BR112019011494A2 - processo para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere um processo para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz, no qual um tecido biológico é clarificado eletroforeticamente, em que o tecido é imerso em uma solução de eletroforese alcalina aquosa e na solução de eletroforese esse é exposto a um campo elétrico. a solução de eletroforese contém uma base tampão, cujos cátions apresentam um peso molecular de pelo menos 50 da, em uma concentração de 5 a 100 mol/m3 e um detergente não iônico em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume).

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PREPARAÇÕES BIOLÓGICAS TRANSPARENTES PARA UM EXAME DE MICROSCOPIA DE LUZ
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção se refere a um processo para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz. Em particular, a presente invenção refere-se a um tal processo, no qual um tecido biológico é clarificado eletroforeticamente, em que o tecido é imerso em uma solução de eletroforese alcalina aquosa e na solução de eletroforese esse é exposto a um campo elétrico, sendo que a solução de eletroforese contém uma base e um detergente.
[0002] Preparações biológicas transparentes são necessárias, a fim de poder ilustrar as preparações, por exemplo, por meio de microscopia de luz-folha de forma tridimensional. A fim de obter a transparência de preparações biológicas, em particular, os grupos heme do corante de sangue hemoglobina e lipideos devem ser removidos das preparações biológicas.
ESTADO DA TÉCNICA [0003] A partir do documento US 2015/0144490 Al, é conhecido um procedimento também conhecido como processo CLARITY na preparação de amostras biológicas para a análise microscópica. No processo CLARITY, a respectiva amostra é inicialmente fixada em hidrogel. Somente depois, a amostra é colocada em uma solução de eletroforese alcalina aquosa e nessa solução de eletroforese essa é exposta a um campo elétrico. A solução de eletroforese contém ácido bórico, 0,4 % (mol por volume) de dodecilsulfato de sódio (SDS) e
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2/22 hidróxido de sódio (NaOH) , para ajustar um valor de pH de 8,5. A solução de eletroforese é agitada na câmara, na qual a respectiva amostra é exposta ao campo elétrico. A temperatura da solução de eletroforese, neste caso, é de 37-50 °C, a tensão elétrica aplicada é de 10-60 V (sem uma indicação da distância, através da qual essa tensão cai) . Praticamente, a clarificação eletroforética de acordo com o processo CLARITY, necessita de alguns dias. Depois da clarificação eletroforética, a amostra é transferida para um meio com um Índice de refração de 1,5 e essa pode ser adicionalmente tingida, por exemplo, por meio de um fingimento de anticorpos.
[0004] O documento US 2005/0130317 Al descreve um dispositivo para a análise paralela de moléculas biológicas com uma câmara de reação, que se estende entre dois eletrodos. Aos eletrodos é aplicada uma tensão, que leva a uma migração das moléculas biológicas introduzidas entre os eletrodos.
[0005] A partir do documento WO 2017/096248 Al publicado apenas depois do dia da prioridade desse pedido de patente, são conhecidos processos para a preparação e análise de amostras de tecido tumoral para detectar e monitorar tumores. Os processos apresentam o tratamento de uma amostra biológica através da fixação da amostra na presença de subunidades de hidrogel, a polimerização das subunidades de hidrogel para formar uma amostra incorporada no hidrogel, a clarificação da amostra incorporada em hidrogel e a marcação da amostra clarificada incorporada em hidrogel com um ou mais marcadores detectáveis. A clarificação da amostra compreende, por exemplo, a exposição aos solventes
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3/22 orgânicos, a exposição aos detergentes, tais como, por exemplo, saponina, Triton X-100 e Tween-20, a exposição aos agentes tensoativos iônicos, por exemplo, dodecilsulfato de sódio (SDS) e, em particular, a eletroforese com o uso de uma solução tampão, que apresenta um agente tensoativo iônico, em particular, dodecilsulfato de sódio.
OBJETIVO DA INVENÇÃO [0006] 0 objetivo da invenção é mostrar um processo para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz, que é menos dispendioso e consideravelmente mais rápido que o processo CLARITY conhecido.
RESOLUÇÃO [0007] 0 objetivo da invenção é resolvido por um processo com as características da patente 1 independente. As reivindicações dependentes referem-se às formas de realização preferidas do processo de acordo com a invenção. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0008] Em um processo de acordo com a invenção para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz, o tecido biológico é clarificado eletroforeticamente, em que o tecido é imerso em uma solução de eletroforese alcalina aquosa e na solução de eletroforese esse é exposto a um campo elétrico. A solução de eletroforese contém uma base tampão, cujos cátions apresentam um peso molecular de pelo menos 50 Da, em uma concentração de 5 a 100 mol/m3 (5 a 100 mmol/1) e um detergente não iônico em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume, isto é, peso em quilograma com base no volume em litros).
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4/22 [0009] Com a base tampão, cujos cátions apresentam um peso molecular de pelo menos 50 Da, a base tampão ajusta, de fato, a alcalinidade desejada da solução de eletroforese, mas seus cátions - em particular, comparados com ions de sódio - são comparativamente grandes e imóveis. Isso tem como consequência, que o campo elétrico não provoca apenas principalmente uma corrente elétrica em forma de cátions móveis da base tampão, mas sim, em uma proporção essencial, também uma corrente de micélios, nos quais os grupos heme e/ou lipideos estão incluídos no detergente. A corrente elétrica à base desses micélios leva à clarificação desejada do tecido biológico, em que esse conduz os micélios e, com isso, os grupos heme e lipideos para fora do tecido biológico.
[0010] Como no processo de acordo com a invenção é aplicado um detergente não iônico, também não ocorre qualquer corrente elétrica em forma de ions de detergentes, provocada pelo campo elétrico aplicado, que, como tal, seria do mesmo modo parasita, tal como uma corrente dos cátions da base tampão em relação à clarificação desejada do tecido biológico. A consequência de tais correntes iônicas parasitas seria, entre outras, um aquecimento do tecido biológico, sem que esse aquecimento fosse associado a uma clarificação do tecido biológico. As correntes parasitas também evitariam, que os campos elétricos com maiores intensidades de campo possam ser formados ao longo do tecido biológico, porque as grandes correntes provocadas assim aqueceríam demais o tecido biológico. Tais campos elétricos com maior intensidade de campo, no entanto, são vantajosos para a condução elétrica também de micélios
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5/22 maiores e correspondentemente imóveis do tecido biológico.
[0011] Pelo fato de que no processo de acordo com a invenção tanto os cátions da base tampão são relativamente imóveis, como também o detergente é não iônico, as correntes parasitas são mantidas baixas, de modo que a eficiência da clarificação eletroforética é consideravelmente aumentada com base nas correntes circulantes. Além disso, a tendência de detergentes não iônicos de se ligarem às proteínas, que devem permanecer no tecido biológico, é menor do que a tendência de detergentes iônicos, tais como, por exemplo, SDS. Por esse motivo, no processo de acordo com a invenção é possível dispensar, sem mais, uma fixação do tecido biológico em hidrogel, com o qual no processo CLARITY conhecido é garantido, que as proteínas permanecem no respectivo tecido biológico. A omissão da necessidade da fixação do tecido biológico em hidrogel, neste caso, não tem apenas a vantagem, de ser
economizado um considerável gasto no processo, mas sim,
consegue-se também, que a mobilidade dos micélios, que
devem ser conduzidos para fora do tecido biológico com
auxílio do campo elétrico aplicado, não se j a reduzida pelo
hidrogel.
[0012] Ao todo, com o processo de acordo com a invenção, uma clarificação de tecidos biológicos para a produção de preparações biológicas para um exame de microscopia de luz já é obtida regularmente dentro de poucas horas.
[0013] Entende-se que a indicação detergente não iônico não deve ser entendida de tal modo, que com isso, significa apenas um detergente com uma ionicidade de zero. Muito mais, a indicação refere-se a todos os detergentes,
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6/22 que não apresentam qualquer ionicidade pronunciada, isto é, pelo menos essencialmente não apresentam qualquer ionicidade. Preferivelmente, o detergente não iônico, além disso, é selecionado pelo fato, de que apresenta a menor afinidade possível às proteínas. 0 perito, com base nessa especificação é capaz, sem mais, de selecionar os detergentes não iônicos adequados.
[0014] Ensaios práticos do processo de acordo com a invenção mostraram, que pelo menos os seguintes detergentes são adequados como detergentes não iônicos: Tween 20, Tween 80, Triton X45, Triton X100, Triton X102, n-octil-beta-Dglucopiranosida, etoxilato de octilfenol, Brij35 e Nonidet P40. Propriedades particularmente boas para usar na presente invenção mostraram os detergentes não iônicos Tween 80, Triton X45, Triton X102, n-octil-beta-Dglucopiranosida, Brij35 e Nonidet P40.
[0015] O detergente não iônico, que é usado no processo de acordo com a invenção, também pode ser composto por mais de um dos detergentes mencionados acima. A mistura dos detergentes pode ser adaptada especificamente às diversas substâncias constitutivas do respectivo tecido biológico a serem removidas na clarificação eletroforética.
[0016] A concentração da base tampão na solução de eletroforese é de preferivelmente 10 a 50 mol/m3 e ainda mais preferivelmente, de 15 a 25 mol/m3, isto é, cerca de 2 0 mol/m3.
[0017] A concentração do detergente não iônico na solução de eletroforese é de preferivelmente 0,5 a 1,5 % (peso por volume), isto é, cerca de 1 % (peso por volume).
[0018] O peso molecular dos cátions da base tampão é de
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7/22 preferivelmente pelo menos 100 Da. Bases tampão, que cumprem essa exigência cada vez mais na ordem de sua nomeação, são Tris, Bicinas e BisTris.
[0019] Uma temperatura máxima da solução de eletroforese durante a clarificação eletroforética pode ser mantida em uma faixa de 20 a 90 °C. Em todo caso, a temperatura deve ser mantida abaixo de um ponto de ebulição da solução de eletroforese. Normalmente, é preferível manter a temperatura máxima da solução de eletroforese, durante a clarificação eletroforética, em uma faixa de 40 a 60 °C, isto é, em aproximadamente 50 °C. Com uma temperatura excedente, contudo, pode-se conseguir que os pontos de ligação para anticorpos às proteínas sejam termicamente desmascarados, de modo que essas proteínas, em seguida, possam ser marcadas com os anticorpos.
[0020] No processo de acordo com a invenção, um aumento de temperatura do tecido biológico resulta através da entrada de energia elétrica, que é transformada em calor. Isso é basicamente inevitável. No processo de acordo com a invenção, contudo, a clarificação obtida do tecido biológico com base na entrada de energia elétrica é particularmente grande.
[0021] Isso torna particularmente fácil limitar a temperatura do tecido biológico a uma temperatura máxima
nas faixas mencionadas, sem que, para esse fim, por
exemplo, seria necessário um resfriamento ativo da solução
de eletroforese. [0022] Na realização do processo de acordo com a
invenção, durante a clarificação eletroforética, um valor de pH da solução de eletroforese pode ser mantido em uma
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8/22 faixa de 8 a 9. A corrente elétrica que circula em consequência do campo elétrico aplicado, reduz tipicamente o valor de pH da solução de eletroforese, mesmo também se a base tampão disponibilizar um reservatório para grupos OH. A fim de manter elevada a eficiência da clarificação do tecido biológico, é conveniente, por conseguinte, manter o valor de pH da solução de eletroforese na faixa alcalina mencionada. Para esse fim, durante a clarificação eletroforética pode ser acrescentada uma base tampão fresca. Também o detergente consumido através da canalização dos micélios sob a influência do campo elétrico, pode ser outra vez completado durante a clarificação eletroforética, acrescentando detergente fresco à solução de eletroforese. Uma eficiência máxima do processo de acordo com a invenção é obtida, quando a solução de eletroforese é continuamente trocada por uma solução de eletroforese não consumida.
[0023] No processo de acordo com a invenção, uma potência elétrica, que é cedida à solução de eletroforese e ao tecido imerso nessa, pode ser regulada durante a clarificação eletroforética. Essa regulação pode ocorrer dependendo da temperatura do tecido biológico ou da solução de eletroforese ou também para um valor constante, que garante a manutenção de uma certa temperatura máxima. Pelo menos a potência elétrica, durante um período parcial da clarificação eletroforética, pode ser regulada para um tal valor fixo. Se a clarificação do tecido biológico avançou muito e/ou a solução de eletroforese já foi utilizada em partes essenciais, a regulagem ulterior da potência elétrica para um valor fixo muitas vezes não é mais
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9/22 conveniente .
[0024] 0 avanço da clarificação do tecido biológico pode ser observado detectando uma resistência elétrica da solução de eletroforese e do tecido biológico imerso nessa. Inicialmente, a resistência elétrica diminui, isto é, a condutibilidade elétrica aumenta, quando os micélios a serem canalizados se formam no tecido biológico. Com o consumo da solução de eletroforese e/ou da canalização já ocorrida das partes essenciais dos grupos heme e lipideos a serem removidos, a resistência, então, aumenta outra vez, respectivamente, a condutibilidade elétrica diminui outra vez. Assim, então, no processo de acordo com a invenção, as condições da clarificação eletroforética podem ser modificadas e/ou a clarificação eletroforética pode ser concluída, quando a resistência elétrica ou sua modificação temporal exceder e/ou passar a um nível inferior de um valor limite predeterminado.
[0025] Antes do tecido biológico conforme o processo de acordo com a invenção, ser clarificado eletroforeticamente, esse já pode ser submetido a outros tratamentos. Isso inclui, que o tecido biológico é fixado, por exemplo, com formaldeído, que, contudo, não limita a mobilidade dos micélios, diferentemente de um hidrogel usado para a fixação. Além disso, a lavagem do tecido biológico, por exemplo, com água ou também com a solução de eletroforese usada mais tarde durante a clarificação eletroforética, é incluída nas possíveis etapas da própria clarificação eletroforética. Além disso, o tecido biológico, antes de ser clarificado eletroforeticamente, pode ser incubado em uma solução alcalina aquosa. Nessa incubação, é provado
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10/22 como sendo favorável, se os seguintes parâmetros são pelo menos parcialmente mantidos: a incubação ocorre durante um período de 30 a 120 minutos, preferivelmente de 45 a 90 minutos. A incubação ocorre a uma temperatura de 20 a 50 °C, preferivelmente de 35 a 40 °C, isto é, a cerca de 37,5 °C. A solução alcalina aquosa apresenta uma concentração de álcali de 50 a 2.000 mol/m3, preferivelmente de 100 a 1.000 mol/m3. A solução alcalina aquosa apresenta NaOH para fornecer sua concentração de álcali. A solução alcalina aquosa apresenta um Ci-g-álcool em uma concentração de 10 a 70 % (v/v) ou preferivelmente de 40 a 60 % (v/v). A solução alcalina aquosa apresenta etanol; e a solução alcalina aquosa apresenta um detergente em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume) e preferivelmente de 0,5 a 2 % (peso por volume).
[0026] Adicionalmente à clarificação eletroforética na solução de eletroforese alcalina aquosa, o tecido biológico pode ser incubado em uma solução ácida aquosa e, a seguir, em uma solução de eletroforese ácida aquosa, esse pode ser exposto a um campo elétrico para a outra clarificação eletroforética.
[0027] Ao incubar o tecido na solução ácida aquosa, pode ser mantido pelo menos um dos seguintes parâmetros: a incubação ocorre durante 30 a 120 minutos, preferivelmente durante 45 a 90 minutos. A incubação ocorre a 20 até 50 °C, preferivelmente a 35 até 40 °C. A solução ácida aquosa apresenta uma concentração de prótons de 50 a 2.000 mol/m3, preferivelmente de 100 a 1.000 mol/m3. A solução ácida aquosa apresenta ácido tricloro-acético, a fim de fornecer sua concentração de prótons. A solução ácida aquosa
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11/22 apresenta um Ci-g-álcool em uma concentração de 10 a 70 % (v/v) , preferivelmente de 40 a 60 % (v/v) . A solução ácida aquosa apresenta etanol; e a solução ácida aquosa apresenta um detergente em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume), preferivelmente de 0,5 a 2 % (peso por volume) . Além disso, a solução de eletroforese ácida aquosa pode manter pelo menos um dos seguintes parâmetros: a solução de eletroforese ácida aquosa contém um ácido de tampão em uma concentração de 5 a 100 mol/m3 e um detergente não iônico em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume); e a solução de eletroforese ácida aquosa contém ácido acético em uma concentração de 10 a 50 mol/m3 e um detergente não iônico em uma concentração de 0,5 a 2 % (peso por volume). [0028] Depois que o tecido biológico foi clarificado eletroforeticamente, esse pode ser ulteriormente preparado para o exame de microscopia de luz. Para esse fim, pode ser incluída pelo menos uma das seguintes etapas: o tecido biológico é incubado com pelo menos um anticorpo. O tecido biológico é exposto a um campo elétrico em uma solução do anticorpo. O tecido biológico é tingido com pelo menos um corante. O tecido biológico é exposto a um campo elétrico em uma solução de um corante. O tecido biológico é lavado com um solvente orgânico. O tecido biológico é lavado com xileno ou diclorometano. O tecido biológico é introduzido em uma solução com um índice de refração na faixa de n = 1,4 a n = 1,6. A faixa do índice de refração de n = 1,4 a n = 1,6, isto é, de cerca de n = 1,5 significa, que a solução apresenta o mesmo índice de refração do tecido biológico clarificado. Com isso, não ocorrem quaisquer dispersões nas superfícies limites do tecido biológico durante seu exame
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12/22 de microscopia de luz.
[0029] De forma concreta, o tecido biológico, depois de ter sido clarificado eletroforeticamente, pode ser introduzido em uma solução aquosa e/ou em uma solução de açúcar ou poliol com um índice de refração na faixa mencionada de aproximadamente n = 1,5. Alternativamente, o tecido biológico, depois de ter sido clarificado eletroforeticamente, pode ser desidratado em uma série de álcool com crescente concentração de álcool e/ou pode ser introduzido em um solvente orgânico, em salicilato de metila ou em uma solução de salicilato de metila com um índice de refração na faixa de aproximadamente n = 1,5 [0030] Para a realização concreta do processo de acordo com a invenção, o tecido, para a clarificação eletroforética, pode estar disposto em uma câmara de reação, que apresenta uma câmara de reação formada em simetria rotacional em torno do eixo vertical e que apresenta um corte lateral, a ser preenchida com a solução de eletroforese, um canal anular aberto para baixo na câmara de reação abaixo do corte lateral, que está conectado a um canal de descarga de gás ascendente, um primeiro eletrodo anular dentro do canal anular e/ou na câmara de reação abaixo do canal anular e um segundo eletrodo anular na câmara de reação acima do corte lateral. O primeiro e o segundo eletrodo são conectados, a seguir, às duas saídas de uma fonte de tensão contínua, a fim de expor o tecido biológico a um campo elétrico. O tecido está disposto em uma seção transversal livre reduzida da câmara de reação no corte lateral, onde se concentra um campo elétrico aproximadamente homogêneo entre os eletrodos.
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13/22
Sobre o canal de descarga de gás podem ser desviadas bolhas de gás formadas no eletrodo inferior e ascendentes a partir desse, de modo que essas não se acumulem na câmara de reação e impeçam o fluxo de corrente elétrica. Além disso, a formação de gás oxidrico é evitada, se as bolhas de gás contiverem hidrogênio formado pela hidrólise. A câmara de reação pode apresentar outras características, tais como são conhecidas do documento US 2005/013037 Al.
[0031] Desenvolvimentos vantajosos da invenção resultam das reivindicações de patente, do relatório descritivo e dos desenhos. As vantagens das características mencionadas no relatório descritivo e de combinações de várias características são meramente exemplificativas e podem ter efeito alternativo ou cumulativo, sem que as vantagens devam ser obtidas obrigatoriamente pelas formas de realização de acordo com a invenção. Sem que, por este meio, o objetivo das reivindicações acrescentadas seja modificado, aplica-se com respeito ao teor de publicação dos documentos do pedido e da patente, o seguinte: outras características devem ser deduzidas dos desenhos - em particular, das geometrias mostradas e das dimensões relativas de vários componentes uns em relação aos outros, assim como sua disposição relativa e do composto ativo -. A combinação de características das diferentes formas de realização da invenção ou de características de diferentes reivindicações é igualmente possível desviando dos antecedentes selecionados das reivindicações e estimulada aqui. Isso se refere também àquelas características, que são mostradas em desenhos separados ou que são mencionadas em sua descrição. Essas características também podem ser
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14/22 combinadas com características de diferentes reivindicações. Do mesmo modo, as características listadas nas reivindicações podem ser dispensadas para outras formas de realização da invenção.
[0032] As características mencionadas nas reivindicações e no relatório descritivo devem ser entendidas em relação ao seu número de tal modo, que há exatamente esse número ou um número maior do que o número mencionado, sem que esse necessite de um uso explicito do advérbio pelo menos. Se, portanto, a questão é, por exemplo, um detergente, isso deve ser entendido de tal modo, que estão presentes exatamente um detergente, dois detergentes ou mais detergentes. As características listadas nas reivindicações podem ser complementadas por outras características ou ser as únicas características, que o respectivo processo apresenta ou uma solução usada no respectivo processo.
[0033] Os sinais de referência contidos nas reivindicações não representam qualquer limitação do âmbito dos objetivos protegidos pelas reivindicações. Esses servem meramente para a finalidade de tornas as reivindicações mais fácil de entender.
RESUMO DAS FIGURAS [0034] A seguir, a invenção é ainda mais elucidada e descrita com base nas figuras dos exemplos de realização preferidos apresentados.
Figura 1 é uma vista explodida de uma câmara de reação para a realização do processo de acordo com a invenção
Figura 2 mostra um detalhe de uma forma de realização modificada da câmara de reação em um corte
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15/22 vertical; e
Figura 3 é um fluxograma de uma forma de realização do processo de acordo com a invenção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0035] Em uma forma de realização do processo de acordo com a invenção para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz, uma amostra 1 de tecido biológico 2 é disposta, com o auxilio de um suporte de amostra 3, em uma câmara de reação 4, que está representada na Figura 1 em uma vista explodida. A câmara de reação 4 apresenta uma câmara de reação 5, que é formada em simetria rotacional em torno do eixo vertical 6. Na câmara de reação 5, o tecido biológico é disposto em cerca da metade da altura, sendo que através do suporte de amostra 3 é formado um corte lateral, isto é, uma redução do diâmetro da câmara de reação 5. O tecido biológico, neste caso, está disposto no corte lateral na área da seção transversal livre reduzida 16 da câmara de reação 5. A câmara de reação 5, durante a realização do processo de acordo com a invenção, é preenchida pelo menos com uma solução de eletroforese alcalina aquosa. Também todas as outras soluções, com as quais o tecido biológico 2 entra em contato durante a realização do processo de acordo com a invenção, podem ser preenchidas na câmara de reação 5, respectivamente, podem ser conduzidas através da câmara de reação 5. A câmara de reação 5 apresenta, para este fim, uma conexão superior 7 e uma conexão inferior 8. Essas conexões 7 e 8 não podem ser utilizadas durante o tratamento do tecido biológico 2 para modificar a composição da solução na câmara de reação 5 ou mesmo trocar
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16/22 por uma outra solução, mas sim, também para circular a respectiva solução através da câmara de reação 5. Nessa circulação, a respectiva solução pode ser conduzida, por exemplo, através de um trocador de calor, a fim de temperála ou a solução pode ser regenerada com base nos componentes consumidos.
[0036] Para uma clarificação eletroforética do tecido biológico 2, para, a partir desse, remover, em particular, grupos heme e lipideos, são previstos um eletrodo superior 9 e um eletrodo inferior 10, que são imersos na solução que se encontra na câmara de reação. Aplicando uma tensão entre os eletrodos 9 e 10, forma-se um campo elétrico ao longo do tecido biológico 2, que fornece a força elétrica estimulante para a clarificação eletroforética. Para a aplicação da tensão entre os eletrodos 9 e 10, são previstas ligações de conexões 11 ao eletrodo superior 9 e 12 e ao eletrodo inferior, com as quais os eletrodos 9 e 10 são conectados a uma fonte de tensão continua 13. Os eletrodos 9 e 10 são formados em forma anular para provocar, na área do corte lateral, isto é, da seção transversal livre do suporte de amostra 3, no qual o tecido biológico 2 está disposto, um campo elétrico o mais homogêneo possível. Entende-se, que tanto o suporte de amostra 3, quanto também as duas partes adjacentes 14 e 15 da câmara de amostra 4, são formados a partir de material eletricamente isolante.
[0037] O detalhe representado na Figura 2 em uma seção vertical de uma outra forma de realização da câmara de reação 4, mostra a parte inferior da câmara de reação 5, na qual é instalado o suporte de amostra 3 com a amostra 1, de
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17/22 modo que o tecido biológico 2 está disposto na seção transversal livre 16 do corte lateral da câmara de reação 5 através do suporte de amostra 3. Uma conexão inferior 8 à câmara de reação 5, de fato, não é representada aqui, mas pode estar presente tal como na Figura 1. 0 eletrodo inferior 10 está disposto parcialmente abaixo e parcialmente dentro de um canal anular 17 fechado para cima, que é formado por uma inserção 2 9 na câmara de amostra. O canal anular 17 aberto para baixo está conectado a um canal de descarga de gás 18 ascendente para, a partir do eletrodo 10, em consequência da tensão aplicada, descarregar de forma controlada as bolhas de gás 19 ascendentes contidas, por exemplo, no hidrogênio formado através da hidrólise, para que essas não se acumulem na câmara de reação 5 e impeçam o fluxo de corrente através da câmara de reação 5 e, com isso, também é evitada a formação de gás oxidrico na câmara de reação 5.
[0038] O processo de acordo com a invenção, ilustrado na Figura 3 em um diagrama em bloco, começa com uma fixação 20 do tecido biológico 2, por exemplo, com formaldeido. Essa é seguida por uma lavagem 21 do tecido 2, por exemplo, com água. No decorrer da realização do processo de acordo com a invenção, podem ser inseridas outras etapas de lavagem, que não são destacadas na Figura 3. Basicamente é válido, que o tecido 2, antes de qualquer tratamento mais longo em uma solução, tal como é esclarecido a seguir, pode ser inicialmente lavado com essa solução.
[0039] Uma incubação alcalina 22 ocorre, por exemplo, durante uma hora a 37 °C em uma solução aquosa com 100 mol/m3 de NaOH, 50 % de EtOH e 1 % (peso por volume) de um
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18/22 detergente. Uma eletroforese alcalina 23 seguinte ocorre, por exemplo, durante 45 minutos a 50 °C em uma solução de eletroforese alcalina aquosa com 20 mol/m3 de Tris e 1 % (peso por volume) do respectivo detergente. A própria eletroforese ocorre com uma tensão contínua entre os eletrodos 9 e 10 de no máximo 1000 V, com uma corrente máxima de 150 mA e com uma limitação de potência para 10 W. Isso pode levar, por exemplo, a uma tensão média de 500 V com uma corrente média de 20 mA. Essa, com ligação intermediária de uma etapa de lavagem não representada, pode ser seguida de uma incubação ácida 24. A incubação ácida 24 pode corresponder a uma incubação alcalina 22, além de que essa ocorre com adição de ácido tricloroacético ao invés de NaOH. Do mesmo modo, em uma eletroforese ácida 25 seguinte, podem predominar basicamente as mesmas condições da eletroforese alcalina 23, além de ser usado ácido tricloro-acético ao invés de Tris. A seguir ou em outro ponto adequado do processo de acordo com a invenção, ocorre um fingimento com anticorpo 26, isto é, um fingimento imunológico de certas proteínas, que estão presentes, além disso, no tecido 2 depois da clarificação eletroforética. Neste caso, são usados anticorpos, que se ligam especificamente a essas proteínas e que ou portam um corante ou são marcados a seguir com um corante. Desde que o tecido biológico 2 clarificado e opcionalmente tingido não seja examinado microscopicamente em uma solução aquosa, ocorre uma desidratação 27, à qual se segue uma transferência 28 para um meio com o índice de refração do tecido clarificado de cerca de 1,5. Um meio adequado para esse fim é o óleo de gaultéria. Em seguida, o
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19/22 tecido é adequado, por exemplo, para um exame de microscopia de luz aplicando uma técnica de luz-folha. Em comparação com o conhecido processo CLARITY, o processo de acorcio com a invenção caracteriza —se por um período notai do processo muito curto de poucas noras. Neste caso, deve ser considerado, também, que a incubação ácida 24 e a eletroforese ácida 25 frequentemente não são necessárias para clarificar suficientemente o tecido biológico 2.
[0040] De acordo com o seguinte protocolo para a realização do processo de acordo com a. invenção, as amostras 1 a partir de tecido de pulmão suíno foram clarificadas com êxito de respectivamente cerca de 250 mg. A fixação 20 do tecido 2 ocorre em formaldeído. A lavagem 21 do tecido 2 ocorre durante 10 minutos com água. A incubação alcalina 22 ocorreu durante uma hora a 37 °C em solução aquosa com 500 mol/m3 de NaOH, 50 % (v/v) de EtOH e 1 % (peso por volume) de um detergente não iônico. A eletroforese alcalina 23 ocorreu durante 45 minutos em solução aquosa de eletroforese com 20 mol/m3 de Tris e 1 % (peso por volume) do respectivo detergente não iônico. Neste caso, entre os eletrodos 9 e 10 situou-se uma tensão igual de no máximo 1000 V e a corrente máxima foi de 150 mA, sendo que a potência foi limitada a 10 W. A desidratação 27 ocorreu em 4 etapas de 30 minutos com 50 %, 70 %, 90 % e 100 % de etanol. A transferência 28 ocorreu em óleo de gaultéria. Os vários detergentes não iônicos comprovados, ao ser aplicado esse protocolo, forneceram resultados diferentemente bons, que foram avaliados de acordo com uma escala de avaliação de 0 (má clarificação, amostra tingida escura) até ++++ (boa permeabilidade e
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20/22 descoloração) :
0: nenhum detergente +: Tween 20, Triton X100 ++: n-octil-beta-D-glucopiranosida, Brie 35 +++: Nonidet P40, Triton X45 (solução láctea), Tween 80 ++++: Triton X102 [0041] Em um outro experimento, pesquisou-se a relação entre o decurso da resistência elétrica na eletroforese alcalina 23, a carga sanguinea do tecido 2 e o resultado da clarificação. A resistência elétrica cai no inicio da eletroforese alcalina 23. Isso é atribuído à formação e liberação dos micélios que contêm os grupos heme e lipideos como portadores de carga móvel que, em seguida, podem ser conduzidos para fora do tecido 2. Com a alta carga sanguinea do tecido, podem se formar mais desses portadores de carga. De modo correspondente, a resistência elétrica cai muito mais rápido e atinge também um valor minimo mais baixo. Com o consumo dos componentes formadores de portadores de carga da solução de eletroforese, a resistência aumenta outra vez, também se os componentes formadores de portadores de carga do tecido, isto é, os grupos heme e lipideos, já foram essencialmente removidos do tecido. Esse decurso da resistência elétrica pode ser utilizada especificamente para controlar a eletroforese alcalina, em particular, para reconhecer o periodo, no qual a eletroforese alcalina é concluída de maneira conveniente. Além disso, esse decurso da resistência elétrica é uma evidência para a exatidão das considerações que servem de base para a invenção, para manter a condutibilidade elétrica da própria solução de eletroforese a mais baixa
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21/22 possível e certificar-se para que sejam formados, se possível, apenas portadores de carga, que contêm realmente substâncias a serem removidas do tecido para sua clarificação, tais como grupos heme e lipídeos. A corrente elétrica que flui nessas condições leva de forma eficiente à clarificação eletroforética do tecido 2. Com isso, é evitado tanto um aquecimento elétrico da amostra 2 através das correntes elétricas parasitas, como também é evitado, que tais correntes elétricas parasitas evitem praticamente a formação de altas intensidades de campo do campo elétrico formado ao longo da amostra, tais como são necessárias para exercer sobre micélios, que compreendem grandes grupos heme e/ou lipídeos, energias elétricas suficientemente grandes, a fim de conduzir as mesmas para fora do tecido biológico 2 .
LISTA DE REFERÊNCIAS [0042] amostra tecido biológico suporte de amostra câmara de reação câmara de reação eixo vertical conexão superior conexão inferior eletrodo superior eletrodo inferior ligação ligação fonte de tensão contínua
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22/22 parte superior da câmara de reação 4 parte inferior da câmara de reação 4 seção transversal livre canal anular canal de descarga de gás bolhas de gás fixação lavagem incubação alcalina eletroforese alcalina incubação ácida eletroforese ácida fingimento do anticorpo desidratação transferência inserção

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo para a produção de preparações biológicas transparentes para um exame de microscopia de luz, no qual um tecido biológico (2) é clarificado eletroforeticamente, em que o tecido é imerso em uma solução de eletroforese alcalina aquosa (23) e na solução de eletroforese esse é exposto a um campo elétrico, no qual a solução de eletroforese contém uma base e uma concentração de 5 a 100 mol/m3 e um detergente em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume), caracterizado pelo fato de que a base é uma base tampão, cujos cátions apresentam um peso molecular de pelo menos 50 Da e que o detergente é um detergente não iônico.
2/7 substância, que é selecionada a partir do grupo, que consiste em: Tween 80, Triton X102 e Nonidet P40.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detergente não iônico é composto pelo menos predominantemente por pelo menos uma substância, que é selecionada a partir do grupo, que consiste em: Tween 20, Tween 80, Triton X45, Triton X100, Triton X 102, n-octil-beta-D-glucopiranosida, etoxilato de octilfenol, Brij35 e Nonidet P40.
3/7 eletroforética é mantida em uma faixa de 8 a 9.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detergente não iônico é composto pelo menos predominantemente por pelo menos uma substância, que é selecionada a partir do grupo, que consiste em: Tween 80, Triton X45, Triton X102, n-octilbeta-D-glucopiranosida, Brij35 e Nonidet P40.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detergente não iônico é composto pelo menos predominantemente por pelo menos uma
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5/7 eletroforeticamente na solução de eletroforese alcalina aquosa, é incubado em uma solução ácida aquosa e depois, em uma solução de eletroforese ácida aquosa, é exposto a um campo elétrico.
5. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a solução de eletroforese contém a base tampão em uma concentração de 10 a 50 mol/m3 ou de 15 a 25 mol/m3.
6/Ί tricloro-acético em uma concentração de 10 a 50 mol/m3 e um detergente não iônico em uma concentração de 0,5 a 2 % (peso por volume).
6. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a solução de eletroforese contém o detergente não iônico em uma concentração de 0,5 a 1,5 % (peso por volume).
7/7 refração na faixa de n = 1,4 a n = 1, 6 e/ou introduzido em salicilato de metila ou em uma solução de salicilato de metila com um indice de refração na faixa de n = 1,4 a n = 1,6.
7. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o peso molecular dos cátions da base tampão é de pelo menos 100 Da.
8. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a base tampão é composta pelo menos preponderantemente por pelo menos uma substância, que é selecionada a partir do grupo, que consiste em: Tris, Bicine e BisTris.
9. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma temperatura máxima da solução de eletroforese durante a clarificação eletroforética é mantida em uma faixa de 20 a 90 °C abaixo de um ponto de ebulição da solução de eletroforese.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a temperatura máxima da solução de eletroforese durante a clarificação eletroforética é mantida em uma faixa de 40 a 60 °C.
11. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um valor de pH da solução de eletroforese durante a clarificação
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12. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que durante a clarificação eletroforética, uma base tampão fresca e/ou detergente fresco é acrescentada à solução de eletroforese.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a solução de eletroforese é trocada continuamente.
14. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma energia elétrica, que é fornecida à solução de eletroforese e ao tecido imerso nessa, é regulada durante a clarificação eletroforética.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a energia elétrica é regulada, pelo menos para um período parcial da clarificação eletroforética, para um valor fixo.
16. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que durante a clarificação eletroforética é registrada uma resistência elétrica da solução de eletroforese e do tecido biológico (2) imerso nessa.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as condições da clarificação eletroforética são alteradas e/ou a clarificação eletroforética é concluída, quando a resistência elétrica ou sua alteração temporal excedem e/ou não atingem um valor limite predeterminado.
18. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tecido
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19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que durante a incubação do tecido na solução alcalina aquosa, antes de ser clarificado eletroforeticamente, são mantidos pelo menos um dos seguintes parâmetros:
a incubação ocorre durante 30 a 120 minutos ou durante 45 a 90 minutos;
a incubação ocorre a 20 até 50 °C ou a 35 até 40 °C; a solução alcalina aquosa apresenta uma concentração de metais alcalinos de 50 a 2.000 mol/m3 ou de 100 a 1.000 mol/m3; a solução alcalina aquosa apresenta NaOH;
a solução alcalina aquosa apresenta um Ci-g-álcool em uma concentração de 10 a 70 % ou 40 a 60 % (peso por volume); a solução alcalina aquosa apresenta etanol e a solução alcalina aquosa apresenta um detergente em uma concentração de 0, 1 a 10 % ou de 0,5 a 2 % (peso por volume).
20. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tecido biológico (2), antes ou depois de ser/foi clarificado
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21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que durante a incubação do tecido na solução ácida aquosa, é mantido pelo menos um dos seguintes parâmetros:
a incubação ocorre durante 30 a 120 minutos ou durante 45 a 90 minutos;
a incubação ocorre a 20 até 50 °C ou a 35 até 40 °C;
a solução ácida aquosa apresenta uma concentração de prótons de 50 a 2.000 mol/m3 ou de 100 a 1.000 mol/m3;
a solução ácida aquosa apresenta um ácido tricloroacético;
a solução ácida aquosa apresenta um Ci-g-álcool em uma concentração de 10 a 70 % ou de 40 a 60 % (peso por volume);
a solução ácida aquosa apresenta etanol e a solução ácida aquosa apresenta um detergente em uma concentração de 0,1 a 10 % ou de 0,5 a 2 % (peso por volume); e a solução ácida aquosa de eletroforese mantém pelo menos um dos seguintes parâmetros:
a solução ácida aquosa de eletroforese contém um ácido tampão em uma concentração de 5 a 100 mol/m3 e um detergente não iônico em uma concentração de 0,1 a 10 % (peso por volume) e a solução ácida aquosa de eletroforese contém ácido
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22 . Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tecido biológico (2) , depois de ter sido clarificado
eletroforeticamente é incubado com um anticorpo e/ou em uma solução de um anticorpo, é exposto a um campo elétrico e/ou tingido com um corante e/ou em uma solução de um corante, é exposto a um campo elétrico e/ou lavado com um solvente orgânico e/ou lavado com xileno ou diclorometano e/ou introduzido em uma solução com um indice de refração na faixa de n = 1,4 a n = 1,6.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o tecido biológico (2), depois de ter sido clarificado eletroforeticamente é introduzido em uma solução aquosa com um indice de refração na faixa de n = 1,4 a n = 1, 6 e/ou introduzido em uma solução de açúcar ou poliol com um indice de refração na faixa de n = 1,4 a n = 1,6.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o tecido biológico (2), depois de ter sido clarificado eletroforeticamente é desidratado em uma série de álcool com crescente concentração de álcool e/ou introduzido em um solvente orgânico com um indice de
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25. Processo, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tecido para a clarificação eletroforética está disposto em uma câmara de reação (4), que apresenta uma câmara de reação (5) formada em simetria rotacional em torno do eixo vertical (6) e que apresenta um corte lateral, a ser preenchida com a solução de eletroforese, um canal anular (17) aberto para baixo na câmara de reação (5) abaixo do corte lateral, que está conectado a um canal de descarga de gás (18) ascendente, um primeiro eletrodo anular (10) dentro do canal anular (17) e/ou na câmara de reação (5) abaixo do canal anular (17) e um segundo eletrodo anular (9) na câmara de reação (5) acima do corte lateral,
- na qual o primeiro e o segundo eletrodo (9, 10) são conectados às duas saldas de uma fonte de tensão continua (13) e na qual o tecido em um corte transversal livre reduzido (16) da câmara de reação (5) está disposto no corte lateral.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110763661B (zh) * 2018-07-25 2022-03-22 中国科学院合肥物质科学研究院 处理液组合物、试剂盒和生物器官透明化同时进行免疫标记的方法
DE102020109087A1 (de) 2020-04-01 2021-10-07 MobiCron GmbH Elektrophoresevorrichtung zur Verwendung bei einem Electroclearing-Verfahren
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EP4016045A1 (de) 2020-12-17 2022-06-22 MobiCron GmbH Verfahren zur optischen klärung einer gewebeprobe mit einem einbettungsmedium

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9306729D0 (en) 1993-03-31 1993-05-26 British Tech Group Improvements in separators
US5916265A (en) * 1994-03-30 1999-06-29 Hu; Jie Method of producing a biological extracellular matrix for use as a cell seeding scaffold and implant
US6203683B1 (en) 1998-11-09 2001-03-20 Princeton University Electrodynamically focused thermal cycling device
DE10209609A1 (de) 2002-03-05 2003-10-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und Vorrichtung zur Parallelanalyse von Bio-Molekülen
ATE555666T1 (de) * 2002-05-23 2012-05-15 Ortho Clinical Diagnostics Inc Einfang, konzentration und quantifizierung eines abnormalen prionproteins aus biologischen flüssigkeiten mittels tiefenfiltration
GB2398751A (en) 2003-02-28 2004-09-01 Univ Surrey A dielectrophoretic separation device
US7273720B1 (en) * 2004-12-02 2007-09-25 Collaborative Laboratory Services, Llc Rapid tissue processing method and apparatus
US8092670B2 (en) * 2005-09-29 2012-01-10 Toto Ltd. Method for specifically detecting analyte using photocurrent, and electrode, measuring cell and measuring device for use therein
JP2008249543A (ja) * 2007-03-30 2008-10-16 Tohoku Univ 組織標本からの細胞の調製方法
GB0810445D0 (en) 2008-06-06 2008-07-09 Lab901 Ltd An electrophoresis cassette
JP2010008332A (ja) * 2008-06-30 2010-01-14 Canon Inc 界面動電装置
JP5182809B2 (ja) * 2008-07-07 2013-04-17 独立行政法人産業技術総合研究所 タンパク質の分析方法及び分析試薬
CA2745431A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 Timothy J. O'leary Pressure-assisted molecular recovery (pamr) of biomolecules, pressure-assisted antigen retrieval (paar), and pressure-assisted tissue histology (path)
FR2947632B1 (fr) * 2009-07-01 2011-11-11 Sebia Sa Analyse et dosage d'hemoglobines glyquees par electrophorese capillaire, compositions tampon et kits pour electrophorese capillaire
CA2845713A1 (en) 2011-08-19 2013-02-28 David Martin Morrow Gradient array dielectrophoresis separation (grads) with concomitant light therapy
US20150362459A1 (en) 2012-02-24 2015-12-17 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Method and System for Concentrating Particles from a Solution
CN104350372B (zh) 2012-08-09 2018-03-02 斯坦福大学托管董事会 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
KR20160058900A (ko) * 2013-09-20 2016-05-25 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법
KR101563826B1 (ko) * 2014-12-31 2015-10-28 계명대학교 산학협력단 조직 투명화 방법
JP6781421B2 (ja) * 2015-03-18 2020-11-04 国立研究開発法人理化学研究所 生物材料の観察方法および透明化方法
US20190113423A1 (en) 2015-12-02 2019-04-18 Clearlight Diagnostics, LLC Methods for preparing and analyzing tumor tissue samples for detection and monitoring of cancers
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