 、ｄｓＤＮＡ測定を、より低いＤＮＡ濃度まで容易に拡大することができた。 ｄｓＤＮＡ染料複合体の解離速度及びゲル上におけるｄｓＤＮＡ検出の感度 電気泳動における染料の消失は、臭化エチジウム、チアゾールオレンジ及びポ リカチオン性鎖を有する誘導体についての厳格な第１次速度(first order kinet ics)に従う（図４及び５）。 電気泳動終了時、ゲルを、レーザー励起蛍光ゲルスキャナー(laser-excited f luorescence gel scanner)によりスキヤンした。イメージプロセッシング(image processing)を、それぞれのレーンについてImage（商標）ソフトウェアを用いて 行い、それぞれの時間についての蛍光強度プロットを得た。時間に対する蛍光強 度のlogプロット（図５を参照されたい）により、染料の消失が第１次速度に従 うことが示され、かつｄｓＤＮＡ染料複合体の解離についてのｔ1/2の測定が可 能となる。チアゾールオレンジ及び臭化エチジウムについて、HindIIIにより線 状化されたプラスミドＭ13の50ngアリコートを、ＤＮＡｂｐ：染料２：１で、４ mMのTAE、ph8.2中において染料と混合し、かつ５分間隔でゲルに施した。他の染 料について、３ngアリコートのλＤＮＡ／HindIIIフラグメントを、ＤＮＡｂｐ ：染料５：１で、４mMのTAE-80mM のNaCl、ph8.2中において、それぞれの染料 と混合し、かつ15分間隔で添加した。 上記の結果から、本発明の組成物により、新規かつ重要な一群のＤＮＡ結合蛍 光体が提供されることは明らかである。これらの組成物により、強化された蛍光 性が提供され、電気泳動条件下における半減期が、一般的に利用可能な類似物と 比べ、実質滴に強化されている蛍光体の強化された結合が示される。遊離染料及 びＤＮＡに結合した染料間の平衡は、ポリカチオン性側鎖をもたない類似物と比 較して、結合染料についてかなり望ましいものである。従って、少ない染料を用 いて、かなり少ないバックグラウンドで、極少量のＤＮＡを検出して、より感度 の高い及びより精度の高いＤＮＡ検出が提供される。ポリカチオン性フェナント リジン誘導体について、厳格な結合(tighter binding)の利点は、ゲルの染色（ ＤＮＡ及び溶液の検出）を、臭化エチジウムを用いた場合より10倍少ない染料で 達成することができることである。更に、染色後のゲルのより多い洗浄を、結合 染色のより少ないロスで行うことができ、それは、ｄｓＤＮＡ検出の感度におけ る10倍の改良につながる。 ポリカチオン性不斉シアニン誘導体について、ｄｓＤＮＡ染料複合体は、チア ゾールオレンジを用いて形成されたものより安定性がかなり高いが、それらは、 約500nmでの高い吸光係数及びｄｓＤＮＡへの結合における高い蛍光強化(3000倍 より高い)を保持している。これらの新規な染料は、従って、感度が10倍高い ｄｓＤＮＡ検出用ゲルの後染色(post-staining)を可能にし、また、溶液中のｄ ｓＤＮＡをより高い感度で検出することを可能にする。更に、緑色光を有するｄ ｓＤＮＡ染料複合体の有効励起は、臭化エチジウムにより染色されたゲルにおけ るＤＮＡ検出のために今や一般的に使用されているトランスイルミネーター(tra nsilluminator)と関連している危険なUV暴露の可能性を除去する。これらの染料 は、特に、可視スペクトル範囲内における励起を用いる感度ゲルスキャナー(sen sitive gel scanner)について適用される。 複合体の相対安定性は、ｔ1/2値を比較することにより便宜的に評価する（図 ６における表Ｉ）。この比較から、ポリカチオン性置換基を含んだ染料が、かな りより強力にｄｓＤＮＡに結合することは明らかである。 これらの結果から期待されるように、チアゾールオレンジ（２×10-7Ｍ）より 10倍低い濃度（２×10-8Ｍ）でのN,N'- テトラメチル-1,3- ジアミノプロパンチ アゾールオレンジでのゲルの後染色により、ｄｓＤＮＡ検出の感度が14倍高くな った。臭化エチジウム（２×10-6Ｍ）より10倍低い濃度（２×10-7Ｍ）でのジエ チレントリアミンエチジウムにより、ｄｓＤＮＡ検出の感度が1.7倍高くなった 。ゲル電気泳動 電気泳動を、40mMのトリスアセテート−10mMのEDTA(TAE)、pH8.2中において10 V/cm、厚さ１mmの鉛直0.9％アガロースゲルランにおける、Mini-ProteanII装置( BioRad，Richmond，CA)において行った。ゲルを、サンプル添加の前に１時間、 予備電気泳動(pre-electrophorese)した。50mMのNaClを含み、pH8.2の４mM TAE への希釈による各実験前に、染料溶液を、濃縮貯蔵染料（MeOH又はDMSO中の１× 10-4M）から調製した。ｄｓＤＮＡ染料複合体の解離速度の測定 ｄｓＤＮＡ染料複合体からの染料の消失速度(off-rate)を、下記アッセイによ り測定した。λＤＮＡ／HindIIIを、臭化エチジウム及びチアゾールオレンジに ついてはＤＮＡ塩基対と染料の比を２：１で、他の染料については５：１で、そ れぞれの染料と混合した。混合物の等しい量を、電気泳動中に、５〜15分（適切 に）の間隔でゲル上に添加した。電気泳動の時間の関数としてのそれぞれのバン ドに おける染料保持の量を、アルゴンイオンレーザー励起蛍光ゲルスキャナー(Quesa daら(1991)Biotechniques 10，616-625;Mathies and Huang(1992)Nature 359，1 67-169)を用いてスキャンすることにより測定した。異なる染料での後染色による検出の感度の比較 ５〜30ngまで変動する量のλＤＮＡ／HindIIIフラグメントを含むサンプルを 、同一のゲル上において繰り返し電気泳動した。電気泳動の45分後、ゲルを半分 にカットし、40mM TAEバッファーにおいて染色した。半分のゲルをN,N'- テトラ メチル-1,3- ジアミノプロパンチアゾールオレンジ（２×10-8M）中に浸漬し、 残りの半分のゲルをチアゾールオレンジ（２×10-7M）中に浸漬した。第２ゲル の半分を、ジエチレントリアミンエチジウム（２×10-7M）中に浸漬し、残りの 半分をエチジウム（２×10-6M）中に浸漬した。これは、全て40mMのTAE中におい て行った。浸漬40分後、ゲルを、20分間染料を含まない40mM TAE溶液に移動させ 、その後上述のようにスキャンした。 本明細書において記載した全ての文献及び特許出願は、それぞれの文献又は特 許出願が具体的に及び個々に本明細書中に含まれるものとして示されている程度 において本明細書に含まれるものとする。 本発明は、十分に記載されており、多くの変化及び変更が、添付クレームの精 神及び範囲を逸脱することなく行うことができることは当業者には明らかであろ う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｇ０１Ｎ 27/447 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/533 // Ｇ０１Ｎ 33/533 7363−2Ｊ 27/26 ３１５Ｚ 7363−2Ｊ ３０１ (72)発明者 ベンソン スコット シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94706 アルバニー アダムス ストリー ト 818

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共有結合したベンゾイミダゾール、ベ ンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、アクリジ ン及びキサンテンからなる群から選択された発蛍光基を含む蛍光化合物。 ２．前記鎖が２〜５個の窒素原子を有する請求項１に記載の蛍光化合物。 ３．前記発蛍光基がエチジウム基である請求項２に記載の蛍光化合物。 ４．前記発蛍光基がトリアゾールオレンジ基である請求項２に記載の蛍光化合物 。 ５．前記鎖が２〜５個の窒素原子を有するアルキレンアミンである請求項１に記 載の蛍光化合物。 ６．前記蛍光化合物が少なくとも１つのキノリン及びベンゾチアゾールを含む請 求項１に記載の蛍光化合物。 ７．前記蛍光化合物がフェナントリジンを含む請求項１に記載の蛍光化合物。 ８．少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共有結合したフェナントリジン、ベン ゾチアゾール及びキノリンからなる群から選択された発蛍光団を含む蛍光化合物 。 ９．前記鎖が２〜５個の窒素原子を有する請求項８に記載の蛍光化合物。 10．前記鎖が２〜５個の窒素原子を有するアルキレンアミンである請求項９に記 載の蛍光化合物。 11．チアゾールテトラメチルプロパンジアミン又はテトラメチルエタンジアミン 。 12．エチジウムエタンジアミン又はジエチレントリアミン。 13．少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共有結合したベンゾイミダゾール、ベ ンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、アクリジ ン及びキサンテンからなる群から選択された発蛍光基を含む蛍光化合物の少なく とも１つに非共有結合した核酸分子。 14．前記核酸が２本鎖ＤＮＡである請求項13に記載の核酸。 15．前記発蛍光基が、少なくとも２つの陽電荷を有する鎖に共有結合したフェナ ントリジン、ベンゾチアゾール及びキノリンからなる群から選択された請求項14 に記載の核酸。 16．核酸の検出用の蛍光染料を用いてゲル電気泳動を行う方法において、少なく とも２つの陽電荷を有する鎖に共有結合したベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾ ール、ベンゾオキサゾール、フェナントリジン、キノリン、アクリジン及びキサ ンテンからなる群から選択された発蛍光基を含む蛍光化合物を該蛍光染料として 使用することを含む改良法。 17．前記発蛍光基がチアゾールオレンジである請求項16に記載の方法。 18．前記発蛍光基がエチジウムである請求項16に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001181295A (ja) * 1999-12-24 2001-07-03 Asahi Denka Kogyo Kk 成型体の製造方法

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571388A (en) * 1984-03-29 1996-11-05 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof
US5783687A (en) * 1990-03-14 1998-07-21 The Regents Of The University Of California Dyes designed for high sensitivity detection of double-stranded DNA
US5763162A (en) * 1990-03-14 1998-06-09 The Regents Of University Of California Multichromophore fluorescent DNA intercalation complexes
US5808077A (en) * 1993-06-30 1998-09-15 Abbott Laboratories Intercalators having affinity for DNA and methods of use
DE69433712T2 (de) 1993-06-30 2005-04-14 Abbott Laboratories, Abbott Park Interkalatoren mit affinität für dna und ihre anwendung
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
EP0684316B1 (en) * 1994-04-29 2004-10-20 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Homogeneous method for assay of double-stranded nucleic acids using fluorescent dyes and kit useful therein
US5565554A (en) * 1994-07-29 1996-10-15 The Regents Of The University Of California Dimeric fluorescent energy transfer dyes comprising asymmetric cyanine azole-indolenine chromophores
US6426190B1 (en) 1995-04-20 2002-07-30 Carnegie Mellon University Difference detection methods using matched multiple dyes
US6127134A (en) * 1995-04-20 2000-10-03 Carnegie Mellon University Difference gel electrophoresis using matched multiple dyes
US6008373A (en) * 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5929227A (en) * 1995-07-12 1999-07-27 The Regents Of The University Of California Dimeric fluorescent energy transfer dyes comprising asymmetric cyanine azole-indolenine chromophores
US6337183B1 (en) 1995-09-08 2002-01-08 Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. Screen for compounds with affinity for nucleic acids
JP3425830B2 (ja) * 1995-10-06 2003-07-14 シスメックス株式会社 新規化合物とその用途
US5730849A (en) * 1996-09-30 1998-03-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. High sensitivity dyes as stains for RNA bands in denaturing gels
JP2001514511A (ja) 1997-03-05 2001-09-11 スクリプトゲン ファーマシューティカルズ インク 核酸への親和性を持つ化合物同定のための蛍光異方性を用いたスクリーニング
US5823097A (en) * 1997-06-10 1998-10-20 Dirck; Ronald L. Device for storing and transferring waste cooking oil
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
DE19960924C2 (de) * 1999-12-17 2002-08-01 Therapeutics Gmbh G.O.T. Amphiphile Polyamine, deren Anwendungen
US6368864B1 (en) * 2000-05-05 2002-04-09 Coulter International Corp. Dyes and methods of reticulocyte enumeration
US20040035793A1 (en) * 2001-11-05 2004-02-26 Transgenomic, Inc. Methods, systems, and kits for analysis of polynucleotides
US6838289B2 (en) * 2001-11-14 2005-01-04 Beckman Coulter, Inc. Analyte detection system
US6887668B2 (en) * 2002-04-19 2005-05-03 Beckman Coulter, Inc. Nucleic acid separation and detection by electrophoresis with a counter-migrating high-affinity intercalating dye
US8669052B2 (en) * 2008-06-10 2014-03-11 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow nucleic acid detector
EP1885718B1 (en) 2005-05-11 2017-03-15 Life Technologies Corporation Fluorescent chemical compounds having high selectivity for double stranded dna, and methods for their use
CN100381502C (zh) * 2006-04-19 2008-04-16 天津城市建设学院 一种噻唑橙类菁染料的固相合成方法
US20090131279A1 (en) * 2007-11-15 2009-05-21 Sigma Aldrich Company Nucleic acid fluorescent stains
US20100041045A1 (en) * 2007-11-15 2010-02-18 Sigma-Aldrich Co. Nucleic acid fluorescent stains
US8815609B2 (en) 2008-05-20 2014-08-26 Rapid Pathogen Screening, Inc. Multiplanar lateral flow assay with diverting zone
US9068981B2 (en) 2009-12-04 2015-06-30 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow assays with time delayed components
US8609433B2 (en) * 2009-12-04 2013-12-17 Rapid Pathogen Screening, Inc. Multiplanar lateral flow assay with sample compressor
US20130196310A1 (en) 2008-05-20 2013-08-01 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections
US8962260B2 (en) 2008-05-20 2015-02-24 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and device for combined detection of viral and bacterial infections
US20110086359A1 (en) 2008-06-10 2011-04-14 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow assays
EP2456887B1 (en) 2009-07-21 2015-11-25 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range
US10808287B2 (en) 2015-10-23 2020-10-20 Rapid Pathogen Screening, Inc. Methods and devices for accurate diagnosis of infections
CN114716431B (zh) * 2022-02-17 2022-11-11 北京富百科生物技术有限公司 一种菲啶和苯并噻唑共轭链接的荧光染料合成和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4883867A (en) * 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US4937198A (en) * 1989-07-28 1990-06-26 Becton, Dickinson And Company Novel fluorescent dye
DE69219610T2 (de) * 1991-09-16 1997-10-02 Molecular Probes Inc Dimere unsymmetrische Cyaninfarbstoffe
US5321130A (en) * 1992-02-10 1994-06-14 Molecular Probes, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001181295A (ja) * 1999-12-24 2001-07-03 Asahi Denka Kogyo Kk 成型体の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU6904694A (en) 1994-12-12
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DE69426359T2 (de) 2001-05-17
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EP0702727A4 (en) 1998-05-06
CA2162710C (en) 2002-04-16
US5312921A (en) 1994-05-17
EP0702727B1 (en) 2000-11-29
WO1994026931A1 (en) 1994-11-24
JPH11323173A (ja) 1999-11-26
CA2162710A1 (en) 1994-11-24

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