JPS61258168A - 核酸配列を同定する方法 - Google Patents
核酸配列を同定する方法Info
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- JPS61258168A JPS61258168A JP9948785A JP9948785A JPS61258168A JP S61258168 A JPS61258168 A JP S61258168A JP 9948785 A JP9948785 A JP 9948785A JP 9948785 A JP9948785 A JP 9948785A JP S61258168 A JPS61258168 A JP S61258168A
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- Japan
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- nucleic acid
- probe
- dna
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- stranded
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子の検出、同定のための標識技術１（関
Ｌ７、とくに特定の核酸配列を検出する方法に関する。
Ｌ７、とくに特定の核酸配列を検出する方法に関する。
ＤＮＡやＲＮＡの標識としては、従来から放射性アイソ
トープが最もよく用いられてきた。（、かし近年の遺伝
子工学の適用対象がバクテリアから高等動植物へと移り
、染色体工学、細胞工学が発展するのにともなって、ア
イソトープ法の欠点が、この分野の技術の応用と発＃に
とって障害となってきている。アイソトープ法の欠点は
つぎのとおりである。
トープが最もよく用いられてきた。（、かし近年の遺伝
子工学の適用対象がバクテリアから高等動植物へと移り
、染色体工学、細胞工学が発展するのにともなって、ア
イソトープ法の欠点が、この分野の技術の応用と発＃に
とって障害となってきている。アイソトープ法の欠点は
つぎのとおりである。
（ｌｌ ｉｎ ａｉｔｕハイブリダイゼーションにお
いて。
いて。
近接した遺伝子間の相対的位置関係を明らかにできるだ
けの空間的解償力がない。
けの空間的解償力がない。
（２） １ｎｓｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにおい
て、単一遺伝子を検出し得るだけの感度がない。、（３
） アイソトープを用いた実験、操作は、特別の設備
をそなえたアイソトープ実験室の中でしか行うことがで
きない。このことは、とくにハイブリダイゼーション法
の医療への応用を妨げる遼因となっている。
て、単一遺伝子を検出し得るだけの感度がない。、（３
） アイソトープを用いた実験、操作は、特別の設備
をそなえたアイソトープ実験室の中でしか行うことがで
きない。このことは、とくにハイブリダイゼーション法
の医療への応用を妨げる遼因となっている。
（４） アイソトープを用いることは、たとえ実験室
の中であっても、実験者にとって危険が伴ない、また廃
棄物等による一般人への危険も常に存在する。
の中であっても、実験者にとって危険が伴ない、また廃
棄物等による一般人への危険も常に存在する。
（５）検出のために非常な長時間（数週間〜数カ月）を
要する場合があり、迅速臨床診断への応用が難かしい。
要する場合があり、迅速臨床診断への応用が難かしい。
（６）放射活性は一定の半減期をもって減衰するため、
アイソトープの購入予定日に合わせた実験計画を立てね
ばならず、わずかな８穆のａｍにより、アイソトープや
大規模な実験成果をむだにする危険がある。
アイソトープの購入予定日に合わせた実験計画を立てね
ばならず、わずかな８穆のａｍにより、アイソトープや
大規模な実験成果をむだにする危険がある。
（７）アイソトープは一般にきわめて高価であり、１回
の実験で数十万円分に相当するアイソトープを消費する
１″、とも珍らしくない。このことが、ハイブリダイゼ
ーション法の一般的普及を妨げている。
の実験で数十万円分に相当するアイソトープを消費する
１″、とも珍らしくない。このことが、ハイブリダイゼ
ーション法の一般的普及を妨げている。
このような背景から、放射性アイソトープに代わろＤＮ
Ａ 、ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開発されて
いる（たと七ば、Ｐ 、 Ｒ，Ｌａｎｇｅｒｅｔ ａｌ
、 、 １９８１．Ｐｒｏｃ 、 ｗａｔ８． Ａｃａ
ｄ 、 ｓｅｉ 。
Ａ 、ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開発されて
いる（たと七ば、Ｐ 、 Ｒ，Ｌａｎｇｅｒｅｔ ａｌ
、 、 １９８１．Ｐｒｏｃ 、 ｗａｔ８． Ａｃａ
ｄ 、 ｓｅｉ 。
Ｕ、Ｓ、Ａ、、７８．６６３３−６６３７、およびｐ、
Ｔｃｈｅｎｅｔ ａｌ、 、 １９８４．ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ。
Ｔｃｈｅｎｅｔ ａｌ、 、 １９８４．ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ。
Ａ、、８１．３４６６−３４７０）。しかしこれらの技
術は、上記の欠点の一部のみを解消ｌ−たのにとどまり
、とくに検出感度と空間的解偉力は、下記のように、ア
イソトープ法にまさるものとは言えない。
術は、上記の欠点の一部のみを解消ｌ−たのにとどまり
、とくに検出感度と空間的解偉力は、下記のように、ア
イソトープ法にまさるものとは言えない。
アイソトープ法の検出感度：≦：１．ＯＰＤＮＡＬａｎ
ｇｅｒ法の検出感度： 〜１．Ｏ５ＬＤＮＡＴｅｈｅ
ｎ法の検出感度： １〜８Ｘ１０ １ｉ’ＤＮＡ単一
遺伝子中のＤＮＡ 〜１０ ？ 高感度、高解儂力を与える標識としては、各種蛍光色素
が考えられるが、これらを共有結合によってプローブに
結合させることは、実験操作が煩雑になるうえ、プロー
ブや色素の状態を着るしく変化させ、プローブのＩ・イ
ブリダイゼーション能を奪ったり、ハイプリゼーション
条件下で蛍光を着るしく弱めたりすることが多い。
ｇｅｒ法の検出感度： 〜１．Ｏ５ＬＤＮＡＴｅｈｅ
ｎ法の検出感度： １〜８Ｘ１０ １ｉ’ＤＮＡ単一
遺伝子中のＤＮＡ 〜１０ ？ 高感度、高解儂力を与える標識としては、各種蛍光色素
が考えられるが、これらを共有結合によってプローブに
結合させることは、実験操作が煩雑になるうえ、プロー
ブや色素の状態を着るしく変化させ、プローブのＩ・イ
ブリダイゼーション能を奪ったり、ハイプリゼーション
条件下で蛍光を着るしく弱めたりすることが多い。
本発明者は、プローブと標識物質とを、各々の化学的状
態を変化させることの少ない非共有結合によって結合さ
せることにより、上記のようなアイソトープ法における
欠点を効果的に解消し得ることを見出し、この発明方法
を完成するに至った。
態を変化させることの少ない非共有結合によって結合さ
せることにより、上記のようなアイソトープ法における
欠点を効果的に解消し得ることを見出し、この発明方法
を完成するに至った。
すなわちこの発明は、ＤＮＡ−ｒ’）ＮＡ間、ＲＮＡ−
ＲＮＡ間、もしくはＤＮＡ−ＲＮＡ間のハイブリダイゼ
ーションによって特定の核酸配列を検出する際に、注目
する核酸配列またはその一部に相補的な配列を含む一次
ブローブ、もしくはこの−次プローブと特異的に結合す
ることのできる二次プローブと、自己を表示することの
できろ標識物質とを非共有結合によって結合させ、この
標識物質からの信号を検出することによって、注目する
核酸配列の存在を定性的もしくは定量的に同定すること
を特徴としている。
ＲＮＡ間、もしくはＤＮＡ−ＲＮＡ間のハイブリダイゼ
ーションによって特定の核酸配列を検出する際に、注目
する核酸配列またはその一部に相補的な配列を含む一次
ブローブ、もしくはこの−次プローブと特異的に結合す
ることのできる二次プローブと、自己を表示することの
できろ標識物質とを非共有結合によって結合させ、この
標識物質からの信号を検出することによって、注目する
核酸配列の存在を定性的もしくは定量的に同定すること
を特徴としている。
標識物質としては、放射性以外の手段で自己を信号表示
することのできる種々の物質な使用し得るが、蛍光色素
が有用であり、その中でもとくに有用な４′、６−ジア
ミジノー２−フェニルインド−ル（ＤＡＰＩ） を使用した場合を例にとってこの発明を具体的に説明す
る。
することのできる種々の物質な使用し得るが、蛍光色素
が有用であり、その中でもとくに有用な４′、６−ジア
ミジノー２−フェニルインド−ル（ＤＡＰＩ） を使用した場合を例にとってこの発明を具体的に説明す
る。
ＤＡＰＩは、非共有結合によってＤＮＡと特異的に結合
し、波長３６５ｎｍの紫外線を吸収して４５ Ｑ ｎｍ
の青白い蛍光を発する。至適ｐＨ範囲は約４〜１１と広
く、またイオン要求性はない。
し、波長３６５ｎｍの紫外線を吸収して４５ Ｑ ｎｍ
の青白い蛍光を発する。至適ｐＨ範囲は約４〜１１と広
く、またイオン要求性はない。
したがってＤＮＡをＤＡＰ Ｉで標識するには、通常の
ＤＮＡバッファ、たとえばＴＥＮ（すなわち２０ ｍＭ
の’ｉ’ｒ ｉ ５−ＨＣｌ２．１ ｒｎＭのＥＤＴＡ
、５０ｍＭのＮａ（？Ａ の混合物）中で両者を常温で
混合し、数秒間静置するだけでよい。ＤＡＰ Ｉは通常
のＤＮＡに対しては重量比約１：２５で飽和するが、デ
オキシアデニルｆｆ１（ｄＡ）とデオキシチミジル酸（
ｄＴ）との塩基対およびデオキシシチジル酸（ｄＣ）と
デオキシイノシン酸（ｄＩ）との塩基対に対しては親和
性が強く、重量比約１：３まで飽和しない。結合定数は
約１０であるが、ＤＮＡと結合していないＤＡＰＩ分子
の蛍光強度は、ＤＮＡと結合しているＤＡＰ Ｉ分子の
約１／２０であるので、バックグラウンド値はきわめて
低くすることができる。したがって検出感度は著ろしく
高く、ポリアクリルアミドゲル上のバンドと１３、ては
、トランスフェラ−ゼを用いて約１ｎｉＤＮＡを検出で
き、また溶液としては、分光蛍光光度計の検出限界（約
ｘｎｙｏＮＡ）以下、さらｋｆｆｉ電倍増装置付蛍光顕
微鏡を用いれば１０ ｐＤＮＡを検出することができ
る。
ＤＮＡバッファ、たとえばＴＥＮ（すなわち２０ ｍＭ
の’ｉ’ｒ ｉ ５−ＨＣｌ２．１ ｒｎＭのＥＤＴＡ
、５０ｍＭのＮａ（？Ａ の混合物）中で両者を常温で
混合し、数秒間静置するだけでよい。ＤＡＰ Ｉは通常
のＤＮＡに対しては重量比約１：２５で飽和するが、デ
オキシアデニルｆｆ１（ｄＡ）とデオキシチミジル酸（
ｄＴ）との塩基対およびデオキシシチジル酸（ｄＣ）と
デオキシイノシン酸（ｄＩ）との塩基対に対しては親和
性が強く、重量比約１：３まで飽和しない。結合定数は
約１０であるが、ＤＮＡと結合していないＤＡＰＩ分子
の蛍光強度は、ＤＮＡと結合しているＤＡＰ Ｉ分子の
約１／２０であるので、バックグラウンド値はきわめて
低くすることができる。したがって検出感度は著ろしく
高く、ポリアクリルアミドゲル上のバンドと１３、ては
、トランスフェラ−ゼを用いて約１ｎｉＤＮＡを検出で
き、また溶液としては、分光蛍光光度計の検出限界（約
ｘｎｙｏＮＡ）以下、さらｋｆｆｉ電倍増装置付蛍光顕
微鏡を用いれば１０ ｐＤＮＡを検出することができ
る。
この方法は、先に述べたアイントーブ法の欠点をすべて
克服しており、ハイブリダイゼーションプローブの標識
法としてきわめてすぐれたものと言える。しかし非共有
結合は、一般に共有結合に較べて結合力が弱いので、高
温、高塩濃度のノ・イブリダイゼーション条件下では、
プローブから離れて周辺のＤＮＡ、あるいはそれ以外の
細胞成分に非特異的に吸着する場合もあり得る。この発
明の他の態様によれば、このようなおそれがある場合に
も、標識物質の特異的結合を確保することが可能である
。この態様において、この発明方法は下記の工程で遂行
されろ。
克服しており、ハイブリダイゼーションプローブの標識
法としてきわめてすぐれたものと言える。しかし非共有
結合は、一般に共有結合に較べて結合力が弱いので、高
温、高塩濃度のノ・イブリダイゼーション条件下では、
プローブから離れて周辺のＤＮＡ、あるいはそれ以外の
細胞成分に非特異的に吸着する場合もあり得る。この発
明の他の態様によれば、このようなおそれがある場合に
も、標識物質の特異的結合を確保することが可能である
。この態様において、この発明方法は下記の工程で遂行
されろ。
（１）目的とする核酸配列と相補的配列をもった一次プ
ローブと、適宜に選んだ二次プローブとに、互いに相補
的なオリゴヌクレオチド（たとえばポ１１ ｄ Ｇとポ
リｄＣ）のテールを付加する。一次プローブが一本鎖Ｄ
ＮＡ、二次プローブが二本鎖ＤＮＡであるような場合に
は、テールの付加は、ターミナルトランスフェラーゼま
たはＤＮＡリガーゼを用いて酵素的に行うことができる
。一次プローブと二次プローブとの特異的結合が、特異
的塩基配列と、この塩基配列を特異的親和性する蛋白分
子との相互作用忙よるものである場合には、特異的核酸
配列を一次プローブに付加するだけでよ℃１゜ （２）試料の核酸と一次プローブとのハイブリダイゼー
ションを常法（たとえば用土、山崎訳「分子生物実験マ
ニュアル」講映社、１９８３．Ｐ１７２）にしたがって
行う。このとき、オリゴヌクレオチドのテールはフリー
のままである。
ローブと、適宜に選んだ二次プローブとに、互いに相補
的なオリゴヌクレオチド（たとえばポ１１ ｄ Ｇとポ
リｄＣ）のテールを付加する。一次プローブが一本鎖Ｄ
ＮＡ、二次プローブが二本鎖ＤＮＡであるような場合に
は、テールの付加は、ターミナルトランスフェラーゼま
たはＤＮＡリガーゼを用いて酵素的に行うことができる
。一次プローブと二次プローブとの特異的結合が、特異
的塩基配列と、この塩基配列を特異的親和性する蛋白分
子との相互作用忙よるものである場合には、特異的核酸
配列を一次プローブに付加するだけでよ℃１゜ （２）試料の核酸と一次プローブとのハイブリダイゼー
ションを常法（たとえば用土、山崎訳「分子生物実験マ
ニュアル」講映社、１９８３．Ｐ１７２）にしたがって
行う。このとき、オリゴヌクレオチドのテールはフリー
のままである。
（３）二次プローブを標識する。二次プローブが二本鎖
ＤＮＡである場合、これに特異的親和性をもつ蛍光色素
である臭化エチジウムやＤＡＰＩを用いることができる
。とくに二次プローブが二本鎖ｄＡ−ｄＴ、ｔリゴマー
またはコポリマーであれば。
ＤＮＡである場合、これに特異的親和性をもつ蛍光色素
である臭化エチジウムやＤＡＰＩを用いることができる
。とくに二次プローブが二本鎖ｄＡ−ｄＴ、ｔリゴマー
またはコポリマーであれば。
ＤＡＰ Ｉとの親和力は一層強められる。
（４）一次プローブと二次プローブとを結合させる１゜
これは相補的なオリゴヌクレオチドテール同士のハイブ
リダイゼーションまたは特異的核酸配列とそれを認識す
る蛋白分子との結合であるから、極めて温和な条件下で
すみやかに完了する反応がある。したがってこの間に標
識物質が褪色したり、二次プローブから脱落したりする
ことはない。また標識は、二次プローブ自体に結合して
いて、テール部分には結合していないので、テール同士
のハイブリダイゼーションが標識物質に阻害されろこと
もない。
これは相補的なオリゴヌクレオチドテール同士のハイブ
リダイゼーションまたは特異的核酸配列とそれを認識す
る蛋白分子との結合であるから、極めて温和な条件下で
すみやかに完了する反応がある。したがってこの間に標
識物質が褪色したり、二次プローブから脱落したりする
ことはない。また標識は、二次プローブ自体に結合して
いて、テール部分には結合していないので、テール同士
のハイブリダイゼーションが標識物質に阻害されろこと
もない。
（５）標識を検出する。標識が蛍光色素である場合には
、蛍光顕微鏡を用いて検出する。これにより、従来の蛍
光分光光度計を用いた場合よりも格段に高い感度を得る
ことができ、さらに光電倍増装置を使用することにより
、１ ｐ？以下の極微量のＤＮＡを検出できる。
、蛍光顕微鏡を用いて検出する。これにより、従来の蛍
光分光光度計を用いた場合よりも格段に高い感度を得る
ことができ、さらに光電倍増装置を使用することにより
、１ ｐ？以下の極微量のＤＮＡを検出できる。
実施例１
（１）常法（三宅等編「昆虫のバイオテクノロジーマニ
ュアル」講談社、１９８４、Ｐ２１０）Ｉｃしたがって
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒπ２
系統から垂線染色体標本をつくる。
ュアル」講談社、１９８４、Ｐ２１０）Ｉｃしたがって
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒπ２
系統から垂線染色体標本をつくる。
（２）ｐπ２５．ｌにクローンされたＰ因子の一部約１
ｋｂをｐｓｔ ｉで切り出す。
ｋｂをｐｓｔ ｉで切り出す。
（３）ターミナルトランスフェラーゼによりポリｄＧテ
ールを付加する。
ールを付加する。
Ｐ因子ＤＮＡ／Ｐ Ｓ ｔ Ｉ １ ｐＭｌ
０ｍＭ 、 ｄＧＴＰ ６ μ１３ＴｄＴ
６０ Ｕ１０ＸＨＥＰＥＳバ
ッファ ２０μ！Ｈ２０２００μｍ６まで （３７℃、３０分） ここで、ｌ０ＸＨＥＰＥＳ バッファは、ＨＥＰＥＳ
−ＮａＯＨ２００ｍＭ （ｐＨ＝７．１） Ｍ Ｐ Ｃ１３２４０ｍ Ｍ ＢＳＡ（ヌクレアーゼ含有せず） ０ 、５ ｍｆ
／ｍＪ３ＤＴＴ Ｏ，
１ｍＭからなる。
０ｍＭ 、 ｄＧＴＰ ６ μ１３ＴｄＴ
６０ Ｕ１０ＸＨＥＰＥＳバ
ッファ ２０μ！Ｈ２０２００μｍ６まで （３７℃、３０分） ここで、ｌ０ＸＨＥＰＥＳ バッファは、ＨＥＰＥＳ
−ＮａＯＨ２００ｍＭ （ｐＨ＝７．１） Ｍ Ｐ Ｃ１３２４０ｍ Ｍ ＢＳＡ（ヌクレアーゼ含有せず） ０ 、５ ｍｆ
／ｍＪ３ＤＴＴ Ｏ，
１ｍＭからなる。
この反応により、およそ３ｏ塩基ｄ Ｇ／３’ 末端が
付加される。
付加される。
（４）ポリｄＡ−ｄＴオリゴ−ｒ−（１，５ｋｂ）ｌｃ
ｄｃテールを付加する。
ｄｃテールを付加する。
ポ リ ｄＡ−ｄＴ １
９Ｍ１０ｍＭ、ｄＣＴＰ ６μ２ＴｄＴ
３０Ｕ １０×カコジレートバツフア ２０μ！Ｈ２０２
００，ｌｔまで （３７℃、２０分） ここで、１０×カコジレートパツフアは、Ｔｒｉｓ
３００ｍＭカコジル
酸 ＩＭ （ｐＨ＝７．６） ＣＯＣ１０２１０ｒｎＭ ＢＳＡ（ヌクレアーゼ含有せず） Ｏ、”＞ｍＰ／
ｒｒｔ１３からなる。
９Ｍ１０ｍＭ、ｄＣＴＰ ６μ２ＴｄＴ
３０Ｕ １０×カコジレートバツフア ２０μ！Ｈ２０２
００，ｌｔまで （３７℃、２０分） ここで、１０×カコジレートパツフアは、Ｔｒｉｓ
３００ｍＭカコジル
酸 ＩＭ （ｐＨ＝７．６） ＣＯＣ１０２１０ｒｎＭ ＢＳＡ（ヌクレアーゼ含有せず） Ｏ、”＞ｍＰ／
ｒｒｔ１３からなる。
この反応により、ポリｄＡ−ｄＴ０３′末端あたり約３
０塩基のｄＣが付加される。これを飽和量（ＤＮＡの１
／３重量）以下のＤＡＰＩと混合する。
０塩基のｄＣが付加される。これを飽和量（ＤＮＡの１
／３重量）以下のＤＡＰＩと混合する。
（５）−次プローブのハイブリダイゼーションヲ常法（
前述の［昆虫のバイオテクノロジーマニュアルＪＰ２１
０．Ｐ２１５）Ｋしたがって行う。
前述の［昆虫のバイオテクノロジーマニュアルＪＰ２１
０．Ｐ２１５）Ｋしたがって行う。
（６）一次プローブとのハイブリダイゼーションの終っ
た垂線染色体標本を１ ｘ ｓｓｃで洗い、二次プロー
ブの溶液１０〜２０μぶを滴下し、カバーグラスをかけ
て３７℃で１時間インキュベートする。
た垂線染色体標本を１ ｘ ｓｓｃで洗い、二次プロー
ブの溶液１０〜２０μぶを滴下し、カバーグラスをかけ
て３７℃で１時間インキュベートする。
さらにＩ Ｘ ｓｓｃで２回洗浄したのち、アルコール
シリーズで脱水する。
シリーズで脱水する。
（７）落射製蛍光顕微鏡に元電倍像管つきのビデオカメ
ラを装着して、励起波長３６５ ｎｍ 、蛍光波長４５
０ ｎｍで検鏡する。位相差検鏡との併用により、垂線
染色体のバンドのうち、約３０にＤＡＰＩ蛍光が検出さ
れる。
ラを装着して、励起波長３６５ ｎｍ 、蛍光波長４５
０ ｎｍで検鏡する。位相差検鏡との併用により、垂線
染色体のバンドのうち、約３０にＤＡＰＩ蛍光が検出さ
れる。
実施例２
−ＺΔ−μノニ／Ｘイーグ」−ノ：不−イニ二乞旦／−
（１）ニトロセルロースへのプロッティングおよび一部
プローブとのハイブリダイゼーションは常法（前記の［
分子生物学実験マニュアルＪＰ１．８０）にしたがって
行う。ただし、できるだけ小形の泳動ゲルを用い、泳動
レーンの幅もなるべく狭くする。
（１）ニトロセルロースへのプロッティングおよび一部
プローブとのハイブリダイゼーションは常法（前記の［
分子生物学実験マニュアルＪＰ１．８０）にしたがって
行う。ただし、できるだけ小形の泳動ゲルを用い、泳動
レーンの幅もなるべく狭くする。
（２）ハイブリダイゼーションの終ったニトロセルロー
スフィルターを別のプラスチックバッグに入れ、ＤＡＰ
Ｉ標識された二次プローブを含む１５ａのＩ Ｘ Ｓ
ＳＣを加える。
スフィルターを別のプラスチックバッグに入れ、ＤＡＰ
Ｉ標識された二次プローブを含む１５ａのＩ Ｘ Ｓ
ＳＣを加える。
（３）室温で３０〜６０分放置したのち、ｌ Ｘ ｓｓ
ｃで洗浄し、風乾する。
ｃで洗浄し、風乾する。
（４）落射蛍光顕微鏡を用いて、フィルター上のＤＡＰ
Ｉ蛍光を検出する。
Ｉ蛍光を検出する。
Claims (7)
- （１）ＤＮＡ−ＤＮＡ間、またはＲＮＡ−ＲＮＡ間、も
しくはＤＮＡ−ＲＮＡ間のハイブリダイゼーションによ
つて特定の核酸配列を検出する際に、注目する核酸配列
またはその一部に相補的な配列を含む一次プローブ、も
しくはこの一次プローブと特異的に結合することのでき
る二次プローブと、自己を信号表示することのできる標
識物質とを非共有結合によつて結合させ、上記標識物質
からの信号を検出することによつて、注目する核酸配列
の存在を定性的もしくは定量的に同定する方法。 - （２）上記標識物質が蛍光色素である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （３）上記蛍光色素が下記の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインド
ールである特許請求の範囲第２項記載の方法。 - （４）上記蛍光色素からの信号の検出が、蛍光顕微鏡ま
たは光電倍増装置つき蛍光顕微鏡によつて行われる特許
請求の範囲第２項記載の方法 - （５）上記一次プローブと上記二次プローブとの特異的
結合が、互いに相補的な一本鎖核酸オリゴマー同士のハ
イブリダイゼーションによるものである特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - （６）上記一次プローブと上記二次プローブとの特異的
結合が、特異的塩基配列と、この塩基配列を特異的に認
識する蛋白分子との相互作用によるものである特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - （７）上記二次プローブが、デオキシアデニル酸とデオ
キシチミジル酸との相補的二重鎖オリゴマー部分または
相補的二重鎖コポリマー部分、デオキシシチジル酸とデ
オキシイノシン酸との相補的二重鎖オリゴマー部分また
は相補的二重鎖コポリマー部分、もしくはイノシン酸の
四本鎖オリゴマー部分を含む特許請求の範囲第１項記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9948785A JPS61258168A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | 核酸配列を同定する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9948785A JPS61258168A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | 核酸配列を同定する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61258168A true JPS61258168A (ja) | 1986-11-15 |
Family
ID=14248660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9948785A Pending JPS61258168A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | 核酸配列を同定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61258168A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0382433A2 (en) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Zeneca Limited | Detection of nucleic acid sequences using fluorescence polarisation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6039565A (ja) * | 1983-07-14 | 1985-03-01 | バイエル・コーポレーシヨン | 標識核酸プローブおよびそれらの調製用付加物 |
-
1985
- 1985-05-13 JP JP9948785A patent/JPS61258168A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6039565A (ja) * | 1983-07-14 | 1985-03-01 | バイエル・コーポレーシヨン | 標識核酸プローブおよびそれらの調製用付加物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0382433A2 (en) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Zeneca Limited | Detection of nucleic acid sequences using fluorescence polarisation |
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