CN110036272B - 制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法，其中通过将生物组织浸入含水碱性电泳溶液中并在电泳溶液中暴露于电场从而以电泳方式使生物组织澄清化。所述电泳溶液包含浓度为5至100mol/m³的其阳离子具有至少50Da的分子量的缓冲碱以及浓度为0.1至10％(w/v)的非离子洗涤剂。

Description

制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法

技术领域

本发明涉及制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法。本发明尤其是涉及此类方法，其中通过将组织浸入含水碱性电泳溶液中并在电泳溶液中暴露于电场，从而以电泳方式使生物组织澄清化，其中所述电泳溶液包含碱和洗涤剂。

透明生物制剂是必不可少的，从而例如可以借助光片显微三维塑造制剂。为了实现生物制剂的透明度，尤其是由生物制剂去除血液染色剂血红蛋白的血红素基团和脂类。

背景技术

由US 2015/0144490 A1公开了在制备用于显微分析的生物试样时还称作CLARITY法的方式。在CLARITY法中首先将各个试样固定在水凝胶中。然后才将试样放入含水碱性电泳溶液中，并在该电泳溶液中暴露于电场。所述电泳溶液包含硼酸、0.4％(m/v)十二烷基硫酸钠(SDS)和氢氧化钠(NaOH)，以调节pH值为8.5。将所述电泳溶液在腔室中循环，在其中将各个试样暴露于电场。在此，电泳溶液的温度为37至50℃，施加的电压为10至60V(没有说明这些电压下降的区段)。根据CLARITY法，电泳澄清化实际上需要一些天。在电泳澄清化之后，将试样转移到折射率为1.5的介质中，其可以额外地例如借助抗体染色进行染色。

US 2005/0130317 A1描述了一种利用在两个电极之间延伸的反应空间平行分析生物分子的装置。在电极上施加电压，这导致被引入电极之间的生物分子移动。

由在本专利申请的优先权日之后才公开的WO 2017/096248 A1公开了制备和分析肿瘤组织试样以检测和监视肿瘤的方法。该方法包括：通过固定试样在存在水凝胶亚单元的情况下处理生物试样，使水凝胶亚单元聚合以形成嵌入水凝胶中的试样，使嵌入水凝胶中的试样澄清化，及利用一种或多种可检测的标记物标记澄清化的嵌入水凝胶中的试样。试样的澄清化例如包括暴露于有机溶剂，暴露于洗涤剂，例如Saponin、Triton X-100和Tween-20，暴露于离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，尤其是通过使用包含离子表面活性剂尤其是十二烷基硫酸钠的缓冲溶液而实施电泳。

发明目的

本发明基于以下目的，提供比已知的CLARITY法复杂性低并且明显更迅速的制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法。

发明内容

在根据本发明的制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法中，通过将组织浸入含水碱性电泳溶液中并在电泳溶液中暴露于电场，从而以电泳方式使生物组织澄清化。所述电泳溶液包含浓度为5至100mol/m³(5至100mmol/l)的其阳离子具有至少50Da的分子量的缓冲碱以及浓度为0.1至10％(w/v，即以千克计的重量，基于以升计的体积)的非离子洗涤剂。

利用其阳离子具有至少50Da的分子量的缓冲碱，虽然调节缓冲碱至电泳溶液的所期望的碱度，但是其阳离子尤其是与钠离子相比是比较大的，并且是不能移动的。因此，电场尤其是不仅引起缓冲碱的移动的阳离子的形式的电流，而且主要部分还引起胶粒的流，在其中在洗涤剂中包含血红素基团和/或脂类。基于这些胶粒的电流导致所期望的生物组织澄清化，是通过该电流将胶粒及由此将血红素基团和脂类由生物组织导出。

通过在根据本发明的方法中使用非离子洗涤剂，也没有产生通过施加的电场引起的洗涤剂离子形式的电流，其如同缓冲碱的阳离子的流，对于所期望的生物组织澄清化而言仅是寄生的。此寄生的离子电流特别是导致加热生物组织，此加热与生物组织的澄清化无关。寄生电流还防止产生越过所述生物组织的更大场强的电场，因为由此引起的大电流会过度加热所述生物组织。但是此更大场强的电场对于由生物组织以电力方式导出即使更大且相应地不能移动的胶粒而言是有利的。

因为在根据本发明的方法中缓冲碱的阳离子是相对不能移动的，而且洗涤剂是非离子的，所以保持寄生电流小，从而使电泳澄清化的效率基于流动的电流明显升高。此外，非离子洗涤剂接合在应当留在生物组织中的蛋白质上的倾向低于诸如SDS的离子洗涤剂的倾向。因此可以在根据本发明的方法中没有困难地省略掉将生物组织固定在水凝胶中，在已知的CLARITY法中利用水凝胶确保将蛋白质留在各种生物组织中。消除将生物组织固定在水凝胶中的必要性，在此不仅具有节省掉显著的工艺复杂性的优点，而且还实现不通过水凝胶降低应当借助施加的电场由生物组织导出的胶粒的可移动性。

总计通过根据本发明的方法经常在几小时内已经实现生物组织澄清化以制备用于光学显微检验的生物制剂。

可以理解，术语“非离子洗涤剂”不应当理解为由此仅是指离子性为零的洗涤剂。而是该术语涉及所有不具有明显的离子性、即至少基本上没有离子性的洗涤剂。此外于是优选选择非离子洗涤剂，其具有对蛋白质尽可能低的亲和性。本领域技术人员根据这一预先规定能够没有困难地选择合适的非离子洗涤剂。

根据本发明的方法的实际测试表明，至少以下洗涤剂适合作为非离子洗涤剂：Tween 20、Tween 80、Triton X45、Triton X100、Triton X102、正辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷、辛基酚乙氧基化物、Brij35和Nonidet P40。非离子洗涤剂Tween 80、Triton X45、Triton X102、正辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷、Brij35和Nonidet P40显示出用于本发明的特别好的性质。Tween 80、Triton X102和Nonidet P40显示出最有利的性质。

在根据本发明的方法中使用的非离子洗涤剂还可以由多于一种前述的洗涤剂组成。洗涤剂的混合物可以针对不同的有待在电泳澄清化时去除的各种生物组织的内容物加以确定。

在电泳溶液中缓冲碱的浓度优选为10至50mol/m³，更优选为15至25mol/m³，即约20mol/m³。

在电泳溶液中非离子洗涤剂的浓度优选为0.5至1.5％(w/v)，即约1％(w/v)。

缓冲碱的阳离子的分子量优选为至少100Da。以其命名的顺序增大的程度满足这些要求的缓冲碱是Tris、Bicine和BisTris。

在电泳澄清化期间电泳溶液的最大温度可以保持在20至90℃的范围内。在此情况下，保持温度低于电泳溶液的沸点。通常优选的是，在电泳澄清化期间电泳溶液的最大温度保持在40至60℃的范围内，即在大约50℃下。但是通过超出的温度可以实现，通过加热解蔽抗体在蛋白质上的接合点，从而随后可以用抗体标记这些蛋白质。

在根据本发明的方法中，通过输入电能，其转化成热量，导致生物组织温度升高。这基本上是不可避免的。但是在根据本发明的方法中，基于输入的电能，实现的生物组织澄清化特别大。由此还特别容易将生物组织的温度限制到在所述范围内的最大温度，不必为此例如对电泳溶液进行主动冷却。

在实施根据本发明的方法时，在电泳澄清化期间可以使电泳溶液的pH值保持在8至9的范围内。由于施加的电场而流动的电流，典型地使电泳溶液的pH值减小，即使缓冲碱提供OH-基的储蓄池。为了保持生物组织澄清化的效率高，因此有意义的是，使电泳溶液的pH值保持在所述的碱性范围内。为此目的，可以在电泳澄清化期间添加新鲜的缓冲碱。通过在电场的作用下导出胶粒而消耗的洗涤剂还可以在电泳澄清化期间重新添满，是通过向所述电泳溶液添加新鲜洗涤剂。在所述电泳溶液连续地用未消耗的电泳溶液进行替换时，实现根据本发明的方法的最大效率。

在根据本发明的方法中可以在电泳澄清化期间调节对所述电泳溶液和浸入其中的组织施加的电功率。可以取决于生物组织或电泳溶液的温度进行所述调节，或者还可以调节至恒定值，其确保遵守特定的最大温度。至少可以经历电泳澄清化的部分时间段将电功率调节至此固定值。在生物组织澄清化已经进展到相当大的程度和/或所述电泳溶液相当大部分已经被消耗掉时，继续调节电功率至固定值经常不再是有意义的。

可以通过测定电泳溶液和浸入其中的生物组织的电阻来观测生物组织的澄清化的进展。首先在生物组织中形成待导出的胶粒时，电阻下降，即电导率增大。于是随着消耗电泳溶液和/或已经导出待去除的血红素基团和脂类的主要部分，电阻重新增大或电导率重新减小。因此于是在电阻或其随时间的变化超过和/或不超过预定的极限值时，可以在根据本发明的方法中改变电泳澄清化的条件和/或可以结束电泳澄清化。

在通过根据本发明的方法以电泳方式澄清化所述生物组织之前，已经可以实施其他处理。这包括例如用甲醛固定所述生物组织，但是其不限制胶粒的可移动性，这不同于用于固定的水凝胶。此外，将例如用水或者还用随后在电泳澄清化期间使用的电泳溶液洗涤生物组织算作可能的在真正的电泳澄清化之前的步骤。此外，所述生物组织在以电泳方式澄清化之前可以在碱性水溶液中进行孵育。在此孵育过程中，在至少部分地遵守以下参数时，被证明是有利的：孵育历时30至120min、优选45至90min的时间。在20至50℃、优选35至40℃、即约37.5℃的温度下进行孵育。所述碱性水溶液的碱浓度为50至2,000mol/m³，优选为100至1,000mol/m³。所述碱性水溶液含有NaOH，以提供其碱浓度。所述碱性水溶液含有浓度为10至70％(v/v)或优选40至60％(v/v)的C_1-6醇。所述碱性水溶液含有乙醇；所述碱性水溶液含有浓度为0.1至10％(w/v)、优选0.5至2％(w/v)的洗涤剂。

除了在碱性含水电泳溶液中进行电泳澄清化，所述生物组织还可以在酸性水溶液中进行孵育，然后在含水酸性电泳溶液中暴露于电场以进行进一步的电泳澄清化。

在所述酸性水溶液中孵育所述组织时，可以遵守以下参数至少之一：孵育历时30至120min，优选45至90min。在20至50℃、优选35至40℃下进行孵育。所述酸性水溶液的质子浓度为50至2,000mol/m³，优选为100至1,000mol/m³。所述酸性水溶液含有三氯乙酸，以提供其质子浓度。所述酸性水溶液含有浓度为10至70％(v/v)、优选40至60％(v/v)的C_1-6醇。所述酸性水溶液含有乙醇；所述酸性水溶液含有浓度为0.1至10％(w/v)、优选0.5至2％(w/v)的洗涤剂。此外，所述含水酸性电泳溶液可以遵守以下参数至少之一：所述含水酸性电泳溶液包含浓度为5至100mol/m³的缓冲酸和浓度为0.1至10％(w/v)的非离子洗涤剂；所述含水酸性电泳溶液包含浓度为10至50mol/m³的乙酸和浓度为0.5至2％(w/v)的非离子洗涤剂。

在所述生物组织以电泳方式进行澄清化之后，可以为了进行光学显微检验而继续制备。为此可以考虑以下步骤至少之一：所述生物组织与至少一种抗体进行孵育。所述生物组织在抗体的溶液中暴露于电场。所述生物组织用至少一种染料进行染色。所述生物组织在染料的溶液中暴露于电场。用有机溶剂洗涤所述生物组织。用二甲苯或二氯甲烷洗涤所述生物组织。将所述生物组织引入折射率在n＝1.4至n＝1.6的范围内的溶液中。n＝1.4至n＝1.6、即约n＝1.5的折射率范围意味着，所述溶液具有与澄清化的生物组织相同的折射率。由此在对生物组织进行光学显微检验时在生物组织的界面处不发生散射。

具体而言，可以将所述生物组织在以电泳方式澄清化之后引入水溶液中和/或糖或多元醇溶液中，其折射率在所述的大约n＝1.5的范围内。替代性地，可以将所述生物组织在以电泳方式澄清化之后在具有增大的醇浓度的醇系列中脱水，和/或引入有机溶剂中，水杨酸甲酯中或水杨酸甲酯溶液中，其折射率在大约n＝1.5的范围内。

为了具体地实施根据本发明的方法，可以将用于电泳澄清化的组织布置在反应室中，其具有以围绕垂直轴旋转对称的方式构成并且具有收腰部的、装有电泳溶液的反应空间，在收腰部下方的反应空间中具有向下开口的环形管道，其连接至向上引导的排气管道，在环形管道中和/或在环形管道下方的反应空间中具有第一环形电极并且在收腰部上方的反应空间中具有第二环形电极。于是将第一和第二电极连接至直流电压源的两个输出端，以将所述生物组织暴露于电场。将所述组织布置在收腰部中在反应空间的减小的自由横截面中，在电极之间近似均匀的电场会聚于此。可以经由排气管道导出在下电极处形成并由此上升的气泡，从而使其不在反应空间中聚集及阻碍电流。此外，防止产生爆鸣气，在气泡包含通过水解形成的氢气时，其可能与在上电极处通过水解形成的氧气混合。反应室可以具有其他由US 2005/0130317 A1所公开的特征。

本发明的其他有利的实施方案由权利要求书、说明书和附图获得。在说明书中所述的特征和多个特征的组合的优点仅为示例性的，可以替代性地或累积性地实现，不必强制性地由根据本发明的实施方案实现所述优点。不由此改变所附权利要求的主题，关于原始申请材料及专利的公开的内容适用于以下方面：可以从附图，尤其是所示的多个元件彼此的几何形状和相对尺寸及其相对顺序和作用关联性，获得其他特征。本发明的不同实施方案的特征或不同权利要求的特征的组合同样可能偏离权利要求的所选的回引方式并由此提出。这还涉及在分离的附图中显示或者在其说明中所述的特征。这些特征还可以与不同权利要求的特征相结合。同样可以取消掉在权利要求中所述的用于本发明的其他实施方案的特征。

在权利要求书和说明书中所述的特征关于其数量应当理解，存在恰好为所述数量或者比所述数量更大的数量，不必明确地使用副词“至少”。因此例如在述及洗涤剂时，应当理解，存在恰好一种洗涤剂、两种洗涤剂或更多种洗涤剂。在权利要求中所述的特征可以用其他特征补充或者是单独的特征，其具有各种方法或在各种方法中使用的方案。

在权利要求中所包含的附图标记不应限制通过权利要求保护的主题的范围。它们仅用于使权利要求更容易理解的目的。

附图说明

下面依照在图中所示的优选的实施例进一步阐述和描述本发明。

图1是用于实施根据本发明的方法的反应室的爆炸图。

图2所示为反应室的一个修改的实施方案在垂直截面中的细节；及

图3是根据本发明的方法的一个实施方案的流程图。

具体实施方式

在根据本发明的制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法的一个实施方案中，借助试样保持器3将来自生物组织2的试样1布置在反应室4中，其在图1中在爆炸图中显示。反应室4具有以围绕垂直轴6旋转对称的方式构成的反应空间5。将所述生物组织2在反应空间5中布置在约一半的高度，其中通过试样保持器3构成收腰部，即反应空间5的直径收缩部。在此将所述生物组织布置在收腰部中在反应空间5的减小的自由横截面16的范围内。在实施根据本发明的方法时，反应空间5至少装有含水碱性电泳溶液。也可以将在实施根据本发明的方法时与所述生物组织2接触的所有其他溶液装入反应空间5中，或者引导通过反应空间5。反应空间5为此具有上接头7和下接头8。这些接头7和8可以在处理生物组织2期间不仅用于改变在反应空间5中溶液的组成，或者甚至用另一种溶液替换，而且还用于使各种溶液通过反应空间5进行循环。在此循环过程中，可以引导各种溶液例如通过热交换器，以对其进行热处理，或者所述溶液可以针对所消耗的组分进行再生。

为了对生物组织2进行电泳澄清化从而由此去除尤其是血红素基团和脂类，设置上电极9和下电极10，将它们浸入位于反应空间中的溶液中。通过在电极9和10之间施加电压，产生越过所述生物组织2的电场，其为了电泳澄清化提供驱动电力。为了在电极9和10之间施加电压，设置上电极9的连接导线11和下电极的连接导线12，由此将电极9和10连接至直流电压源13。电极9和10是以环形构成的，从而在收腰部的范围内，即试样保持器3的自由横截面，所述生物组织2布置在其中，产生尽可能均匀的电场。可以理解，试样保持器3以及试样室4的这两个邻接的部分14和15由电绝缘材料构成。

在图2中在垂直截面中显示的反应室4的另一个实施方案的细节显示出反应空间5的下部，其中使用具有试样1的试样保持器3，从而通过试样保持器3将所述生物组织2布置在反应空间5的收腰部的自由横截面16中。在此虽然没有显示出至反应空间5的下接头8，但是可以如在图1中存在。下电极10部分地布置在向上封闭的环形管道17下方且部分地在其内部，其是通过在试样室中的插入物29构成的。将向下开口的环形管道17连接至向上引导的排气管道18，从而将由电极10由于施加的电压上升的包含例如通过水解形成的氢气的气泡19受控制地排出，由此使其不在反应空间5中聚集及阻碍电流通过反应空间5，由此还避免在反应空间5中形成爆鸣气。

在图3中在框图中所示的根据本发明的方法以例如利用甲醛固定20生物组织2开始。紧接着例如用水洗涤21组织2。在实施根据本发明的方法的过程中，可以插入在图3中未加以强调的其他洗涤步骤。基本上适用的是，所述组织2在每次在溶液中更长时间处理之前可以首先用该溶液洗涤，如其在下面所述。

在37℃下在含有100mol/m³ NaOH、50％EtOH和1％(w/v)洗涤剂的水溶液中进行碱性孵育22例如历时一小时。在50℃下在含有20mol/m³Tris和1％(w/v)各种洗涤剂的含水碱性电泳溶液中进行紧接着的碱性电泳23例如历时45min。以在电极9和10之间最大1000V的直流电压、150mA的最大电流和10W的功率限制，进行真正的电泳。这例如可以在20mA的平均电流下产生500V的平均电压。中间插入未示出的洗涤步骤，紧接着可以进行酸性孵育24。酸性孵育24可以对应于碱性孵育22，区别在于在代替NaOH添加三氯乙酸的情况下进行。在紧接着的酸性电泳25中，同样可以采用与碱性电泳23基本上相同的条件，区别在于代替Tris而使用三氯乙酸。在根据本发明的方法之后或它的其他合适的位置实施抗体染色26，即特定蛋白质的免疫学染色，其在电泳澄清化之后仍然存在于所述组织2中。在此使用的抗体，其特异性地接合在此蛋白质上，并且本身带有染料或者之后用染料标记。若澄清化且任选染色的生物组织2不应当在水溶液中以光显微方式进行检验，则进行脱水27，紧接着转移28到澄清化的组织的折射率为约1.5的介质中。适合于此的介质是冬青油。随后所述组织例如适合于通过使用光片技术进行光学显微检验。与已知的CLARITY法相比，根据本发明的方法的特征在于非常短的几个小时的总的工艺持续时间。在此还可以考虑，酸性孵育24和酸性电泳25经常不是必不可少的，从而足以使所述生物组织2澄清化。

根据以下用于实施根据本发明的方法的详细规程，成功地使各自约250mg来自猪肺组织的试样1澄清化。在甲醛中固定20组织2。用水洗涤21组织2历时10min。在37℃下在含有500mol/m³ NaOH、50％(v/v)EtOH和1％(w/v)非离子洗涤剂的水溶液中进行碱性孵育22一小时。在含有20mol/m³ Tris和1％(w/v)各种非离子洗涤剂的含水电泳溶液中进行碱性电泳23历时45min。在此，在电极9和10之间施加最大1000V的直流电压，最大电流为150mA，其中功率被限制到10W。在使用50％、70％、90％和100％乙醇的四个30分钟步骤中进行脱水27。转移28到冬青油中。在采用此详细规程时，不同的测试的非离子洗涤剂获得不同好坏的结果，如下根据由0(差的澄清化，暗色染色的试样)直至++++(良好的透明度和无色性)的评价尺度进行评价：

0：不使用洗涤剂

+：Tween 20，Triton X100

++：正辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷，Brie 35

+++：Nonidet P40，Triton X45(乳状溶液)，Tween 80

++++：Triton X102

在另一个实验中，检验在碱性电泳23时电阻的变化方式、所述组织2的血液负载和澄清化结果之间的关系。电阻在碱性电泳23开始时下降。这归因于形成和释放包含血红素基团和脂类的胶粒作为可移动的载荷子，其随后可以通过电场由组织2导出。在所述组织的血液负载高时，可以形成更多的此类载荷子。相应地，电阻明显更迅速地下降，还实现更小的最小值。随着电泳溶液的形成载荷子的组分的消耗，电阻重新增大，同样在所述组织的形成载荷子的成分，即血红素基团和脂类，已经基本上由所述组织去除时。这一电阻变化方式可以针对性地用于控制碱性电泳，尤其是认识到以更有意义的方式结束碱性电泳的时刻。此外，这一电阻变化方式是基于本发明的正确性的考虑的证明，保持电泳溶液本身的电导率尽可能地小，并且注意尽可能仅形成载荷子，其实际上包含为了其澄清化而有待由所述组织去除的物质，如血红素基团和脂类。在这些条件下流动的电流有效地导致组织2的电泳澄清化。由此不但避免通过寄生电流对试样2进行电加热，而且还避免此寄生电流实际上防止形成越过所述试样产生的电场的高场强，如其需要，以对包含比较大的血红素基团和/或脂类的胶粒施加足够大的电力，以将其由生物组织2导出。

附图标记列表

1 试样

2 生物组织

3 试样保持器

4 反应室

5 反应空间

6 垂直轴

7 上接头

8 下接头

9 上电极

10 下电极

11 导线

12 导线

13 直流电压源

14 反应室4的上部

15 反应室4的下部

16 自由横截面

17 环形管道

18 排气管道

19 气泡

20 固定

21 洗涤

22 碱性孵育

23 碱性电泳

24 酸性孵育

25 酸性电泳

26 抗体染色

27 脱水

28 转移

29 插入物(Einsatz)

Claims (27)

1.制备用于光学显微检验的透明生物制剂的方法，其中通过将生物组织浸入含水碱性电泳溶液(23)中并在电泳溶液中暴露于电场，从而以电泳方式使生物组织(2)澄清化，其中所述电泳溶液包含浓度为5至100mol/m³的碱和浓度为0.1至10％(w/v)的洗涤剂，其特征在于，所述碱是缓冲碱，其阳离子具有至少50Da的分子量，所述洗涤剂是非离子洗涤剂，所述非离子洗涤剂是至少基本上没有离子性的洗涤剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子洗涤剂至少主要由至少一种选自以下组中的物质组成：Tween 20、Tween 80、Triton X45、Triton X100、Triton X102、正辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷、辛基酚乙氧基化物、Brij35和Nonidet P40。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子洗涤剂至少主要由至少一种选自以下组中的物质组成：Tween 80、Triton X45、Triton X102、正辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷、Brij35和Nonidet P40。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子洗涤剂至少主要由至少一种选自以下组中的物质组成：Tween 80、Triton X102和Nonidet P40。

5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，所述电泳溶液包含浓度为10至50mol/m³或15至25mol/m³的缓冲碱。

6.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，所述电泳溶液包含浓度为0.5至1.5％(w/v)的非离子洗涤剂。

7.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，所述缓冲碱的阳离子的分子量为至少100Da。

8.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，所述缓冲碱至少主要由至少一种选自以下组中的物质组成：Tris、Bicine和BisTris。

9.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，在所述电泳澄清化期间所述电泳溶液的最大温度保持在低于所述电泳溶液的沸点20至90℃的范围内。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述电泳澄清化期间所述电泳溶液的最大温度保持在40至60℃的范围内。

11.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，在所述电泳澄清化期间所述电泳溶液的pH值保持在8至9的范围内。

12.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，在所述电泳澄清化期间向所述电泳溶液添加新鲜的所述缓冲碱和/或新鲜的所述洗涤剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，连续地替换所述电泳溶液。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述电泳澄清化期间调节对所述电泳溶液和浸入其中的组织施加的电功率。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，至少经历所述电泳澄清化的部分时间段，将电功率调节至固定值。

16.根据权利要求1至4及14之一所述的方法，其特征在于，在所述电泳澄清化期间测定所述电泳溶液和浸入其中的生物组织(2)的电阻。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在电阻或其随时间的变化超过和/或不超过预定的极限值时，改变所述电泳澄清化的条件和/或结束所述电泳澄清化。

18.根据权利要求1至4及14之一所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在以电泳方式澄清化之前，实施以下操作至少之一：

-固定，

-洗涤，和

-在碱性水溶液中进行孵育。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述碱性水溶液中孵育所述组织时，在以电泳方式澄清化之前，遵守以下参数至少之一：

-孵育30至120min；

-在20至50℃下进行孵育；

-所述碱性水溶液的碱浓度为50至2,000mol/m³；

-所述碱性水溶液含有NaOH；

-所述碱性水溶液含有浓度为10至70％(v/v)的C_1-6醇；

-所述碱性水溶液含有乙醇，及

-所述碱性水溶液含有浓度为0.1至10％(w/v)的洗涤剂。

20.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在其在碱性含水电泳溶液中以电泳方式澄清化之前或之后，在酸性水溶液中进行孵育，然后在含水酸性电泳溶液中暴露于电场。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，

-在所述酸性水溶液中孵育所述组织时，遵守以下参数至少之一：

-孵育30至120min；

-在20至50℃下进行孵育；

-所述酸性水溶液的质子浓度为50至2,000mol/m³；

-所述酸性水溶液含有三氯乙酸；

-所述酸性水溶液含有浓度为10至70％(v/v)的C_1-6醇；

-所述酸性水溶液含有乙醇，及

-所述酸性水溶液含有浓度为0.1至10％(w/v)的洗涤剂；及

-所述含水酸性电泳溶液遵守以下参数：

-所述含水酸性电泳溶液包含浓度为5至100mol/m³的缓冲酸及浓度为0.1至10％(w/v)的非离子洗涤剂。

22.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在以电泳方式澄清化之后，实施以下操作至少之一：

-与抗体进行孵育，

-在抗体的溶液中暴露于电场，

-用染料染色，

-在染料的溶液中暴露于电场，

-用有机溶剂洗涤，及

-被引入折射率在n＝1.4至n＝1.6的范围内的溶液中。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在以电泳方式澄清化之后，用二甲苯或二氯甲烷洗涤。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在以电泳方式澄清化之后，实施以下操作至少之一：

-被引入折射率在n＝1.4至n＝1.6的范围内的水溶液中，和

-被引入折射率在n＝1.4至n＝1.6的范围内的糖或多元醇溶液中。

25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在以电泳方式澄清化之后，实施以下操作至少之一：

-在具有增大的醇浓度的醇系列中进行脱水，

-被引入折射率在n＝1.4至n＝1.6的范围内的有机溶剂中，和

-被引入折射率在n＝1.4至n＝1.6的范围内的水杨酸甲酯或水杨酸甲酯溶液中。

26.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，

-将用于电泳澄清化的组织布置在反应室(4)中，其

-具有以围绕垂直轴(6)旋转对称的方式构成并且具有收腰部的、装有电泳溶液的反应空间(5)，

-在收腰部下方的反应空间(5)中具有向下开口的环形管道(17)，其连接至向上引导的排气管道(18)，

-在环形管道(17)中和/或在环形管道(17)下方的反应空间(5)中具有第一环形电极(10)，及

-在收腰部上方的反应空间(5)中具有第二环形电极(9)，

-其中将所述第一和第二环形电极(9，10)连接至直流电压源(13)的两个输出端，及

-其中将所述组织布置在收腰部中在反应空间(5)的减小的自由横截面(16)中。

27.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述生物组织(2)在以电泳方式澄清化之前，实施以下操作至少之一：

-用甲醛固定，

-用水洗涤，和

-用所述电泳溶液洗涤。

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