JPH08505776A - 蛍光標識としてエネルギー転移用にデザインされた色素とｄｎａの複合体 - Google Patents

蛍光標識としてエネルギー転移用にデザインされた色素とｄｎａの複合体

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JPH08505776A JP6517054A JP51705494A JPH08505776A JP H08505776 A JPH08505776 A JP H08505776A JP 6517054 A JP6517054 A JP 6517054A JP 51705494 A JP51705494 A JP 51705494A JP H08505776 A JPH08505776 A JP H08505776A
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Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡに結合する異種多量体蛍光団が提供され、該異種多量体蛍光団は電気的分離におけるＤＮＡの検出および高い蛍光効率と大きなストークスシフトを有するプローブの調製に備える。加えて、蛍光性分子の適当な選択により、単一の狭い波長帯の励起光源を使うことができながら、一方で容易に区別するのに十分な分離を有する蛍光発光を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光標識としてエネルギー転移用に デザインされた色素とＤＮＡの複合体 政府補助金へのクロス・リファレンス 本発明は、エネルギー省により認められた補助金契約番号DB-FG-91BR61125の もとで政府の援助をかりて作られた。 関連出願へのクロス・リファレンス 本出願は1992年２月６日に出願された出願第07/831,823号の一部継続出願であ り、その出願は1990年3月14日に出願された出願第493,307号の一部継続出願であ る。 序論 技術分野 本発明の分野は蛍光組成物である。背景 蛍光シグナルの検出は様々な状況下で且つ様々な条件下で広範囲に応用されて いる。蛍光は検出可能なシグナルを発する手段として多数の利点を有する。蛍光 は放射能標識が持つ多くの欠点に悩まない上、多くの場合に高レベルの感度に備 える。蛍光の検出用機器は容易に入手可能であり、蛍光標識は免疫診断、ゲル電 気泳動や蛍光標示式細胞分取器における核酸バンドやタンパク質バンドの検出と いった多様な状況において応用されている。蛍光シグナルの感度は多数の因子に 依存する：自然消光の可能性；蛍光の量子効率に対する蛍光性分子に関連する他 の分子の影響；蛍光の量子効率および蛍 光体の性質に対する媒体の影響；光に対する蛍光体の安定性；バックグラウンド 蛍光を除去する能力；並びに光源の性質。 多くの応用には、１つの系の様々な特徴を検出することができるように、多数 の識別可能な蛍光体を有することを望む。例えば、FACSでは、細胞または他の組 成物の２つの特徴の存在を同定することに関心がある場合がある。ＤＮＡのハイ ブリダイゼーションでは、ゲル中、プレート上などで観察した時に２つの異なる ＤＮＡ配列を識別することを望むかもしれない。しばしば、同じ波長での励起を 考慮しながら識別可能である位十分に異なる発光最大を有する蛍光体を得ること は非常に困難である。従って、狭域帯の放射線源による励起を考慮に入れながら 、容、易に識別可能な蛍光放出最大に備えることにより多重式測定を可能にする ような蛍光標識を同定することに実質的な関心がある。関連文献 次の参考文献はＤＮＡ挿入性蛍光二量体およびそれらの物性を記載している： Gaugainら，Biochemistry，17:5071-5078（1978）；Gaugainら，Biochemistry， 17:5078-5088（1978）；Markovitsら，Anal．Biochemistry，94:259-269（1979 ）；Markovits，Biochemi-stry，22:3231-3237（1983）；およびMarkovitsら，N ucl．AcidsRes.，13:3773-3788（1985）。様々な挿入化合物と核酸との相互作用 はBermanおよびYoung，Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，10:87-224（1986）により 概説されている。ＤＮＡまたはＲＮＡと共に臭化エチジウムを電気泳動した時の 該色素の保持は、AngemullerおよびSayavedra-Soto，Biotechniques，8:36（１9 90）；Rosenおよびvilla-Komaroff，Focus，12:23（1990）に記載されている。G lazerら，Proc.Natl．Acad．Sci．USA，87:3851-3855（1990）；Ryeら，Nucl.Ac ids Res.，19:327-333（1991）；Quesadaら， BioTechniques，10:616-625（1991）；Ryeら，Nucl．Acids Res.，20:2803-2812 （1992）も参照のこと。 発明の要約 新規蛍光組成物とそれらの用途が提供される。ここで、該蛍光組成物は少なく とも２つの蛍光団成分を有する複数の正の電荷を有する二本鎖ＤＮＡに強く結合 し、前記蛍光団成分の１成分は低波長で発光する該成分の蛍光（励起エネルギー ）を効率的に消光することができ；挿入された蛍光組成物は親の蛍光団より実質 的に多い発光効率に備え；そして高波長で発光する蛍光団と低波長で発光する蛍 光団との間で観察される蛍光発光の比は少なくとも約１.２：１であることによ り特徴づけられる。それらの組成物は、ＤＮＡ用の蛍光標識として、ＤＮＡと組 み合わせて他の分子用の標識として、および様々な系の分析において（この場合 多重式蛍光分析が望ましい）利用される。 図面の簡単な説明 図１は、チアゾール単量体中間体の合成のための合成スキームであり； 図２は、チアゾール二量体（TOTOおよびTOTAB）の合成のための合成スキーム であり； 図３は、チアゾール−エチジウム二量体（TOBD）の合成のための合成スキーム であり；そして 図４は、フルオレセイン−エチジウム異種二量体（FED）の合成のための合成 スキームである。 特定態様の説明 単独でまたは二本鎖核酸中に挿入して異種二量体蛍光組成物を使用する新規方 法が提供される。ここで、前記組成物は、有利には一緒に使われるかまたは同種 二量体と共に使われる、少なくとも２の正電荷を含んで成る結合基により連結さ れた２つの異なる蛍光団成分を有することにより特徴づけられる。異種二量体の 蛍光団成分は、第一の蛍光団成分が約500nm未満、普通は約450nm未満、且つ通常 は約275nm以上、普通は約300nm以上に、溶液中の吸収最大を有するという点で同 族である。溶液中での第二の蛍光団成分の発光最大は通常350nm以上、普通は約4 00nm以上であり、且つ約600nm未満、普通は約550nm未満であろう。対比してみる と、ＤＮＡ中に挿入された時の第一の蛍光団成分の吸収最大は通常少なくとも約 375nm、普通は少なくとも約400nm、より普通には少なくとも約450nmであろう。 ＤＮＡ中に挿入された時の第二の蛍光団成分の発光最大は通常少なくとも約450n m、より普通には少なくとも約500nmであり、且つ普通は約750nm未満、より普通 には約700nm未満であろう。蛍光団のうちの少なくとも１つはdsＤＮＡに強く結 合することができ、普通はdsＤＮＡに挿入することができるだろう。 第二の蛍光団成分は、dsＤＮＡと結びつくと、それと組み合わされる第一の蛍 光団成分よりも少なくとも25nm、普通は約100nmまで、より普通には約75nmまで 大きい吸収最大を有することにより更に特徴づけられるだろう。主題の組成物が dsＤＮＡ中に挿入されると、第二の蛍光団は、他の状態において照射条件下で第 一の蛍光団から観察されたであろう蛍光の少なくとも約80％を消光することがで きるだろう。効率的消光を有するためには、供給体の発光スペクトルと受容体ま たは第二の蛍光団の吸収スペクトルとが重複するだろう。普通、高波長で発光す る発光団と低波長で発光する発光団 との間の観察される発光の比は、少なくとも１.２：１、より普通には少なくと も約２：１であり、５：１またはそれ以上かもしれない。狭い波長帯を使う場合 、特にレーザーを使う場合の照射の波長と蛍光発光最大との間のストークスシフ トは、少なくとも約75nm、より普通には少なくとも約100nm、好ましくは約125nm より大きいだろう。光の吸収率を最大にするために励起波長で吸光係数を有する 供与体発色団があることが有利である。 供与体蛍光団は約2000程度の吸光係数を有してもよいが、望ましくは吸光係数 は少なくとも5000、好ましくは少なくとも10,000であり、50,000またはそれ以上 でもよい。 主題の異種二量体は新規の蛍光特性を有する。吸収性蛍光団の発光は少なくと も約80％、通常は少なくとも約85％消光される。その上、発光性蛍光団の発光は 、dsＤＮＡの一次結合部位に単独で結合させた時、励起光の波長を除いて同じ条 件下で、発光性蛍光団の同種二量体の発光最大の少なくとも２倍、通常は少なく とも約７倍明るい（多量である）。よって、弱吸収性発光体を用いることにより 発光収率を大きく増加させることができる。 主題の組成物は２つ以上の蛍光団成分を含んで成ることができ、ここで一対 の蛍光団は上記に指摘した範囲に従って関連づけられる。その他の蛍光団は一対 の蛍光団と同一もしくは異なることができる。異なる場合、蛍光性質は一般に一 対の蛍光団について指摘した範囲により左右されるだろう。蛍光団が異なる場合 、各蛍光団は上述した範囲に従うと次にくる蛍光団に関して示差的な吸光最大を 有するだろう。即ち、３つの異なる蛍光団成分があったら、第一と第二の間には 少なくとも25nmの吸光最大の差があり、そして第二と第三の間には少なくとも25 nmの差があるだろう。普通、分子は多くて４つの異なる蛍光団、より普通には多 くて約３つの異なる蛍光団を 有するだろう。蛍光団が結合される特定の順番があることは必要でないので、蛍 光団間の距離がエテルギー転移を考慮したものでありさえすれば、それらは中心 から放射状に広がるスポークスを有する中心の結合基から、環状分子または他の 好都合な合成中間体まで、直線形式で結合させることができる。 結合基は、正電荷を担持することができるかまたは電荷を帯びている少なくと も２つの基または官能基、例えばアミノ基、アンモニウム基、スルホニウム基等 、大部分は正のヘテロ原子として窒素または硫黄を含んで成る基を有することに より特徴づけられるだろう。結合鎖は隣接する単量体単位dsＤＮＡへの同時挿入 を考慮した長さのものであることができ、この、場合、通常は少なくとも約10オ ングストローム（Å）の長さを提供し、鎖の中に普通は少なくとも約９原子、よ り普通には少なくとも約10原子を有し、そして環状結合基が含まれる最も短い鎖 をカウントすると、蛍光単位間に普通は多くても約26原子、より普通には多くて も約20原子を有する。 結合基は普通は０〜８、より普通には０〜６、好ましくは約２〜６個のヘテロ 原子、特に正電荷に備えるであろうヘテロ原子を鎖中に有する脂肪族または脂環 式の基だろう。結合基上には通常少なくとも合計２の正電荷、より普通には多く ても約６の正電荷があるだろう。 蛍光団成分は環式、多環式、特に少なくとも２個の環を有し且つ多くても約６ 個の環、より普通には多くても約５個の環を有し、前記環の少なくとも２個が縮 合し、通常は前記環の多くても４個が縮合している多環式芳香族であることがで きる。芳香族化合物は、炭素環式、または特に複素環原子として１〜３個、より 普通には１〜２個の窒素原子を有する複素環式であることができる。他の複素環 原子としては酸素および硫黄（カルコゲン）が挙げられる。 環は多種多様な置換基により置換されてもよく、置換基としては１〜４個の炭 素原子、通常１〜２個の炭素原子を有するアルキル基；通常１〜４個の炭素原子 を有するオキシ、例えばヒドロキシ、アルコキシおよびカルボキシ；０〜８個、 通常０〜６個の炭素原子を有するアミノ、例えば単置換および二置換されたアミ ノ、特にモノアルキルアミノおよびジアルキルアミノ；チオ、特に１〜４個、通 常１〜２個の炭素原子を有するアルキルチオ；シアノ；１〜８個、通常１〜６個 の炭素原子を有する非オキソカルボニル、例えばカルボキシおよびその誘導体、 特にカルボキサミドまたはカルボキシアルキル；通常１〜４個の炭素原子を有す るオキソカルボニルまたはアシル；ハロ、特に原子番号9〜35のハロ、等が挙げ られる。 特に着目の蛍光団成分は、結合によりまたは芳香族成分と合同して１もしくは 複数のエチレン性基を有する結合基により連結された２個の環系を含むだろう。 着目の芳香族基としては、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキ サゾール、キノリンおよびアクリジンが挙げられる。代表的な基としては、チア ゾールオレンジ、チアゾールブルー、エチジウム、フルオレセイン、アクリジン 、フェナントリジン、キサンテン、および特にフルオロンが挙げられる。 蛍光団成分の組合せとしては、チアゾールオレンジとチアゾールブルー、チア ゾールオレンジとエチジウム、フルオレセインとエチジウム、アクリジンとエチ ジウム、等が挙げられる。しかしながら、アクリジンは320nm以上で非常に低い 吸光係数を有するので、優良な供与体ではない。アクリジンはチアゾールオレン ジやフリオレセインに対しては供与体として働くことができるが、蛍光発光にあ まり大きくない増加を与えるだろう。 化合物は、第三または第四級アミノ基に備えて、アルキレン基が 2〜10個、通常２〜６個の炭素原子を含むアルキレンポリアミンと、ハロアルキ ル置換または擬似ハロアルキル置換された蛍光性多環式芳香族化合物とから調製 することができる。アミノ基は、蛍光化合物との反応の前もしくは後に任意の便 利なアルキル化剤を使って第四級化することができ、またはアルキル基が約１〜 ６個、通常１〜３個の炭素原子を有するアルキルアミンを使って最初に第三級ア ミンとして調製することができる。 それらの化合物は標識試薬としての用途があり、この場合は核酸の検出方法に おいて利用されるかまたは化合物を標識して蛍光シグナルを提供するための標識 として利用される。同時検出を行うことができる複数のマーカーを有することに より、多数の分析的応用が達成できる。例えば、そのような応用としては、２〜 ３列挙すると、蛍光イムノアッセイ、蛍光現場ハイブリダイゼーション、および 細胞集団のフローサイトメトリー分析が挙げられる。 主題の組成物の適当な組合せにより、エネルギー転移を利用して容易に分解可 能な発光波長を達成する、共通の励起波長を有する色素を使用することができる 。加えて、dsＤＮＡ−色素複合体を使うと、供与体の励起が受容体からの発光を 大きく増強させ、供与体の発光は同じ環境中での適当な単量体色素に比較すると 実質的に消光される。よって、主題の色素の組合せを使うことにより、異なるds ＤＮＡ断片の高感度多重式検出が達成され得る。 主題の組成物は、電界を使う分離法、例えば電気泳動に利用することができる 。主題の化合物を使用する場合、核酸（通常はＤＮＡ）と色素は適当に緩衝化さ れた溶媒中に一緒に混合され、そして色素が核酸に非共有結合的に結合して核酸 中に挿入するのに十分な時間の間インキュベートされる。色素対二本鎖核酸の比 は、所望の感度に応じて、塩基対あたり色素約１分子から400塩基対あたり１分 子 ほど小さくまでの広範囲に及ぶことができ、普通は100塩基対あたり色素１分子 ほどである。約15bp／色素分子未満では、色素の更なる付加による発光の増加は 15bp／色素以上ほどには効果的でなくなる。４塩基対以上につき１色素より多く 存在する色素は、完全な消光をもたらすことがあり、そのため４塩基対につき１ 色素分子のモル比より高い色素量の増加は望ましくないかもしれない。しかしな がら、ＤＮＡと組み合わせる色素の量は、２塩基につき１分子の比、または１塩 基対につき１もしくはそれより高い比であることもでき、この場合消光は観察さ れない。一般に最適な結果をもたらす色素の量は、4〜100塩基対につき、普通は 約10〜50塩基対につき、約１分子の範囲であろう。 様々な試料を様々な色素と組合せ、次いで電気的に分離させようとする様々な 試料を組み合わせることができる。よって、電気泳動を行う同一のチャンネルで 、同じ波長の照射光を使って、様々なバンドからの蛍光波長の差を検出すること により、様々なバンドを検出することができる。 核酸の量は一般に電気泳動に用いる常用量、一般に約５pg／μｌ〜約５ng／μ ｌの範囲であろう。蛍光効率のため、毛管電気泳動を効率的に実施することがで きる。約5〜10、より普通には約７〜９の範囲のｐＨを提供するために、様々な 常用の緩衝液、例えば普通約1〜50mM、より普通には約1〜20mMの範囲で存在する トリス−酢酸塩またはトリス−ほう酸塩を用いることができる。また、金属イオ ンキレート化剤が少量、通常は約０.０５〜０.５mM存在してもよい。便利には、 EDTAを使用することができる。 通常は少なくとも約５分間且つ多くても約２時間、色素と核酸をインキュベー トすることができ、複合体形成は室温で約１時間未満で、通常は約30分間で完了 するだろう。インキュベートした溶液は そのまま使用することができ、またはゲルに適用する前に適宜希釈することがで きる。 電気泳動は、非共有結合的に結合しそして挿入された色素の蛍光によりバンド を検出することができる任意の便利で且つ従来の方法で実施することができる。 電気泳動は未結合の色素がバンドの領域から除去されていることを保証し、そし て色素が核酸中に保持されているとわかるため、蛍光スキャニングにより個々の バンドを容易に検出することができる。 核酸をゲルに適用する前に核酸を色素とインキュベートする代わりに、分離を 行った後で色素を適用してもよい。挿入された色素は挿入されてない色素とは実 質的、に異なる吸光−発光領域（および大きく増加した蛍光強度）を有するであ ろうから、挿入されてない色素の存在下であっても、挿入された色素を容易に検 出することができる。 個々のバンドを検出するためには任意の従来の検出系を使用することができる 。使用する特定の色素に依存して、励起光は吸収性色素の主な吸収バンドの範囲 内に入るように選択されるだろう。 特に着目されるのは、同焦点レーザースキャニング蛍光イメージング系の使用 である。好都合であることがわかっている系は、顕微鏡の対物レンズを通って試 料の上にかかるレーザー光線を反射するのに長列型二色性光線スプリッターを使 用する。蛍光発光は対物レンズにより集められ、光線スプリッターを通って光検 出器に入る。次いで蛍光発光は立体フィルターに通され、光増幅管に到達する前 の長列もしくは帯状列の色フィルターまたは干渉フィルターにおいて同焦点検出 が行われる。２.５μm分解度で適当なサーボモーター駆動型ＸＹ平進台を使用し 、ゲルを便利な速度、約１〜５cm／秒近くでレーザー光線の先に平進させる。Ｘ Ｙ平進台を制御するためそ して画像を捕捉および表示するためにマイクロコンピューターを使用してもよい 。次いで蛍光画像を擬似着色させそして異なる強度レベルを表すようにコード化 し、コントラストをヒストグラム均等化法で引き延ばして画像を強化することが できる。画像データを量化するために、核酸バンドを包含する画像カラムを抽出 しそして積分することができる。 先の用途のために、挿入された蛍光色素を含まない状態で核酸を容易に単離す ることができる。核酸の50％またはそれより高い回収 酸をヨウ化アルカリ金属の水溶液中でGlassmilkと混合し、例えば1〜10ngの核酸 （１〜５μg/mlの核酸）と約1〜10μg/mlのGlassmilkを混合し、攪拌しながら約 5〜60分間インキュベートし、次いで遠心することにより、生成したペレットを 単離する。次いで該ペレットを適当なエタノール性緩衝化水溶液中に（例えば１ ：１）再懸濁し、遠心し、そしてこの洗浄操作を繰り返した後、蛍光色素を実質 的に含まない核酸が得られる。 電気泳動において主題の挿入性蛍光色素を使用することによって、非常に高い レベルの蛍光強度が得られるために大きく増大した感度が獲得される。未知の組 成の混合物中のＤＮＡ断片のサイズおよび量を、混合物の複雑さと断片のサイズ 範囲に依存して、全量100pg〜1ngの材料で決定することができる。よって、本方 法は、約５ng未満、特に約１ng未満、しばしば約100pg未満、更には約50pg未満 の核酸の検出にも応用することができる。 電気泳動における核酸バンドの検出に主題の色素を使用する代わりに、実質的 に飽和量の主題の色素とdsＤＮＡを含んで成る組成物を使用してもよい。この場 合、dsＤＮＡは共有結合的または非共有結合的のいずれかで別の存在物への結合 のために或る存在物に連結 される。それらの存在物は、様々な別の型の分子に比較して相補的存在物に対し て特異的な親和力を有するために特異的結合ペアと呼ばれるか、または他の分子 、例えばポリペプチドもしくは糖と反応するための共有結合性官能基と呼ばれる だろう。 特異的結合ペアは、任意にリガンドまたはレセプターと呼ばれる多種多様な分 子を包含することができる。本発明では、リガンドおよびレセプターとして、様 々なタンパク質、例えば抗体、特異的結合性タンパク質、例えば表面膜タンパク 質レセプター、レクチン、血液タンパク質等、炭水化物、タンパク質が特異的に 結合する天然および合成の有機小分子、天然のタンパク質レセプターまたは抗体 、相補性領域全体に渡り通常少なくとも約30％の相補性、好ましくは少なくとも 約50％の相補性を有する相同配列または部分相同配列にハイブリダイズするかま たは特異的に結合することのできる核酸等を挙げることができる。要するに、相 補的メンバーの存在の検出に標識を使用できるような、特異的結合親和力を有す るいずれの２分子も使用することができる。所望の特異性は、検出しようとする 分子の特定の性質、試料の性質について望まれる情報等に依存して広範囲に異な り得る。 標識は、多種多様な試料、例えば生理学的試料、例えば血液、血漿、尿、髄液 、唾液、便、粘液等、加工からの廃物試料、ゴミ、土、水等、の中の様々な分子 、製品（例えば食品、薬品）中の混入物等を検出するために利用することができ る。 所望の蛍光強度に依存して、dsＤＮＡの長さ、分子あたりの蛍光強度を増加さ せるための非共有結合および挿入のレベルを変えることができる。普通、少なく とも約16塩基対、より普通には少なくとも約20塩基対が存在するだろう。また、 少なくとも約１kbpまたは２kbp以上ものdsＤＮＡを有することもある。dsＤＮＡ の特定の長 さは本発明にとって重要ではなく、分子あたりの所望の蛍光強度、標識の目的、 便利性等に従って変えることができる。ある色素、例えばエチジウム−アクリジ ン異種二量体を使うと、Ａ−Ｔ対を有することにより蛍光強度が増加することが 認められる。よって、標識として使用するためにポリＡ−Ｔ／ポリＡ−Ｔ二量体 の用意をすることができる。しかしながら、挿入二量体が与えるものよりも更に dsＤＮＡの安定性を高めることを望むならば、ＡＴ対とＧＴ対の組合せまたはポ リＧ−Ｃ／ポリＧ−Ｃ dsＤＮＡを使用することができる。或いは、任意の源の ランダムＤＮＡ、例えば子牛胸腺ＤＮＡ、大腸菌ＤＮＡ等を使用してもよい。 dsＤＮＡは、別の分子への結合手段を備えるべきである。これは、標識を使用 する予定の方法に依存して、様々なやり方で達成することができる。例えば、ds ＤＮＡは、ビオチン接合ヌクレオチド、１または複数のビオチンを含むことがで きる。ここでビオチンはアビジンまたはストレプトアビジン（以後、両者を「ア ビジン」と称する）に結合するだろう。ビオチンは、操作の性質、条件等に応じ て、ヌクレオチドあたり１つのビオチンからヌクレオチドの０.１％までに及ぶ ことができる。あるいは、何らかの分子、特に着目の試料中で遭遇しそうにない 有機小分子（約２kdal未満）を使用してもよい。この場合、有機小分子はそれが 特異的に結合する特異的レセプターまたは抗体、特にモノクローナル抗体を有す る。よって、チロキシン、コルチコステロイド、エストロゲン、レチン酸、マン ノース等を、そのような分子に特異的に結合するタンパク質と共に使用すること ができる。或いは、それに対する抗体が生産されている合成分子、例えば２，４ −ジニトロフェニル、バルビツレート、ホスファチジルコリン等を使用してもよ い。それらの分子は、常用の自動法に従ってＤＮＡを合成する場合に内部または 末端ヌクレオチドに結 合させることによりＤＮＡの合成中に組み込むことができ、または利用可能なヒ ドロキシルもしくはアミノ基のいずれかに結合させることによりＤＮＡの合成後 に付加することができる。 結合性存在物は、安定な共有結合を形成することのできる官能基を有する分子 に共有結合するための活性官能基、例えばアミノ、ヒドロキシル、チオ、カルボ キシル、活性オレフィンまたはアリール等であることができ、ここで該官能基は ヌクレオチドの天然の官能基以外のものである。チオール基との反応用に活性オ レフィン（例えばマレイル）、アミンとの反応用にカルボキシル、等により、標 識を修飾することができる。こうして、診断、競合アッセイおよび非競合アッセ イ、組織学、細胞学、分離、例えば電気泳動、HPLC、FACS等での使用にむけて、 多数の異なる型の分子を蛍光標識することができる。 ＤＮＡ鎖は様々な構造をとることができる。多くの場合、dsＤＮＡは二本の鎖 を含んで成り、それらの鎖は完全にまたは部分的にのみ重複することができ、一 方の鎖が他方の鎖よりも実質的に長くなるように末端が５′および／または３′ 方向に延び、他方の鎖が５′近位、３′近位または中心に結合することができる 。あるいは、二本の鎖が互い違い末端（staggered ends）を提供するように重複 することができ、ここで該ＤＮＡの一本鎖部分は次いで相補的配列への結合に用 いることができる。あるいは、鎖が自分自身で輪を作って二本鎖部分を提供する ように、一本鎖に逆方向反復配列を提供することができる。ヘアピン構造を単独 で標識に利用してもよく、またはヘアピンの一本鎖部分を相補的配列へのハイブ リダイゼーションに使用してもよい。ハイブリダイズする一本鎖部分は、互い違 い末端に備えた５′もしくは３′末端の延長部分であってもよく、またはヘアピ ンのループ中に存在してもよい。 主題の標識は、標識が直接的または間接的のいずれかで結合する分子、使用す る媒体、使用する条件等からの干渉を伴わずに、高レベルの蛍光強度に備えるた めに広範囲の環境および状況において使用することができる。よって、主題の標 識は特異的結合ペアアッセイにおいて使用することができ、該アッセイでは特異 的結合ペアの組合せを介して標識を別の分子に容易に結合させることができる。 例えば、診断アッセイでは、アビジン接合抗体（ここで該抗体は着目の分子に結 合する）をビオチン標識ＤＮＡ色素組成物と組み合わせて蛍光標識抗体を提供す ることができる。 あるいは、アビジンがビオチン標識抗体とビオチン標識ＤＮＡ色素組成物との 架橋として働くように、抗体をビオチンで標識することができる。この方法では 、試料を相補的特異的結合ペアメンバーと混合しそしてアッセイを実施した後で 蛍光標識を添加することができ、次いで標識を添加し、非特異的に結合した標識 を除去することができる。 一本鎖ＤＮＡ配列が標識の一部として提供される場合、これは相補的ＤＮＡま たはＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに利用することができる。非共有結 合的に結合され挿入された色素の存在は、該dsＤＮＡの安定性を大きく増加させ る。よって、非共有結合的に結合され挿入されたdsＤＮＡが安定であり、一方で 試料ＤＮＡが変性されて一本鎖となり得る条件下で、変性媒体中に主題の標識を 導入することができる。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが存在する場合、変性条件に 備える必要はないだろう。従って、主題の分子は、電気泳動、ポリメラーゼ連鎖 反応（この場合一本鎖配列はプライマーとして働くことができる）を含む様々な 条件下で、サザンブロット法、ノーザンブロット法等において、ＤＮＡ配列を同 定するためのプローブとして利用することができる。 非核酸特異的結合ペアメンバーとＤＮＡ色素会合体との間に非共有結合的複合 体を置く代わりに、共有結合に備えることができる。例えば、活性基、例えばカ ルボキシ、ジアゾ、アジド、活性エチレン等を提供することにより、アミド、ア ミン、ジアゾ、エステル、チオエーテルを生成する常用の結合基を使用するか、 あるいは炭素−水素結合中への挿入、または二重結合への付加を使用することに よって、蛍光成分を他の分子、例えばタンパク質、糖、脂質等に容易に結合させ ることができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの３′または５′末端のいず れかにチオール基を導入し、相補鎖を合成し、そして非共有結合的に結合され挿 入された色素複合体を形成させることができる。次いで該、ＤＮＡ上のチオール 基を、マレイミドで修飾されたタンパク質、例えば抗体と反応させることができ る。アクリルメチルアジドを付加することもでき、するとフォトタイプ時に二重 結合に付加するかまたはランダムに挿入するであろうニトレンを生成する。他の 技術は文献中に見られる常用手順に従うことができる。 主題のＤＮＡ色素組成物は、別の分子からエネルギーを転移または受容したい と所望する状況においても利用することができる。主題の組成物は、励起エネル ギーの受容もしくは転移用の別の蛍光色素で置換された分子、例えば色素が挿入 されたＤＮＡ分子と共に、または励起光と放出光との間のシフトを広げるような 別の蛍光分子と共に使用することができる。この技術は、診断アッセイにおいて 、または２つの存在物（例えばエピトープ、表面膜レセプター等）の間の空間的 関係を決定したいと望む場合に、利用することができる。 主題の標識は、実質的に増加した蛍光強度の結果として大きく増大した感度に 備えるために蛍光標示式細胞分取器において利用することもできる。また、表面 膜レセプタータンパク質にはリガンド、 レクチンには糖、細胞表面上に存在するエピトープには抗体を用いることができ 、この場合、細胞成分に結合する分子に共有結合的または非共有結合的に主題の 標識を結合させることができる。 主題の標識を使って転写開始要素、例えばプロモーター、オペレーター、エン ハンサー等に対するタンパク質を検出することもできる。本発明に従って標識ds ＤＮＡを標識タンパク質と混合し、非共有結合的に結合され挿入された蛍光体と は異なる波長で発光する蛍光分子、または他の適当な標識で標識することにより 、転写因子と補因子の存在を決定することができる。例えば、該混合物をゲル電 気泳動し、そしてＤＮＡに結合したタンパク質の存在を二重標識とバンドシフト によって同定することができる。 本発明の非共有結合的に蛍光が結合され挿入されたＤＮＡは、その場でのハイ ブリダイゼーション研究、即ち１つの二重鎖核酸分子から別の分子への蛍光分子 の分子間転移に、例えば蛍光剤が媒体に転移されることなく蛍光色素を転移せし めるために、利用することができる。これは、三量体形成を伴う染色体の作製、 ゲル中または膜上の核酸への転移、等に利用することができる。蛍光体が挿入さ れたＤＮＡを粒子、例えば磁石に結合させ、転移剤として使用した後に除去する ことができる。 本発明の化合物は、同焦点の蛍光イメージング系を使って有利に利用すること ができる。この系では、或る色素を使うと100pg未満のＤＮＡを検出することが でき、別の組合せでは約５pgのＤＮＡを検出することができる。組織学または細 胞学では、本発明の蛍光標識は、特に低レベルで標的エピトープを検出する際の 高感度に備える。 色素を個別に使うことの他に、少なくとも２ビットの着目の試料または組成物 に関する情報を得ることを所望する多様な用途におい ては、色素を組み合わせて利用することができる。ＤＮＡの不在下では、実質的 な重複が存在してわずかな識別だけが得られるだろうが、挿入された色素は挿入 されてない色素とは異なる吸収および発光スペクトルを有するため、ＤＮＡ中に 挿入された時に２つの二量体化合物の存在を検出することができる。更に、異種 二量体を同種二量体と共に使用することができるため、本発明の異種二量体を単 独で使用する必要はない。ここで異種二量体と同種二量体は共通の波長領域によ り励起される同一の吸収性蛍光団または異なる吸収性蛍光団を有するが、発光性 蛍光団が明らかに異なる。例えば、エチジウム二量体、チアゾールオレンジ二量 体、チアゾールブルー二量体、オキサゾールイエロー二量林等を、通常同じ吸収 性蛍光団が存在する異種二量体と共に使用することができるが、多くの場合、２ つの吸収性蛍光団が重複した吸収ピークを有する異なる吸収性蛍光団で十分であ る。 主題の色素を使った組合せを利用することにより、多数の異なる環境において ２つの異なる現象を検出することができる。特に着目されるのは、単一の励起光 を使用しそして２以上の現象について蛍光を測定することができるフローサイト メトリーである。前記現象は、ウイルスや細胞もしくはそれらの有意な断片中に 存在するような、同一もしくは異なるタンパク質（単一のタンパク質またはタン パク質の凝集物が含まれる）の２つの異なるエピトープへの結合現象を含む。こ うして、単一の励起レーザーを使って、２つの異なるマーカーの存在によって細 胞のような粒子を選別することができる。同様に、組織学や細胞学において、同 一もしくは異なる細胞上に存在するかまたは細胞外に存在し得る種々のタンパク 質の存在を決定することができる。適当なら、特異的結合性分子に結合した色素 を実験動物中に注入して種々の分子または細胞の移動を追跡すること ができ、この場合、特定部位のところの２つの異なる標的の存在に着目する。単 一の励起光が所望され且つ複数の異なる情報値が同時に所望されるような多数の 他の用途は一般に文献中に記載されており、本発明が利用可能になれば更に進展 するだろう。 多くの用途には、複数の蛍光分子が望ましいだろう。通常は多くて約30nm、普 通は多くて約20nmの比較的狭いバンド幅の励起光を使用できるように、キット中 の蛍光分子が約25nm内に吸光最大を有することにより特徴づけられる、キットを 提供することができる。吸収性蛍光団は同一であっても異なってもよい。 該キットは、各々が２〜４個、普通は２〜３個の蛍光団を有する２つ以上の蛍 光性多量体を有し、ここで前記蛍光団の少なくとも１つがdsＤＮＡに結合（通常 は挿入）することができる。前記多量体の少なくとも１つは、１色素を基準とし てdsＤＮＡ分子あたり１つの蛍光団に比べて蛍光を減弱させることなく、ＤＮＡ 200bpあたり少なくとも１色素の比でdsＤＮＡに結合することができ、そしてds ＤＮＡに結合した時と結合してない時で異なる波長で蛍光団が吸収し発光する、 少なくとも約25nmのストークスシフトを有することにより特徴づけられる異種多 量体であろう。前記少なくとも１つの異種多量体以外の他の多量体は同種多量体 であってもよく、特に着目されるのは同種および異種二量体並びに異種三量体で ある。 次の実施例は例示のために与えられるのであって限定のためではない。 実施例 色素の合成 材料と方法。３−メチルベンゾチアゾール−２−チオン、レピジン、３，８− ジアミノ−９−フェニルフェナントリジン、フルオレ セインイソチオシアネート異性体Ｉ、ジエチレントリアミン、テトラメチル−１ ，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン、無水HBr／酢酸といった 出発物質はAldrich社から購入し、更に精製せずに使った。無水メタノール、ト リエチルアミンおよびピリジンはナトリウムから蒸留し、窒素下で保存した。無 水ニトロベンゼンはP2O5から新たに蒸留した。全ての無水反応は、窒素雰囲気下 でオーブン乾燥済のガラス器具の中で実施した。反応は短波長および長波長ＵＶ 光の下でＴＬＣ（Merck A254）によりモニタリングした。フラッシュクロマトグ ラフィーは、Fluka社からの220-440メッシュのシリカゲル60上で実施した。ＴＬ Ｃ上で単一スポットを与えた中間生成物は、AMX-300装置を使って測定されたそ れらの1H-NMRスペクトルにより同定した。UV／VIS吸収スペクトルはPerkin Elme r Lambda６分光光度計を使って測定し、そして蛍光発光スペクトルはPerkin Elm er MFP 44B分光蛍光計を使って測定した。 異種二量体の合成。図１に概略されるように、Brookerらの方法〔（1942）JAC S 64:199-210；（1941）JACS63:3192-3203〕に従って、Ｎ−３−ヨードプロピル 誘導化レピジン（1）をＮ−メチル−２−メチルチオベンゾチアゾール（2）また はＮ−メチル−２−（Ｎ′−フェニル、Ｎ′−アセチル、３−アゾプロピリデン ）ベンゾチアゾール（4）と15分以内で反応させると、高収率でヨードプロピル チアゾールオレンジ中間体（3）またはヨードプロピルチアゾールブルー中間体 （5）（TB）が得られる。化合物（1）は還流しているジオキサン中での５当量の １，３−ジヨードプロパンによるレピジンのアルキル化により高収率で製造され 、一方で化合物（2）は還流している200プルーフのエタノール中で３当量のヨー ドメタンを３−メチルベンゾチアゾール−２−チオンと反応させそしてエーテル で沈澱させた時に定量的に形成された。化合物（2）は（3）の合成の際の中間体 としても使用し た。 図１。チアゾール単量体中間体の合成。ａ）無水EtOH中に懸濁し、１当量のＴ ＥＡを加え、室温で15分間攪拌し、エーテルで沈澱させ、アセトン／エーテルか ら再結晶する；３が収率80％、５が収率60％。 チアゾールオレンジ−チアゾールブルー異種二量体を合成するために、ヨード プロピルチアゾールオレンジ誘導体（4）を過剰のテトラメチル−１，３−ジア ミノプロパンと反応させて（スキーム２）中間体のテトラメチルジアミノプロピ ルチアゾールオレンジ誘導体（6）を生成させた。化合物（6）（TO6）を再結晶 により精製した後、チアゾールブルー誘導体（5）と反応させ、良好な収率のチ アゾールオレンジ結合チアゾールブルー異種二量体TOTAB（7）を得た。（4）の 二量化〔Ryeら，Nucleic Acids Res.，20:2803-2812（1992）に記載された通り 〕を使って、０.５当量のテトラメチル−１，３−ジアミノプロパンを用いてほ ぼ定量的に同種二量体TOTO（8）を合成した。 図２。チアゾール二量体の合成。ａ）無水MeOH中に懸濁し、６当量のテトラメ チル−１，３−プロパンジアミンを加え、６時間還流させ、アセトン／エーテル 中で沈澱させ、MeOH：CH2Cl2（1:10）／アセトンから再結晶する。６の収率80％ 。ｂ）無水MeOH中に懸濁し、１当量の（5）を加え、10時間還流させ、エーテル で沈澱させ、MeOH：CH2Cl2（1:10）で固体を粉砕し、EtOAc:AcOH:H2O（1:2:2） でカラムをフラッシュする。７の収率80％。ｃ）無水MeOH中に懸濁し、０.５当 量のテトラメチル−１，３−プロパンジアミンを加え、18時間還流させ、アセト ンで沈澱させ、MeOH：CH2Cl2（1:10）で固体を粉砕し、MeOH／アセトンから再結 晶する。収率80％の８。 チアゾールオレンジ−エチジウム異種二量体は、図３に概略される通りに３， ８−ジアミノ−９−フェニルフェナントリジン（9）から中間体（10）を経由し て得られた。一般に、チアゾールオレンジ−エチ ジム異種二量体（11）の合成はGaugainらの方法〔Biochemistry，17:5071-5078 （1978）〕に従って行った。ただし、アミノ置換基を保護するのにアセテートま たはカルボエトキシ基の代わりにカルボベンジルオキシ基を用いた。（10）をチ アゾール誘導体（3）とカップリングさせた後、粗製固体として得られるジカル ボベンジルオキシ保護中間体を脱保護（無水HBr／AcOH）すると、最適化されて ない低収率の所望のチアゾールオレンジ−エチジウム異種二量体TOED（11）と相 当量の望ましくない副生成物が得られた。チアゾールオレンジ−エチジウム異種 二量体の合成におけるリンカーとしてジアミノプロパンの代わりにテトラメチル ジアミノプロパンを使用すると、第四級化メチレンジアミンリンカーを有す、る 改善された収率の同族体TOBD-2を与えた。フルオレセイン−エチジウム異種二量 体は図４に記載の通りに合成した。 図３。チアゾール−エチジウム異種二量体の合成。ａ）無水ピリジン中に懸濁 し、２.２当量のカルボベンジルオキシクロリドを０℃で滴下添加し、室温で12 時間以上攪拌し、エーテル／石油エーテルで沈澱させ、固体をCH2Cl2中に懸濁し 、そして10％NaHCO3で洗浄し、有機相を乾燥し、濃縮し、カラムをMeOH:CH2Cl2 （1:50）でフラッシュする。ｂ）無水ニトロベンゼン中に懸濁し、５当量の１， ３−ジヨードプロパンを加え、160℃で４時間加熱し、エーテルで沈澱させ、カ ラムをMeOH:CH2Cl2（1:10）でフラッシュする。ｃ）無水MeOH中に懸濁し、10当 量の１，３−ジアミノプロパンを加え、７時間還流させ、H2Oで沈澱させ、EtOH 中に懸濁し、濃HClで酸性にし、エーテルで沈澱させ、カラムをEtOAc:AcOH:H2O （6:3:2）でフラッシュする。（9）から（10）への収率22％。ｄ）無水MeOH中に 懸濁し、３当量の1N NaOHを加え、H2Oで固体を沈澱／洗浄し、オーブン中で60℃ で固体を乾燥する。ｅ）無水MeOH中に懸濁し、０.７当量の３を加え、 10時間還流させ、エーテル／石油エーテルで沈澱させ、更に精製せずに使う。ｆ ）無水HBr／AcOH中に懸濁し、室温で１時間攪拌し、濃縮し、CH2Cl2中に懸濁し 、TBA／エーテルで沈澱させ、カラムをBtOAc:AcOH:H20（6:3:2）でフラッシュす る。 図４。フルオレセイン−エチジウム異種二量体の合成。スキーム３の段階ａと ｂについて記載された通りに、段階（a）と（b）を実施する。 ｃ）無水MeOH中に懸濁し、10当量のジエチレントリアミンを加え、７時間還流さ せ、H2Oで沈澱させ、EtOH中に懸濁し、そして濃HClで酸性にし、エーテルで沈澱 させ、カラムをEtOAc:AcOH:H2O（6:3:2）でフラッシュする。（9）から間の収率 28％。ｄ）MeOH中に懸濁し、４当量の1N NaOHを加え、H2Oで固体を沈澱／洗浄し 、オーブン中で60℃で固体を乾燥する。ｅ）無水MeOH中に懸濁し、１.１当量のF ITCを加え、室温で２時間攪拌し、濃HClで酸性にし、エーテルで沈澱させ、更に 精製せずに固体を使用する。ｆ）無水HBr／AcOH中に懸濁し、室温で１時間攪拌 し、濃縮し、CH2Cl2中に懸濁し、TEA／エーテルで沈澱させ、カラムをEtOAc:AcO H:H2O（7:3:2）でフラッシュする。 色素T0TAB（7）、T0ED（11）およびFED（13）の結合構造は、ＴＬＣ（1:1v/v MeOH:CH2Cl2および容量比で1:2:2のEtOAc:AcOH:H2O）により単量体出発物質のチ アゾールオレンジ（6）、チアゾールブルー（5）、エチジウム誘導体（10）もし くは（12）、またはフルオレセインイソチオシアネートのいずれも含まないこと を示したクロマトグラフィー的に純粋な二量体中の両単量体のＵＶ／可視吸収の 存在により確立された。T0TABを示す507nmと633nmでのMeOH中の可視吸収最大と 、FEDの294nmと486nmの吸収は、色素中の結合発色団の存在を明らかに指摘する （表１参照）。 等濃度の単量体の吸収スペクトルを足すと、等濃度の結合二量体のスペクトル によく近似した。チアゾールオレンジ（6）とチアゾールブル-単量体（5）の吸 収スペクトルの比較は、TOTAB二量体の505nmでの吸収の３%未満が該二量体のチ アゾールブルー部分によるものであることを確立した。よって、505nmにおける チアゾールオレンジ単量体（6）の吸光係数＋チアゾールブルー単量体（5）の吸 光係数をTOTAB二量体の505nmでの吸収（ε＝77,600M-1cm-1）とし、全てのその 後のTOTAB濃度決定において使った。TOED二量体については、 等濃度の臭化エチジウムと（6）からとった別々のスペクトルを足したものがス ペクトルのＵＶ領域での等濃度の該二量体のものとよく近似し、これをT0ED二量 体の295nmでの吸収の吸光係数（ε＝62,000M-1cm-1）を決定するのに使った。FE D（13）のＵＶおよび可視吸収最大のところの吸光係数の算出は、溶媒に対する フルオレセイン発色団の高感度の可視吸収スペクトルにより複雑になった。メタ ノール中とTAE中のFBDの紫外吸収スペクトルは、等濃度のフルオレセインイソチ オシアネートと臭化エチジウムの吸収スペクトルの和によく近似した。該色素は 合成の様々な段階で生成される塩を保持する顕著な傾向があるため、乾量に基づ くそれらの吸光係数の容易な直接測定が妨げられた。dsＤＮＡ−異種二量体色素複合体のスペクトル 100bp：色素において子牛胸腺dsＤＮＡに結合したTOTAB、TOEDおよびFBDの蛍 光スペクトルを488nmの励起波長を使って測定した。遊離の二量体の蛍光スペク トルは、発光が重複してTOTABの場合は660nmそしてTOEDの場合は630nmに中心が ある幅広い蛍光を生じたため、十分な情報をもたなかった。ＤＮＡに結合した時 の各二量体のチアゾールオレンジ部分の大きな深色効果は、結合色素のスペクト ルに２つの発光最大をもたらした。それらの条件下では、TOEDはチアゾールオレ ンジとエチジウム発光に相当する532nmと610nmで最大の蛍光を発した。溶液中の 遊離型の色素の蛍光に比較して、ＤＮＡに結合するとTOTABの長波長蛍光発光の3 84倍の増加とTOEDの長波長蛍光発光の227倍の増加が見られることにより、ＤＮ Ａへの色素の堅固な結合が示された。遊離型のTOTABおよびTOED色素に対して結 合型色素の強い蛍光増大は、両方の発色団がＤＮＡに強固に結合していることを 示す。ＤＮＡに結合した時にチアゾールブル ー部分にブルーシフトがないことは（遊離型の660nmでの発光に対して結合型は6 62nmでの発光）、少なくとも部分的に外部の水性環境に暴露されたＤＮＡの小さ な森のなかに色素分子のこの部分が非挿入形式で実際に結合されるかもしれない ことを示唆した。 488nmで照射した時の結合型色素の吸収スペクトルと結合型色素の蛍光発光の 比較から、両色素において供与体発色団と受容体発色団の間でエネルギー転移が 起こったことは明らかであった。色素のチアゾールオレンジ部分の488nm励起に より生じた532nm発光に対して、観察されたTOTABのチアゾールブルー部分の662n mでの発光の増強は、結合型色素の吸収曲線を仮定すれば、明白にエネルギー転 移の結果であった。同様に、、ＤＮＡに結合したT0EDの可視吸収曲線は488nmで のチアゾールオレンジ吸収が優性であった（ε供与体：ε受容体＝14：1）が、4 88nmでの励起によるエネルギー転移は、610nmでのより大きなエチジウム発光に 次いで532nmでのチアゾールオレンジ発光をもたらした。100：１のＤＮＡbp：色 素比での非常に効率的なエネルギ-転移の観察は、TOTABとTOED中の供与体発色団 と受容体発色団が互いに連結しているという独自の証拠を提供する。ＤＮＡに結 合した未連結のチアゾールオレンジ単量体TO6（化合物６）の発光スペクトルの プロットは、ＤＮＡに結合した同濃度のTOTABおよびTOEDと比較した時、ＤＮＡ 上の結合部位の飽和よりもずっと下で（100bp：色素）、結合型異種二量体のチ アゾールオレンジ発光が90％以上消光されることを証明した。同様に、FEDの発 光スペクトルと同濃度のフルオレセインイソチオシアネートの発光スペクトルと の比較は、結合型二量体においてフルオレセイン発光の90％以上の消光が起こる ことを証明した。ＤＮＡに結合した異種二量体とエチジウム二量体の蛍光発光の 比較も調べた。するとTOTAB二量体は、それの発光最大において溶液中のエチジ ウム 二量体の９倍以上明るい蛍光を発し、一方でTOED二量体は８倍明るい蛍光を発し た。TOED中のエチジウム蛍光の610nm発光：エチジウム二量体中の２個のエチジ ウム発色団の610nm発光の比に基づくと（エチジウム：エチジウム二量体の吸光 係数の比、5500：8900を考慮に入れて）、100bp：色素でＤＮＡに結合したTOED 二量体中のエチジウム発色団の15倍の蛍光増強が算出された。この結果は、エネ ルギー転移が弱吸収性発色団の蛍光収率を増加させることができることを示す説 得力ある良い例である。 受容体発光最大においてモニタリングするかまたは受容体／供与体発光最大の 比としてプロットした、TOTABおよびTOEDによる子牛胸腺dsＤＮＡの滴定は、種 々の一重要な結果を導いた。ＤＮＡ上の部位が色素で飽和された状態になるにつ れ、付加色素１モルあたりの供与体発色団と受容体発色団の両方の発光（特に供 与体発光）が次第に消光されるようになる。受容体発色団の発光によりモニタリ ングしそして付加色素１モルあたりに標準化した子牛胸腺ＤＮＡの滴定は、付加 色素１モルあたりの蛍光が100〜20bp／色素の範囲でほぼ直線関係を有すること を示し、このことは溶液中での色素の結合が強い配列特異性を示さないことを指 摘している。色素の原液のアリコートを０.５mlの4mM TAE中の子牛胸腺ＤＮＡ（ ｃ＝5×10-6Ｍ bp）に添加し、そして各スペクトルを記録する前に該混合物を15 分間インキュベートすることにより、滴定を実施した。指摘の条件下で100bp／ 色素において子牛胸腺ＤＮＡに結合された２つの色素の発光スペクトルを記録す ることにより、得られた２組の滴定データを互いに関して標準化した。20bp：色 素を越えてＤＮＡ上の部位が飽和された状態になると、付加色素１モルあたりの 発光の量が急速に減少する。一次部位が色素で飽和された状態になった時の二次 部位への結合は、挿入剤色素の一般的性質である〔Gaugainら， Biochemistry，17:5078-5088（1978）〕。ＤＮＡ上の一次挿入部位が飽和される と発光が急速に下落することから判断すると、両色素について、二次的無蛍光部 位への結合が一次部位に結合した色素の外部消光を引き起こしたことは明白であ る。 bpＤＮＡ：色素の比の関数としての供与体発光団と受容体発光団の発光の比の 分析（条件については上記を参照のこと）は、色素のチアゾールオレンジ供与体 発光の消光の量が、受容体発光の消光の量に比べて、ＤＮＡ上の結合部位の分数 飽和率に強く依存することを示した。隣接する受容体発色団の比率が増加するに つれ、チアゾールオレンジ供与体発光はますます消光されるようになる。色素の 飽和レベルでは、ＤＮＡに結合したTOTABとTOEDの両者について532nmでのチアゾ ールオレンジ発光はほとんど消光される。よって、３bp：色素でTOTABを使った 滴定では、17：1の受容体蛍光：供与体蛍光の最大比が得られ、一方でTOEDを使 った滴定では、39.5：1の受容体蛍光：供与体蛍光の最大比が得られた。過剰の 色素（０.５bp ＤＮＡ：色素）の存在下では、ＤＮＡに結合したTOTABとTOED両 色素について、供与体と受容体の両方の発光がほとんど完全に消光された。 フルオレセイン−エチジウム異種二量体（FED、化合物13）のスペクトルを測 定した。FEDの蛍光発光スペクトル対エチジウム同種二量体の蛍光発光スペクト ルの等モル基準での比較は、共に100bpＤＮＡ：色素での子牛胸腺ＤＮＡの存在 下で、620nm以上でFEDはエチジウム同種二量体の７倍を越える蛍光を発すること を示した。ゲル上のdsＤＮＡの検出 材料と方法。Ryeら（前掲）により記載された手順に従って、電気泳動分離お よびdsＤＮＡ−色素複合体の検出を行った。電気泳動 は、Mini-Protean II装置（BioRad，Richmond，CA）内で、40mMTris−酢酸塩−E DTA（TAE），pH８.２中、10Ｖ／cmで泳動する厚さ１mmの垂直０.９％アガロース ゲル上で実施する。試料の負荷前に１時間ゲルを予備電気泳動する。色素の処理 用原液（ｃ＝1×10-7Ｍ）は、各実験の前に4mM TAE，pH８.２の中に希釈するこ とにより、濃原液色素（MeOHまたはDMSO中ｃ＝1×10-4Ｍ）から新たに調製する 。基本的な緩衝液中でのシアニン色素とエチジウム色素の既知の不安定性（Rye ら、前掲）は、TAE中の処理用原液を実験ごとに新しく調製しなければならない ことを強制する。典型的な１ngのλＤＮＡ／HindIII ＤＮＡの負荷には、濃いＤ ＮＡ（10ng／μｌのＤＮＡを２μｌ）を4mM TAE pH８.２沖の色素に添加する。 色素を処理用原液で希釈し、0.27ng／μｌのＤＮＡ75μｌ＋色素（10bp：色素に は4.19×10-8Ｍの色素）混合物の最終容量においてＤＮＡを添加した時に正確な ＤＮＡ bp：色素の比を与え、次いで色素−ＤＮＡ混合物を遮光下で30分間イン キュベートする。30分間のインキュベーション時間の後、25μｌの15％水性フィ コール溶液を加え、５％フィコールを含有する０.２ng／μｌのＤＮＡ−色素混 合物100μｌを与える。この混合物の５μｌ試料（１ｎｇＤＮＡ負荷量）をアガ ロールゲル上に負荷し、遮光下で１時間電気泳動する。次いで同焦点イメージン グ系（Ryeら、前掲）を使ってゲルをスキャンする。Ryeら、前掲の中に記載され た通りにデータを解析する。 結果。λＤＮＡ／HindIIIラダーを使った最初の電気泳動実験は、異種二量体 色素−ＤＮＡ複合体、特にシアニン二量体TOTOおよびTOTAB色素−ＤＮＡ複合体 が、ゲルのウエル中に縞を付け沈澱する該複合体の傾向のために、変動的な結果 を与えることを示した。一貫した結果を生むために、TOTABの場合はＤＮＡとの インキュベーション前に４mM TAE中の色素に100mM NaClを加えることにより、 縞と沈澱の問題を完全に排除した。オキサゾールイエロー二量体を使った研究に おいて、40mM TAEインキュベーション緩衝液の使用がバンドパターンを改善する ことは以前に観察されている（Ryeら、前掲）。更なる研究は、バンドの鋭さと シグナル強度が＜50mM NaClでは改善されなかったが、80〜100mM塩では最適であ ったことを示した。インキュベーション混合物における４mM TAEまたは40mMTAE 中＞150mM NaClの濃度では、バンドのシグナル強度が低下した。これはおそらく 高い塩濃度ではＤＮＡへの色素の結合定数が低くなるからだろう。実験した全て の色素について、インキュベーション混合物中の4mM TAE緩衝液への50〜100mM N aClの添加が一貫した結果をもたらしたので、そ、の後全ての実験において使用 した。 全て５bp：色素の比で等量のλＤＮＡ／HindIII ＤＮＡに結合させそして同一 ゲル上で泳動したTOTAB、TOEDおよびエチジウム二量体のdsＤＮＡ複合体のシグ ナル強度の比較は、TOTABがエチジウム二量体の４〜５倍明るいことを示したが 、TOEDはエチジウム二量体よりわずかに明るいだけであることがわかった。TOED によるＤＮＡ検出の感度の増加があまり大きくないのは、電気泳動中にTOEDが迅 速にＤＮＡから損失するためであった。対照的に、TOED-2はＤＮＡとずっと安定 な複合体を形成し、エチジウム同種二量体を使った場合に可能であるＤＮＡ検出 感度の２倍の高感度を与えた。TOTABについては、シグナル強度に対するλＤＮ Ａ／HindIII断片サイズのプロットは直線関係を示した。 一定の比において色素と複合体形成したλＤＮＡ／HindIII断片の多数の負荷 量を泳動することにより、色素の感度をアッセイした。５bp：色素においてTOTA Bで染色した断片は、バンドあたり12pgにいたるまで可視できた。TOEDはあまり 高感度でなく、１ng未満のＤＮＡ負荷量では、５bp：色素にてTOEDで染色すると 23kb断片だ けが検出可能であった。23kbのλＤＮＡ／HindIII断片バンドは、２bp：色素に おいてTOEDで染色すると380pgまで検出可能であった。TOEDで染色されたλＤＮ Ａ／HindIII断片についてのバンド強度の時間依存性実験は、電気泳動の最中に ゆっくりした該色素の解離が認められることを指摘した。 様々な量のλＤＮＡ／HindIII断片と一定量の色素の混合物のゲル電気泳動を 、TOTABとTOEDを使って実施した。TOTABの場合、色素１モルあたりに換算したバ ンド蛍光強度は100〜2bp：色素のＤＮＡ／色素比に渡って一定であり、4〜5bp： 色素において飽和された。 ＤＮＡ：色素比に対する断片移動度の依存性をTOTABについて調査した。100bp ：色素において色素が負荷された断片の移動度を１に標準化すると、50bp：色素 での移動度は１、20bp：色素では０.９９、10bp：色素では０.９７、そして５bp ：色素では０.９２であった。 FEDとdsＤＮＡの複合体は、臭化エチジウムとdsＤＮＡの複合体よりも電気泳 動に対して安定であることがわかった。dsＤＮＡ断片の多重検出およびサイズ決定 TOTABと複合体形成させた1kbのdsＤＮＡラダーを使用し、チアゾールオレンジ 二量体と複合体形成させたλＤＮＡ／HindIII断片と一緒に泳動させる、２色多 重実験を実施した。前記断片のサイズのlog逆関数に対してプロットした、TOTAB と複合体形成させた１kbのラダーバンドの移動度の最小二乗法適合は、２％また はそれより高い精度で、TOTOで染色したλＤＮＡ／HindIII断片のサイズ決定を 可能にした。 上記結果から、本発明が様々な異なる環境中で多種多様な分子を検出するため のユニークな機会を提供することは明白である。特に 着目されるのは、狭い波長バンド幅の単一光源を使って複数の分子を励起させる ことができ、そこで各分子を独立的に検出することができることである。更に、 本発明の色素をＤＮＡに挿入することにより、蛍光収率が大きく増加される。 本明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、各々の刊行物または 特許出願があたかも特異的に且つ個別的に参考として組み込まれると指摘された かのように、参考として本明細書中に組み込まれる。 今まで本発明を理解の明確化のために説明と実施例により幾分詳細に記載して きたが、本発明の技術に照らせば、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱 することなく幾つかの変更や改良を行い得ることは当業者にとって容易に明らか であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 27/447

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２つの蛍光性多量体を含んで成るキットであって、各多量体が 少なくとも２つの蛍光団を有し、前記多量体のうちの少なくとも１つが ａ）少なくとも２つの異なる蛍光団を含んで成り、前記蛍光団はdsＤＮＡに結 合されると異なる波長で吸収しそして発光し； ｂ）少なくとも約25nmのストークスシフトを有し； ｃ）200bpあたり少なくとも色素１分子の比においてdsＤＮＡに挿入すること ができ； ｄ）２〜４つの蛍光団を有する ことにより特徴づけられ、 ここで前記蛍光性多量体のうちの少なくとも２つはdsＤＮＡに結合されると同 一の狭い光バンド幅領域の中で励起させることができ、そして少なくとも25nm離 れて最大放出を有する、前記キット。 ２．前記少なくとも２つの蛍光性多量体が、少なくとも２の正電荷を含んで成 る結合鎖により連結された前記蛍光団を有する、請求項１に記載のキット。 ３．前記キットが少なくとも３つの多量体を含んで成る、請求項１に記載のキ ット。 ４．前記多量体のうちの少なくとも１つがベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾ ール、アクリジン、フェナントリジンまたはキサンテンを含んで成る蛍光団を有 する、請求項１に記載のキット。 ５．前記多量体がベンゾチアゾールを含んで成る蛍光団を有する、請求項４に 記載のキット。 ６．前記多量体がチアゾールオレンジニ量体、チアゾールオレンジーチアゾー ルブルー二量体またはチアゾールオレンジ−エチジウ ム二量体である、請求項４に記載のキット。 ７．前記多量体がフェナントリジンを含んで成り且つフルオレセイン−エチジ ウム二量体またはエチジウム二量体である、請求項４に記載のキット。 ８．dsＤＮＡ分子に蛍光性分子が結合された少なくとも20bpのdsＤＮＡ分子で あって、前記蛍光性分子が ａ）少なくとも２つの異なる蛍光団を含んで成り、前記蛍光団はdsＤＮＡに結 合されると異なる波長で吸収しそして発光し： ｂ）少なくとも約25nmのストークスシフトを有し； ｃ）200bpあたり少なくとも色素１分子の比においてdsＤＮＡに挿入すること ができ； ｄ）２〜４つの蛍光団を有し：そして ｅ）他の条件が等しい中で、同強度の励起光における発光性蛍光団の同種二量 体に比較した異種二量体の蛍光発光が少なくとも２倍大きい ことにより特徴づけられる、前記dsＤＮＡ分子。 ９．前記蛍光性分子がベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、フェナントリ ジンまたはキサンテンを含んで成る蛍光団を有する、請求項８に記載のdsＤＮＡ 分子。 10．前記蛍光性分子がチアゾールオレンジ−チアゾールブルー二量体またはチ アゾールオレンジ−エチジウム二量体である、請求項９に記載のdsＤＮＡ分子。 11．前記蛍光性分子がフルオレセイン−エチジウム二量体である、請求項９に 記載のdsＤＮＡ分子。 12．特異的結合ペアのメンバーに共有結合されている、請求項８に記載のdsＤ ＮＡ分子。 13．前記メンバーがビオチンである、請求項12に記載のdsＤＮＡ 分子。 14．蛍光性異種多量体であって、 ａ）少なくとも２つの異なる蛍光団を含んで成り、前記蛍光団はdsＤＮＡに結 合されると異なる波長で吸収しそして発光し； ｂ）少なくとも約25nmのストークスシフトを有し； ｃ）200bpあたり少なくとも色素１分子の比においてdsＤＮＡに挿入すること ができ； ｄ）２〜４つの蛍光団を有し；そして ｅ）他の条件が等しい中で、同強度の励起光における発光性蛍光団の同種二量 体に比較した異種二量体の蛍光発光が少なくとも２倍大きい ことにより特徴づけられる、前記蛍光性異種多量体。 15．前記蛍光性異種多量体がベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、フェナ ントリジンまたはキサンテンを含んで成る蛍光団を有する、請求項14に記載の蛍 光性異種多量体。 16．前記蛍光性異種多量体がチアゾールオレンジ−チアゾールブルー二量体ま たはチアゾールオレンジ−エチジウム二量体である、請求項15に記載の蛍光性異 種多量体。 17．前記蛍光性異種多量体がフルオレセイン−エチジウム二量体である、請求 項15に記載の蛍光性異種多量体。 18．蛍光性異種多量体であって、 ａ）少なくとも２つが異なる２〜４つの蛍光団を含んで成り、前記異なる蛍光 団はdsＤＮＡに結合されると異なる波長で吸収しそして発光し； ｂ）少なくとも約25nmのストークスシフトを有し； ｃ）200bpあたり少なくとも色素１分子の比においてdsＤＮＡに挿入すること ができ； ｄ）他の条件が等しい中で、同強度の励起光における発光性蛍光団の同種二量 体に比較した異種二量体の蛍光発光が少なくとも２倍大きく；そして ｅ）前記蛍光団が約２〜４つの第四級アミン基を含んで成る結合基により連結 されている ことにより特徴づけられる、前記蛍光性異種多量体。 19．混合物の成分を指定するために蛍光を使って成分を同定する方法において 、 蛍光体として請求項14に記載の蛍光性多量体を使用し、ただし前記成分はdsＤ ＮＡ以外であることを前提とし、前記蛍光性多量体がdsＤＮＡに結合されている ことを含んで成る改良。 20．混合物の成分を分離するために蛍光を使って混合物の成分を分離する方法 において、 蛍光標識として少なくとも２つの蛍光性多量体を使用し、各多量体は少なくと も２つの蛍光団を有し、前記多量体のうちの少なくとも１つが ａ）少なくとも２つの異なる蛍光団を含んで成り、前記蛍光団はdsＤＮＡに結 合されると異なる波長で吸収しそして発光し； ｂ）少なくとも約25nmのストークスシフトを有し； ｃ）200bpあたり少なくとも色素１分子の比においてdsＤＮＡに挿入すること ができ； ｄ）２〜４つの蛍光団を有する ことにより特徴づけられ、 ここで前記蛍光性多量体のうちの少なくとも２つはdsＤＮＡに結合されると同 一の狭い光バンド幅領域の中で励起させることができ、そして 前記成分がdsＤＮＡ以外である時、前記多量体がdsＤＮＡに結合されそして前 記dsＤＮＡが前記成分に結合されることを前提とする改良。
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